UNIVERSITE CHEIKlI AN'fA DIOP DE DAKAR

FACULIE DE' MEDD'CIN.E, DE PHARMACIE ET

D'ODONTO-STOMATOLOGIE

MEMOIRE POUR LE CERTIFICAT D'ETUDES SPECIALES (C.E.S.)

D'HEMATOLOGIE BIOLOGIQUE

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Présenté et soutenu
Par
Docteur Modou Oumy KANE

Directeur du CE.S,' Professeur Lamine DIAKHATE

ANNEE UNIVERSITAIRE 1999-2000

~[ Il~IJJt~117IelK\rNrlElllE 1(Q)~1 r~~J5j~[M]l

~~JE n~~[E~~cç(Q)~[D)~[E~A

A son Prophète Mouhamed (P.S.L.)

Et à son fidèle Serviteur Cheikh Ahmadou BAMBA

,4 mes parents

,4 mes frères et sœurs

,4 tous les enseignants qui ont participé à ce CES

Merci pour votre enseignement riche en qualité

,4 tout le personnel du Centre National de Transfusion Sanguine

,4 tout le personnel du Département de Physiologie-Phannacologie

,4 tout le personnel du Laboratoire de Biologie de l'Institut Pasteur de Dakar

,4 tous mes camarades de CES

,4ux Professeurs Lamine DIAKHATE et Doudou TIllAM

Pour m'avoir considéré comme un véritable membre du c.N.T.S

,4ux Assistants Awa TOUREIFALL et Macoura GADJI

,4u Professeur Aminata SALLIDIALLO

Pour m'avoir permis de trouver le temps de me consacrer à ce CES

,4u Professeur Babacar FAYE

,4et Professeur Doudou BA

,4 tous mes amis

 ~ REMERCIEMENTS J

Membres de jury de ce C.E.S

Pour l'honneur que vous nousjailes en acceptant de juger ce travail

1
1

! SOMMAIRE

INTODUCTION 1
PREMIERE PARTIE: Généralités 3
1- GROUPES SANGUINS ERYTHROCYTAIRES : Historiques et notions générales 4
11- GROUPES SANGUINS ERYTHROCYTAIRES : Application en clinique et en
therapeutique 5
Il./- LA TRANSFUSION SANGUINE. 5
Il. 2- MALADIE HFMOLYTIQUE NEO-NATALE ET PHENOTYPE RHESUS 5
II. 3- ASSOCIATION ENTRE GROUPES SANGUINS ABO ET CERTAINES_MALADIES.. 5
II. 4- ANTIGENES DE GROUPE SANGUIN ETMALIGNllE 6
III- TESTS EN GEL: Mise au point et évolution 7
II/./-LA MISEAU POINT DU GEL-TEST ~ 7
II1.2- LES TROIS PHASES DE SON EVOLUTION 8
DEUXIEME PARTIE: Travail personnel 10
1- MATERIEL ET METHODE 11
1./- CADRE DE L'ET[IDE 11
1. 2- POPULATION D'EroDE 11
1.3- MATERIEL 11
1.3.1- Groupage sur plaque d'opaline 11
1.3.1./-Méthode globulaire de Beth Vincent 11
1. 3.1.2- Méthode sérique de Simonin 12
[Link]- Contrôles 12
1.3.2- Groupage sur gel.. 12
1.3.3- Tests de confirmation 13
1.4- M}~THODOLOGIE 13
1.4.1- Groupage sur plaque d'opaline l4
l. 4. /./- Méthode globulaire de Beth Vincent 14
/.4. 1. 2- Groupage dans le système rhésus 15
1.4.1. 3- Méthode sérique de Simonin 15
1.4.2- Groupage sur gel 17
1. 4. 2.1- Méthode globulaire 17
[Link]- Méthode sérique 18
1.4.3- Tests de confirmation 19
 1.4.3./- Test de Cooombs
[Link]- Réaction de Fixation-Elution (RFE) 19

RESULTATS 21
l)- RESULTATS DES PHENOTYPAGES 22
II)- DUREE DES MANIPULATIONS 24
II.1- METHODE SUR PLAQUE 24
n.2- METHODE SUR GEL. 25
lII)- DIFFICULTES DIVERSES 25
Ill. 1- METHODE SUR PLAQUE 25
III. 2- METHODE SUR GEL 25
IV)- COÛT DES MATERIELS ET REACTIFS 26
V) - SENSIBILITE ET FIABILITE 28
DISCUSSION 29
]- Fiabilité des résultats et Sensibilité 30
2- Manipulations _ 30
3- Le personnel 30
4- Durée des manipulations 31
5- Le coût des matériels et réactifs 31
6- La COllsenJation des réactifs 33
7- Approvisionnement des réact~fs 33
CONCLUSION 34
BIBLIOGRAPHIE __ 36
 1

