Réunion d’information

ADRIANOR 26 septembre 2013

Comment valider vos procédures de

nettoyage et désinfection?
INRA, UR 638 PIHM
369 rue Jules Guesde, 59651 Villeneuve d’Ascq
+33 (0)3 20 43 54 24
Faille C., Clarisse M., Zundel S., Villain M., Derache E.
Qu’est-ce qu’un biofilm?

.2
Qu’est-ce qu’un biofilm?
 Communauté de micro-organismes fixés à une surface, enchâssés
dans une matrice d’exopolymères
 Processus naturel
 Structure vivante, dynamique, en perpétuel
remaniement
 Dominant en milieu hostile
 Structure et physiologie du biofilm =>
conditions d’organisation sociale proches
de celles qu’établissent entre elles les
cellules eucaryotes au sein des tissus

.3
Qu’est-ce qu’un biofilm?
 Mode de vie ubiquitaire
 Observé sur tous types de surfaces
 tissus animaux & végétaux
 matériaux chimiquement inertes
 Observé pour tout milieu de suspension
 air
 liquide
 aliment

.4
Les biofilms en IAA…

.5
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
 Chaînes de transformation des aliments : rôle majeur dans la
contamination des produits
 1996-1998: 40% des TIAC = conséquence d’une contamination des
équipements (Haeghebaert, 2001)
 + récemment: ~ 25% des infections par les aliments dues à une
contamination durant le procédé de transformation
Japon 2000: > 14 000 personnes malades par consommation de lait
contaminé (vanne encrassée)
 Problème domestique
 Surfaces des cuisines à l’origine de nombreuses contaminations
30% des salmonelloses
nombreuses épidémies à Campylobacter, E. coli O157

.6
Où trouve-t-on les biofilms en IAA
 Ateliers (viandes, poissons, fromages, etc.)
 Équipements
 Murs, sols
 Aération, air conditionné, écoulement des eaux usées, siphons
 Équipements fermés (produits laitiers, etc.)
 Circuit de fabrication
 Conditionnement
 Circuit de nettoyage
 Cuisines collectives ou non
 Surfaces en contact direct ou non avec les aliments
 +/- Éponges, torchons

.7
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
 Aliments / ingrédients
 Feuille de salade

.8
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
 Surfaces d’équipements

 Industrie de la viande
=> Surface de réfrigérateur
ex: Listeria monocytogenes

 Pisciculture
=> Surface de bassin
ex: Yersinia ruckeri

.9
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
 Domestique, restauration

 Planche de découpe

 Eponge

.10
Les biofilms en environnements agro-alimentaires
 Domestique, restauration

 Torchons

.11
Spécificités de ces biofilms

.12
Bactéries capables de se développer dans les
conditions difficiles rencontrées en environnement
d’ateliers
(dessiccation, présence de sel, pH acides, T° basses, …)

Surface de réfrigérateur dans l’industrie de la viande

Fromagerie
[ NaCl] + pH acide
.13
Bactéries capables de résister aux procédures de
nettoyage et de désinfection
Rôle de la bactérie
• Propriétés de surface
• Structure du biofilm (3D, exopolymères)

Rôle du matériau
• physico-chimie de surface
• topographie

.14
Exemples de micro-organismes pathogènes en
biofilms d’environnement agroalimentaire
 L. monocytogenes (biofilms mixtes, adaptation au froid)
 acier, polymères (tapis convoyeurs, bacs saumurage), bois (maturation
fromage), siphons
 filière lait, viande, poissons, légumes
 Salmonella spp.
 acier, ciment, polymères, verre
 filières volaille, viande (abattoirs), eau
 E. coli
 acier (couteaux), polymères (tapis convoyeurs)
 filière viande
 Bacillus cereus… (cellules végétatives et spores)
 acier (conduites, tanks, remplisseuses), polymères (joints), papier
 filière lait, légumes
.15
Exemples de micro-organismes d’altération en
biofilms en environnement d’IAA
 Pseudomonas spp. (biofilms hébergeant Listeria, Salmonella)
 sols, aliments (viande), siphons, eau
 filière lait (bas pH), viande, légumes, fruits
 Bactéries lactiques
 Lactobacillus sake (viande)
 Carnobacterium spp. (lait, viande, poisson)
 Bactéries thermorésistantes

.16
Détection de souillures

.17
Choix du protocole

Choix des méthodes de détection de l’hygiène des surfaces

 Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection (CCP

essentiel à sécurité alimentaire) Surveillance au minimum quotidienne

 Établissement de la validité des méthodes de surveillance pour établir si

 pas de dérive
 corrélation entre réponse du test et qualité hygiénique de surface :
Périodicité moindre (1-2 fois/semaine)

