Mise au point
Les couleurs en dermatopathologie
Colors in dermatopathology
N. Ortonne (Département de pathologie, hôpital Henri-Mondor, AP-HP, Créteil)
à l’œil nu sur les cadavres à l’analyse des cellules et des tissus
Mots-clés : Couleur • Coloration • Dermatopathologie • Immuno à l’échelle microscopique. On distingue différents types de
histochimie • Immunofluorescence directe • Hybridation in situ. coloration, certaines étant utilisées de façon systématique et
d’autres sur demande (voir fiche technique no 1, p. 217). Les
Keywords: Color • Staining • Dermatopathology • Immuno colorations bi- ou trichromiques sont très largement utilisées
histochemistry • Direct immunofluorescence • In situ hybridization. pour l’analyse morphologique des structures normales, que ce
soient des coupes de tissus (histologie et histopathologie) ou
d’étalement de cellules (cytologie). Leur principe est presque
toujours le même, reposant sur l’association d’un colorant
L’
histopathologie consiste à analyser les tissus acidophile, qui va plutôt se fixer dans les noyaux cellulaires
au microscope. Cette discipline repose riches en acides nucléiques, et d’un colorant basophile qui va,
entièrement sur des techniques permettant quant à lui, marquer les cytoplasmes riches en protéines. Pour
de visualiser les tissus, grâce à des colorations marquant les colorations trichromiques (hématéine, éosinine safran, tri
spécifiquement telle ou telle structure cellulaire chrome de Masson, etc.), il y a, en outre, un réactif permettant
de marquer le collagène, constituant principal des matrices
ou extracellulaire.
extracellulaires. Pour ce qui est de la coloration HES, qui reste
la plus utilisée dans tous les domaines de la pathologie, c’est le
De manière schématique et d’un point de vue technique, rôle du safran, qui permet de marquer en jaune orangé le colla
3 grandes approches sont à distinguer : gène dermique des prélèvements cutanés. Le même principe
▶▶Les colorations chimiques, dont la principale reste la tech est utilisé pour colorer les étalements de cellules de cytologie.
nique dite “standard trichromique” par hématéine éosine et Pour le cytodiagnostic de Tzanck, on utilise en règle générale
safran (HES). le May-Grünwald-Giemsa, qui permet de visualiser en bleu
▶▶Les techniques d’immunomarquage protéique (immuno les noyaux et en violet les cytoplasmes (figure 1). D’autres
histochimie et immunofluorescence). colorations sont plus ponctuellement utilisées pour étudier
▶▶Les techniques d’hybridation in situ, qui permettent de
colorer spécifiquement des séquences d’acides nucléiques
(ADN ou ARN).
La multiplicité des techniques actuellement disponibles fait que
la pathologie est probablement, à côté de la dermatologie, une
des disciplines médicales les plus visuelles et les plus “colo
rées” et que, par conséquent, les dermatopathologistes ont au
quotidien les yeux rivés à un kaléidoscope de lésions c liniques
et de coupes histologiques. Dans les lignes qui suivent, les
principales techniques de coloration et de marquage des tissus
sont abordées, en s’appuyant sur des exemples concrets du
vaste monde de la dermatopathologie, qui ne manque pas,
par la variété des situations auxquelles elle nous confronte,
de nous en faire voir de toutes les couleurs !
Colorations standard et “spéciales”
et pigments cutanés
Figure 1. Cytodiagnostic de Tzanck permettant de visualiser des kéra-
La coloration des coupes de tissus et des cellules représente tinocytes de l’épiderme agglutinés en amas sur un fond inflammatoire
l’approche la plus ancienne et la plus élémentaire en ana fait surtout de polynucléaires neutrophiles (May-Grünwald-Giemsa,
tomie et cytologie pathologiques. C’est elle qui a permis de × 400).
faire évoluer l’anatomie pathologique de l’étude morbide faite
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Figure 2. Périartérite noueuse caractérisée par une lésion de vascu-
larite intéressant une artériole de moyen calibre située à la jonction
entre le derme et l’hypoderme. La nature artériolaire et non veinu-
laire du vaisseau lésé est confirmée par la coloration par l’orcéine
qui permet d’identifier la limitante élastique de la média (HES, × 50 Figure 3. Le marquage par le bleu de Toluidine permet ici de carac-
et orcéine, × 400). tériser de nombreux mastocytes localisés dans le derme papillaire,
présentant des granulations métachromatiques violettes dans leur
cytoplasme, dans le cadre d’une mastocytose cutanée de type urticaire
l’aspect de structures histologiques normales au cours de pigmentaire. On note une coloration métachromatique verte de la
certaines pathologies. C’est le cas par exemple de la colora- mélanine, qui contraste avec la coloration bleue du réactif (coloration
tion par l’orcéine qui permet de visualiser les fibres élastiques par le bleu de Toluidine, × 400).
