Technique diagnostic en histo-

cytologie

Dr NDOUMBA Alice
Médecin Anatomopathologiste
FMSP-UDS
 Sommaire

• Objectifs
• Définition
• Buts
• Histopathologie
• Cytopathologie
• Conclusion

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 Objectifs
• A la fin de ce cours l’étudiant devra être
capable de:
• Définir l’anatomie pathologique
• Donner les buts de l’anatomie
pathologique
• Définir la biopsie et expliquer ses
variantes
• Définir la fixation et donner la préparation
des principaux fixateurs utilisés en
histopathologie
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 Objectifs
• Citer 5 modes de fixation en
cytopathologie
• Citer 5 types de prélèvement
cytologique
• Donner les étapes des techniques de
coloration de routine en histopathologie
et en cytopathologie
• Citer 3 types de coloration spéciale en
anatomie pathologique

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 Définition
L’anatomie pathologie
• = discipline médicale basée sur l’observation et
la description des altérations morphologiques
imprimées par la maladie sur le corps humain
• =Etudie la lésion ou altération morphologique
causée par les maladies sur le corps humain
• Elle intègre la macroscopie, microscopie et les
techniques spéciales

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 Définition
Macroscopie

6
 Définition
Microscopie

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 Buts
4 buts principaux:
• Diagnostic : chez le vivant l’examen
des lésions permet de rassembler les
différents éléments nécessaires pour
le diagnostic et le choix d’un
protocole thérapeutique

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 Buts
Macroscopie

9
 Buts
Microscopie

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 Buts
• Confrontation anatomoclinique:
chez le mort la nécropsie permet de
vérifier le diagnostic clinique anté-
mortem, d’apprécier l’étendue de la
maladie, de préciser les causes et
mécanismes du décès et d’étudier les
effets néfastes ou bénéfiques des
traitements entrepris

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 Buts

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 Buts
• Didactique : rechercher une
connaissance des lésions, des
mécanismes étiopathogéniques et
physiopathologiques qui sous-
tendent les maladies
• Recherche : pérenniser les
recherches anatomocliniques chez
l’homme et expérimentales chez
l’animal

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 Techniques
• Histopathologie
• Exploite les prélèvements de
fragments de tissu ou d’organe

• Cytopathologie
• Etudie les anomalies à l’échelon
cellulaire

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 Technique d’histopathologie
standard

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 Définition
• L’histopathologie est l’étude des
lésions d’un fragment de tissu ou
d’organe au laboratoire
• Il permet de
- Poser le diagnostic
- Rassembler les éléments du
pronostic
- Type histologique
- Grade/Stade

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 Prélèvements
• Biopsie : prélèvement d’un fragment de
tissu chez un être vivant en vue de le
soumettre à un examen
anatomopathologique
- Taille variable
- Plusieurs variantes
 Biopsie-exérèse
 Biopsie extemporanée
 Ponction-biopsie
 Biopsie endoscopique
 Curetage biopsique

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 Prélèvements
• Pièce opératoire
 Un organe (amputation)
 Un fragment d’organe (lobe,
segment,…)
 Une grosse lésion (myomectomie)
 Taille de la lésion
 Limites chirurgicales
 Présence d’autres éléments du
pronostic (emboles, extension,…)

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 Prélèvements
• Pièce de nécropsie
 Confrontation anatomoclinique
 Déterminer les causes de la mort
 Médicale?
 Médico-légale?

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 Demande d’examen
• Adresse Médecin • Renseignements
demandeur cliniques et para-
cliniques
• Formation
sanitaire • Diagnostic
présomptif
• Identité malade
• Organe prélevé • Eventuellement
schéma des
• Date et heure de lésions
prélèvement
• signature
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 Fixation

• Procédé qui consiste à conserver un

prélèvement tissulaire ou d’organe
dans une substance chimique ou
physique afin de le soustraire à la
putréfaction et de le conserver à
l’état le plus proche possible de
celui où il se trouvait dans
l’organisme.

