UNIVERSITÉ PARIS VI – PIERRE et MARIE CURIE

THÈSE DE DOCTORAT

Présentée et soutenue publiquement pour l’obtention du titre de

Docteur de l’Université Paris VI

Spécialité : Écologie Microbienne – Sciences de l’Eau

Ecole Doctorale : Géosciences et Ressources Naturelles

Aurélie CÉBRON

NITRIFICATION, BACTÉRIES NITRIFIANTES

ET ÉMISSIONS DE N2O
La Seine en aval de Paris

Soutenue le 5 novembre 2004

Jury :

BONIN Patricia Rapporteur

CAUMETTE Pierre Rapporteur
DEGRANGE Valérie Examinateur
GARNIER Josette Directrice de thèse
LAANBROEK Hendrikus Examinateur
MARIOTTI André Président du jury
«Parfois, visible et claire, rapide ou lente, elle se fuit avec un murmure de mystère qui se
change tout à coup en mugissement de torrent rebondissant pour se fondre au tonnerre
perpétuel des chutes écrasantes et éblouissantes, porteuses d'arcs-en-ciel dans la vapeur.

Mais tantôt, elle se dérobe et s'achemine, secrète et pénétrante. Elle scrute les masses
minérales ou elle s'insinue et se fraie les plus bizarres voies. Elle se cherche dans la nuit dure,
se rejoint et s'unit à elle-même; perce, transsude, fouille, dissout, délite, agit sans se perdre
dans le labyrinthe qu'elle crée; puis elle s'apaise dans des lacs ensevelis qu'elle nourrit de
longues larmes qui se figent en colonnes d'albâtre, cathédrales ténébreuses d'où s'épanchent
des rivières infernales que peuplent des poissons aveugles et des mollusques plus vieux que le
déluge.

Dans ces étranges aventures, que de choses l'eau a connues!? Mais sa manière de connaître
est singulière. Sa substance se fait mémoire: elle prend et s'assimile quelque trace de tout ce
qu'elle a frôlé, baigné, roulé: du calcaire qu'elle a creusé, des gîtes qu'elle a lavés, des sables
riches qui l'ont filtrée. Qu'elle jaillisse au jour, elle est toute chargée des puissances primitives
des roches traversées. Elle entraîne avec soi des bribes d'atomes, des éléments d'énergie pure,
des bulles de gaz souterrains, et parfois la chaleur intime de la terre.

Considérez une plante, admirez un grand arbre, et voyez en esprit que ce n'est qu'un fleuve
dressé qui s'épanche dans l'air du ciel. L'eau s'avance par l'arbre à la rencontre de la lumière.
L'eau se construit de quelques sels de la terre une forme amoureuse du jour. Elle tend et
étend vers l'univers des bras fluides et puissants aux mains légères.»

PAUL VALÉRY, Louanges de l'eau, La Pléiade, p. 202-204.

3
 Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier Josette Garnier d’avoir accepté d’être ma directrice de thèse
et de m’avoir encadrée durant ces trois années marathoniennes. Elle a toujours été attentive à
la progression de mon travail, elle a su m’encourager durant les moments difficiles (merci le
déménagement et les coupures de courant à répétitions !). Optimisme, pragmatisme et
disponibilité ne sont pas ses moindres qualités. Merci Josette.

Je remercie Monsieur Alain Tabbagh de m’avoir accueillie au sein du laboratoire et de la

grande équipe de l’UMR sisyphe.

Je suis extrêmement reconnaissante envers l’ensemble des membres du jury d’avoir accepté
de juger mon travail. Je remercie Madame Patricia Bonin et Monsieur Pierre Caumette pour
leur travail de rapporteurs ainsi que Madame Valérie Degrange et Messieurs Hendrikus
Laanbroek et André Marriotti pour leur présence en tant qu’examinateurs.

Je tiens particulièrement à remercier Monsieur Ghislain de Marsily, pour m’avoir fait

confiance, accordé une bourse et intégrée à l’Ecole Doctorale Géosciences et Ressources
Naturelles, dans le cadre de laquelle j’ai été acceptée malgré mon sujet de thèse bien
atypique. Merci Monsieur de Marsily de m’avoir prodigué de nombreux conseils et de
consacrer une grande partie de votre temps à tous les thésards, ces années passées à l’UMR
Sisyphe ont été une grande chance, donnant une pluridisciplinarité passionnante à mon
travail.

J’exprime ma reconnaissance à tous les membres de l’UMR et notamment à toute l’équipe

« Piren », chercheurs, techniciens, thésards, SIGistes et stagiaires, avec lesquels j’ai travaillé
dans une ambiance détendue, en toute liberté et amitiés. Merci Anun pour ces longues heures
passées devant le chromato. Merci Maïa pour ton soutien et nos conversations entre deux
portes au labo et tous ces bons petits plats accompagnés de Vodka citron glacée….
Merci à Amélie, Samia et Florence pour votre amitié, votre complicité, votre soutien et tous
ces moments partagés au labo, sur le terrain et pendant nos petites soirées, depuis déjà trois
ans.

Je souhaite également remercier les personnes qui ne sont plus au laboratoire mais qui ont
beaucoup compté, merci Maïté, ton aide précieuse et ta joie de vivre m’ont permis de me
sentir à l’aise dès mon arrivée au laboratoire.

Je tiens particulièrement à remercier Thierry Berthe pour sa collaboration et l’ensemble de

ses conseils. Je suis également très reconnaissante à Gilles Billen, Valérie Degrange,
Fabienne Petit et Laurent Phillipot pour avoir suivi mon travail et contribué à son bon
déroulement grâce à leurs commentaires scientifiques extrêmement précieux.

Merci au Professeur Hendrikus Laanbroek de m’avoir fait l’honneur de m’accueillir au sein de

son Institut durant ces deux courts séjours de 2 semaines chacun et d’avoir permis que je
manipule presque 24h/24 afin que je puisse rentabiliser mes voyages… je n’ai pas beaucoup
profité des Pays-Bas mais qui sait, peut être mon prochain séjour sera plus long… Merci aussi
à Manuela sans qui là-bas je n’aurais rien pu faire, elle a été très efficace au travail et une
excellente amie durant les courts moments de détente.

Un grand merci au personnel du Service de Navigation de la Seine et particulièrement à

Monsieur Ficht pour son aide précieuse sur le terrain, merci pour les prélèvements
exceptionnels de 200 L d’eau à Duclair.

Toute mon sympathie aux fées du secrétariat, à Nadine Nouani et Valérie Girard, toujours
disponibles pour régler le moindre problème dans les plus brefs délais.

4
Je ne peux oublier l’ensemble des thésards et ex-thésards qui m’ont entourée et supportée
(dans tous les sens du terme) et avec qui j’ai passé d’excellents moments.

Infiniment merci à toute ma famille d’avoir été présente et de me soutenir sans condition
avec toute son affection.

Merci enfin à toi Steph, pour ton amour de chaque instant.

5
6
LISTE DES ILLUSTRATIONS……………………………………………………………………………..11

INTRODUCTION GÉNÉRALE ............................................................................14

I. GÉNÉRALITÉS SUR LES MILIEUX LOTIQUES ET SUR LA NITRIFICATION 20

I.1. ÉCOLOGIE DES MILIEUX LOTIQUES ET FONCTIONNEMENT DE LA SEINE ................. 22

I.1.1. Fonctionnement écologique global des cours d’eau 22
I.1.1.1. Hydrosystème fluvial, un assemblage complexe .....................................................22
I.1.1.2. Le transport de matière organique et de nutriments ..............................................24
I.1.1.3. Equilibre N, P, Si et eutrophisation .........................................................................24
I.1.2. Microorganismes et cycles biogéochimiques 26
I.1.2.1. Rôles des microorganismes......................................................................................26
I.1.2.2. Interactions entre les cycles biogéochimiques........................................................27
I.1.2.3. Le cycle du carbone ..................................................................................................28
I.1.2.4. Phosphore et Silice...................................................................................................29
I.1.2.5. Le cycle de l’azote .................................................................................................... 30
I.1.3. Activité humaine, pollutions azotés et nitrification 35
I.1.3.1. Les sources multiples de pollutions .........................................................................35
I.1.3.2. L’agriculture .............................................................................................................35
I.1.3.3. Les rejets urbains .....................................................................................................36
I.1.3.4. Retombées atmosphériques.....................................................................................36
I.1.3.5. Les émissions de N2O...............................................................................................37
I.1.4. Fonctionnement écologique de la basse Seine 40
I.1.4.1. Caractéristiques générales....................................................................................... 40
I.1.4.2. Le bassin amont .......................................................................................................42
I.1.4.3. Les rejets de l’agglomération parisienne.................................................................44
I.1.4.4. L’axe fluvial anthropisé (la basse Seine) .................................................................45
I.1.4.5. L’estuaire ..................................................................................................................46
I.1.4.6. Modélisation du fonctionnement écologique de la Seine.......................................47

I.2. GÉNÉRALITÉS SUR LA NITRIFICATION ET LES BACTÉRIES NITRIFIANTES ............... 50

I.2.1. Taxonomie et Phylogénie des bactéries nitrifiantes 50
I.2.1.1. Taxonomie et phylogénie des bactéries nitrosantes................................................ 51
I.2.1.2. Taxonomie et phylogénie des bactéries nitratantes................................................54
I.2.2. Métabolisme des bactéries nitrifiantes 58
I.2.2.1. Métabolisme des bactéries nitrosantes ...................................................................59
I.2.2.2. Métabolisme des bactéries nitratantes ................................................................... 61
I.2.2.3. Relation entre énergie et synthèse ..........................................................................62
I.2.2.4. Cinétiques de nitrification et de croissance des bactéries nitrifiantes ..................64
I.2.2.5. Nitrification autotrophe vs. nitrification hétérotrophe..........................................65
I.2.3. Eléments de biochimie et de génétique 67
I.2.3.1. L’ammonium monooxygénase (AMO) ....................................................................67
I.2.3.2. L’hydroxylamine oxydoréductase (HAO) et les cytochromes associés..................69
I.2.3.3. La nitrite-réductase et l’oxyde-nitrique-réductase des bactéries nitrosantes.......70
I.2.3.4. Les systèmes d’oxydation des nitrites des bactéries nitratantes (nitrite
oxydoreductase NOR) ........................................................................................... 71
I.2.4. Écologie des bactéries nitrifiantes 72
I.2.4.1. Facteurs influençant la croissance des bactéries nitrifiantes .................................72
I.2.4.2. Ecologie des bactéries nitrifiantes .......................................................................... 75
I.2.4.3. Emissions de N2O par nitrification-dénitrifiante...................................................78

I.3. NITRIFICATION EN MILIEUX NATURELS ............................................................ 83

I.3.1. Techniques de détection du processus de nitrification 83
I.3.1.1. Dosage des différentes formes d’azote.................................................................... 84

7
 I.3.1.2. Les microélectrodes ................................................................................................ 84
I.3.1.3. Activités nitrifiantes : potentielles et réelles ...........................................................85
I.3.1.4. Emissions de N2O.................................................................................................... 86
I.3.2. Techniques d’étude des bactéries nitrifiantes 87
I.3.2.1. Techniques classiques de microbiologie .................................................................87
I.3.2.2. L’immunofluorescence ........................................................................................... 88
I.3.2.3. Technique de détection in situ : la technique FISH .............................................. 88
I.3.2.4. Techniques utilisant la PCR ................................................................................... 89
I.3.2.5. Limites des techniques ........................................................................................... 90
I.3.3. La nitrification dans les milieux naturels 92
I.3.3.1. Le sol .........................................................................................................................92
I.3.3.2. Biofilms, stations d’épuration et réacteurs nitrifiants ...........................................94
I.3.3.3. Les océans ................................................................................................................94
I.3.3.4. Les milieux d’eau douce ..........................................................................................95
I.3.3.5. Corrélation activité-populations bactériennes .......................................................96
I.3.4. Les populations bactériennes nitrifiantes dans les milieux naturels 97
I.3.4.1. Biofilms, stations d’épuration et réacteurs nitrifiants............................................99
I.3.4.2. Le sol ......................................................................................................................100
I.3.4.3. Les milieux aquatiques salins................................................................................100
I.3.4.4. Les milieux d’eau douce ........................................................................................ 101
I.3.5. Etat des connaissances du processus de nitrification en Seine en 2001 102

II. SITE D’ÉTUDE ET MÉTHODOLOGIE..........................................................102

II.1. SITE D’ÉTUDE ............................................................................................ 106

II.2. ECHANTILLONNAGE ET TRAITEMENT DES ECHANTILLONS ................................107

II.2.1. Stratégie d’échantillonnage 107
II.2.1.1. L’effet de la station d’Achères ............................................................................... 107
II.2.1.2. L’estuaire : salinité et bouchon vaseux ................................................................108
II.2.1.3. Bassin amont et apport latéraux ..........................................................................108
II.2.2. Prélèvement et traitement des échantillons 110
II.2.2.1. Prélèvements......................................................................................................... 110
II.2.2.2. Traitement des échantillons ................................................................................ 110

II.3. STOCKS D’AZOTE ET ACTIVITÉS NITRIFIANTES .................................................111

II.3.1. Dosages des différentes formes d’azote 111
II.3.1.1. Dosage de l’ammonium.......................................................................................... 111
II.3.1.2. Dosage du nitrite....................................................................................................111
II.3.1.3. Dosage du nitrate................................................................................................... 111
II.3.1.4. Dosage de l’oxyde nitreux...................................................................................... 111
II.3.2. Activités nitrifiantes potentielles 112
II.3.2.1. Activité potentielle nitrifiante ...............................................................................112
II.3.2.2. Activités nitrosantes et nitrates potentielles ........................................................112

II.4. EXPÉRIENCES EN BATCH ET CHÉMOSTAT....................................................... 114

II.4.1. Expériences en Batch : effet des concentrations en NH4+ et NO2- 114
II.4.2. Expériences en Chémostat : effet de la concentration en oxygène 114
II.4.2.1. Phase de mise en culture batch .............................................................................114
II.4.2.2. Phase de mise en culture chémostat.....................................................................115
II.4.3. Cinétiques de production de N2O 116

II.5. ECOLOGIE MOLÉCULAIRE............................................................................. 117

II.5.1. Extraction de l’ADN et purification 117
II.5.2. Quantification des bactéries nitrifiantes : la PCR compétitive 118
II.5.3. Diversité bactérienne nitrosante 122
II.5.3.1. Construction de banques de gène amoA.............................................................. 122
II.5.3.2. DGGE .................................................................................................................... 123

8
III. RÉSULTATS ..............................................................................................124

III.1. ÉTUDE DU PROCESSUS DE NITRIFICATION ..................................................... 127

III.1.1. La nitrification dans la basse Seine 128
III.1.1.1. Rôle des apports latéraux..................................................................................... 128
III.1.1.2. Azote et activités nitrifiantes dans la basse Seine .............................................. 136
III.1.1.3. Émissions de N2O dans la basse Seine................................................................140
Publication 1. Émissions de N2O dans la basse Seine et l’estuaire.................. 140
III.1.1.4. Étude du processus de nitrification en conditions contrôlées ............................161
Publication 2. Cinétiques de nitrification et de production de N2O par la
communauté bactérienne naturellement présente dans la Seine. .................. 161
III.1.1.5. Modélisation ........................................................................................................ 181
Publication 3. Modélisation des transformations de l’azote dans la basse Seine.
...................................................................................................................... 181
III.1.2. La nitrification dans l’estuaire aval 192
[Link] des différentes formes d’azote............................................................ 192
III.1.2.2. Activités nitrifiantes potentielles........................................................................ 195

III.2. ÉTUDE DES POPULATIONS BACTÉRIENNES NITRIFIANTES ................................201

III.2.1. Les bactéries nitrifiantes dans la basse Seine 202
III.2.1.1. Les populations bactériennes nitrosantes ......................................................... 202
Publication 4. Nitrification et bactéries nitrifiantes dans la basse Seine, étude
des sites de Triel et Duclair ........................................................................... 202
Publication 5. Analyse DGGE de la population bactérienne nitrosante dans la
basse Seine : Mise en évidence de l’impact de la station d’Achères ................. 215
III.2.1.2. La population bactérienne nitratante................................................................ 230
Publication 6. Nitrobacter et Nitrospira deux genres représentatifs de la
communauté des nitratantes : détection, quantification et comportement dans
la Basse Seine ............................................................................................... 230
III.2.2. Les bactéries nitrifiantes dans l’estuaire 246
III.2.2.1. La population bactérienne nitrosante ................................................................247
III.2.2.2. La population bactérienne nitratante ............................................................... 250

IV. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.......................................................... 253

IV.1. LA NITRIFICATION, SES ÉTAPES INTERMÉDIAIRES, SES POPULATIONS .............. 255

IV.2. LES FACTEURS DE DIVERSITÉ DES POPULATIONS NITRIFIANTES .......................257
IV.3. LA NITRIFICATION ET LE FONCTIONNEMENT ÉCOLOGIQUE DE LA SEINE ........... 260
IV.4. PERSPECTIVES ......................................................................................... 262

BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................... 265

9
LISTE DES ILLUSTRATIONS
TABLEAUX

Chapitre I.
Tableau I.1. Illustration du modèle théorique nommé « spiralling concept »……………………………….………..…24
Tableau I.2. River Continuum Concept…………………………………………………………………………………...24 Tableau
I.3. Réservoirs de carbone au sein de la biosphère……………………………….………………………….…29 Tableau I.4.
Abondance de l’azote dans différents milieux.……………………………………………………………..31 Tableau I.5.
Différentes formes inorganiques et état d’oxydation de l’azote (N).………………………………………32 Tableau I.6.
Description des étapes du cycle de l’azote.…………………………………………………………………32 Tableau I.7.
Différentes sources aquatiques et terrestres d’émissions de N2O.…………………………………………39 Tableau I.8.
Caractères morphologiques des cinq genres bactériens nitrosants.…………………………………….…52 Tableau I.9.
Caractéristiques physiologiques de certaines espèces bactériennes nitrosantes et description de leurs
habitats…………………………………………………………………………………………………..…………………….53 Tableau I.10.
Caractéristiques morphologiques et physiologiques des différents genres bactériens nitratants.………55 Tableau
I.11. Caractéristique de croissance de certaines bactéries nitrifiantes en culture pure……………………….65 Tableau
I.12. Paramètres cinétiques de croissance des bactéries nitrifiantes………………………………………..….66 Tableau
I.13. Exemple de taux de nitrification de quelques bactéries nitrifiantes autotrophes et hétérotrophes.……67
Tableau I.14. Nombre d’opérons amo et de copies du gène amoC chez plusieurs bactéries
nitrosantes…………….69 Tableau I.15. Inhibiteurs des deux étapes de la nitrification le plus fréquemment
utilisés……………………………..76 Tableau I.16. Effet de différents pesticides sur la croissance de Nitrobacter
agilis en culture pure..………………..…77 Tableau I.17. Production de NO et N2O pour des conditions optimum et
sub-optimum de concentration en
oxygène.………………………………………………………………………………………………………….……………82 Tableau I.18.
Microélectrodes utilisées dans la littérature pour l’étude du processus de nitrification…………………85 Tableau
I.19. Détermination du processus à l’origine des émissions de N2O par la technique combinant l’inhibition à
l’acétylène (C2H2) et à l’oxygène.………………………………………………………………………………………87 Tableau I.20.
Principales méthodes de biologie moléculaire utilisées dans les études d’écologie microbienne……...90 Tableau
I.21. Taux de nitrification potentielle (pNA) et réelle (rNA) dans des sols, réacteurs nitrifiants, sédiments d’eau
douce, estuariens et marins.…………………………………………………………………………………………..93

Chapitre II.
Tableau II.1. Présentation des campagnes effectuées entre 2001 et 2003 dans la Basse Seine…...………………..107
Tableau II.2. Présentation des campagnes d’échantillonnage réalisées dans l’estuaire de
Seine…………………....108 Tableau II.3. Présentation des couples d’amorces PCR utilisés pour la
cPCR………………………………………..118 Tableau II.4. Présentation des couples d’amorces PCR utilisés pour la
DGGE………………………………………123

Chapitre III.
Tableau III.1. Concentrations en ammonium, nitrite et nitrate et mesures des activités nitrosantes et nitratantes
potentielles des échantillons de sol et de sédiments prélevés dans le bassin de l’Orgeval………………………...130
Tableau III.2. Concentrations en ammonium, nitrite, nitrate et mesures des activités nitrifiantes, nitrosantes et
nitratantes potentielles dans les échantillons d’eau d’Achères……………..……………………………………….131 Tableau
III.3. Caractéristiques physicochimiques et activités nitrifiantes mesurées dans l’Eure et l’Oise…………...134
Tableau III.4. Paramètres cinétiques de nitrosation, nitratation et contrôlant la production de N2O par
nitrification-dénitrifiante………………………………………………………………………………………………………………….180
Tableau III.5. Comparaison des activités nitrosantes et nitratantes potentielles et réelles de l’estuaire de Seine
avec certaines activités nitrifiantes publiées………………………………………………………………………………..198 Tableau
III.6. Caractéristiques physico-chimiques des échantillons utilisés dans l’analyse des populations bactériennes
nitrifiantes au niveau de l’estuaire de Seine………………………………………………………………..246

10
FIGURES

Chapitre I.
Figure I.1. Schématisation de la boucle microbienne et de la chaîne trophique dans les milieux
aquatiques.……….28 Figure I.2. Interactions entre différents cycles
biogéochimiques.………………………………………………………...29 Figure I.3. Cycle de l’azote montrant les
connexions existant entre les milieux terrestres et aquatiques……………...34 Figure I.4. Concentrations
atmosphériques en N2O depuis 1750 jusqu’à nos jours……………………………………38 Figure I.5. Sources naturelles
et anthropiques d’émissions de N2O par les milieux aquatiques et terrestres………….39 Figure I.6. Émissions
globales de N2O par les écosystèmes aquatiques…………………………………………………39 Figure I.7. Variation des
débits à l’exutoire des grands sous bassins pour l’année 1999………………………………41 Figure I.8. Carte
représentant le réseau hydrographique et les 4 sous bassins et de la basse Seine…………………..42 Figure I.9.
Carte représentant le réseau hydrographique et l’occupation du sol du bassin de la Seine……………….42 Figure
I.10. Carte représentant les densités de populations dans le bassin de la Seine………………………………..43 Figure
I.11. Carte représentant les taux de croissance annuels de la teneur en nitrates dans le bassin de la Seine entre
1992 et 2000.…………………………………………………………………………………………………………………44 Figure I.12. Vue
aérienne de la station d’épuration d’Achères…………………………………………………………..46 Figure I.13. L’estuaire
de la Seine, sa sectorisation et illustration de la présence du bouchon vaseux grâce aux concentrations en MES à
l’étale de base mer………………………………………………………………….…………...47 Figure I.14. Représentation
conceptuelle du modèle RIVE………………………………………………………………49 Figure I.15. Arbre phylogénétique
de parcimonie maximum des bactéries nitrifiantes basé sur une analyse comparative de séquences d’ADNr
16S…………………………………………………………………………………….51 Figure I.16. Arbre phylogénétique basé sur la
comparaison (neighbor-joining) des séquences d’ADNr 16S………...54 Figure I.17. Arbre phylogénétique
(neighbor joining) du genre Nitrobacter…………………………………………....56 Figure I.18. Arbre phylogénétique
montrant la position des membres du phylum Nitrospira au sein de la phylogénie
bactérienne.…………………………………………………………………………………………………………………...57 Figure I.19.
Arbre phylogénétique du phylum Nitrospira………………………………………………………………..58 Figure I.20.
Modèles des chaînes de transfert des électrons des bactéries nitrosantes et nitratantes………………….59 Figure
I.21. Modèle hypothétique de l’oxydation de l’ammoniaque chez Nitrosomonas eutropha…………………..60
Figure I.22. Processus de nitrification-dénitrifiante ou processus OLAND……………………………………..……….61
Figure I.23. Modèle hypothétique de l’oxydation de l’ammoniaque……………………………………………………61
Figure I.24. Arrangement des gènes hao et amo chez N. europaea et Nitrosomonas sp. souche ENI-
11…………….68
Figure I.25. Description des étapes d’oxydation de l’ammonium.………………………………………………………70
Figure I.26. Effet de la température sur l’activité de Nitrosomonas et Nitrobacter………………………………….....74
Figure I.27. Effet du pH sur l’activité de Nitrosomonas et Nitrobacter………………………………………………….74
Figure I.28. Classification phylogénétique schématique basée sur les séquences d’ADNr 16S des bactéries
nitrosantes de la sous-classe β des Protéobactéries……………………………………………………………………………………...97
Figure I.29. Distribution des bactéries nitrosantes (séquences d’ADNr 16S) suivant les milieux où elles ont été
isolées ou détectées………………………………………………………………………………………………………………..….98 Figure
I.30. Distribution des bactéries nitrosantes (gène amoA) suivant les milieux où elles ont été isolées ou
détectées………………………………………………………………………………………………………………………98

Chapitre II.
Figure II.1. Représentation du site d’étude : la Basse Seine……………………………………………………………106 Figure
II.2. Représentation du bassin de l’Orgeval affluent du Grand Morin…………………………………………109 Figure
II.3. Protocole rappelant la méthode de mesure d’activité nitrifiante potentielle par incorporation de 14C…112
Figure II.4. Protocole rappelant la méthode de mesure des taux potentiels de nitrosation et
nitratation…………...113 Figure II.5. Test de linéarité de la méthode de mesure des cativités nitrosantes et
nitratantes potentielles………...113 Figure II.6. Schéma des cultures en
batch………………………………………………………………….…………...114 Figure II.7. Schéma du pilote en
chémostat………………………………………………………………..…………...115 Figure II.8. Protocole des cinétiques de
production de N2O………….…………………………………...…………...116 Figure II.9. Représentation des étapes du
protocole de PCR compétitive amoA…………………………………..…119 Figure II.10. Représentation de la
construction des stocks d’ADN compétiteur et d’ADN cible utilisés lors de la PCR compétitive ciblant
amoA………………………………………………………………………………………………..…120 Figure II.11. Représentation de
la construction des stocks d’ADN compétiteur et d’ADN cible utilisés lors de la PCR compétitive ciblant le genre
Nitrobacter…………………………………………………………………………………...120 Figure II.12. Représentation de la
construction des stocks d’ADN compétiteur et d’ADN cible utilisés lors de la PCR compétitive ciblant le genre
Nitrospira…………………………………………………………………………………….121

Chapitre III.

11
Figure III.1. Bassin de l’Orgeval affluent du Grand Morin.…………………………………………...………………..129
Figure III.2. Concentrations en ammonium, nitrite et nitrate à l’aval d’Achères.……………………………………..132
Figure III.3. Activités nitrosantes et nitratantes potentielles à l’aval d’Achères………………………………………..133
Figure III.4. Concentrations en ammonium, nitrite, nitrate et oxyde nitreux le long du continuum de la basse
Seine…………………………………………………………………………………………………………………………136 Figure III.5.
Données compilées des concentrations en ammonium, nitrite et nitrate des campagnes de 2001 à
2003………………………………………………………………………………………………………………………….137 Figure III.6.
Activités nitrosantes et nitratantes potentielles le long du continuum de la basse Seine……………….139 Figure
III.7. Évolution des concentrations en ammonium et nitrate dans le gradient de salinité pour l’ensemble des
campagnes de 2001 à 2003………………………………………………………………………………………………..192 Figure III.8.
Evolution des concentrations en ammonium dans le gradient de salinité………………………………193 Figure III.9.
Évolution des concentrations en nitrate dans le gradient de salinité……………………….…………..193 Figure III.10.
Évolution des concentrations en oxyde nitreux dans le gradient de salinité…………………………..194 Figure III.11.
Quantité de Matière en suspension (MES) en fonction de la salinité…………………………………..195 Figure III.12.
Évolution des activités nitrosantes et nitratantes potentielles dans le gradient de salinité…………….196 Figure
III.13. Relation entre les activités nitrosantes et nitratantes potentielles……………………………………….196 Figure
III.14. Test de l’effet de la salinité sur les activités nitrosantes et nitratantes potentielles…………………….197
Figure III.15. Bilan de l’azote entre Caudebec recevant les apports de l’estuaire amont et la Baie de Seine à la
salinité 15 0/00………………………………………………………………………………………………………………..199 Figure III.16.
Représentation schématique des proportions de chaque cluster bactérien nitrosant aux sites de Triel et Duclair
dans la Basse Seine.………………………………………………………………………………………………..214 Figure III.17.
Représentation schématique de la communauté bactérienne nitrosante le long du continuum de la basse Seine
depuis Paris jusqu’à l’estuaire pour la campagne de juillet 2002………………………………………….228 Figure III.18.
Nombre de copies de gène amoA dans l’estuaire.………………………………………………………247 Figure III.19.
Quantification du nombre de copies de gène amoA et activités nitrosantes potentielles des échantillons réalisés
dans l’estuaire.……………………………………………………………………………………………………...248 Figure III.20. Profil
DGGE d’échantillons prélevés durant un cycle de marée………………………………………..249 Figure III.21. Nombre
de bactéries du genre Nitrobacter et Nitrospira dans l’estuaire………………………………250 Figure III.22.
Quantification des bactéries nitratantes.…………………………………………………………………251 Figure III.23.
Activités nitratantes potentielles dans l’estuaire………………………………………………………….251

Chapitre IV.
Figure IV.1. Schéma récapitulatif illustrant notre démarche d’étude………………………………...………………..261

12
13
INTRODUCTION GÉNÉRALE

14
15
 Introduction

Certains organismes peuvent survivre sans air mais aucun ne peut survivre en absence
totale d’eau. L’eau est donc sans aucun doute l’élément essentiel de toute vie sur la Terre.
Dans la biosphère, les mers et océans contiennent 95% des ressources en eau de la planète,
alors que l’eau douce (lacs, rivières et aquifères souterrains), indispensable à la survie de
l’humanité ne représente que 3.5% dont les deux tiers se trouvent dans les nappes
phréatiques.

Depuis toujours, les rivières jouent un rôle important dans le développement des
civilisations ; hormis le fait que les cours d’eau soient une richesse économique, ils servent
également de voie de transport, ils permettent la création d’énergie et sont souvent des
milieux récepteurs de déchets humains et naturels. L’ensemble de ces activités anthropiques
contribue à déstabiliser l’équilibre environnemental et à créer des pollutions directement
nuisibles pour la vie aquatique, et indirectement néfastes à l’ensemble de la biosphère en
raison des échanges entre les compartiments aquatique, terrestre et atmosphérique.

Même en absence de pollution significative, la qualité des rivières change avec les
saisons et leur localisation géographique. Cependant la majorité des écosystèmes aquatiques
est aujourd’hui perturbée par des contaminations anthropiques. Les polluants dominants des
cours d’eau sont aujourd’hui les nitrates et les pesticides lessivés des sols agricoles sur-
fertilisés mais également les rejets urbains contenants toutes sortes de substances
(ammonium, matière organique, hydrocarbures, métaux lourds, médicaments, organismes
pathogènes ou non…). En effet, les rejets des effluents de stations d’épuration dans les
rivières, provoquent de forts bouleversements environnementaux quand, imparfaitement
traités, ils contiennent de grandes quantités de matière organique, de nutriments et de
micro-organismes.

La Seine et son bassin versant sont étudiés depuis de nombreuses années au sein de
l’UMR Sisyphe, dans le cadre des programmes PIREN-Seine et Seine-Aval. Dans la basse
Seine, une perturbation majeure est causée par le rejet des effluents de la station d’épuration
d’Achères. Ces effluents apportent au milieu récepteur une grande quantité d’ammonium
(NH4+), qui est ensuite complètement oxydé en nitrate (NO3-) au cours de son transfert vers
l’aval, grâce au processus de nitrification prenant place dans la basse Seine. Dans la zone
estuarienne un déficit en oxygène est alors en partie provoqué par une forte activité
nitrifiante.

Ces observations nous ont donc conduites à nous intéresser au processus de

nitrification, réalisé en deux étapes, par des bactéries chémolitotrophes nitrosantes (oxydant
l’ammonium en nitrite) et nitratantes (oxydant le nitrite en nitrate). Dans la basse Seine, une
production de N2O (gaz à effet de serre) peut également être observée. Ce N2O pourrait être
en partie produit en tant qu’intermédiaire lors du processus de nitrification-dénitrifiante,
étape apparaissant en conditions de stress oxique encore mal définies.

A l’aval d’Achères, le cycle de l’azote est profondément modifié par l’impact des
effluents de la station d’épuration. Il était nécessaire de comprendre dans quelles mesures les
apports de nutriments et de bactéries allochtones influencent le processus de nitrification à
travers les deux étapes connues de nitrosation et de nitratation, mais aussi par l’étape de
nitrification-dénitrifiante à l’origine du N2O et enfin d’évaluer le devenir et le rôle des
bactéries allochtones dans la Seine. La basse Seine est un site d’étude exceptionnel pour ce
type de recherche puisque les apports anthropiques de la station d’épuration d’Achères
peuvent représenter, en période estivale, jusqu’à 1/4 du débit du fleuve.

16
 Introduction

Ce travail de thèse a donc pour double objectif de :

• Améliorer d’abord la connaissance du processus de nitrification : nitrosation,

nitratation et émission de N2O par nitrification-dénitrifiante, en milieu naturel et tout
particulièrement dans une grande rivière anthropisée. Le processus de nitrification est donc
d’abord mis en évidence in situ. Toutefois, des expérimentations ont été réalisées en
laboratoire, afin d’améliorer la modélisation du processus de nitrification et d’intégrer au
modèle général du fonctionnement écologique de la Seine, les quantités de N2O émises sur ce
secteur de la basse Seine, mais également celles d’azote minéral transportées aux zones
côtières souvent à l’origine de l’eutrophisation. En effet, la modélisation passe par la
détermination des cinétiques et des paramètres des différentes étapes de la nitrification. Il
fallait d’une part affiner les valeurs des paramètres cinétiques des deux étapes classiques de
la nitrification en prenant en compte les deux groupes bactériens fonctionnels et d’autre part
définir les cinétiques et déterminer les paramètres contrôlant l’émission de N2O par le
processus de nitrification-dénitrifiante. La nitrification serait ainsi prise en compte dans le
modèle sous une complexité telle que, outre les variables classiques de qualité (O2, formes
des N, P, Si, biomasses des organismes associés), la production du N2O serait aussi calculée.
Ce modèle permettrait d’explorer la réponse du milieu récepteur tant aux conditions variées
de l’environnement (hydrologie, apports, etc.) qu’à une mise en place sans doute progressive
des traitements tertiaires programmés en stations d’épuration et en particulier à Achères à
l’horizon 2007.

• Connaître la composition des populations bactériennes qui réalisent les

différentes étapes du processus de nitrification et étudier leur origine et leur devenir au cours
de leur cheminement vers l’aval pour appréhender l’impact d’Achères, constituait par ailleurs
une démarche novatrice. Pour répondre à cet objectif, nous avons quantifié les populations
bactériennes nitrosantes et nitratantes dans la basse Seine et déterminé la diversité
phylogénétique des populations bactériennes nitrifiantes, leur évolution spatiale dans la
basse Seine ainsi que leur évolution temporelle.

17
 Introduction

Ce mémoire est présenté en 4 parties :

• La synthèse bibliographique, en première partie, fait le point sur le

fonctionnement écologique général des milieux lotiques et sur l’état actuel des connaissances
du processus de nitrification et des bactéries nitrifiantes. Le recyclage des éléments sera
détaillé à travers la description des cycles du carbone et de l’azote. Ceci nous conduira à
discuter la fragilité de l’équilibre des cycles biogéochimiques souvent bouleversés par
l’activité humaine. En effet, il existe un certain nombre de sources anthropiques de pollutions
et nous nous focaliserons sur le cas des pollutions azotées et leur incidence sur l’étape de
nitrification. Le fonctionnement écologique de la Basse Seine, site d’étude sera alors présenté.
Cette synthèse bibliographique abordera ensuite plus en détail le processus de nitrification et
sa réalisation par les bactéries nitrifiantes, incluant l’état d’avancement des connaissances
sur la phylogénie des bactéries nitrifiantes. Leur métabolisme sera décrit ainsi que certains
éléments biochimiques et génétiques aidant à la compréhension de ce métabolisme nitrifiant.
Enfin nous décrirons l’écologie des bactéries nitrifiantes au sein des milieux naturels.

• La seconde partie présente les méthodologies actuellement disponibles pour

l’étude du processus de nitrification et des populations bactériennes nitrifiantes. Nous
verrons que parmi la littérature, les sites d’études de la nitrification sont relativement
diversifiés allant des milieux terrestres et aquatiques, aux environnements artificiels tels que
des bioréacteurs. L’état des connaissances sur le processus de nitrification dans la basse
Seine sera alors introduit, ce qui permettra de présenter la stratégie que nous avons adoptée
dans ce travail (choix méthodologiques, échantillonnage, expérimentations…).

• En troisième partie, les résultats obtenus au cours de cette étude, sont

majoritairement exposés sous forme d’articles, regroupant classiquement à la fois la
méthodologie, les résultats et une discussion associée. Outre la présentation générale des
résultats des profils typiques de nitrification sur les 350 km de la Basse Seine, un des articles
y associe la quantification des émissions de N2O, dont les facteurs de contrôle sont étudiés
plus en détail dans un autre article. Trois autres articles sont plus axés sur la connaissance
des populations bactériennes, 1) sur les populations nitrosantes, d’abord globalement
quantifiées mais aussi étudiées dans leur diversité, 2) et sur deux genres bactériens nitratants
(Nitrobacter et Nitrospira).

• Enfin, une conclusion générale permettra d’expliquer l’apport de ce travail à la

connaissance fondamentale du processus de nitrification in situ dans un milieu anthropisé.
D’un point de vu plus appliqué, nous montrerons la contribution de notre travail à la
compréhension du fonctionnement global de l’écosystème Seine, débouchant sur une
meilleure intégration du processus de nitrification au sein de la modélisation.

18
19
 I. GÉNÉRALITÉS SUR LES MILIEUX
LOTIQUES ET SUR LA NITRIFICATION

20
21
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

I.1. Écologie des milieux lotiques et

fonctionnement de la Seine

Bien que les océans occupent la majeure partie de la surface de la biosphère et jouent
un rôle essentiel à l’échelle globale, les écosystèmes aquatiques continentaux, malgré leur
faible surface relative à l’échelle de la biosphère, présentent une importance écologique
majeure puisqu’ils reflètent directement le fonctionnement des bassins versants et la vie des
populations humaines riveraines. On désigne sous le terme d’écosystèmes limniques
l’ensemble des milieux d’eaux douces continentaux (eaux courantes, lacustres et stagnantes).
On les subdivise en écosystèmes lenthiques (lacs, étangs, mares, marais et marécages) où le
renouvellement des eaux est très lent et en écosystèmes lotiques (cours d’eau) où celui-ci est
rapide, les réservoirs se situant dans un gradient lenthique-lotique. Nous ne nous
intéresserons ici seulement au fonctionnement des écosystèmes lotiques, la Seine étant notre
site d’étude.

I.1.1. Fonctionnement écologique global des cours d’eau

Les écosystèmes lotiques ou cours d’eau, sont constitués d’un assemblage complexe
d’écosystèmes aquatiques dont l’ensemble est dénommé hydrosystème fluvial. Le
fonctionnement physique et biologique des cours d’eau est contrôlé par des contraintes
environnementales variées conduisant à une grande variabilité spatiale et temporelle.
L’objectif de ce paragraphe est de rappeler quelques grands principes d’organisation et de
fonctionnement des milieux lotiques.

I.1.1.1. Hydrosystème fluvial, un assemblage complexe

Les hydrosystèmes fluviaux sont en constante interaction d’amont en aval avec les
habitats environnants, le fonctionnement écologique de ces écosystèmes est donc régit par les
trois dimensions spatiales et la dimension temporelle (Ward 1989).

A la différence des lacs et autres eaux stagnantes, les écosystèmes lotiques dépendent
des divers habitats terrestres et semi-terrestres qui les jouxtent en terme de flux d’énergie,
d’apports en éléments minéraux nutritifs et de matières organiques à travers les flux d’eaux
et de particules suivant les trois dimensions : longitudinale, latérale et verticale (Vannote et
al. 1980 ; Newbold et al. 1981 ; Minshall et al. 1983). La dimension longitudinale, conjuguée
au temps de résidence, gouverne les transports de matière et d’énergie ; le « spiralling
concept » (Newbold et al. 1981) illustre les mécanismes de transferts chimiques, de
minéralisation, et de transport des éléments nutritifs selon des flux en hélice (Tableau I.1).
Au sein de ces systèmes, les communautés vivantes sont organisées en fonction de l’évolution
graduelle des facteurs abiotiques et biotiques et notamment en fonction de l’origine et du
type de matière organique illustré par la théorie du continuum fluvial ou « River Continuum
Concept » de Vannote et al. (1980) (Tableau I.2). La dimension latérale, quant à elle,
concerne toutes les relations entre le cours d’eau et son bassin versant. Le cours d’eau est
surtout en relation permanente avec les écosystèmes riverains, comme la ripisylve, les zones
ripariennes et autres zones humides, ainsi que les écosystèmes lentiques constitués de bras
morts, d’étangs, de sablières ou réservoirs en dérivations. Tous ces milieux jouent un rôle de
filtre capable de réduire la charge polluante en provenance du bassin versant (Mitsch 1992 ;
Hunt et al. 1999 ; Billen & Garnier, 1999 ; Garnier et al. 1999). La dimension verticale,

22
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

illustrée par les relations du cours d’eau avec la zone hyporhéïque, les aquifères et les nappes
phréatiques sous-alluviales, a un rôle majeur rappelé par Hynes (1983) et Boulton et al.
(1998). Cette zone est le siège d’échanges d’eau, de nutriments, de matière organique et
d’oxygène, répondant à des variations de débit ainsi qu’à des changements de topographie et
de porosité du lit du cours d’eau. Enfin, la dimension temporelle mêlant l’échelle des temps
géologiques à une échelle de temps beaucoup plus courte perçue par les organismes
aquatiques est également essentielle à la compréhension du fonctionnement global d’un
cours d’eau.

Tableau I.1. Illustration du modèle théorique nommé « spiralling concept ».

Ce modèle a été décrit par Newbold (1981). Il illustre les effets des différentes interactions existant
entre la vitesse du courant, les mouvements de dépôt/remise en suspension, les activités biologiques
(respiration benthique et taux de recyclage des nutriments) et les effets sur le cycle de la matière
organique dans les rivières. (Adapté d’après Minshall et al. 1983)

Tableau I.2. River Continuum Concept. Principaux paramètres décrits dans la théorie du
continuum fluvial définissant l’écologie des rivières suivant leurs ordres.

23
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

Le réseau hydrographique est fortement hiérarchisé : ses éléments (taille du bassin,

nombre de tributaires, densité du drainage) présentent une importance croissante depuis les
ramifications originelles de l’amont dépourvues de tributaires (ordre 1, cf. ordination de
Strahler, 1957) jusqu’à l’axe principal (d’ordre 7 à 9 pour nos rivières européennes), ce qui
favorise le développement de biotopes variés (Tableau I.2). Hormis cette classification, les
écosystèmes lotiques comportent toujours quatre zones écologiques distinctes d’amont vers
l’aval : le crénon, le rhithron, le potamon et l’estuaire (Ramade 2003), auxquelles sont
associées des caractéristiques environnementales spécifiques : teneur en nutriments (milieu
oligotrophe, mésotrophe puis eutrophe d’amont en aval), oxygénation, température et
peuplement. Ainsi se mettent en place, d’amont en aval, des écosystèmes contrastés abritant
une diversité spécifique, notamment microbienne, parfaitement adaptée.

I.1.1.2. Le transport de matière organique et de nutriments

Une rivière est un système comprenant à la fois son cours principal et ses tributaires,
s’écoulant en une direction et portant une charge significative de matière dissoute et
particulaire ayant une source naturelle ou anthropique. Les rivières contiennent des
composés naturels tels que les ions inorganiques dissous (Ca2+, HCO3-, SO42-, Cl-, Mg2+, Na+,
K+…), les nutriments (SiO2, NO3-, NH4+, orthophosphates…), des composés organiques
(acides humiques, hydrocarbures…) et des substances xénobiotiques synthétisées par
l’homme (micropolluants organiques) présents pour la plupart à de très faibles
concentrations mais ayant parfois des pouvoirs fortement toxiques. Ces matières se déplacent
vers l’aval et sont sujettes à d’intensives transformations chimiques et biologiques (Admiraal
& Van Zanten 1988). Les nutriments transportés par les fleuves influencent les activités
biotiques au niveau des estuaires et des zones côtières et peuvent servir d’indicateurs
importants de changements des conditions dans le bassin versant (Howarth et al. 1996). Les
concentrations en nutriments peuvent atteindre des taux très élevés dans les cours d’eau
traversant des zones urbaines et/ou agricoles. En effet, depuis 1950, l’impact humain sur son
environnement est très important, l’augmentation de l’agriculture intensive, la déforestation,
la construction de barrages, le développement urbain en sont des exemples (Crutzen &
Stoermer 2000 ; Meybeck, 2001). Les caractéristiques des rivières (température,
stratification, turbulence, turbidité, conditions redox, régime hydrologique, et productivité in
situ) ont été modifiées (Friedl & Wuest 2002). Les activités humaines ont induit une
augmentation de 50 à 70% des flux de matières organiques particulaires (MOP) dans les
rivières (Smith & Hollibaugh 1993 ; Ver et al. 1999 ; Rabouille et al. 2001). Aux sources
naturelles de nutriments inorganiques (décomposition de la matière organique) se sont
ajoutés des sources anthropiques (fertilisation, rejets urbains…) qui ont augmenté d’un
facteur 2 à 3 les apports en N et P (Howarth et al. 1996), alors que les concentrations en silice
tendent à diminuer à cause de la rétention de cet élement par les barrages (Humborg et al.
2000). Tous ces changements ont donc un impact sur les cycles biogéochimiques naturels et
provoquent des modifications au niveau des rapports entre les concentrations des éléments
biogènes majeurs azote, phosphore et silice (N, P et Si) induisant le phénomène
d’eutrophisation des milieux aquatiques (Turner et al. 1998).

I.1.1.3. Equilibre N, P, Si et eutrophisation

Dans des milieux peu anthropisés, les cycles biogéochimiques sont en équilibre, aucun
des éléments n’étant en excès par rapport aux besoins des organismes. Cependant l’activité
humaine mène à certains dérèglements en introduisant dans les milieux aquatiques de
grandes quantités d’azote et de phosphore, éléments nutritifs principaux dont les cycles
biogéochimiques sont alors bouleversés. L’augmentation de la production primaire qui en
résulte entraîne une accumulation de biomasse végétale, typique de l’eutrophisation du

24
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

milieu récepteur. Le problème d’eutrophisation des rivières est très général en Europe
occidentale où la densité de population est particulièrement élevée et l’agriculture intensive.
La plupart des grandes rivières souffrent d’eutrophisation : le Rhin, la Loire, le Lot, le Pô, le
Rhône et la Seine (Garnier et al. 1998b). Dans les petites rivières non canalisées,
l’eutrophisation se manifeste par une croissance excessive de végétaux fixés (macrophytes)
qui encombrent le lit de la rivière, alors que dans les grandes rivières l’eutrophisation est liée
au développement d’algues planctoniques (bloom de cyanobactéries) (Billen et al. 1994). Ces
développements intempestifs de végétaux aquatiques provoquent indirectement une
désoxygénation locale de la colonne d’eau nuisible à la communauté piscicole. Ce
dysfonctionnement concerne également les zones côtières dont la seule source appréciable de
nutriments provient du lessivage des bassins versants et de son transport par les rivières
(Garnier et al. 2001 ; Nemery 2003). Pour les milieux côtiers d’importantes marées rouges
(Dinoflagéllés) et blooms algaux ont été cartographiés sur les côtes européennes depuis la
mer Baltique jusqu’à la Manche et dans la Méditerranée (Caumette & Baleux 1980). La santé
publique est donc également concernée par ce phénomène d’eutrophisation à cause de la
production de toxines par certaines cyanobactéries (Rosenberg et al. 1988 ; Vollenweider et
al. 1992 ; Falconer 1996).

Il existe un équilibre entre les nutriments : azote, phosphore et silice (Meybeck 1982 ;
Conley et al. 1993 ; Galloway et al. 1995 ; Seitzinger & Sanders 1997 ; Vitousek et al. 1997 ;
Kroeze & Seitzinger 1998 ; Caraco & Cole 1999), contrôlant le niveau et le type de production
primaire (développement de diatomées ou de cynobactéries) (Rabalais & Turner 2001). Le
débit, les apports diffus et ponctuels et les processus de rétention ou d’élimination étant très
différents d’amont en aval du réseau hydrographique, ceci induit des changements au niveau
des rapports N : P : Si. Ces rapports doivent être comparés à la composition moyenne algale,
qui détermine dans quelles proportions le phytoplancton ou les macrophytes prélèveront les
nutriments. Le rapport N/P moyen des végétaux aquatiques est de 7 (en poids de N et de P)
(Redfield et al. 1963) ; le rapport Si/N des populations de diatomées d’eau douce est en
moyenne de 5.5 (en poids de Si et de N), tandis qu’il est de l’ordre de 2 pour les diatomées
marines (Conley & Kilham 1989). Souvent l’azote apparaît comme excédentaire par rapport
au phosphore et à la silice dans la majeure partie du réseau hydrographique. Le phosphore
est l’élément le plus susceptible de limiter la croissance algale, surtout dans les secteurs
amonts (Vollenweider 1968 ; Schindler 1977). La silice peut également limiter la croissance
des diatomées en période de pic printanier.

25
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

I.1.2. Microorganismes et cycles biogéochimiques

L’interaction continue, qui s’exerce entre facteurs abiotiques et organismes vivants
d’un écosystème, s’accompagne d’une circulation ininterrompue de matière entre biotope et
biocœnose sous forme de substances alternativement minérales et organiques, dissoutes et
particulaires. L’existence des cycles biogéochimiques, confère à la biosphère un pouvoir
considérable d’autorégulation ou d’homéostasie, lequel assure la pérennité des écosystèmes :
carbone, hydrogène, oxygène, azote, phosphore, soufre, potassium, chlore, calcium,
magnésium, fer, silice et une trentaine d’autres éléments, indispensables à l’édification des
cellules vivantes, sont sans cesse transformés et absorbés par les microorganismes (Atlas &
Bartha 1998).

Même si la description des cycles biogéochimiques ne peut se faire qu’élément par

élément, tous les cycles sont néanmoins interconnectés. Le cycle du carbone (élément
biogène majeur) jouant un rôle d’entraînement et de régulation pour tous les autres cycles, le
phosphore et la silice étant des éléments fondamentaux pouvant limiter la production
primaire et le cycle de l’azote, objet de notre étude, seront les seuls à être développés ici,
toutefois nous aborderons quelques interactions entre les différents cycles.

