La Chromatographie Liquide

à Haute Performance

Prof. Yacine BADJAH

 La chromatographie liquide

C’est la première méthode chromatographique décrite

(comme méthode non instrumentale)
Comme l’échantillon n’a pas besoin d’être vaporisé
pour être analysé, pratiquement tous les composés
chimiques peuvent être étudiés par chromatographie
liquide
Le développement de l’instrumentation en
chromatographie liquide a eu lieu après la
chromatographie gazeuse à cause des difficultés à
automatiser l’opération (obtention d’un débit stable de
solvant, mise au point d’une méthode de détection
efficace et sensible des différentes classes de solutés,…)
 Un peu d’histoire:
Naissance « officielle » de la chromatographie:
le 21 Mars 1903 à Varsovie
Ce jour-là, Mikhail Semenovitch TSWETT (un botaniste russe) a présenté
à un congrès de la Société Polonaise de Sciences Naturelles une
communication intitulée: « Une nouvelle classe de phénomènes
d’adsorption et leurs applications en analyse biochimique » portant sur la
purification de pigments végétaux (chlorophylle) sur une colonne de craie
1938 : REICHSTEIN explique le principe de l'élution et de la
séparation des composés dans une colonne
1952 : l'utilité des gradients d'élution est montrée
1967 : grâce aux travaux de HUBER et HUZSMAN, le début de la
chromatographie liquide à haute vitesse, plus tard appelée à juste titre
chromatographie liquide haute performance (CLHP)
1969 : après le 5e Symposium International « Advances in
Chromatography » développement rapide de la chromatographie en
phase liquide CLHP ou HPLC
 Principe de la chromatographie liquide

Un liquide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne. Cette

colonne peut contenir un support solide poreux ou non appelé phase
stationnaire
Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du
mélange, appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors
de la traversée de la colonne
De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du
mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que
leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la
colonne les uns après les autres et donc séparés
Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur
permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme
Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de
rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et
détecté) caractérise qualitativement une substance
L'amplitude de chaque pic, ou encore l'aire limitée par le pic et la ligne
de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le
mélange injecté
 Principaux modes en
chromatographie liquide

Il existe plusieurs modes possibles en chromatographie

liquide à haute performance. Ils correspondent chacun à un
type précis d’interaction:

adsorption
partage
échange d’ion
exclusion par taille
 Chromatographie d’adsorption

la phase stationnaire est un solide adsorbant

la rétention est due à un suite de processus
d’adsorption / désorption
 Chromatographie
d’adsorption
O H
la silice et l’alumine sont les Si
phases stationnaires les plus O
utilisées
Si O
le soluté et le solvant peuvent H
être attirés par les sites O
polaires situés à la surface de
Si
la phase stationnaire
adsorbante O H
si les solutés présentent des
Groupements
interactions différentes vis-à-vis
silanols Si-OH à la
de la phase stationnaire, leur
surface de la silice
séparation est possible
 Chromatographie de partage

la phase stationnaire est un liquide déposé ou

greffé sur un support solide
la rétention est basée sur le partage du soluté
entre les deux phases liquides (solubilité relative)
 Chromatographie de partage

les espèces les plus retenues sont celles ayant une

plus grande affinité (solubilité) pour la phase
stationnaire, relativement à la phase mobile (éluant)
la séparation est basée sur les différences entre la
solubilité relative
Il existe deux modes en chromatographie liquide
mode « normal »: phase stationnaire polaire et phase
mobile apolaire, c’est le premier mode décrit
mode « inverse »: phase stationnaire apolaire et phase
mobile polaire, c’est le mode le plus utilisé en
chromatographie liquide
 Chromatographie de partage

l’ordre d’élution des solutés peut être pratiquement inversé avec la

même colonne en utilisant les modes « normal » « inverse »

Exemple:
mode « normal » mode « inverse »
 Chromatographie par échange d’ions

la phase stationnaire possède des groupements

chargés à sa surface
la rétention est basée sur les interactions
d’attraction entre les groupements chargés de la
phase stationnaire et les solutés portant une charge
opposée
 Chromatographie par échange d’ions

dans ce mode on utilise en chromatographie

liquide « instrumentale » des échangeurs d’ions
faibles
ces phases stationnaires sont obtenues par
greffage de groupements chargés échangeurs d’ions
sur un support solide
les résines échangeuses d’ions classiques ne
pourraient pas résister à la pression élevée
 Chromatographie par échange d’ions

