PREPERATION DE L’ADN A CLONER

RAPPELS SUR L’ADN

L’ADN est la molécule essentielle de tous les organismes vivants. Elle porte l’information génétique faisant d’un organisme ou d’une
cellule ce qu’elle est.

La structure de l’ADN (acide désoxyribonucléique) est composées de groupement phosphate lié à un sucre (le désoxyribose) qui est lui-
même fixé à une des 4 bases azotée, A (adénine), C (cytosine), G (guanine), T (thymine). Un groupe « phosphate-sucre-base azotée » constitue un
nucléotide. Les nucléotides sont liés les uns aux autres pour former un brin d’ADN. L’ADN est donc un polymère de nucléotide. Deux brins d’ADN
interagissent entre eux par les bases azotées formant une molécule d’ADN double brin. Cette molécule est similaire à une échelle dans laquelle les
groupements phosphate-ribose constitueraient les montants et les bases azotées formeraient les barreaux. Les deux brins d’ADN dans cette
échelle sont en orientation opposées (antiparallèle). Cette échelle est torsadée donnant la fameuse forme de double hélice à l’ADN double-brin.

La distance entre 2 résidus est de 0.34 nm. 1 tour d’hélice contient 10 paires de bases (3,4 nm). Le diamètre de l’hélice d’ADN est de 2
nm. La taille d’un génome humain est de 3.2 milliard de paires de bases par génome haploïde soit 6.4 milliard de paires de bases réparties sur les
23 paires de chromosomes. Mis bout à bout, cela donne plus de 2 mètres d’ADN par cellule ! Pour empaqueter tout cet ADN dans le noyau, l’ADN
est fortement replié et compresser avec l’aide de protéines pour former la chromatine. L’empaquetage extrême de l’ADN forme les chromosomes
mitotiques.

Historiquement, on doit la mise en évidence d’acides nucléiques (dénommés alors nucléine) à un biologiste suisse Friedrich Miescher en
1869. Phoebus Lavene découvre dans les années 1920 que les acides nucléiques sont constitués de nucléotides et Oswald Avery en 1944 démontre
que l’ADN est le support de l’information génétique. La structure de la double hélice fut découverte en 1953 par Francis Crick et James Watson qui
reçurent le prix Nobel en 1962.

Extraction et purification

L’ADN doit impérativement être purifié à partir de matériel biologiques dans des conditions optimales de qualité et de quantité.

Faire éclater les globules rouge du sang avec un choc osmotique en le mélangeant à une solution hypotonique, récupérer les globules
blancs par centrifugation, ajouter un mélange de détergeant (SDS) et de protéinase K; le détergeant détruira les membranes et la protéinase
digérera les protéines associées à l’ADN, Extraire l’ADN des protéines par un mélange phénol-chloroforme. Le phénol est un excellent agent
dénaturant des protéines et il permet de séparer efficacement les protéines et les acides nucléiques, il est ensuite éliminé par l’extraction avec du
chloroforme, la séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par la centrifugation. La phase aqueuse contient les acides nucléiques.
Les acides nucléiques pouvant être finalement récupérés sous forme solide à la suite de précipitation par l’alcool éthylique absolue froide (- 20°C).
L’ADN précipite sous forme de filaments visibles à l’œil nu qui sont récupérés par enroulement sur une baguette de verre, re-dissoudre l’ADN dans
une solution tamponnée. L’ADN peut être ainsi conservé à 4°C plus d’une année.

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Dosage de l’ADN

 
Le dosage s'effectue par spectrophotométrie dans l'ultra-violet à 260 nm. Il est indispensable de mesurer également l'absorption à 280 nm. Cette
dernière longueur d'onde permet d'estimer la contamination éventuelle de l'extrait par des protéines. L'absorption se définit par l'unité de densité
optique mesurée à 260 nm. Une unité de densité optique à 260 nm correspond à l'absorption d'une solution d'ADN double brin à la concentration
de 50 µg/ml ou à l'absorption d'une solution d'ADN simple brin à la concentration de 33 µg/ml ou encore à de l'ARN à 40 µg/ml.

