Rapport de TP chromatographie COSIS

MASTER : CHIMIE ORGANIQUE AU

SERVICE DE L’INDUSTRIE ET DE LA
SANTE

SEMESTER :1

Rapport des travaux pratiques de

chromatographie

Encadré par : Mr. ROMANE ABDERRAHMANE

Préparés par :
CHAOU Chaimaa
ELMOUSAOUI Soukaina

Année universitaire : 2019/2020

Rapport de TP chromatographie COSIS

I. Introduction :
Les méthodes HPLC représentent l’outil de séparation chromatographique le plus courant
(à l’échelle analytique ou préparative). La transition entre la chromatographique en
colonne et l’HPLC s’est faite grâce à la possibilité de fabriquer des particules de très
faible taille (3 - 10 µm) et de granulométrie homogène, qui permettait de réaliser des
colonnes très efficaces impliquant la nécessité d'employer des pompes à haute pression
pour pousser les solvants (et des tubes résistants pour y mettre les phases stationnaires).

II. Principe de la technique La Chromatographie

Liquide Haute Pression (ou Haute Performance)
Est une technique permet de séparer, d’identifier et de quantifier un ou
plusieurs composés qui peuvent être dissous dans un liquide à des
concentrations aussi faibles que l'état de traces (quelques ppm). Les
composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce
mélange est introduit dans un solvant (ou éluant), cela représente la phase
mobile. Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins
avec la phase stationnaire maintenue en place dans un tube appelé colonne
chromatographique. Cette colonne est fixée dans un four où les conditions de
température sont déterminées par avance. Le mélange à analyser est injecté
dans le système chromatographique puis transporté au travers du système
chromatographique grâce à une pompe à haute pression. Les composés en
solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la
phase stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les
différents solutés sont caractérisés par un pic. Les analytes qui ont le moins
d’affinité avec la phase stationnaire ou une plus grande quantité
d'interactions avec la phase mobile quitte la colonne plus rapidement.
L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.
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Figure 1 : principe de fonctionnement de l’HPLC

Les résultats sont connus :

 Les produits sont d’autant plus longs à sortir que la colonne est longue et
large,
 Les pics sont d’autant plus finsque les billes de silice sont
petites et régulières, et que les chaines alkyles qui les tapissent sont
longues.
 les produits sortent d’autant plus vite que la température, le
débit et la proportion de solvant organique sont élevés.
Les cases colorées en blanc sont modifiables et les valeurs figurant dans les
cases bleues résultent d’un calcul. Les solvants organiques utilisés sont :
Acétonitrile /Méthanol

Les concentrations des produits tout comme leur coefficient de réponse, appelé epsilon :
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III.Résultats :

i. Influence de la longueur de la colonne

En variant respectivement les longueurs de 5, 12,5 et 25 cm on
obtient les trois chromatogrammes A, B et C .

1. Pour une longueur de 5cm

Figure 2: chromatogramme A

Commentaire :
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Les distances entre les différentes pics sont très courtes , ce qui signifie que
les temps de rétentions des constituants sont très proche ,alors il est difficile à
déterminer l’air de chacun ; on a ce qu’on appelle le chauvechement pour les
deux premiers pics.

2. Pour une longueur de 12.5cm

Figure 3: chromatogramme B
Commentaire :

Les pics sont bien séparés, ils ont une forme gaussienne alors il est facile de
déterminer l’air de chacun, ainsi que la durée de détection pour toutes les
constituantes environ 2 ,5min est meilleur.

3. Pour une longueur de 25cm

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Figure 4: chromatogramme C

4. conclusion
Pour avoir une bonne séparation, il faudrait que la longueur de la
colonne soit grande mais pas assez trop ; Dans notre cas la séparation
est meilleur pour une longueur de 12,5cm.

ii. Influence du diamètre de la colonne

En variant respectivement les diamètres internes de la colonne de
3,8,4,6 et 5,2 mm on obtient les trois chromatogrammes A1, B1 et C1.

1. Pour un diamètre de 3,8mm

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Figure 5: chromatogramme A1
Commentaire :
Les temps de rétentions des deux premiers pics sont très proche ;très difficile
à calculer l’air ,la résolution n’est pas bonne.