INTRODUCTION
 2

L'Immuno-hématologie et l'Immunogénétique sont les deux sœurs jumelles

de ce siècle [4]. Elles sont nées en effet, en 1900 avec la découverte par
Landsteiner des groupes sanguins.
Landsteiner observe que lorsque l'ont met en présence le sérum et les
hématies d'individus différents, des agglutinations apparaissent. Ceci prouve
l'existence d'anticorps sériques définissant deux variétés d'antigènes
principalement A et B. cette découverte est à la base des futurs moyens de
détecti on des groupes sanguins érythrocytaires par la mise en œuvre de réactions
d'agglutination entre anticorps sériques et antigènes globulaires. C'est ce que
l'on appelle: le Groupage ou phénotypage [1, 4].
Ce phénotypage a connu une grande évolution dans le temps avec la mise
au point d'anticorps-test de plus en plus monoclonaux et donc spécifiques; mais
également et surtout par des techniques sur gel qui ont apporté une dose
supplémentaire de fiabilité et de précision, améliorant de façon indéniable la
qualité et la sécurité des transfusions [15].
Dans ce travail, nous nous proposons de faire une· étude comparative entre
la méthode traditionnelle sur plaque de phénotypage ABO/Rhésus et la
technique sur gel.
L'objectif de cette étude est de comparer respectivement pour ces deux
méthodes, la fiabilité des résultats, la simplicité des actes, le rapport qualité/prix;
ceci dans le but de voir s'il est possible d'appliquer éventuellement les tests sur
gel en pratique courante dans nos laboratoires.
 3

PREMIERR PARTIE:
GENERALITES
 4

1- GROUPES SANGUINS ERYTHROCYTAIRES : HISTORIQUES ET

NOTIONS GENERALES

Tout commence par Karl Landsteiner. En 1900, Karl Landsteiner découvre

à Vienne, le premier système de groupe sanguin, ABO [4]. Les transfusions de
sang sont bien supportées lorsque le donneur et le receveur sont compatibles [1].
La transfusion sanguine prend son essor. Emigré plus tard aux États-Unis, Karl
Landsteiner découvre en 192Tau soir de sa vie un autre système de groupe
sanguin, le système rhésus.
Ultérieurement, Landsteiner et Levine, en immunisant des animaux avec
des hématies humaines, découvrent en 1939 deux autres systèmes de groupe
sanguin : MN et P [4].
Dès les années qui avaient suivi sa première découverte, Landsteiner avait
prédit que les groupes sanguins permettraient un jour d'identifier les hommes
aussi parfaitement que les empreintes digitales.
Depuis trois quarts de siècle, notre connaissance de la mosaïque s'est
complétée. Nous avons appris à connaître pavé après pavé, système de pavé
après système de pavé, la constitution de la surface des globules rouges. Les
pavés de la mosaïque du globule rouge, les facteurs de groupes sanguins sont les
témoins des hérédités lointaines [1, 4].
 5

11- GROUPES SANGUINS ERYTHROCYTAIRES : APPLICATION EN

CLINIQUE ET EN THERAPEUTIQUE

Il.1- LA TRANSFUSION SANGUINE

Le but de la transfusion est d'apporter au receveur, les constituants du sang

qUI lui font défaut. Le plus souvent, ce sont des hématies qui doivent être
transférées en préservant leur intégrité fonctionnelle.
Pour cela, il est fondamental que la compatibilité immunologique soit aussi
parfaite que possible entre donneur et receveur [3, 9].
Cette condition passe par un groupage sanguin correctement effectué pour
déceler une éventuelle incompatibilité qui peut être à l'origine d'accidents
immunologiques sous forme de destruction des érythrocytes du donneur par les
anticorps du receveur [5].

Il.2- MALADIE HEMOL YTIQUE NEO-NATALE ET PHENOTYPE RHESUS

La maladie hémolytique du nouveau-né représente l'exemple le plus

évident du rôle direct d'un phénotype de groupe sanguin dans une maladie. Dans
le système Dd, les femmes Rh négatif sont les seules qui puissent donner
naissance à un enfant atteint de maladie hémolytique du nouveau-né ~ encore
faut-il que l'enfant soit Rh positif [3, 10].

Il.3- ASSOCIATION ENTRE GROUPES SANGUINS ABO ET CERTAINES

MALADIES

Le premier exemple d'une association entre phénotype ABü et une maladie

a été la relation entre le groupe sanguin A et le cancer de l'estomac observé en
1955 dans la population anglaise. L'excès de groupe A parmi les sujets atteints
de cette maladie est resté constamment sîgnificatif dans d'autres populations et
cette relation est généralement considérée comme une donnée sûre.
 6

Une autre association relativement bien établie est celle de la plus grande
fréquence de sujets du groupe 0 non sécréteurs chez les malades atteints d'ulcère
duodénal que chez les sujets nom1aux.
D'autres associations ont été rapportées excès de A dans la maladie
thrombo-emboIique et la maladie de Biermer, excès de 0 dans le rhumatisme
articulaire aigu [2, 4].

Il.4- ANTIGENES DE GROUPE SANGUIN ET MALIGNITE

Les antigènes de groupes sanguins ont été longtemps considérés comme

des produits génétiques, donc immuables sauf en cas de mutations et sensibles à
l'environnement.
Néanmoins.., on sait depuis une vingtaine d'années que des modifications
indiscutablement acquises et somatiques peuvent être observées au niveau des
antigènes portés par les globules rouges au cours d'affections malignes du tissu
hématopoïétique. Il s'agit essentiellement de déficits ou de disparition des
antigènes Al, A, B ou H [2].
 7

111- TESTS EN GEL: MISE AU POINT ET EVOLUTION

Le gel test est né fin 1984 début 1985, il Y a maintenant plus de 15 ans. Si
de ce fait, il fait un peu figure d'ancêtre dans une revue prospective, son histoire
constitue malgré tout, une bonne introduction à une telle revue, d'une part parce
qu'elle n'est pas terminée et que d'autres développements restent possibles,
d'autre part parce qu'elle est ~out à fait représentative de la naissance et de
l'arrivée à maturité d'un nouveau produit.
Il serait intéressant de faire la lumière sur les faits marquants de son
développement et sa place actuelle en Immuno-Hématologie [6].