I.1.2.1. Rôles des microorganismes

Dès 1935, Tansley, (dans Ramade 2003) a décrit un écosystème comme étant
l’association d’un environnement physico-chimique spécifique avec une communauté
vivante. L’organisation globale des cours d’eau est ainsi à la base des notions d’écologie
fondamentale. En effet, les milieux lotiques, caractérisés par un ensemble de facteurs de
nature physique et chimique (localisation géographique, intensité du courant, concentrations
en éléments minéraux, intensité des flux de matière…) définissent des biotopes particuliers
auxquels sont associés des systèmes biologiques complexes, les biocœnoses, constituées de
communautés spécifiques, d’associations de micro-organismes, de plantes et animaux
inféodés à un milieu particulier. Biotope et biocœnose sont en perpétuelles interactions.

Avant les années 1970, les écologistes estimaient la taille de la communauté

microbienne au moyen de techniques de mise en culture et pensaient par exemple que l’eau
de mer ne contenait que quelques centaines de cellules par millilitre (Jannasch & Jones
1959). Toutefois, ils ont réalisé grâce à l’arrivée des techniques de microscopie électronique et
à épifluorescence que la communauté microbienne pouvait être beaucoup plus
importante : de l’ordre de plusieurs millions de cellules par millilitre (Watson et al. 1977 ;
Hobbie et al. 1977 ; Porter & Feig 1980).

A l’origine de la chaîne alimentaire et contribuant à la production primaire, ces micro-

organismes jouent un rôle prépondérant dans les flux de matière et d’énergie au sein des
écosystèmes aquatiques formant ainsi, par des interactions multiples, un réseau trophique
microbien extrêmement complexe (Cole et al. 1988 ; Pace & Cole 1996).

On distingue les microorganismes autotrophes et hétérotrophes. On compte parmi les

autotrophes, utilisant le CO2 comme source de carbone, les microorganismes
photosynthétiques (phytoplancton, protozoaires chlorophylliens, cyanobactéries) et les
microorganismes chemiolithotrophes (intervenant dans les cycles de l’azote, du soufre et du
fer). Ces microorganismes jouent un rôle primordial dans la production primaire et le
recyclage des nutriments au sein des milieux aquatiques (Dugdale & Goering 1967 ; Hecky &
Kilham 1988). Le rôle des microorganismes hétérotrophes (bactéries, protozoaires,
microzooplancton) est primordial dans le recyclage du carbone. Ils utilisent le carbone
organique en conditions aérobies et/ou anaérobies et permettent le recyclage et la remise à
disposition de la matière organique, à travers la boucle microbienne (Azam et al. 1983)

26
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

venant se greffer sur la chaîne trophique classique (Carpenter & Kitchell 1993) (Figure I.1).
Les transferts vers les niveaux trophiques supérieurs peuvent conduire à des pertes en
carbone (sous forme de CO2 ou de CH4), en phosphate et en azote, remis à disposition des
producteurs primaires sous forme minérale (par exemple : PO43-, NH4+) (Bianchi 1998).

Figure I.1. Schématisation de la boucle microbienne et de la chaîne trophique dans les milieux
aquatiques.

Les microorganismes autochtones des milieux lotiques peuvent être planctoniques ou

attachés à des surfaces (biofilm ou périphyton accroché aux matériaux immergés) ou encore
fixés aux particules minérales et organiques fines en suspension dans la colonne d’eau
(Böckelmann et al. 2000 & 2002; Neu et al. 2000). La présence ou l’absence d’une source de
carbone et d’énergie (organique ou minérale), induit une première spatialisation, la présence
de lumière favorise les individus phototrophes, et enfin la présence ou non d’oxygène permet
l’installation des microorganismes aérobies ou anaérobies, respectivement.
Au total, les communautés microbiennes assurent ainsi, avec des spécificités plus ou
moins grandes, le renouvellement des nutriments à travers les cycles biogéochimiques.

I.1.2.2. Interactions entre les cycles biogéochimiques

Dans un environnement naturel où est présent un grand nombre de microorganismes,

il est difficile de déterminer quel groupe dégrade un certain substrat et avec quel taux de
conversion. Ce type de questionnement a pu être en parti résolu grâce à l’utilisation
d’inhibiteurs spécifiques de certaines activités (Oremland & Capone 1988). Toutefois
plusieurs populations peuvent entrer en compétition pour un même substrat ou une même
population peut utiliser différents substrats suivant les conditions environnementales. Les
interactions sont multiples et extrêmement complexes au sein d’un milieu, elles sont régies
par des facteurs biotiques et/ou abiotiques parfois mal définis.

En effet, à partir d’un pool d’accepteurs d’électrons potentiels présents dans

l’environnement, les microorganismes utilisent celui qui peut être, génétiquement parlant,
utilisé et qui fournit le meilleur rendement énergétique. Il apparaît donc une compétition
pour le substrat au sein de la communauté microbienne et une spatialisation des activités
suivant la disponibilité à la fois de l’oxygène et des différents accepteurs d’électrons. Une telle
organisation peut apparaître dans des sédiments (Figure I.2) ou des biofilms bactériens où
des gradients chimiques (pH, oxygène…) se forment spatialement (Wimpenny 1992).

27
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

Figure I.2. Interactions entre différents cycles biogéochimiques (C, N, S, O). Stratification de
l’utilisation des accepteurs d’électron (O2, NO3-, SO42- et HCO3-) suivant la profondeur dans les
sédiments côtiers (D’après Atlas et Bartha 1998).

D’autres interactions dépendent moins de la spatialisation, il s’agit d’interactions

positives de type coopération. Plusieurs exemples peuvent être considérés : 1) Les formes
réduites de l’azote (N), du soufre (S), du fer (Fe) et du manganèse (Mn), sont produites grâce
à la fixation de substances organiques durant la photosynthèse ; en retour, la ré-oxydation
chémolithotrophe de ces éléments est liée à la conversion du CO2 par les cellules
(métabolisme autotrophe) ; Les cycles du carbone (C), de l’hydrogène (H) et de l’oxygène (O)
sont donc intimement impliqués dans le recyclage de l’azote, du soufre, du fer et du
manganèse. 2) La solubilisation, l’assimilation et la précipitation du calcium (Ca) et de la
silice (Si) sont directement ou au moins énergétiquement, liées à la photosynthèse et à la
respiration du carbone. 3) Les acides libérés, par exemple, lors de la nitrification ou de
l’oxydation des sulfures, aident à la mobilisation du phosphore ; de plus, la photosynthèse et
la respiration sont nécessaires pour son assimilation et sa conversion en phosphate.
Il ne s’agit ici que de montrer par quelques exemples, la complexité des interactions et
des relations liant l’ensemble des cycles biogéochimiques.

I.1.2.3. Le cycle du carbone

Le carbone est un des éléments biogènes majeur, sa répartition dans la biosphère est
décrite dans le tableau I.3.
Tableau I.3. Réservoirs de carbone au sein de la biosphère.

28
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

Deux phénomènes biologiques fondamentaux conditionnent et régulent la circulation

du carbone dans la biosphère, il s’agit de la photosynthèse et de la respiration (Wetzel 1983 ;
Atlas & Bartha 1998). Les microorganismes autotrophes (photosynthétiques et
chimiolithotrophes) convertissent le CO2 en composés organiques ; cette production primaire
nette est alors disponible pour les consommateurs hétérotrophes qui, en respirant,
convertissent la matière organique en CO2. Les deux mécanismes, production et respiration,
ne se compensent pas forcément, ce qui conduit à des systèmes globalement hétérotrophes
puis globalement autotrophes d’amont en aval d’un réseau (Vannote et al. 1980). Ce schéma
peut être modifié quand les systèmes sont perturbés, par exemple par des apports allochtones
de matière organiques (Garnier et al. 2001).
En plus de ce carbone organique autochtone (carbohydrates, acides aminés et acides
organiques, …), les milieux aquatiques reçoivent de grandes quantités de résidus végétaux
(polymères carbonés tels que la cellulose ou la lignine), mais également des quantités
significatives de composés organiques apportés par l’action de l’homme. La composition
qualitative de la matière organique présente dans les milieux aquatiques est donc très variée
et bien que les possibilités enzymatiques des microorganismes semblent illimitées, certains
composés allochtones peuvent être récalcitrants à la biodégradation (Rieger et al. 2002), ou
nécessite l’adaptation métabolique de la microflore (par exemple : communauté bactérienne
biodégradatrice d’hydrocarbures aromatiques polycycliques, HAP, Budzinski et al. 1998).

La dégradation et le recyclage de la matière organique dans la plupart des habitats

sont effectués par les bactéries à la fois dans des conditions aérobies et anaérobies. La gamme
la plus grande de transformations du carbone se passe en conditions aérobies
(biodégradation de polymères végétaux -cellulose, chitine, lignine- en composés organiques
simples et humiques, méthylotrophie ou utilisation de composés monocarbonés comme le
méthane ou le méthanol). Cependant certaines transformations, comme par exemple la
méthanogénèse (réduction du CO2 en CH4 par des microorganismes chimiolithotrophes) ou
acétogénèse (réduction du CO2 en acétate), ne se passent qu’en conditions anaérobies (Wetzel
1983 ; Atlas & Bartha 1998).

I.1.2.4. Phosphore et Silice

Le phosphore et la silice sont les deux éléments pouvant limiter la production

primaire dans les milieux aquatiques.

Le phosphore représente moins de 0.1% (en masse) de la composition élémentaire de

la lithosphère (Pourriot & Meybeck 1995) mais il est d’une grande importance écologique.
Composant essentiel du vivant (nucléotides, ADN, phospholipides des membranes
cellulaires, enzymes) il joue un rôle clé dans le transfert d’énergie (ATP). Le stock de
phosphore minéral disponible pour les êtres vivants est entièrement contenu dans les roches
ignées, il est mis en solution par altération chimique puis introduit dans les eaux
continentales par érosion et lessivage. Ces processus entraînant une partie du phosphore, qui
associé à de fines particules, se retrouve non disponible pour le vivant (Filippelli 2002). Le
cycle du phosphore ne fait pas intervenir de réaction d’oxydo-réduction, mais alterne entre
des formes solubles et insolubles. La plupart des transformations du phosphore effectuées
par des microorganismes peuvent être vue comme un transfert entre phosphate inorganique
et organique ou comme un transfert de phosphate insoluble (formes immobilisée) à des
composés solubles et mobiles (Atlas & Bartha 1998). Dans l’eau le phosphore est sous forme
d’ion phosphate correspondant à l’équilibre de dissociation de l’acide orthophosphorique
(H3PO3 ↔ H2PO4- + H+ ↔ HPO42- + 2H+ ↔ PO43- + 3H+). Souvent la disponibilité du
phosphate est le facteur limitant de la croissance des microorganismes et de la productivité
du milieu. Le phosphore introduit dans les écosystèmes aquatiques est acheminé par les
fleuves aux zones côtières et fertilise les eaux littorales qui, de ce fait, sont généralement très

29
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

productives en phytoplancton et algues marines. Par son ouverture sur les fonds océaniques
(perte par sédimentation de la matière organique), le cycle naturel du phosphore n’est pas
complètement bouclé. Par ailleurs, il ne présente pas de phase gazeuse significative (hormis
quelques infimes quantités de phosphure d’hydrogène dégagées par fermentation anaérobie
dans certains biotopes palustres) de sorte qu’il est exclusivement sédimentaire. Le cycle
global naturel du phosphore apparaît donc par nature « ouvert » à l’échelle de la biosphère,
ce qui le différencie nettement du cycle naturel de l’azote par exemple, qui parcourt une
véritable boucle entre l’atmosphère et la biosphère. L’homme contribue énormément à
amplifier le déséquilibre du cycle naturel du phosphore par l’introduction des engrais
phosphatés et aussi des phosphates comme détergents dans les lessives (Nemery 2003).

La silice est le second élément le plus abondant de la planète et représente 27% de la

lithosphère. L’altération de la silice minérale par l’acide carbonique présent dans les eaux de
pluie, libère de la silice dissoute (H4SiO4) qui enrichie les eaux fluviales. Cette production de
silice dissoute dépend de la lithologie, du débit des cours d’eau et par conséquent du climat
(Billen et al. 1998a). La silice dissoute peut être intégrée par les diatomées pour former leurs
frustules (silice biogénique) (Tréguer et al. 1995) ou par des plantes supérieures sous formes
de phytolithes pour rigidifier leur squelette (Conley 2002).

I.1.2.5. Le cycle de l’azote

L’azote est un élément essentiel à tous les organismes, il est présent dans la
constitution des protéines (acides aminés), des acides nucléiques, et divers polymères
(pigments…). Dans la biosphère, le plus important stock d’azote (1.000.000 milliards de
tonnes) se trouve sous forme gazeuse (N2) dans l’atmosphère. Seuls certains procaryotes sont
capables de fixer l’azote atmosphérique. Il existe également d’importants réservoirs d’azote
inutilisable, présent dans les roches ignées et sédimentaires sous forme d’ammoniaque non
échangeable. L’azote fixé, azote organique (organismes vivants, matière morte et humus) et
ions inorganiques (ammonium, nitrite et nitrate) pouvant être utilisés par tous les
organismes vivants est le stock le plus limité (Pourriot & Meybeck 1995) (Tableau I.4).

Tableau I.4. Abondance de l’azote dans différents milieux (Mariotti 1982)

L’azote inorganique connaît un grand nombre d’états d’oxydation allant de –3 à +5

(Tableau I.5). Il est présent dans les milieux aqueux sous formes dissoutes, complexées ou
gazeuse.

30
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

Tableau I.5. Différentes formes inorganiques et états d’oxydation de l’azote (N).

(D’après Hagopian & Riley 1998).

Toutes les étapes du cycle de l’azote effectuées par des populations microbiennes
spécifiques (Figure I.3) sont régulées par des contraintes environnementales déterminant en
retour la distribution des différents composés azotés. Les nombreuses transformations de
l’azote, permettent à cet élément de circuler entre le compartiment atmosphérique et les
milieux terrestres et aquatiques et de déterminer en partie la productivité écologique de ces
habitats. Avant toute anthropisation, le cycle de l’azote était en équilibre entre la fixation
d’azote atmosphérique (N2) et la dénitrification (production de N2). Cependant, les apports
anthropiques croissants déséquilibrent le cycle de l’azote, augmentant constamment la
quantité d’azote utilisable dans les milieux terrestres et aquatiques. Les différentes étapes du
cycle de l’azote fournissent ou demandent plus ou moins d’énergie aux bactéries qui les
réalisent (Tableau I.6).

Tableau I.6. Description des étapes du cycle de l’azote.

Equation et énergie libre (∆G’0) de ces réactions. (MO = Matière Organique)

Fixation de l’azote

Ce processus de fixation d’azote apparaît en réponse à des concentrations en

ammonium faibles ou limitantes dans le milieu. Suivant le milieu considéré, la fixation de
l’azote moléculaire (N2) peut être conduite par différents types de bactéries et

31
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

Archaebactéries qui convertissent l’azote moléculaire en ammoniaque (Howarth et al. 1988).

Les cyanobactéries (Anabaena, Aphanizomenon, Nostoc, Gloeotrichia, Cylindrospermum,
Calothrix, Scytonema et Tolypothrix) sont les principaux microorganismes fixateurs d’azote
dans les milieux aquatiques (Paerl 1990). La fixation de l’azote chez les cyanobactéries, se fait
dans des hétérocystes protégeant le complexe enzymatique (nitrogénase) de l’inactivation par
l’oxygène. Ces microorganismes tirent l’énergie nécessaire à la fixation de l’azote grâce à la
photosynthèse. Le taux de fixation d’azote par les cyanobactéries est généralement une ou
deux fois plus fort que celui des bactéries hétérotrophes du sol (Azotobacter, Azospirillum,
Klebsiella ou encore Azospirillum) (Atlas & Bartha 1998).

Ammonification ou minéralisation

Une seconde source d’ammonium est l’ammonification ou minéralisation de la

matière organique, effectuée par de nombreuses plantes, animaux et microorganismes
hétérotrophes. Ce processus contribue à la productivité de l’écosystème (Blackburn 1983). La
qualité de la matière organique va déterminer la rapidité avec laquelle elle sera minéralisée.
Elle pourra être plus ou moins labile ou réfractaire suivant son origine (Enriquez et al. 1993),
on peut la classer en 2 ou 3 compartiments aux temps de renouvellement différents (Billen
1982). En fonction de la complexité structurale de la matière organique, l’ammonification
peut être une simple réaction de désamination ou une série de processus métaboliques
complexes faisant intervenir des enzymes hydrolysant les polymères en composés
monomériques.

Dans l’environnement, un équilibre s’établit entre l’ammoniaque et l’ammonium en

fonction du pH et de la température d’après l’équation suivante (Anthonisen et al. 1976):

NH3 = [1.214 (NH4+ + NH3) 10pH] / [exp(6344/273 + T°C) + 10pH]

Nitrification

La nitrification est un processus en deux étapes au cours desquelles, l’ammoniaque

(NH3) ou les ions ammonium (NH4+) sont oxydés en nitrite puis en nitrate (Bock et al. 1992).
En conditions aérobies, ce processus est réalisé par deux groupes bactériens
chimiolithoautotrophes, ces bactéries nitrifiantes utilisant l’énergie dérivée de la nitrification
pour assimiler du CO2.

La première étape de la nitrification (nitrosation) est réalisée par les bactéries

nitrosantes (Prosser 1989), parfois nommées AOB (Ammonia–Oxidizing Bacteria). Ces
bactéries oxyderaient l’ammoniaque (et non l’ammonium, Suzuki et al. 1974) en nitrite,
immédiatement consommé par les bactéries nitratantes, le nitrite étant ainsi toujours présent
à de très faibles concentrations dans l’environnement. La nitrosation est réalisée en deux
temps grâce à l’intervention de deux enzymes : l’ammonium monooxygénase (oxydation de
l’ammonium en hydroxylamine NH2OH) et l’hydroxylamine oxydoréductase (oxydation de
l’hydroxylamine en nitrite) ; ce dernier stade produit des ions H+, qui acidifient le milieu.
Depuis peu, on sait que les bactéries nitrosantes en stress oxique peuvent également réaliser
de la dénitrification (nitrification-dénitrifiante) et générer des composés azotés gazeux tels
que du NO, N2O et N2 comme produits de l’oxydation de l’ammonium en utilisant le nitrite
comme accepteur d’électrons (Ritchie & Nicholas 1972 ; Goreau et al. 1980 ; Hynes &
Knowles 1984 ; Poth & Focht 1985 ; Kuai et al. 1998). Cette voie de transformation est encore
mal connue faute de méthode pour la mettre en évidence et mesurer son importance. Ce
processus est en outre désigné de manières très variables selon les auteurs, ce qui ne simplifie
pas la synthèse des connaissances.

32
 N2

NH3 , NOx , NO, HNO3 , NH3 , NOx , NO, HNO3 ,

PAN, PON PAN, PON

Fixation
Fixation N2O microbienne
industrielle Dépôts
Fixation Dépôts
microbienne atmosphériques atmosphériques

synthèse d’acides aminés

USINES

PLANTES
engrais STEP
R-NH2 ANIMAUX

Décomposition
de la matière
organique AGRICULTURE

NH4 + / NO3 -
cyanobactéries
urée Urée / N-organique Assimilation
N-organique
Hydrolyse/minéralisation Chaîne
NH3 /NH4 + trophique
Hydrolyse NO, N 2 O, Minéralisation
N2 nitritation Nitrif ication-Dénitrif iante

Nitrification
Ammonif ication Nitrif ication-Dénitrif iante
Dénitrif ication NO, N 2 O, Décomposition
NO2 - N2 de la matière
NH3 /NH4 + - - NO, N 2 O,
NO2 NO3 organique
nitritation nitratation N2
nitratation
Nitrification
Lessivage NO3 -
des sols
Réduction
Dissimilatrice des nitrates
diff usion N-organique

NO, N 2 O,
Assimilation
NO3 - N2

dénitrif ication

Réduction NH4 +
dissimilatrice du nitrate

Figure I.3. Cycle de l’azote montrant les connexions existant entre les milieux terrestres et
aquatiques. PAN = peroxyacyl nitrate, PON = particulate organic nitrogen
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

La seconde étape de la nitrification est réalisée par les bactéries nitratantes (Prosser
1989) que l’on appellera aussi NOB (Nitrite–Oxidizing Bacteria). Ce groupe bactérien
convertit le nitrite en nitrate grâce à une enzyme : la nitrite oxydoréductase.

D’autres microorganismes tels que des bactéries hétérotrophes et des champignons

sont capables d’effectuer une nitrification hétérotrophe (Verstraete & Alexander 1973),
cependant ce processus semble négligeable dans l’environnement. La nitrification
hétérotrophe peut également générer du N2O, produit intermédiaire dans la réduction du
NO2- en N2. Des quantités non négligeables de N2O peuvent être produites par ce processus,
sous certaines conditions, par exemple en milieu très acide avec de fortes concentrations en
oxygène et en matière organique (Papen et al. 1989 ; Anderson et al. 1993 ; De Boer &
Kowalchuk 2001).

Réduction assimilatrice et dissimilatrice du nitrate

L’assimilation (ou réduction assimilatrice) du nitrate est réalisée, en présence

d’oxygène, par un groupe hétérogène de bactéries (Lin & Stewart 1998), champignons
(Sengupta et al. 1996), algues (Solomonson & Vennesland 1972) et de plantes (Hagemann &
Redd 1980). Ce processus implique plusieurs systèmes enzymatiques (nitrate- et nitrite-
réductases) permettant la formation d’ammoniaque, ensuite incorporé rapidement sous
forme d’azote organique (acides aminés). Comme nous l’avons évoqué, ce processus
contribue à la production d’azote gazeux (NO, N2O, N2).
En conditions anaérobies dans des milieux fortement chargés en matières organiques,
lors du processus de réduction dissimilatrice du nitrate ou respiration des nitrates, le nitrate
peut devenir accepteur final d’électrons et être converti en ammonium, simultanément à
l’oxydation de la matière organique, toutefois, aucune forme d’azote gazeux n’est produite.
Une grande diversité de bactéries fermentatives et anaérobies strictes sont capables de
réaliser cette voie dissimilatrice (Focht & Verstraete 1977 ; Stouthamer 1988 ; Bonin 1996)
pouvant être très importante dans les sédiments estuariens et côtiers (Christensen et al.
2000 ; Bonin et al. 1998). Ce processus résultant en la conservation de l’azote sous une forme
disponible dans le milieu.

Dénitrification

La dénitrification est un processus anaérobie convertissant le nitrate en azote gazeux

(N2O et N2) pendant que du matériel organique est oxydé. La capacité à dénitrifier est très
largement distribuée au sein de différents groupes taxonomiques de bactéries hétérotrophes.
Le processus de dénitrification est inductible (activité facultative) : il est contrôlé par le
passage de conditions oxiques à des conditions anaérobies pour pratiquement tous les
dénitrifiants (Baumann et al. 1996). En présence d’oxygène moléculaire ces bactéries ont un
métaboliqme aérobie, mais en carence en oxygène, elles sont capables de maintenir leur
activité respiratoire en utilisant le nitrate comme accepteur final d’électron. Les bactéries
dénitrifiantes convertissent le nitrate en oxyde nitrique (NO) via le nitrite, puis en oxyde
nitreux (N2O) et enfin en azote gazeux N2 (selon les genres bactériens, une seule partie de
cette chaîne peut être effectuée). Dans les milieux aquatiques, la dénitrification existe
essentiellement dans les sédiments et les zones ripariennes et on n’observe pas ou peu
d’activité dénitrifiante dans la colonne d’eau (Bianchi et al. 1994; Fustec et al. 1998; Bonin et
al. 1998). Cependant ce processus peut devenir significatif dans les zones estuariennes où le
recyclage des nutriments est très actif et où les matières en suspension sont souvent très
concentrées et autorisent la présence de micro-niches anoxiques (Bianchi et al. 1994).

34
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

I.1.3. Activité humaine, pollutions azotés et nitrification

L’eau est une ressource avec des applications dans des domaines très variés.
Aujourd’hui, l’homme prend possession des milieux aquatiques pour satisfaire ses activités
récréatives (baignade, pêche…) et convoite également grandement les ressources destinées à
l’eau potable, pour son alimentation et son confort sanitaire. Les cours d’eau sont en outre
utilisés depuis longtemps à des fins commerciales et économiques (transport fluvial, usines
installées aux abords des rivières, génération d’énergie, irrigation des sols cultivés). Toutes
ces activités humaines conduisent à l’artificialisation et la pollution des cours d’eau,
auxquelles s’ajoutent de multiples rejets domestiques et industriels ainsi que les apports par
le lessivage des sols agricoles et miniers (Holt 2000).

I.1.3.1. Les sources multiples de pollutions

Aujourd’hui, la quasi-totalité des milieux aquatiques est anthropisée. En milieu rural,

l’agriculture est la source majeure de pollutions diffuses à laquelle s’ajoute, dans les milieux
urbains, les pollutions ponctuelles des effluents domestiques de stations d’épurations ou
industriels (Islam & Tanaka 2004). Les retombées atmosphériques constituent également
une autre source de pollution, plutôt diffuse ; des hydrocarbures aromatiques polycycliques
(HAP) peuvent être détectés dans les cours d’eau et sédiments marins relativement loin de
leurs sources d’émission (Tsapakis et al. 2003 ; Motelay-Massei et al. 2004)
Ces pollutions, ponctuelles ou diffuses, d’origine urbaine ou agricole, sont souvent la
source des mêmes contaminants (pesticides, herbicides, nutriments : P, N, C, matière
organique, métaux lourds, macropolluants, molécules synthétiques et microorganismes)
(Warren et al. 2003 ; Islam & Tanaka 2004). Les pollutions ponctuelles sont généralement
peu variables dans le temps (au niveau du volume et des concentrations déversées), elles sont
facilement identifiables et quantifiables, et leur impact est plus marqué en période d’étiage
estival, surtout lors des temps de pluie estivaux (Seidl et al. 1998). Au contraire, les pollutions
diffuses sont difficiles à caractériser dans l’espace et dans le temps car leurs quantités et
qualités sont très variables (Thornton & Jeffrey 1999), elles dépendent beaucoup des
événements pluvieux et des interactions avec les aquifères (pour l’azote en particulier).

I.1.3.2. L’agriculture

L’application de fertilisants naturels et d’engrais artificiels sur les sols agricoles peut
atteindre 200 kgN ha-1 an-1 dans les bassins des pays industrialisés. L’apport d’azote aux
zones côtières par les fleuves en Europe de l’Ouest, exprimé par unité de surface des basins
versants est compris entre 750-1500 kg [Link]-1 représentant des valeurs 10 à 20 fois
supérieures à celles estimées pour une situation pristine de forêt tempérée (Howarth et al.
1996 ; Billen et al. 1999b). L’application d’engrais est devenue excessive au cours des
dernières décennies, elle est passée de 10.8 Mt N an-1 en 1960 à 85.6 Mt N an-1 en 2000 (FAO
2002) en raison de la culture intensive. L’impact sur les eaux superficielles et les eaux
profondes est donc croissant (Spalding & Exner 1993 ; Billen 1999a).

Le nitrate, composé azoté mobile, est principalement apporté aux cours d’eau par le
lessivage des sols fertilisés, en moyenne en Europe 15kg N ha-1 an-1 (Haag & Kaupenjohann
2001). Dans le cas des sols cultivés, c’est pendant les périodes pluvieuses où le sol est laissé
nu après la récolte que se produisent les fuites d’azote les plus importantes (5 mg N.L-1 dans
le cas d’un ruisseau agricole du bassin amont de la Seine, Billen et al. 1998a). Au contraire,
les systèmes terrestres à couverture permanente (forêts et prairies) sont moins propices au

35
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

lessivage azoté (0.5 mg N.L-1 dans le cas d’un ruisseau forestier du bassin amont de la Seine :
Billen et al. 1998a).

Les bactéries nitrosantes oxydent en outre l’urée (provenant de l’élevage) et les

fertilisants ammoniacaux en nitrite, lui-même converti en nitrate par les bactéries
nitratantes. D’un point de vue anthropocentrique l’activité des bactéries nitrifiantes peut être
considérée comme étant à la fois négative et bénéfique. Elle joue un rôle central dans le cycle
de l’azote, mais contribue en même temps à l’acidification des sols agricoles et à la perte de
fertilisant en produisant des composés facilement lessivables ou utilisés comme accepteurs
d’électrons pour la dénitrification (Kennedy 1992). Le processus de nitrification peut donc
contribuer à une pollution significative des eaux en nitrite et surtout en nitrate. Souvent le
processus de nitrification n’est pas désiré en agriculture et dans certains pays, des inhibiteurs
de la nitrification comme le nitrapyrin (N-serve) ont été utilisés pour limiter les pertes
d’azote (Slangen & Kerkhoff 1984; Poth & Focht 1985).

I.1.3.3. Les rejets urbains

Le lessivage des zones urbaines et industrielles contribue également à enrichir les

milieux environnants (aquatiques ou terrestres) en oxydes d'azote issus de combustions. Les
rivières reçoivent en plus, les effluents urbains en quantités importantes, rejetés par les
industries et les municipalités après un traitement plus ou moins complet en station
d’épuration. Ceci induit une pollution directe par rejet des effluents dans les cours d’eau
(Chesterikov et al. 1998). Les données disponibles concernant la plupart des capitales
européennes sur les rejets de nutriment depuis la fin du 19ème siècle (Billen et al. 1999b)
montrent que les valeurs sont constantes autour de 10-15 g N hab-1 jour-1 proche du taux
physiologique d’excrétion défini par Verbanck et al. (1994). Les eaux usées urbaines
contiennent de l'azote sous forme organique, sous forme ammoniacale ou nitrique. Les
conséquences de tels rejets peuvent être multiples : la concentration en oxygène diminue à
l’aval immédiat des rejets urbains à cause de la forte demande en oxygène des
microorganismes hétérotrophes, pouvant induire de forts déficits locaux en oxygène.
L'ammonium, issu de l’hydrolyse de l’urée, peut également s’avérer toxique pour de
nombreuses espèces et contribuer au déficit en oxygène s’il est nitrifié. Les rejets urbains
contribuent également à l’apport de microorganismes, considérés comme allochtones, ils
peuvent ou non se maintenir dans le milieu récepteur et induire des modifications au niveau
des communautés endogènes, comme par exemple l’apport de résistances à certains
antibiotiques (Goñi-Urriza et al. 2000)

Une pollution indirecte existe également par production de boues par les stations de
traitement des eaux usées, entre les années 2000 et 2005 la production de boues par la
France devrait passer de 580.000 à 1.3 millions de tonnes de matières sèches produites par
an (ASIA 2000).

I.1.3.4. Retombées atmosphériques

L’eutrophisation des cours d’eau et notamment des estuaires peut être le résultat d’un
apport en azote pour partie provenant de dépôts atmosphériques (Paerl & Whitall 1999),
même si l’impact réel de ces apports n’est pas encore très bien documenté. Il faut cependant
noter que les dépôts atmosphériques peuvent contribuer jusqu’à 15-35% du flux annuel
d’apport d’azote par dépôts secs et humides dans le cas de 40 estuaires américains
(Alexander et al. 2000). Parmi les espèces azotées atmosphériques, on note la présence de
gaz anthropogènes (NOx dont le NO et NO2), l’ammoniaque (NH3) et l’oxyde nitreux (N2O),

36
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

des peroxyacyl-nitrates (PAN), de l’acide nitrique HNO3 et des sels d’ammonium.

L’industrialisation, les véhicules à moteurs et la combustion d’hydrocarbures sont des
sources importantes d’émissions de gaz, notamment de dioxyde d’azote (Vitousek et al. 1997 ;
Galloway et al. 1995). L’ammoniaque peut être émis par de nombreuses sources :
volatilisation à partir des effluents d’élevage ou des fertilisants synthétiques, combustions
(feux de forêt, incinération et hydrocarbures), émissions par les sols naturels et agricoles (Lee
et al. 1997 ; Bowman et al. 1997). L’ammoniaque peut être transféré très efficacement sur de
longues distances par volatilisation (Garban et al. 2004). Le NH3 étant instable, il est
rapidement converti en NH4+ ou se redépose à la surface terrestre, de fortes concentrations
sont toutefois relevées à proximité des sources d’émissions et proche de la surface terrestre
(Ferm 1998). Pitcairn et al. (2002) ont rapporté une diminution de 95% de la concentration
en NH3 à 650 m de la source. Dans l’atmosphère se forment des sels d’ammonium
((NH4)2SO4 ou NH4NO3) formant de fines particules ayant un temps de résidence beaucoup
plus long dans l’atmosphère. En prenant un temps de résidence de 6 jours et une vitesse de
vent de 5m s-1, la distance de transport de ces sels peut atteindre 2500 km (Irwin & Willams
1988). Enfin, l'azote gazeux fixé par les cyanobactéries peut en outre indirectement enrichir
les milieux aquatiques (Horne & Commins 1987 ; Jaffe 1992).

I.1.3.5. Les émissions de N2O

Les productions d’oxyde nitreux (N2O) ont jusqu’à présent été principalement
étudiées dans les environnements terrestres où les processus microbiens produisent plus de
70% de l’oxyde nitreux atmosphérique total (Conrad 1996). Ces dégagements de N2O se
produisent en grande partie sur les sols agricoles (4.2 Tg N-N2O an-1, IPCC 2001), soumis à
l’utilisation d’engrais azotés et posent donc le problème d’une perte considérable d’azote en
agriculture (Henault et al. 1998 ; Majumdar et al. 2002). La pollution des cours d’eau à cause
des intrants azotés provoque un déplacement de cette production de N2O dans les milieux
aquatiques et les zones côtières (Mc Elroy et al. 1978 ; Capone 1991).

Le N2O est d’une importance primordiale car c’est un gaz à effet de serre ayant un fort
impact sur notre environnement, 310 fois plus important que celui du CO2 (Trogler 1999).
Dans la stratosphère, ce gaz réagit avec les atomes d’oxygène en formant de l’oxyde nitrique
(NO) détruisant la couche d’ozone et pouvant provoquer des pluies acides (Crutzen 1981). La
concentration atmosphérique en N2O a augmenté de 15% depuis l’époque pré-industrielle
(Figure I.4) et une stabilisation au taux actuel de 311-313 ppb nécessiterait une réduction des
émissions anthropogéniques de plus de 50% (Houghton et al. 1996).

Figure I.4. Concentrations atmosphériques en N2O depuis 1750 jusqu’à nos jours.

37
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

Les émissions totales de N2O atteignent aujourd’hui 15.7 à 26.7 Tg N an-1 (Houghton
et al. 1996). Le N2O a de nombreuses sources anthropiques (Tableaux I.7) : les industries
(production de nylon), la combustion de fuel (véhicules automobiles), les systèmes de
chauffages industriels et individuels, etc… Il est toutefois produit en grande quantité par les
processus microbiens, dans les sols, les stations de traitement des eaux usées et les milieux
aquatiques (océans, rivières, milieux limniques) (Figures I.5 et I.6). Les processus de
dénitrification, nitrification et réduction dissimilatrice du nitrate en ammonium (DNRA)
contribuent à la production de N2O, les deux premiers processus étant les sources
dominantes.

Tableau I.7. Différentes sources aquatiques et terrestres d’émissions de N2O. (Seitzinger 2000)

Figure I.6. Émissions globales de N2O par les

Figure I.5. Sources naturelles et anthropiques écosystèmes aquatiques (unité en Tg [Link]-1) et
d’émissions de N2O par les milieux aquatiques et pourcentage des émissions anthropiques (A) et
terrestres (Seitzinger 2000) naturelles (N) (Seitzinger 2000).

38
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

39
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

La Seine est le reflet de l’ensemble de ces perturbations ; il s’agit d’un fleuve

grandement anthropisé où le cycle de l’azote est largement sollicité par les pollutions
agricoles et urbaines. Dans la basse Seine, soumise à la pression urbaine de toute
l’agglomération parisienne, le processus de nitrification a un rôle majeur.

I.1.4. Fonctionnement écologique de la basse Seine

Les programmes de recherche PIREN-Seine et Seine-Aval s’intéresse tous deux au
fonctionnement de la Seine et de son bassin. Les objectifs du premier sont, en bref, de
comprendre le fonctionnement écologique de l’ensemble du système fluvial en réponse à
l’activité humaine dans le bassin versant. D’abord focalisé sur les impacts de l’agglomération
parisienne sur la basse vallée de la Seine, le programme PIREN-Seine s’est progressivement
tourné vers les petits bassins amont pour y étudier l’impact des apports diffus d’origine
agricole. Le second focalise ses études sur le fonctionnement écologique de l’estuaire qui est
déterminé par les apports massifs de pollution de la partie amont mais aussi par les apports
et les aménagements intra-estuariens.

I.1.4.1. Caractéristiques générales

Le réseau hydrographique de la Seine s’étend sur un bassin versant de 78.600 km2

(jusqu’au Havre), celle ci prend sa source sur le plateau de Langres (471m) et se jette dans la
Manche. L’influence des mouvements de marée est perceptible jusqu’au barrage de Poses,
limite artificielle de la Seine fluviale et estuarienne.
Les débits moyens de la Seine à Poses, sont estimés à 435 m3 s-1 soit un écoulement
spécifique de 203 mm an-1 (Guerrini et al. 1998). La Seine et l’ensemble de ses tributaires
sont caractérisés par un régime hydrologique de type pluvial océanique : c’est-à-dire un
maximum d’écoulement en hiver quand les températures sont basses et l’évapotranspiration
minimale, et un minimum en été (Figure I.7). Les débits annuels moyens à Poses pour la
période étudiée sont variables (900 m3.s-1 en 2001, 590 m3.s-1 en 2002, 390 m3.s-1 en 2003).
Ces moyennes masquent néanmoins des situations de crue (2.280 m3.s-1 en mars 2001) et
d’étiage (90 m3.s-1, en septembre 2003) parfois très marquées.

Figure I.7. Variation des débits à l’exutoire des grands sous bassins pour l’année 1999 (Nemery
2003).

Le réseau hydrographique de la Seine peut être subdivisé, notamment pour les

besoins de la modélisation, en quatre sous bassins : la Seine amont, les affluents principaux
de la Seine (Marne, Oise, Eure) et en un axe principal : la basse Seine (Figure I.8). Les
activités humaines anciennes ou actuelles ont des conséquences énormes sur l'écoulement, la

40
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

qualité des eaux et des milieux. L'agriculture intensive sur l'ensemble du bassin (46% du
bassin est recouvert par des terres agricoles) (Figure I.9) et la présence de l'agglomération
parisienne, une des plus grandes mégapoles d'Europe en sont à l’origine. Sur les 12% du
territoire national que représente le bassin de la Seine, sont concentrés 25% de la population
française, 33 % de la production agricole et industrielle et 50% du trafic fluvial.

Figure I.8. Carte

représentant le réseau
hydrographique, les 4 sous
bassins et la basse Seine
(PIREN-Seine)

L’utilisation du sol est dominée par la grande culture (céréales, cultures industrielles,
légumes secs, protéagineux), l’élevage est présent surtout sur le pourtour du bassin (Morvan,
Thiérache) et est en régression dans le reste du bassin (Figure I.9). Le drainage agricole
encore mineur affecte toutefois une grande part du bassin d’autant que la taille moyenne des
exploitations tend à augmenter (Guerrini et al. 1998).

Figure I.9. Carte représentant le réseau hydrographique et l’occupation du sol du bassin de la Seine
(PIREN-Seine).

41
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

La distribution de la population est très déséquilibrée : sur les 2500 km2 de la région
parisienne vivent 10 millions d’habitants et sur les 65000 km2 du reste du bassin environ 7
millions d’habitants (Guerrini et al. 1998). La pression urbaine est donc extrême lorsque la
Seine traverse notamment l’agglomération parisienne.

Figure I.10. Carte représentant les densités de populations dans le bassin de la Seine (PIREN-
Seine).

Les densités les plus faibles sont rencontrées à l’Est du bassin (Figure I.10), en amont
de la Seine, de l’Yonne, de la Marne, de l’Aube et de l’Aisne. La Figure I.10 met en évidence la
très forte urbanisation au centre du bassin, dans la région parisienne, mais aussi sur le
tronçon de la basse Seine où l’on retrouve des îlots de forte densité correspondant aux villes
de Rouen ou du Havre. Les 10 millions d’habitants que compte l’agglomération parisienne
exercent une forte pression «urbaine» sur la Seine, accentuée par les faibles débits d’étiage.

I.1.4.2. Le bassin amont

Le bassin amont de la Seine (jusqu’à la confluence de la Seine avec la Marne) est une
zone de 31.000 km² représentant 40 % du bassin total de la Seine. La périphérie du bassin
est occupée par des espaces mixtes alternant entre cultures et espaces boisés. Le centre du
bassin est presque entièrement recouvert de sols cultivés et de prairies agricoles (69 % de la
surface totale du bassin de la Seine), alors que la population et l'activité industrielle sont
regroupés près des grands axes hydrographiques. L’agriculture et l’élevage représentent donc
les 2 principales sources de pollution du bassin amont.

42
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

Certaines régions du bassin telle que la Champagne crayeuse se sont hissées aux rangs
des premiers producteurs français et européens dès les années 60 (Crubellier et al. 1987).
Cette réussite s’est cependant opérée au détriment de la qualité des eaux de surface et
souterraines par l’emploi massif de produits fertilisants (azote, phosphore), de pesticides et
par des pratiques de drainage des sols. L’azote est surtout apporté au printemps entre février
et avril. Les pratiques d’analyses de sol et de fertilisation raisonnée, pour optimiser les
apports nutritifs et ne pas sur-fertiliser les sols, est loin d’être systématique chez les
agriculteurs du bassin de la Seine, conduisant à la pollution des sols mais surtout des eaux de
surface. L’excès de nitrate, non consommé par la végétation, est parfois directement lixivié
par les eaux de pluie (Figure I.11). Les échanges existant entre les eaux de surface et les eaux
souterraines engendrent la pollution des nappes phréatiques tant en nitrates, qu’en produits
phytosanitaires. La présence de zones humides de fond de vallées contribue à améliorer la
qualité des eaux, non seulement en interceptant les particules et leur charge polluante
(phosphore : Némery, 2003 ; Garnier et al. 2004) mais aussi en épurant les eaux de leurs
composés dissous (nitrate en particulier : Billen & Garnier 1999). En effet les zones humides
ont un pouvoir de rétention et d’élimination des polluants azotés et phosphorés ; la teneur en
nitrate diminue d’une part suite à l’absorption par les végétaux ripariens, d’autre part grâce
au processus de dénitrification (Fustec et al. 1998).
Les zones agricoles apportent également des produits phytosanitaires et
micropolluants organiques de tous types parfois non dégradables (Chevreuil et al. 1998).

Figure I.11. Carte représentant les taux de croissance annuels de la teneur en nitrates dans le
bassin de la Seine entre 1992 et 2000 (PIREN-Seine).

Les axes principaux des sous-bassins de la Seine, de la Marne, et de l’Aube, sont

équipés de barrages-réservoirs destinés à maintenir le tirant d'eau nécessaire pour la
navigation en été, mais surtout à soutenir un débit d’étiage suffisant pour assurer les
prélèvements nécessaires à la production d'eau potable aux exutoires de la Marne et de la
Seine, en amont de Paris. Ces réservoirs modifient à la fois l’hydrologie et la biogéochimie des

43
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

cours d’eaux (Garnier et al. 1999 ; Garnier et al. 2000) ; ce sont des sites de sédimentation,
modifiant ainsi le transport des matières en suspension, et ils sont également connus pour
stocker ou éliminer les éléments nutritifs (Si, N, P). De manière générale, les concentrations
en phosphate et en silice diminuent dans les réservoirs durant le printemps et l’été,
consommés respectivement par le phytoplancton et les diatomées (Garnier et al. 1999).
Quant aux nitrates, ils diminuent également grâce principalement au processus de
dénitrification, alors que l’ammonium augmente durant la période estivale à cause de la
minéralisation de la matière organique (Garnier et al. 1999).

Outre les axes aux exutoires déjà très urbanisés, certaines grosses agglomérations
rejettent leurs effluents urbains (Troyes, Châlon en Champagne, Reims, etc…). Cependant ces
effets sont beaucoup moins marqués que ceux de la capitale, car les effluents de leur station
d’épuration sont relativement mieux épurés, les stations étant plus récentes et de bien plus
faible capacité (Tusseau et al. 2000). Les axes canalisés des principaux tributaires sont
toutefois déjà très eutrophes (Garnier et al. 1998b).

I.1.4.3. Les rejets de l’agglomération parisienne

La basse Seine est grandement anthropisée par la présence de l’agglomération

parisienne et notamment par le rejet des effluents urbains traités dans les stations
d’épuration. Le Syndicat Interdépartemental pour l’Assainissement de l’Agglomération
Parisienne (SIAAP) achemine et épure chaque jour 3 millions de m3 d’eaux usées produites
par plus de 8 millions d’habitants.

L’agglomération parisienne compte 4 stations de traitement des eaux usées. La station

d’épuration d’Achères (Figure I.12) est la plus ancienne (1940) et la plus importante, elle
traite 2 millions de m3 par jour d’eaux usées équivalent à 6 millions d’habitants, par
traitement secondaire (boues activées). En 1976, a été construite la station de Noisy le Grand
(Marne aval) ne traitant actuellement que 30 000 m3 par jour. Les deux autres stations plus
récentes, celles de Valenton (Seine amont) et Colombes (Seine centre), traitent chacune
environ 300 000 m3 par jour par traitement tertiaire. La station d’épuration d’Achères a
évidemment le plus fort impact sur la Basse Seine. A l'horizon 2015, les 2,8 millions de m3
d'eau rejetés chaque jour dans la zone centrale d'Ile-de-France seront traitées par traitement
tertiaire dans six stations d'épuration : il reste à construire deux nouvelles stations (les
Grésillons à Triel et La Morée en Seine-Saint-Denis), à renforcer les stations Marne Aval et
Seine Amont pour alléger la station d’Achères (sa capacité baissera à 1.5 millions de m3 par
jour). Si des progrès significatifs ont d’ores et déjà été réalisés en terme de qualité (Garnier et
al. soumis), d’autres sont en cours notamment à la station d'Achères qui, grâce à de nouveaux
équipements terminés en 2007, devrait réduire de moitié la pollution carbonée, de 80 % le
phosphore et de 100 % l'azote ammoniacal (nitrification complète) et de 30% le nitrate
(dénitrification partielle). En 2015 l'efficacité de traitement devrait atteindre 70 à 80 % pour
ces trois éléments (C, N, P) grâce à une unité de dénitrification supplémentaire.

Actuellement, par temps sec, les effluents traités d’Achères (environ 30 m3.s-1)
contiennent en moyenne 45 mg.L-1 de MES riches en carbone organique (34%), en azote (6%)
et en phosphore (2.5%). De plus ces effluents sont particulièrement chargés en azote
ammoniacal (> 30 mg N-NH4+.L-1) puisque le traitement de ce polluant est quasiment nul
(Chesterikov et al. 1998). En ce qui concerne les micropolluants organiques, ils réagissent
différemment à l’hydrologie, en temps de pluie, les composés organiques volatiles comme le
trichloroéthylène sont dilués alors que les PCB (polychlorobiphényles, composé
organohalogéné) sont plutôt plus concentrés dans les effluents urbains (Chevreuil et al.
1998).

44
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

En basses eaux, au cours de la traversée de la ville de Paris, après la réception des

rejets d’Achères, la plupart des paramètres de pollution (Carbone organique dissous, NH4+,
métaux, PCB, hydrocarbures) exprimés par litre d’eau croissent de 6 à 60% malgré une forte
sédimentation des matières en suspension.

Figure I.12. Vue aérienne de la

station d’épuration d’Achères
(source : SIAAP)

I.1.4.4. L’axe fluvial anthropisé (la basse Seine)

L’axe fluvial s’étend depuis la confluence de la Marne (à l’amont de Paris) jusqu’à

Poses, limite amont de la zone estuarienne. A ce niveau la Seine est une large rivière d’ordre 7
(selon Strahler, 1957), puis d’ordre 8 après la confluence avec l’Oise (elle-même d’ordre 7).
Cette partie de la Seine est soumise aux rejets des effluents des stations d’épuration de
l’agglomération parisienne, et principalement à ceux d’Achères. Les effets de ces rejets
urbains et industriels s’observent loin en aval de l’agglomération, et pour certains polluants,
se perçoivent jusqu’à la zone côtière, voire la Mer du Nord.

Au cours de la traversée de la ville de Paris, la concentration de la plupart des

variables de pollution croît, à l’aval des rejets d’Achères et après la confluence avec l’Oise, 15 à
20% des charges en carbone organique particulaire (COP), et 20 à 40% des charges en azote
et en phosphore particulaire (NP et PP) proviennent d’Achères (Chesterikov et al. 1998).
L’impact anthropique s’exerce surtout en période d’étiage. Un impact majeur concerne
l’ammonium (N-NH4+), dont la concentration est multipliée par 6 après les rejets (atteignant
6 mg N.L-1). L’apport conséquent de matière organique biodégradable provoque en période
estivale, un fort déficit en oxygène à l’aval immédiat d’Achères (Servais & Garnier 1993 ;
Servais et al. 1999 ; Garnier et al. 2001).
L’ammonium apporté en masse par les effluents d’Achères est ensuite lentement
nitrifié le long du continuum de la basse Seine, où l’on voit se concentrer des nitrates produit
lors de ce processus d’oxydation (Billen et al. 1998b ; Brion et al. 2000). Les pollutions
métalliques et micropolluants organiques se concentrent depuis les petits bassins amont

45
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

jusqu’en aval. Les flux de métaux particulaires représentent 80 à 90% des flux de métaux, en
moyenne pondérée par rapport au flux de MES, on note des concentrations à Poses de 88 µg
Cu.g-1 et 109 µg Pb.g-1 par rapport au Rhône contenant 30.5 µg Cu.g-1 et 19.5 µg Pb.g-1
(Thévenot et al. 1998). La contamination en micropolluants organiques est principalement
évaluée grâce à leur impact et leur bioaccumulation chez certains indicateurs biologiques ;
notons par exemple que la teneur en PCB chez la Dreissène (Mollusque) échantillonnée à
Poses peut atteindre 4.000 µ[Link]-1 alors qu’elle n’est que de quelques centaines de µ[Link]-1 de
matière sèche dans le lac Léman (Chevreuil et al. 1998).

I.1.4.5. L’estuaire

La zone estuarienne de la Seine s’étend sur 163 km depuis le barrage de Poses jusqu’à
Honfleur marquant le début de la Baie de Seine (Figure I.13). L’hydraulique particulière du
système est conditionnée par l’action combinée du débit du fleuve et de la marée. Ces deux
forces variables en intensité selon la saison pour le fleuve, et selon le coefficient de marée,
s’opposent lors du flot et se conjuguent lors du jusant selon un rythme régulier imposé par
l’onde marégraphique.
L’estuaire de la Seine (50 km2) est le troisième plus grand estuaire macrotidal français
après la Gironde (625 km2) et la Loire (60 km2). Les forts marnages rencontrés sur les côtes
françaises atlantiques entraînent la formation de zones de forte concentration de particules,
appelées bouchon vaseux, étant en interaction avec les vasières intertidales, zones de dépôt se
situant dans la zone de balancement des marées, couvertes à pleine mer, découvertes à basse
mer.

