PRODUCTION INDUSTRIELLE DE L’INSULINE
ÉVOLUTION ET DÉFIS
Anne-Laure Hussenot-Bouvet
Directrice Qualité du Campus Insuline Francfort
Académie nationale de Pharmacie - 19.01.2022
INSULINE HUMAINE & INSULINES ANALOGUES
Insuline humaine
Insuline analogue lente ou à action
prolongée
A-Kette
B-Kette
Asp
Insulines analogues rapides
3
PRODUCTION INDUSTRIELLE DE L’INSULINE EN 4 ÉTAPES
1 2 3 4
Préparation des „Banques Production de la matière Répartition aseptique Assemblage des stylos
Cellulaires“ de micro- première de l’insuline: injecteurs à partir des
organismes recombinants cartouches
- Mise en solution du Principe
- Process «Upstream»: Actif
Synthèse du gène codant pour multiplication bactérienne par le - Filtration stérilisante - Assemblage des cartouches
l’insuline procédé de la fermentation dans un stylo injecteur
(environ 48 heures) - Répartition aseptique
- intégration du gène dans - étiquetage and packaging
l’ADN d’une cellule hôte (ex: la - Process « Downstream»: - Inspection et tests d’intégrité
bactérie Escherichia coli) isolation/transformation et
- Création des banques purification (environ 70 h)
cellulaires conservées à
-120°C.
Contrôle Qualité tout au long du process de production
4
ÉTAPE 1
SYNTHESE DU GÈNE CODANT L‘INSULINE ET INTÉGRATION DANS UNE CELLULE HÔTE
Chaine A
• Synthèse du gène codant l‘insuline (insuline humaine et analogues)
Presequence • Intégration du gène dans une cellule hôte
• multiplication des bactéries génétiquement modifiées produisant l‘insuline.
Peptide-C
Chaine A
Chaine B Gène codant Presequence Synthèse du gène codant
l’insuline Peptide-C l’insuline
109 acides aminés
Chaine B
• Origine non-animale pas de risque viral
• Process de fermentation très reproductible
• Croissance très rapide et haut rendement
E. Coli
Protéine de petite structure avec peu de
Insuline risque de dégradation
51 acides aminés
5
ÉTAPE 1
PRÉPARATION DES BANQUES CELLULAIRES DE MICRO-ORGANISMES RECOMBINANTS
Chaine A
Presequence
Peptide C
Chaine B
Synthèse du gène de l‘insuline
E. coli avec le gène de l‘insuline Sélection des clones
Banques Cellulaires Ampoule de bactéries recombinantes
mises dans un bouillon de culture
6
ÉTAPE 2
CARACTÉRISTIQUES DE L‘ÉTAPE DE PRODUCTION DE LA MATIÈRE PREMIÈRE
1-4 Fermentation
• Process « upstream »: Process de fermentation 5 Récupération des cellules
• Process « downstream »:
6 Destruction cellulaire et homogénéisation
• Isolation et transformation 7
Isolation de la protéine fusionnée et rinçage
• Purification 8 Création de ponts bisulfiques
9 Clivage enzymatique
Matière Première très stable 10 Chromatographie d’adsorption
• Procédures de purification très efficaces 11 Chromatographie échangeuse d’ions
• Méthodes chromatographiques orthogonales (chromatographie d’adsorption, échangeuse
12 Chromatographie phase inverse
d’ions, phase inverse)
• Résines de chromatographie performantes 13 Cristallisation ou précipitation / Drying
• Cristallisation et/ou precipitation permettant d’obtenir une matière première stable et
pure. 14 Mélange
• Matière première sèche et stable dans le temps qui doit être conservée en dessous de -15°C
(pendant 3-5 ans)
Matière Première d’Insuline
7
ÉTAPE 2 PROCESS “UPSTREAM“ : FERMENTATION
Laboratoire de microbiologie
1. Culture
Cellulaire
Banque cryogenique
Stock de
cellules bacteriennes
3. Fermentation principale
Induction
4. Inactivation
2. Pre-
fermentation
Process Downstream
8
ETAPE 2 PROCESS “DOWNSTREAM“ : ISOLATION/TRANSFORMATION ET PURIFICATION
Cellule [Link]
Récupération des
5 Centrifugeuse
cellules
Corps d’inclusion
Elimination des débrits
Destruction cellulaire et celullaires et des
6 homogenisation protéines d‘[Link]
(enzymes etc …)
Proteines fusionnées
(Corps d’inclusion concentrés)
Isolation de la protéine Elimination des débrits
7 fusionnée et rinçage céllulaires et des protéines
solubles
Pre-Pro-Insulin
Elimination des protéines de
8 Création ponts la cellule hôte
bisulfuriques
Elimination de la
9 Clivage enzymatique pre-sequence et du peptide-C
9
CLIVAGE DE LA PRE-PRO INSULINE PAR L‘ENZYME DE CLIVAGE
Exemple de formation d’impuretés pendant l’étape de clivage
3
2
3500
1 Glargine
Insulin
3000 des-Arg
Peak Area / -
des-Thr
2500
2000
Le clivage enzymatique se fait sur des acides aminés spécifiques
1500
Clivage correct Mauvais clivage 1000
500
→ Beaucoup d‘impuretés peuvent être causées par de mauvais clivages 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time / h
10
ÉTAPE 2 “DOWN STREAM PROCESS“ : SÉPARATION ET PURIFICATION
Pureté Chromatographie Elimination des endotoxins,
60-70 % 10
d’adsorption enzymes, framents d’ADN. …,
Pureté
Sup 95 %
Chromatographie Elimination des impuretés par
11
échangeuse d’ions échange d‘ions, ADN et
trypsine
Pureté
Sup 99 %
Chromatographie Elimination des impuretés
12 hydrophobiques
phase inverse
Cristallisation/
13 Elimination des sels, des
Précipitation puis
solvants et de l‘eau
séchage
14 Homogénéisation des
Mélange
lyophilisats
11
ETAPE 3 : PROCESS DE REPARTITION ASEPTIQUE
Operation Step
Principe actif (poudre) Dissolution
ajustement du pH
I
très stable
Stockage à -15°C Solution I
Péremption entre 3-5 ans Dissolution II Pre-filtration V
Préparation
Fitration VIa
Répartition
Dissolution III
stérilisante
Repartition VII
Mélange IV
Inspection visuelle VIII
Mélange et ajustement du
pH V
Condtionnement du PSO IX
Insuline pour injection
12
ÉTAPE 3 : PROCESS DE REPARTITION ASEPTIQUE
Cuves contenant la Inspection 600 cart. / min
solution d‘insuline
Filtration stérilisante au point de
répartition
Conditionnement
du PSO
Répartition dans un Rotation des
isolateur (classe A) dans un cartouches avant
Approvisionnement environnement classe D inspection
des cartouches
600 cart. / min
Préparation Bouchons Répartition Inspection visuelle Etiquetage/cdt
13
ÉTAPE 4 : ASSEMBLAGE EN STYLOS INJECTEURS
Produit fini Packaging
Etiquetage
Ligne packaging
cartouches
Assemblage
Dispositifs médicaux connectés
Bouchon du stylo injecteur Corps du stylo injecteur
Cloud
Applications
Rapports 14
DE LA MANUFACTURE A L‘INDUSTRIE 4.0
Robotisation
Standardisation & Performance
des procédés
Contrôle de la contamination
100 ans plus tard
Connectivité
Digitalisation / Intégrité des données
Qualité et Conformité
Innovation
Respect de l’environnement
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