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 Fixateurs

• Types
• Propriétés
• Fixateurs usuels
• Mode de préparation
• Avantages
• Inconvénients
• Temps de fixation
• Les défauts d’une bonne fixation
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 Macroscopie
 Poids
 Taille: mensurations dans les 3 dimensions
 Couleur
 Consistance
 Plastique
 Ferme
 Osseuse
 Friable
 fibreuse
 Remaniements
 Nécrose
 Hémorragie
 Cavités

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 Macroscopie

• Tranches de section orientées

• Dans les cassettes

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 Macroscopie

25
 Macroscopie

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 Circulation
• Procédé automatisé consistant en
la déshydratation, l’éclaircissement
et l’imprégnation en paraffine de
fragments de tissus contenus dans
des cassettes

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 Circulation

28
 Circulation

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 Circulation
• Déshydratation
 Douce
 Bacs d’alcool de degré croissant
 Peut être manuelle

• Eclaircissement
 Débarrasse les tissus excès d’alcool, précipités
protéiques
 Se fait par des dérivés du benzène (xylène ou
toluène)
 Peut être manuelle

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 Circulation
• Imprégnation ou inclusion en paraffine
Rend le tissu dur pour de bonnes
coupes
Se fait en paraffine liquide chaude
secondairement solidifiée par la
glace

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 Enrobage
• En paraffine
Se fait dans des moules en posant le tissu
au milieu
Verser une petite quantité de paraffine
liquide dans le moule, poser la pièce face
à couper au contact du moule, poser la
cassette dessus
Compléter la paraffine
Laisser durcir en congélation

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 Enrobage

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 Coupe au microtome
• Coupes fines 3-5µm
• Etalement sur lame
• Utilisation d’un bain-marie
Gélatine comme colle
• Utilisation de la plaque chauffante
Albumine comme colle
• Séchage
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 Coupe au microtome

35
 Coupe au microtome

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 Bain marie

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 Coloration

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 Coloration
Définition:
• La coloration est une réaction chimique qui
permet de teindre une substance ou un
ensemble de substances d’une manière
durable
• La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine est une
technique de coloration d'usage courant en histologie
et en histopathologie.
• C'est une coloration bichromatique qui se compose
d'un colorant nucléaire, l'hématoxyline, et d'un
colorant cytoplasmique, l'éosine.
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 • Cette technique fait agir successivement:
• La solution d’hématoxyline localise la chromatine nucléaire :
c’est une coloration progressive * (bleu violet)
• L’alcool-acide permet la différenciation rapide
• L’eau ammoniacale bleuie les noyaux
• La solution d’éosine localise le cytoplasme : c’est une
coloration régressive ** (rose à rose orangé)

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 Coloration
Principe:
En microscopie optique, on peut observer :
• Les noyaux en bleu/violet ;
• Les basophiles en pourpre ;
• Le cytoplasme acidophile en rouge ;
• Les muscles en rose foncé ;
• Les érythrocytes en rouge cerise ;
• Le collagène en rose pâle.
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 Coloration

Facteurs influant la coloration

• Chimiques
• pH, concentration en H+ a une influence sur le degré
d’ionisation des colorants et tissus
• Fixation
• Concentration du colorant
• Pureté des colorants

• Physiques
• Absorption des colorants par les diverses structures
• Perméabilité des structures
• Epaisseur de la coupe

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 Protocole de coloration
1- Etapes préparatoires
• Déparaffinage
• Réhydratation
• Lavage

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 Protocole de coloration
2- Coloration
• HE
• Dédifférenciation
• Bleuillissement
• Déshydratation
• Eosine acqueuse

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 Protocole de coloration
3-Etapes préparatoires au montage
• Déshydratation
• Eclaircissement
• Montage

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 Protocole de coloration
• Résultats
• Noyaux: bleu-violacés
• Cytoplasme: rose pâle
• Muscle: rose rouge
• Fibres: rose orangé

