I.
GENERALITE SUR LA FIEVRE CATARRHALE OVINE(FCO)
[Link]
[Link] INFECTIEUX
[Link]
[Link] ET RECEPITIVITE D’AUTRES ESPECES ANIMALES AU
VIRUS DE LA FCO
2-2-1-ESPECES SENSIBLES
2-2-2-ESPECES RECEPTIVES
2.2-3-MODE DE TRANSMISSION DU VIRUS
2-3-1-TRANSMISSION VENERIENNE
2-3-2-TRANSMISSION VERTICALE
2-3-3-TRANSMISSION HORIZONTALE
I-3-LE VECTEUR
3-1-PRESENTATION
3-2-BIOLOGIE
3-3-CONDITIONS A REUNIR POUR AVOIR LA CAPACITE DE
TRANSMESTTRE LE VIRUS DE LA FCO
3-4-FACTEURS LIES AUX VECTEUR INFLUANT SUR LA
TRANSMISSION DU VIRUS DE LA FCO
I-4-SIGNES CLINIQUES
[Link] NECESSAIRES
[Link] biologique
[Link] technique
[Link] ETAPES DE LA PCR
[Link] de lADN
[Link] de LADN
[Link]
1
IV- ELECTROPHOSE SUR GEL
D’AGAROSE
v- CONCLUSION
INTRODUCTION
La fièvre catarrhale ovine est une maladie virale ovine vectorielle transmise par un moucheron
hématophage de l’espèce Culicoïdes imicola. En raison de la sensibilité au froid de ces
moucherons, la maladie est historiquement tropicale et subtropicale. Cependant, tous les modèles
épidémiologiques existants ont été bouleversés en 2006 par l’apparition inexpliquée du sérotype
8 de la maladie au Nord de l’Europe, zone où C. imicola est absent. Le virus, en présence d’une
population naïve, a révélé une expression clinique originale caractérisée par une sensibilité accrue
des bovins par rapport à ce qui avait précédemment été décrit pour la maladie.
Dans un contexte d’épizootie, cet événement pathologique inattendu nous amène à nous
questionner sur les facteurs de terrain ayant permis une dissémination virale aussi rapide en
l’absence du vecteur classique. Dans un but de compréhension et de détection précoce de la
maladie par les professionnels participant à la lutte contre l’épizootie, nous pouvons nous
demander quels sont les signes cliniques à rechercher sur les bovins suspects et quels aspects de
la pathogénie du virus permettent de les expliquer ? Dans le but d’éviter toute confusion avec
d’autres maladies présentes sur le territoire, il est nécessaire de les connaître et de préciser leurs
similitudes et leurs différences d’expression avec la fièvre catarrhale ovine.
2
Afin d’éviter la dissémination accidentelle du virus par les transports d’animaux, le clinicien doit
s’interroger sur les caractéristiques des mécanismes de virémie et d’immunité associés à la
présence du virus de la fièvre catarrhale ovine chez les bovins ? Les conséquences de ces
mécanismes immunitaires en termes de détection des malades par des analyses de laboratoire et
de protection des animaux par la vaccination doivent être connues.
I-FIEVRE CATARRHALE OVINE (FCO):
PRESENTATION, GENERALITES
I-1-HISTORIQUE
La FCO est décrite en 1881 pour la première fois en Afrique du Sud. Dès 1940, elle est décrite en
Afrique centrale puis dans le Bassin Méditerranéen (Israël, Turquie, Syrie, Oman, Arabie
Saoudite) et l’Asie (Inde, Chine, Pakistan, Japon, Indonésie, Malaisie). Elle est aujourd’hui
présente en Amérique du Nord (USA, Canada), Amérique Centrale et Amérique du Sud
(Mexique, Chili, Brésil, Guyane), en Australie et en Nouvelle Zélande. Les territoires d’outre
mers français ont été concernés, notamment la Réunion entre 1974 et 1977. Dans la majorité des
cas, le virus est présent sur toutes les terres situées entre les latitudes 35°S et 40°N (figure 1).
