Chapitre II.
Techniques et instrumentations
Méthodes d’étude des biomolécules
Démarche
marche d’analyse
d analyse
Plan du cours
1. Introduction
2. Démarche d’analyse
2. 1. But
2. 2. Procédures
2. 2. 1. Echantillonnage
’é
a. Type d’échantillon
b. Préparation de l’échantillon
2. 2. 2. Méthodes d’extraction
a. Extraction liquide/liquide
b. Extraction solide/liquide
c. Extraction solide/solide
2. 2. 3. Méthodes de séparation et de purification
a. Séparation par précipitation
b. Relargage
c. Chromatographie
d. Electrophorèse
2. 2. 4. Méthodes de dosage 1
Substance à analyser
Sang, urine, sol, eaux usées etc.
Prélèvement de l’échantillon
Conservation, Stabilisation et Préparation de l’échantillon
Extraction: isolement du composé à étudier
Extraction liquide/liquide
Extraction solide/liquide
Extraction solide/solide
Fractionnement et Purification
Séparation par précipitation
Séparation par dialyse et filtration 1. Gravimétrie, volumétrie 3. Méthodes enzymatiques
Chromatographie 2. Méthode optique: 4. Méthodes immunochimiques
Electrophorèse Spectrophotométrie d’absorption
Photométrie d’émission
Dosage Fluorimétrie
Néphélométrie
Opacimétrie
Réfractométrie
Polarimétrie 2
Echantillon
Echantillon représentatif Echantillon authentique
Conservation, Stabilisation et Préparation de l’échantillon
Transport Conservation
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Méthodes d’extraction
Extraction liquide/liquide ≠ Distillation fractionnée
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Extraction solide-liquide
Extracteur Soxhlet 5
Extraction solide-liquide
Extracteur Soxhlet 6
Extraction solide-liquide
Sortie de l'eau de refroidissement
Condenseur
Entrée de l'eau de refroidissement
Adaptateur d'expansion
Corps en verre ou
Corps de l’extracteur
Haut du siphon
Filtre (cartouche poreuse)
Tube d'adduction
(Retour de distillation ) Sortie du siphon
Ballon à col rodé
Agitateur magnétique
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Extracteur Soxhlet
Extraction solide-liquide
Extraction solide/liquide: Extracteur soxhlet
(extraction continue)
Quand le ballon est chauffé, les vapeurs de solvant
passent par le tube adducteur, se condensent dans
le réfrigérant et retombent dans le corps de
l'extracteur, faisant ainsi macérer le solide dans le
solvant (chauffé par les vapeurs se trouvant en dessous).
Le solvant condensé s'accumule dans l'extracteur jusqu'à
atteindre le sommet du tube siphon qui provoque alors
le retour du liquide dans le ballon, accompagné des
substances extraites, et le solvant contenu dans le
ballon s'enrichit donc progressivement en composés
solubles.
Le solvant continue alors de s'évaporer, alors que les
substances extraites restent dans le ballon (leur
température d'ébullition doit être nettement supérieure à
celle du solvant extracteur)
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Extraction solide-liquide
Chromatographie sur Colonne
Equilibration de la colonne → travail en
tampon et force ionique adéquats.
Conditionner de la cartouche en faisant Exemple: extraction ou purification des ADN
percoler un volume donné de solvant ou de
plusieurs solvants afin d’activer le support.
La cartouche ne doit pas sécher avant le
dépôt de l'échantillon.
Fixation de la molécule à purifier.
Déposer l'échantillon goutte à goutte.
Lavage de la colonne → on élimine ce qui
n’est pas fixé. Laver la cartouche pour
éliminer les composés inutiles en faisant
passer un solvant éluant les composés
indésirables sans éluer le composé à doser.
(Il est possible de faire un séchage en
laissant le vide pendant plusieurs minutes).
Elution → on décroche ce qui a été fixé
Eluer les composés avec un faible volume de
solvant approprié
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Groupe silanol (Si-OH)
Surface structure of silica gel, dry and hydrated
En surface, des groupes silanol (Si–OH) subsistent et sont responsables de la très
forte polarité du gel de silice. En présence d'eau, cette surface s’hydrate ce qui provoque
une diminution de la polarité.
Solvant apolaire
Ces solvants n'influencent pas, ou très peu, la réaction. Ils sont souvent insolubles à l'eau.
Exemple: hexane, benzène, toluène. Les solvants aprotiques apolaires constituent les
solvants de référence. Ils ne solvatent pas les molécules en fonction des charges portées
par celles-ci.
Solvant polaire
Ces solvants peuvent former des liaisons hydrogène, possèdent un fort pouvoir ionisant
et un pouvoir séparateur élevé. Ils sont souvent solubles à l'eau. Exemple: H2O, alcools,
acides carboxyliques. Les solvants protiques polaires solvatent les molécules chargées. Ils
solvatent très fortement les anions grâce à des liaisons hydrogènes. Ceux-ci deviennent
isolés et donc sont peu réactifs dans ce type de solvant. Les cations sont aussi solvatés
par le pôle électronégatif du solvant. Cette solvatation est moins forte qu'avec une liaison
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hydrogène. Les cations sont modérément réactifs.
Extraction solide-solide
SPME
Enfleurage
MicroExtraction sur Phase Solide
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Extraction solide-solide
SPME
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MicroExtraction sur Phase Solide
SPME
La première étape: Extraction
(absorption ou adsorption)
Cette phase solide est un film polymère
(longueur 1 cm, épaisseur 7 à 100 mm)
enrobant une fibre en verre de silice
(diamètre 100 mm), l’ensemble étant
protégé dans une aiguille creuse amovible.
L'aiguille amovible a pour rôle de percer le
septum du flacon contenant l'échantillon à Fibre en verre
analyser ; la fibre est alors déployée hors de de silica Film polymère
l'aiguille et plongée, soit directement dans Aiguille creuse
l'échantillon, Les solutés se concentrent amovible
alors dans la phase solide polymère.
La seconde étape Désorption thermique
des solutés adsorbés. Pour ce faire, la fibre
de silice, recouverte du film polymère et
protégée dans l'aiguille creuse, est plongée
dans un injecteur CPG chauffé. Une fois
dans l'injecteur, la fibre est à nouveau
déployée hors de l'aiguille creuse
protectrice et les solutés sont alors
rapidement relâchés et transférés vers la
colonne de CPG pour analyse.
Ce système permet une analyse à la fois en cours d'extraction en fin d'extraction
qualitative et quantitative. 13
Fibre SPME
Extraction solide-solide
Extraction Désorption
(absorption ou adsorption)
Analyse qualitative et quantitative (CPG ou HPLC) 14
Centrifugation
La force de pesanteur descendante Fp
La poussée d'Archimède ascendante Fa
Une force de friction Fv
La force centripète F'c
La force centrifuge Fc
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Evaporation rapide
Réfrigérant 3
Dispositif fait
tourner le ballon
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1 Ballon
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Ballon réceptacle
Évaporateur rotatif ou Rotavapor 16
Un bain-marie d'eau afin de chauffer la
solution à concentrer
Un ballon 1 dont la forme est adaptée.
Un réfrigérant qui condense les gaz
Un ballon réceptacle dans lequel les
gaz condensés sont recueillis.
Un dispositif qui fait tourner le ballon
suivant son axe de symétrie afin de
permettre une homogénéisation du
milieu et une évaporation tranquille.
Évaporateur rotatif ou Rotavapor
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