du derme et de la limitante élastique des parois artériolaires
(figure 2). Enfin, certains types cellulaires peuvent être mieux
caractérisés par l’utilisation de colorations particulières. Un demandées plus ponctuellement, et leur indication dépend
des meilleurs exemples est certainement le mastocyte, dont des résultats de l’analyse morphologique et du contexte
les granulations sont capables de réagir avec de nombreux clinique. Dans le domaine de la pathologie infectieuse, les
agents chimiques (Giemsa, bleu de méthylène ou de Toluidine, principales sont celles de Gram pour les cocci (bleu foncé),
etc.), en donnant des variations de couleur par un processus de Gomori-Grocott pour les parois de champignons et d’Histo
de “métachromasie” (figure 3). plasma encapsulatum (noire), et de Ziehl-Neelsen pour les
infections à mycobactéries (rouge) [figure 5]. Pour ce qui est
Certaines colorations permettent de visualiser des agents des dermatoses de surcharge, les principaux réactifs utilisés
pathogènes ou des surcharges d’origine endogène. Dans la en dermatopathologie sont le bleu Alcian (pH 2,5), qui iden-
plupart des laboratoires traitant des prélèvements cutanés, tifie les surcharges en glycosaminoglycanes de la substance
la coloration par l’acide périodique de Schiff (PAS) est r éalisée fondamentale dans les mucinoses dermiques ou folliculaires,
systématiquement sur les biopsies cutanées, car elle permet et le rouge Congo pour les amyloses cutanées primitives ou
de visualiser les spores et les filaments mycéliens des secondaires (coloration rouge brique avec aspect biréfringent,
infections mycosiques (figure 4). D’autres colorations sont vert jaune, en lumière polarisée).
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Figure 5. Dans cet infiltrat neutrophilique d’aspect suppuré, qui appa
raît ici bien reconnaissable grâce à la contre-coloration par le bleu
de méthylène, on voit des amas de bacilles acido-alcoolo-résistants,
colorés en rouge, témoignant d’une mycobactériose atypique à Myco-
bacterium chelonae (coloration de Ziehl-Neelsen, × 400).
Figure 4. Coloration par l’acide périodique de Schiff (PAS), identifiant
ici des amas de filaments de dermatophytes localisés dans la lumière
de la gaine folliculaire dans le cadre d’une folliculite mycosique (PAS,
× 400).
Il convient de rappeler que les couleurs observées sur des
coupes de tissus ne sont pas toujours le fait de la main du Figure 6. Les berges chirurgicales de ce carcinome basocellulaire
technicien. infiltrant ont été peintes avec une encre noire lors de l’échantillonnage
macroscopique, permettant de bien analyser les berges au micro
Les médecins effectuant l’échantillonnage macroscopique uti- scope, qui semblent saines sur cet échantillon (HES, × 50).
lisent volontiers des encres de couleur (noire, verte, bleue, etc.)
pour marquer les berges chirurgicales des pièces de résection
(figure 6). Cela est fort utile pour le repérage des berges lors de ment voir, en situation pathologique, des pigments endogènes
l’analyse microscopique, ces pigments ayant pour propriété de d’hémosidérine, également brunâtre, qui correspondent à un
résister à l’ensemble des traitements techniques permettant produit de dégradation de l’hémoglobine. Ce pigment se voit
l’élaboration des coupes de tissus. donc dans les suites des dermatoses hémorragiques ou pur-
puriques ou dans des tumeurs remaniées par des saigne-
Enfin, il existe des pigments endogènes ou exogènes qui ments (figure 7, p. 214). Les médicaments peuvent bien sûr
résistent à toutes les étapes techniques d’élaboration des s’accumuler dans des lysosomes, sous forme de métabolites
coupes et que l’on retrouve à l’analyse microscopique. C’est colorés appelés “lipofuscines”, le plus souvent de coloration
vrai de la mélanine, qui prédomine à l’état normal dans la brunâtre, comme la mélanine et l’hémosidérine. Des colora-
couche épidermique basale et apparaît d’autant plus visible tions peuvent être ainsi nécessaires pour identifier la nature
que le phototype est foncé, de façon logique. On peut égale- exacte des pigments cutanés ; c’est le cas de la coloration de
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Figure 8. Double marquage effectué dans un lymphome B centro-
folliculaire cutané primitif, permettant de distinguer les lymphocytes B
tumoraux exprimant dans leurs noyaux le facteur de transcription
BOB1, en brun, et les lymphocytes T de l’environnement exprimant
dans leur cytoplasme BCL2, en rouge (double immunomarquage
développé avec la diaminobenzidine [DAB] et le fast red, × 200).
mates offre l’avantage de permettre la réalisation de doubles
marquages (figure 8), et pour certains, de réaliser des tech-
niques d’hybridation in situ (cf. infra).