11/.1- LA MISE AU POINT DU GEL-TEST

En y regardant de près, il est étonnant que le gel-test ait mis si longtemps à

apparaître : il ne fait appel à aucun outil, ni à aucune technologie complexe.
Simplement il rapproche des procédés ou des substances utilisées dans des
domaines différents et il les détourne de leur vocation première, utilisant ainsi
des moyens bien connus de stimuler l'innovation.
Le gel de Sephadex par exemple, s'il est utilisé depuis longtemps en
chromatographie, l'est à cause de la porosité de chacune de ses billes. Dans le
gel-test, il n'agit que par sa granulométrie et peut être remplacé par d'autres
supports, ce qui a permis à certains fabricants d'en proposer des variantes basées
strictement sur le même procédé : les hématies libres arrivent à se frayer un
passage à travers des billes, tandis que les agglutinas sont bloqués à la surface
[6] .
Le procédé est donc basé sur une modification de comportement des
hématies agglutinées. Dans le passé, d'autres méthodes ont utilisé d'autres types
de modifications du comportement des hématies agglutinées ou des hématies
revêtues comme par exemple la lecture par coulage en microplaque ou la
sédimentation d'hématies dans les microplaques [6, 7].
 8

Une autre nouveauté apportée par le gel-test, déterminante, a été de

pennettre de s'affranchir des lavages précédant le test à l'antiglobuline, du fait
des vitesses respectives de sédimentation des hématies et du plasma lors de la
centrifugation [8, 13].
Au moment de sa description, le gel ne servait que pour réaliser des tests à
l'antiglobuline. Les réactifs étaient préparés tous les jours, quelque fois deux fois
par jour et utilisés dans des dispositifs artisanaux [6].

1/1.2- LES TROIS PHASES DE SON EVOLUTION

• La première phase d'évolution du gel-test a demandé près de trois ans,

jusqu'à sa commercialisation en 1988 et abouti au système ID® de Diamed [6].
Cette période a notamment permis:
- de préciser la formulation des différents gels réactifs;
- de définir les dispositifs permettant la mise en œuvre de carte avec
plusieurs tubes et une centrifugeuse;
- de résoudre le problème de la conservation [6, 8, 13].
• Dans une 2ème phase, tous les éléments de la réaction ont été optimisés. La
fonne et la nature du plastique des cartes ont été améliorées. Parallèlement, les
réactifs ont fait des progrès considérables et ces progrès ont été utilisés pour
développer de nouvelles utilisations existantes. La meilleure connaissance du
procédé, son appropriation par de nombreux laboratoires et le travail de
technovigilance qu'ont effectué ces laboratoires ont également concouru à cette
optimisation. Jusque là et à quelques anecdotes près, les tests en gel étaient
exclusivement distribués par la firme DIAMED [6].
èmc
• La 3 phase d'évolution des méthodes en gel est plus récente puisqu'elle
débute en 1992 avec la mise sur le marché de tests similaires par d'autres
compagnies. En réalité, si l'on excepte quelques copies plus ou moins conformes
du gel-test, comme celles des sociétés Diagast ou Jacques Boy, tests dont la
distribution est encore limitée, la principale variante a été introduite par la firme
 9

Ortho qui a repris un des supports testés à l'origine et abandonnés au profit du

gel de Sephadex : les billes de verre ; et a commercialisé le test résultant sous le
nom de Bio Vue® [6].
L'introduction de ces copies du test original est l'occasion d'une bataille
juridique qui constitue une sorte de cas d'école en matière de propriété
industrielle, même si ce genre d'événement semble de plus en plus fréquent au
cours de la vie d'un nouveau produit [6].
 10

DEUXIEMt: PARTIE:
TRA VAIL PERSONNEL
 11

1- MATERIEL ET METHODE
1.1- CADRE DE L'ETUDE

Notre étude a été réalisée au Centre National de Transfusion'Sanguine.

1.2- POPULA TION D'ETUDE

Notre population d'étude est constituée par 150 donneurs de sang d'âge
moyen 25 ans (extrêmes 19 à 53 ans). Le sex-ration est de 1/8 en faveur des
hommes. Avec cette population, nous avons procédé pour chaque sujet à un
groupage sur plaque et un groupage sur gel.

1.3- MA TERIEL

1.3.1- Groupage sur plaque d'opaline

/.3.1.1- Méthode globulaire de Beth Vincent

. Ff Réactifs

• Sérum-test anti A

• Sérum-test anti B
• Sérum-test anti A+B

• Sérum-test anti D

• Sérum-test anti-H
ri' Matériel

• Plaque d'opaline

• Verre à pied

• Tube à hémolyse

• Pipette Pasteur

• Crayon gras

• Coton ou compresse

• Microscope

• Lames de microscope

• Rhésuscope
 12

/.3.1.2- Méthode sérique de Simonin

!Fr Réactifs

• Globules-test Al
• Globules-test A2
• Globules-test B
:V. Matériel (Idem méthode globulaire)

/.3.1.3- Contrôles

~ Réactifs
• Témoion AB : sérum de sujet AB
• Témoin allo : globules rouges de sujet 0
• Témoin auto : sérum de l'échantillon + globules fouges de
l'échantillon
1.3.2· Groupage sur gel
! ir Réactifs
• Carte-ID "ABO/Rh" contenant des anticorps polyclonaux anti-A,
anti-B, antl-AB, anti-D et anti-CDE d'origine humaine, inclus dans le gel. Le
micotube CTL est le contrôle négatif.
• ID-Diluent l : solution de bromeline modifiée pour suspenSIOn
d'hématies.