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 Techniques spéciales
• Colorations spéciales
• Perls
• Gomori-Grocott
• PAS
• Ziehl. Etc
• IHC
• FISH
• PCR
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La cytopathologie
 Sommaire

• Définition
• Prélèvements
• Modes d’étalement
• La fixation en cytopathologie
• La coloration

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 Définition

• La cytologie est l’examen

microscopique de cellules isolées ou
en petits amas, étalées sur une
lame en couche mince
• La cytopathologie est l’étude des
lésions à l’échelon cellulaire
• Les cellules peuvent provenir de
matériel varié

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 Prélèvements
• Par grattage
 FCV
• Par ponction ou recueil
 De liquides physiologiques
 Sang
 Urines
 LCR
 Sperme

 De liquides pathologiques
 Pleural
 Péricardique
 Ascite

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 Prélèvements
 Autres liquides pathologiques
 LBA, lavage gastrique
 Aspiration bronchique
 Brossage
 Kyste
 … etc

• Par apposition d’empreintes cytologiques

 Ganglion ++
• Par ponction de masse (à l’aiguille fine)
 Masse ou organe plein superficiel
 Masse profonde (écho-guidée)

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 Demande d’examen
Accompagne le prélèvement

• Adresse Médecin • Renseignements

demandeur cliniques et para-
cliniques
• Formation sanitaire
• Identité malade • Diagnostic
présomptif
• Organe prélevé ou
type de prélèvement
• Eventuellement
schéma des lésions
• Date
• signature
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 Modes d’étalement des cellules

• Frottis
• Étalement manuel sur la lame
• Direct à partir du dispositif de
prélèvement (spatules, brosses,
écouvillon)
• Soit à l’aide d’une deuxième lame
• Par capillarité (sang, liquide des séreuses)
• Glissement lame sur les grumeaux
Éléments volumineux sur les franges

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 Modes d’étalement des cellules

• Étalement matériel cytocentrifugé

• La cytocentrifugeuse projette les cellules
en suspension dans le liquide, sur une
lame perpendiculaire à l’axe de
centrifugation
• Étalement des cellules sur disque de 0,5
cm de diamètre (« spin »)
• Lames fixées sur godets
• Vitesse pré-affichée (800trs/min. en 10
min
55
 Modes d’étalement des cellules

• Épanchement tumoral des séreuses:

possibilité de rétention des grumeaux
tumoraux dans le pertuis

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 Modes d’étalement des cellules

• Étalement matériel centrifugé

• Liquides très fluide +++
• Centrifugeuse simple (1200 trs/min en
10 min.)
• Frottis sur lames du culot de
centrifugation

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 Modes d’étalement des cellules

• Empreintes cytologiques
• Biopsies chirurgicales ou pièces d’exérèse
(ganglion ++)
• Fragment biopsié ou tranche de section
de pièce ouverte
• « séchage » préalable sur papier filtre
• Faire plusieurs étalements et prendre les
plus fins

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 Fixation

• C’est la sérosité enserrant les cellules

qui permet l’adhésion de celles-ci à la
lame
• La fixation permet de maintenir les
cellules dans un état non dégradé

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 Fixation
• Plusieurs méthodes de fixation:
• Cf Exposé

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 Macroscopie

• Volume; quantité
• Couleur
• Aspect
• Présence de précipités
• Odeur
• Goûter???!!!

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 Coloration
• Plusieurs méthodes de coloration
• MGG
• Papanicolaou
• Colorations spéciales
 Ziehl-neelsen (BAAR)
 Perls (présence de fer)
 PAS (Mycose)
 Gomori-grocott (Mycose)

