TP N°: 01
Initiation au laboratoire de
microbiologie
Dr. LOUNAS A.
Laboratoire?
Définition :
Local aménagé pour effectuer des recherches
scientifiques, des analyses biologiques.
Classification des laboratoires :
Groupes de risque Spécification
Groupe de risque 1 (risque faible ou nul pour Micro-organismes non pathogènes.
les individus ou la collectivité)
Groupe de risque 2 (risque modéré pour les Germe pathogène capable de provoquer une maladie humaine ou animale
individus, faible pour la collectivité) mais qui ne présente vraisemblablement pas un sérieux danger pour le
personnel de laboratoire, la collectivité, le bétail ou l’environnement. Une
exposition en laboratoire est susceptible d’entraîner une infection grave,
mais qui peut être traitée ou prévenue efficacement; par ailleurs le risque de
propagation de l’infection est limité.
Groupe de risque 3 (risque important pour les Germe pathogène qui cause habituellement une grave maladie humaine ou
individus, faible pour la collectivité) animale, mais qui ne se transmet généralement pas d’un individu à l’autre. Il
existe un traitement et des mesures préventives efficaces.
Groupe de risque 4 (risque important pour les Germe pathogène qui cause habituellement une grave maladie humaine ou
individus comme pour la collectivité) animale et peut se transmettre facilement d’un individu à l’autre, soit
directement, soit indirectement. Il n’existe généralement ni traitement, ni
mesures préventives efficaces.
Tableau 1. Classification des micro-organismes infectieux par groupe de risque
Classification des laboratoires :
Groupe de risque Niveau de sécurité Type de laboratoire Pratiques de Appareillage de
laboratoire sécurité
1 De base-niveau de Enseignement de base BTM Aucun ; palliasse sans
sécurité biologique 1 protection
2 De base-niveau de Services de santé BTM et vêtements palliasse sans
sécurité biologique 2 primaire ; laboratoires protecteurs ; logo de protection et BTM
d’analyse ou de risque biologique contre le risque
recherche d’aérosols
3 Confinement-niveau Diagnostic spécialisé ; Comme niveau 2, + ESB ou autres moyens
de sécurité biologique recherche vêtements spéciaux, de confinement
3 accès réglementé et primaire pour
flux d’air dirigé. l’ensemble des
activités.
4 Confinement haute Manipulation des Comme niveau , plus ESB Class III,
sécurité- niveau de germes pathogènes sas à air à l’entrée, autoclave à deux
sécurité biologique 4 dangereux douche à la sortie, et portes.
élimination spécifique
des déchets.
Tableau 2. Rapport entre groupe de risque et niveau de sécurité biologique
Consignes de sécurité
Le port de la blouse est obligatoire
Se laver les mains avant et après manipulations
Délimiter le plan de travail, autour du bec bunsen.
Décontaminer le matériel septique à la fin des manipulations.
Décontaminer le plan de travail à la fin des manipulations.
Milieux de culture :
•Identifiés sur le fond
•Déposés à l’endroit dans l’étuve
•Transportés dans des portoirs (bouillon) ……
Ne jamais approcher de substances inflammables près de la
flamme…
PRESENTATION DU
LABORATOIRE
Gros Equipements : Etuve, poupinel,
autoclave, hotte, microscope, réfrigérateur...
Petit Matériel :
* Matériel volumétrique et de manipulation des liquides : fioles jaugée,
éprouvette, pipette, micropipette, burette, poire en caoutchouc.
* Matériel de filtration et de séparation : entonnoir, papier filtre quantitatif et
qualitatif, papier Joseph.
* Instruments : support trépied, pince, anse de platine (anse d’inoculation), boite à
coloration, boite de stockage de lame et lamelle, portoirs, balance.
Autoclave
Poupinel
Poupinel
Etuve (incubateur)
Etuve (incubateur)
Hotte
Hotte
Microscope optique (M.O)
Microscope électronique à balayage
Microscope électronique à
transmission
STERILISATION ET
DESINFECTION
TERMINOLOGIE :
Désinfection : Opération permettant de tuer ou d’inactiver momentanément les
bactéries ou les virus. La désinfection est valable seulement au moment où elle est
pratiquée. Elle ne reste active que dans un laps de temps relativement court.