Figure I.13. L’estuaire de la Seine, sa sectorisation et illustration de la présence du bouchon vaseux

grâce aux concentrations en MES à l’étale de base mer (d’après Guézennec 1998)

46
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

L’estuaire de Seine est caractérisé dans sa partie fluviale par une intense activité
bactérienne, notamment la nitrification qui permet d’oxyder, en situation estivale, la quasi-
totalité de l’ammonium entrant à Poses. Cette nitrification s’accompagne d’un déficit en
oxygène en aval de Rouen, pouvant s’étendre sur 40 à 50 km (Brion et al. 2000 ; Garnier et
al. 2001).
La distribution de l’activité et de la biomasse des bactéries nitrifiantes a déjà été
étudiée dans la Seine fluviale et estuarienne pour différentes situations de débits (Brion
1998 ; Brion et al. 2000). Si cette étude a permis la mise en évidence des principaux facteurs
de contrôle de la dynamique des bactéries nitrifiantes, elle n’avait pas pris en compte les
organismes de la nitrification, et n’avait pas non plus considéré les émissions de N2O liées à
ce processus.
Les connaissances du processus de nitrification méritaient donc d’être complétées,
dans un contexte d’application de la directive cadre sur l’eau impliquant la mise en place
progressive du traitement tertiaire à Achères. La Basse Seine représente un site idéal pour
étudier et modéliser les bactéries nitrifiantes et la nitrification.

I.1.4.6. Modélisation du fonctionnement écologique de la Seine

La démarche de la modélisation du fonctionnement biogéochimique adoptée pour la

Seine est de type mécanistique et consiste à établir le lien quantitatif entre les flux
microscopiques de matières au sein d’un compartiment biologique dont les cinétiques et les
paramètres ont été déterminés expérimentalement avec les manifestations macroscopiques
de ces mécanismes à l’échelle de l’écosystème.

Le modèle RIVERSTRAHLER (Billen et al. 1994 ; Garnier et al. 1995; Billen &
Garnier, 1999 ; Billen et al. 2001 ; Garnier et al. 2004) prend en compte l’ensemble du
bassin : les chevelus des sous-bassins représentés par ordre de Strahler (1957), les réservoirs
et un ou plusieurs axes principaux, selon la stratégie du découpage en sous-bassins adoptée.
Le débit en tête de bassin est calculé par une relation pluie-débit (Bultot & Dupriez 1976), les
flux d’eau étant acheminé dans les cours d’eau d’ordre croissant (Billen et al. 1994). Le
modèle RIVERSTRAHLER résulte ainsi d’un couplage entre modèle hydrologique
relativement simple et un module décrivant les processus écologiques et biogéochimiques (le
modèle RIVE), unique des têtes de bassins à l’estuaire.

Le modèle RIVE (Figure I.14) est une formulation mathématique de la cinétique des
processus de transformation du carbone, de l’azote, du phosphore, de la silice et de leur
circulation entre les différents compartiments du système : le phytoplancton, les bactéries
hétérotrophes et nitrifiantes, le zooplancton, les échanges à l’interface eau-sédiment et
l’adsorption des phosphates, tout en prenant en compte les échanges d’oxygène (pour les
développements successifs de RIVE, cf. : Garnier & Billen 1993 ; Billen et al. 1994 ; Garnier et
al. 1995 ; Billen & Garnier, 1999 ; Garnier et al. 1999).

Ce modèle permet de confronter notre vision du fonctionnement du système fluvial

avec la réalité, par sa capacité à reproduire les observations de terrains. Comme les cinétiques
et les paramètres sont déterminés de manière indépendante des observations, l’écart entre les
simulations et les observations est le reflet de notre compréhension du système, les
simulations représentant ainsi de véritables validations.

Si, au cours des 10 dernières années, le processus de nitrification de la colonne d’eau a

pu être décrit de manière plus fine, sous ses 2 étapes classiques (nitrosation et nitratation :
Brion 1998 ; Brion & Billen, 1998), et les transformations de l’azote et du carbone
(nitrification et dénitrification) dans les sédiments, réévaluées (Sanchez 1997 ; Billen et al.
1998b), il restait encore des améliorations à apporter à ces représentations pour prendre en

47
Chapitre I. 1. Généralités sur les milieux Lotiques

compte les émissions de N2O notamment et affiner encore les résultats du modèle dans une
perspective d’exploration de scénarios, liés à la mise en place du traitement tertiaire à la
station d’épuration d’Achères. C’est ainsi que l’étude de l’activité nitrifiante in situ a été
poursuivie, en tenant compte des populations bactériennes fonctionnelles complexes.

Figure I.14. Structuration conceptuelle du modèle RIVE (Billen & Garnier 1996)

Apports Hydro-météo Morphologie

Température
Diffus Ponctuels Eclairement
(usage du (stations Description fine
sol/ d’épuration et Pluie
des biefs et
fertilisation) industries) Débit
caractéristiques
par ordre de

Rétention Cinétique des processus microscopiques

riparienne (modèle RIVE)

Manifestations macroscopiques
(distribution géographique et
saisonnière des variables d’état)

Variables d’état du modèle RIVE : Processus du modèle RIVE :

OXY : oxygène dissous -Assimilation photosynthétique de carbone
DIA : diatomées -Respiration algale
GRA : chlorophycées -Synthèse et catabolisme des réserves algales
ZOO : zooplancton -Croissance algale
H1D : matière organique dissoute rapidement -Excrétion algale
hydrolysable -Lyse algale
H2D : matière organique dissoute lentement -Broutage zooplanctonique
hydrolysable -Croissance et respiration zooplanctonique
H3D : matière organique dissoute réfractaire -Excrétion zooplanctonique
H1P : matière organique particulaire rapidement -Mortalité zooplanctonique
hydrolysable -Hydrolyse de la matière organique polymérique
H2P : matière organique particulaire lentement -Croissance et respiration bactérienne
hydrolysable -Excrétion bactérienne d’azote et de phosphore
H3P : matière organique particulaire réfractaire -Mortalité bactérienne
Ds :substrat organique directement utilisable -Sédimentation de la matière organique particulaire
Bp : bactéries hétérotrophes autochtones inorganique
Bg : bactéries hétérotrophes allochtones -Sédimentation de la matière organique particulaire
NH4 : ammonium organique
NO3 : nitrate -Minéralisation benthique de la matière oraganique
NI : bactéries nitrifiantes -Nitrification dans la colonne d’eau
SIO : silice dissoute -Adsorption-désorption des phosphates
DSI : silice détritique particulaire
PO4 : ortho-phosphate
AP : phosphate adsorbé
SM : matières en suspension minérales

48
49
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

I.2. Généralités sur la nitrification et les

bactéries nitrifiantes

Ce second chapitre s’intéresse plus particulièrement au processus de nitrification et

notamment aux bactéries impliquées dans cette fonction. Nous décrirons leur taxonomie,
leur phylogénie ainsi que leur métabolisme et ferons le point sur l’état des connaissances
actuelles sur la biochimie et la génétique gouvernant les deux étapes de nitrosation et
nitratation. Puis nous essayerons de mieux cerner l’écologie des deux populations
bactériennes nitrifiantes en nous intéressant à leurs niches écologiques.

I.2.1. Taxonomie et Phylogénie des bactéries nitrifiantes

Figure I.15. Arbre phylogénétique de parcimonie maximum des bactéries nitrifiantes basé sur une
analyse comparative de séquences d’ADNr 16S. Les branches menant aux bactéries nitrosantes et
nitratantes sont respectivement nommées par AOB et NOB (d’après Schramm 2003).

50
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Les bactéries nitrifiantes chimiolithotrophes sont des bactéries à Gram négatif qui
possèdent la capacité d’utiliser l’ammonium ou le nitrite comme seule source d’énergie et
d’effectuer la fixation autotrophe du CO2 via le cycle de Calvin. Ces bactéries étaient
anciennement regroupées au sein de la famille des Nitrobacteriaceae (Watson et al. 1989) et
séparées en deux groupes fonctionnels. La répartition des bactéries nitrosantes et nitratantes
en différents genres était anciennement dépendante de leur morphologie (taille des cellules,
forme, arrangement des membranes intracytoplasmiques). Cependant, cette classification est
en contradiction avec les résultats obtenus à partir d’analyses phylogénétiques montrant que
les bactéries nitrosantes, caractérisées par le préfixe Nitroso-, et les bactéries nitratantes,
caractérisées par le préfixe Nitro-, ne forment pas forcément des groupes monophylétiques
(Head et al. 1993; Orso et al. 1994; Teske et al. 1994; Purkhold et al. 2000), elles sont en fait
réparties en 6 lignées phylogénétiques différentes (Figure I.15).
Afin de mieux connaître les caractéristiques propres à chacun des deux groupes
fonctionnels nitrifiants, nous présenterons successivement les bactéries nitrosantes, puis les
bactéries nitratantes.

I.2.1.1. Taxonomie et phylogénie des bactéries nitrosantes

Après les premiers résultats d’isolement de bactéries nitrosantes à la fin du XIXème

siècle (Frankland & Frankland 1890; Winogradsky 1890), les chercheurs ont continué à
s’intéresser à la diversité des bactéries nitrosantes dans les milieux naturels et les
environnements aménagés en utilisant des techniques d’enrichissement et d’isolement. Ces
efforts ont permis la description de 16 espèces bactériennes nitrosantes (Watson 1965; Koops
et al. 1976; Jones & Morita 1983; Koops et al. 1990). Par la suite, des études utilisant
l’hybridation ADN-ADN ont mis en évidence l’existence de 15 espèces supplémentaires
(Koops et al. 1991; Stehr et al. 1995a). Les critères morphologiques (taille, forme,
cytomembrane…) ont permis de distinguer 5 genres parmi les bactéries nitrosantes :
Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus et Nitrosovibrio (Winogradsky
1892; Watson et al. 1989; Koops et al. 1991). Les espèces bactériennes appartenant à ces
genres ont des caractéristiques morphologiques et physiologiques différentes décrites dans
les Tableaux I.8 et I.9. Les faibles taux de croissance et les faibles rendements de croissance
des bactéries nitrosantes rendent les analyses basées sur la mise en culture extrêmement
longues, fastidieuses et potentiellement biaisées. Ces contraintes ont donc très certainement
ralenti la connaissance de ce groupe fonctionnel.

Tableau I.8. Caractères morphologiques des cinq genres bactériens nitrosants (D’après Koops et al.
2003)

51
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Tableau I.9. Caractéristiques physiologiques de certaines espèces bactériennes nitrosantes et

description de leurs habitats (D’après Koops et al. 2003). STEP : Station d’épuration.

Aujourd’hui les approches phylogénétiques ont permis de préciser ces connaissances.

La phylogénie des bactéries nitrosantes, est désormais essentiellement basée sur les analyses
de séquences codant soit pour les ARNr 16S soit pour le polypeptide enzymatique (AmoA)
portant le site actif de l’ammonium-monooxygénase (enzyme catalysant l’oxydation de
l’ammoniaque en hydroxylamine). Le séquençage systématique de ces gènes, chez toutes les
espèces bactériennes nitrosantes connues (Suwa et al. 1994; Stehr et al. 1995a; Juretschko et
al. 1998) et pour les clones environnementaux (Rotthauwe et al. 1995; Stephen et al. 1996;
Purkhold et al. 2000) conduit aujourd’hui à une vision robuste de la phylogénie de ce groupe
fonctionnel.

Des analyses basées sur la comparaison des séquences d’ARNr 16S de bactéries
nitrosantes en cultures pures ont révélé l’existence de deux lignées monophylétiques
appartenant aux Protéobactéries : la première au sein de la sous-classe γ et la seconde dans la
sous-classe β (Figure I.16). Les espèces marines Nitrosococcus halophilus et Nitrosococcus
oceani sont affiliées à la sous classe γ des Protéobactéries et sont proches des bactéries
oxydant le méthane (Watson 1965; Purkhold et al. 2000). Les membres des genres
Nitrosomonas (dont Nitrosococcus mobilis), Nitrosospira, Nitrosolobus et Nitrosovibrio
forment un groupe assez lié dans la sous classe β des Protéobactéries (Woese et al. 1984;
Head et al. 1993; Teske et al. 1994; Utåker et al. 1995; Pommerening-Röser et al. 1996;
Purkhold et al. 2000). Les bactéries du genre Nitrosomonas peuvent encore être subdivisées
en plusieurs lignées : la lignée de N. europaea/Nc. mobilis, la lignée représentée par N.
marina, la lignée désignée par N. oligotropha et enfin celle de N. communis (Figure I.16).
Nitrosomonas cryotolerans appartient à une lignée séparée des β-Protéobactéries.
Nitrosospira, Nitrosolobus et Nitrosovibrio sont très proches et forment un groupe séparé de
celui des Nitrosomonas. Stephen et al. (1996) ont suggéré une sous-division du genre
Nitrosospira en 4 clusters (cluster 1 à 4), le cluster 1 ne contenant aucune espèce cultivée, un
cinquième cluster (le cluster 0) a ensuite été identifié (Purkhold et al. 2000). Toutefois les
différents clusters identifiés chez les Nitrosospira ne sont pas comparables (d’un point de vu
phylogénétique) avec les différentes lignées de Nitrosomonas.

52
 Figure I.16. Arbre phylogénétique basé sur la comparaison (neighbor-joining) des séquences
d’ADNr 16S reflétant les liens entre les bactéries nitrosantes et divers organismes de référence. AOB
= ammonia-oxidizing bacteria (bactéries nitrosantes); MOB = methane-oxidizing bacteria (bactéries
oxidant le methane). La barre indique une divergence de 10% des séquences (extrait de Bock &
Wagner 2001 et modifié à partir de Purkhold et al. 2000).
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

D’autres marqueurs de phylogénie peuvent être utilisés ; par exemple Aakra et al.
(2001) ont fait une analyse phylogénétique à partir des séquences intergéniques 16S-23S
(appelées ISR : intergenic spacer region) des bactéries nitrosantes. Toutefois ce type de
séquence très variable rend difficile les alignements de séquences et l’obtention d’une
phylogénie robuste. Le gène de fonction amoA (codant pour la sous-unité catalytique de
l’ammonium monooxygénase, cf. partie I.2.3.1) est utilisé couramment comme molécule
marqueur. Purkhold et al. (2000) ont obtenu, à partir des séquences d’ADNr 16S, une
phylogénie proche de celle obtenue avec les séquences du gène amoA ; une des principales
différences pour la phylogénie basée sur amoA, est la réunion des deux clusters N.
oligotropha et N. communis en une seule lignée. Norton et al. (2002) ont démontré que
l’ADNr 16S est plus conservé que le gène amoA au sein des bactéries nitrosantes, ainsi la
phylogénie établie sur les bases de l’ADNr 16S serait la plus informative et la plus précise.

I.2.1.2. Taxonomie et phylogénie des bactéries nitratantes

Toutes les bactéries nitratantes chimiolithoautotrophes isolées appartiennent à un

des quatre genres suivants : Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina et Nitrospira. Watson et
al. (1981) furent les premiers à classer ces bactéries nitratantes en trois genres distincts
(Nitrospira n’ayant été découvert qu’en 1986) sur des bases morphologiques et
physiologiques, au niveau des besoins nutritionnels notamment (Tableau I.10). Ces quatre
genres bactériens, décrits par Bock & Koops (1992), possèdent des ultrastructures
membranaires intracytoplasmiques servant de critère de reconnaissance.

Tableau I.10. Caractéristiques morphologiques et physiologiques de différents genres bactériens

nitratants.

Par la suite, les techniques de biologie moléculaire, ont aussi permis de déterminer la
phylogénie de ce groupe fonctionnel (Figure I.15). Ainsi, le genre Nitrobacter appartient à la
sous-classe α des Protéobactéries, Nitrococcus est classé dans la sous-classe γ des
Protéobactéries, le genre Nitrospina a une affiliation phylogénétique encore floue proche de
la sous-classe δ des Protéobactéries, mais formant un groupe lié au phylum Acidobacterium-
Holophaga, enfin le genre Nitrospira est dans un phylum séparé auquel il a donné son nom
(Orso et al. 1994; Teske et al. 1994; Ehrich et al. 1995; Schramm 2003). Cette phylogénie a
été confortée par l’étude de Bartosh et al. (1999), basée sur la réaction des 4 genres bactériens
nitratants à des anticorps monoclonaux ciblant la nitrite oxido-réductase.

Seules les caractéristiques des genres Nitrobacter et Nitrospira et non celles des deux
genres marins Nitrospina et Nitrococcus seront développées ici.

54
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Nitrobacter

Les espèces appartenant au genre Nitrobacter sont des microorganismes à Gram

négatif tirant leur énergie de l’oxydation du nitrite en nitrate. Les bactéries du genre
Nitrobacter sont ubiquistes dans la nature et ont été détectées dans des environnements
variés tels que le sol, les milieux aquatiques et les boues activées (entre autre: Chartrain et al.
1983; Bock et al. 1990; DeBoer et al. 1991; Degrange & Bardin 1995; Mobarry et al. 1996;
Sorokin et al. 1998; De Beer & Schramm 1999; Regan et al. 2002). Jusqu’ici, quatre espèces
de Nitrobacter ont été décrites : Nitrobacter winogradskyi (Winogradsky 1892), N.
hamburgensis (Bock et al. 1983), N. vulgaris (Bock et al. 1990) et N. alkalicus (Sorokin et al.
1998). La phylogénie des bactéries appartenant au genre Nitrobacter (Figure I.17), basée sur
l’analyse des séquences d’ADNr 16S, fut établie par Orso et al. (1994). Les différentes souches
de Nitrobacter sont très proches phylogénétiquement (environ 99.2% de similitude).

Figure I.17. Arbre phylogénétique (neighbor joining) du genre Nitrobacter, basé sur la
comparaison des séquences d’ADNr 16S. (D’après Orso et al. 1994).

Alors que les bactéries du genre Nitrobacter ont été isolées dans des environnements
variés, pendant longtemps les trois autres genres bactériens nitratants étaient supposés être
confinés aux environnements marins (Bock & Koops 1992).

Nitrospira

Les études récentes ont montré la présence de bactéries proches du genre Nitrospira
dans divers environnements non marins. La première espèce de Nitrospira isolée, N.
marina, l’a été à partir d’eau de mer, alors que la seconde N. moscoviensis a été cultivée à
partir d’un biofilm s’étant développé dans la tuyauterie en fer d’un système de chauffage à
Moscou, en Russie (Ehrich et al. 1995). Ces espèces sont les deux seules connues en culture
pure ; toutefois, un certain nombre de bactéries liées phylogénétiquement ont été détectées
par analyse de séquences d’ADNr 16S, immunoblot et autres techniques moléculaires. Le
genre Nitrospira a été détecté dans des boues activées (Burrell et al. 1998; Juretschko et al.
1998), des biofilms de réacteurs nitrifiants (Schramm et al. 1998; Okabe et al. 1999; Gieseke
et al. 2001), des sols et rhizosphères (Marilley & Aragno 1999; Bartosch et al. 2002), des
filtres d’aquarium d’eau douce (Hovanec et al. 1998), des eaux souterraines contaminées
(Cho & Kim 2000), des sédiments marins et d’eau douce (Li et al. 1999; Todorov et al. 2000;
Altmann et al. 2003). Ces bactéries semblent donc largement représentées dans la nature et
pourraient contribuer à l’oxydation du nitrite.

Le genre Nitrospira appartient à un phylum distinct (Ehrich et al. 1995), séparé en

trois groupes monophylétiques ainsi que l’attestent toutes les méthodes phylogénétiques
(Figure I.18). Toutes les séquences appartenant au premier groupe sont affiliées à N.
moscoviensis et N. marina, le second groupe compte toutes les séquences proches de
Leptospirillum ferrooxidans, et les organismes du troisième groupe sont liés à

55
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Thermodesulfovibrio yellowstonii et Magnetobacterium bavaricum. Le groupe représenté

par N. moscoviensis et N. marina est lui-même divisé en quatre sous-groupes (Daims et al.
2001a). Chacun des sous-groupes I, III et IV (Figure I.19) regroupent des séquences de
bactéries nitratantes d’habitats limités : respectivement bioréacteurs nitrifiants, grottes sous-
marines et fonds marins. Le sous-groupe II est composé de séquences bactériennes détectées
dans des environnements plus divers (bioréacteurs, aquarium d’eau douce, lacs, sol et
rhizosphère), cependant des biais d’interprétation peuvent apparaître dû au nombre limité
d’étude concernant ce genre bactérien.

Le genre Nitrospira semble donc relativement diversifié au niveau phylogénétique, il

semble avoir des abondances variées et une large distribution dans les environnements
terrestres et aquatiques. Les analyses de diversité des bactéries nitratantes dans les
environnements aquatiques continentaux se doivent donc de cibler à la fois les deux genres
bactériens nitratants : Nitrobacter et Nitrospira.

Figure I.18. Arbre phylogénétique montrant la position des membres du phylum Nitrospira au sein
de la phylogénie bactérienne (Ehrich 1995)

56
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Figure I.19. Arbre phylogénétique du phylum Nitrospira basé sur l’analyse comparative des
séquences d’ADNr 16S (Daims et al. 2001a)

57
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

I.2.2. Métabolisme des bactéries nitrifiantes

Les bactéries nitrifiantes autotrophes dérivent leur énergie de l’oxydation d’azote

inorganique (NH3 et NO2-) et utilisent le dioxyde de carbone (CO2) comme seule source de
carbone pour la synthèse de biomasse. Les bactéries nitrifiantes assimilent le CO2 via le cycle
de Calvin et l’enzyme D-ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RubisCO)
catalysant la formation de 3-phosphoglycérate. Jusqu’à récemment, la croissance des
bactéries nitrifiantes n’ayant pas été démontrée en présence d’autres sources de carbone ou
d’énergie, ces bactéries étaient considérées comme des chémolithoautotrophes strictes.
Cependant, des études de marquage isotopique ont montré une évidence directe
d’incorporation de composés organiques, par des souches de Nitrosomonas et de
Nitrobacter, prouvant ainsi la croissance mixotrophe de certaines bactéries nitrifiantes.

b.

a.

Figure I.20. Modèles des chaînes de transfert des électrons des bactéries nitrosantes (a) et
nitratantes (b). a) Les parties faisant intervenir le NO, N2O et N2 sont encore hypothétiques. b) la
partie supérieure de la figure représente la voie de dénitrification et de croissance hétérotrophe des
bactéries nitratantes et la partie basse la voie de nitrification. CM = membrane cytoplasmique ; i =
intérieur de la cellule, cytoplasme ; o = extérieur de la cellule, périplasme ; TCA = cycle du
tricarboxylate. (Figures de I. Schmidt tirées de Bock & Wagner 2001)

58
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

I.2.2.1. Métabolisme des bactéries nitrosantes

Métabolisme nitrifiant

L’oxydation de l’ammonium se déroule en deux étapes, l’oxydation de l’ammoniaque

en hydroxylamine est réalisée grâce à l’ammonium-monooxygénase, puis l’hydroxylamine-
oxydoréductase se charge d’oxyder l’hydroxylamine en nitrite. Les bactéries nitrosantes sont
chimiolithotrophes, elles tirent leur énergie de l’oxydation de l’ammoniaque en nitrite via
l’hydroxylamine suivant les 2 réactions :

NH4+ + 0.5O2 + 2e- → NH2OH + H+

NH2OH + H2O → NO2- + 5H+ +4e-

L’atome d’oxygène incorporé dans l’hydroxylamine provient de l’oxygène

atmosphérique, le second atome d’oxygène formant le nitrite provient de l’eau. Deux des
quatre électrons générés sont utilisés pour oxyder une nouvelle molécule d’ammonium alors
que les deux autres sont dirigés vers la chaîne de transfert des électrons et sont utilisés pour
réduire le CO2 et la biosynthèse d’ATP (Figure I.20a). Le flux réverse des électrons
permettant la formation de NADH.

De nouveaux modèles hypothétiques sont apparus récemment, faisant intervenir

l’oxyde nitrique ou le tétroxyde d’azote (N2O4) comme agent oxydant de la première étape de
la nitrosation en présence d’oxygène (Schmidt et al. 2001 et 2002). Cette réaction décrite en
figure I.21 peut être résumée de la manière suivante :

NH3 + N2O4 + 2H+ + 2e- → NH2OH + 2NO + H2O

2NO + O2 → 2 NO2 (N2O4)

Ces deux équations peuvent se combiner en une seule réaction qui s’avère être en
accord avec la réaction connue d’oxydation de l’ammonium en hydroxylamine :

NH3 + O2 + 2H+ + 2e- → NH2OH + H2O

D’après ce nouveau modèle, l’oxygène moléculaire est utilisé pour oxyder le NO,
l’oxygène de l’hydroxylamine a donc bien pour origine l’oxygène moléculaire mais est ici
incorporé via le NO2 (Schmidt et al. 2001 et 2002).

Figure I.21. Modèle hypothétique de l’oxydation de

l’ammoniaque chez Nitrosomonas eutropha.
D’après ce modèle, N2O4 serait l’oxydant de l’ammoniaque. En
conditions oxiques, l’oxygène est utilisé pour ré-oxyder le NO
en NO2. L’hydroxylamine produite est ensuite oxydée en nitrite
(Schmidt et al. 2002)

59
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

En condition de stress oxique, le métabolisme nitrifiant des bactéries nitrosantes est

modifié. Du NO et N2O seraient produits par oxydation de l’ammonium en utilisant le nitrite
comme accepteur d’électron (Figure I.22) par le processus de nitrification-dénitrifiante
(Ritchie & Nicholas 1972; Poth & Focht 1985; Colliver & Stephenson 2000 ; Skiba & Smith
2000 ; Wrage et al. 2001) nommé également processus OLAND (Oxygen Limited
Autotrophic Nitrifier Denitrification). La nitrification-dénitrifiante a été mise en évidence par
Ritchie & Nicholas (1972) sur la base d’expériences sur Nitrosomonas europaea, avec ajout
de NH4+, NO3- ou NH2OH marqués au 15N, en montrant que N. europaea produisait du N2O
par réduction du NO2- avec le NH2OH comme donneur d’électron, réaction réalisée dans des
conditions aussi bien aérobies qu’anaérobies. En 1985, Poth et Focht ont démontré que ce
processus était amplifié chez N. europaea dans des conditions de stress en oxygène. En
transformant du NO2- marqué au 15N en N2O, le profil de 15N du N2O était en accord avec la
cinétique de la dénitrification, ce qui montre que les étapes sont les mêmes que pour la
dénitrification.
Un modèle hypothétique d’oxydation de l’ammoniaque en totale anaérobiose a été
proposé par Schmidt et al. (2002), faisant intervenir le N2O4 comme oxydant (Figure I.23).

Figure I.22. Processus de nitrification-

dénitrifiante ou processus OLAND. (Schmidt
et al. 2002)

Figure I.23. Modèle hypothétique de

l’oxydation de l’ammoniaque dépendante du
NO2 en anaérobiose chez Nitrosomonas
eutropha. D’après ce modèle, N2O4 est
l’oxydant de l’ammoniaque. (Schmidt et al.
2002).

Assimilation du carbone

Utåker et al. (2002) ont isolé et comparé les séquences des RubisCO de 13 bactéries
nitrosantes différentes. Toutes les souches analysées possèdent des gènes codant pour la
RubisCO de type I. L’enzyme est un hexamère constitué de 8 grandes sous unités (52.2 kDa)
et 8 petites sous-unités (13.3 kDa) (Hatayama et al. 2000). Alors que toutes les bactéries
nitrosantes examinées, appartenant à la sous-classe β des Protéobactéries, possèdent des
RubisCO “red-like” (c’est à dire similaire à celles rencontrées chez les algues rouges), N.
europaea Nm50 a au contraire une enzyme “green-like” (c’est à dire similaire à celles
rencontrées chez les algues vertes) (Hatayama et al. 2000).

60
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Parmi les composés organiques pouvant être métabolisés par les bactéries nitrosantes
en conditions mixotrophes, on compte le pyruvate (Wallace et al. 1970), l’acétate (Martiny &
Koops 1982; Wallace et al 1970), l’α-kétoglutarate et le succinate (Wallace et al. 1970) ainsi
que les acides aminés (Clark & Schmidt 1967a et 1967b). De plus certaines souches de
Nitrosomonas sont capables d’utiliser des substances organiques telles que l’urée ou la
glutamine comme source d’ammoniaque pour leur croissance lithotrophe (Koops et al. 1991).

L’achèvement récent du séquençage du génome de N. europaea (Chain et al. 2003)

devrait maintenant permettre de comprendre pourquoi cet organisme ne peut pas pousser en
conditions totalement hétérotrophes. Parmi les gènes identifiés, certains se sont révélés
similaires aux gènes nécessaires au catabolisme des carbohydrates par la glycolyse et le cycle
de l’acide tricarboxylique ; des gènes codant potentiellement pour des transporteurs d’ions et
de composés organiques (notamment une perméase au fructose) ont en effet été détectés.
Hommes et al. (2003) ont montré grâce à des expériences avec du fructose marqué au 14C que
plus de 90% du carbone incorporé par N. europaea provenait effectivement du fructose. Les
bactéries nitrosantes pourraient ainsi tirer leur source de carbone du fructose, cette étude
étant la première à avoir mis en évidence une croissance chimiolithohétérotrophe de N.
europaea dans un milieu sans CO2 et avec du fructose comme seule source de carbone.

I.2.2.2. Métabolisme des bactéries nitratantes

Métabolisme nitrifiant

L’oxydation du nitrite en nitrate est réalisée par le système d’oxydation du nitrite

(NOS) comprenant notamment la nitrite oxydo-réductase (NOR) (Sundermeyer-Klinger et al.
1984 ; Meincke et al. 1992), l’eau servant de source d’oxygène. Les électrons produits lors de
cette réaction sont transférés à une cytochrome-oxydase de type aa3 via les cytochromes a- et
c- (Figure I.20b).

Assimilation du carbone

La plupart les bactéries nitratantes sont lithoautotrophes, utilisant le nitrite comme

seule source d’énergie et le CO2 comme source de carbone. Cependant, en plus de leur
croissance autotrophe, certains Nitrobacter sont capables de pousser en milieu mixotrophe
en présence de nitrite et de composés organiques ou même en conditions hétérotrophes, en
présence de matière organique (Bock 1976 ; Steinmüller & Bock 1976 ; Bock et al. 1983). Les
différentes souches connues de Nitrobacter diffèrent par leurs potentialités métaboliques :
Nitrobacter agilis souche AG est préférentiellement autotrophe, Nitrobacter spp. souche LL
serait préférentiellement mixotrophe et Nitrobacter hamburgensis souche X14 aurait une
croissance plutôt hétérotrophe (Bock et al. 1983 ; Gay et al. 1983 ; Bock et al. 1990). Les
nitratants tels que les espèces Nitrobacter winogradskyi, N. hamburgensis et N. vulgaris
peuvent croître chimioorgano-trophiquement grâce à l’acétate ou au pyruvate comme
donneur d’électron et à l’oxygène ou au nitrate comme accepteur d’électron (Freitag et al.
1987). Bien que ces bactéries soient capables de croître en conditions hétérotrophes, leur
croissance est inefficace et lente dans ces conditions (Bock & Koops 1992). De plus, les
substrats inorganiques autres que le nitrite, le NO par exemple, peuvent être utilisés, ce qui
indique une complexité du métabolisme des espèces du genre Nitrobacter (Freitag et al.
1987). Dans les environnements anoxiques, la nitrite oxydo-reductase peut réduire le nitrate
(Sundermeyer-Klinger et al. 1984). En absence d’oxygène, les bactéries du genre Nitrobacter
sont également capables de croître grâce à la dénitrification (Freitag et al. 1987). Le nitrate
peut servir d’accepteur d’électrons dérivés de composés organiques. Toutefois, il faut noter
que, Goreau et al. (1980) ont montré que Nitrobacter n’est pas capable de produire de N2O

61
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

en condition oxique ; cependant en anoxie plusieurs souches de Nitrobacter seraient

capables d’en émettre (Freitag et al. 1987).

Le manque de cultures pures de bactéries du genre Nitrospira restreint les

connaissances sur la physiologie et la génétique de ces microorganismes. Daims et al. (2000
et 2001a) ont démontré avec des expériences en bioréacteurs, qu’en conditions aérobies, les
bactéries proches des Nitrospira utilisent le carbone inorganique (HCO3- et/ou CO2) et le
pyruvate mais pas l’acétate, le butyrate et le propionate, suggérant ainsi un métabolisme
mixotrophe en présence de pyruvate ; cependant, aucune des sources de carbone testées lors
de conditions anaérobies n’étaient utilisées. Néanmoins, les bactéries appartenant au phylum
Nitrospira peuvent survivre dans des zones à très faible pression en oxygène (Okabe et al.
1999; Gieseke et al. 2001). La capacité à passer d’une respiration aérobie à un métabolisme
anaérobie pourrait être avantageuse dans de telles conditions. Les expériences de Daims et al.
(2001a) n’ont pas permis de montrer l’existence de la respiration du nitrate chez Nitrospira,
qui peut employer d’autres stratégies de survie aux périodes de carence en oxygène. Des
expériences en culture pure ont par ailleurs montré que Nitrospira marina est une bactérie
aérobie stricte (Watson et al. 1986) alors que Nitrospira moscoviensis peut présenter une
activité hydrogénase par oxydation de l’hydrogène (H2) et utiliser le nitrate comme accepteur
d’électron et le CO2 comme seule source de carbone (Ehrich et al. 1995).

I.2.2.3. Relation entre énergie et synthèse

Les bactéries nitrifiantes sont aérobies et la plupart sont autotrophes. L’énergie

nécessaire à la fixation du CO2 provient de la nitrification. Cependant l’ammoniaque et le
nitrite ne sont pas de très bonnes sources d’énergie. Les électrons libérés durant leur
oxydation ne peuvent être transférés aux substances qu’en fin de chaîne respiratoire. Ainsi,
l’oxydation du NH3 et NO2- ne peut pas directement être couplée à la réduction des premiers
éléments de la chaîne respiratoire. De l’énergie est donc nécessaire pour fournir des électrons
à ce niveau supérieur d’énergie. Ceci explique donc le faible taux de croissance des bactéries
nitrifiantes et leur besoin relativement élevé en nutriments, les rendant difficiles à cultiver. Et
c’est ainsi que les bactéries nitrifiantes peuvent transformer de grandes quantités d’azote,
même quand leur population est restreinte.
Les réactions stœchiométriques de l’oxydation de l’ammonium en nitrite puis en
nitrate peuvent être résumées de la manière suivante :

NH4+ + 1.5 O2 → 2 H+ + H2O + NO2- (1)

NO2- + 0.5 O2 → NO3- (2)

Les équations (1) et (2) permettent d’avoir les rendements énergétiques des 2 étapes
de la nitrification. La première étape de la nitrification est exogène et libère 4 fois plus
d’énergie que la seconde. La perte d’énergie libre pouvant atteindre 58 à 84 kcal par mole
d’ammonium et entre 15.4 et 20.9 kcal par mole de nitrite (Gibbs & Schiff 1960 dans Halling-
Sorensen & Jorgensen 1993). Les bactéries nitrosantes auraient donc un gain énergétique
plus important que les bactéries nitratantes pour une même quantité d’azote oxydé.
L’équation globale d’oxydation de l’ammonium peut s’écrire :

NH4+ + 2 O2 → NO3- + 2 H+ + H2O (3)

Grâce à la formule empirique C5H7NO2 représentant la formation de biomasse, les

équations caractérisant la croissance des bactéries nitrosantes (équation 4) et nitratantes
(équation 5) s’écrivent respectivement :

15 CO2 + 13 NH4+ → 10 NO2- + 3 C5H7NO2 + 23 H+ + 4 H2O (4)

62
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

5 CO2 + NH4+ + 10 NO2- + 2 H2O → 10 NO3- + C5H7NO2 + H+ (5)

Environ 99% du CO2 nécessaire est présent sous forme dissoute et, suivant le pH du
milieu, un équilibre s’établit entre l’acide carbonique et le bicarbonate :

CO2 + H2O ⇔ H2CO3 ⇔ H+ + HCO3- (6)

En considérant Nitrosomonas et Nitrobacter comme représentant des bactéries

nitrosantes et nitratantes, et en utilisant des valeurs de consommation et de rendements
définis par Haug et McCarty (1972) (dans Halling-Sorensen & Jorgensen 1993), les équations
d’oxydation-synthèse s’écrivent :

55 NH4+ + 76 O2 + 109 HCO3- → C5H7NO2 + 54 NO2- + 57 H2O + 104 H2CO3 (7)

400 NO2- + NH4+ + 4 H2CO3 + 195 O2 + HCO3- → C5H7NO2 + 400 NO3- + 3 H2O (8)

Ces équations montrent que l’oxydation de 100 mg de N-NH4+ produit 14.6 mg de

biomasse Nitrosomonas et 2.0 mg de biomasse Nitrobacter. Soit au total environ 17 mg/L de
biomasse nitrifiante, ce qui confirme un rendement de croissance faible, le rendement des
bactéries hétérotrophes étant de l’ordre de 15-30% (Barrillier & Garnier 1993).

63
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

I.2.2.4. Cinétiques de nitrification et de croissance des bactéries

nitrifiantes

Caractéristiques de croissance des bactéries nitrifiantes en culture pure

En culture pure le taux de croissance spécifique (µmax) des bactéries nitrosantes et

nitratantes est faible et le temps de génération très long : 7 à 24h pour les nitrosantes, 10 à
140 h pour les nitratantes (Bock et al. 1989). Les caractéristiques de croissance connues de
certaines bactéries nitrifiantes sont présentées dans le tableau I.11.

Tableau I.11. Caractéristiques de croissance de certaines bactéries nitrifiantes en culture pure.

(D’après Féray 2000). Les valeurs pour les Planctomycètes réalisant l’Anammox ont été ajouté à titre
de comparaison.

Cinétiques de nitrification et de croissance des bactéries nitrifiantes

L’étude en laboratoire de l’activité et de la croissance des bactéries nitrifiantes, à

partir de cultures de bactéries nitrifiantes provenant de l’environnement, ou de cultures
pures de bactéries nitrosantes et nitratantes, a permis d’en définir les cinétiques (Brion &
Billen 1998). Ainsi la vitesse d’oxydation de l’ammonium ou des nitrites (V) dépend de la

64
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

concentration en substrat et en oxygène selon une équation hyperbolique (de type Michaëlis-
Menten ou Monod : M), et de la température selon une relation sigmoïdale :

V = VspMax . f (T) . M (S) . M (O2) . BM

avec f (T) = exp [(T-Topt)2/dTi2] , M (S) = [S/(S+KmS)] et M (O2) = [O2/(S+Km-oxy)]

où BM est la biomasse nitrifiante, O2 la concentration en oxygène, S la concentration en
substrat (NH4+ ou NO2-) et T la température.
La croissance (G) est proportionnelle à cette activité :

G = µmax . f (T) . M (S) . M (O2) . BM

Les valeurs des paramètres déterminés par Brion & Billen (1998) sont présentées dans
le tableau I.12.

Tableau I.12. Paramètres cinétiques de croissance des bactéries nitrifiantes. (Brion & Billen 1998).

I.2.2.5. Nitrification autotrophe vs. nitrification hétérotrophe

En plus des nitrifiants autotrophes, un certain nombre de bactéries hétérotrophes, de

champignons et d’algues sont capables d’oxyder l’ammoniaque ou des composés organiques
en nitrite ou en nitrate (Focht & Verstraete 1977), par nitrification hétérotrophe. Ce processus
n’étant pas couplé à une génération d’énergie, les nitrifiants hétérotrophes ont besoin
d’oxyder des substrats organiques. Au cours de la nitrification hétérotrophe, l’ammoniaque
ou les composés azotés réduits (groupe amine des acides aminés) sont co-oxydés en
hydroxylamine, oxydes d’azote gazeux, nitrite ou nitrate. Par exemple, des bactéries
méthane-oxydantes peuvent co-oxyder l’ammoniaque en nitrite grâce à la combinaison d’une
méthane-monooxygénase et d’une hydroxylamine-oxydoréductase (O'Neil & Wilkinson 1977 ;
Zahn et al. 1994). Ainsi, dans certains cas comme celui par exemple de la rhizosphère du riz,
les bactéries oxydant le méthane participent à la nitrification (Bodelier & Frenzel 1999). Une
attention toute particulière est portée sur les nitrifiants hétérotrophes car une grande partie
est également capable de dénitrification aérobie en présence de matière organique
(Castignetti & Hollocher 1984).

L’importance environnementale de la nitrification hétérotrophe est toutefois

controversée car elle ne semble contribuer que minoritairement à la nitrification dans
l’environnement (Brown 1988). L’inhibition de l’une ou de l’autre des deux activités
nitrifiantes a été utilisée afin d’estimer la part de chaque processus dans la production de
nitrate, des inhibiteurs des cellules eucaryotes (tels que les cyclohexamines) pour déterminer

65
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

l’importance de l’activité nitrifiante fongique (Shimel et al. 1984), ou des inhibiteurs de la

nitrification autotrophe (Nitrapyrin ou acétylène) (Hynes & Knowles 1982). Bien que les taux
de nitrification (Tableau I.13) des bactéries nitrifiantes hétérotrophes soient très faibles
comparés à ceux des bactéries nitrifiantes autotrophes (Robertson & Kuenen 1988), la
nitrification hétérotrophe semble être importante quand la nitrification autotrophe est
inhibée par des conditions environnementales particulières (milieux très acides, Killham
1986).

Tableau I.13. Exemple de taux de nitrification de quelques bactéries nitrifiantes autotrophes et

hétérotrophes. (source : Focht & Verstraete, 1977).

Il est à observer que les taux de croissance maximale des bactéries nitrifiantes
autotrophes sont très inférieurs à ceux des bactéries hétérotrophes (Robertson & Kuenen
1988). Dans les conditions effectives des cours d’eau, la lenteur du développement des
bactéries nitrifiantes est encore accentuée. Cela conditionne fortement leur dynamique dans
le réseau hydrographique, particulièrement dans les ordres inférieurs, où les taux de dilution
par les apports latéraux de débit sont souvent supérieurs à ces taux de croissance. Dans ces
conditions, la forte propension des bactéries nitrifiantes à se fixer aux particules solides
(Stehr et al. 1995b) correspond peut-être à une stratégie leur permettant, malgré la lenteur de
leur croissance, de maintenir en place leur population dans un cours d’eau.

66
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

I.2.3. Eléments de biochimie et de génétique

Les progrès principaux concernant la connaissance et la compréhension de la
biochimie et génétique des bactéries nitrifiantes ont été obtenus en utilisant comme
organismes modèles Nitrosomonas europaea et Nitrobacter hamburgensis, deux espèces
parmi les plus facilement cultivables. Le premier système génétique décrit de bactérie
nitrosante a été celui de N. europaea ce qui a permis aux industriels de mettre au point les
premiers mutants (Hommes et al. 1996; Iizumi & Nakamura 1997).
Récemment, le séquençage complet du génome de N. europaea a été réalisé (les séquences
sont disponibles à l’adresse : [Link]
[Link]/prod/bin/microbes/neur/[Link]).

L’oxydation du NH3 en NO2-, en deux étapes, est réalisée par deux enzymes clés,
l’ammonium monooxygénase (AMO) qui catalyse l’oxydation du NH3 en NH2OH et par
l’hydroxylamine oxydoréductase (HAO) qui catalyse l’oxydation du NH2OH en NO2-. Des
études in vivo et in vitro ont permis d’obtenir des informations considérables concernant la
structure et les activités de ces deux enzymes (Figure I.24, cf. revue de Arp & Sayavedra-Soto
2002). Les bactéries nitrosantes, capables de réduire le nitrite en N2O en conditions de stress
oxique possèdent aussi une nitrite-réductase et une acide nitrique réductase encore peu
étudiées (Hooper 1968). L’oxydation du nitrite en nitrate par les bactéries nitratantes est
réalisée par le système d’oxydation des nitrites (ou nitrite oxidoréductase, NOR).

Figure I.24. Arrangement des gènes hao et amo chez N. europaea et Nitrosomonas sp. souche ENI-
11.
Les flèches indiquent le sens de lecture des gènes.
Les distances entre chaque région sont indiquées en kilobases et ne sont pas représentées aux
proportions.
Les zones grisées montrent les régions organisées de la même manière (d’après Chain et al. 2003).

I.2.3.1. L’ammonium monooxygénase (AMO)

Biochimie

L’ammonium monooxygénase (AMO) oxyde l’ammoniaque en hydroxylamine, grâce à

l’intervention d’oxygène moléculaire (O2) et de deux électrons. Un atome d’oxygène est réduit
en eau, alors que le second atome d’oxygène est incorporé pour former l’hydroxylamine. Avec
une faible spécificité pour le substrat, cette enzyme est également capable d’oxyder certains
composés apolaires tels que le méthane, le monoxyde de carbone et quelques hydrocarbures
aromatiques et aliphatiques (Hooper et al. 1997). L’AMO est une enzyme membranaire
similaire à la méthane monooxygénase (pMMO) des bactéries méthanotrophes. Ces enzymes
sont homologues par la composition de leurs sous-unités, l’action de leurs inhibiteurs, la
gamme de leurs substrats et la séquence nucléotidique des gènes codant pour leur synthèse.

67
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

L’AMO serait également proche d’une monooxygénase permettant l’oxydation des alcanes
(notamment le butane) chez Nocardioïdes sp. CF8 (Hamamura et al. 2001).
L’enzyme est constituée de trois polypeptides (AmoA, AmoB, AmoC). Si N. europaea
est incubé en présence d’éthylène radioactif (14C2H2), l’activité de l’AMO est inhibée et le
polypeptide AmoA est marqué au 14C montrant que la protéine AmoA (31.8 kDa) porte le site
actif catalytique de l’oxydation du NH3 (Hyman & Arp 1992). Le polypeptide AmoB (38 kDa)
a été mis en évidence grâce à sa co-purification avec AmoA (McTavish et al. 1993a). Le
polypeptide AmoC (31.4 kDa) non purifié, est mis en évidence de manière indirecte : les
gènes codant pour AmoC, AmoA et AmoB sont en effet co-transcrit en un seul ARNm
(Sayavedra-Soto et al. 1998).

Le nitrite, produit lors du métabolisme nitrosant, est toxique pour N. europaea selon
un mécanisme spécifique à l’AMO (Stein & Arp 1998). Les bactéries nitrosantes peuvent
toutefois contrer les effets négatifs du nitrite au moyen d’une nitrite-réductase périplasmique
(NirK) (Beaumont et al. 2002).

Génétique

Les trois polypeptides constituant l’AMO sont codés par 3 gènes contigus : amoC,
amoA et amoB (Figure I.24), co-transcrits en un ARNm de 3.5 kb. Chez N. europaea, cet
opéron est présent sous forme de deux copies quasiment identiques (> 99% d’homologie)
(McTavish et al. 1993a), une troisième copie de amoC non associée aux deux autres gènes et
n’ayant que 60% d’homologie est également présente (Sayavedra-Soto et al. 1998).
Les autres bactéries nitrosantes de la sous-classe β des Protéobactéries possèdent des
gènes amo très similaires à ceux de N. europaea (Klotz & Norton 1998). Suivant les bactéries,
l’opéron amoCAB peut être présent jusqu’à trois copies (McTavish et al. 1993a; Klotz &
Norton 1998; Sayavedra-Soto et al. 1998; Norton et al. 2002) (tableau I.14).

Tableau I.14. Nombre d’opérons amo et de copies du gène amoC chez plusieurs bactéries
nitrosantes.

Le taux d’identité étant très élevé entre les différentes copies du gène amo, Klotz &
Norton (1998) ont proposé l’existence d’un mécanisme correctif maintenant l’identité des
gènes au cours du temps ; ces différentes copies ne seraient pas le résultat de transfert
interspécifique mais d’un phénomène de duplication. Cependant, même si les différentes
copies de amo sont fonctionnelles, leur expression est différente. Chez N. europaea, un
mutant sur amoA1 aura un taux de croissance d’environ 25 % inférieur à la normale, alors que
le taux de croissance d’un mutant sur amoA2 sera similaire au phénotype sauvage (Hommes
et al. 1998). Dans les cellules, il se forme 3 transcrits amoC, amoAB et amoCAB (3.5 kb). Les
sites d’initiation de la transcription sont connus : il y a deux promoteurs à 166 et 103 pb en
amont du codon initiateur de amoC et un à 114 pb en amont du codon initiateur de amoA

68
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

(Hommes et al. 2001). Chez N. europaea, l’ammoniaque induit une réponse

transcriptionnelle, et sert de signal à l’expression génique. Lorsque des cellules sont traitées
avec du NH4+ et du 14CO2, une large gamme d’ARNm marqués est détectée par électrophorèse
(Sayavedra-Soto et al. 1998) alors que peu de protéines sont marquées (Hyman & Arp 1995).

Les bactéries nitrosantes appartenant à la sous classe γ des Protéobactéries, ont un

opéron amo unique très différent des bactéries nitrosantes de la sous classe β (Alzerreca et al.
1999). Alzerreca et al. (1999) ont montré que Nitrosococcus oceani et la souche marine C-113,
ont leur opéron amo identique à 90%. Cependant cet opéron n’a que 49 à 53% d’homologie
avec les gènes pmo et entre 39 et 42% d’homologie avec l’opéron amo des bactéries de la
sous-classe β des Protéobactéries. L’analyse des gènes amo des bactéries nitrosantes des
sous-classes β et γ des Protéobactéries et des gènes pmo des bactéries méthane-oxidantes, a
conduit à émettre l’hypothèse qu’une même lignée se serait séparée en trois très tôt au cours
de l’évolution (Klotz & Norton 1998 ; Alzerreca et al. 1999).

I.2.3.2. L’hydroxylamine oxydoréductase (HAO) et les cytochromes

associés

Biochimie

L’hydroxylamine oxydoréductase (HAO) permet l’oxydation de l’hydroxylamine en

nitrite et libère 4 électrons dont deux resservent à la première étape d’oxydation de
l’ammoniaque et les deux autres à générer de l’énergie (ATP/NADH). L’HAO est située dans
le périplasme, c’est un homotrimère dont les sous-unités de 64 kDa contiennent chacun 8
hèmes de type c (Igarashi et al. 1997). Sept forment des liaisons covalentes avec la protéine et
le huitième (P460) se situe au niveau du site actif de l’oxydation de l’hydroxylamine (Arp &
Sayavedra-Soto 2002). Les paires de hèmes fonctionnent comme des centres redox de
transfert d’électron. Le flux d’électron est canalisé à travers le cytochrome c554 puis jusqu’au
cytochrome cm552, où il est redirigé pour moitié vers l’AMO et pour moitié vers l’oxydase
terminale et utilisé dans les différents processus cellulaires de la biosynthèse et de génération
d’ATP (Figure I.25) (Whittaker et al. 2000).