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 Coloration
Principe de la coloration de papanicolaou
= coloration polychrome qui permet de différencier
les cellules en fonction de leur maturité et de leur
activité métabolique
= utilisée pour la différentiation des cellules dans les
fluides corporels. Les échantillons peuvent être des
frottis gynécologiques, des crachats, de l’urine, du
liquide céphalo-rachidien, du liquide synovial ou tout
autre échantillon contenant des cellules.
= coloration de référence pour les études en cytologie
gynécologique pour détecter la présence anormale de
cellules dans le cervix utérin dans le cadre du
diagnostic précoce du cancer de l’utérus.
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 Principe de la coloration de papanicolaou
Application
= utilisée pour la différentiation des cellules dans les
fluides corporels. Les échantillons peuvent être des
frottis gynécologiques, des crachats, de l’urine, du
liquide céphalo-rachidien, du liquide synovial ou tout
autre échantillon contenant des cellules.
= coloration de référence pour les études en cytologie
gynécologique pour détecter la présence anormale de
cellules dans le cervix utérin dans le cadre du
diagnostic précoce du cancer de l’utérus.

64
 Coloration
Principe de la coloration de papanicolaou
Elle est composée de trois colorants :
• L’hématoxyline de Harris qui colore les noyaux des cellules grâce à
son affinité avec l’ADN
• L’Orange G (OG 6), un colorant acide qui réagit avec les cellules
squameuses matures de par son affinité avec la kératine
• L’Eosine-Azur (EA 50), un colorant acide polychrome (éosine, vert
lumière et brun de Bizmark) qui réagit avec le cytoplasme des
cellules squameuses non matures (cellules basales et
intermédiaires) ainsi qu’avec les cellules glandulaires et les
hématies.

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 Coloration
Principe de la coloration de papanicolaou
• La transparence des cytoplasmes est très importante pour observer
les agrégats de cellules. Elle dépend de la concentration d’éthanol
dans la coloration.
Ainsi, on observe :
• Les noyaux des cellules qui apparaissent en bleu/noir
• Les cytoplasmes des cellules non kératinisées en bleu/vert
transparent (cellules des couches profondes cyanophiles)
• Les cytoplasmes des cellules kératinisées en rose/orange
transparent (cellules éosinophiles superficielles)
• Les hématies en rouge

66
 Coloration
FCV

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 Coloration
Principe de la coloration de May-Grünwald Giemsa
(MGG)
• Elle combine l’action de deux colorants neutres :
– un colorant selon May-Grünwald qui est composé d’un
colorant acide (l’éosine), et d’un colorant basique (le bleu de
méthylène)

– un colorant selon Giemsa qui est constitué, lui aussi,

d’éosine et d’un autre colorant basique qui est
métachromatique, l’azur de méthylène.

68
 Coloration
Principe de la coloration de May-Grünwald Giemsa
(MGG)
• Le 1er colorant induit une coloration orthochromatique des
éléments cellulaires auxquels il se fixe (couleur rose ou
orange pour les éléments acidophiles due à l’éosine et
couleur bleue ou violette pour les éléments basophiles et
neutrophiles due au bleu de méthylène)
• alors que le 2nd colorant induit une coloration
métachromatique (couleur rouge pour les éléments
azurophiles).
•

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 Coloration
Applications

La coloration de MGG est une méthode de coloration

utilisée en hématologie pour différencier et compter les
différentes populations de cellules sanguines dans des
préparations cellulaires (cytologie).
Echantillons concernés
La coloration de May-Grünwald Giemsa est réalisée
classiquement sur des frottis sanguins et des
myélogrammes.
Il est également utilisé en anatomie pathologie pour
mieux observé les cellules inflammatoires

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 Coloration MGG

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 Coloration MGG

72
 Coloration MGG

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 Coloration MGG

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 Techniques spéciales
• Immunocytochimie = méthode
d'analyse des cellules in situ par une
technique d'immunofluorescence.

• Hybridation chromogénique in situ

= une technique cytogénétique qui combine la
méthode de détection du signal chromogénique
des techniques d'immunohistochimie à
l'hybridation in situ

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 Techniques spéciales
PCR (polymerase chain reaction)=
"amplification en chaîne par polymérase . C'est
une technique de laboratoire qui, grâce à des
artifices d' "amplification", permet de détecter
des molécules présentes en très petite
quantité dans un échantillon biologique

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 MERCI

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