Actuellement, la forme enzootique de la maladie est la plus courante. Elle concerne une grande
partie des troupeaux de zone tropicale et subtropicale. L’expression clinique aiguë de la maladie
y est rare. [GIBBS et GREINER (1994) ; ZIENTARA et al. (2006)] En 2006, l’Europe était
indemne de FCO depuis 20 ans, excepté quelques incursions au Portugal et en Espagne (de 1956
à 1960), en Grèce (1979) et à Chypre. Le virus (sérotypes, 2, 9, 4, et 16) se répand dans le Bassin
Méditerranéen et persiste en 1999. En 2006, l’Europe était indemne de FCO depuis 20 ans,
excepté quelques incursions au Portugal et en Espagne (de 1956 à 1960), en Grèce (1979) et à
Chypre. Le virus (sérotypes, 2, 9, 4, et 16) se répand dans le Bassin Méditerranéen et persiste en
1999 touchant des populations auparavant indemnes en Grèce, en Bulgarie, en Tunisie et en
Turquie. En 2000, la Tunisie, l’Algérie, l’Italie (Sardaigne, Sicile et Calabre), la Grèce, la France
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(Corse), sont contaminées (figure 2). Les années suivantes, plusieurs épizooties ont lieu touchant
tout le Sud de l’Europe. Les foyers sont jugulés par des vaccinations de masse dans les régions
concernées. Elles empêchent le développement de nouvelles épizooties mais n’empêchent pas
tout à fait la circulation virale dans les foyers. [BREARD et al. (2004a) ;GIBBS et GREINER
(1994) ; MELLOR et al. (2008); ZIENTARA et al. (2006)]
I-2-AGENT INFECTIEUX
2-1-VIROLOGIE
rus responsable dLe vie la fièvre catarrhale ovine (Bluetongue en anglais) est connu depuis 1905,
année où il a été décrit pour la première fois.
L’agent de la fièvre catarrhale ovine est un virus nu de la famille des Reoviridae et du genre des
Orbivirus. Il a une structure isocaédrique constituée de deux capsides contenant 10 segments
d’ARN bicaténaire codant au moins 10 protéines (tableau 1).
[HATELEY (2009) ; ZIENTARA et al. (2006)] Sept des protéines formées sont structurales (VP
1 à 7). Les protéines VP7 et VP2 sont majoritaires (figure 8). VP1, 4 et 6 constituent la capside
interne. VP2 et 5 exclusivement constituent la capside externe. [HATELEY (2009) ;
SCHWARTZ-CORNIL et al. (2008)]
· VP2 (et VP5 dans une moindre mesure) est responsable de la variabilité antigénique du virus
avec 24 sérotypes connus à ce jour. Un potentiel 25ème sérotype de la FCO a été découvert en fin
d’année 2007 dans deux troupeaux caprins de la région de Toggenburg en Suisse. Des études
pour déterminer les caractéristiques virologiques et cliniques de ce virus sont en cours
[CHAIGNAT et al. (2009)].
VP2 est codée par le segment 2 du génome viral. La moindre variation de séquence de ce
segment se traduit par une variation antigénique du BTV. Les différences de séquences de
nucléotides entre les différents variants peuvent aller de 29% (BTV 8 et BTV 18) à 59% (BTV 16
et BTV22). A l’intérieur d’un même sérotype, des différences importantes de codage de VP2
(jusqu’à 30%) peuvent être observées, ceci en fonction de l’origine géographique du virus.
[MAAN et al.2007]
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La protéine VP2 est le responsable de la liaison aux récepteurs cellulaires, de l’hémagglutination
et de la réponse immunitaire à l’aide d’anticorps spécifiques. La protéine VP2 possède une forte
affinité avec certains composants des érythrocytes ; cette propriété joue probablement un rôle
dans la liaison du virus avec les globules rouges.
· VP5 est beaucoup plus stable que VP2, néanmoins quelques variations peuvent exister en
fonction de l’origine géographique du virus. Cette protéine sert au relargage des protéines virales
depuis le réticulum endoplasmique jusqu’au cytoplasme de la cellule infectée.
· VP3 et VP7 sont codées par un segment d’ARN stable conservé chez tous les virus
BTV. Elles comportent des épitopes fortement antigéniques communs aux 24 sérotypes. De
nature hydrophobe, elles jouent un rôle important dans l’intégrité du nucléoïde. Le complexe
formé par ces deux protéines protège le génome viral en empêchant par exemple l’activation
l’une réponse immunitaire par interféron de type I (ou α).
Les trois autres protéines formées sont non structurales (NS 1, 2 et 3). [DAL POZZO et al.
(2009b)]
_ NS1 est impliquée dans la formation des tubules lors de la réplication virale.
_ NS2 joue un rôle dans la synthèse de l’ARN.