Figure I.25. Description des étapes d’oxydation de

l’ammonium. La participation des cytochromes et du
stock d’ubiquinone est également décrite (d’après Arp
& Sayavedra-Soto 2002)

69
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Génétique

Le gène hao, 1710 pb de long, codant pour l’HAO est exprimé sous la forme d’un
transcrit monocistronique1 (Sayavedra-Soto et al. 1994). Le génome de N. europaea contient
3 copies séparées du gène hao (McTavish et al. 1993b). Les régions codantes des trois copies
de hao sont identiques à l’exception d’un nucléotide (Hommes et al. 2001). La HAO n’a pas
pour le moment montré d’homologie de séquence avec d’autres protéines connues et serait
donc spécifique aux bactéries nitrosantes. Le gène hao3 diffère des 2 autres au niveau de sa
séquence non codante en amont de son codon initiateur, sa séquence promotrice étant située
à 54 pb du codon initiateur alors que celles des gènes hao1 et hao2 sont localisées 71 pb en
amont (Hommes et al. 2001). Les trois copies de hao semblent avoir la même fonction
puisque des mutants sur hao1, hao2 ou hao3 se comportent comme la cellule sauvage
(Hommes et al. 1996).

Les bactéries nitrosantes possèdent plusieurs cytochromes impliqués dans le

transport d’électron à partir de l’HAO. Le premier accepteur d’électron est le cytochrome C554
périplasmique (tétrahème de type c). Une copie du gène hcy (ou cyc) codant pour ce
cytochrome est localisée 1162 pb en aval de chaque copie de hao (Hommes et al. 2001). Le
cytochrome membranaire Cm552 (Figure I.25) est quant à lui codé par un gène contigu à deux
des copies de hcy. Il est donc fort probable que les deux cytochromes soient co-transcrits
puisque leur gène sont séparés par à peine 2 nucléotides.

I.2.3.3. La nitrite-réductase et l’oxyde-nitrique-réductase des bactéries

nitrosantes

Il a été montré que les bactéries nitrosantes, telles que N. europaea peuvent produire
de l’oxyde nitrique (NO) et de l’oxyde nitreux (N2O) par réduction des nitrites. Dans les
environnements pauvres en oxygène, le nitrite peut se substituer à l’oxygène comme
accepteur final d’électron réalisant ainsi une respiration similaire à la dénitrification (Ritchie
& Nicholas 1972; Poth & Focht 1985).

En 1968, Hooper a décrit la première nitrite-réductase chez Nitrosomonas europaea.

Les premières expériences sur la protéine partiellement purifiée ont montré qu’il s’agissait
d’une enzyme induite par de faibles concentrations en oxygène et portant un noyau cuivre
très similaire à la nitrite-réductase des bactéries dénitrifiantes hétérotrophes (Ritchie &
Nicholas 1974). Le gène nirK code pour cette nitrite-réductase, l’inactivation de ce gène chez
N. europaea rend les cellules beaucoup plus sensibles au nitrite (Beaumont et al. 2002). Les
séquences de ce gène sont très différentes d’une espèce nitrosante à l’autre, cependant le gène
nirK a été détecté chez plusieurs bactéries nitrosantes autres que N. europaea notamment
chez N. marina et certains isolats d’origine marine (Casciotti & Ward 2001).

Grâce au séquençage complet du génome de Nitrosomonas europaea, Chain et al.

(2003) ont détecté des gènes ayant une forte homologie avec les gènes nor codant pour
l’oxyde nitrique-réductase de type c-Nor chez les bactéries dénitrifiantes. Grâce à cette
observation, il a été postulé que, en complément de la nitrite-réductase, les bactéries
nitrosantes devaient posséder une oxyde nitrique-réductase afin d’éliminer le NO produit et
expliquer ainsi la production de N2O. Beaumont et al. (2004) ont bien identifié une oxyde-
nitrique-réductase chez N. europaea, codée par le groupe de gène norCBQD. Toutefois, cette
enzyme ne semble pas indispensable au processus de nitrification-dénitrifiante chez N.
europaea puisque sa mutation n’affecte pas la production de N2O, et cette enzyme serait
même active en condition de croissance aérobie. Ces recherches, ont donc permis de mettre

1
ARN ne comportant qu'une seule information génétique.

70
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

en évidence l’existence d’une enzyme capable de produire du N2O, mais qui ne serait pas
responsable de l’activité de nitrification-dénitrifiante, qui est parfois tout simplement
attribuée à l’HAO (Hooper et al. 1997).

I.2.3.4. Les systèmes d’oxydation des nitrites des bactéries nitratantes

(nitrite oxydoreductase NOR)

Comme l’oxydation du nitrite est un processus réversible, la nitrite oxidoréductase,

enzyme membranaire, catalyse l’oxydation du nitrite en nitrate ou la réduction du nitrate en
nitrite. C’est une enzyme inductible localisée du coté interne des membranes cytoplasmiques
et intracytoplasmiques (Tsien et al. 1968).

Suivant la méthode utilisée pour isoler les protéines du système NOR, leurs
caractéristiques moléculaires peuvent varier. Le système NOR est constitué de deux ou trois
sous-unités (Meincke et al. 1992). L’enzyme de N. hamburgensis est constituée de 2 ou 3
grandes sous-unités de masses moléculaires 32, 65 et 115 kDa (Sundermeyer-Klinger et al.
1984; Meincke et al. 1992), celle de 32 kDa n’étant pas purifiée lors de traitement thermique.
Spieck et al. (1996) ont également purifié chez Nitrobacter hamburgensis un hétérodimère
αβ de 186 kDa. Chez N. winogradskyi et N. vulgaris, la NOR serait constituée de deux sous-
unités de masses moléculaires 115-130 et 65 kDa (Bock et al. 1990). Les masses moléculaires
de la β-NOR du genre Nitrobacter et de la sous-unité β du système d’oxydation du nitrite
NOS (β-NOS, Nitrite Oxidizing System) du genre Nitrococcus sont identiques (65 kDa). Au
contraire, les masses moléculaires des β-NOS des genres Nitrospina et Nitrospira sont
différentes (48 et 46 kDa).

Les niveaux de similitude entre le système NOS des genres Nitrococcus, Nitrospina et
Nitrospira et la NOR du genre Nitrobacter sont d’autant plus grand que les organismes sont
proches phylogénétiquement. Les masses moléculaires des protéines détectées chez
Nitrococcus mobilis sont identiques à celles de la β-NOR des espèces de Nitrobacter. De plus
la localisation des enzymes oxydant le nitrite chez Nitrobacter et Nitrococcus, est la même,
elle sont associées au coté interne des membranes cytoplasmiques et intracytoplasmiques
(Spieck et al 1996). Les genres Nitrospina et Nitrospira sont beaucoup moins proches
phylogénétiquement de Nitrobacter. Ainsi, la localisation cellulaire du système NOS de ces
deux espèces bactériennes est différente de celle de la NOR de Nitrobacter, le système NOS
étant associé au coté périplasmique des membranes cytoplasmiques (Spieck et al. 1998).

Les gènes codant pour les deux sous-unité (norA et norB) de la nitrite oxydoréductase
de Nitrobacter hamburgensis ont été séquencés (Kirstein & Bock 1993). Ces gènes sont
associés à une troisième ORF (norX), située entre norA et norB. Les sous-unités α et β de la
NOR présentent également de grandes similitudes avec les sous-unités α et β de la nitrate
réductase présentes chez de nombreux chimioorganotrophes dont E. coli.

71
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

I.2.4. Écologie des bactéries nitrifiantes

I.2.4.1. Facteurs influençant la croissance des bactéries nitrifiantes

En laboratoire, les bactéries nitrifiantes ont des taux de croissance très lents, les
temps de génération les plus courts étant de 7h pour le genre Nitrosomonas et de 10h pour le
genre Nitrobacter (Bock et al. 1990). Dans l’environnement, en fonction de la concentration
en substrat, de la disponibilité de l’oxygène, de la température et du pH, la plupart des
espèces nitrifiantes ont besoin de plusieurs jours, voire plusieurs semaines pour se diviser.

Oxygène

En raison de leur métabolisme oxydatif, les bactéries nitrifiantes sont dépendantes de

la présence en oxygène pour l’oxydation de l’ammoniaque et du nitrite. En 1983, Josserand
situe entre 0.5 et 4 mg.L-1 la concentration en oxygène dissous correspondant à une
nitrification optimale en culture pure. Des cinétiques de consommation de l’oxygène ont été
déterminées sur des bactéries, cultivées en cultures mixtes dans des chémostats, pour
différents taux de croissance et différentes concentrations en oxygène (Laanbroek & Gerards
1993). La diminution de la pression en oxygène dans les cultures paraît réprimer l’oxydation
du nitrite avant que l’oxydation de l’ammonium ne soit affectée et donc induit une
accumulation de nitrite, ce qui s’explique par la différence d’affinité des bactéries nitrosantes
et nitratantes pour le substrat ; en effet l’affinité de Nitrosomonas europaea pour l’oxygène
est supérieure à celle de Nitrobacter hamburgensis (Laanbroek et al. 1994). Cependant, les
auteurs montrent que l’affinité pour l’oxygène de Nitrobacter devient équivalente à celle de
Nitrosomonas dans des conditions continues de limitation en oxygène. De plus, la croissance
en anaérobiose du genre Nitrobacter, grâce à son aptitude à dénitrifier en présence de
matière organique, peut lui conférer un avantage compétitif vis à vis de Nitrosomonas. Les
bactéries nitratantes ont longtemps été considérées comme des microorganismes aérobies
stricts, toutefois la croissance des bactéries nitratantes avait déjà été observée dans des
environnements totalement anaérobies (boues, réservoirs anaérobies d’eaux usées), en
absence de nitrate et d’oxygène, mais en présence de concentrations significative de sulfides
(Abeliovich 1987). La coexistence de processus d’oxydation et de réduction par Nitrobacter
au sein d’une même culture avait déjà été démontrée (Freitag et al. 1987). Les bactéries
nitratantes peuvent quant à elles survivre en condition anoxique en utilisant par exemple le
pyruvate comme donneur d’électron (Freitag et al. 1987). Rappelons que les bactéries
nitrosantes possèdent égalment des voies métaboliques induite en conditions de sress oxique
et en anaérobiose, comme la capacité d’oxyder l’ammonium en prenant le nitrite comme
accepteur d’électron, produisant ainsi du N2O (Ritchie & Nicholas 1972; Poth & Focht 1985).

Température

Les bactéries nitratantes sont généralement mésophiles avec des températures

optimales de 26 à 38°C (Figure I.26), bien que ce processus puisse avoir lieu entre 5 et 42°C
pour certaines souches dans les milieux naturels. Le taux de croissance spécifique de
Nitrosomonas augmente d’environ 10% et celui de Nitrobacter d’environ 6% après une
élévation de température de 1°C, dans une gamme de température entre 8 et 23°C (Knowles
et al. 1965). La température peut également intervenir de façon indirecte sur la nitrification
en modifiant la concentration en oxygène dissous, ou la teneur en NH3 conjointement avec le
pH (Laudelout et al. 1976).

72
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Figure I.26. Effet de la température sur l’activité de (a) Nitrosomonas et (b) Nitrobacter (Grunditz
& Dalhammar 2001)

pH

Les bactéries nitrifiantes ont une croissance et une activité optimales pour des pH
compris entre 7,5 et 8,5 (Josserand 1983 ; Bock et al. 1989). Un exemple d’effet du pH sur
l’activité en culture pure de Nitrosomonas et Nitrobacter est présenté en Figure I.27.
Cependant dans la nature, ces bactéries peuvent tolérer des gammes de pH plus larges,
notamment des pH acides (dans des sols forestiers acides) ou basiques. Sorokin et al. (1998)
ont par exemple détecté et isolé cinq souches bactériennes nitratantes adaptées à un
environnement lacustre alcalin (pH 10), souches maintenant classées dans la nouvelle espèce
Nitrobacter alkalicus. Groeneweg et al. (1994) ont montré que l’activité de Nitrosomonas en
culture pure était maximale pour des valeurs de pH comprises entre 6.7 et 8.0, qu’elle était
légèrement plus faible entre 8.0 et 9.0, mais 2 fois plus faible entre 6.3 et 6.7. De même
Allison & Prosser (1993) ont détecté une diminution de 39% de l’activité nitrosante de
Nitrosomonas en réacteur quand le pH passe de 8.0 à 7.0.

Figure I.27. Effet du pH sur l’activité de (a) Nitrosomonas et (b) Nitrobacter (Grunditz &
Dalhammar 2001).

Par ailleurs le pH influence indirectement les bactéries nitrifiantes en favorisant ou

non la formation des formes libres de l’ammonium ou de l’acide nitreux, qui inhiberaient les
bactéries. Ainsi, à pH acide, l’inhibition serait due à la formation de HNO2, et à pH basique à
la formation de NH3 (Anthonisen et al. 1976). Toutefois il est supposé à l’heure actuelle, que
le substrat de la nitrosation n’est pas NH4+ mais NH3 (Painter 1986). La réduction de
l’activité nitrosante à pH acide pourrait donc indirectement résulter de la limitation en NH3

73
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

libre. La concentration de NH3 dépend de la concentration totale en ammonium (équilibre

NH3/NH4+), l’action du pH est donc variable suivant la concentration totale en ammonium,
plus le substrat est concentré plus la culture supportera des pH acides (Painter 1986 ; Allison
& Prosser 1993).
Une autre hypothèse a été émise, l’alcalinité du milieu et non le pH serait le facteur
influençant réellement l’activité nitrifiante (Biesterfeld et al. 2003).

Concentration en substrat

En général, des concentrations en NH4+ de 2 à 10 mM et en NO2- de 2 à 30 mM sont

optimales (Bock et al. 1986). Les bactéries nitrifiantes peuvent être inhibées par leur propre
substrat, ainsi que par leurs produits d’oxydation. En effet le nitrite devient un rétro-
inhibiteur de la nitrosation lorsqu’il atteint de trop fortes concentrations, il inhibe
l’ammonium monooxygénase (Sümer et al. 1995). De plus, certaines concentrations de NH3
et HNO2 peuvent respectivement inhiber la nitrosation et la nitratation en fonction des
conditions de pH (Anthonisen et al. 1976). Les produits d’oxydation, nitrite et nitrate, sont
inhibiteurs à des concentrations respectivement de 300 mg/L (20 mM N-NO2-) pour le genre
Nitrosomonas et 4000 mg/L (285 mM N-NO3-) pour le genre Nitrobacter (Bock et al. 1989).
Toutefois de telles valeurs sont peu observées dans l’environnement.

Composés azotés gazeux

Les bactéries nitrifiantes réagissent souvent à la présence de composés azotés gazeux

tels que le NO, N2O et NO2. Par exemple, la présence de NO est nécessaire à l’oxydation de
l’ammoniaque par Nitrosomonas eutropha (Zart et al. 2000). En effet, l’oxyde nitrique
semble même activer la nitrification, puisque lorsqu’il est complètement éliminé du milieu de
culture, la nitrification est inhibée et ne reprend qu’après l’ajout de NO (Zart et al. 2000 ;
Schmidt et al. 2001). De plus, la croissance et l’activité nitrosante de Nitrosomonas eutropha
sont accrues par la présence de NO2 (Zart & Bock 1998). Cette dernière observation vient
conforter le modèle hypothétique d’oxydation de l’ammonium proposé par Schmidt et al.
(2001) et expliqué dans la partie I.2.2.1.

Lumière

Les bactéries nitrosantes et nitratantes sont sensibles à la lumière. Pour le genre

Nitrobacter, qui est plus sensible à la lumière visible que le genre Nitrosomonas (Olson
1981), la photooxydation des cytochromes c est sûrement la cause de la mort cellulaire. Pour
les bactéries nitrosantes, il s’agirait d’une inhibition de l’ammonium monooxygénase (Shears
& Wood 1985). Hooper et Terry (1974) ont testé le champ d’action de la photo-inactivation de
l’activité nitrosante chez Nitrosomonas. Cette photoinhibition suit une cinétique du premier
ordre avec un niveau proportionnel à l’intensité lumineuse testée. Cette inhibition se situe
surtout dans les longueurs d’onde correspondant aux ultraviolets, inhibant à la fois
l’oxydation de l’ammoniaque et de l’hydroxylamine : les bactéries présenteraient donc une
photoinhibition pour des longueurs d’ondes inférieures à 480 nm, par un mécanisme de
photooxydation du cytochrome c (Bock et al. 1986). Néanmoins, les bactéries nitrifiantes sont
rencontrées dans beaucoup d’habitats exposés à la lumière tels que l’interface eau-
atmosphère des milieux d’eau douce et marins, donc manifestement, les bactéries nitrifiantes
doivent posséder des mécanismes de protection pour contrer la photoinhibition et les
dommages causés par la lumière.

74
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

I.2.4.2. Ecologie des bactéries nitrifiantes

Inhibition

Plusieurs composés sont utilisés pour inhiber la nitrosation par inactivation de

l’ammonium monooxygénase. L’inhibition sélective de la nitratation est moins aisée, hormis
le chlorate (NaClO3) s’étant révélé efficace (Belser & Mays, 1980) (Tableau I.15).

Tableau I.15. Inhibiteurs des deux étapes de la nitrification le plus fréquemment utilisés.

Si dans les milieux naturels le processus de nitrification peut être inhibé, les
substances inhibitrices dans les milieux complexes que sont les eaux usées en stations
d’épuration sont nombreuses mais peu connues (Jonsson et al. 2000). Des méthodes simples
ont été décrites afin de tester le potentiel inhibiteur d’un échantillon (par exemple un
échantillon d’eau usée), en y ajoutant soit des cultures pures de bactéries nitrifiantes (Tanaka
et al. 1993 ; Grunditz & Dalhammar 2001), soit une boue nitrifiante « sludge » (Arvin et al.
1994), puis en mesurant le taux d’inhibition de l’activité nitrifiante par rapport à la normale.
Si ce genre d’approche permet de tester la potentialité inhibitrice d’une substance, il n’est pas
sûr qu’en absence de réponse, ces mêmes bactéries ne seraient pas sensibles à d’autres
inhibiteurs, ou d’autres bactéries nitrifiantes que celles utilisées ne seraient pas inhibées par
l’échantillon.

Des tests en culture pure ont montré par exemple que certains pesticides ont le
pouvoir d’inhiber l’activité nitratante chez Nitrobacter (Tableau I.16) ou que certains acides
gras non saturés ou monoterpènes peuvent inhiber l’activité de Nitrobacter (Svenson et al.
2000). Fuller & Scow (1996, 1997) ont montré que le toluène ou trichloroethylène peuvent
inhiber la nitratation dans les sols.

75
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Tableau I. 16. Effet de différents pesticides sur la croissance de Nitrobacter agilis en culture pure
(d’après Winely 1970). chlordane (1,2,3,5,6,7,8, 8-octachloro-2,3,3a,4,7, 7a-hexahydro-4,7-
methanoindene), CIPC [isopropyl N-(3-chlorophenyl) carbamate], DDD [l, 1-dichloro-2,2-bis (p-
chlorophenyl) ethane], eptam (S-ethyl-di-N,N-propyl-thiocarbamate), heptachlor (1 ,4, 5,6,7,8,8 -
heptachloro-3a ,4,7,7a-tetrahydro-4, 7-endo-methanoindene), lindane (isomère gamma du 1,2, 3,4,
5, 6-hexachloro-cyclohexane).

Niches écologiques des bactéries nitrifiantes

Malgré les effets inhibiteurs, les bactéries nitrifiantes sont présentes dans quasiment
tous les environnements, oxiques et anoxiques. Puisque l’ammoniaque et le nitrite sont les
sources d’énergie des bactéries nitrifiantes, leur distribution dans les habitats naturels
dépendra des différentes sources géologiques, biologiques et anthropogéniques, d’azote
réduit. Les bactéries nitrifiantes sont ainsi adaptées à une gamme très large de
concentrations en nutriment, puisqu’il existe des espèces bactériennes nitrifiantes variées
ayant des affinités différentes pour le substrat. La sensibilité aux facteurs environnementaux
étant différente selon les espèces, à chaque niche écologique particulière correspondra une
association de bactéries nitrifiantes spécialisées.

Les bactéries nitrifiantes sont largement distribuées dans une grande diversité de
milieux : eau douce, milieux marins, sol, systèmes d’épuration des eaux usées, et même dans
des milieux atypiques tels que les roches ou les maçonneries, dans des milieux extrêmes tels
que des systèmes de chauffage à des températures supérieures à 47°C ou dans le permafrost à
une profondeur de 60m et une température de –12°C. Bien que le pH optimum pour la
croissance cellulaire soit de 7.0-8.0, les bactéries nitrifiantes peuvent être détectées dans des
environnements très acides (des sols forestiers très acides ayant un pH de 4) et des milieux
très alcalins tels que des lacs ayant des pH atteignant 9.7-10.5 (Sorokin et al. 2001). Le
développement dans les environnements extrêmes est sûrement favorisé grâce à l’activité
urolytique de certaines souches nitrifiantes mais aussi grâce à la formation de biofilms et
d’agrégats protecteurs (De Boer et al. 1991; Allison & Prosser 1993).

La présence de matière organique peut également être un facteur sélectif,

spécialement pour certaines souches de Nitrobacter lithotrophes facultatives. En effet, la

76
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

plupart des espèces de Nitrobacter sont capables de croître hétérotrophiquement par

oxydation de l’acétate, du pyruvate, glycérol et autres composés organiques simples (Bock &
Koops 1992).

Avantages écologiques

Les bactéries nitrifiantes possèdent des mécanismes de survie leur permettant d’être
présentes dans des écosystèmes variés, des milieux aquatiques aux écosystèmes terrestres.
Elles ont même été détectées dans les façades en grès de bâtiments et dans l’eau de pluie
(Visser 1964 ; Meincke, 1989). Ces bactéries peuvent se maintenir en conditions de carence
en substrat (ammonium ou nitrite), grâce par exemple à la respiration de composés
cytoplasmiques, métabolisme ralenti quasiment indétectable (Johnstone & Jones, 1988). Les
bactéries nitrifiantes sont capables de survivre à des périodes prolongées en anaérobiose par
exemple dans des réservoirs d’eau usée ou des sédiments eutrophes (Smorczewski & Schmidt
1991). N. eutropha pourrait même survivre sans ammoniaque pendant une durée de 1 an
(Pinck et al. 2001). Plus généralement, les bactéries nitrosantes en carence, maintiennent
leur contenu cellulaire en ARNr à un niveau normal (Wagner et al. 1995). La présence de
plusieurs copies de gène codant pour l’AMO, permettrait une production plus rapide d’ARNm
et de protéines au moment d’apport soudain d’ammonium dans les environnements naturels
(Hommes et al. 1998). Cette capacité peut certainement conférer un avantage sélectif aux
bactéries nitrosantes maintenant un niveau constamment élevé d’AMO (Pinck et al. 2001).
Pour des faibles concentrations en oxygène dissous dans le milieu, les bactéries nitrosantes
peuvent utiliser le nitrite comme accepteur d’électron et générer de l’oxyde nitreux (N2O)
(Ritchie & Nicholas 1972; Poth & Focht 1985). Ces auteurs ont mentionné l’importance de
l’utilisation du nitrite comme alternative à l’oxygène comme accepteur d’électron pour les
microorganismes se retrouvant temporairement dans des conditions d’anaérobiose. En 1985,
Poth et Focht ont proposé plusieurs avantages à l’existence de ce processus : 1) la
conservation de l’oxygène pour la première étape de nitrification. 2) l’élimination du nitrite,
produit toxique. 3) la diminution de la compétition pour l’oxygène, avec les microorganismes
nitratants, en consommant le nitrite. Enfin, en milieu anaérobie et hétérotrophe, les bactéries
nitratantes sont capables de réduire le nitrate en nitrite (respiration du nitrate) et en
ammonium (réduction dissimilatrice du nitrate) (Sundermeyer-Klinger et al. 1984).

Fixation et formation de biofilms

Les bactéries nitrifiantes sont souvent assemblées en agrégats ou biofilms grâce à la

production de polymères extracellulaires (EPS), formant un manteau de lipopolysaccharides
qui leur procure un fort pouvoir de fixation. Elles sont alors plus résistantes aux inhibiteurs
de la nitrification tel que le nitrapyrin (Powell & Prosser 1991), peuvent supporter des pH
relativement faibles (Allison & Prosser 1993) et sont protégées de la dessiccation, des
variations de pH et de la prédation (Prosser 1989 ; Watson et al. 1989 ; Verhagen et al. 1993 ;
Stehr et al. 1995b). L’association des bactéries nitrifiantes à un support (particules en
suspension, formant des clusters, agrégats, flocs ou biofilms) est aussi observée en milieux
naturels (Lusby et al. 1998 ; Koops & Pommerening-Röser 2001). Diab & Shilo (1988) ont
démontré la forte affinité des bactéries nitrifiantes pour la fixation grâce à l’introduction de
particules inertes dans un milieu, sur lesquelles 70 à 95% des bactéries nitrifiantes présentes
se fixent après 30 minutes. De même, dans une culture liquide de N. europaea en carence
depuis 42 jours, on observe une phase de latence avant la consommation de l’ammonium et
la production de nitrite, alors que la même expérience réalisée avec des bactéries mises en
présence de particules minérales, montre l’absence de phase de latence avant la production
de nitrite (Batchelor et al. 1997). La survie des bactéries attachées serait plus grande que
celles des libres dans un milieu carencé en substrat tant en condition anaérobie qu’aérobie
(Diab & Shilo 1988). La nitratation serait 130% supérieure dans un biofilm fixé que dans une

77
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

culture libre (Audic et al. 1984). Les populations associées à des surfaces ressuscitent plus
rapidement que des suspensions cellulaires, ce qui s’expliquerait par un phénomène
dépendant de la densité cellulaire (Batchelor et al. 1997) appelé « Quorum sensing » déjà
observé chez beaucoup de bactéries à Gram négatif (Swift et al. 1996). Une proximité
cellulaire et une forte concentration bactérienne procure dans ce cas un avantage écologique
dans les environnements ou le substrat est présent de façon irrégulière. Le mécanisme de
protection par les EPS, n’est toutefois pas clair, et la composition en EPS des bactéries
nitrifiantes et leur effet sur la physiologie des bactéries n’ont pas été caractérisés.

Si dans des boues activées, les microcolonies de Nitrospira sont relativement petites,
compactes et sphériques, les Nitrospira s’associant en biofilms sont beaucoup plus grands et
ont une morphologie plus complexe et irrégulière, des cavités internes se créent dans le
biofilm formant des réseaux de canaux perméables aux molécules de faible poids moléculaire
et aux substances solubles (Daims et al. 2001a). Des gradients de concentrations des
substrats (nitrite, gaz et composés métaboliques) sont malgré tout observés dans les agrégats
bactériens, à une échelle du mm ou µm, permettant ainsi à différentes populations et
différents processus de coexister (Verhagen et al. 1995). L’association entre les bactéries
nitrosantes et nitratantes facilite ainsi les échanges de nutriments, notamment la circulation
et transformation du nitrite.

Limites physiologiques

Les bactéries nitrifiantes sont photoinhibées (Johnstone & Jones 1988) et sont très
sensibles aux variations de leur milieu quand les conditions ne sont plus optimales (pH
alcalin autour de 7.0-8.0 et conditions mésophiles). Les expériences montrent notamment
que N. europaea est incapable de réguler son pH intracellulaire quand les conditions
externes varient (Frijlink et al. 1992). Le taux de croissance et l’activité des bactéries
nitrifiantes diminuent donc grandement dès que le pH passe en dessous de la neutralité. En
ce qui concerne la température, il semble qu’il y ait une relation linéaire entre l’activité et la
température entre 7 et 35°C pour la nitrosation, la température optimum de nitratation étant
plus faible que celle de la nitrosation. Au dessus de 42°C et en dessous de 5°C l’activité
nitrifiante est quasiment nulle (Painter, 1970). Enfin le dernier handicap écologique s’avère
être leur taux de croissance particulièrement lent à cause du faible rendement de production
d’énergie. Le temps de génération peut atteindre 7-8 h en conditions optimales (Bock et al.
1989), mais reste 5 à 10 fois inférieur à celui de bactéries hétérotrophes aérobies (Barillier &
Garnier 1993). Ce temps de génération in situ est plutôt de l’ordre de 26h pour les bactéries
nitrosantes et 60h pour les bactéries nitratantes (Belser 1984). Les bactéries nitrifiantes se
retrouvent donc in situ, en compétition avec les bactéries hétérotrophes si l’ammonium est la
seule source d’azote disponible (Verhagen et al. 1995).

I.2.4.3. Emissions de N2O par nitrification-dénitrifiante

Grâce notamment à leur présence dans des milieux anoxiques (Abeliovich & Vonhak
1992), les bactéries nitrifiantes ont un métabolisme beaucoup plus versatile que celui
supposé pendant longtemps. Si en conditions oxiques, lors du processus classique de
nitrification, les bactéries nitrosantes produisent en très faible quantité du N2O comme
intermédiaire de la nitrosation et plus précisément lors de l’oxydation de l’hydroxylamine en
nitrite (Jiang & Bakken 1999 ; Casciotti & Ward 2001), elles seraient capables de produire de
grandes quantités d’oxyde d’azote en conditions limitantes en oxygène grâce à l’ammonium
comme donneur d’électron (Goreau et al. 1980 ; Kuai & Verstrate 1998) où grâce à
l’hydrogène ou à des composés organiques en conditions anoxiques (Bock et al. 1995). En

78
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

condition oxique ou anoxique, ces bactéries peuvent utiliser le N2O4 comme oxydant lors de
l’oxydation de l’ammonium (Schmidt et al. 2001). Toutes ces nouvelles voies de conversion
de l’ammonium sont complexes et encore mal connues, les hypothèses basées sur quelques
observations expérimentales en culture pure restant à confirmer. De plus, de nouveaux
microorganismes Anammox (Anaerobic ammonium oxidation) appartenant aux
Planctomycètes et capables d’oxyder l’ammonium en conditions anoxiques ont été découverts
récemment, ce qui complique encore davantage le cycle de l’azote (Jetten et al. 1999 ; Strous
et al. 1999 ; Schmid et al. 2000). Une coopération pourrait même exister entre les bactéries
nitrosantes et celles de l’Anammox les premières oxydant l’ammonium en nitrite
immédiatement consommé par les secondes (Sliekers et al. 2002 et 2003).

Mécanisme de production de N2O par les bactéries nitrosantes

Plusieurs études anciennes montraient que certaines bactéries nitrosantes naturelles

et en cultures étaient capables de dénitrifier le nitrite en azote gazeux avec l’ammonium
comme donneur d’électron, en conditions de stress oxique (Blackmer et al. 1980 ; Goreau et
al. 1980 ; Poth & Focht 1985 ; Poth 1986). Plus récemment, Bock et al. (1995) ont confirmé,
en cultures pures ou mixtes, que Nitrosomonas eutropha était effectivement capable de
dénitrifier le nitrite en utilisant soit l’hydrogène soit l’ammonium comme donneur d’électron.
Shresta et al. (2002) montrent que N. europaea peut simultanément nitrifier et dénitrifier
dans des conditions contrôlées de pH (7.0-8.0) et d’oxygénation (faible pression partielle en
oxygène). Il serait même possible en conditions limitantes en oxygène d’obtenir des activités
simultanées de nitrification/dénitrification intense au sein de réacteurs traitant des eaux
usées (Helmer & Kunst 1998 ; Siegrist et al. 1998) ; cependant il n’a pas été prouvé que ce soit
le fait de bactéries nitrosantes. Ces observations ont conduit Kuai & Verstraete (1998) à
étudier le pouvoir dénitrifiant d’une boue nitrifiante en conditions limitées en oxygène
(processus OLAND : Oxygen Limited Autotrophic Nitrification-Denitrification). Cette étude
confirme le fait que les microorganismes, catalysant le processus OLAND, sont bien les
bactéries nitrosantes. La réaction stœchiométrique du processus OLAND est :

NH4+ + 1.5O2 → NO2- + H2O + 2H+ puis NH4+ + NO2- → N2 + 2H2O

soit au total : 2NH4+ + 1.5O2 → N2 + 3H2O + 2H+

L’azote moléculaire (N2) serait le composé gazeux produit majoritairement (80%),

toutefois 20% de l’ammonium serait oxydé en N2O (Kuai & Verstraete 1998). La production
de NO, N2O et N2 lors de la dénitrification aérobie des bactéries nitrosantes a déjà été
montrée (Poth & Focht 1985 ; Remde & Conrad 1990). Pynaert et al. (2003) montrent sur un
réacteur en phase stationnaire (29.1°C, pH 7.85, DO = 0.57±0.12 mg O2.L-1), qu’il y aurait
97% de N2, 3.1% de N2O et 0.0003 % de NO produit par les microorganismes autotrophes.

Chez Nitrosomonas eutropha un autre processus d’oxydation de l’ammonium, cette

fois en anaérobiose (Schmidt & Bock 1997 ; Schmidt & Bock, 1998), utilisant le dioxyde
d’azote (NO2) ou le tétroxyde d’azote (N2O4) à la place de l’oxygène, a été mis en évidence.
Cette réaction produit deux molécules d’oxyde nitrique (NO) :

NH3 + N2O4 + 2H+ + 2e- → NH2OH + H2O + 2NO

L’hydroxylamine produite est ensuite oxydée en nitrite et lui-même partiellement

utilisé comme accepteur d’électron conduisant à la formation de N2 :

NH2OH + H2O → HNO2 + 4 H+ + 4e- et HNO2 + 3 H+ + 3e- → 0.5 N2 + 2H2O

79
Chapitre I. 2. Généralités sur la nitrification

Toutefois dans l’environnement, en condition réductrice, il n’y a pas de NO2 disponible ;

l’oxydation anaérobie de l’ammonium dans ces conditions est donc totalement dépendante
du transport de NO2 provenant des couches oxiques. Pendant l’oxydation de l’hydroxylamine,
du NO, N2O et N2 peuvent être produits (Hooper & Terry 1979 ; Bock et al. 1995), y compris
en présence d’acétylène (Schmidt et al. 2001).

Facteurs influençant les émissions de N2O

Le NO et le N2O peuvent être produit par une grande variété d’organismes (nitrifiants
autotrophes, nitrifiants hétérotrophes bactériens et fongiques, dénitrifiants hétérotrophes,
bactéries réductrices ou respirant les nitrates, plantes et algues) en quantités variables selon
les conditions physicochimiques du milieu. Parmi tous ces organismes, les nitrosantes
peuvent, grâce à leur système enzymatique, s’adapter rapidement aux conditions favorables
et réaliser la nitrification-dénitrifiante (Siegrist et al. 1998). L’oxygénation serait le facteur
principal de déclenchement de la production d’azote gazeux par les bactéries nitrosantes
(Diab et al. 1992 ; Wrage et al. 2004). L’optimum de production de NO et N2O chez N.
europaea serait pour une pression en oxygène comprise entre 0.2 kPa et 0.4 kPa (Anderson
et al. 1993). Kuai & Verstraete (1998) confirment que le processus OLAND est réalisé à des
concentrations en oxygène dissous très faibles, entre 0.1 et 0.8 mg.L-1. Un changement
brusque de l’oxygénation sur des cultures pures de bactéries nitrosantes conduit à un pic de
production de NO et N2O, juste après le stress oxique, chez la plupart des espèces
bactériennes étudiées (Kester et al. 1997a et b). Le N2O représentant 7.4% de l’azote oxydé
par les bactéries nitrosantes en conditions aérobies (3.8 mg.L-1) augmenterait à 21.6% en
conditions de faibles pressions partielles en oxygène (Béline et al. 2001). De nombreuses
recherches sont actuellement réalisées afin d’optimiser le traitement des eaux en station
d’épuration, une nitrification partielle (nitrosation) peut être réalisée en réacteur avec un pH
de 7.5, une concentration en oxygène dissous de 1.5 mg.L-1 et une température de 30°C
(Jianlong & Ning 2004).

La concentration en substrat constitue un autre facteur influençant le processus de

nitrification-dénitrifiante. Sur des échantillons de sol, la proportion de N2O produit par
nitrification-dénitrifiante augmente avec l’ajout d’ammonium, cet ajout n’engendrant aucun
effet sur la diversité génétique de la communauté nitrosante (Avrahami et al. 2002). Plus
l’apport en ammonium est élevé, plus la production de nitrite et de N2O est importante
(Burgess et al. 2002). Anderson et al. (1993) avaient montré qu’en culture pure de N.
europaea, la production de N2O était positivement corrélée à la concentration en nitrite dans
le milieu, et qu’au-dessus de 0.5 mM de nitrite dans le milieu, du N2O était produit, quelle
que soit la concentration en oxygène. Ce phénomène est probablement dû à une compétition
entre l’oxygène et le nitrite comme accepteur d’électron, la disponibilité en nitrite
augmenterait la production de N2O (Dundee & Hopkins 2001 ; Wrage et al. 2004).

D’un point de vu écologique, ce mécanisme semble important pour la survie des

bactéries nitrosantes en conditions microaérophiles, et pourrait même avoir un rôle de
transport : les bactéries échappant aux profondeurs anoxiques par l’intermédiaire des bulles
de gaz (N2O) montant vers la surface (Philips et al. 2002).

80
 Tableau I.17. Production de NO et N2O pour des conditions optimum et sub-optimum de concentration en oxygène
(D’après Colliver & Stephenson 2000)

Optimum (stress oxique) Sub-optimum (sans carence en oxygène)

N 2O NO NO/N2O N 2O NO NO/N2O Références
Bactéries
O2 (mg.L-1) Production de O2 (mg.L-1) Production de (molN/molN) O2 (mg.L-1) Production de O2 (mg.L-1) Production de (molN/molN)
N2O N2O N2O N2O
Nitrosovibrio anoxique 3415 nmol anoxique 1288 nmol N.h-1 0.35 8.3 <5 nmol N.h-1 8.3 537 nmol N.h-1 107
N.h-1 Remde &
Nitrosomonas anoxique 5740 nmol anoxique 618 nmol N.h-1 0.12 8.3 8 nmol N.h-1 8.3 219 nmol N.h-1 27 Conrad (1990)
N.h-1
Nitrosomonas 0.18 3.4 .10-12 mmol - - - >7 1.05 .10-12 mmol - - - Goreau et al.
sp. [Link]-1.j-1 [Link]-1.j-1 (1980)
N. europaea 0.21 - 0.21 - 5.1 >4.1 - >4.1 - 1.15 Lipschultz et al.
(1981)
N. europaea 0.20 7.4 Indépendant 5.35 0.9 >1.9 0.85 Indépendant 4.8 8.5 Anderson &
.10-12 mmol .10-12 mmol .10-12 mmol .10-12 mmol Levine (1986)
[Link]-1.j-1 [Link]-1.j-1 [Link]-1.j-1 [Link]-1.j-1
N. europaea 0.10 - 0.10 - 3 >0.4 - >0.4 - 5.1 Kester et al.
(1997)
N. europaea 0.30 6 nmol N2O. - - - >0.9 1 nmol N2O. - - - Hynes &
flacon-1.h-1 flacon-1.h-1 Knowles (1984)
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3. Nitrification en milieux naturels

Les environnements aquatiques sont caractérisés par des gradients physiques et

chimiques qui engendrent des structurations spatiales et temporelles se traduisant par des
adaptations des organismes et des communautés (Carpenter & Kitchell 1993). L’étude des
communautés bactériennes intervenant dans les différentes étapes du cycle de l’azote
n’échappe pas à la prise en compte de ces interactions complexes (Bianchi 1998).

Depuis les travaux de Fuhrman & Azam (1982), la plupart des études d’écologie
microbienne menées sur les écosystèmes aquatiques se sont essentiellement portées sur le
cycle du carbone et ont rarement permis la caractérisation des relations entre la composition
des communautés et/ou populations bactériennes et leurs activités fonctionnelles. Les
approches ont surtout été basées sur des méthodes biogéochimiques (traçages radioactifs)
pour quantifier les processus microbiens et les dénombrements microscopiques par
épifluorescence (Porter & Feig 1980). On trouve dans la littérature quelques approches
microbiologiques ou taxonomiques basées sur l’analyse fine des populations, mais elles sont
alors rarement reliées à l’intensité des processus.

Il existe encore peu d’études conjuguant ces deux types d’approches conceptuelles sur
les milieux aquatiques (de Bie et al. 2001). Pourtant l’étude simultanée des
abondances/biomasses, diversité microbienne et des activités nous semble indispensable
pour comprendre et quantifier les transformations et circulations de l’azote. Les facteurs qui
régulent ces activités, qu’ils soient externes (température, nutriments, prédation…) ou
intrinsèques (processus cellulaires mis en œuvre par les microorganismes) doivent être
connus et quantifiés. Les caractéristiques de certaines espèces bactériennes (proportion,
phase de croissance ou état de survie, etc…) sont par ailleurs des éléments fonctionnels qui
restent à préciser.

I.3.1. Techniques de détection du processus de nitrification

La grande majorité des études concernant le cycle de l’azote et notamment le
processus de nitrification en milieu naturel, a été menée sur le sol et les stations d’épuration.
La nitrification des milieux aquatiques soumis à une pollution ammoniacale (apports
d’effluents domestiques ou industriels) a été beaucoup moins étudiée malgré son importance
écologique.
Afin d’illustrer la diversité des approches biochimiques utilisées dans l’étude du
processus de nitrification, nous allons séparer les divers milieux naturels faisant l’objet
d’études. Chaque domaine connaît des spécificités dues aux contraintes intrinsèques de
l’habitat étudié, cependant il est intéressant de confronter ces différentes approches pour : 1)
comparer l’intensité de la nitrification dans divers milieux souvent en connexion, et 2)
pouvoir prendre connaissance et éventuellement adapter les techniques développées dans les
autres domaines.
Même si les techniques analytiques, fréquemment automatisées, ont des protocoles
bien définis et normalisés, le choix d’une technique dépend surtout des objectifs d’étude
fournissant des degrés d’information différents et requière des adaptations spécifiques au
milieu physico-chimique étudié (eau, sédiment…).
Il faut différencier la technique de dosage d’un stock d’azote (par la colorimétrie par
exemple) et la méthode expérimentale mesurant une vitesse de processus qui selon les
conditions conduit à une activité réelle ou potentielle.

82
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3.1.1. Dosage des différentes formes d’azote

Les différentes formes d’azote inorganiques (NH4+, NO2- et NO3-) dans les échantillons
peuvent être dosées spectrophotométriquement. L’ammonium est dosé par la méthode
colorimétrique au bleu d’indophénol (Slavyck & McIsaac 1972). Les nitrites sont dosés par la
méthode colorimétrique à la sulfanilamide, coloration de Griess-Ilosway (Keeney & Nelson
1982 ; Rodier 1984). Les nitrates sont réduits en nitrite sur colonne de cadmium dans un
tampon basique, puis les nitrites sont dosés comme décrit ci-dessus (Rodier 1984). Ces
dosages peuvent être effectués selon des principes identiques grâce à des analyseurs
automatiques type Technicon ou sur chromatographie ionique type Dionex. Stüven et al.
(1992) ont présenté également le dosage de l’ammonium du nitrite et du nitrate par HPLC
(High Pressur Liquid Chromatography). Le processus de nitrification in situ, peut être mis en
évidence par les variations de ces composants dans le temps ou dans l’espace. Les dosages
sont réalisés à partir d’échantillons d’eau filtrée, il peut s’agir d’échantillons de la colonne
d’eau ou d’eau interstitielle à l’intérieur des sédiments. Dans ce second cas l’eau est extraite
de couches successives de manière à recomposer un gradient de concentrations en fonction
de la profondeur (par exemple, par couches de 2.5 à 5 mm d’épaisseur ; De Beer et al. 1991).
La méthode dite du « peeper » ou plaque à dialyse permet d’obtenir des profils de
concentrations in situ (Adams 1991). Ce type de technique n’a pas toujours une résolution
spatiale suffisante pour localiser précisément les processus de nitrification et dénitrification,
qui peuvent coexister à l’intérieur d’une mosaïque de « microzones ».
Le stock en gaz issu de la nitrification (le N2O, gaz à effet de serre, en particulier) peut
être dosé par chromatographie en phase gazeuse, à capture d’électron ou par analyseur infra-
rouge dans le cas d’un suivi en temps réel des émissions.

I.3.1.2. Les microélectrodes

Plus récemment des méthodes permettant la caractérisation fine de milieux

particuliers (sédiment et biofilm) ont été développées ; ce sont des microcapteurs ou
microélectrodes permettant de mesurer les concentrations des différentes formes d’azote2 à
des échelles très fines (celles du µm), sans perturber l’environnement physique, chimique et
biologique de l’échantillon (Revsbech et al. 1988). Les microélectrodes, basées sur des
membranes ou des gels échangeurs d’ions, pour mesurer les concentrations en NH4+ (De Beer
et al. 1991) ou en N2O (Revsbech et al. 1988) conduisent à des résultats précis (tableau II.1).
Les microélectrodes destinées au dosage du NO3- sont plus délicates d’emploi à cause des
interférences (les bicarbonates notamment) et de l’instabilité du signal obtenu (Jensen et al.
1993). Pour parer à ce problème, des microcapteurs à NO3-, utilisant des enzymes
immobilisées de type nitrate-réductases, ont été décrits (Willner et al. 1992), mais la
fonctionnalité de cette technique en environnement naturel reste à déterminer, car les
enzymes sont affectées par les changements de milieu. Plus récemment, des développements
ont été réalisés à l’aide de cultures pures de bactéries dénitrifiantes, immobilisées en face
d’un microcapteur à N2O, ces bactéries sont destinées à réduire, en présence d’acétylène, le
NO3- et le NO2- en N2O qui est alors détecté par la microélectrode (Larsen et al. 1996) ; malgré
la plus grande résistance des bactéries face aux variations environnementales, certains
inconvénients demeurent : l’ajout d’acétylène provoquant notamment en milieu anoxique,
une accumulation de N2O interférant dans la production de NO3-. L’utilisation de souches
mutantes de bactéries dénitrifiantes déficientes en oxyde-nitreux réductase (Larsen et al.
1997) a permis d’améliorer sensiblement l’outil, puisque Lorenzen et al. (1998) ont utilisé
avec succès ces biocapteurs sur des sédiments colonisés par des algues, leur permettant de
calculer des taux nets de consommation et de production de nitrate (en utilisant la loi de

2
D’autres variables peuvent être mesurées par cette technique : O2, potentiel d’oxydoréduction, pH,... qui ont une incidence
forte sur le cycle de l’azote.

83
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

Fick). Les résolutions spatiales (mesures tous les 0.1mm) et temporelles seraient excellentes
par rapport aux méthodes énumérées précédemment, une localisation fine des sites d’activité
nocturne et diurne d’assimilation de l’azote, de nitrification et de dénitrification étant alors
possible (Schramm 2003).

Tableau I.18. Microélectrodes utilisées dans la littérature pour l’étude du processus de nitrification
(Schramm 2003)

I.3.1.3. Activités nitrifiantes : potentielles et réelles

Deux catégories de méthodes sont employées : celles utilisant un traceur isotopique et

celles dites non isotopiques, basées sur des dosages chimiques. Ces méthodes peuvent être
appliquées sur des échantillons d’eau ou de sédiment dans des conditions optimales
d’incubation (ajout de substrats azotés, température, oxygénation et pH optimum), ce qui
conduit à une activité potentielle (voir entre autres : Hart et al. 1994 ; Bodelier et al. 1996 ;
Roy et al. 1996 ; Clays-Josserand et al. 1988 ; Féray & Montuelle 2003 ; Fortuna et al. 2003)
ou dans les conditions du milieu naturel, ce qui fourni une mesure d’activité réelle (voir entre
autres : Feliatra & Bianchi 1993 ; Bianchi et al. 1994 ; Strauss & Dodds 1997 ; Bianchi et al.
1999a et b ; De Bie et al. 2002). Les mesures d’activités nitrifiantes sont parfois effectuées sur
des échantillons déstructurés (sol notamment) pouvant introduire des biais ; le taux de
nitrification mesuré dans un échantillon de sol mélangé est en effet 4 fois supérieur à celui
d’une carotte intacte du même sol (Ross & Hales 2003).

Parmi les méthodes isotopiques, il existe la technique de traçage au 15N (Davidson et

al. 1991 ; Rysgaard et al. 1993), et celle utilisant l’incorporation de 14C pour mesurer de façon
indirecte, l’activité des bactéries nitrifiantes litho-autotrophes (Billen 1976 ; Somville 1976;
Brion & Billen 1998). La première, largement utilisée dans des études environnementales car
elle permet de mesurer l’activité nitrifiante sans manipuler le substrat (Rysgaard et al. 1993 ;
Barraclough & Puri 1995 ; Willison et al. 1998 ; Mendum et al. 1999), repose sur une
incubation après un ajout de 15N-NO3- dans l’échantillon analysé, l’activité nitrifiante
contribuant à une dilution du nitrate marqué, que l’on dose en spectrométrie de masse pour
calculer l’intensité de la nitrification. Le marquage du nitrite (15N-NO2-) a également été testé
(Burns et al. 1995). La méthode de fixation de 14C-CO2 ajouté à l’échantillon sous forme de
HCO3- dont l’incorporation serait proportionnelle à l’activité nitrifiante est controversée, car

84
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

le rapport entre le nombre de moles d’azote oxydé et de carbone fixé en culture pure serait
variable (entre 5 et 42 : Glover 1985).

Le principe des techniques non isotopiques consiste à mesurer les changements de

concentration des sels azotés (ammonium, nitrite, nitrate) au cours du temps. Dans ce cas, le
taux de nitrification (nitrosation et nitratation) d’un échantillon peut être déterminé par
incorporation au système d’incubation, d’inhibiteurs de la nitrosation comme l’allylthiourée
(ATU) et/ou de la nitratation comme le chlorate (Belser & Mays 1980), puis l’on mesure les
concentrations des ions inorganiques azotés au cours du temps pour déterminer ce qui
apparaît ou disparaît.

Une mesure d’activité potentielle peut être convertie en activité réelle en tenant
compte des variables environnementales (concentrations en substrats azotés et en oxygène,
température…) et des paramètres physiologiques (Ks, µmax) des bactéries (Cooper 1984). Les
méthodes d’activités réelles (sans ajout de substrat et à la température du milieu, c'est-à-dire
environ 15-20°C) demandent des temps d’incubations (en laboratoire) relativement longs et
sont donc peu avantageuses pour des mesures de routine. Parfois, le milieu est suffisamment
riche en ammonium et suffisamment actif pour que le temps d’incubation soit court ; de
l’ordre de 4 à 6h d’incubation dans des mesures d’activité nitrifiante réelle dans l’estuaire du
Rhône (Feliatra & Bianchi 1993; Bianchi et al. 1994). Les mesures d’activités réelles in situ,
utilisant des cloches benthiques (pour les sédiments fins) et des réacteurs étanches (pour les
galets colonisés par des biofilms) sont parfois difficiles à mettre en œuvre à cause de la
lenteur de la réaction de nitrification et sont principalement adaptées aux cours d’eau de
moindre taille (Teissier & Torre 2002). La nitrification peut enfin être indirectement déduite
de mesures de dénitrification du nitrate produit, à l’aide de dosage du N2O formé (Lensi et al.
1985 & 1986). Par ailleurs, l’activité nitrifiante réelle peut être estimée grâce à un bilan des
flux d’azote, en considérant la consommation de l’ammonium dans le système étudié comme
l’a montré Butturini et al. (2000) lors d’expérimentation en laboratoire pour estimer l’activité
nitrifiante dans le sédiment de la rivière La Solana. Pour finir, il est possible de mettre en
évidence l’activité de nitrification grâce à l’analyse du fractionnement isotopique naturel de
cette réaction, en effet, la nitrification s’accompagne d’un effet isotopique important,
provoquant l’apparition de nitrates appauvris en 15N par rapport à l’ammonium servant de
substrat (Mariotti 1982 ; Sébilo 2003).