Exemple de séparation: analyse des anions inorganiques

détection UV détection par conductimétrie

1- fluorure F-
2- chlorure Cl-
3- nitrite NO2-
4- bromure Br-
5- nitrate NO3-
6- phosphate PO43-
7- sulfate SO42-
 Chromatographie par exclusion (SEC)

dans ce mode la séparation des solutés se fait

d’après leur dimension moléculaire
la phase stationnaire est un matériau poreux
ayant des pores de dimension bien déterminée
ce mode était appelé anciennement
chromatographie par perméation de gel (GPC)
 Chromatographie par exclusion (SEC)

dans ce mode, chaque colonne peut séparer des

molécules de dimension bien déterminée
les espèces ayant une dimension importante ne
pourront pas pénétrer dans tous les pores, elles
auront un trajet plus court dans la colonne et
seront éluées en premier
ce mode est très utilisé dans la détermination des
domaines de taille et de masse des macromolécules
(polymères, protéïnes,…)
 Chromatographie par exclusion (SEC)
Exemple de séparation d’un polymère présentant trois
domaines de masse. Le deuxième groupe correspond à
une plus grande distribution en masse

00
00

.0
25
.0
50

0
00
5.
 Chromatographie par exclusion (SEC)
Exemple de séparation de polystyrènes étalons ayant
différentes masses moléculaires

1- 1.800.000
2- 300.000
3- 100.000
4- 35.000
5- 17.500
6- 9.000
7- 2.000
8- toluène
 Le solvant en chromatographie liquide

la nature de la phase mobile éluante est le

paramètre fondamental en chromatographie liquide
à haute performance
contrairement à la chromatographie gazeuse, les
interactions entrant en jeu sont diverses:

soluté phase
stationnaire
soluté phase mobile
phase mobile phase
stationnaire
 Aspect économique
La chromatographie liquide haute performance est très utilisée
aujourd’hui aussi bien à l’échelle analytique et préparative. Les
frais d’utilisation ne sont pas négligeables. Exemple: comparaison
des coûts entre la HPLC et la cristallisation:

pureté rendement Coût approximatif

Cristallisation 97,5 – 98,6 % 75 – 78 % 150 $/kg
C.L.H.P. 99,5 – 99,7 % 95 – 96 % 250 $/kg

Dans le calcul du coût de l’analyse par chromatographie liquide à

haute performance, le prix du solvant occupe la place la plus
importante. Quelques exemples:

Solvant Méthanol Acétonitrile Tétrahydrofur Hexane Chloroforme Diméthylformami

anne (THF) de (DMF)

Prix ($/l) 15 30 30 45 30 45
 Choix du solvant en chromatographie
liquide

nous nous limiterons au cas des modes « normal »

et « inverse »
l’influence de la nature de la phase mobile est
fondamentale dans ces deux cas
première étape importante avant de déterminer
la nature du sovant:
choix du mode à utiliser:

mode normal ou mode inverse?

 Choix du mode en chromatographie liquide

Règle générale:

si le soluté est insoluble dans l’eau ou apolaire:

 Utiliser le mode normal

si le soluté est soluble dans l’eau ou non soluble
mais polaire:

 Utiliser le mode inverse

N.B.: la situation n’est pas toujours aussi nette,

mais ce raisonnement constitue un bon point de
départ
 Choix de la phase mobile en C.L.H.P.:
il est rare de trouver une phase mobile adéquate
constituée par un « solvant pur »
généralement, l’obtention d’une bonne séparation
nécessite de recourir à un mélange d’au moins deux
solvants
facteurs à prendre en considération:
force du solvant: c’est une mesure de la polarité
relative du solvant (capacité du solvant à déplacer
un soluté sur un support tel que la silice ou
l’alumine)
indice de polarité: permet d’évaluer la polarité
d’un solvant par rapport aux autres
Propriétés de quelques solvants utilisés en C.L.H.P.
Solvant Force du Indice de Viscosité Indice de UV cutoff
solvant ° polarité P réfraction (nm)
n-pentane 0.00 ~0.0 0.23 1.36 210
carbone tétrachlorure 0.18 1.6 0.97 1.47 265
toluène 0.29 2.4 0.59 1.50 285
diéthyl éther 0.38 2.8 0.32 1.35 220
térahydrofuranne 0.45 4.0 - 1.41 220
butanone 0.51 4.7 - 1.38 330
acétonitrile 0.65 5.8 0.37 1.34 210
méthanol 0.95 5.1 0.60 1.33 210