_ NS3 participe à la libération du virus provenant de cellules infectées après multiplication. Le
virus est sensible au pH inférieur à 6 ou supérieur à 8. Il peut être détruit par la chaleur à partir de
50°C pendant 180 minutes ou 60°C pendant 15 minutes. Il est sensible aux désinfectants
classiques. [VAN AERT et al. (2008)]
2-2-SESIBILITE ET RECEPITIVITE D’AUTRES ESPECES
ANIMALES AU VIRUS DE LA FCO
2-2-1-ESPECES SENSIBLES
La fièvre catarrhale ovine, historiquement spécifique des ovins dispose de nombreux réservoirs
épidémiologiques. En effet, les bovins, et les caprins dans une moindre mesure se sont révélés
être des espèces sensibles au sérotype 8 de la FCO. Ils sont donc capables d’héberger le virus, de
le multiplier en supportant des manifestations cliniques de l’infection.
5
Des ruminants sauvages ont montré des signes cliniques dans des parcs zoologiques ainsi qu’en
Amérique du Nord pour d’autres sérotypes de FCO et d’autres Orbivirus (cervidés, antilopes et
mouflons). [SAILLEAU et al. (2006)] En France, des signes cliniques de FCO ont été observés
chez des ruminants sauvages présents dans différents zoos présents en zone d’épizootie du
sérotype 8. [MAYER et al. (2007)] En Belgique, dans un zoo, deux Lynx sont morts après une
courte période de léthargie. A l’autopsie, les animaux étaient anémiés, ils présentaient une
adénomégalie, des hématomes sous-cutanés, des pétéchies ainsi qu’une congestion, une infection
et un œdème du poumon. Sur les deux animaux, les parois des vaisseaux musculaires étaient
œdémateuses et enflammées. L’un des deux animaux était positif en virologie pour la FCO. Le
sérotype 8 a été isolé. [JAUNIAUX et al. (2009)]
2-2-2-ESPECES RECEPTIVES
Certaines espèces de la faune sauvage sont capables de multiplier le virus de la FCO.
Pour l’instant, aucun signe clinique n’a été mis en évidence chez celles-ci. On dit ces espèces
réceptives, ce sont des réservoirs épidémiologiques du virus. Parmi les ruminants sauvages, des
analyses sérologiques d’épidémiosurveillance [ROSSI et al. (2010)] ont montré une
séroconversion sur plusieurs espèces. Ceci est un signe de réceptivité au virus. Les principales
espèces montrant une séroconversion sont :
· le cerf élaphe (Cervus elaphus): prévalence de 40,9% en moyenne ;
· le daim (Dama dama);
· le mouflon méditerranéen (Ovis gmelini musimon) : prévalence de 2,1% en moyenne
en France mais concentrés dans les milieux forestiers, tous les mouflons de montagne
étaient négatifs. En Espagne la prévalence sur cette espèce avoisinait les 25 à 33% ;
· le bouquetin ibérique (Capra pyrenaica) : prévalence de 11% en moyenne en Espagne
contre 3 bouquetins infectés sur 48 en Sardaigne.
19
Les études françaises d’épidémiosurveillance ont permis de montrer que parmi certaines
espèces de ruminants sauvages, la circulation virale était presque nulle :
· le chevreuil (Capreolus capreolus) ;
· le chamois (Rupicapra rupicapra) ;
· Le bouquetin (Capra ibex) ;
6
· L’isard (Rupicapra pyrenaica) : prévalence de 1,1% en moyenne.
2-3-MODE DE TRANSMISSION DU VIRUS
La fièvre catarrhale ovine est historiquement considérée comme une maladie non contagieuse
dont la transmission est uniquement vectorielle. Cependant, divers évènements survenus lors de
l’épizootie due au sérotype 8 du BTV en Europe du Nord tendent à montrer que d’autres voies de
transmission sont possibles [THIRY et al. (2008)] :
2-3-1-TRANSMISSION VENERIENNE
Les mâles en infection aiguë et en période de virémie peuvent excréter du virus dans le sperme
avec un titre viral qui suit celui du sang. L’infection pourrait donc se transmettre lors d’une
saillie, par insémination artificielle ou lors de transfert d’embryons. [WRATHALL et al. (2006)]
2-3-2-TRANSMISSION VERTICALE
Les données épidémiologiques répertoriées pendant le récent épisode de FCO démontrent que des
veaux nés de mères vaccinées et négatives en RT-PCR, ont pu donner naissance à des veaux
positifs en RT-PCR sur le sol anglais alors que l’épizootie n’avait pas encore gagné le territoire et
que l’on était hors de la période vectorielle. [MENZIES et al.(2008). Dans une étude l’infection
expérimentale de 16 vaches gestantes a confirmé la possibilité d’un passage transplacentaire du
virus par naissance de veaux viropositifs présentant des signes cliniques de FCO. [BACKX et al.