2. Pour un diamètre de 4,6mm

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Figure 6: chromatogramme A2

Commentaire :
Les pics sont bien séparés, ainsi que la durée de détection est bien ,alors la
résolution est bonne .

3. Pour un diamètre de 5,2mm

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Figure 7: chromatogramme A3

4. conclusion
Pour avoir une bonne séparation, il faudrait que le diamètre de la
colonne soit environ égal à 4,6mm.

iii. Influence du diamètre des particules

En variant respectivement les diamètres de particules de 2,5, 5 et 10 μm on
obtient les trois chromatogrammes A2, B2 et C2 .

1. Pour un diamètre de 2,5μm

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Commentaire :
Malgré que la séparation est bonne, Les pics sont très fine ce qui va rendre la
détermination de l’air plus difficile.

1. Pour un diamètre de 5μm

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Commentaire :
Ce chromatogramme présente une bonne résolution, les pics sont bien fins et
séparés.

1. Pour un diamètre de 10μm

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Commentaire :
Ce chromatogramme comporte des pics qui sont très larges, ainsi on a le
chevauchement pour les deux premiers pics, la résolution est mauvaise .

4. conclusion
Pour avoir une bonne résolution ;le diamètre des particules doit avoir une
valeur de 5 μm.

iv. Influence de la longueur de la chaîne alkyle :

En variant respectivement Les chaines alkyles comportant 2, 8 et18 atomes de
carbone on obtient les trois chromatogrammes A3, B3 et C3.
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1. Pour une chaine alkyle comporte 2 atomes de carbone

Commentaire :
Le chromatogramme présente une mauvaise séparation ,on a le
chevauchement entre tous les pics .

2. Pour une chaine alkyle comporte 8 atomes de carbone

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Commentaire :
Ce chromatogramme présente des pics qui sont larges, difficile à l’interpréter,
ainsi qu’on des chevauchements.
3. Pour une chaine alkyle comporte 18 atomes de carbone
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Commentaire :
Les pics sont bien séparés et sont bien fins ce qui va faciliter l’interprétation, la
résolution alors est bonne.

4. Conclusion
Pour avoir une bonne résolution la phase stationnaire doit comporter une
chaine alkyle de 18 carbones.

v. Influence de la température

La variation de la température influence la séparation ; En variant respectivement, Les

températures de 15, 30 et 45°C on obtient les trois chromatogrammes A4, B4 et C4.

1. Pour une température de 15°C

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Commentaire :
L’absence du pic de l’un des constituants de mélange.

2. Pour une température de 30°C

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Commentaire :
Les pics sont bien séparés, mais le temps de rétention pour le dernier constituant
est très long, la séparation n’est pas bonne.

3. Pour une température de 45°C

Commentaire :
Ce chromatogramme présente des pics bien séparés et fins, ainsi que le temps
des différents constituants est bonne.

4. Conclusion
La séparation est meilleure dans le cas où la température est égale à 45°C.

vi. Influence du débit

En variant respectivement les débits d’éluant de 0,5, 2 et 4 [Link]-1 on obtient
les trois chromatogrammes A5, B5 et C5.
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1. Pour un débit de 0,[Link]-1

Commentaire :
La séparation est mauvaise ; l’absence des pics de quatre constituants de
mélange.
2. Pour un débit de [Link]-1
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Commentaire :
Ce chromatogramme présente des pics bien séparés, mais le temps de
rétention pour le dernier composé est très long.

3. Pour un débit de [Link]-1

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Commentaire :
Ce chromatogramme présente des pics fins et bien séparés, ainsi que le temps
de rétention est bonne ,alors la résolution est efficace.

4. Conclusion
Pour avoir une bonne séparation le débit de la phase mobile devrait avoir la
valeur de [Link]-1.

vii. Influence de la proportion en solvant organique

En variant respectivement les proportions de 30, 60 et 90 % en solvant
organique on obtient les trois chromatogrammes A6, B6 et C6.

1. Pour une proportion de 30% en solvant organique

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Commentaire :
Ce chromatogramme présente des pics bien séparés, ainsi que le temps de
rétention des constituants est bien, alors la séparation est bonne.