.18
Caractéristiques du test à prendre en compte?
 Vitesse
 Tests biochimiques.
Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection.
 Sensibilité, exactitude
 Tests microbiologiques, PCR, visualisation directe des surfaces
Établissement de la validité des méthodes de surveillance
 Simplicité
 Facilité de mise en œuvre ou automatisation complète
 Reproductibilité
 Influence du manipulateur…
 Coût
 Méthodes par contact…
 Technique reconnue
 Publiée ou testée par organismes reconnus
.19
Caractéristiques de la souillure à prendre en compte?
 Constituants du biofilm
 Microorganismes / matière organique / matière minérale
 Etat des microorganismes
 Vivants et cultivables
 VNC
 Morts
Où se situe le biofilm?
 Accessibilité ou non
 Surface place lisse / recoin / surface rugueuse

Pop. totale

Pop. Viable (CTC+)

Pop. cultivable

Prélèvement de surfaces en ateliers .20

de la filière fromage (Alliot, 1999)
Cadre de l’étude

Contrat en partenariat avec l’ADRIANOR et l’ADRIANORMANDIE, et

des PME agroalimentaires
 Projet DIAMS (DRAF) : Diagnostic Autocontrôle Mesure des Souillures.

Objectif
 Diagnostic de la pertinence des produits et procédures d’autocontrôle sur la
détermination du niveau d’encrassement par des souillures complexes à l’issue
des opérations de nettoyage et désinfection

.21
Outils de contrôle de l’hygiène des surfaces
Evaluation de l’hygiène des surfaces

Souillure

Microbiologique Non microbiologique

(viable cultivable)

Tests par frottis Tests par

Visuel Bioluminescence Protéines EPS NADPH Allergènes
empreintes
Cytométrie Sucres
Lipides

Ecouvillons Boîtes contact Microscopique Non

Eponges Lames contact microscopique
Chiffonnettes Films

.22
Approche expérimentale

.23
Méthodes d’étude
Biofilms
 3 souches bactériennes (IAA)
• Pseudomonas fluorescens D3-276 (produits laitiers)
• Escherichia coli CECT 434 (légumes)
• Bacillus cereus CUETM 98/4 (produits laitiers)

Matériaux 1 6 2
 Très répandus dans les IAA
• Acier inoxydable 304 2B (1)
• Acier inoxydable 304 2R (2)
• Polyéthylène (3)
• Polypropylène (4)
4 3 5
• Téflon (5)
 Verre (6)

.24
Propriétés des matériaux

Verre Acier inoxydable 2R Acier inoxydable 2B

Polypropylène Téflon Polyéthylène

Acier Acier
Verre Polypropylène Téflon Polyéthylène
inoxydable 2R inoxydable 2B
Rugosité moyenne
<0,01 0,02 0,13 0,14 0,45 11,61
Ra (µm)
Angle de contact à .25
25,5° 43,0° 50,3° 97,1° 113,0° 89,0°
l’eau
Mode opératoire

Production de biofilms

Immersion horizontale
Incubation 24 h à 25°C
Méthodes test Coloration

Tests microbiologiques Tests microbiologiques

Tests biochimiques Observation
par frottis par empreintes

incubation
48 h à 30°C

Dénombrement

.26
Décrochement par frottis

.27
Outils de décrochement
 Ecouvillons (différentes « tiges », différents matériaux de prélèvements…)
 Coton (Copan)
 Rayonne (Copan)
 Fibre de Polyester (Texwipe)
 Nylon floqué (Quantiswab, Copan)

.28
Outils de décrochement
 Mousse Polyester biseautée (Enviro-Swab, 3M)

 Eponge (Sponge Stick, 3M)

 Chiffonnette (Grosseron)

.29
Efficacité des outils de prélèvements, rôle du matériau

Verre Inox 2R Inox 2B Polyéthylène Polypropylène Téflon

Coton
Rayonne
Polyester
Quantiswab
Enviroswab
Eponge
Chiffonnette
Outils les plus performants: Outils les moins performants:
Résultats les plus élevés sur P. Résultats les plus faibles sur P.
fluorescens et E. coli fluorescens et E. coli

Eponge : test parmi les plus performants quelque soit le matériau

Quantiswab, Enviroswab, chiffonnette performants sur verre et aciers
+/- polypropylène
Ecouvillons en rayonne et polyester, voire coton : peu performants
même sur acier inoxydable
.30
Intérêts/inconvénients des prélèvements par frottis