(2009)]
2-3-3-TRANSMISSION HORIZONTALE
Elle n’est pas formellement prouvée, néanmoins deux des mères vaches de l’étude de Menzies et
al. (2008) seraient devenues positives en virémie (alors que les seuls animaux viropositifs étaient
les veaux nés positifs et en saison d’inactivité vectorielle) probablement par ingestion de
7
placenta. Un exemple d’infection de lynx eurasiens, dans un parc animalier par ingestion de
veaux mort-nés existe en Belgique. Les mères des avortons étaient vironégatives dans un
troupeau vironégatifs et hors période d’activité vectorielle. Il semblerait donc que dans ce cas
précis, une combinaison de transmission verticale et horizontale ait eu lieu. [JAUNIAUX et al.
(2009)].
Expérimentalement, chez des veaux nés vironégatifs, la buvée d’un colostrum provenant d’une
mère infectée a entraîné une contamination orale chez un des veaux. [BACKX et al. (2009)]
I-3-LE VECTEUR
3-1-PRESENTATION
Le virus de la FCO est transmis par un diptère hématophage du genre Culicoïdes. Le vecteur
majeur (et historique) de la maladie appartient à l’espèce Culicoïdes imicola . Originellement
tropical, ce moucheron a récemment étendu sa distribution géographique (par exemple dans le
Bassin Méditerranéen). D’autres Culicoïdes ont pu jouer un rôle mineur dans l’expansion de la
maladie. Par exemple C. variipeni en Amérique du Nord, C. insignis en Floride et Amérique du
Sud, C. fulvus et C. wadaï en Australie. [GIBBS et GREINER (1994) ; MELLOR et al. (2008)]
3-2-BIOLOGIE
Les Culicoïdes se nourrissent en majorité de nectar, seules les femelles (dans un grand nombre
d’espèces) sont hématophages. Chez 90% des espèces, le repas sanguin précédent la ponte est
obligatoire. Les insectes piquent rarement en plein jour en plein soleil, mais plutôt, selon les
espèces, à l’ombre, à l’aube ou le soir au coucher du soleil. C. imicola aurait des repas
exclusivement nocturnes. Chaque ponte est précédée d’un repas sanguin 2 jours avant environ.
La hausse des températures entraîne une augmentation du nombre de repas sanguins, de la
fréquence de ponte et de la taille de la population. Au-dessus d’un certain seuil, l’effet s’inverse
tant pour les adultes que pour le développement larvaire dont chaque phase s’allonge. Des
8
températures basses inhibent l’activité des adultes et le développement larvaire en dessous d’un
seuil propre à l’espèce.
Les déplacements des Culicoïdes se font par vol actif sur de courtes distances (500m environ). Le
vent peut par contre les déplacer sur de plus grandes distances.
Une seule ponte peut représenter entre 10 et 674 oeufs selon des facteurs liés à l’espèce et aux
conditions de vie. Les oeufs, pondus au sol en milieu généralement humide, éclosent 2 à
8 jours après la ponte (sauf exception dans les pays nordiques). Le développement larvaire dure
entre 2 semaines et 1 mois selon les conditions climatiques. Alors les insectes se transforment en
nymphes, puis en adultes au bout de 2 à 10 jours.
3-3-CONDITIONS A REUNIR POUR AVOIR LA CAPACITE DE
TRANSMESTTRE LE VIRUS DE LA FCO
Pour pouvoir s’infecter avec un virus et transmettre celui-ci à un hôte, permettant la
dissémination de la maladie, le vecteur doit être en mesure de réunir certaines conditions
[CIRAD (2010) ; WALZER (2009)] :
· le Culicoïde doit faire un repas sanguin sur un hôte virémique ;
· il doit être exposé au virus dans ses conditions naturelles de vie (les insectes capturés
sur le terrain sont porteurs du virus) ;
· il doit être capable de transmettre le virus (le virus doit être présent dans les glandes
salivaires de l’insecte) ;
· le virus doit survivre dans le vecteur en s’y multipliant ;
· le moucheron doit piquer un animal réceptif : le virus doit pouvoir s’y multiplier aussi.
La notion de compétence vectorielle reflète les notions évoquées ci-dessus pour l’insecte
individuellement. Elle témoigne de la capacité de l’insecte à s’infecter, à amplifier et à
transmettre le virus. Elle est mesurée en laboratoire par l’infection expérimentale de ruminants
inoculés par les insectes auparavant gorgés de sang infecté dans des concentrations suffisantes.