° est donné pour l’alumine

 Mélange de solvants en C.L.H.P.:
on peut obtenir une force éluante ou une polarité
optimale en mélangeant deux solvants différents en
proportion bien définie

Force du solvant °
0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

dichlorométhane CH2Cl2 méthanol CH3OH

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

acétonitrile CH3CN méthanol CH3OH

0 20 40 60 80 100
 Classification des solvants en C.L.H.P.:
Snyder a proposé une classification des solvants utilisés en
chromatographie liquide en fonction de leurs propriétés
chimiques, acides, basiques et polaires:

Classe Familles
I éthers aliphatiques et alkyl amines
II alcools aliphatiques
III THF, pyridines, DMSO, amides
IV formamide, acide acétique, glycols
V dichlorométhane, 1,2-dichloroéthane
VI halogénures d’alkyle, esters, cétones, nitriles
VII benzène et dérivés
VIII chloroforme, crésol, eau
 Classification des solvants en C.L.H.P.
accepteurs de protons
0.2 0.7

0.7 0.2
donneurs
de protons 0.2 dipoles
0.7
forts
Limite d’utilisation des solvants en C.L.H.P.:

Cas où les solvants ne peuvent pas être utilisés en

chromatographie liquide

s’ils ne sont pas miscibles en toutes proportions

en cas de réaction chimique entre eux
si leur absorbance UV est trop élevée
si leur viscosité est trop forte
en cas de toxicité élevée ou inflammabilité
s’ils présentent une pression de vapeur excessive
en cas de prix excessif
 Solvants les plus courants en mode inverse:

méthanol: caractère acide

acétonitrile: caractère basique
tétrahydrofuranne: caractère polaire
eau: permet d’ajuster la polarité du milieu

de plus, tous ces solvants sont caractérisés par:

• une faible viscosité
• une disponibilité avec une pureté élevée
• une bonne transparence en UV
• une bonne miscibilité les uns avec les autres
 Processus d’élution:

 Lors du déplacement le long de la colonne, le front de

chaque soluté subit un élargissement progressif dû à la
diffusion (transversale et longitudinale):

 Le front du soluté sera d’autant plus large que le

séjour dans la colonne est long
 Le chromatogramme:
grandeurs fondamentales

 tM : temps mort (soluté non retenu)

 tR : temps de rétention (temps de séjour dans la

colonne)
 Pic chromatographique:

 supposé gaussien

 écart-type de la gaussienne

 largeur à mi-hauteur
 largeur à la base (intersection
des tangentes aux points d’inflexion)

 En pratique, il est difficile de

déterminer le début et la fin du pic;
on mesure directement tR et 
sur le chromatogramme
 Equations fondamentales:
 Facteur de capacité: définit une rétention relative

k = t’R / tM = (tR – tM) / tM

 Sélectivité d’une colonne:
 = t’R2 / t’R1 = k2 / k1 (>1 car t’R2 > t’R1 )
 Résolution entre deux pics:

RS = 2 (tR2 – tR1) / (= 1,18 (tR2 – tR1) / (

 la séparation est d’autant meilleure que RS est plus grand

 pour deux pics d’aires voisines, lorsque RS est supérieur à 1, la séparation est
pratiquement complète, puisqu’il n’y a alors que 2% de recouvrement
 pour RS inférieur à 0,8, la séparation est généralement insuffisante
 Efficacité d’une colonne:
Les pics étant supposés gaussiens, on peut caractériser l’élargissement des pics,
d’autant plus important que l’efficacité de la séparation est faible, par un
nombre de plateaux théoriques N, semblable à celui rencontré pour la distillation
fractionnée. Pour une gaussienne vraie, N s’exprime des trois manières suivantes:

N = (tR / )2 (: écart-type du pic gaussien)