• Globules-test: Al, B
fi' Matériel
• ID-Dispenser
• ID-Pipetor
• Embouts ("ID tips")
• Tubes courts pour suspension
• Centrifugeuse type "ID Centrifuge 24 S"
• Portoir ("ID working table")
 13

1.3.3- Tests de confirmation

[Link]- Test de Coombs
cff' Réactifs
• Eau physiologique
• Sérum test anti D.
• Sérum de Coombs
Cff' Matériel
• Tubes à hémolyse
• Centrifugeuse
• Pipettes Pasteur
• Bain-marie
• Microscope
[Link]- Réaction de Fixation Elution (RFE
Cff Réactifs
• Eau physiologique
• Anticorps homologues
• Hématies tests A, B, 0-, 0+
'if Matériel
• Tubes à hémolyse
• Centrifugeuse

• Pipettes Pasteur

• Bain-marie
• Réfrigérateur
• Microscope

1.4- METHODOLOGIE

Les 50 premiers prélèvements ont été utilisés sur une durée de 5 jours à des fins
d'entraînement pour nous familiariser avec la technique sur gel et pour mieux
comparer les durées des manipulations.
1
1 14

1 1.4.1- Groupage sur plaque d'opaline

[Link]- Méthode globulaire de Beth Vincent

'Er Déposer sur la plaque d'opaline déjà numérotée

• l goutte de sérum-test anti-A
• 1 goutte de sérum-test anti-B
• l goutte de sérum-test anti-A+B
. ft Ajouter sur chaque goutte de sérum-test 1 goutte de globules rouges et une
goutte de sérum physiologique.
,rr Avec le fond d'un tube à hémolyse, mélanger soigneusement chaque
goutte de sang avec la goutte de réactifs, de façon à former une tâche d'environ 2
cm de diamètre.
Il faut toujours nettoyer le fond du tube à hémolyse entre 2 manipulations, avec
le coton (ou compresse).
Ff' Imprimer à la plaque un lent mouvement circulaire.
Laisser reposer 30 secondes et lire les agglutinations en agitant la plaque.
Cff Lecture
Une réaction antigène-anticorps se traduit par une agglutination notée par un
signe positif (+).
Une absence de réaction antigène-anticorps se traduit par une absence
d'agglutination notée par un signe négatif (-).
cff' Validation
Toute détermination de groupe sangum ABÜ se fait systématiquement en
présence de témoins.
Le témoin auto et le témoin AB contrôlent l'épreuve globulaire de Beth Vincent.
• Témoin auto : sérum de l'échantillon + globules rouges de
l'échantillon.

• Témoin AB sérum d'un sujet AB + globules rouges de

l'échantillon à grouper
1
1 15

1
La négativité de ces témoins valide la méthode de Beth Vincent.
La positivité du témoin auto témoignerait de la présence d'auto-anticorps.
La positivité du témoin AB témoignerait de la présence d'une
polyagglutinativité.
d Interprétation des résultats (voir tableau)

[Link]- Groupage dans le système rhésus

La détermination des antigènes du système rhésus se fait par méthode

globulaire. C'est une technique d'agglutination comme précédemm'ent :
ô~ Déposer une goutte de globules rouges de l'échantillon
rfr Déposer une goutte de sérum-test anti-D
[t' Mélanger avec l'extrémité d'un tube à hémolyse
'ft> Noter l'absence ou la présence d'agglutination.
Cette réaction sefait surtout entre 37 et 40°C en utilisant un rhésuscope.
j'oute réaction négative doit être confirmée par un test de Coombs et
même une réaction defixation-élution (RFb).

[Link]- Méthode sérique de Simonin

rf Sur une plaque d'opaline numérotée, mettre 3 gouttes de sérum de

l'échantillon à grouper.
• Sur la 1ère goutte, on met des globules-tests Al
èrnc
• Sur la 2 goutte, on met des globules-test A2
èrnc
• Sur la 3 goutte, on met des globules-tests B
. d" Avec le tube à hémolyse (ou agitateur en verre) on mélange le sérum et
le globule-test de façon à former une tâche ovalaire d'environ 2 cm.
lff Plaque au repos pendant 2 minutes
(ir Lecture : (comme méthode globulaire)
 16

Validation: 2 tests
• Le témoin auto (voir méthode globulaire)
• Le témoin allo : 1 goutte de sérum du malade + 1 goutte de
globules-tests 0
La négativité de ces témoins valide la méthode sérique.
La positivité du témoin allo signifierait la présence d'allo-anticorps irréguliers en
dehors du système ABO.
,t!~ Interprétation des résultats

Tahleau 1: Résultats de groupage par la méthode de sur plaque d'opaline

Groupes Méthode de Beth Vincent Méthode de Simonin

Sérum anti-A AntiB AntiA+B GRA GRB
A + - + - +
B - + + + -
AB + + + - -
0 - - - + +
'----

[,es sujets dont les globules rouges donneront une agglutination avec le
sérum-test anti-D seront dites Rhésus positifs. A l'inverse, on parle de
Rhé.. .·us négat~f
 17