I.3.1.4. Émissions de N2O

Sur des échantillons naturels (eau, sol,…), la contribution du processus de

nitrification-dénitrifiante à la production de N2O peut être estimée par des préincubations
avec et/ou sans 10Pa d’acétylène (C2H2) (Gödde & Conrad 2000 ; Bollmann & Conrad 1998).
Des incubations avec de petites quantités de C2H2 (de 0.01 à 0.1 kPa) et de fortes
concentrations en O2 (100kPa) ont été utilisées pour différencier la nitrification,
dénitrification, nitrification-dénitrifiante et les autres sources de production N2O (Tableau
II.2, Robertson & Tiedje 1987 ; Webster & Hopkins 1996 ; Wrage et al. 2000). L’acétylène
inhibe la nitrification (substrat suicide de l’AMO) et bloque la réduction du N2O en N2 et
l’oxygène est sensé supprimer la voie de réduction de nitrification-dénitrifiante ; toutefois la
production de N2O s’est avérée être parfois plus élevée après addition des inhibiteurs (Wrage
et al. 2000). Une étude sur N. eutropha a montré qu’il fallait ajouter 80 Pa de C2H2 pour
inhiber l’activité de l’AMO, et que cette enzyme était affectée négativement par la
concentration ambiante en oxygène (Schmidt & Bock 1998). De plus il semble que toutes les
bactéries nitrosantes ne soient pas inhibées de la même manière par l’ajout de C2H2 (Wrage
et al. 2004). Toutefois cette technique à l’acétylène est utilisée sur les milieux aquatiques
pour déterminer le processus responsable de la production de N2O (Bonin et al. 2002 ; De Bie
et al. 2002).

85
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

Tableau I.19. Détermination du processus à l’origine des émissions de N2O par la technique
combinant l’inhibition à l’acétylène (C2H2) et à l’oxygène. Technique de Webster & Hopkins (1996) et
Robertson & Tiedje (1987) ; (+ : le processus a lieu, - : le processus est inhibé).

Les émissions de N2O peuvent être estimées grâce également à l’utilisation de

techniques isotopiques en ajoutant à l’échantillon du substrat marqué au 15N. La comparaison
des abondances en N2O, NH4+ et NO3- marqués au 15N à différents temps de l’incubation
permet de déterminer à partir de quel substrat le N2O a été formé (Stevens et al. 1997 ; Wolf
& Brumme 2002).

I.3.2. Techniques d’étude des bactéries nitrifiantes

Winogradsky, avait déjà soupçonné l’existence d’une large diversité des bactéries
nitrifiantes (Winogradsky 1892). Cependant un des problèmes majeurs rencontré lorsque
l’on étudie la diversité microbienne dans des environnements complexes, est qu’une grande
majorité des microorganismes n’est pas cultivable par les techniques traditionnelles (Amann
et al. 1995). Le développement des outils moléculaires, comme ceux basés sur des analyses de
séquences d’ADNr 16S, a rendu possible l’exploration et la mise en évidence d’espèces
bactériennes non cultivables ou ayant des taux de croissance très faibles, au sein
d’environnements très variés (Head et al. 1998).
Les techniques d’études, désormais nombreuses, de ce groupe fonctionnel ont permis
de progresser sur le plan de la diversité des populations bactériennes nitrifiantes dans divers
habitats.
La communauté bactérienne nitrosante est beaucoup plus étudiée que les populations
nitratantes et donc mieux connue. Pour les bactéries nitrosantes, les outils moléculaires ont
été plus facilement développés, et en particulier, pour celles appartenant à la sous-classe β
des Protéobactéries qui forment au sein de cette branche un groupe monophylétique
relativement lié. Au contraire, les différents genres bactériens nitratants appartiennent à des
branches phylogénétiques éloignées, ce qui ne facilite pas le développement d’outil de
détection de la communauté globale.

I.3.2.1. Techniques classiques de microbiologie

Le taux de croissance très lent des bactéries nitrifiantes a sévèrement gêné les
approches dépendant de la mise en culture tant pour le dénombrement des bactéries
nitrifiantes que pour l’étude de la diversité ou de la dynamique de la communauté nitrifiante.
La technique du Nombre le Plus Probable (NPP ou Most Probable Number MPN) a
souvent été utilisée pour quantifier les bactéries nitrifiantes dans des échantillons
environnementaux (voir entre autres : Matulewich et al. 1975; Chesterikoff et al. 1992; Roy et
al. 1996; Féray & Montuelle 2003). Cependant, cette technique longue, conduit à des
dénombrements qui ne sont pas forcément corrélés avec l’activité nitrifiante potentielle du
même échantillon (Belser 1979; Mansch & Bock 1998). Les milieux de cultures étant sélectifs,

86
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

seule une partie des nitrifiants serait en effet cultivable dans les conditions standards de
culture (Juretschko et al. 1998; Stephen et al. 1998; Purkhold et al. 2000). De plus, les
bactéries nitrifiantes assemblées en agrégats, sont plus résistantes à la dispersion, de telle
sorte que les protocoles standards sous-estiment souvent le nombre de bactéries présent dans
les microcolonies (Watson et al. 1989; Stehr et al. 1995b; Wagner et al. 1995).
Ainsi, la mise en culture des bactéries nitrifiantes a des limites évidentes, puisque la
majorité des microorganismes reste non cultivable (Amann et al. 1995) et que les
arrangements spatiaux et microenvironnements sont déstructurés par ces techniques.

I.3.2.2. L’immunofluorescence

Les bactéries nitrifiantes peuvent être énumérées directement par des techniques de
microscopie, en utilisant par exemple des anticorps fluorescents (FA) (Belser 1979). La
détection immunologique reste une technique limitée à cause de la diversité sérologique
restreinte par le faible nombre de bactéries disponibles en culture pure et étant souvent
originaires d’un même écosystème (Josserand & Cleyet-Marel 1979; Stanley & Schmidt 1981).
Les techniques immunologiques offrent néanmoins la possibilité d’une quantification rapide,
sensible et très spécifique de bactéries dans des échantillons environnementaux, permettant
ainsi de déterminer la diversité des bactéries nitrosantes et nitratantes dans les milieux
aquatiques et le sol (Ward & Carlucci 1985). Völsch et al. (1990) ont obtenu une corrélation
entre l’activité nitrosante de boues activées et la présence d’un sérotype en utilisant la
combinaison d’anticorps polyclonaux dirigés contre deux sérotypes de Nitrosomonas et la
cytométrie en flux pour quantifier les bactéries nitrosantes dans des boues activées. La
quantification de genres ou groupes bactériens par des techniques immunologiques peut
toutefois être problématique si les anticorps utilisés sont trop spécifiques, reconnaissant
seulement les cellules ayant servi à leur conception. Récemment, des anticorps monoclonaux
et polyclonaux reconnaissant les sous-unités α et β du système d’oxydation du nitrite (α et β-
NOS) ont été décrits et permettent à la fois la détection des genres Nitrobacter et Nitrospira
(Aamand et al. 1996; Bartosch et al. 1999 ; Maron et al. 2003). Ceux reconnaissant
spécifiquement la protéine AmoB des bactéries nitrosantes de la sous-classe β des
Protéobactéries sont également maintenant disponibles (Pinck et al. 2001). Cette dernière
technique, standardisée, pourrait devenir la mieux adaptée pour effectuer des
dénombrements de la population nitrosante totale dans des échantillons environnementaux.

I.3.2.3. Techniques de détection in situ : la technique FISH

Des analyses quantitatives et structurales des populations bactériennes nitrifiantes

dans leurs environnements naturels peuvent aujourd’hui être réalisées grâce à l’utilisation de
la technique d’hybridation fluorescente in situ (FISH = Fluorescent in situ hybridization)
(Amann et al. 1990) ; la FISH est une technique de microscopie dans laquelle, une
hybridation spécifique des cellules ciblées est réalisée à l’aide de sondes oligonucléotidiques
fluorescentes dirigées contre les ribosomes cellulaires. La technique du FISH combinée à
l’utilisation des microélectrodes, fournit une preuve qualitative de l’activité métabolique de
certaines bactéries et rend plus aisée la quantification des activités spécifiques et des
cinétiques de croissance de microorganismes non cultivés.
Sur la base des séquences d’ADN 16S ribosomales (ADNr) disponibles dans les
banques de données, des sondes oligonucléotidiques pour la FISH, ciblant tous les niveaux
taxonomiques, ont été développées (Head et al. 1998; Amann & Ludwig 2000; Amann et al.
2001). Aujourd’hui des sondes spécifiques des différents genres bactériens nitrifiants existent
(Wagner et al. 1995; Mobarry et al. 1996; Wagner et al. 1996; Juretschko et al. 1998),
notamment celles du phylum et genre Nitrospira (Daims et al. 2001a). Le développement de

87
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

sondes FISH, nécessite de trouver une séquence consensus spécifique qui servira de cible.
Ainsi les bactéries nitrifiantes, réunies en grandes lignées phylogénétiques, sont donc des
cibles idéales.

I.3.2.4. Techniques utilisant la PCR

La détection de bactéries nitrifiantes indépendamment de la mise en culture peut

désormais être réalisée grâce à l’utilisation de la PCR (Polymérase Chain Reaction). Cette
technique ne donne pas, en revanche, d’information sur la structure de la communauté.
La plupart des études environnementales sont basées sur la comparaison de
fragments spécifiques sur l’ADNr 16S, par PCR des gènes fonctionnels peuvent également
être ciblés. Dans le cas de la nitrification, la plupart des amorces PCR ciblent l’ADNr 16S
aussi bien pour la population nitrosante (Hiorns et al. 1995 ; Kowalchuk et al. 1997 ; Utåker &
Nes 1998 ; Voytek & Ward 1995) que nitratante (Degrange & Bardin 1995), les seuls gènes
fonctionnels actuellement ciblés étant amoA (Purkhold et al. 2000; Rotthauwe et al. 1997) et
amoB (Calvo & Garcia-Gil 2004).
Les analyses PCR sont la plupart du temps combinées à des techniques de
« fingerprinting3 » (Tableau II.3) telles que la DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis, Muyzer et al. 1993 ; Kowalchuk et al. 1997), et la T-RFLP (Terminal
Fragment Length Polymorphism, Horz et al. 2000) ou couplées à des clonages et
séquençages (Bruns et al. 1999). L’utilisation d’amorces PCR permet une approche correcte
de la diversité des populations nitrifiantes in situ toutefois elle reste beaucoup plus répandue
pour l’étude des bactéries nitrosantes (Kowalchuk et al. 1998; Horz et al. 2000; Schmid et al.
2000; Nicolaisen & Ramsing 2002) que pour les bactéries nitratantes pour lesquelles il
n’existe pas encore d’amorces PCR permettant de cibler un gène fonctionnel tels que les
gènes codant pour les diverses sous-unités de la NOR. Il est également possible de cibler par
PCR la région intergénique entre les gènes 16S et 23S (IGS) ; cette technique a été appliquée
aux bactéries nitrosantes (Aakra et al. 1999) ainsi qu’à l’étude de la diversité des espèces
appartenant au genre Nitrobacter dans le sol, l’eau et les sédiments d’un lac (Navarro et al.
1992).
Le clonage de fragments de gène d’ADNr 16S accompagné de la technique de DGGE
(Hovanec et al. 1998) ont été utilisés dans l’étude de la diversité nitratante de biofilms
présents dans des aquarium d’eau douce. La DGGE apparaît ainsi comme un outil
prometteur permettant la détection et la comparaison rapide de la diversité des bactéries
nitrifiantes dans des échantillons variés (Kowalchuk et al. 1997; Nicolaisen & Ramsing 2002).

Outre la détection, la quantification des bactéries nitrosantes et nitratantes peut

également être réalisée grâce à la technique de PCR compétitive ou cPCR (Berthe et al. 1999;
Stephen et al. 1999; Dionisi et al. 2002). La cPCR donne des dénombrements bactériens
jusqu’à 3 fois plus élevés qu’avec des méthodes classiques de MPN (Phillips et al. 2000), mais
ces dénombrements des bactéries nitrosantes ne reflètent pas forcément les variations
d’activités nitrifiantes (Mendum et al. 1999). La Real-time PCR, qui permet de suivre en
temps réel la quantité d’ADN amplifié lors de la PCR et non uniquement la quantité finale de
produit d’amplification comme la cPCR (Hermanson & Lindgren 2001 ; Boon et al. 2003),
semble conduire à des résultats intéressants mais n’a pas encore été comparée aux autres
méthodes.

Tableau I.20. Principales méthodes de biologie moléculaire utilisées dans les études d’écologie
microbienne. Il est précisé la signification des abréviations couramment utilisées et des références
bibliographiques, celles écrites en gras sont des études portant sur la diversité des bactéries
nitrosantes.

3
Littéralement empreinte digitale

88
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3.2.5. Limites des techniques

Alors qu’avec les méthodes classiques de microbiologie on a pensé pendant longtemps

que Nitrobacter était la souche nitratante dominante dans tous les environnements tels que
le sol, les milieux aquatiques, les stations d’épuration, l’utilisation récente des techniques de
biologie moléculaire, a montré que le genre Nitrospira pouvait être majoritaire dans de
nombreux milieux (Juretschko et al. 1998; Schramm et al. 1998; Okabe et al. 1999; Burrell et
al. 2001).
Le dénombrement MPN est très dépendant du milieu de culture utilisé (Both et al.
1990a; 1990b) et les milieux de cultures sont souvent très éloignés des conditions
environnementales (Koops & Pommerening-Röser 2001), ainsi les techniques dépendantes
de la mise en culture sont sélectives envers certaines bactéries. De plus, l’efficacité de
détection de la technique MPN ne serait que de 0.001–0.05% (Hall 1986) ce qui sous-estime
grandement la communauté nitrifiante. L’utilisation de l’immunofluorescence ne permet pas
la détection ou l’identification de nouvelles bactéries ou de bactéries nitrifiantes non
cultivables. En effet les anticorps étant préparés à partir de bactéries en cultures pures, cette
technique aura tendance à ne détecter que les bactéries proches de l’espèce ayant servie à la
préparation des anticorps. Les techniques, dépendantes directement ou indirectement d’une
mise en culture, ne détectent pas l’ensemble de la communauté fonctionnelle ciblée,
l’efficacité de la technique de MPN conduit à un rendement de détection de seulement 3.1% et
celui de l’immunofluorescence atteint 21.3% (Féray et al. 1999).

Les dénombrements effectués avec la technique FISH sont entre 1 et 4 fois supérieurs
à ceux généralement obtenus avec la méthode MPN (Altmann et al. 2003) et restent donc
faibles par rapport à l’immunofluorescence. La technique FISH présente en outre
l’inconvénient d’une faible intensité de signal et d’un fort bruit de fond pour des échantillons
contenant peu de bactéries ou des bactéries faiblement actives. Si le bruit de fond peut être
atténué grâce à une instrumentation sophistiquée (microscopie à déconvolution : Manz et al.
(2000) ou confocale laser : Wagner et al. (1994)), l’intensité du signal peut être décuplée
grâce à des systèmes d’amplification enzymatique du signal, après un traitement au

89
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

chloramphénicol qui augmente la concentration cellulaire en ribosome ou avec l’utilisation de

sondes polynucléotidiques multi-marquées (Schramm 2003). L’utilisation de sondes
spécifiques ou d’anticorps laissent de plus la possibilité que certaines espèces non ciblées
réagissent quand même aux sondes utilisées. Les amorces PCR utilisées ne couvrent pas
forcément la totalité de la communauté fonctionnelle et introduisent donc un biais au niveau
de la diversité et de la distribution environnementale des bactéries. Les étapes de PCR,
clonage puis séquençage peuvent par ailleurs introduire des biais de séquence, expliquant la
grande hétérogénéité des séquences environnementales. Il est également important de
préciser que la spécificité actuelle de beaucoup d’amorces PCR, utilisées dans un certain
nombre d’études, diffère grandement de ce qu’elle était lors de la mise au point des amorces :
par exemple, les amorces NitA, fréquemment utilisées dans l’étude de la population
nitrosante (Abd El Haleem et al. 2000; Ward et al. 2000; Hollibaugh et al. 2002), montrent
aujourd’hui des mésappariements pour tous les Nitrosospira, tous les membres des lignées
N. communis et N. oligotropha et pour la plupart des membres de la lignée N. marina. Afin
de se prémunir de ce genre de biais, il est préférable d’utiliser des amorces PCR ayant une
plus grande sensibilité (ciblant toutes les bactéries nitrosantes ou au moins toutes les
nitrosantes de la sous-classe β des Protéobactéries) au détriment de la spécificité (n’excluant
pas forcément toutes les autres bactéries). Enfin, la simple identification par PCR d’une
séquence appartenant à une bactérie nitrifiante ne prouve ni que cet organisme est abondant
dans le milieu étudié ni qu’il est physiologiquement actif.

90
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3.3. La nitrification dans les milieux naturels

Les méthodes de mesure des activités nitrifiantes sont nombreuses et les protocoles
employés sont divers (temps d’incubation plus ou moins long, mesure de l’activité réelle ou
potentielle, estimation des activités par bilan de masse, détermination de l’activité nitrifiante
à partir des profils mesurés par microélectrodes…). De plus chaque auteur utilisant sa propre
unité pour exprimer ses résultats (consommation d’azote par quantité de sédiment ou de sol,
par unité de surface, par unité de volume ou encore en fonction de la concentration en
matière organique) l’établissement d’une synthèse devient ardu. Il est donc très difficile de
dresser un tableau récapitulatif montrant des valeurs d’activités moyennes observées pour
chaque habitat. Nous avons donc fait le choix de présenter d’une manière non exhaustive des
exemples d’activités nitrifiantes mesurées dans des sols variés (prairie, sol cultivés), des
réacteurs et biofilms nitrifiants, des sédiments de rivières et de lacs, des estuaires et des
milieux marins (Tableau II.4), puis de montrer les spécificités de chaque habitat.

I.3.3.1. Le sol

La nitrification est limitée par la concentration en ammonium, généralement assez

faible dans les sols arables et les zones forestières, car l’ammonium produit par
minéralisation de la matière organique est consommé par les microorganismes hétérotrophes
et les plantes. Au contraire dans les prairies accueillant du bétail et dans les parcelles
cultivées, régulièrement fertilisées avec des engrais contenant de l’ammonium, la nitrification
est très active (Nishio & Fujimoto 1990). Les taux de nitrification dans les sols agricoles
dépendent donc de la période et du type de fertilisation. En effet, Fortuna et al. (2003) ont
montré que l’activité nitrifiante augmente considérablement juste après les périodes de
fertilisation ou d’épandage, avec un taux de nitrification après l’ajout d’engrais (8.20 g N. g
de sol-1. jour-1) 4.2 fois supérieur à la normale (1.95 g N. g de sol-1. jour-1) et 1.5 fois supérieur
après l’ajout de compost (5.14 g N. g de sol-1. jour-1). Le taux de nitrification pourrait dans
certain cas être lié aux caractéristiques du milieu étudié : à l’altitude (Bohlen et al. 2001), à
l’humidité et à la température (Gilliam et al. 2001), aux espèces végétales (Christ et al. 2002)
et à l’utilisation des sols (Goodale & Aber 2001).

L’importance de la nitrification-dénitrifiante dans différents sols, est encore peu

connue, car la distinction entre le N2O produit par nitrification ou par dénitrification est
difficile à appréhender et le processus n’est étudié que depuis quelques années. Plusieurs
études ont rapporté une augmentation de la production de NO et N2O juste après fertilisation
du sol (Akiyama et al. 2000), confirmant le rôle de la nitrification dans les émissions de gaz à
effet de serre. La proportion de N2O produit par nitrification-dénitrifiante par rapport à la
dénitrification hétérotrophe, augmente avec l’ajout d’ammonium, de 25 à plus de 50%
(Avrahami et al. 2002). Dans les sols, la quantité de N2O perdue par ce processus peut varier
depuis des quantités insignifiantes (Robertson & Tiedje 1987) à environ 30% de la quantité
totale produite (Webster & Hopkins 1996). Dans certaines conditions, le processus de
nitrification est majoritairement responsable des émissions de N2O, notamment pour des
pressions en oxygène dans le sol supérieures à 0.35 kPa (Khalil et al. 2004). Bollmann &
Conrad (1998) avaient précédemment montré que du N2O était produit par ce processus pour
des pressions partielles en oxygène de 0.1-0.5 kPa. De plus, la nitrification serait le processus
majeur de production de NO et N2O dans des sols avec un faible contenu en eau, où ces gaz
représenteraient respectivement 0-2.5% et 0.03-1% de l’azote oxydé (Garrido et al. 2002).
Enfin, la température, le pH, la teneur en carbone, l’humidité du sol, influencent aussi la
proportion de N2O produit par nitrification ou par dénitrification (Gödde & Conrad 2000).
Par ailleurs, les zones forestières tempérées, continuellement soumises à des dépôts
atmosphériques azotés, contribuent à une augmentation des émissions de NO ; l’azote

91
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

ammoniacal oxydé par nitrification conduisant à une surproduction de NO et de nitrate

(Venterea et al. 2003a et b).

Tableau I.21. Taux de nitrification potentielle (pNA) et réelle (rNA) dans des sols, réacteurs
nitrifiants, sédiments d’eau douce, estuariens et marins.

Sites Activités nitrifiantes Références

Sol prairie (Michigan, EU) pNA : 1.3-2.75 µg N.g sol-1.j-1 Fortuna et al. (2003)
Sol prairie (Kansas, EU) pNA : 0.03-0.34 µg N.g sol-1.j-1 Strauss et al. (1997)

Sol agricole fertilisé avec engrais pNA : 8.2 µg N.g sol-1.j-1 Fortuna et al. (2003)
azotés (Michigan, EU)
Sol agricole fertilisé avec compost pNA : 5.14 µg N.g sol-1.j-1 Fortuna et al. (2003)
(Michigan, EU)
Sol agricole (Kansas, EU) pNA : 0.04-0.4 µg N.g sol-1.j-1 Strauss et al. (1997)
Biofilm Réacteur nitrifiant rNA : 100 mg N.m-2.j-1 Gieseke et al. (2001)
Biofilm Réacteur nitrifiant rNA : 576 mg N.m-2.j-1 Schramm et al. (1999)
Boues activées rNA : 9.4-33.7 mg N.g VSS-1.j-1 Fouratt et al. (2003)
Boues activées rNA : 500-700 mg N.g VSS-1.j-1 Campos et al. (1999)
Sédiment Rivière La Chalaronne pAOA : 43.4-133 µg N.g sé[Link]-1.j-1 Féray & Montuelle
(Ain, France) pNOA : 11.2-28 µg N.g sé[Link]-1.j-1 (2003)
Sédiment Rivière (Kansas, EU) pNA : 0.16-0.81 µg N.g sé[Link]-1.j-1 Strauss et al. (1997)

Sédiment Rivière La Solana rNA : 5.8-28.8 µg N.g séd-1.j-1 Butturini et al. (2000)
(Espagne)
Sédiment de 36 Rivières rNA : 0.08-1.1 µg [Link] séd-1.j-1 Strauss et al. (2002)
(Wisconsin-Michigan, EU)
Sédiment Rivière (Allemagne) rNA : 336±13 mg N.m-2.j-1 Altmann et al. (2003)
Sédiment de Rivière Seneca River rNA : 210-400 mg N.m-2.j-1 Pauer & Auer (2000)
(N.Y., EU)
Sédiment de lac Onondaga lake rNA : 320-420 mg N.m-2.j-1 Pauer & Auer (2000)
(N.Y., EU)
Sédiment de lac (Danemark) rNA : 77-121 mg N.m-2.j-1 Lorenzen et al. (1998)
Biofilm sur galet de la Garonne rNA : 60-127 mg N.m-2.j-1 Teissier & Torre (2002)
(France)
Estuaire Rhône (France) rNA : 14-28 µg N.L-1.j-1 Feliatra & Bianchi (1993)
Estuaire Narragansett Bay (EU) rNA : >154 µg N.L-1.j-1 Berounsky & Nixon
(1990 et 1993)
Estuaire Long Island sound rNA : 88 µg N.L-1.j-1 Capone et al. (1990)
Estuaire Urdaibai (Espagne) rNA : >64 µg N.L-1.j-1 Iriarte et al. (1996)
Estuaire Tamar (Australie) rNA : 42 µg N.L-1.j-1 Owens (1986)
Estuaire Chesapeake Bay (EU) rNA : 448 µg N.L-1.j-1 Horrigan et al. (1990)
Estuaire Escaut (Pays-Bas) rNA : >630 µg N.L-1.j-1 De Bie et al. (2002)
Sédiments Mer du Nord rNA : 2-9 mg N.m-2.j-1 dans Herbert (1999)
Sédiments Limjforden rNA : 38 mg N.m-2.j-1 dans Herbert (1999)
(Danemark)
Ochlockonee Bay (EU) rNA : 84 mg N.m-2.j-1 dans Herbert (1999)
Odawa Bay (Japon) rNA : 38-42 mg N.m-2.j-1 dans Herbert (1999)

92
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3.3.2. Biofilms, stations d’épuration et réacteurs nitrifiants

La nitrification par les biofilms benthiques en rivière est admise depuis longtemps
(Tuffey et al. 1974). Cependant, les biofilms nitrifiants ont essentiellement été étudiés en
stations d’épuration en raison de l’intérêt technologique qui en découle.
Dans les stations d’épuration, on favorise l’activité nitrosante, pour réduire le contenu
en ammonium (produit de l’hydrolyse de l’urée) de l’eau avant qu’elle soit rejetée dans le
milieu récepteur. Grâce à l’utilisation de microsondes, l’activité nitrifiante a été mise en
évidence in situ (de Beer et al. 1993; Lorenzen et al. 1998; Schramm 2003; Stief et al. 2003).
Les expériences de Okabe et al. (1999) ont décrit la localisation des activités nitrosantes et
nitratantes dans des biofilms nitrifiants de station d’épuration, la nitrosation est située dans
la couche externe du biofilm et la nitratation dans la couche juste en dessous. L’étude des
distributions des activités nitrifiantes a été poursuivie par Gieseke et al. (2001 et 2003) qui
ont montré que l’activité nitrifiante est localisée dans une couche de 200 à 300 µm à la
surface des biofilms.
Les biofilms sont intéressants pour étudier la compétition entre bactéries nitrifiantes
autotrophes et les hétérotrophes pour l’oxygène et le rôle du rapport C/N dans le contrôle de
la distribution et de l’activité des nitrifiants (Satoh et al. 2000 ; Okabe et al. 2002).

I.3.3.3. Les océans

La nitrification benthique et dans la colonne d’eau des zones côtières a été étudiée
(Henriksen & Kemp 1988 ; Bianchi et al. 1999 a et b). Dans la majorité des milieux marins, il
semble que les taux de nitrification soient relativement similaires, peu importe la région
étudiée (Tableau II.4 ; Herbert 1999). Toutefois il semble que le maximum d’activité puisse
apparaître en différentes saisons, en fonction soit de la température soit du taux de diffusion
de l’oxygène qui régule l’activité nitrifiante (Herbert 1999). Les taux de nitrification, détectés
dans des sédiments côtiers du Danemark, augmentent d’un facteur 5 quand la température
passe de 2°C au printemps à 22°C en automne (Hansen 1980 dans Herbert 1999) ; cependant
la température affecte la diffusion de l’oxygène dans les sédiments et peut donc avoir un effet
inhibiteur de la nitrification. Certains sédiments marins sont des sites d’une nitrification
suboxique, couplée à la réduction du manganèse (Hulth et al. 1999). En effet, dans des
sédiments mixés physiquement ou biogéniquement, le MnO2 peut être enfoui dans les
couches anoxiques du sédiment et y être utilisé par les bactéries pour oxyder l’ammonium en
nitrate.

La grande partie du N2O produite dans les océans provient de l’activité nitrifiante, la
dénitrification n’apparaissant que dans les zones complètement anoxiques (zones profondes,
supérieures à 2000 m de profondeur) (Butler et al. 1989). Toutefois, le fonctionnement
général de production de N2O en milieu marin, n’est pas encore bien connu et les études
isotopiques ont donné peu de résultats (Codispoti et al. 1993). En conséquence, la
contribution des océans au bilan total de N2O varie suivant les études, mais elle est
aujourd’hui estimée entre 20% et 27% du total des émissions (soit entre 4.7 ± 3.1 et 6.3 ± 4.4
Tg [Link]-1) sans en connaître la proportion produite par nitrification (Seitzinger et al.
2000).

93
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3.3.4. Les milieux d’eau douce

En milieu lacustre, deux principaux facteurs conditionnent la nitrification : les

nutriments et le cycle annuel des températures et des brassages. Dans la colonne d’eau,
l’activité nitrifiante est généralement maximale durant les périodes de brassage ou de
circulation hivernale quand l’hypolimnion, riche en ammonium se mélange à l’eau de surface
appauvrie en ammonium par l’assimilation algale estivale. Dans les lacs stratifiés la zone de
nitrification se déplace verticalement en fonction des saisons : au printemps, avant la
stratification, la chimiocline ammonium-oxygène se situe à l’interface eau-sédiment, et
remonte peu à peu en été quand l’hypolimnion devient anoxique, puis s’enfonce de nouveau
après le brassage automnal (Christofi et al. 1981). Le compartiment sédimentaire lacustre a
un rôle important sur la nitrification car la communauté bactérienne y semble plus
importante et l’azote ammoniacal plus concentré que dans la colonne d’eau (Hall 1986).
Svensson (2001) a montré pour un lac eutrophe, que le processus de nitrification était la
source majoritaire de production de N2O (environ 0.22% du NH4+ oxydé) dans les sédiments
bioturbés par des larves (Chironomus plumosus).
Dans les petits cours d’eau, les taux de nitrification dans la colonne d’eau seraient
insignifiants et l’essentiel de la nitrification aurait lieu dans la couche supérieure oxique des
sédiments (Kors et al. 1998; Pauer & Auer 2000). Pour des sédiments éclairés, la nitrification
est couplée à la photosynthèse benthique qui procure de l’oxygène à la nitrification alors que
les microalgues peuvent être en compétition avec les nitrifiants pour l’ammonium et le CO2,
et éventuellement inhiber la nitrification en augmentant le pH (Nielsen et al. 1990 ;
Risgaard-Petersen et al. 1994 ; Lorenzen et al. 1998 ; An & Joye 2001 ; Flipo et al. 2004). La
nitrification peut également être observée dans les sédiments dans des zones plus profondes
et oxygénées par la bioturbation des macroinvertébrés benthiques (Svensson et al. 2001 ;
Stief & de Beer 2002), ou dans la rhizosphère des plantes aérenchymateuses, produisant de
l’oxygène (Bodelier et al. 1996 ; Risgaard-Petersen & Jensen 1997).
Dans les cours d’eau de grandes tailles, les bactéries nitrifiantes peuvent croître dans
la colonne d’eau, fixées aux particules en suspension (Brion & Billen 1998).
Certaines études présentent des mesures de nitrification dans la colonne d’eau
d’estuaires (Tableau II.4 ; Owens 1986 ; Berounsky & Nixon 1990 ; Feliatra & Bianchi 1993 ;
Brion & Billen 1998). En estuaire, le pic de nitrification coïncide généralement avec le
maximum de turbidité, les faibles salinités ou la partie d’eau douce estuarienne (de Bie et al.
2002). Plus en aval on observe une chute brutale de l’activité pouvant s’expliquer par la
limitation en ammonium et l’intolérance à la salinité des communautés bactériennes lotiques
apportées par le fleuve. Dans l’estuaire de l’Elbe, entre 50 et 100% des bactéries nitrifiantes
sont attachées aux particules et forment des flocs (Stehr et al. 1995b), de même dans
l’estuaire de l’Urdaibai, l’activité nitrifiante est principalement associée à la fraction
supérieure à 3µm (Iriarte 1996). Avec un temps de résidence plus long (Soetaert 1995), les
bactéries nitrifiantes fixées aux particules se développent dans les estuaires.
Comme la production de N2O est liée positivement à la nitrification et plus
généralement à l’intensité des taux de renouvellement de l’azote et du carbone, les estuaires
sont potentiellement de fortes sources d’oxyde nitreux (Firestone & Davidson, 1989). Dans
l’estuaire du Rhône (Marty et al. 2001 ; Bonin et al. 2002) ou celui de la Colne River (Dong et
al. 2002), le bouchon vaseux (maximum de turbidité) serait un site de production de N2O
principalement par dénitrification alors que dans la zone estuarienne marine le processus de
nitrification-dénitrifiante serait à l’origine du N2O. A noter que le flux d’émission de N2O par
nitrification serait nettement inférieur à celui de la dénitrification (Dong et al. 2002).

I.3.3.5. Corrélation activité-populations bactériennes

Contrairement aux observations de Dodds & Jones (1987) il apparaît maintenant que
pour un même niveau d’activité, les populations bactériennes concernées peuvent être

94
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

différentes, quantitativement et qualitativement.

Par exemple, dans le gradient de salinité du Rhône, il ne se produit pas de changement
apparent de la densité bactérienne alors que les taux d’oxydation de l’ammonium et des
nitrites diminuent d’un facteur 10 entre le fleuve et l’embouchure (Bianchi et al. 1994). Le
dénombrement de la biomasse totale bactérienne ne peut toutefois pas rendre compte d’une
modification des populations microbiennes intervenant dans le cycle de l’azote. D’autres
études relient les densités de nitrifiants estimés par comptage MPN, dans la colonne d’eau et
les sédiments, à des mesures d’activités (Hasting et al. 1998 ; Pauer & Auer 2000) ; elles
mettent en évidence un faible taux de nitrification dans la colonne d’eau, associé à une faible
biomasse bactérienne nitrifiante, et un fort taux de nitrification correspondant à des fortes
biomasses dans les sédiments. Dans des sédiments lacustres littoraux, un taux de
nitrification très fort en été, n’est pas pour autant accompagné d’une augmentation notable
de la quantité de bactéries nitrosantes (Hasting et al. 1998).

Dans de telles études d’écologie microbienne, dans les milieux aquatiques, les auteurs
concluent en principe que d’autres facteurs, tels que le nombre de bactéries, leur affiliation
génétique et leur caractéristique physiologique, doivent être considérés pour correctement
interpréter les résultats obtenus (Larsen et al. 1996). Ces études fonctionnelles induisent
donc des questions relatives au lien entre l’activité, la densité et la diversité des communautés
ce qui nécessite donc de connaître les communautés microbiennes impliquées.

95
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3.4. Les populations bactériennes nitrifiantes dans les

milieux naturels
Les bactéries nitrifiantes sont présentes dans les environnements oxiques et
anoxiques, elles sont largement distribuées dans une grande diversité de milieux (Figure II.1,
II.2 et II.3) : eau douce, milieux marins, sol, systèmes d’épuration des eaux usées, et même
dans des milieux atypiques tels que les roches ou les maçonneries, des milieux extrêmes à
faibles ou fortes températures ou à des pH acides ou très alcalin. Les populations nitrifiantes
des habitats extrêmes ne seront pas discutées ici, nous nous intéresserons essentiellement à
la diversité et aux spécificités écologiques des populations nitrifiantes au sein
d’environnements naturels tels que les sols, les milieux aquatiques et les systèmes artificiels
(boues activées ou réacteurs nitrifiants).
Les populations bactériennes nitrifiantes s’adaptent aux conditions du milieu auquel
elles appartiennent. Une compétition pour le substrat (affinités différentes suivant les
espèces), pour l’oxygène et une meilleure tolérance aux divers facteurs environnementaux
(température, pH, salinité…) vont sélectionner les espèces bactériennes les mieux adaptées.
Par exemple, une diminution de la concentration en ammonium dans un réacteur, induit des
changements au niveau de la structure et une baisse du nombre et de l’activité de la
population nitrosante (Schramm et al. 1999).
La description de la diversité des populations nitrifiantes au sein de différents
habitats nécessite de prendre en compte que l’environnement n’est pas toujours un milieu
fermé et à l’état stable, mais qu’il peut acceuillir certaines bactéries allochtones qui peuvent
ou non jouer un rôle dans le milieu.

Figure I.28. Classification phylogénétique schématique basée sur les séquences d’ADNr 16S
(>1000pb) des bactéries nitrosantes (isolats, enrichissement ou clones environnementaux) de la sous-
classe β des Protéobactéries. Les numéros présents dans chaque triangle indiquent le nombre de
séquences disponible dans chaque cluster (d’après Koops et al. 2003)

96
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

Figure I.29. Distribution des bactéries nitrosantes (séquences d’ADNr 16S) suivant les milieux où
elles ont été isolées ou détectées. Dans chaque cluster, l’origine de chaque séquence a été précisée. Le
nombre d’habitats différents où un même cluster a été détecté est indiqué entre parenthèse, chaque
habitat a été regroupé dans 7 grandes catégories d’habitats : sol, stations d’épuration,
environnement d’eau douce, environnements marins, dunes côtières, estuaires et autres. La
proportion de chaque cluster est illustrée en fonction de chaque catégorie d’habitat. Enfin dans la
légende apparaît le nombre d’échantillons analysés dans chaque habitat : n pour le nombre d’études
fournissant des séquences d’ADNr 16S obtenues par clonage, et m pour le nombre d’études étant
passées par une mise en culture (d’après Koops et al. 2003)

Figure I.30. Distribution des bactéries nitrosantes (gène amoA) suivant les milieux où elles ont été
isolées ou détectées. Cf. légende de la Figure II.2 (d’après Koops et al. 2003)

97
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3.4.1. Biofilms, stations d’épuration et réacteurs nitrifiants

Une communauté nitrifiante complexe constituée de Nitrosomonas, Nitrosospira,

Nitrobacter et Nitrospira a été détectée dans des biofilms nitrifiants par la technique FISH
(de Beer & Schramm 1999). Nitrospira spp. et Nitrosospira sp., formant des amas denses en
contact les uns avec les autres, sont majoritaires dans des réacteurs nitrifiants (Schramm et
al. 1998). Les études, concernant l’organisation spatiale des bactéries nitrosantes et
nitratantes dans des biofilms présents dans les eaux usées domestiques, ont révélé l’absence
du genre Nitrobacter et la prédominance de bactéries du genre Nitrospira organisées en
microcolonies souvent proches d’amas de bactéries nitrosantes (Okabe et al. 1999) ; alors que
les bactéries nitrosantes étaient dispersées dans l’ensemble du biofilm, les nitratantes n’ont
été identifiées que dans la zone de forte activité nitratante. Ces observations sont différentes
de certaines études où : 1) des amas de Nitrobacter et Nitrosomonas ont été identifiés
(hybridation in situ) dans des flocs de stations d’épuration (Mobarry et al. 1996), 2) les
premiers 100 µm seraient principalement habités par des bactéries nitrosantes appartenant
aux lignées proche de N. europaea et N. oligotropha mais avec une population nitratante,
principalement représentée par Nitrospira avec une abondance 30 fois supérieure à la
quantité de bactéries nitrosantes (Gieseke et al. 2001), et 3) les deux genres bactériens
nitratants (Nitrobacter et Nitrospira) semblent coexister et ne pas s’exclure l’un l’autre
(Gieseke et al. 2003). Les stations de traitement des eaux usées présentent donc chacune
leurs spécificités physicochimiques susceptibles d’influencer la diversité bactérienne.
Dans un biofilm lié à une membrane, des bactéries phylogénétiquement proches de
Nitrosomonas europaea et de Nitrobacter peuvent être plus compétitives que des
Nitrosospira sp. et Nitrospira sp., dans la zone de fortes concentrations en oxygène, en
ammonium et en nitrate, (Schramm et al. 2000). Toutefois, les espèces appartenant aux
lignées représentées par Nitrosomonas europaea et Nitrobacter deviennent moins
abondantes lorsque l’oxygène se raréfie (Schramm et al. 2000). Ceci illustre l’équilibre
écologique fragile existant dans ce type de milieu où les conditions peuvent être très
changeantes.
Dans un réacteur à séquençage de phase (sequencing batch), la composition de la
biomasse nitratante de la boue d’ensemencement ne contenant au début que 4% de clones
phylogénétiquement proche de Nitrospira moscoviensis, est dominée après 6 mois par 89%
de cette même espèce montrant ainsi pour la première fois la dominance de Nitrospira dans
les systèmes de traitement des eaux usées (Burrell et al. 1998; Burrell et al. 1999).
Dans les boues activées de stations d’épuration, le genre Nitrobacter n’a pas été
détecté au contraire des bactéries phylogénétiquement proches du genre Nitrospira (9% de la
communauté totale) (FISH : Juretschko et al. 1998). Avec la même approche, Daims et al.
(2001a) concluent à la prédominance du genre Nitrospira dans les boues activées en
conditions aérobies. En ce qui concerne les nitrosantes, les membres de la lignée représentée
par N. europaea/Nc. mobilis ont souvent été isolés dans les stations d’épurations (Juretschko
et al. 1998; Koops & Pommerening-Röser 2001), ainsi que des membres du groupe
représenté par N. oligotropha et N. nitrosa (Suwa et al. 1997). Il semble alors que les
bactéries du genre Nitrosomonas soient prédominantes dans les boues activées par rapport à
celles du genre Nitrosospira (FISH: Daims et al. 2001b; Gieseke et al. 2001; Juretschko et al.
1998; Mobarry et al. 1996; Okabe et al. 1999; Schramm et al. 2000; Schramm et al. 1996).
Notons que certaines stations d’épurations ont une population nitrosante relativement
monospécifique alors que d’autres présentent une plus grande diversité.
Les biofilms nitrifiants des réseaux de distribution d’eau courante ont des bactéries
nitrosantes principalement représentées par des membres du cluster 6a (N. oligotropha et N.
ureae) et une population nitratante mixte composée de différents membres des genres
Nitrobacter et Nitrospira (T-RFLP et clonage : Regan et al. 2002).

98
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

I.3.4.2. Sols

Dans la plupart des sols agricoles et forestiers, Nitrosospira serait le genre nitrosant
majoritaire par rapport à Nitrosomonas (DeBoer et al. 1992 ; Kowalchuk et al. 1997 & 1998 ;
Hasting et al. 2000 ; Phillips et al. 2000 ; Bano & Hollibaugh 2000 ; Ibekwe et al. 2002). Les
Nitrosospira appartenant aux clusters 2, 3 et 4 sont ceux le plus souvent rencontrés dans les
sols (Kowalchuk et al. 1997, 1998 & 2000 ; Stephen et al. 1998, Bruns et al. 1999 ; Mendum et
al. 1999 ; Hasting et al. 2000 ; Phillips et al. 2000). Toutefois, dans les sols acides (landes,
prairies, forêts et marécages), où les quantités en ammoniaque sont faibles, les espèces ayant
une activité uréase (les genres Nitrosospira et Nitrosovibrio) semblent être les
représentantes exclusives de la population nitrosante (Stephen et al. 1996; Jiang & Bakken,
1999; Kowalchuk & Stephen 2001 ; Smith et al. 2001; Bäckman et al. 2003). Les membres du
cluster 2 des Nitrosospira sont particulièrement adaptés aux faibles pH (Kowalchuk et al
1997; Stephen et al. 1998). Toutefois une étude récente a montré la prédominance de
Nitrosomonas europaea dans un sol forestier acide (Carnol et al. 2002). Dans les sols plus
neutres (sols cultivés), les membres des lignées représentées par N. communis et
Nitrosolobus multiformis sont dominants (Koops & Pommerening-Röser 2001). Dans les
sols naturellement oligotrophes et légèrement acides (pH 6.0), des souches appartenant aux
lignées N. oligotropha et Nitrosospira ont également été isolées (Koops & Pommerening-
Röser 2001). Il semble que la quantité d’ammonium apportée ou présente dans le milieu
n’influence pas fondamentalement la diversité de la population nitrosante, majoritairement
représentée par des Nitrosospira, des changements au niveau spécifique (remplacement d’un
cluster par un autre) peuvent toutefois survenir (Aakra et al. 1999, 2000 ; Mendum et al.
1999 ; Avrahami et al. 2002).
En ce qui concerne la population bactérienne nitratante, elle a été beaucoup moins
étudiée, ou les études se sont restreintes à la détection d’un seul genre. Pendant longtemps
les études ne se sont intéressées qu’au genre Nitrobacter, il est donc apparu comme
majoritairement responsable de l’activité nitratante dans les sols de tous types : agricoles
(Degrange & Bardin 1995 ; Grundmann & Normand 2000), acides (DeBoer et al. 1991),
alcalins (Sorokin et al. 1998), forestiers, le permafrost (Soina et al. 1991). Toutefois depuis
quelques années les études s’intéressent de plus près au genre Nitrospira qui serait
également ubiquiste et a désormais été détecté dans le sol (Bartosh et al. 2002).

I.3.4.3. Milieux aquatiques salins

On a longtemps admis que les espèces bactériennes nitrifiantes, vivant dans les
environnements aquatiques d’eau douce et marins, étaient identiques. Au contraire, l’étude
de la diversité des bactéries nitrifiantes (sondes oligonucléotidiques spécifiques) dans des
aquariums d’eau douce et marin a montré une grande concentration de Nitrosomonas
europaea dans le milieu marin alors que cette souche n’était que très faiblement concentrée
dans l’aquarium d’eau douce (Hovanec & Delong 1996).
Dans les environnements halophiles, les bactéries nitrosantes (ayant des besoins en
sels ou une tolérance accrue à la salinité) de la sous-classe γ des Protéobactéries (N. oceani)
ainsi que les membres de la lignée représentée par Nitrosomonas marina, sont fréquemment
retrouvés dans les milieux aquatiques salins. Ainsi, des fragments de séquences d’ADNr 16S
appartenant aux Nitrosomonas et Nitrosospira des clusters 5 et 1 et n’ayant pas de
représentant cultivé, sont fréquemment détectés dans les estuaires et environnements marins
(Bano & Hollibaugh 2000; Hollibaugh et al. 2002; McCaig et al. 1999; Phillips et al. 1999;
Stephen et al. 1996; Francis et al. 2003). Les espèces Nitrosococcus et Nc. halophilus
semblent également préférer les milieux halophiles (Koops et al. 1990). La lignée représentée
par N. europaea/Nc. mobilis possède une tolérance au sel, qui explique sa présence en
Californie dans le « Mono Lake » (Ward et al. 2000) et la lignée comptant les bactéries
proches de N. halophila dans un lac salé Mongolien (Sorokin et al. 2001). La détection de

99
Chapitre I. 3. Nitrification en milieux naturels

bactéries du genre Nitrosospira, peu tolérantes au sel, n’implique pas forcément leurs
activités dans l’environnement, mais peuvent éventuellement y survivre si elle y sont
apportées.
Dans les estuaires, des espèces bactériennes halotolérantes ou halophiles (N. marina
et N. aestuarii appartenant au cluster 6b) sont également détectées (De Bie et al. 2001 ;
Bollmann & Laanbroek 2002).

I.3.4.4. Milieux d’eau douce

Au sein des habitats d’eau douce, les membres du groupe représenté par
Nitrosomonas oligotropha dominent souvent la population nitrosante. Ces bactéries ont été
isolées (Koops & Pommerening-Röser 2001) à partir d’échantillons naturels, et détectées
grâce aux techniques moléculaires dans l’eau et les sédiments de milieux d’eau douce
(Bollmann & Laanbroek 2001; DeBie et al. 2001; Regan et al. 2002; Speksnijder et al. 1998;
Whitby et al. 2001). Des bactéries du genre Nitrosospira, membres des clusters 0, 2, 3 et 4,
ont été détectées dans ces même habitats (Kowalchuk et al. 1998; Speksnijder et al. 1998;
Whitby et al. 1999; Burrell et al. 2001; Whitby et al. 2001) ; les membres du genre
Nitrosospira sont aussi majoritaires dans les sédiments de lacs eutrophes (Smorczewski &
Schmidt 1991; Hiorns et al. 1995). Occasionnellement, des membres des lignées représentées
par N. europaea, N. eutropha et N. nitrosa, ont été isolés dans des rivières et lacs eutrophes
(Koops & Pommerening-Röser 2001) ou seulement détectés par PCR (Speksnijder et al. 1998;
Whitby et al. 1999; Bollmann & Laanbroek 2001; Burrell et al. 2001).
Rappelons que l’absence de bactéries nitrosantes de la sous-classe γ dans les
environnements non-marins, peut être due au manque d’études.
Dans des aquariums d’eau douce la population nitratante dominante retrouvée au
sein de biofilms est constituée d’espèces putatives proches du genre Nitrospira alors que le
genre Nitrobacter n’a pas été détecté (Hovanec et al. 1998). Ces analyses phylotypiques
(DGGE) et combinées à des analyses de nitrite et nitrate, ont permis de montrer une
corrélation entre l’apparition des bactéries proches de Nitrospira et l’initiation in situ de
l’activité nitratante. Il apparaît désormais que le genre Nitrospira pourrait avoir un rôle
majeur dans l’oxydation du nitrite par rapport à Nitrobacter que l’on pensait majoritaire
(Burrell et al. 1998; Daims et al. 2000).

100
I.3.5. Etat des connaissances du processus de nitrification
dans la Seine en 2001.

A l’aval de l’agglomération parisienne, la pollution organique et ammoniacale,

représente une nuisance majeure. Si la pollution organique entraîne une désoxygénation à
l’aval immédiat de la station d’Achères, c’est dans l’estuaire fluvial que la pollution
ammoniacale est à l’origine d’une seconde zone de désoxygénation due à la nitrification
(Romana et al. 1992). L’étude du processus de nitrification a débutée dès 1993 dans le cadre
des programmes PIREN-Seine et Seine-aval, afin de tenter de comprendre son
fonctionnement dans la basse Seine influencée par les effluents d’Achères. Le but étant
initialement de quantifier la nitrification pour expliquer le déficit en oxygène observé dans
l’estuaire amont, en prenant explicitement en compte la nitrification. La réévaluation de la
méthode de mesure de l’activité nitrifiante potentielle au 14C et la détermination des
paramètres de croissance des bactéries nitrosantes et nitratantes en culture pure ont permis
de modéliser la nitrification dans la basse Seine et dans l’estuaire, notamment pour la période
1993-1997 avant la mise en place de la station d’épuration de Colombes et la volonté affirmée
d’améliorer le traitement des effluents (Brion & Billen 1998 ; Brion et al. 2000). Des
investigations ponctuelles ont également été menées sur le rôle des effluents dans
l’ensemencement d’une biomasse nitrifiante (Brion & Billen 1999). Le bilan de la nitrification
dans l’oxygénation a été établi relativement aux processus impliqués dans le bilan d'oxygène
(Garnier et al. 2001).
Entre 1996 et 1999, les déficits en oxygène ont été moins importants que pour la
période allant de 1993 à 1995 (Brion et al. 2000 ; Garnier et al. 2002). Même si le traitement
des effluents émanant des stations d’épurations parisiennes tend à s’améliorer (Billen et al.
2001), la charge ammoniacale reste très élevée à l’aval d’Achères. Malgré l’évolution des
traitements, la nitrification a toujours lieu dans la basse Seine et crée toujours un déficit en
oxygène ; de plus, une augmentation des émissions de N2O à l'aval d'Achères a été mise en
évidence (Garnier et al. 2002).
L’origine de la nitrification et des apports de nitrifiantes (biofilms des réseaux
d'assainissement) dans des effluents de traitement secondaire et l’étude des variations
saisonnières de ces apports ont été appréhendées afin d’établir la relation Nitrifiantes vs.
MES (données en station d’épuration) pour la modélisation (Garnier et al. soumis).
Parallèlement, des adaptations de technique moléculaire ont été réalisées afin d’étudier et de
quantifier les bactéries nitrifiantes (Berthe et al. 1999 ; Berthe et al. 2000).