Stérilisation : Processus par lequel on tue ou élimine les micro-organismes et les
spores de toute nature aboutissant à un état d’asepsie.
Décontamination : Tout processus destiné à éliminer ou tuer des micro-
organismes. Ce terme désigne également l’élimination ou la neutralisation
de produits chimiques ou radioactifs dangereux.
STERILISATION
Différentes techniques existent :
• Stérilisation par chaleur sèche
• Stérilisation par chaleur humide
• Stérilisation par les gaz
• Stérilisation par filtration
• Stérilisation par radiations
STERILISATION PAR CHALEUR
SÉCHE
Flambage :
Fils de platine
Pipettes Pasteur …..
STERILISATION PAR CHALEUR
SÉCHE
Four Pasteur (poupinel) :180°C pd 90 min
Températures :
210° pendant 20 min.
180° ‘’ 90 min.
160° ‘’ 2 h
140° ‘’ 3 H
STERILISATION PAR CHALEUR
SÉCHE
Four Pasteur (poupinel) :
son utilisation est :
Possible sur :
matériel métallique (instruments de dissection) pouvant tolérer de
très hautes températures.
filtres, mortiers, …
verrerie sauf verreries de précision qui peuvent subir des
déformations entraînées par la dilatation.
Inutilisable sur :
caoutchouc
matières plastiques
milieux de culture et tous les liquides
STERILISATION PAR CHALEUR
HUMIDE
Autoclave (Autoclavage) : Tue les cellules végétatives et les
endospores.
La durée de son utilisation est variable en fonction :
Du milieu
De la température utilisée
Du volume des récipients
Exemples :
Milieux de culture : 120° C pendant 20 min.
Textiles 135° C ‘’ 10 min.
Instruments 135° C ‘’ 10 min.
Température et pression sont interdépendantes :
100° C → 1,006 bar
120° C → 2 bars
143° C → 4 bars
STERILISATION PAR FILTRATION
STERILISATION PAR FILTRATION
Diamètre du filtre de 0,2 μm = micro-
organismes trop gros et sont donc retenus par
le filtre.
Intéressante lors d'utilisation de solutions
thermolabiles :
acides aminés
Vitamines
hormones de croissance
acides nucléiques
une bonne partie des antibiotiques.
STERILISATION PAR RADIATION
Rayons UV : utilisés au lab
décontamination de l’air
décontamination des paillasses
Décontamination des hottes….
Rayons X, σ :
Stérilisation industrielle des boites de Pétri en matière plastique et
de produit pharmaceutiques.
STERILISATION PAR LES GAZ
(Agents chimiques)
Exp :
Formol (Formaldéhyde).
Oxyde d’éthylène (stérilisation industrielle)
Utilisation :
stérilisation des salles de travail
destruction des germes portés par des instruments
souillés.
stérilisation des lames et la verrerie qui ne passe pas en
autoclave.
DESINFECTION
Différentes techniques existent :
Moyens physiques :
Chaleur : Tyndallisation, Pasteurisation
radiation.
Moyens chimiques :
Antiseptiques
Désinfectants.
DESINFECTION
Pasteurisation :
Traitement à chaud de liquides
Tuant des pathogènes mais pas forcément toutes les bactéries
Les températures se situent entre 63 à 85°C selon la nature du
produit.
On distingue :
Pasteurisation basse : 63° C pendant 30 min
Pasteurisation haute : 72° C pendant 20 sec
Flache pasteurisation (UHT) ou upérisation : 135-150 °C pendant 2-
3 sec (procédé de stérilisation).
N.B : ces valeurs sont relatives à la pasteurisation du lait.
DESINFECTION
Tyndallisation :
Permet d'éliminer du milieu les formes de résistance des bactéries que
sont les spores.
Utilisée notamment pour la conservation de la viande.
24 h 24 h
1ère 2ième 3ième
chauffage chauffage chauffage
T° : 60-70°c T° : 60-70°c T° : 60-70°c
Durée : 30 à 60 min Durée : 30 à 60 min Durée : 30 à 60 min
DESINFECTION
Agents chimiques :
Antiseptiques : utilisés sur les tissus vivants.
Exp : alcool à 70°, Eosine, iode, eau oxygénée.
Désinfectants : utilisés sur la substance inerte.
Exp : eau de Javel, crésol, ammonium quaternaire…
Merci