N = 16 (tR / )2 (: largeur à la base du pic)

N = 5,54 (tR / )2 (: largeur à mi-hauteur du pic)

Pour pouvoir comparer entre elles des colonnes de différentes longueurs, on
définit la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT):

h = L/N (L est la longueur de la colonne)

h peut varier de quelques centimètres (colonnes remplies) à quelques microns
(colonnes capillaires en CPG).
 Résolution entre deux pics 1 et 2:

La résolution entre deux pics successifs peut s’écrire sous l’une des
deux formes suivantes:

équation de Knox

équation de Purnell
 Détermination de la phase mobile optimale:

Une méthode simple permet de déterminer, en quelques

étapes, le mélange optimal de solvants qui donnera les
meilleurs résultats:

a- démarrer l’analyse avec l’un des solvants organiques

mélangé avec l’eau; essayer les compositions binaires à partir
de 0% en eau, jusqu’à l’obtention de la valeur optimale de k’
pour les pics les plus intéressants
b- préparer et tester les mélanges binaires aqueux avec les
autres solvants organiques, de façon à obtenir la même
polarité de phase qu’en a
c- évaluer chacune de ces phases binaires et noter celles
qui améliorent la séparation et l’élution (k’, forme des pics,…)
d- mélanger les phases donnant les meilleurs résultats et
tester la résolution obtenue
 Exemple d’optimisation de la phase mobile:

41% CH3CN – 59% H2O k’ = 5 30% CH3CN – 70% H2O k’ = 10

21% CH3OH – 79% H2O k’ = 10 11% CH3CN – 12% CH3OH –

77% H2O k’ = 10
 Le gradient d’élution en C.L.H.P.:

contrairement à la chromatographie gazeuse, une

variation de la température n’a qu’un effet minime sur
la rétention et sur la séparation en chromatographie
liquide à haute performance
cependant, la polarité de la phase mobile a une
influence déterminante sur la rétention et sur la
séparation
pour cette raison, une variation progressive de la
composition de la phase mobile éluante peut jouer le
rôle de « programmation de solvant » et agir sur la
polarité de la phase mobile au cours de l’analyse
c’est le principe de la chromatographie liquide avec
gradient d’élution
 Le gradient d’élution en C.L.H.P.:

Avantages
réduction du temps d’analyse
amélioration de la résolution des constituants du
mélange
optimisation de la forme des pics
sensibilité accrue

Inconvénients
reproductibilité plus délicate qu’en mode isocratique
possibilité de dérive de la ligne de base
programmation délicate dans certains cas
 Le gradient d’élution en C.L.H.P.:

Il peut être obtenu

soit « pas à pas »: en passant continuellement d’un
solvant à l’autre durant l’analyse
soit de façon continue: la composition du mélange est
progressivement modifiée, comme en programmation de
la température
dans la plupart des cas, le gradient de solvant est de
type « flux combinés », chaque solvant est pompé à part et
mélangé avec l’autre solvant de manière turbulente pour
faciliter l’homogénéisation de la phase mobile
le débit de chaque solvant est contrôlé par le
programmateur de façon que le débit total reste constant
 Le gradient d’élution: domaines d’application

Le gradient d’élution ne peut pas être appliqué à tous les

modes de chromatographie liquide

chromatographie liquide-liquide: difficile

chromatographie sur phase greffée: oui
chromatographie d’adsorption: oui
chromatographie par échange d’ion: oui
chromatographie d’exclusion: non
 Mise au point d’un programme de gradient
d’élution adéquat:

il est toujours conseillé de commencer par essayer le mode

isocratique avant de travailler en gradient d’élution
pour cela, essayer la méthode en 4 étapes décrite
précédemment (choix d’une phase binaire ou ternaire)
si aucun mélange binaire ou ternaire ne donne une séparation
acceptable, l’analyse doit être faite en mode gradient
les résultats obtenus en mode isocratique permettront de
déterminer les compositions initiale et finale
la composition initiale doit avoir une polarité permettant une
bonne séparation des premiers pics du chromatogramme
la composition finale devrait permettre une séparation des
derniers pics en un temps raisonnable
ensuite, il reste à choisir la rampe permettant de passer de la
composition initiale à la composition finale de façon à bien
séparer les constituants restants du mélange