Les questions qui restent alors sont :

1) Poursuivre la quantification de la nitrification dans un contexte d'amélioration progressif
des traitements pour mieux cerner le passage au traitement tertiaire.
2) Approfondir la connaissance du processus de nitrification en explorant l'étape
intermédiaire de la production de N2O. Déterminer les cinétiques et les paramètres de cette
étape et compléter la formulation du processus de nitrification dans le modèle RIVE de
Riverstrahler.
3) Afin de construire le schéma conceptuel sous plusieurs étapes il est nécessaire de connaître
les bactéries qui réalisent ces différentes étapes.
4) Reconsidérer les origines et le devenir de la nitrification et décrire la dynamique et les
successions des populations bactériennes nitrifiantes et leurs diversités.
5) Modéliser la nitrification et la production de N2O à l'aval d'Achères et explorer les
scénarios de traitement tertiaire.

101
II. Site d’étude et Méthodologie

102
103
Chapitre II.

Dans ce contexte, ma thèse doit répondre aux objectifs suivants :

1) Poursuivre le suivi du processus de nitrification in situ, afin d’avoir une vision à la fois
spatiale et temporelle de l’évolution du processus à l’aval des rejets des effluents d’Achères.
2) Etudier le mécanisme de nitrification-dénitrifiante en tentant de définir les conditions
optimales de production de N2O et en déterminant les paramètres cinétiques d’émissions de
ce gaz à effet de serre.
3) Déterminer la diversité bactérienne nitrifiante au travers des deux groupes fonctionnels
nitrosant et nitratant. Faire un suivi spatial et temporel des communautés nitrifiantes afin de
comprendre les modifications de populations et l’influence des effluents d’Achères sur
l’évolution des populations bactériennes.
Afin de répondre à ces objectifs nous avons mis en œuvre une méthodologie utilisant
et développant un certain nombre de techniques analytiques.

Dans le cadre de l’étude du cycle de l’azote à l’échelle du bassin de la Seine, nous

avons ici cherché à étudier la nitrification, sous ses différentes étapes, d’un point de vu à fois
biogéochimique et en considérant également les populations bactériennes qui les réalisent. Si
les mesures de processus restent des mesures biogéochimiques, la caractérisation
taxonomique des communautés bactériennes a été réalisée avec des outils moléculaires et
génétiques (PCRc : Diviacco et al. 1992 ; DGGE : Muyzer et al. 1993) et non par les approches
classiques de mise en culture (Matulewich et al. 1975).

104
Chapitre II. 1. Site d’étude

II.1. Site d’étude

La basse Seine s’étend depuis l’amont de la ville de Paris (à la confluence de la Marne

avec la Seine, station de Saint Maurice au Km 0, Figure II.1) jusqu’au barrage de Poses (au
Km 202), qui empêche l’onde marégraphique d’aller plus en amont et le barrage forme donc
la limite amont de l’estuaire de la Seine. Le secteur fluvial de l’estuaire s’étend jusqu’en
amont de Caudebec (Km 310), qui est la limite de l’intrusion saline. De Caudebec à Honfleur
(Km 356), ville située à l’embouchure, s’étend le gradient de salinité influencé par les marées
et le débit du fleuve. En période estivale, un bouchon vaseux s’installe dans l’estuaire aval, ce
site singulier où l’on observe un maximum de turbidité a donc un rôle capital dans les cycles
biogéochimiques.
Les stations de prélèvements le long du continuum sont au nombre de 18, elles sont
désignées par un numéro et/ou par leur distance en kilomètre depuis la station de Saint
Maurice située au Km 0 (Figure II.1).

La basse Seine et l’estuaire reçoivent tous les apports du bassin versant caractérisé par
une forte activité industrielle, une agriculture intensive et une forte densité de population
illustrée principalement par la présence de l’agglomération parisienne. Les effluents
domestiques de 6.5 millions d’équivalent habitants de Paris et de son agglomération sont
traités par la station d’épuration d’Achères équipée à l’heure actuelle d’un traitement
secondaire de type boues activées. Les effluents traités sont déversés dans la basse Seine
(Figure II.1) et apportent de grandes quantités de matières organiques et d’ammonium qui
sont ensuite consommés dans la basse Seine.

Figure II.1. Représentation du site d’étude : la basse Seine. 18 stations de prélèvements sont
figurées par des cercles de couleur : jaune pour les stations à l’amont des rejets d’Achères, bleu pour
les stations de la basse Seine en amont du barrage de Poses, vert pour les stations de l’estuaire amont
d’eau douce et rouge pour les stations de l’estuaire aval subissant l’effet de la salinité.
1: Saint Maurice, Km 0 ; 2: Maison Laffittes, Km 48 ; 3: Conflans, Km 70 ; 4: Triel, Km 84 ;
5: Porcheville, Km 101 ; 6: Vernon, Km 137 ; 7: Les Andelys, Km 173 ; 8: Poses, Km 202 ;
9: Pont Arche, Km 208 ; 10: Elbeuf, Km 219 ; 11: Oissel, Km 230 ; 12: Bassin des Docks, Km 251 ;
13: La Bouille, Km 260 ; 14: Duclair, Km 278 ; 15: Heurtauville, Km 298 ; 16: Caudebec, Km 310 ;
17: Tancarville, Km 337 ; 18: Honfleur, Km 356.

105
Chapitre II. 2. Echantillonnage

II.2. Échantillonnage et traitement des

échantillons

II.2.1. Stratégie d’échantillonnage

II.2.1.1. L’effet de la station d’épuration d’Achères

Un des objectif principal de ce travail étant de suivre le processus de nitrification dans

la basse Seine, majoritairement influencé par les apports des rejets des effluents d’Achères, il
était donc important d’étudier un grand nombre de sites le long du continuum. D’une part il
était capital de choisir des sites en amont des rejets d’Achères afin de servir de référence pour
la composition de la masse d’eau arrivant à Paris avant l’impact d’Achères. Nous avons donc
fait le suivi de deux sites, Saint Maurice et Maison Laffittes (Figure II.1), tout en étant
conscient que pour ces deux stations, les masses d’eau sont déjà anthropisées par l’ensemble
des activités industrielles, agricoles et les rejets urbains déversés en amont de Paris. Le
continuum en aval des rejets d’Achères a été étudié jusque dans l’estuaire pour environ 16
stations (Figure II.1) afin de suivre finement le déroulement du processus de nitrification, à la
fois dans la basse Seine jusqu’au barrage de Poses ainsi que dans l’estuaire. Au total, pour les
campagnes réalisées dans la basse Seine, entre 9 et 21 sites (Tableau II.1) sont échantillonnés
le long du continuum entre la première station St Maurice et la station de Honfleur dans
l’estuaire aval (Figure II.1). Enfin, les effluents bruts et traités de la station d’épuration
d’Achères sont également analysés en vu de mieux comprendre ce qui est apporté en Seine
par les effluents.
Les campagnes d’échantillonnage (de 2001 à 2003) sont principalement réalisées du
primtemps à l’automne, pour couvrir la totalité de la campagne estivale. Le suivi des variables
de qualité de l’eau et des populations bactériennes, nous permet d’appréhender le
fonctionnement écologique de ce tronçon en situations variées de débit (Tableau II.1). Les
campagnes réalisées en avril et mai nous permettent d’avoir une situation de référence pour
laquelle les processus biogéochimiques sont très lents. Le processus de nitrification est très
actif en été, de juin à fin septembre quand la température de l’eau est plus clémente (environ
20°C) et les débits plus faibles, autorisant un temps de résidence plus long de la masse d’eau
et donc un développement des microorganismes.

Tableau II.1. Présentation des campagnes effectuées entre 2001 et 2003 dans la Basse Seine.
Les dates auxquelles les prélèvements ont été effectués sont précisées ainsi que le nombre de
prélèvement, les gammes de températures de l’eau le long du continuum lors de l’échantillonnage et
enfin les débits de la Seine au niveau de la station de Poses (limite de l’estuaire amont) pour le
premier et dernier jour de chaque campagne de prélèvements.
2001 2002 2003
mai juillet mai juillet septembre avril mai septembre

Date 7-9/05 9-11/07 14-15/05 9-11/07 24-25/09 1-2/04 6-7/05 8-9/09

Nombre de 9 18 10 21 16 9 16 16
prélèvements

Température 12.8-13.6 20.9-22.9 15.6-16.4 20.4-23.4 17.2-18.3 10.5-14 16.2-17.8 19.5-22.3

(°C)
Débit de la
1650-1700 722-466 417-511 190-254 185-115 403-368 345-459 110-117
Seine à Poses
(m3.s-1)

106
Chapitre II. 2. Echantillonnage

II.2.1.2. L’estuaire : salinité et bouchon vaseux

Deux campagnes bateaux ont été menées dans le cadre du programme Seine-Aval ; la
première (Nuts01) du 6 au 11 août 2001 à bord du navire océanographique (N. O.) Thalia de
l’Ifremer et la seconde (Nuts02) du 16 au 20 septembre 2002 à bord du navire
océanographique Côte de la Manche de l’INSU. Lors de ces campagnes, deux stratégies ont
été adoptées pour les prélèvements : a) selon un gradient de salinité, débutant soit à l’étale de
pleine mer ou de basse mer, depuis le point le plus marin (salinité 30-32 ‰) jusqu’au point
le plus fluvial (salinité 0 ‰) en remontant l’estuaire vers l’amont. b) depuis un point fixe
situé en amont du pont de Normandie pendant au moins un cycle de marée.
De plus, des campagnes plus légères ont été menées en 2002 et 2003 d’avril à octobre,
en points fixes au niveau de Honfleur et de Tancarville. Ces prélèvements nous ont permis
d’appréhender la dynamique saisonnière de l’azote dans le maximum de turbidité (bouchon
vaseux). L’analyse de l’ensemble de ces échantillons permet d’étudier à la fois l’évolution des
processus suivant les saisons mais également en fonction de conditions hydrologiques
contrastées (2001 : année humide; 2003 : année sèche). Les dates auxquelles ont été
effectués les prélèvements, les noms, le type de campagne ainsi que les débits de la Seine à
Poses lors de chaque campagne sont présentés dans le tableau II.2.

Tableau II.2. Présentation des campagnes d’échantillonnage réalisées dans l’estuaire de Seine.
Valeurs des débits à Poses lors des campagnes effectuées en 2001, 2002 et 2003. Les types de
campagnes sont notés, P.F. : point fixe en demi-cycle de marée à Honfleur ou Tancarville et N.O. :
avec navire océanographique avec étude de point fixe et investigations dans un gradient de salinité.

II.2.1.3. Bassin amont et apports latéraux

Des prélèvements ponctuels d’eau, de sédiment et de sol (provenant des champs

jouxtant les cours d’eau échantillonnés), en tête de bassin dans une zone agricole, ont été
réalisés (Figure II.2). Nous avons également échantillonné les deux affluents majeurs de la
basse Seine : l’Oise et l’Eure en une seule date (mai 2004), en une seule station située juste en
amont de la confluence des rivières avec la Seine.
Ces campagnes ponctuelles ont permis de caractériser plus précisément le
fonctionnement du processus de nitrification, d’étudier les apports directs des zones agricoles
avant tout rejet urbain et de montrer le rôle des apports latéraux sur ce processus.

107
Chapitre II. 2. Echantillonnage

Figure II.2. Représentation du bassin de l’Orgeval, affluent du Grand Morin. Les sites
d’échantillonnage de sol provenant des parcelles agricoles sont représentés par des cercles rouges,
les cercles bleus localisent les sites d’échantillonnage de sédiment dans les cours d’eaux. 1. Ferme
Loge, 2. Ru de Fosse Rognon,
3. Avenelles et 4. Le theil. (Carte adaptée d’après une illustration du Cemagref).

108
Chapitre II. 2. Echantillonnage

II.2.2. Prélèvement et traitement des échantillons

II.2.2.1. Prélèvements

Des prélèvements de 5 à 10L d’eau sont en général réalisés.

Pour les campagnes le long du continuum, les échantillons sont prélevés à l’aide d’un
sceau en surface depuis des ponts traversant la Seine. Dans l’estuaire à partir de Poses, les
prélèvements sont fait par bateau à 1 m de profondeur par le Service de Navigation de la
Seine (SNS).
Les prélèvements, effectués en points fixes (P.F.) lors de demi-cycles de marée dans
l’estuaire, sont faits à partir d’un ponton à l’aide d’un sceau. Lors des campagnes sur les
navires océanographiques, les prélèvements sont effectués avec une bouteille Niskin à
plusieurs profondeurs (surface, intermédiaire et fond).

II.2.2.2. Traitement des échantillons

Certaines mesures sont réalisées directement sur le terrain au moment des

prélèvements, pour le reste elles sont réalisées au laboratoire sur les 5 à 10L d’eau prélevée et
stockée à 4°C durant le transfert.
Directement sur le terrain les mesures de pH, de température et d’oxygène dissous
sont effectuées. Un flacon de 100mL d’eau est stoppé à l’aide de chlorure mercurique (HgCl2,
0.5% concentration finale) et scellé, de retour au laboratoire il est stocké à 4°C en attendant
d’y doser le N2O dissous pour chaque échantillons.
Au laboratoire l’eau est gardée soit brute pour les analyses des composés particulaires
(ex : Phosphore total), soit filtrée sur des membranes en fibre de verre (Whatman, GF/F)
pour les dosages des nutriments dissous (azote inorganique et PO43-). A partir de différents
filtres, la quantité de matières en suspensions (MES), de carbone organique particulaire
(COP), les concentrations en chlorophylle et en silice sont également dosés. Les MES sont
analysées par pesée après séchage à 105°C du matériel recueilli par filtration de 100 à 500 ml
d’échantillon sur des filtres GF/F (0.7 µm) pré-pesés et grillés à 450°C.

Des volumes variables de 100 à 250 mL d’eau (volume variable suivant le contenu en
MES) sont filtrés sur des membranes en nitrocellulose de porosité 0.22 µm (Durapore®,
diam. = 45 mm) en triplicats et les filtres sont stockés à –20°C en attendant l’étape
d’extraction de l’ADN pour les analyse d’écologie moléculaire.

Deux flacons de 200 mL et 250 mL de chaque échantillon vont servir aux mesures des
activités nitrifiantes, nitrosante et nitratantes potentielles (cf. partie II.3.2).

109
Chapitre II. 3. Stock d’azote et activités nitrifiantes

II.3. Stocks d’azote et activités nitrifiantes

II.3.1. Dosages des différentes formes d’azote

Sur l’ensemble des prélèvements, les concentrations en ammonium, en nitrite et en

nitrate ont été déterminées par les méthodes de dosages colorimétriques décrites
précédemment (Slavyck & McIsaac 1972 ; Rodier 1984). C’est dosages sont réalisés sur de
l’eau filtrée sur une membrane GF/F et stockée à –20°C. Le suivi des concentrations en oxyde
nitreux dissous dans l’eau a également été effectué.

II.3.1.1. Dosage de l’ammonium

L’ammonium est dosé par coloration, pendant au minimum 6h, au bleu d’indophénol
(norme AFNOR T90-15 d’août 1975). En milieu alcalin, les ions ammonium forment avec le
phénol (réactif 1 : 3.5% phénol, 0.4% nitroprussiate de sodium) et l’hypochlorite (réactif 2 :
28% citrate de sodium, 2.2% soude, hypochlorite de sodium à 0.14% de chlore actif) un
composé de type bleu d’indophénol dont l’absorbance est mesurée à une longueur d’onde de
630nm. La courbe d’étalonnage est réalisée à partir d’une solution standard commerciale
d’ammonium chloride à 1 g.L-1.

II.3.1.2. Dosage du nitrite

Les nitrites sont dosé par coloration à la sulfanilamide aussi nommée coloration de
Griess-Ilosway (norme AFNOR T90-013 de mai 1993). L’échantillon est mis en contact d’un
réactif de diazotation (sulfanilamide 1% dans une solution d’acide phosphorique) de façon à
transformer les nitrites en sel de diazonium. Ce sel réagit avec un réactif de couplage (N-
naphtyl-1-ethylènediamine dichlorohydrate 0.1%) pour donner un complexe coloré rose dont
l’absorbance est mesurée à une longueur d’onde de 540nm. La courbe d’étalonnage est
réalisée à partir d’une solution standard commerciale de nitrite de sodium à 1 g.L-1.

II.3.1.3. Dosage du nitrate

Les nitrates sont réduits en nitrites par passage de l’échantillon d’eau sur une colonne
formée de granules de cadmium cuivrés (norme AFNOR T90-012 de décembre 1987), les
nitrites ainsi formés sont alors dosés par la méthode décrite précédemment.

II.3.1.4. Dosage de l’oxyde nitreux

L’oxyde nitreux (N2O) est mesuré sur des échantillons d’eau conservés avec du
chlorure mercurique (0.5 % en concentration finale) dans des flacons de 100 ml scellés, puis
gardés à 4°C jusqu’à l’analyse. L’analyse est réalisée en chromatographie en phase gazeuse
avec capture d’électron sur des triplicats.

II.3.2. Activités nitrifiantes potentielles

Dès le retour au laboratoire, des mesures d’activités nitrifiantes potentielles ainsi que
des mesures d’activités nitrosantes et nitratantes potentielles ont été déterminées par les

110
Chapitre II. 3. Stock d’azote et activités nitrifiantes

techniques présentées précédemment (Brion & Billen 1998 ; Cébron et al. 2003). Les figures
II.3 et II.4 présentent les protocoles montrant le principe des deux méthodes employées.

II.3.2.1. Activité nitrifiante potentielle (pNA)

Cette première méthode permet de mesurer l’activité nitrifiante potentielle globale de

l’échantillon au moyen d’une méthode basée sur l’incorporation de carbone 14 et développée
par Billen en 1976 puis récemment améliorée par Brion & Billen en 1998. On ajoute à
l’échantillon d’eau du carbonate marqué au 14C et du substrat (NH4Cl, 2mM concentration
finale), l’échantillon est alors inhibé ou non par ajout de : N-Serve (5 mg.L-1 concentration
finale) ou ATU (Allylthiourée 1 mg.L-1 concentration finale), inhibiteur de la nitrosation, et
de chlorate (5 mM concentration finale), inhibiteur de la nitratation (Figure II.3). Les 2
échantillons sont incubés en conditions optimales puis la radioactivité incorporée est
mesurée en scintillation liquide sur des quintuplicats. La quantité de carbone incorporée est
alors proportionnelle à l’azote oxydé. L’activité nitrifiante potentielle est calculée grâce au
rapport de 0.11 ± 0.01 µmol C incorporé / µmol N oxydé.

Figure II.3. Protocole rappelant la méthode de mesure d’activité nitrifiante potentielle par
incorporation de 14C décrite par Brion & Billen (1998). L’activité est déduite de la différence
d’incorporation de 14C dans des échantillons d’eau contenant du H14CO3-et de l’ammonium
(NH4Cl)entre des échantillons non inhibés (1) et inhibés par ajout de N-serve et chlorate (NaClO3)
inhibant respectivement la nitrosation et nitratation (2). L’activité nitrifiante potentielle est calculée
grâce au rapport de 0.11 ± 0.01 µmol C incorporé / µmol N oxydé.

II.3.2.2. Activités nitrosante et nitratante potentielles (pAOA et pNOA)

La seconde méthode nous a permis d’obtenir indépendamment les taux potentiels de

nitrosation et de nitratation, cette technique est basée sur le dosage des nitrites dans des
échantillons d’eau avec ou sans l’un des deux inhibiteur de la nitrification. L’échantillon
additionné de substrat (NH4Cl 2mM concentration finale, et KNO2 0.06mM concentration
finale) est séparé en quatre. Le premier tube sert de témoin, grâce à l’ajout de chlorure
mercurique (0.06% final) dès le départ inhibant toute activité microbienne, on connaîtra la
concentration initiale en nitrite. Dans le second on ajoute du chlorate (10 mM concentration
finale), la nitratation étant alors inhibée, on observera uniquement une production de nitrite
correspondant à l’activité nitrosante potentielle. Dans le troisième tube, on ajoute de
l’allylthiourée (1 mg.L-1 concentration finale), la nitrosation étant alors inhibée, on observera
uniquement une consommation de nitrite correspondant à l’activité nitratante potentielle.
Enfin le dernier tube est un contrôle dans lequel aucun inhibiteur n’est ajouté. Chacune des
conditions est réalisée en duplicat. Après une incubation en conditions optimales pendant
24h, les tubes sont stoppés avec du chlorure mercurique et le nitrite est dosé dans chacun

111
Chapitre II. 3. Stock d’azote et activités nitrifiantes

d’eux. Les concentrations en nitrite peuvent être exprimées en fonction du temps

d’incubation, ce qui nous permet d’en déduire les taux de production (nitrosation) et de
consommation de nitrite (nitratation).

Figure II.4. Protocole rappelant la méthode de mesure des taux potentiels de nitrosation et
nitratation par incubation avec ou sans les inhibiteurs spécifiques de chacune des 2 étapes de
nitrification (Allylthiouré ATU et Chlorate Na ClO3) puis dosage des nitrites.

Un test de linéarité de cette technique en fonction du temps d’incubation des

échantillons a été réalisé afin de vérifier qu’au cours de l’incubation de 24h, on a ni division
cellulaire ni nouvelle production d’enzyme. L’expérience a été réalisée avec huit séries de
tubes, chaque série est alors incubée plus ou moins longtemps, les temps d’incubation variant
entre 4.5 et 48 heures. Les résultats montrent que pour les 30 premières heures d’incubation,
la production et la consommation du nitrite est linéaire (Figure II.5). Nous pouvons donc
considérer que pour 24h d’incubation les résultats sont donc bien représentatifs des activités
potentielles nitrosantes et nitratantes des échantillons.

Figure II.5. Test de linéarité de la

méthode de mesure des activités
nitrosantes et nitratantes potentielles.
En rouge il s’agit d’une production de
nitrite équivalente à la nitrosation et en
bleu il s’agit d’une consommation de
nitrite équivalente à la nitratation.

II.4. Expériences en Batch et Chemostat

112
Chapitre II. 4. Batch et Chemostat

Nous avons effectué au laboratoire des expériences de mise en culture d’eau de Seine
en chémostats (cultures continues) et en batchs, afin d’étudier en conditions contrôlées le
processus de nitrification, et de déterminer les conditions favorables et les paramètres de
contrôle de la production de N2O par nitrification-dénitrifiante.

II.4.1. Expériences en batch : effet des concentrations en NH4+ et

NO2-

De l’eau de Duclair est mise en culture avec l’ajout de 30 mg N-NH4+.L-1, l’oxygène

dissous dans l’eau est maintenu à 7.5 mg.L-1 et le pH entre 7.5 et 8. Les différentes formes
d’azote inorganique dissout sont dosées tous les jours. Lorsque la totalité de l’ammonium a
été consommé, la culture est séparée en plusieurs batchs de 1.5L (Figure II.6) dans lesquels
sont imposées différentes conditions (variation des concentrations en ammonium et nitrite).
Pour tester l’effet de la concentration en ammonium sur la production de N2O, on
ajoute des concentrations croissantes d’ammonium, de 0.08 à 16.9 mg N-NH4+.L-1, et une
même quantité de nitrite (2.2 mgN-NO2-.L-1). Pour tester l’effet de la concentration en nitrite
sur la production de N2O, on ajoute des concentrations croissantes de nitrite de 0.08 à 28 mg
N-NO2-.L-1 et une même quantité d’ammonium (25 mg N-NH4+.L-1). Les différents Batchs
subissent ensuite un stress oxique et des cinétiques de production de N2O sont effectuées
après 3 heures.

Figure II.6. Schéma des cultures en batch

II.4.2. Expériences en chémostat : effet de la concentration en

oxygène

II.4.2.1. Phase de mise en culture batch

Un volume de 60L d’eau de la Seine est prélevé au niveau du site de Duclair (à 278 km
de Paris) au niveau de la plus forte activité nitrifiante potentielle. Une partie (5L) est mise en
culture Batch (culture fermée) pour une période de 10 à 15 jours avec un ajout d’ammonium
(30 mg N.L-1 finale), une agitation et une oxygénation maintenue à 7-8 mg/L, afin de
favoriser la croissance des populations bactériennes nitrifiantes. Au bout de 15 jours cette
culture nitrifiante est utilisée comme le point de départ du pilote en chémostat (culture
alimentée en continu). Pendant le même laps de temps, le reste de l’eau de la Seine est laissé
à température ambiante sans traitement particulier et servira de nourrice d’alimentation
(après autoclavage) pour le chémostat. Au cours de cette phase, on peut considérer que la
plus grande partie de la matière organique biodégradable a été consommée par les bactéries
hétérotrophes, ce qui permet de s’affranchir au maximum d’une quelconque activité
hétérotrophe (par exemple de dénitrification) dans le pilote; au terme de ces 15 jours, cette

113
Chapitre II. 4. Batch et Chemostat

eau est autoclavée avant d’être utilisée comme nourrice. Le chémostat fonctionne ensuite en
continu pendant environ 3 semaines, jusqu’à l’obtention d’une phase stationnaire, quand la
nitrification est relativement constante dans le pilote.

II.4.2.2. Phase de mise en culture chemostat

Le pilote a une contenance de 2L (Figure II.7), il est donc alimenté en continu par une
nourrice d’eau de Seine stérile (cf. Ci-dessus) à laquelle on ajoute 30 mg N-NH4+ L-1 sous
forme d’une solution NH4Cl tamponnée par un tampon phosphate (K2HPO4 / KH2PO4) à 0.5
mM en concentration finale. Le débit d’entrée et de sortie est constant (1L jour-1) et régulé par
une pompe péristaltique ; l’eau du pilote est ainsi entièrement renouvelée tous les 2 jours.
L’eau du pilote et de la nourrice sont agitées grâce à des barreaux aimantés pour maintenir
les MES en suspension. A l’intérieur du pilote, le pH est maintenu entre 7.5 et 8 (pH
optimum pour les bactéries nitrifiantes ; Bock et al., 1989) grâce au pouvoir tampon de la
nourrice, et la concentration en oxygène dissous est contrôlée grâce à la combinaison d’une
aquapompe et d’une bouteille d’azote gazeux (N2). L’oxygène dissous dans le pilote est
maintenu entre 7.5 et 8 mg L-1 pendant toute la durée de la phase « chémostat ».
Après environ 3 semaines, quand le pilote a atteint sa phase stationnaire, pour
laquelle l’activité nitrifiante et les concentrations en ammonium, nitrite et nitrate sont
constantes plusieurs stress oxiques sont imposés, l’oxygène dissous dans l’eau étant abaissé à
différentes concentrations comprises entre 0.25 et 4.5 mg L-1. Au total nous avons réalisé 4
chémostats et répartis les différents stress oxiques sur les 4 expériences.

Figure II.7. Schéma du pilote en Chémostat

Au cours des 2 phases de batch et de chémostat, des prélèvements sont effectués une
fois par jour afin de doser les concentrations en ammonium (NH4+), nitrite (NO2-), nitrate
(NO3-), et de déterminer la quantité de MES dans les cultures.
II.4.3. Cinétiques de production de N2O
Sur les cultures batch et sur les pilotes en chémostat en phase stationnaire, des
cinétiques de production de N2O sont réalisées pour chacune des conditions imposées
(concentrations en oxygène dissous, ammonium et nitrite). Après 3h de stress oxique, 3
flacons de 100 mL d’eau sont remplis, le premier est stoppé à l’aide de chlorure mercurique

114
Chapitre II. 4. Batch et Chemostat

au temps initial, le second après 30 minutes et le troisième après 60 ou 90 minutes. En

dosant la concentration en N2O dissous dans chaque flacon par chromatographie en phase
gazeuse, nous pouvons exprimer la concentration en N2O en fonction du temps d’incubation
et en déduire la production de N2O pour les différentes conditions d’oxygénation et de
concentration en ammonium et nitrite.

Figure II.8. Protocole des cinétiques de production de N2O

Une première cinétique de production de N2O est effectuée avant même de faire un
stress oxique, pour une concentration en oxygène dissous de 7.5 mg.L-1, afin de connaître la
production de base de N2O dans des conditions aérobies. Une série de stress oxiques est alors
effectuée sur la culture chémostat. C’est après 3h de stress que les cinétiques de production
de N2O sont réalisées; l’oxygénation est ensuite rétablie à 7.5-8 mg.L-1 pendant au minimum
36h avant d’imposer un autre stress oxique. Treize conditions d’oxygénations différentes (7.5,
4.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1.4, 1.25, 1.1, 0.8, 0.5, 0.4 et 0.25 mg L-1) ont été testées sur 4 chémostats.
Ces expériences nous permettent alors de définir une valeur en oxygène dissous pour laquelle
la production de N2O est maximale.
L’effet des concentrations en ammonium et nitrite est alors testé dans des expériences
en Batch (cf. II.4.1) dans lesquels est imposé un stress oxique à la valeur d’oxygène dissous
optimale pour la production de N2O par nitrification-dénitrifiante. Nous avons testé 12
concentrations en ammonium différentes et 13 concentrations en nitrite.

115
Chapitre II. 5 Ecologie moléculaire

II.5. Ecologie moléculaire

II.5.1. Extraction de l’ADN et purification

L’extraction de l’ADN des échantillons de l’eau de Seine et de l’eau de la station

d’Achères est réalisée à l’aide d’un Kit commercial Fast DNA spin Kit for soil (Bio101, USA).
L’ADN est extrait à partir des filtres stockés à chaque campagne (cf. II.2.2.2).
Les bactéries et matières en suspension retenues sur le filtre sont éluées avec un
mélange de détergent (978 µL Sodium Phosphate Buffer + 122µL MT Buffer). Le mélange est
transféré dans un Lysing Matrix Tube, qui contient des billes de céramique et de silice,
permettant de lyser les microorganismes. Les cellules sont cassées mécaniquement dans un
appareil le Bead Beater. Après une centrifugation (30 sec à 14.000g), le surnageant
(contenant l’ADN) est traité avec 250 µL de réactif PPS, tandis que le culot contenant les
débris cellulaires et les protéines est éliminé. A la suite d’une seconde centrifugation, le
surnageant est transféré dans un nouveau tube auquel est ajouté une matrice de silice
(Binding Matrix). La fixation de l’ADN chargé négativement se fait sur la matrice, qui est
ensuite transférée sur une colonne (Spin Filter). Après plusieurs étapes de centrifugation et
de purification (éthanol), l’ADN est élué avec de l’eau Dnase free.

L’ADN est ensuite purifié sur une colonne de Sephadex G-200 afin d’éliminer les
derniers contaminants présent dans les échantillons d’ADN, qui pourraient affecter
l’efficacité d’amplification pendant la PCR.
La préparation d’une colonne de Sephadex G-200 est réalisé dans un tube corning de
15mL dans lequel est placé une seringue de 2 mL. Le gel de Sephadex G-200 est compacté par
centrifugation jusqu’à l’obtention d’une colonne de 1cm. L’échantillon d’ADN de 100 µL est
déposé à la surface de la colonne. Après centrifugation, la colonne est lavée 3 fois avec du
tampon TEN (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 10mM NaCl) et à nouveau centrifugé. Le filtra de
400µL récupéré dans le tube corning est transféré dans un microtube propre et les acides
nucléiques sont précipités avec 0.1 volume d’acétate de sodium + 2 volumes d’éthanol 100%
froid. Après centrifugation, le culot est séché et rincé à nouveau dans 150µL d’éthanol 70%.
Une dernière centrifugation permet de récupérer un culot d’ADN, celui-ci est élué dans
100µL (même volume que l’échantillon de départ) de tampon TE (10 mM TRIS pH 8.0, 1 mM
EDTA) et les échantillons sont conservés à -20°C jusqu’à leur utilisation.

La technique d’extraction utilisée est une technique mise au point pour extraire de
l’ADN total d’échantillons de sol, elle est donc adaptée aux échantillons : 1) où les
microorganismes sont fixés aux particules, 2) riches en matières organiques et acides
humiques. Nous avons fait le choix de cette technique car l’utilisation d’un kit commercial est
beaucoup plus rapide que l’utilisation de protocoles traditionnels. Un plus grand nombre
d’échantillons peut être traité en même temps ce qui est très important dans notre étude
puisque pour chaque campagne d’échantillonnage, on compte entre 16 et 18 échantillons
extraits en triplicats. L’efficacité de la méthode utilisée (kit Bio101 + Bead Beating) a été
testée dans plusieurs études. Hermansson & Lindgren (2001) ont montré que la quantité
d’ADN extraite reste constante au-delà de 10 secondes et jusqu’à 100 secondes d’agitation en
présence des billes de silice (dans notre protocole d’extraction l’agitation est de 35 secondes).
Martin-Laurent et al. (2001) ont comparé les efficacités d’extraction de 3 méthodes : 2 kits
industriels dont le Kit Bio 101 que nous avons utilisé, ainsi qu’un protocole développé dans
leur laboratoire. Le rendement d’extraction du kit Bio101 est de 0.79 ± 0.86 µg d’ADN.g sol-1,
cette valeur étant inférieure au rendement par leur méthode traditionnelle. Le rendement
d’extraction dépend du sol considéré, dans notre étude, nous avons également eu des
rendements d’extraction variables suivant l’échantillon, entre 0.4 et 40 µg d’ADN extrait.L-1
d’eau de la Seine ou des effluents d’Achères, dépendant bien entendu de la localisation de

116
Chapitre II. 5 Ecologie moléculaire

l’échantillon (on aura plus d’ADN extrait dans les échantillons d’Achères et de l’estuaire par
rapport à ceux provenant des stations de l’amont de Paris où les MES sont moins
nombreuses). Si l’on considère un rendement similaire dans tous les échantillons (toujours
une même proportion d’ADN extraite par rapport à l’ADN total), on obtient une mesure
indirecte de la biomasse bactérienne in situ.

II.5.2. Quantification des bactéries nitrifiantes : la PCR

compétitive

Les populations bactériennes nitrifiantes ont été quantifiées grâce à l’utilisation des
techniques de PCR compétitive (cPCR) déjà développées au laboratoire (Berthe et al. 1999 ;
Cébron et al. 2003) dont le protocole est présenté en Figure II.9. Cette technique moléculaire
permet la co-amplification de l’ADN environnemental (ADN cible, ici fragments spécifiques
des bactéries nitrifiantes) avec un ADN compétiteur (de taille légèrement différente),
introduit dans les tubes de PCR en différentes concentrations connues. Le rapport des
intensités des deux bandes de produits de PCR, cible et compétiteur, estimé grâce à un
analyseur d’image (Quantity One, BioRad), permet d’établir une droite étalon utilisée pour
déterminée la concentration des échantillons environnementaux (Figure II.9).

Cette technique permet de cibler, d’une part l’ensemble de la communauté nitrosante

de la sous-classe β des Protéobactéries en ciblant le gène amoA (d’après la méthode de
Stephen et al. 1999) à l’aide des amorces PCR mises au point par Rotthauwe et al. (1997)
(Tableau II.3), d’autre part le genre Nitrobacter (Berthe et al. 1999) au moyen des amorces
PCR développées par Degrange & Bardin (1995) (Tableau II.3). Afin de cibler au mieux
l’ensemble de la communauté nitratante, j’ai développé au laboratoire la PCR compétitive
pour détecter le genre Nitrospira (deuxième genre nitratant susceptible d’être présent dans
les milieux aquatiques) d’après la méthode de Dionisi et al. (2002) (Tableau II.3). Des stocks
d’ADN cible et de compétiteur ont été réalisés pour les trois méthodes (Figure II.10, II.11 et
II.12)

Tableau II.3. Présentation des couples d’amorces PCR utilisés pour la cPCR.

117
Chapitre II. 5 Ecologie moléculaire

Figure II.9. Représentation des étapes du protocole de PCR compétitive ciblant le gène amoA. Le
principe est le même pour les PCRc ciblant le genre Nitrobacter et Nitrospira. La description de la
construction de l’ADN compétiteur T4 et de l’ADN cible D3 est décrite en Fifure II.7.

118
Chapitre II. 5 Ecologie moléculaire

Figure II.10. Représentation de la construction des stocks, d’ADN compétiteur et d’ADN cible,
utilisés lors de la PCR compétitive ciblant amoA.

Figure II.11. Représentation de la construction des stocks, d’ADN compétiteur et d’ADN cible,
utilisés lors de la PCR compétitive ciblant le genre Nitrobacter (D’après Berthe et al. 1999).

119
Chapitre II. 5 Ecologie moléculaire

Figure II.12. Représentation de la construction des stocks, d’ADN compétiteur et d’ADN cible,
utilisés lors de la PCR compétitive ciblant le genre Nitrospira.

Jusqu’à présent la diversité des bactéries nitrosantes a souvent été étudiée mais leur
quantification au moyen d’outils moléculaires est plus rare. La PCR compétitive, décrite par
Diviacco et al. (1992), a été utilisée dans quelques études pour quantifier la population
nitrosante, en ciblant soit le gène amoA (Kowalchuk et al. 1999 ; Mendum et al. 1999 ;
Stephen et al. 1999), soit l’ADNr 16S (Mendum et al. 1999 ; Phillips et al. 2000). Nous avons
déjà discuté de l’efficacité des autres méthodes de quantification (cf. partie II.1.2.3) telles que
la technique MPN extrêmement longue et biaisée par la mise en culture dans un milieu
sélectif éloigné des conditions environnementales (Koops & Pommerening-Röser 2001), la
technique FISH demandant une mise au point importante dans le cas d’échantillons
fortement chargés en matières organiques et minérales (Cébron 2001) ou encore
l’immunofluorescence qui a tendance à préférentiellement cibler les bactéries ayant servi au
développement des anticorps (Belser 1979; Abeliovich 1987; Völsch et al. 1990)

L’ADN compétiteur est construit de manière à avoir une séquence la plus proche
possible de celle de l’ADN cible environnemental mais d’une longueur légèrement différente
(± 10%). Les deux ADN étant co-amplifiés, les problèmes de : variations inter-tubes,
contamination par des inhibiteurs de PCR, variations de température… sont largement
éliminés car ils touchent de la même manière l’amplification de l’ADN cible et du
compétiteur. Bjerrum et al. (2002) ont réalisé un test rigoureux pour évaluer l’efficacité de la
méthode de PCRc ciblant amoA. Le but était de vérifier : 1) l’efficacité d’amplification
équivalente entre l’ADN cible et le compétiteur, peu importe la dilution, 2) la spécificité
d’amplification des amorces, 3) la précision, en utilisant des échantillons dont les quantités
de bactéries nitrosantes sont connues, 4) l’applicabilité à différents types d’échantillons tels
que des boues activées, du sol de rizière et du sédiment estuarien, et pour finir 5) la capacité
de la technique à amplifier et quantifier les différents genres bactériens nitrosants. Cette
étude a permis de montrer une efficacité d’amplification identique entre l’ADN cible et le
compétiteur. Ceci confirme les études précédentes montrant qu’une différence de taille
d’environ 10% n’affecterait pas l’efficacité d’amplification (Zimmermann & Mannhalter
1996). Bjerrum et al. (2002) ont montré que le compétiteur peut dans certains cas s’amplifier
jusqu’à 30 fois plus rapidement que l’ADN cible toutefois dans notre étude nous avons utilisé
un stock de compétiteur cloné dans un plasmide selon la méthode de Stephen et al. (1999)
qui évite ce problème. Dans les protocoles de PCRc que nous avons utilisé pour l’ensemble de
nos études, nous avons établi la droite de calibration entre l’ADN cible et le compétiteur en
utilisant toujours la même quantité de compétiteur, seule la concentration de l’ADN cible
varie, nous avons montré que pour une même concentration d’ADN cible et de compétiteur,

120
Chapitre II. 5 Ecologie moléculaire

l’intensité des deux bandes était la même, notre co-amplification est linéaire et le compétiteur
et l’ADN cible s’amplifient avec un rapport 1 :1. Dans notre travail nous avons utilisé des
amorces PCR ciblant le gène amoA, il nous semble que cette approche soit meilleure que celle
décrite récemment utilisant des amorces dites « sélective » ciblant l’ADNr 16S (Mendum et
al. 1999 ; Phillips et al. 2000) puisque nous avons fait nous même l’expérience de la faible
spécificité des amorces ciblant l’ADNr 16S des bactéries nitrosantes, pouvant amplifier l’ADN
appartenant à d’autres bactéries de la sous-classe β-des Protéobactéries mais n’étant pas des
nitrosantes (Cébron et al. 2004). Mendum et al. (1999) confirment cette remarque puisqu’ils
ont montré que les résultats avec l’ADNr 16S étaient plus variables que ceux obtenus en
ciblant amoA et que l’approche 16S tend à sur estimer la taille de la population. Nous avons
ciblé des fragments de l’ADNr 16S lors de la quantification de Nitrobacter et Nitrospira,
toutefois si il existe un biais expérimental lors de cette quantification, il est le même sur les
deux PCRc et les résultats peuvent tout de même être comparés l’un à l’autre. Pour finir cette
méthode à l’avantage d’être rapide peu coûteuse et permet la détection des bactéries pour une
gamme très large de concentrations. Bjerrum et al. (2002) ont pu détecter à peine 30 copies
de amoA dans une PCR correspondant à environ 1000 cellules.g sol-1. Actuellement la
technique « real-time PCR » semble très performante et plus rapide que la PCRc puisqu’elle
ne nécessite pas d’analyse post-PCR (quantification de l’intensité des bandes, construction de
la courbe étalon…), toutefois l’appareillage reste très onéreux et les résultats obtenus soit par
PCRc soit real time PCR sont très comparable. Une étude portant sur la quantification de
Streptococcus mutans a même montré que la real time PCR est plus rapide, autant sensible,
mais moins reproductible que la PCR compétitive (Rupf et al. 2003).

II.5.3. Diversité bactérienne nitrosante

II.5.3.1. Construction de banques de gène amoA – clonage RFLP

La diversité phylogénétique des populations bactériennes nitrosantes a été étudiée

par deux approches complémentaires. Nous avons, dans un premier temps, étudié la
diversité des bactéries nitrosantes en deux sites : à Triel, station à l’aval immédiat des rejets
des effluents d’Achères et à Duclair dans l’estuaire amont où la nitrification potentielle est
souvent maximum. Pour ces deux échantillons de la campagne de septembre 1998, nous
avons construit des banques de gènes amoA par clonage. Une PCR amoA (Rotthauwe et al.,
1997) est effectuée sur l’ADN de chacun des 2 échantillons, les produits de PCR amoA sont
excisé du gel d’agarose, puis purifié avec un kit d’extraction sur gel (Qiagen). Les fragments
de gènes amoA de Triel et Duclair sont ensuite clonés dans des vecteurs plasmidiques
(pCR2.1 vector, TAcloning® kit, Invitrogen). 50 clones de chaque banque sont sélectionnés au
hasard. Les fragments amoA de chacun des clone sont ré-amplifiés par PCR puis digérés par
l’enzyme de restriction MspI (analyse RFLP). Les clones sont regroupés suivant leurs profils
de restriction visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose 2%. Les fragments de gène
amoA de un ou deux clones représentatif de chaque groupe de restriction sont alors
séquencés (Eurogentec) afin d’établir la phylogénie des communautés nitrosantes présentes
en chacun des deux sites d’étude par analyse phylogénétique (Blast, Clustal, Programme
PHYLIP).

II.3.3.2. Electrophorèse en gradient dénaturant DGGE

121
Chapitre II. 5 Ecologie moléculaire

Dans un second temps, nous avons choisi d’étudier la diversité bactérienne nitrosante
au moyen de la technique de DGGE (Muyzer et al. 1993 ; Kowalchuk et al. 1998), à la fois
complémentaire et plus informative que la première. La DGGE a été réalisée au Laboratoire
« Netherlands Institute of Ecology (NIOO-KNAW), Center for Limnology » aux Pays-Bas au
cours de deux séjours de deux semaines, sous la direction du Professeur HJ. Laanbroek.
Entre 16 et 18 échantillons du continnum de la basse Seine et les échantillons d’eau brute et
traitée d’Achères ont été analysés pour les trois campagnes de Juillet 2002, Septembre 2002
et septembre 2003.
Une première PCR est effectuée avec les amorces CTO189F et CTO654R (Kowalchuk
et al., 1997 ; Tableau II.4), permettant l’amplification d’un fragment de 465 pb de l’ADNr16S
spécifique des bactéries nitrosantes de la sous classe β des Protéobactéries. Une nested PCR
est ensuite effectuée sur ces premiers produits de PCR avec les amorces 357F et 518R décrites
par Muyzer et al. (1996) (Tableau II.4). Ces second produits de PCR ayant une longueur de
196 pb, sont alors analysés en DGGE. Cette technique d’électrophorèse permet, grâce à un
gradient dénaturant de polyacrylamide, de séparer des fragments de PCR de même taille
suivant leur séquence (%GC). Ainsi, sans compter la présence d’hétéroduplex et autres biais,
chaque bande visible sur gel correspond à une séquence unique et donc à une espèce
bactérienne. L’ADN est marqué au BET (Bromure d’éthydium) et visualisé aux UV, puis
l’analyse des profils DGGE est effectuée grâce à un analyseur d’image (Quantity One, Bio-
Rad). On visualise alors les profils de chaque échantillon, illustrant, tel un code barre, la
diversité bactérienne nitrosante du site échantillonné. Cette technique a l’avantage d’être
rapide et de permettre ainsi d’analyser beaucoup d’échantillon en même temps.

Les différentes bandes d’ADN sont découpées sur les gels DGGE, une nouvelle nested
PCR et migration DGGE sont réalisées pour vérifier la pureté de nos fragments d’ADN, puis
les différentes bandes sont séquencées. Les séquences partielles d’ADNr16S obtenues à partir
de nos échantillons d’eau de Seine, sont comparées aux séquences disponibles dans les bases
de données afin d’effectuée l’analyse phylogénétique (BlastN, ClustalX, Phylip 3.5) de notre
communauté nitrosante.

Tableau II.4. Présentation des couples d’amorces PCR utilisés pour la DGGE.

122
123
III. RÉSULTATS

124
125
 Chapitre III. Résultats

Ce quatrième chapitre présente l’ensemble des résultats obtenus au cours de cette

thèse, la plupart des résultats sont présentés sous forme d’articles soumis ou déjà publiés en
anglais, toutefois certains résultats encore préliminaires font l’objet de sous parties rédigées
en français. Nous espérons que cette hétérogénéité ne gênera pas trop les lecteurs.
L’étude du processus de nitrification in situ dans la Basse Seine et son estuaire, a été
réalisée lors de campagnes de prélèvements printanières et estivales de 2001 à 2003, mais
aussi au laboratoire en conditions contrôlées afin de comprendre et de définir au mieux les
cinétiques des différentes étapes du processus de nitrification. La basse Seine fortement
anthropisée par les rejets de la station d’épuration d’Achères, représente un site exceptionnel
pour étudier les effets d’une pollution anthropique sur le fonctionnement écologique d’un
fleuve.
Les résultats sont séparés en deux grandes parties, la première (partie III.1) ayant
attrait à l’étude du processus de nitrification au niveau biogéochimique et la seconde (partie
III.2) présentant les études menées pour déterminer la diversité bactérienne nitrosante et
nitratante au sein de la basse Seine et de son estuaire.

126
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

III.1. Étude du Processus de nitrification

Le processus de nitrification sera présenté séparément pour la basse Seine et

l’estuaire.

Nous parlerons d’une part de la nitrification dans la basse Seine, tronçon allant de la
confluence de la Marne et de la Seine incluant l’estuaire amont. Nous tenterons de mettre en
évidence et de comprendre :
- L’influence des apports latéraux naturels et anthropiques sur l’induction du
processus de nitrification in situ et principalement l’impact des apports des effluents
d’Achères sur le fonctionnement écologique de la basse Seine.
- Nous verrons où, quand et comment le processus de nitrification est induit et se
déroule dans la basse Seine. Nous analyserons son importance au niveau du recyclage des
formes inorganiques de l’azote.
- Une partie sera consacrée aux émissions de N2O, au moyen de bilans effectués
avec des donnés récoltées sur une décennie, nous concluons que les processus de nitrification
mais aussi de dénitrification contribueraient à la production de ce gaz à effet de serre.
- Grâce à la mise au point de batchs et de chémostats nitrifiants, nous avons
reproduit au laboratoire, les conditions favorables au processus de nitrification et à l’étape de
nitrification-dénitrifiante, responsable d’une partie des émissions de N2O. A partir de ces
expériences, nous avons établit les paramètres cinétiques de la nitrification-dénitrifiante et
confirmer ceux des étapes de nitrosation et nitratation pour des populations naturelles.
- Enfin, ces paramètres ont été utilisés pour la modélisation du processus de
nitrification dans la basse Seine à l’aide du modèle RIVERSTRAHLER. Nous avons
commencé à tester des scénarios de prospective afin de prévoir les effets d’une amélioration
du traitement des eaux usées parisiennes.

En seconde partie, nous avons mesuré le processus de nitrification au niveau de

l’estuaire aval, dans le bouchon vaseux et le gradient de salinité.

127
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

III.1.1. La nitrification dans la basse Seine

Dans le cadre des programmes PIREN-Seine et Seine aval, le processus de

nitrification est étudié depuis un certain nombre d’années au sein du laboratoire. Cette étape
du cycle de l’azote est d’une importance capitale dans l’écologie des milieux aquatiques, elle
contribue à l’élimination des composés azotés inorganiques du milieu.

III.1.1.1. Rôle des apports latéraux

La majeure partie de l’ammonium de la Seine provient des effluents d’Achères qui

fournissent le substrat nécessaire au processus de nitrification.
Afin de mieux comprendre la dynamique de l’azote dans l’axe Paris-estuaire, nous
avons toutefois mesuré les formes de l’azote et déterminé les activités nitrifiantes potentielles
dans les têtes de bassin amont et dans les principaux affluents.