2. Pour une proportion de 60% en solvant organique

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Commentaire :
Les temps de rétention des différents constituants sont très proches, la
séparation n’est pas bonne.

3. Pour une proportion de 90% en solvant organique

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Commentaire :
Les temps de rétention des différents constituants sont très proches ,la
séparation est mauvaise .

4. Conclusion
Pour avoir une bonne séparation la proportion en solvant organique doit égale
à 30%.

viii. Conclusion générale :

Les conditions pour avoir une bonne séparation sont :
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I. Introduction
La chromatographie est une technique de séparation des substances chimiques
(mélange homogène liquide ou gazeux) qui repose sur des différences de
comportement entre une phase mobile courante et une phase stationnaire (ou
phase fixe). On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature
des phases utilisées ou celle des phénomènes mis en œuvre dans la séparation.
Son principe est basé sur les différences d’affinité des composés du mélange avec
la phase stationnaire et la phase mobile. 
Le chromatogramme traduit la variation du soluté dans l’éluant en fonction du
temps.

Parmi les techniques associe à la chromatographie en trouve la chromatographie

en phase gazeuse (CPG) et, la méthode classique, la chromatographie sur
colonne.

II. Chromatographie phase gazeux :

i. Définition :
La CPG gaz-solide est une chromatographie d'adsorption, Elle permet d’analyser
qualitativement et quantitativement des mélanges complexes de gaz ou de
composés qui peuvent être volatilisés sans être décomposé. La phase
stationnaire étant un solide adsorbant. Les constituants du mélange injecté sont
en équilibre entre la phase gazeuse et la surface du solide où ils s'adsorbent. Le
gaz qui véhicule les constituants du mélange (souvent nommés solutés) constitue
la phase mobile et est appelé gaz vecteur.

ii. Principe :
Le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la
phase mobile qui l'entraîne le long de celle-ci. Si la phase stationnaire a été bien
choisie, les constituants du mélange sont inégalement retenus par celle-ci lors de
la traversée de la colonne. De ce phénomène nommé « rétention », il résulte que
les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase
mobile et que leurs vitesses de migration respectives sont inégales. De ce fait,
les constituants du mélange sortent de la colonne les uns après les autres au sein
de la phase mobile. A la sortie de la colonne se trouve un détecteur relié à un
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enregistreur. Lorsqu'un constituant du mélange arrive au niveau du détecteur, un

pic apparaît sur l'enregistreur.

III. Chromatographie sur colonne

i. Définition :
Est une chromatographie liquide-solide (CLS), d’adsorption et préparative qui
permet de séparer les constituants d’un mélange liquide.

La phase stationnaire est un adsorbant solide polaire (silice ou alumine), la

phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants qui dépend de la nature
des constituants a séparés.

ii. Principe :
On utilise une colonne en verre équipée d'un verre fritté et d'un robinet. La
colonne est remplie d'une poudre, généralement de l'alumine ou de la silice, ou
une résine échangeuse d'ions. Un mélange est placé en haut de la colonne. Selon
la nature de l'éluant et du contenu de la colonne, certaines molécules sont plus
facilement éluées que d'autres.

IV. Extraction des pesticides par chromatographie :

i. Les pesticides :
Un pesticide est une substance utilisée pour lutter contre des organismes
considérés comme nuisibles. C'est un terme générique qui rassemble les
insecticides, les fongicides, les herbicides, les parasiticides. Ils s'attaquent
respectivement aux insectes ravageurs, aux champignons, aux « adventices »
et aux vers parasites. Les familles les plus importantes sont les
organophosphorés et les organochlorés.