 Autorisent des analyses ultérieures variées

 Facilité de mise en œuvre
 Consommables bon marché
 Analyse de zones +/- accessibles
 Récupération +/- bonne de la souillure (- 1 log / microscopie)
 Influence du manipulateur

.31
Méthodes par contact

.32
Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact

 Géloses contact:
 Pétrifilms™ (Coliformes et
Flore Totale, 3M)
 Lames bifaces gélosées
(Coliformes et Flore Totale,
LiofilChem)
 Boîtes contact (Flore Totale,
ATL)
 Résultats proches pour les 3
méthodes

.33
Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
Boites contact (RODAC, ATL)
 Gélose présentant ménisque convexe
 Reproductibilité de pression et durée => applicateurs

Applicateur (500 g, 10 s)

.34
Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
PétrifilmTM 3M
 Double film
• partie inférieure contenant un milieu déshydraté
(réhydratation de 30 min à 1-2 h)
• film supérieur quadrillé pour le dénombrement
 Reproductibilité de pression et durée => applicateur
 Lecteurs automatiques disponibles commercialement

.35
Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
Lames gélosées (LiofilChem)
 Lames biface (milieux différents)
 Application manuelle

Incubateur
.36
Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
Intérêts / inconvénients
 Facilité d’utilisation
 Empreinte d’une surface => localisation précise d’une contamination
 Consommables bon marché (1-2 €) +/- mini-étuves, applicateurs et
portoirs commercialement disponibles
 Accessibilité nécessaire
• Géométrie
• Surfaces plates et lisses [boîtes contact]
 Récupération partielle des souillures
• Bonne sur surface mouillée, moins bonne parfois sur surface sèche
• +/- reproductible [ex : lames gélosées, pas d’applicateur]
 Incubation longue (24 h à 72 h)
 Problème des cellules mortes et VNC, de résidus bactéricides
.37
Méthodes biochimiques

.38
Outils biochimiques

Méthodes par frottement + analyse (Kit)

Principe
 Prélèvement par écouvillon et dosage direct (colorimétrique…)
• des protéines +/- sucres réducteurs
• des sucres
• de l’ATP, NADP
• de résidus alimentaires

.39
Outils biochimiques

 Protéines :
 Clean-Trace Plus (3M)
 Clean-Trace Instant (3M)
 Pro-Clean (Hygiena)
 Rida et Path-Check (R-Biopharm
/ Microgen)
 Flash (Biocontrol)

.40
Outils biochimiques
 Protéines, sucres et lipides :
 Clean Test (LiofilChem)

 Glucose/lactose :
 Spotcheck Plus (Hygiena)

 NAD(P)/NAD(P)H :
 Speed Check (Ecolab)

 Résidus alimentaires :
 Vericleen (Charm)

 EPS sur surfaces d’acier :

 Biofilm Detector Kit (REALCO)

.41
Outils biochimiques

Bilan efficacité
Spotcheck Plus (lactose /glucose) pas adapté aux biofilms
Vericleen et Flash : les moins performants surtout sur le Polyéthylène

1: Témoin (pas de biofilm)

2: Résultat positif orangé
- +
1 2 3
3: Résultat positif violet

Tests positifs demandant une certaine expertise

 Clean Trace Instant (3M) : lecture très rapide parfois nécessaire
 Biofilm Detector Kit sur acier (REALCO) : étape de « nettoyage » de la surface
 ProClean (Hygiena) : tige très souple, prélèvement parfois inférieur à celui des
autres kits
.42
Outils biochimiques
Bilan efficacité
 Tests positifs, lecture facile :
 Speed Check (Ecolab) : changement de couleur très net

 Ridacheck, Pathcheck (R-Biopharm / Microgen)

 Clean trace Plus (3M), Clean Test (LiofilChem)

.43
Outils biochimiques

Intérêts / inconvénients
 Meilleure accessibilité que méthodes par contact
 Très rapides (qq secondes à qq minutes)
 Très faciles à mettre en œuvre (avec gabarit usage unique [~1 €] ou acier [~25 €])
 Sensibilité faible: qq µg  qq 10aines µg (selon auteurs)
 Influence du manipulateur (pression appliquée, schéma de prélèvement)
Conclusion

.45
 Méthodes biochimiques : méthodes rapides, relativement
sensibles, bon complément aux méthodes microbiologiques
pour détecter des biofilms sur des surfaces