1.4.2- Groupage sur gel

[Link]- Méthode globulaire

cff' Préparation de l'échantillon

• Préparer une suspension d'hématies du patient à 5% en ID-Diluent
comme suit :
Distribuer 0,5 ml d'ID-Diluent 1 dans un tube propre
Ajouter 50111 de sang total ou 25111 de culot d'hématies
Mélanger doucement
1ncuber 10 minutes à température ambiante.
c'jj' Contrôles
Des échantillons positifs et négatifs connus devront être inclus pour valider les
résultats.
j'J' Protocole
Ne pas utiliser les cartes-ID présentant des signes de déshydratation, des bulles
d'air ou des fermetures endommagées.
• Identifier la carte-ID par le nom et ou le numéro du patient
• Enlever la feuille d'aluminium
• Distribuer 10~1-12f..tl de la suspension d'hématies du patient dans les
microtubes de la carte-ID
• Centrifuger la carte-ID 10 minutes dans l'ID-centrifuge
• Lire et noter les réactions.
éff' Lecture et interprétation des résultats
• Positif: hématies agglutinées formant une ligne rouge à la surface
du gel ou des agglutinats dispersés dans le gel.
• Négatif: hématies en culot au fond du microtube.
 18

Tableau II: Résultats de groupage sur gel par la méthode globulaire

--

Groupes Anti-A Anti-B Anti-AB

A ++++ - ++++
B - ++++ ++++
AB ++++ ++++ ++++
0 - - -

Le microtube ctl (contrôle) doit toujours être négatif.

S'il est positif, la détermination ABD ne peut être validée. Il faudra alors
renouveler le test. Ici également, comme dans la méthode sur plaque, les
sl~jets Rhésus positifs seront détectés par une agglutination au gel sous
forme d'un dépôt à la surface du microtube contenant les anticorps anti-D.
Idem pour les antigènes associés au rhésus CDE qui pourront être détectés
au niveau du micro/ube contenant les anticorps correspondants.

[Link]- Méthode sérique

• Identifier les cartes-ID par le nom ou le numéro du patient.

• Enlever la feuille d'aluminium
• Distribuer 50111 de ID-Dia Cell Al (globules-test Al) dans le
microtube 5

• Distribuer 50~d de ID-Dia Cell (globules-test B) dans le microtube

6

• Ajouter 50111 de sérum du patient dans les microtubes 5 et 6

• Incuber à la température ambiante pendant 10 minutes
• Centrifuger pendant 10 minutes dans le ID-Centrifuge
• Lire et noter les réactions.
Groupes Globules-test Al Globules-test B
A +
B +
 19

Remarque
Les sérums-test utilisés dans la méthode globulaire et les globules-tests utilisés
dans la méthode sérique peuvent être contenus dans des microtubes d'une même
carte-ID, nous dispensant d'une double centrifugation.

1.4.3- Tests de confirmation

[Link] Tests de Coombs indirect
· Laver les hématies du malade 3 fois et en préparer une suspension de 5 % en
solution physiologique
· Déposer 3 gouttes de sérum-test anti D dans un tube propre
· Ajouter une goutte de suspension d'hématies
· Incuber pendant 15-30 minutes à 37 oC
· Laver 3 fois le contenu du tube avec la solution physiologique et décanter le
surnageant
· Ajouter une goutte de sérum de Coombs
· Mélanger par agitation et centrifuger tme minute à 1000 tours/mn.
· Resuspendre doucemernt les hématies et au dessus d'un éclairage indirect,
observer
l'agglutination macroscopique ou lire au microscope.

[Link] Réaction de Fixation-Elution (RFE)

· Recueillir dans un tube de 10 cc au minimum 1 ml de culot globulaire
· Effectuer 3 lavages successifs en sérum physiologique préalablement porté à
37 oC.
· Ajouter au culot globulaire lavé un volume égal d'anticorps homologues à
l'antigène recherché
· Incuber 2 heures à 4°C pour les anticorps du système ABO, 1 heure à 37 oC
pour les anticorps du système Rhésus
· Effectuer 6 lavages en sérum physiologique
 20

· Vérifier l'absence de traces d'anticorps sur la dernière eau de lavage

· Ajouter au culot globulaire bien égoutté un volume égal de solution d'élution :
sérum physiologique
· Porter au bain-marie à 56 oC pendant 10 mn pour réaliser l' élution
·Centrifuge immédiatement les tubes pendant 4 mn à 4000 tours/mn
· Séparer immédiatement le surnageant (éluat du culot globulaire). Il est teinté de
rouge résultant de l'hémolyse des globules rouges chauffés
· Tester l' éluat et la 6ème eau de lavage sur une liste d' hématies-tests:
globules-tests 0 (témoin négatif du système ABO)
globules-tests A
globules-tests B
globules-tests 0 Rh-
globules-tests 0 Rh+.
Ces deux tests de confirmation nous ont servi de moyens d'arbitrage entre les
deux techniques à comparer; et donc à ce titre, ne peuvent être elles-mêmes
comparées à la technique sur gel ni ne peuvent être prises en compte dans
l'appréciation des prix pour la méthode sur plaque.
 21

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RESULTATS
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~~
 22

Les résultats seront appréciés sur le plan phénotypique, mais aussi sur le
plan de la durée des manipulations et le coût.