D’un point de vue technique (voir fiche technique no 2, p. 219),
Figure 7. Forme hémopigmentée d’histiocytofibrome, riche en sidéro la première étape consiste, comme précédemment pour les
phages, bien identifiés par la réaction de Perls (coloration de Perls, colorations chimiques, à réhydrater les coupes par des bains
× 100). de xylène puis d’alcool et d’eau. En effet, comme pour la
plupart des colorants chimiques, l’interaction de l’anticorps
avec son antigène cible est une réaction qui ne peut se faire
Fontana, se fixant sur la mélanine (noire), et de la coloration qu’en milieux aqueux. Le marquage en lui-même fait inter-
de Perls, teintant d’un magnifique bleu turquoise les pigments venir 3 acteurs : l’anticorps primaire qui assure la spécificité
d’hémosidérine. Les lipofuscines médicamenteuses peuvent de la réaction ; un système de révélation plus ou moins ampli-
réagir avec différents colorants, incluant le PAS et la coloration ficateur de signal ; une contre-coloration qui permet de visua-
de Perls. Enfin, les tatouages se voient facilement, quelles liser l’ensemble du tissu sur la coupe. Un anticorps spécifique
que soient leurs couleurs, même s’ils sont souvent masqués (dit primaire) est déposé sur la coupe de tissu. Cet anticorps
par la réaction inflammatoire qu’ils peuvent susciter et qui peut être couplé à une enzyme ou à un fluorochrome permet-
conduit à les biopsier. tant directement d’effectuer le marquage, sans utiliser d’anti
corps secondaires. C’est la technique dite “en une couche”.
Pour les techniques en 2 ou 3 étapes, d’autres anticorps sont
Marquage des protéines : immunohistochimie utilisés. Ces anticorps doivent être d’une espèce différente
et immunofluorescence du premier. Ce sont ces anticorps secondaires ou tertiaires
qui sont alors couplés au système de révélation (enzyme ou
L’immunohistochimie a pour objectif de détecter des antigènes fluorochrome). Cette technique permet d’amplifier le signal
protéiques ou glycoprotéiques dans les tissus. Cette technique puisque, théoriquement, plusieurs anticorps secondaires
est très largement utilisée dans la caractérisation des cancers, pourront se fixer sur l’anticorps primaire. Il existe de nom-
incluant les cancers cutanés bien entendu, et permet parfois breux systèmes de révélation permettant l’amplification du
d’apporter une aide pour le diagnostic de certaines derma- signal, les plus fréquemment utilisés reposant sur le couplage
toses inflammatoires. Initialement faite “à la main” lorsque la de l’anticorps secondaire à la biotine, avec un chromogène
technique s’est développée dans les années 1980, elle s ’appuie couplé à la streptavidine (système avidine-biotine), ou sur
maintenant sur des automates. La dernière génération d’auto- les systèmes utilisant un troisième anticorps dirigé contre le
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Figure 10. Mélanome de Dubreuilh in situ caractérisé par une
prolifération intra-épidermique de mélanocytes atypiques, isolés
ou regroupés en amas dans la couche basale, exprimant fortement
l’antigène Melan-A (MART-1). Le marquage rouge, qui ne peut
être confondu avec la mélanine, permet ici de confirmer l’absence
d’invasion dermique et souligne l’architecture particulière de la tumeur,
A B
qui s’étend dans la gaine épithéliale des follicules pileux (HES, × 100
Figure 9. Mycosis fongoïde au stade de plaque avec un infiltrat et immunomarquage de Melan-A/MART-1 développé avec le fast
lymphocytaire dense formant une bande sous-épidermique et infil- red, × 50 et × 200).