La capacité vectorielle, elle, détermine la capacité d’une population de vecteur à transmettre seule
la maladie. Elle tient compte de l’insecte dans sont milieu, dans ses relation avec les individus de
son espèce et de l’espèce hôte et des caractéristiques du virus transmis. Pour pouvoir transmettre
un virus, un Culicoïde doit donc être compétent et capable.
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3-4-FACTEURS LIES AUX VECTEUR INFLUANT SUR LA
TRANSMISSION DU VIRUS DE LA FCO
Si le vecteur est compétent, sa capacité à transmettre le virus va varier en fonction de certains
paramètres environnementaux [HATELEY (2009)]:
· l’augmentation de la fréquence des repas des moucherons ;
· l’accélération du cycle de reproduction des virus ;
· l’accélération de la réplication virale dans le moucheron ;
· l’augmentation du nombre de moucherons compétents dans la population vectorielle ;
· l’implication d’espèces de moucheron vecteur plus nombreuses;
· une température comprise entre 10 et 30°C.
I-4-SIGNES CLINIQUES
Les snytomes sont très varibles selon le serotype, l’espéce et selon l’ individu touche :
Chez les ovins , la maladie peut se presenter sous une forme aiguë, beaucoup plus grave, mais
egalement sous des formes beaucoup plus discret . Certaint individus peuvent ne presenter
auncun signe cliniquevisibles ou des signes frustres peu carasteristiqie. Dans la forme aigue de la
maladie on peut observer trois phases sucesseive :
,nasale occulaire et caudale
_ attiendre les muqueuse bucale
entrainant hypersalivation jetage , larmoiement
et bacteries . on peut dans certains cas obsever
une cianose de la langue lui conferant un aspet
bleuter qui donne nom a la maladie ( bleutongue
en anglais).
-perte d’apetie , abatement, amergrissement et
perte de production ( laitiere, laine, croissance)
10
-impact important sur la reproduction :
infecondité passagere ou definitive chez lees
males et les femmelles gestantes du fait de
transmition transplacentaire du virus
II-MATERIELS NECESSAIRES
1-Materiel biologique
Nos experiences porterons sur les ovins
2-Materiels techniques
-Tube eppendorf
-Micropipette
-Le bain-marie
-Termocicleur
-Gans
-Triton x
-Congelateur
-Une centrifugieuse
III LES ETAPES DE LA PCR
Le cycle de la PCR s’efectue en trois etapes :
11
1- La denaturation de l’ADN.
La denaturation thermique e l’ADN à
95°C . les deux (2) brins de l’ ADN se
separent par rupture des liaisons hydrgene.
Nous obtenons alors des matrices simple
brin .
2- Hydratation de l’ADN
L’hydratation des amorces à 50°C- 65°C .
Les deux amorces contenues en large
exces s’ibride lorsqu’elles rencontrent les
sequences complementaires . la
temperature permet au liaisons hydrogenes
de se reformer . les amorces s’hybrident
plus facilement que les brins d’ADN ainsi,
plus la temperature d’hybridation est
elevée, plus l’hybridation est selective et
specifique.
3- Elongation
L’elongation a 72°C, la taq polymerase
( ADN polymerase) catalyse la replication
12
à partir des ADN monocatenaire amorcés
donc de façon selective
IV- ELECTROPHOSE SUR GEL
D’AGAROSE
La detection des produits emplifier par
electrophorese en gel d’agarose neccessite des
cuves appropriées et un generateur pour
electrophores d’ADN , une table generatrice des
rayons UV et un système photo :
1 preparer le gel d’agarose dans le support de
coulage
2 enlever les vis de joncture et le paigne, puis
submerger le gel dans les
tampon a linterieur de la cassette
d’electrophorese
3 deposer chaque echantillon dans un tube
eppendorf consecutif
4 fermer le couvercle, brancher les prises a la
source de courant et realiser
l’electrophorese
13
5 apres l’electrophose, transferer le gel pour
visualisation
6 analyser a la plaque lumiere blanche
14
v- CONCLUSION
la fiervre catarrhale ovine est une maladie des
ruminants affectant surtout les
15
moutons,pocedant un virus de 24 sterotypes
dont les moucherons sont les vecteurs de
transmissions tres eficace . la FCO est une
maladie infectieuse tourjours debilitante pour les
races onines ameliorées , parfois mortelle. Cette
maladie plus discrete au plan clinique mais reel
dans ses consequences economique severe pour
les eleveurs .
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