Apports du Bassin amont

Avant la traversée de Paris, l’eau de la Seine est un mélange des eaux des deux sous-
bassins de la Marne et de la Seine amont. Ces bassins sont principalement marqués par les
activités agricoles et d’élevage qui engendrent des pollutions azotées nombreuses, telles que
les nitrates, lessivés des sols surfertilisés, mais également l’ammonium issu de certains
engrais ammoniacaux, des excréments d’animaux d’élevage et des rejets urbains qui dans les
petites communes rurales sont parfois rejetés directement dans les cours d’eau. Ces apports
d’ammonium semblent consommés par les microorganismes nitrifiants puisque à la
confluence de la Marne et de la Seine (à l’exutoire des deux grands sous-bassins), les
concentrations en ammonium sont relativement faibles (de 0.03 à 0.48 mg N.L-1 pour mai
2002 et mai 2003). Comme le processus de nitrification apparaît très en amont dans les
cours d’eau de tête de bassin, les microorganismes nitrifiants pourraient être apportés par
l’érosion des sols.

Sur une série de sols agricoles, il a été mesuré une activité nitrifiante potentielle
variant entre 0.35 et 1.7 µmol N.h-1.g-1 de sol (Billen et al. 1998). Au cours de notre étude,
nous avons également réalisé des mesures d’activités nitrosantes et nitratantes potentielles
sur des échantillons de sols, prélevés sur des parcelles agricoles du bassin de l’Orgeval
(affluent du Grand Morin, bassin de la Marne) et sur des échantillons de sédiments, prélevés
dans les cours d’eau traversant ces zones rurales (Figure III.1) et recevant les eaux drainées
des champs environnants.

Figure III.1. Bassin de l’Orgeval,

affluent du Grand Morin. Les sites
d’échantillonnage de sol provenant des
parcelles agricoles sont représentés par
des cercles rouges, les cercles bleus
localisent les sites d’échantillonnage de
sédiment dans les cours d’eaux. 1. Ferme
Loge, 2. Ru de Fosse Rognon, 3.
Avenelles et 4. Le theil. ([Link] II.2).

128
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Nous avons détecté des activités plus faibles que celles de Billen et al. (1998b), dans
les sols analysés, les nitrosations et nitratations potentielles sont comprises entre 0.03 et
0.06 µmolN.g-1.h-1, mais cette différence peut être fortuite compte tenu de la ponctualité des
prélèvements. Toutefois dans les sédiments du cours d’eau recevant les eaux drainées des
parcelles agricoles, elles sont plus élevées, de l’ordre de 0.09 à 0.57 µmolN.g MES-1.h-1 pour la
nitrosation et entre 0.09 et 0.18 µmolN.g MES-1.h-1 pour la nitratation (Tableau III.1). Les
activités réelles peuvent être estimées à partir de l’équation de Michaëlis-Menten, les valeurs
calculées comprises entre 4.3 et 137.8 ng N. min-1.g MES-1 (Tableau III.1) sont du même ordre
que celles de Butturini et al. (2000) qui ont mesuré des activités réelles comprises entre 4 et
20 ng N. min-1.g-1 de sédiment (17 à 86 nmol N.h-1.g-1 de sédiment) dans les sédiments de la
rivière La Solana (Espagne). Les activités nitrifiantes ont tendance à augmenter en
s’éloignant des sources des rus, ce qui suggère un développement croissant des populations
bactériennes nitrifiantes.

Tableau III.1. Concentrations en ammonium, nitrite et nitrate et mesures des activités nitrosantes
et nitratantes potentielles des échantillons de sols et de sédiments prélevés dans le bassin de
l’Orgeval.
Les valeurs d’activités nitrosantes et nitratantes réelles ont été calculées d’après l’équation de
Michaëlis-Menten avec des valeurs de KmNH4 = 1 mg L-1 et KmNO2 = 0.03 mg L-1 (valeurs de Brion &
Billen 1998).

Les activités nitrifiantes potentielles assez élevées dans les sédiments, montrent la
présence d’une communauté bactérienne nitrifiante déjà importante en tête de bassin. Dans
les cours d’eau de tête de bassin, les bactéries nitrifiantes sont actives et se développent dans
les sédiments, les biofilms benthiques ou fixées aux macrophytes aquatiques (Belser 1979 ;
Hall 1986 ; Pauer & Auer 2000 ; Teissier & Torre, 2002 ; Féray & Montuelle, 2003). Les
sédiments et biofilms des rivières, lorsqu’ils sont localisés à proximité d’une source de
nutriment, peuvent avoir un pouvoir de rétention de l’azote très important (Pringle et al.
1988). Certains auteurs ont d’ailleurs utilisé des traceurs isotopiques (15N) afin de suivre in
situ dans les sédiments de lacs ou de rivières les flux d’azote au travers de la chaîne
alimentaire (Dodds & Priscu 1990 ; Peterson et al. 1997 ; Hall et al. 1998 ; Dodds et al. 2000).
Les bilans de masse ont montré que entre 12 et 48% du 15N-NH4Cl pouvait être retenu par la
biomasse (nitrifiante et des producteurs primaires) sur de courtes distances (210m d’un
tronçon de rivière) et entre 25 et 30% était exporté vers l’aval sous forme d’azote inorganique
(Dodds et al. 2000 ; Mulholland et al. 2000 ; Tank et al. 2000).
Les particules en suspension, charriées par les rivières, ainsi que les biofilms
périphytiques, arrachés durant les crues (Flipo et al. 2004), assurent le transfert des
communautés bactériennes vers l’aval.
A son arrivée au niveau de l’agglomération parisienne, l’eau de la Seine est donc
potentiellement porteuse de bactéries nitrifiantes plus ou moins en carence nutritionnelle,
mais probablement prêtes à nitrifier dès l’ajout de substrat.

129
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Les rejets urbains et la station d’épuration d’Achères

Les rejets urbains sont souvent source de grandes quantités d’ammonium, celui-ci
étant issu de l’hydrolyse de l’urée et de la dégradation de la matière organique.

En amont de Paris, la Seine reçoit les rejets urbains de petites communes rurales ainsi
que d’agglomérations de taille moyenne. La Seine traverse par exemple la ville de Troyes et
son agglomération, comptant près de 120.000 habitants, dont les eaux usées sont
efficacement traitées et rejetées dans la Seine. Dans la situation actuelle, les teneurs en
ammonium sont en général basses, à 5 km à l’aval de Troyes (à St Lyé), la concentration est
comprise entre 0.25 et 0.5 mg NH4+ L-1 et à 20km à l’aval l’ammonium à quasiment disparu
(0.1 mg NH4+ L-1) (Mouchel et al. 2000). Ces apports urbains ponctuels restent relativement
faibles par rapport au débit du fleuve, la dilution est rapide et l’impact anthropique en aval
est limité.

L’agglomération parisienne, avec ses 8.5 millions d’habitants, rejette des quantités
bien plus importantes d’effluents urbains, ce qui induit une forte anthropisation de la Seine.
Les eaux traitées par les trois stations de Valenton, Colombes et Noisy-le-grand sont
faiblement chargées en ammonium puisqu’elles ont subi une nitrification et dénitrification
(traitement tertiaire). Toutefois, les 3/4 des eaux usées de la capitale, traitées dans la station
d’épuration d’Achères, ne sont aujourd’hui épurées que par traitement secondaire, les eaux
rejetées en Seine sont donc très fortement chargées en ammonium. On notera que le rapport
habitant sur débit d’étiage atteint 18.000 hab.s m-3 à Troyes, alors qu’il est de 60.000 hab.s
m-3 pour l’agglomération parisienne à l’aval de la confluence de l’Oise avec la Seine (Mouchel
et al. 2000).

Des études précédentes, ont permis de montrer la forte potentialité nitrifiante des
eaux brutes et traitées sortant d’Achères (Brion et al. 2000) et sa variabilité saisonnière
(Garnier et al. soumis). Nous avons continué les analyses des effluents bruts et traités
d’Achères, durant chaque campagne de prélèvement au cours des années 2002 et 2003
(Tableau III.2).

Tableau III.2. Concentrations en ammonium, nitrite, nitrate et mesures des activités nitrifiantes,
nitrosantes et nitratantes potentielles dans les échantillons d’eau d’Achères.
L’eau brute (IN) et traitée (OUT) de la station d’épuration d’Achères a été récoltée à plusieurs
reprises au cours des années 2002 et 2003. * : valeurs négatives aberrantes

130
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Ces résultats montrent que les effluents d’Achères sont fortement chargés en
ammonium (entre 21.5 et 45.7 mg N-NH4+.L-1) et ont une concentration en nitrate
relativement faible (de 2.4 à 3.5 mg N-NO3-.L-1) malgré l’absence de traitement tertiaire. Au
sein de la station, il semble y avoir une production nette d’ammonium et une consommation
d’une partie des nitrates (différence entre eau brute et traitée), résultats des processus de
minéralisation de la matière organique et de dénitrification. Il apparaît que les valeurs des
activités nitrifiantes potentielles effectuées sur l’eau brute d’Achères sont souvent aberrantes
(valeurs négatives), il s’agit sûrement des effets de certaines substances, potentiellement
inhibitrices, présentes dans ces échantillons (Svenson et al. 2000). Dans les effluents traités
d’Achères (ceux déversés dans la Seine), on note de fortes activités nitrifiantes potentielles
allant de 0.79 à 2.07 µmol N oxydé.L-1.h-1. Les activités nitrosantes potentielles sont
également relativement élevées, entre 0.15 et 3.68 µmol N oxydé.L-1.h-1 alors que les activités
nitratantes potentielles sont beaucoup plus faibles (0 à 0.4 µmol N oxydé.L-1.h-1). Ce
déséquilibre entre les deux étapes de la nitrification pourrait expliquer les fortes
concentrations en nitrite dans les effluents d’Achères (de 0.07 à 1.36 mg N-NO2-.L-1).

Hétérogénéité de la nitrification à l’aval des rejets d’Achères

Les effluents d’Achères sont déversés dans la Seine, en rive gauche, à un débit moyen
de 23 m3.s-1 (2 millions de [Link]-1) soit environ de 1/20 à 1/5 du débit du fleuve pour les
périodes estivales de 2001 (470 m3.s-1) et 2003 (110 m3.s-1). L’impact des effluents est donc
très visible à l’aval immédiat des rejets et se fait sentir en aval jusque dans l’estuaire.

Figure III.2. Concentrations en ammonium, nitrite et nitrate à l’aval d’Achères.

Les stations Conflans (1 Km à l’aval des rejets d’Achères), Triel (15 Km) et Porcheville (32 Km) ont été
analysées en trois points de prélèvements : rive gauche, centre et rive droite, afin de montrer
l’impact des rejets d’Achères déversés en Seine rive Gauche. Les flèches indiquent le sens du courant.

Un échantillonnage a été réalisé en septembre 2003, à l’aval d’Achères au niveau des

sites de Conflans (station 3 à 1 km en aval des rejets), Triel (station 4 à 15 km en aval des
rejets) et Porcheville (station 5 à 32 km en aval des rejets) pour mettre en évidence l’impact
direct du panache des effluents et montrer l’hétérogénéité existant dans la qualité de l’eau à
l’aval immédiat des rejets (Figure III.2). Nous remarquons qu’à 1 km à l’aval des rejets
d’Achères (Conflans), la teneur en ammonium est très forte en rive gauche atteignant 6.8 mg
N-NH4+ L-1. L’hétérogénéité est très forte entre les trois prélèvements (rive gauche, centre et
rive droite), pour la concentration en ammonium (Figure III.2). Cette hétérogénéité disparaît
vers l’aval avec le mélange des effluents et de l’eau de la Seine. Au niveau de Porcheville (32
km en aval), l’effet d’Achères n’est plus localisé au niveau de la rive gauche, les

131
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

concentrations en nutriments sont homogènes. La même répartition est observée pour les
nitrites, toutefois moins marquée car la concentration en nitrite reste assez faible à la fois
dans les effluents d’Achères et dans la Seine en amont des rejets (Figure III.2). Les nitrates
sont plus faiblement concentrés dans les effluents que dans l’eau de la Seine arrivant de
l’amont et apportant le nitrate lessivé des sols agricoles. Les effluents d’Achères ont donc une
tendance à diluer l’eau de la Seine en rive gauche à la station Conflans, ce phénomène
s’estompant rapidement vers l’aval (Figure III.2).

Des mesures des activités nitrosantes et nitratantes potentielles ont également été
effectuées sur ces mêmes prélèvements (Figure III.3). Les résultats sont en accord avec les
mesures effectuées directement sur les effluents d’Achères. Nous remarquons une
augmentation des activités nitrosantes et nitratantes potentielles à l’aval immédiat des rejets
de la station d’épuration. Si les activités sont plus fortes en rive gauche pour la station de
Conflans, au niveau de Porcheville, l’eau de la Seine s’est homogénéisée et présente des
activités nitrosantes et nitratantes plus homogènes d’une rive à l’autre.

Figure III.3. Activités nitrosantes et nitratantes potentielles à l’aval d’Achères.

Les stations de Conflans (1 Km à l’aval des rejets d’Achères), Triel (15 Km) et Porcheville (32 Km) ont
été analysées en trois points de prélèvements : rive gauche, centre et rive droite, afin de montrer
l’impact des rejets d’Achères déversés en Seine rive Gauche. Les flèches indiquent le sens du courant.

Même si les effets sur la qualité de l’eau (oxygénation) et la communauté piscicole

sont les conséquences les plus visibles des rejets de stations d’épuration, tous les processus
bactériens sont affectés avec des conséquences sur la plupart des cycles biogéochimiques
(Montuelle et al. 1998). Féray & Montuelle (2003) ont étudié expérimentalement l’effet de
différentes concentrations d’effluents riches en ammonium sur les activités nitrifiantes et la
communauté bactérienne et montré, pour chaque condition, des modifications de la relation
nombre de bactéries-activités potentielles entre avant et après introduction des effluents.

132
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Notons tout de même, pour l’interprétation de ces résultats, que dans le tronçon
Conflans-Triel, se jète l’Oise en rive droite et qu’il existe un barrage de navigation (barrage
d’Andrésy), deux contraintes hydrologiques qui pourraient permettre l’homogénéisation des
eaux. Chesterikoff et al. (1991) ont en effet montré que même si le mélange vertical se fait à
peine après 2 km à l’aval des rejets, la Seine n’est transversalement homogène en ce qui
concerne la conductivité qu’après 13km en aval des rejets d’Achères après réception de l’Oise
et action du barrage d’Andrésy.
Les apports latéraux des deux affluents principaux de la basse Seine, l’Oise et l’Eure,
ne doivent donc pas être complètement négligés dans l’interprétation de nos résultats. Les
résultats obtenus sur ces deux rivières, en une seule occasion en mai 2004 sur chacun des
deux affluents en amont de leur confluence avec la Seine, ne conduisant qu’à des ordres de
grandeur (Tableau III.3).

Tableau III.3. Caractéristiques physicochimiques et activités nitrifiantes mesurées dans l’Eure et

l’Oise. Les prélèvements ont été réalisés en mai 2004, au niveau de stations situées juste avant la
confluence de ces rivières avec la Seine. Les valeurs de nitrosation et nitratation sont des valeurs
d’activités potentielles.

Les concentrations en ammonium, nitrite et nitrate semblent du même ordre de

grandeur que celles de la Seine aux sites de confluence. Les deux affluents n’auraient a priori
pas de rôle majeur d’apport ou de dilution des composés azotés inorganiques. Les mesures
d’activités nitrosantes potentielles y sont également du même ordre de grandeur (de 0.018 à
0.035 µmol N oxydé.L-1.h-1), toutefois les activités nitratantes potentielles sont très fortes,
l’Oise ayant une activité nitratante potentielle environ 10 fois plus élevée que la station de
Conflans et l’Eure environ 3 plus plus forte que celle mesurée à la station de Poses.

133
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Conclusion

L’activité nitrifiante apparaît très tôt dès les cours d’eau de tête de bassin. Pourtant les
concentrations en ammonium y sont relativement faibles. La majeure partie de l’ammonium
(substrat de la nitrification) est apportée par les effluents d’Achères qui sont potentiellement
porteurs de microorganismes nitrifiants, puisque les mesures d’activités nitrifiantes
potentielles y sont très élevées. Nous avons mis en évidence une hétérogénéité des masses
d’eau à l’aval des rejets d’Achères. Il serait donc nécessaire d’en tenir compte lors des
prélèvements et de l’interprétation des données des stations situées dans les 30 km à l’aval
des rejets. Les apports de masse d’eau par l’Oise et l’Eure n’auraient pas un impact majeur au
niveau de la nitrification, mais pourraient faire l’objet d’une étude plus approfondie,
notamment pour confirmer les valeurs élevées de nitratation.

Après avoir identifié les différentes sources de substrat et mis en évidence la

potentialité nitrifiante des divers apports arrivant dans la basse Seine, nous nous focaliserons
sur le déroulement du processus de nitrification de notre site d’étude.

134
Figure III.4. Concentrations en ammonium, nitrite, nitrate et oxyde nitreux le long du continuum de la basse Seine. Le continuum s’étend du km 0 (Saint
Maurice, à la confluence de la Marne et de la Seine) jusqu’à Honfleur (Km 356). Les données des campagnes de 2001 (mai et juillet), 2002 (mai, juillet et
septembre) et de 2003 (avril, mai et septembre) sont présentées. La flèche représente les rejets d’Achères.
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

III.1.1.2. Azote et activités nitrifiantes dans la basse Seine

Afin de poursuivre la compréhension de l’activité nitrifiante dans la basse Seine, nous

nous sommes intéressés à l’évolution des concentrations en ammonium, nitrite, nitrate et
oxyde nitreux qui sont, pour certains, les substrats, et pour d’autres, les produits de la
nitrification.
Les données des campagnes de 2001, 2002 et 2003 présentées en Figure III.4 ont été
regroupées sur une même figure afin de montrer la tendance générale observée (Figure III.5).
Ces mesures mettent en évidence l’impact des rejets des effluents d’Achères et permettent de
suivre les concentrations d’azote jusqu’à l’estuaire, pour diverses saisons et conditions
hydrologiques.

Figure III.5. Données compilées des concentrations en ammonium, nitrite et nitrate des campagnes
de 2001 à 2003. Des courbes de tendance générale sont figurées en pointillés pour les trois
nutriments.

A l’aval immédiat d’Achères, nous observons une brusque augmentation de la

concentration en ammonium, avec des valeurs comprises entre 1.5 et 7 mg N-NH4+.L-1 au
niveau de Conflans. L’apport important d’ammonium par la station d’épuration d’Achères est
d’une part, immédiatement dilué par l’eau de la Seine et de l’Oise, puis est ensuite
entièrement consommé dans la basse Seine (Figure III.4 et 5) grâce notamment au processus
de nitrification. Nous pouvons séparer les profils longitudinaux en deux catégories : 1) les
campagnes printanières où les concentrations en ammonium en Seine sont relativement
faibles, les débits de la Seine élevés (cf. Tableau II.1) et où les processus biologiques ne
paraissent pas très actifs (température moyenne de 14.5°C, faibles concentrations en nitrite et
oxyde nitreux) ; 2) les campagnes estivales pour lesquelles les concentrations en ammonium
à l’aval d’Achères sont plus élevées, les débits de la Seine étant plus faibles et les processus
biologiques favorisés par des températures plus élevées (en moyenne 20.5°C).
Les profils printaniers réalisés en avril et mai, ne présentent donc pas de grandes
variations des concentrations en ammonium, nitrite et nitrate le long du continuum à l’aval
des rejets d’Achères par rapport aux campagnes estivales (Figure III.4). Butturini & Sabater
(1998) ont par exemple montré que l’assimilation des nutriments (ammonium et phosphate)
est influencée par la quantité de nutriment et la température dans une rivière du bassin
méditerranéen. L’efficacité du recyclage des nutriments, dans les zones humides suit
également des cycles saisonniers et une diminution de la consommation de l’ammonium

136
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

lorsque la température diminue en hiver peut être observée, effet lié à une réduction des
activités biotiques (Hill & Payton 1998 ; Jing & Lin 2004).
En période estivale, la concentration en ammonium diminue rapidement entre l’aval
immédiat des rejets d’Achères et la station de Porcheville au Km 101 (Figure III.4). Outre son
oxydation en NO2- puis en NO3-, la diminution de la concentration en ammonium peut
s’expliquer par : 1) l’homogénéisation entre l’eau de la Seine et les effluents d’Achères, 2) la
dilution par l’Oise, 3) la consommation de l’ammonium par les bactéries hétérotrophes (plus
compétitives que les bactéries nitrifiantes grâce à l’apport de matière organique rapidement
biodégradable). Plus en aval, nous observons une décroissance plus lente et constante de
l’ammonium grâce à l’action du processus de nitrification. Cette activité est confirmée par
l’accumulation de nitrite et la production de nitrate (Figure III.4 & III.5). La totalité de
l’ammonium est consommée au niveau de l’estuaire amont (environ 230 km à l’aval des rejets
d’Achères) alors que la concentration en nitrite est encore élevée et peut atteindre des valeurs
de 0.3-0.4 mg N-NO2-.L-1. Il apparaît un déséquilibre entre l’activité nitrosante et nitratante,
les nitrites doivent être plus rapidement produits qu’ils ne sont consommés, ce qui conduit à
leur accumulation dans l’eau de la Seine. Dans les rivières anthropisées, il est courant
d’observer ce phénomène d’accumulation de nitrite. Dans la rivière Lahn (Allemagne), la
concentration en nitrite atteint des valeurs similaires à celles de la Seine de 0.4 mg N-NO2-.L-1
(Von Der Wiesche & Wetzel 1998), concentration qui est supérieure au seuil critique défini en
écotoxicologie (> 0.3 mg N-NO2-.L-1, norme de qualité de l’eau). Il semble que cette
accumulation puisse s’expliquer de plusieurs manières, il peut s’agir 1) d’une différence au
niveau des activités spécifiques entre les deux populations fonctionnelles nitrosantes et
nitratantes, 2) d’une sensibilité différente des deux populations fonctionnelles envers la
température, Von Der Wiesche & Wetzel (1998) ont montré que pour des températures
comprises entre 16 et 22°C l’activité de Nitrobacter est plus inhibée que celle de
Nitrosomonas, ou 3) d’une possible limitation par l’oxygène (les bactéries nitrosantes ayant
une affinité plus grande pour l’oxygène que les bactéries nitratantes).

La quantité d’ammonium consommée n’équivaut pas à la quantité de nitrate produite.

Même en considérant la quantité d’azote incorporée par la biomasse bactérienne et en
supposant qu’une partie de l’ammonium peut être utilisée par les bactéries nitrifiantes
autotrophes pour réduire le nitrite en oxyde nitreux (N2O) par nitrification-dénitrifiante, il y
a apparemment une consommation du nitrate au fur et à mesure qu’il se forme. Ce
phénomène s’explique par la présence d’une activité dénitrifiante se déroulant probablement
au niveau des sédiments benthiques anoxiques puisque aucune empreinte isotopique typique
de la dénitrification n’a pu être observée dans la colonne d’eau (Sébilo 2003 ; Sebilo et al.
2003), toutefois des bilans de dénitrification ont montré une consommation du nitrate de
l’ordre de 71.103 kg N.j-1 (cf. publication 1, partie III.1.1.3. Garnier et al. soumis). Ce type de
couplage entre les processus de nitrification et de dénitrification est souvent observé (Kester
et al. 1997a ; Teissier & Torre 2002 ; Sheibley et al. 2003).

Comme pour les autres formes de l’azote, les concentrations en N2O sont plus élevées
durant la période estivale (Figure III.4). Ce gaz à effet de serre peut être produit lors de
plusieurs processus dont nous avons parlé dans le chapitre I et notamment par les processus
de nitrification-dénitrifiante et de dénitrification. Kester et al. (1997a) ont montré par
exemple que la nitrification pouvait être majoritairement responsable de la production de
N2O dans les sédiments de rivière. Par ailleurs, de fortes concentrations en N2O observées
dans des rivières et milieux estuariens fortement anthropisés recevant des apports important
d’azote et subissant des déficits en oxygène, seraient pour partie dû à la nitrification (McElroy
et al. 1978 ; DeWilde & De Bie 2000 ; De Bie et al. 2002).

Les mesures d’activités nitrosantes et nitratantes potentielles réalisées sur les mêmes
échantillons des campagnes de 2002 et 2003 sont séparées en campagnes printanières (mai

137
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

2002 et avril et mai 2003) et estivales (juillet et septembre 2002 et septembre 2003) (Figure
III.6).

Figure III.6. Activités nitrosantes et nitratantes potentielles le long du continuum de la basse Seine.
Données des campagnes printanières (mai 2002, avril et mai 2003) et estivales (juillet et septembre
2002 et septembre 2003). Des courbes de tendance générale sont figurées en pointillés pour les deux
activités.

Pour la majorité des campagnes, il existe un léger pic d’activités nitrifiantes

potentielles à l’aval immédiat des rejets des effluents d’Achères. Cette activité est
évidemment le reflet de l’apport anthropique de microorganismes nitrifiants et d’ammonium
par la station d’épuration, et peut dans certains cas être sous-estimée compte tenu de
l’hétérogénéité des prélèvements pour ces stations à l’aval immédiat d’Achères.

Quelles que soient les saisons, l’activité nitrifiante potentielle est maximale dans la
zone estuarienne où les matières en suspensions augmentent subitement (entre les kms 250
et 350) montrant la présente du bouchon vaseux (Figure III.6). Les microorganismes
nitrifiants ont tendance à s’accrocher aux matières en suspension (Prosser 1989 ; Stehr et
al.1995b).
Au moment des campagnes printanières, le débit étant plus important, le bouchon
vaseux n’étant pas encore formé et la croissance des bactéries étant plus faible, l’activité
nitrifiante est maximale à la station la plus en aval, à l’entrée de la baie de Seine. Les activités
potentielles nitrifiantes les plus élevées sont effectivement observées à Honfleur, où les
matières en suspensions sont les plus concentrées (Figure III.6).
En ce qui concerne les campagnes estivales, nous remarquons un changement
significatif des profils d’activités nitrosantes et nitratantes potentielles (Figure III.6). Les pics
d’activités potentielles apparaissent cette fois au niveau de l’estuaire plus en amont où le
bouchon vaseux s’est formé, le débit d’étiage et la température estivale plus élevée,

138
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

permettent aux populations bactériennes de se développer plus rapidement. On observe un

léger décalage entre les 2 pics : le pic d’activité nitrosante apparaissant plus tôt (Km 278,
station Duclair) que celui d’activité nitratante. Cette observation peut permettre d’expliquer
l’accumulation de nitrite observée jusqu’au Km 300 (Figure III.5), c’est à ce niveau
qu’apparaît le pic de nitratation (Km 300-310, stations Heurtauville et Caudebec) qui reflète
une activité réelle in situ plus élevée en ce site estuarien.

Conclusion

L’ensemble de ces observations et de ces mesures in situ, nous permet de confirmer

l’impact des effluents d’Achères sur le cycle de l’azote dans la basse Seine et notamment de
mettre en évidence la présence d’une activité nitrifiante significative avec un pic d’activité
dans l’estuaire amont.
Nous avons pu mettre en évidence que parmi les apports latéraux, les effluents
d’Achères sont bien ceux qui ont le plus fort impact au niveau de la basse Seine. Toutefois,
même si les effluents de la station contiennent des microorganismes nitrifiants, ces seules
investigations ne permettent pas d’appréhender leur persistance dans le milieu récepteur.
Nous pouvons cependant conclure que l’apport conséquent d’ammonium rejeté dans les
effluents favorise le développement d’une biomasse nitrifiante très active dans la basse Seine
et notamment dans l’estuaire amont.

139
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

III.1.1.3. Émissions de N2O dans la basse Seine

L’analyse de la littérature montre que le processus de nitrification est susceptible de

produire du N2O dans certaines conditions de stress oxique (Blackmer et al. 1980 ; Goreau et
al. 1980 ; Poth & Focht 1985 ; Poth 1986) et que le processus de dénitrification benthique
pourrait également contribuer à la production de ce gaz à effet de serre (King & Nedwell
1987 ; Zumft 1997 ; Garcia-Ruiz et al. 1998 ; Dong et al. 2002).
Nous avons donc cherché à quantifier les émissions estivales de 1997 à 2003 dans la
basse Seine et à établir les bilans de nitrification et de dénitrification dans l’estuaire de 1993 à
2003 pour appréhender la contribution de chacun des processus dans la production de N2O,
et montrer l’évolution de l’impact des rejets d’Achères dans la basse Seine sur une longue
période et pour des situations hydrologiques variées.

Publication 1. Émissions de N2O dans la basse Seine et l’estuaire

RÉSUMÉ
L'estuaire de la Seine (France) reçoit les eaux d'un bassin de drainage caractérisé par
une densité élevée de population, une activité industrielle importante et une agriculture
intensive. Le lessivage et le drainage des sols agricoles du bassin amont sont des sources
diffuses apportant de grandes quantités de nitrate alors que l’ammonium est principalement
apporté par les effluents de la station d’épuration d'Achères (traitant 6.5 millions
d'équivalent-habitants), rejetés dans la Seine en aval de la ville de Paris. L'ammonium est
principalement nitrifié dans l'estuaire et nous avons montré précédemment que la
nitrification était en partie responsable d'un fort déficit en oxygène durant l’été. Les
variations interannuelles des transformations de l'azote (de 1993 à 2003) dans l'estuaire sont
à la fois contrôlées par l'hydrologie et par les quantités d'azote réduit (azote Kjeldahl) et de
matière organique (exprimée par les valeurs de DBO5, demande biologique en oxygène)
apportées par les effluents, tendant à diminuer avec l'amélioration de leur traitement. En
période estivale, les profils longitudinaux moyens des concentrations en oxygène et en azote
pour les deux périodes, de 1993 à 1997 et 1998 à 2003 en conditions hydrologiques sèches (à
l'exclusion de 2000 et de 2001) montrent clairement les changements sur l'estuaire de
l'impact des effluents traités d’Achères.

Sur la base des données quotidiennes des débits de la Seine et des mesures
bimensuelles des concentrations d'azote à la limite amont de l’estuaire d’eau douce (108 km),
nous avons calculé les flux de nitrification et de dénitrification, représentant respectivement
en moyennes annuelles 43 et 71.103 kg de N.j-1 de 1993 à 2003, les valeurs estivales (Juillet-
Septembre) représentent respectivement 73 et 57 % des flux annuels. L’intensité de
dénitrification dans l'estuaire amont semble être étroitement liée à la nitrification, elle-même
étant reliée à la quantité d'azote (Kjeldahl) apportée par les effluents traités d'Achères.
L'émission de N2O attribuable conjointement aux processus de nitrification et de
dénitrification, a été estimée à environ 40 kg N.j-1 dans le même secteur.

140
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Biogeochemistry, soumis le 11/09/04

Nitrous oxide emission in the Seine River estuary

(France): comparison with upstream sector of the Seine
basin

Josette Garnier1, Aurélie Cébron1, Gaëlle Tallec 1,2, Gilles Billen1, Mathieu Sebilo1,3
and Anun Martinez1
1UMR Sisyphe 7619, Fonctionnement des Hydrosystèmes, Université P. & M. Curie-CNRS, Boite 105, Tour 26, Etage 5, 4 place
Jussieu, 75005 Paris, France
2SIAAP / DRD, 82, Av. Kléber, 92700 Colombes, France
3UMR 7618, Biogéochimie isotopique, Université P. & M. Curie – INRA – CNRS, Boite 120, Tour 56, Etage 4, 4 place Jussieu,

75005 Paris, France

ABSTRACT
The Seine River estuary (France) is the receptacle of a drainage basin characterised by
high population density, heavy industrial activity and intensive agriculture. Whereas nitrate
gets its high concentration from diffuse sources in the upstream drainage basin, ammonium
is contributed mainly by the effluents of the Achères wastewater treatment plant (WWTP)
downstream from Paris and its suburbs (6.5 million equivalent-inhabitants). Ammonium is
mostly nitrified in the estuary and nitrification has been proved to be at the origin of a strong
summer oxygen deficit. Year-to-year variations of nitrogen transformations (from 1993 to
2003) in the estuary are controlled both by the hydrology and by the amounts of reduced
nitrogen (Kjeldahl Nitrogen) and organic matter (as BOD5, Biological Oxygen Demand)
brought by the effluents, which tend to decrease with improved treatment. Average
longitudinal summer profiles of oxygen and nitrogen concentrations for two periods, from
1993 to 1997 and 1998 to 2003 in dry hydrological conditions (excluding 2000 and 2001)
clearly show the changes in the impact on the estuary of wastewater from Paris and its
suburbs.

On the basis of daily water flux data and twice monthly nitrogen measurements at the
boundaries of the upstream freshwater estuarine section (108 km), we calculated nitrification
and denitrification fluxes, whose annual averages were respectively 43 and 71 103 kg N d-1
from 1993 to 2003, with summer values (July-September) representing 73 and 57 % of the
annual fluxes respectively. The degree of denitrification in the upper estuary appears to be
closely related to the nitrification, itself more loosely related to the amount of nitrogen
(Kjeldahl) brought by the treated effluents from the Achères WWTP. The N2O emission,
attributable to both nitrification and denitrification, was estimated to about 40 kg N d-1 in the
same sector.

Key-words: Seine freshwater estuary, domestic impact, nitrogen budget, N2O emissions

141
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

INTRODUCTION
The ecological functioning of the Seine estuary is greatly affected by the input of a
large amount of ammonium brought by the treated effluents from Paris and its suburbs
discharged 200 km upstream, which causes a strong summer oxygen deficit due to
nitrification (Garnier et al. 2001). The treatment of the Paris effluents has been considerably
improved in the last 10 years. Whereas the Achères wastewater treatment plant treated 8.5
million inhabitant-equivalents by the activated sludge process at the beginning of the 1990s,
it now treats only 6.5 million inhabitant-equivalents, as the remainder is processed by
tertiary treatment in a newly constructed WWTP (Colombes) and in those of Valenton and
Noisy, where additional capacity has been installed. The implementation of a tertiary
treatment, involving complete nitrification and partial denitrification at the Achères WWTP
is programmed for 2007.

The process of nitrification is known to be at the origin of nitrous oxide production

(N2O) in the environment, particularly at low ambient oxygen tension (Jorgensen et al. 1984;
De Wilde & de Bie 2000). Nitrification in the Seine river and estuary was initially studied by
Chestérikoff et al. (1992) and Brion et al. (2000). Since these initial studies, emission
patterns of N2O have been explored further and we have characterized and quantified the
populations of nitrifying bacteria using molecular methods (Cébron et al. 2003; Cébron et al.
in press). One purpose was to predict the future reduction of both oxygen deficit and N2O
emission in the estuary after the implementation of a tertiary treatment at the Achères
WWTP.

The general concern for N2O emissions arises from the fact that atmospheric N2O contributes
to global warming with a much higher potential than CO2. In addition, although stable in the
trophosphere, the N2O reaches the stratosphere where the NOx by-products of its
photochemical decomposition contribute to the destruction of the ozone layer (Crutzen &
Ehhalt 1977; Bange 2000). Since 1970, it has increased at a rate of 0.2-0.3 % year-1, reaching
the present level of about 313 ppb (Rasmussen & Khalil 1986; Houghton et al. 1996; Garcia-
Ruiz et al. 1998; Bange, 2000). The global rate of N2O emission has increased dramatically in
the last decade by about 2.8 to 4.3 Tg N y-1 (Nevison et al. 1995), with most of the
anthropogenic N2O production being attributed to agricultural activities (Bouwman 1996;
Bouwman et al. 1993).

Denitrification and, to a lesser extent, dissimilatory nitrate reduction are at the origin
of N2O production (Conrad 1996; Kelso et al. 1997). Agricultural soils have long been
considered as typical sites for N2O production, but denitrification also occurs in anoxic water
bodies and at water-sediment interfaces (Dong et al. 2002; De Bie et al. 2002). As microbial
oxidation of NH4+ to NO2- to NO3- provides a link between nitrogen mineralization and
nitrogen loss through denitrification, both nitrification and denitrification have to be
examined to quantify the production of nitrous oxide as an intermediate product (Miller et al.
1993). Nitrogen transformations in the soil are considered to be responsible for 65 % of the
increasing levels of nitrous oxide (N2O) in the atmosphere (Bouwman et al. 1993; Bouwman
1996; Bouwman et al. 2002; IPCC 2000), but estuaries may account for 60 % of total marine
nitrous oxide emissions (Bange et al. 1996).

Whereas N2O transformations in rivers and coastal zones have been related to N
loading at the global scale (Bouwman 1996; Bouwman et al. 2002; Seitzinger & Kroeze 1998)
and at the regional scale of agrosystems, variables such as oxygen, nitrite and pH have been
explored by field and laboratory experiments (Goreau et al. 1980; Anderson & Levine 1986;
de Bie et al. 2002). Besides anoxic denitrification, it is recognized that N2O
production/emission by nitrification is higher at low oxygen concentrations, but recent
studies have shown a non-linear relationship between them (De Bie et al. 2002; Cébron et al.
submitted). Therefore more studies are needed for a better understanding of the factors

142
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

controlling the N2O production, that appears to vary in time and to be dependent on specific
conditions and cases (Mengis et al. 1996; De Bie et al. 2002).

In the upper Seine estuary, denitrification has been demonstrated, from the analysis
of the natural nitrate isotopic composition, to be of low intensity in the water column (Sebilo
2003). On the other hand, nitrification is active enough to deplete oxygen in the Seine
estuary (Garnier et al. 2001). In this study, we therefore established the nitrification and
denitrification budget in the Seine estuary over a long time series in order to i) quantify
nitrogen transformations, ii) analyse the factors controlling N2O in situ emission and iii)
better identify the mechanisms responsible for N2O emission. From a management point of
view, it is essential to identify the optimal conditions for N2O emission, in order to ensure
that these emissions will cease in the river and estuarine environment when the WWTPs are
equipped with a tertiary treatment, and to avoid their transfer from the receiving water
bodies to the WWTPs.

The study of the estuary was carried out from 1993 to 2003, mainly during the
summer when biological activity is at its maximum, during a period with varied hydrological
conditions (wet and dry). Ancillary variables such as concentrations of nitrogen forms and
oxygen, were also analysed at a seasonal scale. In addition, illustrative results obtained in the
Seine river sector, upstream from the estuary, and upstream and downstream of the outlet of
the Paris effluents, are also shown.

STUDY SITE

Figure 1. Map of the investigated sites in lower Seine River and estuary. The sampled stations are
indicated by their km values.

The nitrogen transformations described here occur mainly within the upstream
freshwater estuary. The weir at Poses (km 202, distance from Paris intra muros) represents
the upstream limit of tidal propagation, hence, of the estuary (Figure 1). The freshwater part
extends to Caudebec (km 310), which represents the upstream limit of saline intrusion. This
is a shallow estuary, well mixed vertically. The Seine estuary is hyper-nutrified, receiving
water from the drainage basin of the Seine river (65 000 km²), which is densely populated,

143
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

heavily industrialized and intensively cultivated. As a result of input from the river drainage
basin and from the effluents of the wastewater plants (mainly Achères, treating by activated
sludge the 6.5 million equivalent-inhabitants of Paris and its suburbs), the Seine estuary has
high concentrations of NO3- and NH4+ at its upstream limit (Poses) with strong gradients
downstream.

SAMPLING STRATEGY
Seasonal sampling: Sampling was carried out at twice-monthly intervals, at the
upstream and downstream limits of the tidal freshwater part of the estuary (Poses and
Caudebec respectively), (Figure 1). Besides classical water-quality variables (O2, PO4-, Si, etc),
the various forms of nitrogen were analysed (NO3-, NO2-, NH4+, total organic nitrogen,
Kjeldahl N). The data used here are those from 1993 to 2003, during the period when a
comprehensive scientific programme was launched by the Région Haute Normandie (Seine-
Aval programme). Nitrous oxide (N2O) was also determined seasonally at Poses and
Caudebec in 1998 and 1999.

Longitudinal summer profiles were obtained at 8 stations from Poses to Caudebec for
the same period. On day i, in addition to oxygen, NO3-, NO2-, NH4+, N2O and nitrification
activities were measured from 1997 onwards. In order to better investigate the influence of
the wastewater effluents from the Paris urban area on the estuary, the investigations within
the freshwater estuary were coupled with a sampling programme in the river upstream on
day i-1 (7 stations) and on day i+1 in the saline estuary, influenced by the marine water (2
stations). On day i-1, samples were taken at the surface of the river and the upstream part of
the estuary (km 0 to 250) from bridges with a bucket, (Figure 1). On day i+1, samples were
collected with the flow from a ship, travelling upstream from km 356 to km 251 (Figure 1), 1
m below the surface (with a peristaltic pump). The water was kept in 10 L containers and the
samples conditioned (filtered and frozen or deep frozen, activity measured) in the laboratory
within 2 to 4 hours of the sampling.

MATERIAL AND METHODS

Inorganic nitrogen. Ammonium was measured on filtered water (GF/C 0.45 µm of
porosity) with the indophenol blue method according to Slavyck & McIsaac (1972). Nitrate
was also measured on filtered water, after a cadmium reduction into nitrite, and nitrite was
measured with the sulfanilamide method according to Jones (1984). Nitrite was measured
prior to cadmium reduction.

Nitrous oxide was determined with a gas chromatograph (Perichrom ST 200)

equipped with and electron capture detector. The total N2O emission (kg N d-1) from the
estuary was estimated within various sections with known areas and volumes by multiplying
the aeration coefficient (m s-1) by the area of the compartment and the difference between the
N2O concentration and the concentration at equilibrium with the atmosphere (de Wilde & de
Bie 2000). The latter value was calculated on the basis of a relation using temperature and
salinity (Weiss & Price 1980).

Total organic nitrogen was determined according to the Kjeldahl method (Rodier
1984) by difference between Kjeldahl N and ammonium concentrations.

Nitrifying activity was determined by the H14CO3 incorporation method in the

presence of specific nitrification inhibitors, as described by Brion & Billen (1998). About 125
ml of a water sample are incubated in the dark for 20-24 hours with the radiotracer (0.5 µCi
ml-1) with and without inhibitors (N-serve or =N-Nitrapyrin=2-chloro-6—trichloromethy

144
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

pyridin: 5 mg l-1 dissolved in ethanol 0.02 % ; chlorate: 10 mmole L-1). Subsamples of 10 to 20

ml were filtered in five replicated on 0.2 µm polycarbonate membrane filters. Radioactivity
incorporation was counted by liquid scintillation. The carbon incorporation rate by the
nitrifying bacteria was calculated by difference between non-inhibited and inhibited samples.
The nitrogen oxidation rate was estimated using a conversion factor of +/- 0.11 µmoles of C-
incorporated per µmoles N oxidised (Brion & Billen 1998). As the incubations were carried
out in optimum conditions (oxygen: 6 mg L-1; ammonium saturation: 2 mM; pH: 7-8;
temperature: 20 °C), the values represent potential nitrifying activities.

RESULTS
Changing conditions in the Seine River and estuary

The study was carried out in changing conditions of water fluxes and effluent inputs,
major factors controlling the spatial distribution and intensity of the biological processes in
the lower Seine River (Chestérikoff et al. 1992; Servais & Garnier 1993; Garnier et al. 1995),
(Figure 2a, b).

Figure 2. a) Average annual and summer variations in the water fluxes from 1993 to 2003 (m3 s-1).
b) Mean daily biological oxygen demand (BOD, 5 days, in 103 kg O2 d-1) and Kjeldahl nitrogen (103 kg
N d-1).

Whereas the years 1996 and 2003 were particularly dry, the years 2000 and 2001
were wet (Figure 2a); these differences in the discharge affect the residence time of the water
bodies and the spatial distribution of the processes.

145
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

The treatment of the effluents of Paris and its suburbs was significantly improved
during the period of study, from 1998 onwards. This is evidenced both by the Kjeldahl
nitrogen load (reduction by 10 % on average), which controls nitrification, and by the organic
carbon load (BOD) (reduction by 40 % on average), which controls denitrification (Figure
2b). The Achères wastewater treatment plant (one of the largest in Europe) represents more
than 80 % of the pollution by Paris of the lower Seine River. The recent changes are only part
of a long-term plan of improvements in the Paris wastewater treatment (Billen et al. 2001).

Longitudinal summer profiles of oxygen and nitrogen in the estuary and the lower Seine
River

To obtain a better understanding of the ecological functioning of the freshwater

estuary, we have analysed the longitudinal pattern of oxygen and nitrogen concentrations
along the continuum from the lower Seine upstream of the effluent outlet of the Paris
WWTPs (Figure 3). The typical features of these profiles are (1) a sudden increase in
ammonium, caused by the discharge of wastewater by the Achères treatment plant at km 70,
(2) a limited oxygen drop immediately downstream of this input, and (3) the NH4+
disappearance, concomitant with an NO3- increase, evidence of nitrification, in the Seine
freshwater estuary (from km 200 to 310); a severe oxygen deficit is observed in this area.

Figure 3. Summer longitudinal variations of a) average summer oxygen concentrations (mgO2 l-1)
and b) nitrate and ammonium (mg N l-1) for the dry periods from 1993 to 1997 and from 1998 to
2003, excluding the wet years 2000 and 2001.

The longitudinal profiles, observed in similar summer conditions during the two
periods from 1993 to 1997 and from 1998 to 2003 with different pollution loads, showed
identical patterns; values were therefore averaged and shown with error bars (Figure 3). The
water flow was low for dry summer conditions and averaged 220 m3 s-1 whereas it was more
than 450 m3 s-1 during the wet years of 2000 and 2001, which we considered separately
(profiles not shown here). For both considered periods, the ammonium brought by the Paris
WWTPs (especially Achères) was completely nitrified 200 km downstream in the freshwater
estuary and oxygen depletion was invariably observed in the same estuarine sector (Figure 3).
The fact that the oxygen depletion was less pronounced in the estuary during the recent

146
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

period was obviously due to weaker nitrification because of the decreasing ammonium load.
In addition to the decrease in ammonium input, that of organic matter, led to better
oxygenation immediately downstream of the effluent outlet during the recent period (Figure
3); the role of heterotrophic bacteria in the degradation of organic matter and oxygen
depletion was demonstrated at the beginning of the 1990s when frequent anoxia led to fish
mortality in the summer (Garnier et al. 1991; Garnier et al. 1992; Servais & Garnier 1993).

Figure 4. Summer longitudinal variations of a) average summer potential nitrifying activity (µgN
oxidized l-1) and of b) nitrite (mg N-NO2 l-1) and nitrous oxide (mg N-N2O l-1) for the dry periods from
1993 to 1997 and from 1998 to 2003, excluding the wet years 2000 and 2001. * 1997 only, for nitrous
oxide

Similar profiles are presented for potential nitrification rates, nitrite and N2O
concentrations (Figure 4). Potential nitrification rates do not reflect the effective in situ rate
of the process, but are rather the expression of the nitrifying biomass. Whatever the period,
values were maximum in the estuary, but increased already at the effluent outlet. At the
mouth of the estuary in the turbidity maximum, potential activity was again high; the
longitudinal pattern of potential nitrifying activity thus showed three sectors that were
related to a shift in the bacterial community as supported by DGGE analysis (Cébron et al. in
press). The NO2- longitudinal pattern fitted rather well with that of potential nitrifying
activity. The N2O concentrations were hardly higher in the estuary than in the lower Seine
River downstream of the effluent outlet.

Seasonal variations of oxygen and inorganic nitrogen in the estuary

Owing to the decrease in the pollution load, seasonal variations of NH4+ concentrations at the
upstream and downstream limits of the estuary also showed a clear decrease since 1998,
enhanced by greater dilution during the wet years of 2000 and 2001 (Figure 5). The NO3-
concentrations, originating mainly from diffuse agricultural sources did not follow the same
trend and even tended to increase due to the continuously rising nitrate contamination from
agricultural sources in the Seine watershed (Billen & Garnier 1999; Billen et al. 2001).

147
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Figure 5. Seasonal variations of nitrate (mgN l-1) and ammonium (mg N l-1) at Poses and Caudebec
from 1993 to 2003, the in- and outlet of the freshwater estuary.

Figure 6. Seasonal variations of nitrite (mgN l-1) and oxygen (mg O2 l-1) at Poses and Caudebec
from 1993 to 2003, the in- and outlet of the freshwater estuary.

148
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Particularly striking is the opposite variations between oxygen and nitrite concentrations
(Figure 6). Taking into account the half-saturation constant for oxygen at the two stages of
the nitrification process (Brion & Billen 1998), oxygen depletion would limit the second stage
of nitrification, allowing NO2- accumulation (and possibly an increase in N2O emission). An
inverse relationship between NO2- and O2 was clearly shown by selecting the summer data, in
the estuary as well as in the corresponding data set upstream of the WWTPs and downstream
of the Paris effluent outlet, where NO2- increased as soon as the oxygen was depleted to 2 mg
l-1 (Figure 7a). A similar relationship was found between N2O and O2 concentrations, i.e. an
increase in N2O concentrations at low oxygen (and high NO2-) concentrations (Figure 7b).
Unfortunately, in situ observations did not give any insight into NO2- and N2O behaviour in
the range of 0 to 2 mg O2 l-1 and were therefore explored experimentally (Cébron et al.
submitted).

Figure 7. Relationships between a) summer values nitrite (mgN-NO2 l-1) and oxygen (mg O2 l-1), b)
summer values of nitrous oxide (µgN-N2O l-1) and oxygen (mg O2 l-1). Poses – Caudebec represent the
freshwater estuary; Saint Maurice - Maisons Laffitte represent the lower Seine upstream the effluent
outlet; Effluent Impact is the measures from station downstream the effluent outlet.

Nitrification and denitrification in the Seine freshwater estuary

The measurements of the nitrogen forms at twice-monthly intervals and of daily water
fluxes led to the calculation of the N fluxes at the boundaries of the freshwater estuary with
the procedure described by Verhoff et al. (1980) and recommended by Walling & Webb
(1985), and commonly used for the Seine (Meybeck et al. 1998; Némery et al. 2004).
N flux = Σ (CiQi). Qm/ ΣQi
Ci = instantaneous concentrations
Qi= corresponding instantaneous water flux
Qm= mean water flux for the period considered (annual or summer)
Nitrification and denitrification (103 kg N d-1) were calculated by subtracting the
output (the fluxes at the downstream boundary) from the inputs represented by the sum of
the concerned N fluxes i) at the upstream boundary, ii) at the outlet of the major tributary
(the Eure River), iii) and those by lateral point sources (Tables 1 & 2). All fluxes (103 kg N d-1),
were calculated as annual and summer (July to September) averages.
The estimate of nitrification flux is given by the output-input of reduced nitrogen
forms (Kjeldahl N). Denitrification was determined by the difference between input-output of
total nitrogen (sum of inorganic and organic N). We compared the results of denitrification
with those obtained by difference between the total inorganic N output plus nitrification. An
average variation coefficient of 3 % and 6 % was found between the two methods for summer
and yearly estimates respectively.

149
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Depending on the years, the range of summer nitrification varied from 55 103 kg N d-1 to 16
103 kg N d-1 (Table 1), and represented on average 73 % of the annual value (Table 1). More
than half the N-NH4 flux brought by the Achères treatment plant was nitrified in the estuary,
and nitrification fluxes within the estuary appeared to be linearly oriented with the Kjeldahl
N discharged with the Achères effluents (Figure 8a). Summer denitrification ranged from 61
to 27 103 kg N d-1 from 1993 to 2003 and represented on average 57 % of the yearly
denitrification (Table 2). It is however interesting to note that denitrification and nitrification
are significantly positively related (Figure 8b).