1)- RESULTATS DES PHENOTYPAGES

Tableau III: Résultats comparatifs du groupage

Numéros Groupes Numéros Groupes

d'échantillon Sur Plaque d'échantillon Sur Plaque Sur Gel
Sur Gel

1 0+ 0+ 29 A+ A+
2 A+ A+ 30 AB+ AB+
3 B+ B+ 31 B+ B+
4 0+ 0+ 32 0+ 0+
5 0- 0- 33 0- 0-
6 0+ 0+ 34* 0- 0+
7 0+ 0+ 35 0+ 0+
8 B+ B+ 36 0+ 0+
9 A+ A+ 37 A+ A+
10 0+ 0+ 38 B+ B+
11* 0- 0+ 39 0+ 0+
12 A+ A+ 40 B+ B+
13 0+ 0+ 41 B+ B+
14 0+ 0+ 42 A+ A+
15 0+ 0+ 43 0+ 0+
16 B+ B+ 44 B+ B+
17 0+ 0+ 45 B+ B+
18 0+ 0+ 46 B+ B+
19 A+ A+ 47 0+ 0+
20 B+ B+ 48 0+ 0+
21 0+ 0+ 49 0- 0- ,
22 0+ 0+ 50 0+ 0+
23 0+ 0+ 51 0+ 0+
24 0+ 0+ 52 0+ 0+
25 0+ 0+ 53 A+ A+
26 A+ A+ 54 A+ A+
27 0+ 0+ 55 B+ B+
28* B- B+ 56 A+ A+
57 0+ 0+
58 0+ 0+
 23

Tableau III : Résultats comparatifs du groupage (suite et fin)

Numéros Groupes Numéros Groupes

d'échantillon Sur Plaque d'échantillon Sur Plaque Sur Gel
Sur Gel

59 B+ B+ 80 0+ 0+
60 0+ 0+ 81 0+ 0+
61 0+ 0+ 82 0+ 0+
62 0+ 0+ 83 B+ B+
63 0+ 0+ 84 B+ B+
64 0+ 0+ 85 0+ 0+
65 B+ B+ 86 AB+ AB+
66 A+ A+ 87 0+ 0+
67* 0- 0+ 88 0+ 0+
68 0+ 0+ 89 0+ 0+
69* 0- 0+ 90 0+ 0+
70 B+ B+ 91 0+ 0+
71 B+ B+ 92 0- 0-
72 B- B- 93 0+ 0+
73 B+ B+ 94 0+ 0+
74 B+ B+ 95 0+ 0+
75 B+ B+ 96 0+ 0+
76 A+ A+ 97* A- A+
77 0+ 0+ 98 B+ B+
78 0+ 0+ 99 0+ 0+
79 A+ A+ 100 0+ 0+

*/ Discordance entre les deux techniques (les tests de confirmation, Coombs ou

RFE donnent raison au gel).
 24

Il)- DUREE DES MANIPULATIONS

1/.1- METHODE SUR PLAQUE

'ri' 1er jour: sur 37 prélèvements

• Préparation des hématies test: 25 minutes
• Centrifugation des échantillons : 10 minutes
• Groupage à proprement parler:
Beth Vincent: 1 heure 15 minutes
Simonin : 1 heure 05 minutes
• Confrontation des résultats: 10 minutes
Temps total ~ 2 heures 5 minutes soit 3 minutes 23 secondes pour
le groupage d'un échantillon.
NB : on n'a pas comptabilisé le temps du Simonin qui se fait en même temps que
le Beth Vincent
'f}' 2ème jour: sur 30 prélèvements
Temps total : 1 heure 47 minutes soit 3 minutes 30 secondes pour le
groupage d'un échantillon.
'11 3èmc jour: sur 17 prélèvements
Temps total: 1 heure environ soit 3 minutes 29 secondes pour le
groupage d'un échantillon.
({i70 4ème jour: sur 16 prélèvements
Temps total: 1 heure environ soit 3 minutes 45 secondes pour le
groupage d'un échantillon.
NB : Les résultats qui donnent un rhésus négatif sur plaque feront l'objet d'une
recherche de Du par le test de Coombs indirect qui dure environ 1 heure
15 minutes. Et si le test de Coombs se révèle négatif, on passe à la
Réaction de Fixation Elution qui dure environ 2 heures 45 minutes
 25

1/.2- METHODE SUR GEL

11 1cr jour: sur 37 prélèvements

• Numérotation des tubes: Il minutes
• Dilution des hématies et distribution: 1 heure 05 minutes
• Centrifugation: 10 minutes
• Lecture : 13 minutes
Temps total: 1 heure 39 minutes soit 2 minutes 40 secondes par
échantillon.
rff' 2ème jour: sur 30 prélèvements
Temps total: 1 heure 12 minutes soit 2 minutes 24 secondes par
échaptillon.
(Ir 3 ème jour: sur 17 prélèvements
Temps total : 42 minutes soit 2 minutes 28 secondes par
échantillon.
'it' 4ème jour: sur 16 prélèvements
Temps total 35 minutes soit 2 minutes 11 secondes par
échantillon.

111)- DIFFICULTES DIVERSES

/1/.1- METHODE SUR PLAQUE

• 3 discordances entre Beth Vincent et Simonin

• 1 discordance au Beth Vincent
Soit 40/0 d'erreurs avec la méthode sur plaque.

/1/.2- METHODE SUR GEL

Aucune discordance entre le test globulaire et le test sérique.