Conservation de l’ADN

L'ADN : peut être conservé dans un tampon (10mM Tris pH=8) additionné d'EDTA (1mM) à 4°C. A pH 8, la dégradation de l'ADN est notablement
plus faible qu'à pH 7. L'EDTA permet de chélater les ions divalents (nécessaires pour les nucléases) et évitent la croissance de microorganismes.
L'ADN peut être également conservé à -20°C dans le même tampon mais des cycles successifs de congélation/décongélation entraînent des
cassures des acides nucléiques de grande taille (>10kb).

La synthèse in vitro

Dès 1955, Kornberg se penche sur la synthèse de l'acide désoxyribonucléique (ADN). À partir d' Escherichia coli, il parvient, le premier, à
isoler et purifier l'enzyme qui catalyse la formation de l'ADN à partir des désoxyribonucléotides (1958) : cette première enzyme est baptisée ADN
polymérase I. Kornberg et son groupe montrent que la réaction de condensation opérée par l'ADN polymérase I est de type semi-conservatif, car
elle nécessite un fragment d'ADN préformé servant d'amorce et de matrice à l'enzyme.

Dans son mélange réactionnel, Kornberg dispose d’ADN modèle, de précurseurs naturels, de l’ADN polymérase active, auquel il ajoute
des précurseurs radioactifs. Après la réaction, la radioactivité se trouvera partagée entre l’ADN éventuellement synthétisé in vitro (en incorporant
des monomères marqués) et l’excédent de précurseurs qui n’ont pas été incorporés. Il est donc essentiel d’éliminer tous ces précurseurs libres
pour attribuer de la radioactivité à une macromolécule. En pratique, les macromolécules sont précipitées par adjonction d’un acide organique et
les petites molécules « acido-solubles » (y compris les précurseurs radioactifs) sont éliminées par centrifugation. Le culot, après plusieurs lavages,
contient les macromolécules (y compris l’ADN) débarrassées de tous précurseurs non incorporé dans la chaine.

Séparation des acides nucléiques

 Ultracentrifugation

La centrifugation est une technique de séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins
lourdes).

Cette technique a été mise au point par Svedberg (1932), qui l’utilisa pour déterminer des masses moléculaires. Elle fut appliquée à la
biologie par physiologiste Belge Albert Claude (Prix Nobel, 1974), qui isola grâce à elle les microsomes.

A des vitesses de l’ordre de 20 000 tours/mn, il est possible de séparer différents types d’ADN (chromosomique et plasmidique) dans un
gradient de chlorure de césium.

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 Electrophorèse
L’Electrophorèse est une technique qui permet de séparer des molécules en fonction de leur taille et de leur charge en utilisant un
courant électrique. On peut ainsi analyser et purifier dans un milieu gélifié (gel d’agarose, gel polyacrylamide, …) l’ADN, l’ARN, les
protéines.
Les fragments d’ADN après digestion par les enzymes de restriction peuvent être séparés par électrophorèse sur un gel d’agarose. Dans
ce type de gel, les migrations des fragments d’ADN dépendent de la taille du fragment plus que de la charge de celui-ci. Plus le fragment
a une taille élevée moins la migration électrophorétique par rapport au puits d’inclusion sera importante. A l’opposé les fragments de
petite taille auront une distance de migration la plus élevée, la détermination précise des tailles de fragments séparés par électrophorèse
est effectuée en faisant migrer les marqueurs de poids moléculaire parallèle avec les échantillons à analysés, la détection de l’ADN sur ce
type de gel est réalisé par exposition aux rayons UV après réaction avec un réactif spécifique (Bromure d’éthidium, par exemple, agent
s’intercalant entre les brins d’ADN).
L’électrophorèse des fragments d’ADN en gel d’agarose permet des séparations jusqu’à 20 – 25 Kb (20000-25000 pb). Le tampon utilisé
pour la migration électrophorétique à un pH d’basique (par exemple : 8. 3 dans le cas du tampon appelé TBE = TRIS-Borate-EDTA). Des
fragments d’ADN de taille restreinte (inférieur à 1000 pb) pouvant être séparé par l’électrophorèse sur le gel de polyacrylamide.