1. Les composés organophosphorés :

Les composés organophosphorés sont rapidement dégradés par le
rayonnement solaire, dans l’air, et dans les sols, bien que de petites quantités
puissent subsister et se retrouver dans la nourriture et l’eau. Cependant, bien
que les organophosphorés se dégradent plus rapidement, ils sont plus
toxiques, ce qui représente un risque pour les utilisateurs de ces composés.
Parmi Les composés organophosphorés les plus courants le Methidathion et
le Diazinon.
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Diazinon Methidathion

2. Les composés organochlorés :

Cette famille comprend un grand nombre de composés chimiques contenant
du chlore et quelquefois d’autres éléments Ils sont très persistants dans les
sols, et ils se concentrent également dans les tissus biologiques. Beaucoup de
composés de cette famille sont interdits 23 en raison de leur neurotoxicité.
Parmi Les composés organochlorés les plus courants le Hexachlorobenzéne
et l’Aldrin.

Hexachlorobenzéne Aldrin

ii. But de manipulation :

Ce TP consiste à analyser un échantillon d’eau contaminé par des
pesticides organophosphorés (Methidathion, Diazinon) et organochlorés
(Hexachlorobenzéne, Aldrin).Extraire les pesticides par extraction liquide-
liquide contenus dans l’eau contaminée. Séparer les pesticides par
chromatographie sur colonne, identifier et quantifier les pesticides par CPG.

iii. Principe de la manipulation :

Les pesticides sont extraits des échantillons par un solvant organique. Cette
phase (l’extrait) est séchée sur sulfate de sodium anhydre, filtré (filtration par
gravité) puis évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif. Les résidus sont repris
par un solvant organique ensuite la phase obtenue est soit injectée
directement dans le chromatographe en phase gazeuse soit filtrée sur une
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colonne de purification. Les composés obtenus sont identifiés et quantifiés

par CPG.

iv. Les matériels et les produits :

1. Les matériels :
 Ampoule à décanter de capacité 1L, béchers et éprouvette graduée.
 Ballon à col rodé pour évaporation.
 Evaporateur rotatif.
 Agitateur magnétique.
 Colonne pour purification.
 Appareils de chromatographie (CPG/ECD et CPG/PFD).
 Colonnes capillaires apolaire BP5 de longueur 25 m.
2. Les produits :
 Florisil.
 Sulfate de sodium.
 Solvants organiques : n-hexane, dichlorométhane.

v. Mode opératoire :
1. Extraction liquide - liquide :
On Introduire dans une erlenmeyer 20 ml de l’eau contaminé (contient les
deux types de pesticides : les organochlorées, les organophosphorées), puis
on ajoute 10 ml un solvant organique (hexane) qui dissout les organochlorés,
après on se mit tous sous l’agitation pendant 15 min à l’aide d’un agitateur
magnétique. Par suite on l’on verse le mélange dans une ampoule à décanter
pour l’extraction les deux phases : une phase organique ; on l’a récupérée
dans une petite erlenmeyer ; et une phase aqueuse. On l’ajoute 10 ml de la
solvant organique suivi par même procédure, on répète ça une autre fois, par
la suite on récupère la phase organique extraite pour la sécher sur sulfate de
sodium anhydre pour éliminer les traces d’eau, après le séchage on fait la
filtration par gravité pour récupérer la phase organique, puis l’vaporisation à
l’aide d’un évaporateur relatif pour évaporer le solvant à les résidus qui repris
par un solvant organique ( hexane), en suite le mélange obtenu aura filtré sur
une colonne chromatographique de purification.

2. Préparation de colonne de purification :

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On prend une colonne de purification, la première des choses on la met le

coton suivi par la phase stationnaire c’est florisil, après le sulfate de
sodium comme un desséchant (pour éliminer les traces d’eaux), après on
ajoute une phase mobile suivi par frape des parois de la colonne pour que
le remplissage soit efficace, par la suite on dispose l’échantillon en tête
de la colonne on ajoute en permanence la phase mobile qui provoque le
déplacement ou migration des constituants.

Le mélange sous agitation  La décantation de mélange

Filtration par gravité du mélange

évaporateur relatif
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3. Conclusion :

On utilise la chromatographie en phase gazeuse pour identifier les

types des pesticides et les quantifier c’est-à-dire on va savoir la
concentration de chaque pesticides, mais dans chromatographie en
phase gazeuse on utilise des détecteurs spécifiques à chaque type
 Pour les organochlorés on utilise le détecteur à capture
d’électron.
 Pour les organophosphorés on utilise le détecteur photométrie
de flamme.