 26

IV)- COÛT DES MATERIELS ET REACTIFS

IV.1- GROUPAGE SUR PLAQUE D'OPAUNE

CfF Matériel
Tableau IV: Prix du matériel pour technique sur plaque

DESIGNATIONS PRIX (FCFA)

Centrifugeuse 900000
Plaque d'opaline 7 000
Rhésuscope 70000
Bain-marie (grand modèle) 600000
Tubes à hémolyse (boîte de 1000) 18000
Embouts (boîte de 1000) 7000
Coton (1 paquet) 3500
Réfrigérateur 900 000
------~-

Tige en verre 6500

Gants (boîte de 100) 4000
Pipette Pasteur (sachet de 100) 7 500
TOTAL 2519500
~-

'F" Réactifs

Tableau V: Prix des réactifs pour technique sur plaque

DESIGNATIONS (1 flacon) PRIX (FCFA) ---

Sérum-test anti-A 8000
Sérum-test anti B 8000
Sérum-test anti-AB 8000
Sérum-test anti D 18 000
Sérum-test antiglobuline 12 000
Sérum-test anti H - 9000
TOTAL 63000
 27

IV.2- GROUPAGE SUR GEL

CF Matériel
Tableau VI: Prix du matériel pour technique sur gel
~"

DESIGNATIONS PRIX (FCFA)

ID-Dispenser 108000
ID-pipetor 316000
Embouts "ID-tips" (boîte de 1000) 8 000
Tubes courts pour suspension (boîte de 8 000
1000)
Centrifugeuse type "ID-centrifuge 24S" 1 656000
Portoir "ID-working table" 364000
--
TOTAL 2460000

ô" Réactifs

Tableau VII: Prix des réactifs pour technique sur gel

DESIGNATIONS PRIX (FCFA)
Cartes-ID "ABüfRhJCDE/CtI" (48 51 200
cartes)
ID-diluant (flacon de 100 ml) 24 000
Globules-tests Al, B (2 x 10 ml) 24600
r---"
TOTAL 99800
 28

V/Sensibilité et Fiabilité
Pour comparer la sensibilité entre les deux méthodes, nous avons pris comme
référence les tests de confinuation de Coombs et la Réaction de Fixation-Elution
(RFE).
Les sujets Il, 28, 34, 67, 69 et 97 qui étaient Rhésus négatifs avec la méthode
sur plaque se sont révélés positifs avec la technique sur gel, positivités
confirmées par le test de Coombs et la RFE.
Les échantillons 18, 43 et 45 ont fait l'objet de discordance entre la méthode
globulaire et la méthode sérique sur plaque.
Avec le sujet 79, on a noté une différence au Beth-Vincent sur plaque.
Aucune discordaIlce n'a été remarquée avec la technique sur gel.
 29

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~~é
DISCUSSION ~~
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Il
 30

Les résultats de l'étude comparative entre les deux méthodes peuvent être
discutés sous plusieurs angles :

1)- Fiabilité des résultats et sensibilité.

Il apparaît clairement que la méthode sur gel est d'une fiabilité et d'une
sensibilité supérieures à celle sur plaque d'opaline [13].
En effet, au cours de l'étude, aucun cas de discordance n'a été observé entre
les tests globulaires et les tests sériques avec la méthode sur gels ; contrairement
à la méthode traditionnelle (3 cas de discordance entre Beth Vincent et Simonin
et un cas de discordance au Beth Vincent).
Par ailleurs, un résultat de rhésus négatif rendu avec la méthode sur gel est
"sans équivoque'; et jamais "démenti" par les tests de Coombs ou de Reaction
Fixation Elution [15].

2)- Manipulations

Là également, il faut remarquer la simplicité des actes dans les deux

méthodes, mais une amélioration de l'hygiène avec la méthode sur gel [6] de
même qu'une lecture des résultats assez aisée pouvant même être différée [8,
15], un encombrement réduit et une standardisation de la méthode sur gel avec
une moins grande dépendance vis à vis du technicien [6, 8, 14]
La méthode sur gel consomme moins de réactifs avec un protocole assez
précis sur les volumes à utiliser [11, 15].

3)- Le personnel

La technique sur gel nécessite un personnel plus restreint (1 technicien

suffit) que la technique sur plaque qui a besoin d'au moins deux techniciens pour
la manipulation et surtout la comparaison des résultats.
 31

4)- Durée des manipulations

La comparaison du temps nécessaire pour la mise en œuvre de ces deux

méthodes montre nettement que la technique sur gel est considérablement plus
rapide que la technique sur plaque d'opaline [7, 13].
En effet, il existe avec la méthode traditionnelle beaucoup d'autres tests
supplémentaires à effectuer (Coombs, RFE) pour confirmer certains résultats
comme par exemple le rhésus négatif; contrairement à la méthode sur gel qui
donne des résultats "tout faits" [] 0, ] 5].