trant l’épiderme et le follicule pileux. L’immunomarquage, réalisé
en brun sur une contre-coloration bleue, souligne le phénotype
majoritairement T (CD3+) [A. marquage en bas à gauche] et CD8–
(B. marquage en bas à droite) de l’infiltrat, que ce soit dans le derme le marquage et les pigments bruns endogènes présents à
ou dans les contingents épidermotrope et pilotrope (HES, × 50 et l’état normal dans la peau (mélanine et hémosidérine, en
immunomarquages développés avec la DAB, × 100). particulier). Pour ce qui est des marquages fluorescents, leur
visualisation repose sur le couplage de l’anticorps primaire ou
secondaire à une molécule capable de restituer de l’énergie
lumineuse lors de l’exposition à une lumière ultraviolette (UV)
chromogène de l’anticorps secondaire (système peroxydase invisible à l’œil nu. Les fluorochromes se distinguent les uns
antiperoxydase [PAP] ou phosphatase alcaline antiphospha- des autres par leur longueur d’onde d’émission, donnant une
tase alcaline [APAAP]). couleur bien précise. Le plus utilisé est le fluoro-isothiocya-
nate (FITC), qui émet dans le vert (figure 11). Si l’analyse des
Les techniques de révélation enzymatique ou chromogénique lames est limitée par la nécessité de les observer avec un
sont réalisées grâce à la transformation d’un substrat adapté microscope spécial à UV, cette technique est plus sensible
en produit coloré, qui permet de visualiser le marquage en et permet de rechercher des antigènes présents en faible
lumière ordinaire (microscope à fond clair). Les systèmes quantité dans les tissus. C’est la raison pour laquelle on
enzymatiques les plus utilisés emploient la peroxydase avec l’utilise pour les techniques d’immunofluorescence directe,
comme substrat la diaminobenzidine (DAB, marquage brun) dont l’objectif est de marquer des autoanticorps fixés dans la
[figure 9] ou l’amino-éthyl-carbazole (AEC, marquage rouge) peau au cours des maladies auto-immunes. Cette technique
d’une part, et la phosphatase alcaline avec comme substrat permet par ailleurs d’effectuer des analyses fines en multiples
le naphtol fast red (marquage rouge), d’autre part (figure 10). marquages puisque, grâce à des filtres adaptés, il est possible
En dermatopathologie, les marquages rouges sont préférés d’analyser sur une même coupe une ou plusieurs couleurs,
par certains car ils permettent d’éviter toute confusion entre successivement.
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Détection de séquences d’acides nucléiques
sur coupe : hybridation in situ, FISH et CISH
La technique de FISH (fluorescent in situ hybridization) est
habituellement utilisée pour marquer l’ADN et permettre,
en ciblant des gènes d’intérêt, de détecter des translocations,
amplifications ou délétions d’intérêt diagnostique ou pronos-
tique pour les cancers. D’un point de vue technique, les images
sont produites en hybridant une sonde d’ADN marquée (dont
la séquence assure la spécificité de reconnaissance de la cible
par appariement spécifique) sur une coupe de tissu. Les coupes
de tissu à analyser font l’objet d’un traitement visant à digérer
les protéines tissulaires, puis elles sont soumises à un traite-
ment dénaturant par la chaleur, afin de désolidariser les brins
d’ADN complémentaires, ce qui permet d’exposer la séquence
d’intérêt à la sonde. Autrefois, les sondes étaient marquées par
un isotope radioactif ; pour des raisons évidentes de sécurité et
de facilité d’emploi, on utilise maintenant des fluorochromes
ou des composants chimiques, selon des modalités proches
de celles employées pour l’immunohistochimie. On décrit ainsi
maintenant des techniques de CISH (chromogenic in situ hybri-
dization). Dans ce dernier cas, la révélation se fait à l’aide de
systèmes enzymatiques couplés respectivement à la strep-
tavidine ou à un anticorps secondaire dirigé contre la sonde,
rappelant les techniques utilisées en immunohistochimie. La
recherche de virus oncogènes, comme les papillomavirus (HPV)
ou le virus d’Epstein-Barr (EBV), se fait de manière courante
par techniques d’hybridation in situ. La recherche du virus
EBV peut être nécessaire à la classification de certains lym- Figure 11. Aspect caractéristique de pemphigus vulgaire. Sur la
phomes cutanés. Concernant les virus HPV, leur détection a coloration standard par HES, on voit un clivage intra-épidermique
peu de place dans la démarche diagnostique ou thérapeutique, supra-basal acantholytique et à l’examen en immunofluorescence
mais elle reste un élément important en recherche ou pour des directe en zone périlésionnelle un marquage en résille avec l’anticorps
études épidémiologiques. anti-IgG (HES, × 100 et marquage des IgG par immunofluorescence
au fluoro-isothiocyanate [FITC], × 200).
En dermatopathologie, les techniques de FISH trouvent des
applications dans le domaine du cancer, et en particulier
pour la caractérisation de certains lymphomes cutanés
primitifs ou secondaires. Une application d’intérêt
majeur reste la recherche de translocation t(17;22)
pour le diagnostic de dermatofibrosarcome de
Darier et Ferrand. Dans la grande majorité
des cas en effet, ce cancer est associé à
un transcrit chimérique issu de la fusion
des gènes PDGFB, situé sur le chromo-
some 22, et de celui de la chaîne alpha
du procollagène de type 1 (COL1A1), Toute l’équipe Edimark Santé
situé sur le chromosome 17. Cette
anomalie est très spécifique du vous souhaite de très belles fêtes de fin d’année
dermatofibrosarcome. II et vous donne rendez-vous en 2017
N. Ortonne déclare
ne pas avoir de liens d’intérêts.
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