République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche
Scientifique
Université Abdelhamid Ibn Badis Mostaganem
Département de biologie
Module : Biochimie et physicochimie appliquée
Spécialité : biochimie appliquée
TP : 01
HPLC
Présenté par
ADAIDA Hadjer
BENAICHA Zineb
DERBAL Souad
Définition : HPLC (High performance liquid chromatography) est l'une des techniques les
plus employées dans les laboratoires d'analyses chimiques. Elle permet l'identification, la
séparation et le dosage de composés chimiques dans un mélange.
Principe :
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est
introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne
chromatographique.
La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique.
Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique.
Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la
phase stationnaire.
En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont
caractérisés par un pic. L'ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.
La phase mobile :
Si la phase stationnaire (colonne) est polaire, on utilise un solvant peu à pas polaire
(phase mobile). C'est la chromatographie en phase normale
Si la phase stationnaire (colonne) est apolaire ou peu, on utilise un solvant polaire. C'est la
chromatographie en phase inversée.
Les solvants d'HPLC sont donc classés suivant leur polarité et leur force éluante. Dans le cas
des colonnes en phase inverse, on utilise le plus souvent un couple de solvant eau/
acétonitrile ou eau/méthanol. L'acétonitrile, bien que plus coûteux permet d'obtenir
généralement une meilleure efficacité.
Le facteur de rétention k est proportionnel au pourcentage en eau de la phase mobile et la
fonction log k = f (%eau) est linéaire. Une élution optimale s'effectuera pour des valeurs de k
comprises entre 2 et 10.
L'optimisation consiste à réaliser plusieurs injections d'une solution contenant les composés à
éluer en faisant varier le %eau dans la phase mobile, Il suffit ensuite de tracer logk =f (%eau)
pour déterminer les conditions idéales d'élution.
La phase stationnaire :
Elles se présentent sous la forme d'un tube d'une dizaine de cm en acier d'un diamètre de 2 à 5
mm. Cependant des colonnes capillaires sont de plus en plus utilisées (ID = 1 mm).
Une colonne de garde est généralement placée avant la colonne ce qui permet de la préserver
d'éventuels polluants qui resteraient en tête de colonne.
Un filtre est également installé en sortie de pompe pour éliminer toutes les particules solides
qui pourraient obstruer la colonne.
La phase stationnaire : elle est le plus souvent en gel de silice [SiO2-x/2(OH)x]n(H2O)p qui est
par la suite greffée pour améliorer les propriétés
La plupart des colonnes actuelles utilisées en HPLC sont peu polaires et hydrophobes. Elles
sont dîtes à phase inverse.
Parmi elles, les colonnes de type C18 sont les plus courantes. Le terme C18 correspond à un
greffage d'une chaîne carbonnée de 18 carbones (CH2)17-CH3 sur le gel de silice. Les phases
stationnaires C8, un peu moins apolaires sont également très largement utilisées.
Toutefois, les colonnes fonctionnant en mode HILIC permettent désormais de séparer des
composés polaires.
Les colonnes sont classées selon l'hydrophobicité de la phase stationnaire. Malgré tout le
choix d'une colonne pour une analyse donnée peut s'avérer compliquée étant donné le nombre
de produits disponibles. Le plus simple est donc de demander directement conseil au
fabricant.
Détecteur :
Il existe plusieurs types de détecteurs :
détecteurs spectroscopiques :
o par spectroscopie d’absorption : ultraviolet-visible ou infrarouge,
o par spectroscopie de fluorescence ;
réfractométrie ;
détecteurs électrochimiques (DEC) :
o ampérométriques,
o coulométriques,
o polarographiques,
o potentiométriques ;
conductimétrie ;
UV à barrette de diodes (DAD) ;
évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL) ;
détection spectrale avec couplage :
o à la spectrométrie de masse (MS), exemples : chromatographie en
phase gazeuse-spectrométrie de masse et chromatographie en phase
liquide-spectrométrie de masse ;
o à la spectroscopie atomique.
Conclusion :
La chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou simplement
La chromatographie en phase liquide (CPL) ou liquid chromatography (LC) est une technique
séparative utilisée en analyse quantitative, qualitative et principalement employée dans le
domaine de la chimie analytique comme outil scientifique majeur mais aussi dans des
domaines variés tels que la Toxicologie et la Biochimie.