5)- Le coût des matériels et réactifs

La comparaison pour le matériel montre un coût nettement plus élevé de la

technique sur gel quand on soustrait le prix du réfrigérateur qui n'est pas un
matériel propre à la méthode sur plaque, mais qui peut servir également pour la
conservation des réactifs de la méthode sur gel et même d'autres réactifs de
laboratoires. Dès lors, le matériel sur plaque reviendrait à 1 6] 9 500 FeF A.
Le matériel pour la technique sur gel revient à 2 460 000 FeF A avec des
articles qui sont tous spécifiques à cette technique.
En ce qui concerne les réactifs, il faut remarquer une différence notoire des
coûts que l'on peut dans un premier temps imputer au mode de conditionnement
des réactifs. Aussi, serait-il intéressant de comparer les prix de revient d'un
groupage par rapport au volume des réactifs et cartes utilisés pour un échantillon
à grouper.
Ainsi, un flacon de sérum-test a un volume de 10 ml. Lorsque nous
considérons que chaque échantillon nécessite une goutte de sérum-test d'environ
1001l1, on peut dire qu'une gamme de flacons de sérums-tests (anti-A, anti-B,
anti-AB et anti-D) permet de faire environ 100 groupages.
 32

Si l'on divise le prix de la gamme (en plus de l'antiglobuline et de l'anti-H)

qui est de 63 000 FCFA par 100, nous avons le prix de revient d'un groupage qui
est en moyenne de 630 FCFA.
Bien entendu, un tel calcul reste marqué par une marge d'erreur difficile à
apprécier. En effet, tout dépend du technicien qui manipule et qui n'est pas
souvent soucieux des volumes à utiliser sans compter les groupages à reprendre
çà et là.
Pour la technique sur gel, nous avons adopté le même procédé que
précédemment (c'est à dire le groupage sur plaque) :
Chaque échantillon à grouper nécessite une carte ID. Le prix des 48 cartes
est de SI 200 FCFA, soit 1 066 FCA par carte.
L'ID-diluant, nécessaire pour la dilution des hématies de l'échantillon
revient à 24 000 CFA pour un volume de 100 ml. Chaque échantillon nécessite
un volume de 0,5 ml pour sa dilution. Donc un flacon d'ID-diluant pennet de
faire 200 groupages, soit 120 FCA pour un groupage.
Pour les globules-tests, on a des flacons de 10 ml avec une prise d'essai de
50111 pour chaque échantillon, soit la possibilité de 200 groupages par flacon.
Donc si l'on rapporte au prix, cela revient à 123 FCA (24 600 FCA / 200) pour
un échantillon.
Au total, avec la technique sur gel, le groupage reviendrait à : 1 066 FCFA
(prix moyen d'une carte) + 120 FCA (prix moyen d'une dilution) + 123 FCA
(prix moyen d'un volume de globules-tests nécessaires), soit 1 309 FCA pour le
groupage d'un échantillon.
Donc là également avec les réactifs, le coût est largement plus important
pour la technique sur gel que la technique sur plaque d'opaline. Et cela aurait
indéniablement une conséquence sur le prix de l'analyse que les patients
devraient payer.
 33

6)- La conservation des réactifs

Là également, il y a un inconvénient majeur de la technique sur gel.

En effet, si les cartes contenant les gels peuvent avoir une longue durée de
conservation, les hématies-tests sont caractérisées par leur mauvaise
conservation et leur grande disposition à l'hémolyse [6, 8]. Tandis qu'avec la
méthode traditionnelle les hématies-tests peuvent être quotidiennement
préparées à partir de sang de sujets de groupes connus.
Quand nous prenons en compte nos réalités climatiques (zone tropicale
relativement chaude), économiques et infrastructurelIes (chaîne de froid
généralement défectueuse surtout dans les régions reculées), nous nous rendons
compte de la difficulté à bien conserver ces réactifs de la technique sur gel.

7)- Approvisionnement des réactifs

A l'heure actuelle, il est plus facile de s'approvisionner en réactifs utilisés

dans la technique sur plaque d'opaline. cela pose le problème de la dépendance
vis à vis du fournisseur avec tous les inconvénients liés à un retard en cas
d'urgence, ou de rupture de réactifs dans le laboratoire.
Cependant, cette situation peut changer avec une meilleure représentation
dans notre pays, des laboratoires produisant ces réactifs.
 34

CONCLUSION
 35

En Immuno-Hématologie érythrocytaire, le gel est un "produit mûr" même

s'il reste susceptible de subir au fil du temps de petites améliorations, notamment
dans la formulation des réactifs inclus [6, 12].
Son utilisation dans le groupage ABü / Rh montre une plus grande
fIabilité, une meilleure lecture et surtout une plus grande sensibilité par rapport à
la méthode traditionnelle sur plaque d'opaline [13, 15].
Cette plus grande sensibilité, surtout dans la détection de l'antigène D faible
(Du) par exemple, amène de plus en plus d'auteurs à reconsidérer la notion de
"rhésus négatif'. En effet, il semble plus raisonnable de considérer comme
rhésus positif, tous les échantillons détectés par ces techniques modernes sur gel
[10,15].
Cependant,> les difficultés de conservation des réactifs (surtout les
hématies), mais surtout le coût assez élevé de ces réactifs du gel par rapport à
ceux de la méthode traditionnelle constituent autant de facteurs limitants qui
rendent timides les laboratoires quant à la systématisation des techniques sur gel,
surtout dans un pays comme le Sénégal.
Sur le plan clinique, il n'y a pas un apport de la méthode sur gel qui peut
justifier le remplacement systématique de la méthode traditionnelle. Par
exemple, il n'est jamais dangereux de rendre un rhésus négatif pour un sujet qui
est réellement rhésus positif [3, 9] (à condition que ce sujet soit un éventuel
receveur et non donneur).
Toutes ces considérations, associées à nos réalités socio-économiques font
que les méthodes traditionnelles ont encore de "beaux jours" devant elles, tout
au moins en ce qui concerne le phénotypage dans les systèmes ABÜ / Rhésus;
laissant le champ libre à la technique sur gel, surtout dans la recherche des
anticorps irréguliers et le phénofypage complet [6, 14].
BIBU06RAPHIE
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