INTRODUCTION ET OBJET DU TEST
API 20 NE est un système standardisé pour l’identification des bacilles à Gram né-
gatif non enterobactéries et non fastidieux (ex. Pseudomonas, Acinetobacter, Fla-
vobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, etc.) combinant 8 tests conventionnels,
12 tests d'assimilation, et une base de données.
PRINCIPE
La galerie API 20 NE comporte 20 microtubes contenant des substrats déshy-
dratés.
Les tests conventionnels sont inoculés avec une suspension bactérienne saline qui
reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d'incubation se
traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.
Les tests d'assimilation sont inoculés avec un milieu minimum et les bactéries
cultivent seulement si elles sont capables d'utiliser le substrat correspondant.
La lecture de ces réactions se fait à l'aide du Tableau de Lecture et l'identification
est obtenue à l'aide du Catalogue Analytique ou d'un logiciel d’identification.
ECHANTILLONS (PRELEVEMENT ET PREPARATION)
API 20 NE ne doit pas être utilisé directement à partir des prélèvements cliniques
ou autres.
Les microorganismes à identifier doivent dans un premier temps être isolés sur un
milieu de culture adapté selon les techniques usuelles de bactériologie.
MODE OPERATOIRE
Test Oxydase
Le test oxydase doit être réalisé, il constitue le 21ème test d’identification à noter
sur la fiche de résultats.
Sélection des colonies
API 20 NE doit être utilisé avec des bacilles à Gram négatif non entérobactéries et
non fastidieux.
NOTE 1 : certaines espèces de bacilles à Gram négatif non entérobactéries qui
sont oxydase négative (S. maltophilia, Acinetobacter...) sont parfaitement identi-
fiées avec API 20 NE. On s'aidera du contexte clinique ou bactériologique pour uti-
liser cette galerie.
NOTE 2 : Les microorganismes fastidieux, exigeants et nécessitant des précau-
tions de manipulation particulières (ex. Brucella et Francisella) ne font pas partie de
la base de données API 20 NE. Il convient d'utiliser d'autres techniques pour ex-
clure ou confirmer leur présence.
Préparation de la galerie
- Réunir fond et couvercle d'une boîte d'incubation et répartir environ 5 ml d'eau
distillée ou déminéralisée dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide.
- Inscrire la référence de la souche sur la languette latérale de la boîte. (Ne pas
inscrire la référence sur le couvercle, celui-ci pouvant être déplacé lors de la ma-
nipulation).
- Sortir la galerie de son emballage individuel.
- Placer la galerie dans la boîte d’incubation.
Préparation de l'inoculum
- Ouvrir une ampoule d'API NaCl 0,85 % Medium (2 ml) ou utiliser un tube conte-
nant 2 ml de solution saline à 0.85 %, sans additif.
- A l'aide d'une pipette, prélever 1 à 4 colonies de morphologie identique, par as-
pirations ou par touches successives. Utiliser préférentiellement des cultures
jeunes (18-24 heures).
- Réaliser une suspension d'opacité égale à 0,5 de McFarland. Cette suspension
doit être utilisée extemporanément.
NOTE : Pour le bon fonctionnement des tests de la galerie API 20 NE, il est très
important d'ajuster la densité de l'inoculum au point 0,5 de McFarland. En particu-
lier, une turbidité plus faible conduit à des résultats faussement négatifs. Ne pas
toucher les cupules lors des manipulations et veiller à ne pas laisser la galerie ex-
posée à l'air longtemps après inoculation
Inoculation de la galerie
- Remplir les tubes (et non les cupules) des tests NO3 à PNPG avec la suspen-
sion précédente en utilisant la pipette ayant servi au prélèvement. Pour éviter la
formation de bulles au fond des tubes, poser la pointe de la pipette sur le côté de
la cupule, en inclinant légèrement la boîte d'incubation vers l’avant.
- Ouvrir une ampoule d’API AUX Medium et y transférer environ 200 μl de la sus-
pension précédente. Homogénéiser avec la pipette en évitant la formation de
bulles.
- Remplir tubes et cupules des tests GLU à PAC en veillant à créer un niveau ho-
rizontal ou légèrement convexe, mais jamais concave. Des cupules incomplète-
ment remplies ou trop remplies peuvent entraîner des résultats incorrects.
- Remplir d'huile de paraffine les cupules des trois tests soulignés (GLU, ADH,
URE) pour former un ménisque convexe.
- Refermer la boîte d'incubation et incuber à 29°C ± 2°C pendant 24 heures (± 2
heures).
LECTURE ET INTERPRETATION
Lecture de la galerie
- Après incubation, la lecture de la galerie doit se faire en se référant au Tableau
de Lecture.
- Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées (GLU, ADH, URE,
ESC, GEL, PNPG).
- La révélation des deux tests NO3 et TRP doit se faire en mettant les tests d'as-
similation à l'abri d'une contamination par l'air ; pour cela, placer le couvercle de
la boîte d'incubation au dessus de ces tests, pendant la période de révélation
des tests NO3 et TRP.
Test NO3 :
- Ajouter une goutte de réactifs NIT 1 et NIT 2 dans la cupule NO3.
- Après 5 mn, une couleur rouge indique une réaction positive, à noter sur
la fiche de résultats.
- Une réaction négative peut être due à la production d'azote (éventuelle-
ment signalée par la présence de microbulles) ; ajouter 2-3 mg de réactif Zn
dans la cupule NO3.
- Après 5 mn, une cupule restée incolore indique une réaction positive à no-
ter sur la fiche de résultats. Si la cupule devient rose-rouge, la réaction est
négative car les nitrates encore présents dans le tube ont alors été réduits
en nitrites par le zinc.
- La réaction utilisée pour l'identification de la bactérie est la réduction des
nitrates ; elle est positive si l'une ou l'autre des deux réactions précédentes
(production de NO2 ou de N2) est positive. La production de N2 peut ce-
pendant être utilisée seule comme test complémentaire dans le Catalogue
Analytique.
Test TRP :
Ajouter une goutte de réactif JAMES. Une couleur rose diffusant dans toute
la cupule indique une réaction positive.
Tests d'assimilation :
Observer la pousse bactérienne. Une cupule trouble indique une réaction
positive.
Des pousses d'intensité intermédiaire peuvent être observées et notées +
ou ±.
Une réincubation est nécessaire dans les cas suivants :
- faible discrimination ;
- profil inacceptable ou profil douteux ;
- si la note suivante est indiquée pour le profil obtenu : IDENTIFICATION NON
VALIDE AVANT 48 H D’INCUBATION
Alors, éliminer, à l’aide d’une pipette, les réactifs NIT 1, NIT 2 et JAMES par aspira-
tion, recouvrir immédiatement les tests NO3 et TRP d'huile de paraffine en formant
un ménisque convexe, incuber à nouveau à 29°C ± 2°C puis lire 24 h plus tard,
sauf les trois premiers tests : NO3, TRP, GLU qui doivent être lus uniquement à 24
h.
Interprétation
L'identification est obtenue à partir du profil numérique.
Détermination du profil numérique :
Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur 1,
2 ou 4 est indiquée pour chacun. En additionnant à l'intérieur de chaque groupe les
valeurs correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres ; la réaction
de l'oxydase qui constitue le 21° test est affectée de la valeur 4 lorsqu'elle est posi-
tive.
Identification :
Elle est réalisée à partir de la base de données
• à l'aide du Catalogue Analytique : Rechercher le profil numérique dans la liste
des profils.
• à l'aide du logiciel d'identification apiweb TM : Entrer manuellement au clavier le
profil numérique à
7 chiffres.