Figure 8. a) Relationships between averaged summer values of nitrification (103 kgN d-1) and
nitrogen load from the Achères effluents (103 kgN d-1). b) Relationships between averaged summer
values of denitrification (103 kgN d-1) and nitrification fluxes (103 kgN d-1).

Nitrous oxide fluxes in the Seine freshwater estuary

The saturation concentration of atmospheric N2O in Seine water is easily calculated

from water temperature and salinity, using the equations of Weiss and Price (1980). For an
atmospheric concentration of 0.3 ppm, saturation in freshwater is between 0.48 and 0.24
µgN-N2O.L-1 in the temperature range from 0 to 20°C. Dissolved N2O concentration above
these values, indicates over-saturation, hence emission of nitrous oxide from the water
column to the atmosphere across the air-water interface. To calculate the magnitude of this
emission flux (in terms of mgN-N2O.m-2.h), the difference between the measured N2O
concentration and the saturation value has to be multiplied by a gas transfer velocity. The
latter is identical to the reaeration coefficient, which has been estimated, for the different
sectors of the Seine river estuary, from the analysis of the oxygen budget (Garnier et al.
2001), yielding coefficients in the range of 0.02 to 0.06 m.h-1, in good agreement with the
estimates made by Thibodeaux et al. (1994) for the fluvial part of the Seine River (0.02 to
0.07 m.h-1) and with the mean annual transfer velocity of 0.067 m.h-1 calculated by Law et al.
(1992) for the Tamar estuary.

150
 Table 1. Budget of Nitrification (103 kgN d-1) in the freshwater Seine Estuary, from 1993 to 2003, averaged annual values (year) and summer values
(Sum). Fluxes of Kjeldahl Nitrogen: inputs are represented by the sum of the fluxes at the estuarine upstream boundary (Poses), of the Eure, a main
tributary within the sector and the lateral inputs (domestic effluents within the sector); outputs are represented by the fluxes at the estuarine downstream
boundary (Caudebec)

Table 2. Budget of denitrification (103 kgN d-1) in the freshwater Seine Estuary, from 1993 to 2003, averaged annual values (year) and summer values
(Sum). Fluxes of total nitrogen (sum of inorganic and organic N): inputs are represented by the sum of the fluxes at the estuarine upstream boundary
(Poses), of the Eure, a main tributary within the sector and the lateral inputs (domestic effluents within the sector); outputs are represented by the fluxes at
the estuarine downstream boundary (Caudebec)
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Summer N2O emission to the atmosphere (kg N d-1) for the same estuarine sector
(Poses-Caudebec, km 202-310) was calculated from the concentrations measured in the
water at the 8 stations (see Figure 1 and Table 3). The variations were small from 1997 to
2003, from 30 to 40 kg N d-1, representing less than 10/00 of nitrification or denitrification for
the same sector. For comparison with the lower Seine sectors upstream from the estuary
(downstream of the effluent outlet: km 50-202; upstream of the effluent outlet: km 0-50),
emission values, given per m-2, averaged 2.7 mg N m-2 d-1 in the estuary against 2.2 mg N m-2
d-1 in the lower Seine and 1.2 mg N m-2 d-1 in the river upstream of the Paris WWTPs (Table
3). This pattern, i.e. maximum summer values increasing from upstream to downstream, was
confirmed by the annual variations in N2O concentrations at various stations in the lower
Seine River (Figure 9).

Table 3. N20 emission (kgN d-1) within the freshwater Seine estuary (Poses-Caudebec: km 202-310)
from 1997 to 2003, given as averaged summer values. See text for estimates. Emissions are within
the downstream lower Seine sector, from downstream of the Paris effluent outlet to Poses (km 50-
202), and the Seine upstream of the effluent outlet (km 0-50) are given for comparison.

Figure 9. Annual variations of nitrous

oxide concentration (µg N-N2O l-1) a) at
Poses and Caudebec, the in- and outlet of
the freshwater estuary. Seasonal
variations of values b) upstream (ML:
Maisons Laffitte) and downstream the
effluents, and c) in the Marne sub-basin,
are shown for comparison. The line of the
variation in N2O concentrations at
saturation is drawn according to Weiss &
Price (1980), taking into account the
temperature.

153
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

No relationship was found between N2O concentrations and nitrification or

denitrification, probably because no N2O data were available for the period from 1993 to
1996, when the wastewater treatment was improved, and nitrification and denitrification
tended to decrease (see Figures 2 and 5). However, an inverse relationship was found
between N2O concentrations and water flux (Figure 10).

Figure 10. Relationships between summer

values of nitrous oxide emissions (kgN-N2O d-
1) and corresponding mean summer water

fluxes (m3 s-1). The relationships for smaller

scale of water flux values is given for
comparison.

DISCUSSION
Improvement of the oxygenation conditions in the lower Seine River and the upper estuary.

A continuous improvement of wastewater treatment was observed over a much longer

period than the one analysed in this paper (see Billen et al. 2001 for a 50-year reconstruction
of the Seine ecological functioning). The profiles shown in Figure 11, help to understand those
of Figure 3 with a longer time period.
Whereas all the Paris domestic wastewater did not arrive at the Achères WWTP
during the period 1969-1971, creating anoxia in the Paris sector itself, collection without
complete treatment from 1973 to 1978 led to such an oxygen deficit that nitrification was far
from completed in the freshwater estuary where denitrification occurred in the water column.
Figure 11 clearly shows the various steps in the improvement of wastewater treatment,
involving first organic matter treatment, then reduction of the ammonium loading. The
decrease in NH4+ inputs from the Achères WWTP has reduced the oxygen deficit in the
freshwater estuary in recent times. Simultaneously, the improvement of the effluent
treatments in terms of BOD5 (and suspended matter, data not shown) has contributed to
reduce the oxygen deficit immediately downstream of the effluent outlet. Given the already
observed improvement in oxygenation, and the implementation of a planned tertiary
treatment of all the effluents from Paris and its suburbs, we can expect a summer recovery of
the oxygenation all along the upstream-downstream continuum which would attenuate the
river discontinuity, linked to the discharge of the Paris effluents.

154
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Figure 11. Summer longitudinal variations of a) average summer oxygen concentrations (mgO2 l-1)
and b) nitrate and ammonium (mg N l-1) for the dry periods 1969-1971, 1973-1978 and 1989-1992.

Budget of nitrification, denitrification and nitrous oxide emission in the freshwater estuary

Whereas chemical analyses show a variation of less than 5 % on nutrient values,

estimates of the water flux vary within about 5 % to 15 %. Regarding the lateral input (treated
domestic effluents) along the sector, a range of 10 to 15 % also seems reasonable. Overall, the
budget fluxes are given with a maximum variation of 30 %. Year-to-year changes should be
interpreted with this limitation in mind.
The budget calculations carried out in the freshwater estuarine sector showed that
nitrification and denitrification fluxes are of the same order of magnitude (Tables 1 & 2).
Nitrification occurred mainly during the three summer months whereas the period of
denitrification was longer. Previous work with the natural isotopic composition of nitrates
has demonstrated that no significant denitrification occurred in the water column of this
estuarine sector (Sebilo, 2003). However, the method does not exclude the possibility of
benthic denitrification (Sebilo et al. 2003). Actually, direct measurements of the benthic
nitrate flux through the water sediment interface allowed Chesterikoff et al. (1992) to
estimate a benthic denitrification of at least 3 103 kgN d-1 in the riverine sector downstream of
the Achères outlet.
The positive relationship between the summer level of nitrification and denitrification
throughout the 11 years, and the similarity of the absolute values of the corresponding
nitrogen fluxes (Tables 1 & 2) should not lead to the conclusion that nitrate produced by
nitrification was reduced by denitrification; nitrate, from diffuse agricultural sources
upstream in the basin, is never limiting for denitrification. The relationship should rather be
interpreted by the improvement of the summer conditions of oxygenation due to the
reduction in organic matter loading, which reduce denitrification, while, in parallel, the
reduction in ammonium loading results in decreasing nitrification.

155
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

N2O emission fluxes in the freshwater estuary (Table 3) amounted to less than 10/00 of
both denitrification and nitrification fluxes.

Mechanisms and control factors of N2O emission

N2O can be produced by nitrification in a narrow range of low oxygenation, provided

that NO2 is available (Ritchie & Nicholas 1972; Goreau et al. 1980; Jorgensen et al. 1984;
Bock et al. 1995; Cébron et al. submitted). N2O is also known as a by-product of
denitrification or dissimilatory nitrate reduction (Conrad 1996; Kelso et al. 1997). Which
mechanism (nitrification and/or denitrification) is responsible for the N2O production
observed in the lower Seine River and estuary, is a question that requires further
investigations.

As observed in the Scheldt estuary (De Bie et al. 2002), N2O and oxygen clearly
appear inversely related, in the range of values found in the Seine estuary (2 to 9 mg O2 l-1, i.e.
64 to 290 µmol l-1) (Figure 7).
N2O concentrations in the Seine estuary were much lower than those in the Scheldt
(8 against 3 µgN l-1 respectively at maximum), just as the ammonium concentration that
differed in the same ratio (4 against 2 mgN l-1 respectively at maximum). This result supports
the assumption by Seitzinger & Kroeze (1998), of a direct connection between the input of
DIN (Dissolved Inorganic Nitrogen) to rivers and the output of N2O gas. These results also
support the findings by McMahon & Dennehy (1999) on the South Platte River (Colorado)
that systems enriched in N by wastewater effluents are an important anthropogenic source of
N2O to the atmosphere. The lower Seine River and estuary -with a concentration above 4
mgN-NO3 l-1 (300 µM) and a N2O emission of 0.54 gN m-² y-1- have values in the higher range
of those reported for 7 rivers and estuaries (Cole & Caraco 2001). These emissions to the
atmosphere are of the same order of magnitude as the highest N2O emissions reported for
eutrophic lake water (Mengis et al. 1996).
Both nitrite and nitrous oxide concentrations in the water clearly depend on the
oxygenation level: values increase at 2 mg O2 l-1 (see Figure 7); the N2O values apparently
increased less than those of NO2, probably due to its escape to the atmosphere when the
water was supersaturated. However, a scatter of data points demonstrated the complexity of
the factors controlling the NO2- and N2O in the water. Because concentrations in the treated
effluents were low (0 to 1 µg l-1 N-N2O), the N2O present in the river must have been
produced in situ, although the oxygen concentrations in the water were high enough. The
N2O production might be due to denitrification occurring below the sediment-water
interface, or even at microsites in suspended aggregates or fluid mud (Bonin & Raymond
1990; Bianchi et al. 1994; Abril et al. 2000; Middelburg et al. 1995; Bonin et al. 2001).
It is a priori surprising to find higher NO2- and N2O concentrations at Poses, the
upstream limit of the estuary, than at the downstream limit at Caudebec in similar
oxygenation conditions. This may have several explanations. The first one would be
ammonium limitation at Caudebec where more intermediate products are consumed than
produced whereas at Poses conditions for nitrification were non-limiting. This would argue in
favour of nitrification as the predominant mechanism of N2O emission in the estuary.
Another hypothesis would be a greater accumulation of biodegradable organic matter at
Poses, which is the limit between the river and the upstream estuary, where the algal
development is generally highest in the summer (Garnier et al. 2001); heterotrophic
respiration of organic matter would deplete the oxygen in the bottom sediment layer; in this
case, denitrification would be at the origin of teh high NO2- and N2O concentrations.

Nitrification appears to be the dominant process at the origin of the N2O emissions
within the freshwater estuary but, denitrification at the anoxic water-sediment interface is
the source of the N2O emissions in the river immediately downstream of the effluent outlet.
The resulting longitudinal pattern of N2O concentrations in the lower Seine and the

156
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

freshwater estuary is therefore a composite one: first, the N2O is produced predominantly by
denitrification and later by nitrification, but the two processes may interfere with each other.

The significance of estuarine N2O emission

Like many estuarine systems receiving high anthropogenic nutrient inputs, the
conditions in the lower Seine River and estuary are ideal both for denitrification at the
sediment-water interface and for nitrification in the well-oxygenated water column, and
consequently likely to contribute significantly to the N2O emissions to the atmosphere (Bange
et al. 1996; De Wilde & De Bie 2000).

According to our estimates, the N2O emission in the upper Seine estuary amounted to
40 kg N d-1 (Table 3). By adding the contributions of the fluvial riverine sectors, upstream
and downstream of the Paris effluent discharge, a total emission of 120 kg N- N2O d-1 was
obtained for the investigated fluvial-estuarine continuum. If we extrapolate the observed
emission rates, namely 1.2 to 2.2 mg N-N2O m-2 d-1, to the whole surface of the Seine drainage
network (310 106 m², Guerrini et al. 1998) a daily emission rate of 370 to 680 kg N-N2O is
obtained for the whole river system across the air-river interface. Although we lack direct
measurements of N2O concentrations in small rivers and streams to completely justify this
extrapolation, it would indicate that 20 –30% of total N2O emissions by the whole river
system occur in its fluvial-estuarine part.

Most global climate scenarios consider that the major part of anthropogenic N2O
emissions is related to agricultural activities and represents, on average 1.25% (range 0.25-
2.25%) of the total nitrogen content of applied organic and mineral fertilizers (IPCC, 2000).
Of this, one third is assumed to occur as direct emission from agricultural soil, one third is
linked to animal waste management, and one third is due to indirect N2O emissions through
ammonium and nitrate losses (IPCC, 2000). Our data on the Seine can be compared to these
general numbers.
The nitrogen fertilizers used in the Seine watershed (75 000 km²) amount to 770 106
kgN yr-1, mostly (75%) of inorganic fertilizers, as animal farming in the Seine basin is
restricted to the peripheral areas. Direct measurements of N2O emission from representative
cultivated soil, fertilized at a rate of 200 [Link]-1, have revealed mean annual emission
rates of 0.4-0.8 kgN-N2O. [Link]-1 (data cited by Khalil, 2003). This would represent the
direct emission from agricultural soils themselves, and falls within the range of 0.2 to 0.4 %
of the used fertilizer. One can then propose the range of 1500 - 3000 103 kgN-N2O yr-1 (0.2-
0.4% of 770 106 kgN yr-1) for the total direct emission of N2O from agricultural soils in the
Seine watershed. The emission from animal waste management should be much lower
because the agriculture in the Seine watershed specializes mostly in cereal and industrial
crops. The above estimate of the ‘indirect’ emission from the river network represents an
annual flux of 135-250 kgN-N2O yr-1, i.e. about 10% of the direct emission from agricultural
soils.

However, several authors have stressed the role of estuaries in the global oceanic N2O
emission. Thus, Bange et al. (1996) noted that the emission flux from the world oceans
estimated by Nevison et al. (1995) (4 (1.2-6.8) Tg N-N2O y-1) reaches 7-11 Tg N-N2O y-1 when
coastal waters and estuaries are included. Considering the total area covered by estuaries (1.4
1012 m², Whittaker & Likens 1975) and an N2O production of about 1 g m-2 N y-1 found in the
Seine estuary, the annual emission would reach about 1.4 Tg N-N2O y-1, at least twice as high
as the range (0.06-0.7 Tg N-N2O y-1) proposed by Seitzinger & Kroeze (1998) or calculated by
De Wilde & De Bie (2000) on the basis of their data from the Scheldt (0.95 Tg N-N2O y-1).

157
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Acknowledgments
This work was undertaken in the framework of the programmes Seine-Aval, funded by
the Région Haute-Normandie and the Agence de l’Eau Seine-Normandie (AESN), and the
PIREN-Seine funded by the CNRS and several institutions involved in the water management
of the Seine River, including AESN. We are grateful to Dr. L.A. Romana, director of the
programme Seine-Aval for his helpful questions and suggestions during the study and to the
Service de la Navigation de la Seine (SNS), for routine measurements complementary to
those we gathered during the study. Mr André Ficht (from the SNS) is particularly
acknowledged for his help on the field.

REFERENCES
Abril G, Riou SA, Etcheber H, Frankinioulle M, De Witt R & Middelburg JJ. 2000. Transient, tidal
time-scale, nitrogen transformations in an estuarine turbidity maximum-fluid mud system (The Gironde,
South West France). Estuar. Coast. Schelf. Sci., 50:703-715
Anderson IC & Levine JS (1986) Relative rates of nitric oxide and nitrous oxide production by nitrifiers,
denitrifiers and nitrate respirers. Appl. Environ. Microb., 51:938-945
Bange WH, Rapsomanikis S & Andreae MO. 1996. Nitrous oxide in coastal waters. Global Biogeochemical
Cycles, 10:197-207
Bange WH. 2000. It’s not a gas. Nature, 408:301-302
Bianchi M, Bonin P & Feliatra 1994. Bacterial nitrification and denitrification rates in the Rhône River Plume
(Northwestern Mediterranean Sea). Mar. Ecol. Prog. Ser., 103:197-202
Billen G & Garnier J. 1999. Nitrogen transfers through the Seine drainage network: a budget based on the
application of the Riverstrahler model. Hydrobiologia, 410:139-150
Billen G, Garnier J, Ficht A & Cun C. 2001. Modelling the response of water quality in the Seine Estuary to
human activity in its watershed over the last 50 years. Estuaries, 24(6):977-993
Bock E, Schmidt I, Stüven R & Zart D. 1995. Nitrogen loss caused by denitrifying Nitrosomonas cells using
ammonium or hydrogen as electron donors and nitrite as electron acceptor. Arch. Microbiol. 163:16-20
Bonin P & Raymond N. 1990. Effect of oxygen on denitrification in marine sediment. Hydrobiologia, 207:115-
122
Bonin P, Tamburini Ch, Michotey V. 2001. Determination of the bacterial processes which are sources of
nitrous oxide production in marine samples. Water Research, 0:1-11
Bouwman AF. 1996. Direct emission of nitrous oxide from agricultural soils. Nutr. Cycling Agroecosyst., 46:53-
70
Bouwman AF, Fung I, Matthews E & John J. 1993. Global analysis of the potential for N2O production in
natural soils. Global Biogeochem. Cycles, 7:557-597
Bouwman AF, Boumans JM, Batjes NH. 2002. Emissions of N2O and NO from fertilied fields : Summary of
available measurement data. Global Biogeochem. Cycles, 16(4):6/1-6/12
Brion N & Billen G. 1998. Une réévaluation de la méthode d’incorporation de H14CO3- pour mesurer la
nitrification autotrophe et son application pour estimer des biomasses de bactéries nitrifiantes. Rev. Sci.
Eau, 11:283-302
Brion N, Billen G, Guézennec L & Ficht A. 2000. Distribution of nitrifying activity in the Seine river
(France) from Paris to the estuary. Estuaries, 23:669-682
Cébron A, Berthe T & Garnier J. 2003. Nitrification and nitrifying bacteria in the lower Seine River and
estuary. Appl. Environ. Microbiol., 69:7091-7100
Cébron A, Coci M, Garnier J & Laanbroek HJ. 2004. DGGE analysis of the Ammonia Oxidizing Bacterial
Community structure in the lower Seine River: impact of the Paris wastewater effluents. Appl. Environ.
Microbil. (in press)
Cébron A, Garnier J & Billen G. (submitted) Nitrous oxide production and nitrification kinetics by bacteria
communities naturally present in river water (the lower Seine, France)
Chesterikoff A, Garban B, Billen G & Poulin M. 1992. Inorganic nitrogen dynamics in the River Seine
downstream from Paris. Biogeochemistry, 17: 147-164
Cole JJ & Caraco NF. (2001.) Emissions of nitrous oxide (N2O) from tidal, freshwater river, the Hudson River,
New York. Environ. Sci. Tech., 35:991-995
Conrad R. 1996. Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4, OCS, N2O and
NO). Microbiol. Rev., 60:609-640
Crutzen PJ & Ehhalt DH. 1977. Effects of nitrogen fertilizers and combustion on the stratospheric ozone layer.
Ambio, 6:112-117
De Bie MJM, Middelburg JJ, Starink M & Laanbroek HJ. 2002. Factors controlling nitrous oxide at the
microbial community and estuarine scale. Mar. Ecol. Prog. Ser., 240:1-9
De Wilde HPJ & De Bie M. 2000. Nitrous oxide in the Scheldt estuary: production by nitrification and
emission to the atmosphere. Mar. Chem., 69: 203-216

158
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Dong LF, Nedwell DB, Underwood GJC, Thornton DCO & Rusmana I. 2002. Nitrous oxide formation in
the Colne estuary, England: the central role of nitrite. Appl. Environ. Microbiol., 40: 526-532
Garcia-Ruiz R, Pattinson SN & Whitton BA. 1998. Kinetic parameters of denitrification in a river
continuum. Appl. Environ. Microb., 64: 2533-2538.
Garnier J, Servais P & Billen G. 1991. Bacterioplankton in the Seine River: impact of the parisian urban
effluents. Can. J. Microbiol., 38: 56-64
Garnier J, Billen G & Servais S. 1992. Physiological characteristics and ecological role of small and large sized
bacteria in a polluted river (Seine river, France). Archiv. Hydrobiol. Ergebn. Limnol. 37:83-94
Garnier J, Billen G & Coste M. 1995. Seasonal succession of diatoms and Chlorophyceae in the drainage
network of the river Seine: Observations and modelling. Limnol. Oceanogr. 40: 750-765
Garnier J, Servais P, Billen G, Akopian M & Brion N. 2001. The oxygen budget in the Seine estuary:
balance between photosynthesis and degradation of organic matter. Estuaries 24(6):964-977
Goreau TJ, Kaplan WA, Wofsy JC, Ms Eloy MB, Valois FW & Watson SW. 1980. Production of NO2-
and N2O by nitrifying bacteria at reduced concentrations of oxygen. Appl. Environ. Microbiol., 40:526-
532
Guerrini M-C, Mouchel J-M, Meybeck M, Penven M J, Hubert G & Muxard T (1998) Le bassin de la
Seine : la confrontation du rural et de l’urbain. Chapitre 1. In: La Seine en son bassin. Fonctionnement
écologique d’un système fluvial anthropisé (Meybeck M., De Marsily G & Fustec F. eds). Elsevier, Paris. p
29-75
Houghton JT, Meira Filho LG, Callander BA Harris N, Kattenberg A & Maskell K (Eds) (1996)
Climate change 1995. The Science of Published for Intergouvernmental panel on climate change,
Cambridge Univ. Press. pp 1-572
Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) (2000) Special report on Emissions Scenarios.
Cambridge Univ. Press, 599 pp
Jones MN. 1984. Nitrate reduction by shaking with cadmium, alternative to cadmium columns. Water Res.
18:643-646
Jorgensen KS, Jensen HB & Sorensen J. 1984. Nitrous oxide production from nitrification and
denitrification in marine sediment at low oxygen concentration. Can. J. Microbiol., 30:1073-1078
Kelso BHL, Smith RV, Laughtlin RJ & Lennox D. 1997. Dissimilatory nitrate reduction in anaerobic
sediments leading to nitrite accumulation. Appl. Environ. Microb., 63:4679-4685
Khalil K. 2003. Emissions de N2O par nitrification et dénitrification à l’échelle de la motte de sol: effet de la
structure du sol, de l’aération et des activités microbiennes. Ph-D Univ. Pierre & Marie Curie, 223 pp
Law CS, Rees AP & Owens NJP. 1992. Nitrous oxide: Estuarine Sources and atmospheric flux. Estuar. Coast.
Shelf Sci., 35:301-314
Mengis M, Gächter R & Wehrli B. 1996. Nitrous oxide emissions to the atmosphere from artificially
oxygenated lake. Limnol. Oceanogr., 41: 548-553
Meybeck M, Mouchel J-M, Idlafkih Z, Andréassian V & Thibert S. 1998. Transfert d’eau, de matière
dissoute et particulaire dans le réseau fluvial. Chapitre 8. In: La Seine en son bassin. Fonctionnement
écologique d’un système fluvial anthropisé (Meybeck M., De Marsily G & Fustec F. eds). Elsevier, Paris.
pp 345-387
Middelburg JJ, Klaver G, Nieuwenhuize J, Markusse RM, Vlug T & Van der Nat FJWA. 1995. Nitrous
oxide emissions from estuarine interdidal sediment. Hydrobiologia, 311: 43-55
Miller LG, Coutlakis MD, Oremland RS & Ward BB. 1993. Selective inhibition of ammonium oxidation
and nitrification-linked N2O formation by methyl fluoride and dimethyl ether. Appl. Environ. Microbiol.,
59:2457-2464
McMahon PB & Dennehy KF. 1999. N2O emissions from a Nitrogen-enriched River. Environ. Sci. Technol,
32: 21-25.
Némery J, Garnier J & Morel C. 2004. Phosphorus budget in the Marne watershed (France): urban vs.
diffuse sources, dissolved vs. particulate forms. Biogeochemistry (in press)
Nevison CD, Weiss RF & Erickson DJ. 1995. Global oceanic emissions of nitrous oxide. J. Geophysical Res.
100: 809-820
Rasmussen RA & Khalil MAJ. 1986. Atmospheric trace gases : trends and distribution over the last decade.
Science, 232: 1623-1624
Ritchie G A & Nicholas D J. 1972. Identification of the sources of nitrous oxide produced by oxidative and
reductive processes in Nitrosomonas europaea. Biochem J. 126: 1181-1191
Rodier J. 1984. L'analyse de l'eau. 7ème édition. Dunod, Paris (Ed). 1365 pp
Sebilo M. 2003. Utilisation du traçage isotopique naturel pour caractériser et quantifier les processus de
nitrification et dénitrification à l’échelle du réseau hydrographique de la Seine. Thèse Doct. Univ. Paris 6,
124pp
Sebilo M, Billen G, Grably M & Mariotti A. 2003. Isotopic composition of nitrate-nitrogen as a marker of
riparian and benthic denitrification at the scale of the whole Seine River system. Biogeochemistry, 63:
35-51
Slavyck G & McIsaac JJ. 1972. Comparison of two automated ammonium methods in a region of coastal
upwelling. Deep Sea Res. 19: 1-4
Seitzinger SP & Kroeze C. 1998. Global distribution of nitrous oxide production and N inputs in freshwater
and coastal ecosystems. Global Biochem. Cycles, 12: 93-113
Servais P & Garnier J. 1993. Contribution of heterotrophic bacterial production to the carbon budget of the
River Seine (France). Microb. Ecol., 25:19-33

159
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Thibodeaux L, Poulin M & Even S. 1994. A model for enhanced aeration of streams by motor vessels with
application to the river Seine. Journal of Hazardous Materials. 37: 459-473
Verhof FH, Yacksich SM & Melfi DA. 1980. River nutrient and chemical transport estimates. J. Environ.
Engng. Div., ASCE. 10: 591-608
Walling DE & Webb W. 1985. Estimating the discharge of contaminants to coastal waters by rivers: some
cautionary comments. Mar. Poll. Bull.16: 488-492
Weiss R.F & Price BA. 1980. Nitrous oxide solubility in water and seawater. Marine Chemistry, 8: 347-359
Whittaker RH & Likens GE. 1975. The biosphere and man. In: Lieth H & Whittaker RH (Eds). Primary
production of the Biosphere. Springer-Verlag, Berlin, pp. 305-328

Conclusion

Cette étude a permis de faire un bilan du processus de nitrification dans la basse

Seine : en été, la nitrification peut oxyder entre 16 et 55.103 kg N.j-1. De plus, il s’agit de la
première étude montrant clairement l’importance du processus de dénitrification dans la
basse Seine, estimé également par un bilan d’azote. Cette activité peut, en été, réduire entre
27 et 61.103 kg N.j-1. Les deux processus se compensent, ce qui explique pourquoi dans la
basse Seine, on ne voit pas apparaître autant de nitrate que d’ammonium consommé, puisque
le processus de dénitrification réduit le nitrate au fur et à mesure de sa production.

Ce bilan des émissions de N2O, à l’échelle de la basse Seine, nous permet de dresser
des hypothèses relativement robustes quant à l’origine de l’oxyde nitreux produit dans la
basse Seine. En effet, nous avons vu que les processus de dénitrification benthique et de
nitrification dans la colonne d’eau devaient chacun contribuer aux émissions de N2O, mais
leur importance relative n’est pas encore déterminée.
Il semble qu’à l’aval immédiat des rejets de la station d’épuration d’Achères la
dénitrification puisse être le processus majeur de production de N2O. Plus à l’aval, au niveau
de l’estuaire amont, la nitrification étant très active et l’oxygène déficitaire nous pensons que
la nitrification-dénitrifiante pourrait grandement contribuer au flux de N2O observé à ce
niveau.

Afin de mieux cerner les conditions propices au processus de nitrification-

dénitrifiante et déterminer les paramètres cinétiques de cette étape du cycle de l’azote
nouvellement étudiée dans la Seine, nous avons analysé la nitrification en conditions
contrôlées au laboratoire.

160
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

III.1.1.4. Étude du processus de nitrification en conditions contrôlées

Ce travail est basé sur l’hypothèse selon laquelle, le processus de nitrification-

dénitrifiante pourrait être, dans certaines conditions, notamment rencontrées dans l’estuaire,
une des voies principales d’émission de N2O dans la Seine. D’après le bilan d’émission de N2O
présenté précédemment, il semble pourtant que le processus de dénitrification contriburait
d’une manière significative aux émissions de N2O dans la basse Seine. Contrairement au
processus de dénitrification, relativement bien connu (Garcia-Ruiz et al. 1998), l’étape de
nitrification-dénitrifiante est encore peu étudiée de manière systématique. Dans cette
optique, nous avons réalisé des cultures en batch et en chémostat, en utilisant de l’eau de
l’estuaire amont comme culture nitrifiante et exploré les facteurs de contrôle principaux
(oxygène, ammonium et nitrite).
Nos objectifs sont ici de : 1) Recréer en conditions contrôlées une culture nitrifiante
afin d’en déterminer les paramètres de croissance et de les confronter avec ceux de la
littérature définis en cultures pures, 2) Déterminer pour quelle valeur de stress oxique,
l’étape de nitrification-dénitrifiante apparaît, 3) Comprendre dans quelles conditions de
substrat la nitrification-dénitrifiante se met en place, et dans quelle mesure elle contribue aux
dégagements de N2O, et enfin 4) Définir les paramètres cinétiques de production de N2O par
une population bactérienne nitrosante complexe naturellement présente dans la basse Seine.

Publication 2. Cinétiques de nitrification et de production de N2O par la

communauté bactérienne naturellement présente dans la Seine.

RÉSUMÉ
Nous avons montré qu’environ 40-60 kgN-N2O.j-1 d’oxyde nitreux (N2O) est produit
dans la basse Seine grandement affectée par le rejet des effluents de la station d’épuration
d'Achères, où l’activité nitrifiante est forte. En raison des émissions de N2O, une hypothèse
importante a été formulée selon laquelle le N2O pourrait être en partie produit par l’activité
de nitrification-dénitrifiante. Pour cerner au mieux les conditions induisant ces émissions de
N2O par nitrification-dénitrifiante, des cultures bactériennes nitrifiantes (en batch et
chemostat) ont été réalisées à partir d'eau de la Seine. Au cours de ces expériences, la
diversité de la communauté bactérienne nitrosante (AOB) a été déterminée par analyse
moléculaire (DGGE). Nous avons ainsi pu montrer que les populations cultivées lors de nos
expériences sont proches de celles naturellement présentes dans la Seine. Nous avons étudié
les cinétiques de nitrification en considérant les deux populations bactériennes fonctionnelles
nitrosantes et nitratantes. Nos résultats expérimentaux ont donc permis de confirmer les
paramètres cinétiques des deux groupes bactériens, c’est-à-dire les taux de croissance, les
rendements de croissance et les constantes de demi-saturation. À partir de ces paramètres et
compte tenu des caractéristiques du chémostat, nous avons déterminé la biomasse nitrifiante
(en mg C) présente dans les cultures tout au long des expériences. Pendant les expériences en
batch et chemostat, des cinétiques de production de N2O ont été réalisées dans diverses
conditions. Nous avons examiné l'effet des concentrations en oxygène dissous, en ammonium
et en nitrite sur les taux de production de N2O. À notre connaissance, notre étude est la
première consacrée à la détermination des concentrations optimales en O2, NH4+ et NO2-
menant à la production maximale de N2O par nitrification-dénitrifiante pour des populations
bactériennes naturelles de milieux d'eau douce. Nous avons testé une gamme assez large de
concentrations en oxygène et avons observé un pic d'émission de N2O entre 1.1 et 1.5 mg O2.L-
1. Nous avons déterminé la production de N O en fonction des concentrations en ammonium
2
et en nitrite en condition optimale d’oxygénation. Les résultats suivant une courbe
hyperbolique de Michaëlis-Menten, les paramètres cinétiques (Vmax et Ks) ont été
déterminés. Le taux de production du maximal de N2O (Vmax) a été estimé à 8-9 µg N-N2O
produit par mg C (biomasse) et par heure, les constantes de demi-saturation de la
nitrification-dénitrifiante sont pour l'ammonium : Ks-NH4+ = 1.5-3 mg N-NH4+.L-1 et pour le
nitrite : Ks-NO2- = 1-4 mg N-NO2-.L-1.

161
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Aquatic Microbial Ecology, soumis le 18/10/2004

Nitrous oxide production and nitrification kinetics by

natural bacterial communities
(the lower Seine River, France)

Aurélie Cébron1, Josette Garnier and Gilles Billen

UMR Sisyphe 7619, Université P. et M. Curie – Paris 6, BP 105, Tour 56-55, Étage 4, 4 place Jussieu, 75005 Paris, France.

ABSTRACT
Nitrous oxide is produced in the lower Seine River at 40-60 kgN-N2O d-1, in a section
greatly affected by effluents from the Achères WWTP, where nitrification is high. Because
water column denitrification is weak in this sector, we hypothesized that N2O could be
produced by a nitrifier-denitrification process. To understand the controls of N2O emission,
nitrifying bacterial cultures (in batches and continuous flow experiments) were grown from
Seine river water. The population diversity of ammonia oxidizing bacteria (AOB) in these
experiments was determined by molecular analysis (DGGE) and found to be similar to those
naturally present in the Seine. We determined nitrification kinetics of the two functional
bacteria populations (ammonium oxidizing, AOB, and nitrite oxidizing bacteria, NOB). Using
known values of the parameters (growth rates, growth yields and half-saturation constant),
we calculated the nitrifying biomass (in mg C) present in cultures during the experiments.
During nitrifying batch and continuous flow experiments, the N2O production kinetics were
examined under contrasted conditions. We tested the effect of dissolved-oxygen, ammonia
and nitrite concentrations on the N2O production rates. To our knowledge, this is the first
study devoted to determining the optimal concentrations of O2, NH4+ and NO2- leading to
maximum N2O production by nitrifier-denitrification for nitrifying bacteria populations from
natural freshwater. We tested a wide range of oxygen conditions and observed a peak of N2O
emission for a narrow range of O2 concentrations, comprised between 1.1 and 1.5 mg.L-1. We
plotted the N2O production as a function of ammonium and nitrite concentrations in optimal
dissolved-oxygen conditions. The results followed the hyperbolic Michaëlis-Menten type
curves, and the kinetics parameters (Vmax and Ks) were determined. The maximum N2O
production rate (Vmax) was estimated at 8-9 µg N-N2O produced per mg C biomass and per
hour, the half-saturation constants of nitrifier-denitrification was for ammonium: Ks-NH4+ =
1.5-3 mg N-NH4+.L-1 and for nitrite: Ks-NO2- = 1-4 mg N-NO2-.L-1.

Key words: nitrous oxide, nitrification, nitrifier-denitrification, continuous flow and batch
cultures.

1
UMR Sisyphe 7619, Université P. et M. Curie – Paris 6, BP 105, Tour 56-55, Étage 4, 4 place Jussieu, 75005
Paris, France. Telephone: Tel: (33)-(1)-44 27 51 34, Fax: (33)-(1)-44 27 51 25. [Link]@[Link]

162
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

INTRODUCTION
Nitrous oxide (N2O) is an active greenhouse gas with high environmental impact due
to its strong global warming potential (320 times greater than CO2; Wrage et al. 2004). As
the atmospheric concentration of N2O has increased by 15% since pre-industrial times,
stabilization at the current rate of 311-313 ppb would require a reduction of the
anthropogenic emissions of more than 50% (Houghton et al. 1996). In the stratosphere, N2O
reacts with the oxygen to form nitric oxide (NO) that plays a role in destruction of the ozone
layer (Crutzen 1981). Whereas the N2O production by aquatic environments represents 35%
of the total N2O emission sources, the anthropized continental aquatic environments
contribute to 10% of these total emissions (Seitzinger 2000).
Denitrification and chemolithotrophic nitrification appear to be the main biological
sources of nitrous oxide emission. Denitrifying bacteria are involved in the production of
gaseous oxidized compounds in environments such as soils, sediment, anoxic waters and
sewage sludge. In addition, ammonia oxidation by autotrophic bacteria can also produce
nitrous oxide either as a by-product of nitrification or as an intermediate in nitrifier-
denitrification. As a by-product of nitrification, N2O is formed during the spontaneous
decomposition of intermediates in ammonia oxidation, e. g. hydroxylamine (NH2OH) might
lead to N2O during nitrification. We define nitrifier-denitrification as ammonia oxidation to
nitrite (NO2-) by ammonia oxidizers with subsequent reduction to molecular nitrogen (N2)
with N2O release as an intermediate (Poth & Focht 1985; Wrage et al. 2001). Studies
describing N2O emissions from nitrification are still scarce in natural aquatic environments,
but Svensson et al. (2001) shew that nitrification may be the major source of N2O in lake
bioturbated sediments, whereas Bonin et al. (2002) and Dong et al. (2002) demonstrated
that nitrification can significantly contribute to N2O emission in the maximum of turbidity
zone of estuaries.
Since 1997, we have also studied the nitrous oxide emission by the lower Seine River
from Paris to the estuary and the overall N2O emission budget has recently been estimated
(Garnier et al., submitted). This stretch of the river is greatly affected by Achères Wastewater
Treatment Plant (WWTP) effluents that contribute to deoxygenize the water column first by
the activity of heterotrophic bacteria immediately downstream of the effluent discharge, then
by that of autotrophic nitrifiers in the estuary (Garnier et al. 2001). A negligible
denitrification in the water column (Sébilo 2003) and a high nitrification (Brion et al. 2000;
Garnier et al. 2001; Cébron et al. 2003) support to focussed on N2O emissions from
nitrification.
Nitrifier-denitrification has been investigated since 1972 by Ritchie & Nicholas (1972)
using isotopic 15N experiments with pure cultures of ammonia-oxidizing bacteria
Nitrosomonas europaea; Poth & Focht (1985) also demonstrated this process in N. europaea
cultures, but only under anoxic stress conditions. Most previous studies used pure culture
strains, including Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha or Nitrosospira briensis
(Kester et al. 1997; Wrage et al. 2004). Investigations using natural populations are scarce
and confined only to soils (Hutchinson et al. 1993) or sewage sludge (Muller et al. 1995).
Previous work in the lower Seine River showed that the species used for pure culture
studies cited above are not well represented in the natural AOB community, dominated by
Nitrosomonas oligotropha and N. ureae -like bacteria belonging to Cluster 6a of β-
Proteobacteria (Cébron et al. 2003; Cébron et al. 2004). To our knowledge, information on
kinetic parameters and N2O production of this bacterial cluster does not exist, and kinetic
parameters can vary greatly between phylogenetically close bacteria. Our objective was to
experimentally determine nitrification and N2O production kinetics using a mixed bacteria
community from the Seine River water, dominated by Nitrosomonas oligotropha- and N.
ureae-like ammonia oxidizers (Cébron et al. 2004). The effect of low oxygen pressure on
nitrous oxide production by nitrifier-denitrification already shown in various controlled
environments, e. g. soil, wastewater and pure culture, has not been studied in freshwater
samples under controlled conditions. A second objective was to determine the effects of

163
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

substrate concentrations (ammonia and nitrite) on nitrous oxide production, which had not
previously been studied with mixed natural populations.
A major goal of this study is to document the functionning of nitrifier-denitrification
in controlled cultures of ammonia-oxidizing bacteria naturally present in the Seine river
water, and to determine the critical controls and process rates. Informations on how
dissolved oxygen, ammonia and nitrite concentrations affect this nitrifyer-denitrification
process, including N2O production are drawn, including reaction coefficients. Further we
propose mathematical formulations of the different steps of the nitrification process, with its
two stages taking into account N2O emissions. The final issue of the study is to provide
kinetics formulations and parameter values that could be included in modelling approaches
devoted to greenhouse gas emission.

METHODS
Sampling station description

The Seine River is greatly affected by the discharge of the Achères WWTP effluents
70 km downstream from Paris. The WWTP effluents contain high quantities of ammonia,
which is oxidized into nitrite and nitrate in the lower Seine River and the upstream
freshwater estuary via the nitrifying process.
Water was collected from the Duclair station, in the freshwater part of the upstream
estuary, located 278 km downstream from Paris, where potential nitrification is the highest
and often accompanied by strong oxygen depletion (Brion & Billen 2000; Garnier et al. 2001;
Cébron et al. 2003). Samples had been collected at different periods in 2002 and 2003, but
invariably during low water conditions (from May to September) when the water temperature
was above 17°C. This water from the Seine freshwater estuary was used for batch and
chemostat culture experiments.

Batch culture experiments

Seven different batch cultures (Fig. 1a) of nitrifying bacteria populations were set up
with 10L of Seine River water from Duclair to which NH4Cl was added, 30 mg N-NH4+.L-1
final concentration. Consequently, the initial water differs from an experiment to another,
but we previously showed that the ammonia-oxidizing bacterial diversity of the Seine River is
similar throughout summer conditions (Cébron et al. 2004). The cultures were run for 2 to 3
weeks under constant shaking. Oxygen was maintained by pump at 7-8 mg.L-1. The pH was
adjusted to between 7.5 and 8.0 by phosphate buffer addition (K2HPO4 / KH2PO4). Nitrifying
activity was checked by measuring ammonia consumption and nitrite and/or nitrate
production. Once ammonium and nitrite were fully oxidized, the culture was divided into 6
different batches of 1.5 L, supplied with oxygen in parallel (Fig. 1a). In order to test the effect
of substrate concentrations on the nitrous oxide production rate, ammonia and nitrite were
added to the different batches at chosen concentrations (12 different ammonium
concentrations from 0.08 to 16.9 mg N-NH4+.L-1 and 13 different ones for nitrite from 0.08 to
28 mg N-NO2-.L-1). The batches were then subjected to oxic stress by reducing oxygen to 1.25
mg.L-1 and nitrous oxide production kinetics were realized; the same experiments were also
run in each batch culture experiment under high oxygenation conditions (7.5 mg.L-1).

Continuous culture experiments

Before starting a continuous culture experiment, the first step in the batch culture was
carried out as described above but with a 5L Seine River water sample. Four batch-

164
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

continuous culture experiments have been realized with different initial water samples. After
two weeks in batch, the nitrifying culture was transferred into a continuous culture device for
3 to 4 weeks, until a typical steady state was reached (Fig. 1b).

a) b)

Fig. 1. Schematic representation of the batch (a) and chemostat (b) setups: (1) Oxygen meter, (2) pH
meter, (3) carbonate buffer, (4) air pump, (5) nitrogen gas (N2) bottle, (6) peristaltic pump.

The working volume of the chemostat was constant (2L) while a peristaltic pump
continuously supplied ammonium-enriched sterilized Seine River water (25 to 30 mg N-
NH4+ .L-1) at a constant rate of 1 L.d-1 (the residence time in the chemostat was therefore 2
days). The ammonia concentration of feed river water was indeed chosen similar to that of
treated wastewater effluent from the Achères WWTP, to reproduce the in situ conditions, i.e.
an input of ammonium by WWTP effluents into the Seine river. The feed water was
phosphate buffered (K2HPO4 / KH2PO4; 0.5 mM final concentration, pH 7.5 to 8) and had a
nitrate of 5-8 mg N.L-1. Both chemostat and feed-tank waters were magnetically stirred to
maintain the particulate matter in suspension. The dissolved-oxygen concentration,
controlled with a combined air pump and gas nitrogen bottle (N2), was maintained at 7.5 - 8
mg.L-1. After 3 to 4 weeks, when the nitrifying activity was at steady state, 13 different oxic
stress conditions (0.25 to 4.5 mg.L-1) were imposed. After 3 hours under oxic stress,
simultaneous nitrous oxide production kinetics were determined as described above (Fig. 2).
Four chemostat experiments covered a wide range of oxic stress conditions and tested the
reproductibility of the results. Each chemostat experiment was also run in high oxygenation
condition (7.5 mg.L-1) to determine the level of nitrous oxide production in a well aerated
medium.

Water analyses

During the batch culture and chemostat experiments, water was sampled daily to
determine variations in DIN species (Dissolved Inorganic Nitrogen). Water was filtered
(glass-fiber membrane, Whatman, GF/F) and frozen until analysis. Ammonium, nitrite and
nitrate were determined spectrophotometrically, ammonium and nitrite according to
Slawyck & MacIsaac (1972) and nitrate after Cd-reduction to nitrite (Rodier 1984).
For molecular analysis, 150 - 250 mL of water (depending on the amount of
suspended particulate matter (SPM)) was filtered through 0.22µm nitrocellulose filters
(Durapore®, diam. = 45mm) in triplicate and the filters were frozen (-20°C) prior to DNA
extraction.

165
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Fig. 2. Nitrous oxide production kinetics

experiment procedure and examples of
results obtained for different conditions of
oxygen, ammonium and nitrite
concentrations. The N2O production test
with 2 different oxygenation conditions is
shown for samples with (dotted line) and
without (straight line) nitrification
inhibitor addition.

166
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Measurement of dissolved nitrous oxide concentrations and nitrous oxide

production kinetics

Nitrous oxide production kinetics were measured on samples taken from batch or
continuous cultures at their steady stages as follows: after 3 hours of oxic stress, three 100mL
flasks were filled from the cultures without shaking and air bubbles, closed with a rubber cap
and sealed. The bacterial activity was immediately stopped with HgCl2 (0.5 % final
concentration) by injection with a syringe and needle into one of the flasks to determine the
initial nitrous oxide concentration. A second flask was poisoned after 30 minutes and the
third after 60 or 90 minutes, during which the oxygen concentration in the flask remained
constant (± 0.05 mg O2.L-1). Dissolved nitrous oxide (N2O) was measured in triplicate by Gas
chromatography with electron capture detection. Nitrous oxide production (in µgN.L-1.h-1)
was determined as the slope of the regression of concentration against time (Fig. 2), and then
estimated per unit AOB biomass. Nitrous oxide production was measured at various oxygen
levels, ammonia and nitrite treatment concentrations, and with or without specific
nitrification inhibitors (ATU = allylthiourea 10mg/L) to confirm that N2O is really produced
by nitrifier-denitrification.

Molecular study of the ammonia oxidizing population

DNA was extracted from the filters (see Water analyses section), collected from one
batch-chemostat experiment, by a bead-beating method with the FastDNA spin Kit for soil
(Bio 101, Lajolla, Calif., USA) and purified on a Sephadex G-200 column. Nucleic acids were
quantified as described by (Cébron et al. 2004).
All PCRs were conducted according to Kowalchuk et al. (1998) as described in
(Cébron et al. 2004) with CTO189F-654R primers, which allow the amplification of partial
16S rDNA sequences (465bp) from β-subclass ammonia-oxidizing bacteria. A nested PCR was
run with the PCR products obtained from CTO primers as matrix DNA with a second primer-
pair allowing the amplification of an internal fragment of 196 bp (Muyzer et al. 1993). PCR
products were loaded for DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) on
polyacrylamide denaturant gels (gradient ranging from 30 to 55%) according to Muyzer et al.
(1993), modified by Kowalchuk et al. (1998) and under conditions used by (Cébron et al.
2004). The DNA was stained with ethidium bromide and visualised by UV transillumination
(Gel Doc 200, BioRad). Digital images of the gels were obtained with a CCD camera
controlled by software Quantity One (BioRad). The DGGE bands were excised, re-amplified
to confirm their purity and sequenced for phylogenetic analyses (Clustal X, PHYLIP 3.5
package) (see Cébron et al. 2004). The ammonia oxidizing bacteria present in the batch and
chemostat were thus identified. The sequences determined in this study were deposited in the
GenBank database under accession numbers AY648571 to AY648575.

Modeling bacterial growth and activity in culture

In closed batch culture, nitrifiers grew until ammonium and nitrite were exhausted. In
continuous culture, microorganisms grew on ammonium and nitrite with constant inflow of
ammonium. The outflow was a blend of nutrient and microorganisms. Assuming a stable
bacterial population composition all along the culture stages of the experiments, the observed
variations of substrate and product concentrations can be modelled using constant kinetic
parameters. We applied the classical conceptual schema of two steps: ammonium (NH4)
oxidation to nitrite (NO2) by AOB and nitrite oxidation to nitrate (NO3) by NOB, using
parameters ranges determined by Brion & Billen (1998) (Table 1).
For both batch and continuous cultures, differential equations were written to model
nitrifying activity:

167
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

dNH4/dt = -µmaxAOB / YAOB × NH4/(NH4+KNH4) × O2/(O2 +KO2) × BMa + Q/V × ( NH4° - NH4)

dNO2/dt = µmaxAOB / YAOB × NH4/(NH4+KNH4) × O2/(O2 +KO2) × BMa + Q/V × ( NO2° - NO2)
- µmaxNOB/ YNOB × NO2/(NO2+KNO2) × O2/(O2 +K’O2) × BMn

dNO3/dt = -µmaxNOB / YNOB × NO2/(NO2+KNO2) × O2/(O2 +K’O2) × BMn + Q/V × ( NO3° - NO3)

dBMa/dt = µmaxAOB × NH4/(NH4+KNH4) × O2/(O2 +KO2) × BMa - Q/V × NH4 - kd × BMa

dBMn/dt = µmaxNOB × NO2/(NO2+KNO2) × O2/(O2 +K’O2) × BMn - Q/V × NO2 - kd × BMn

Where µmaxAOB and µmaxNOB are the maximum growth rate (h-1) of AOB and NOB respectively,
YAOB and YNOB their growth yield (mgC mg N-1). KNH4 and KO2 are the half-saturation constants
for ammonium (mg N.L-1) and oxygen (mg O2 L-1) for AOB, KNO2 and K’O2 are the half-
saturation constant for nitrite and oxygen for NOB. kd is an adjusted first order bacterial
mortality constant. Q is the flow rate and V the culture volume. Q is zero in batch culture.
NH4° and NO2° are ammonium and nitrite concentrations in the feed water and NH4 and
NO2 are the concentrations in the chemostat. These equations are used to model the
nitrifying activities in batch and continuous cultures. The ammonia and nitrite oxidizer
biomass, BMa and BMn respectively, are then deduced from these results.

Table 1. Range of values of growth kinetic parameters of ammonium oxidizing (AOB) and nitrite
oxidizing bacteria (NOB) under oxic conditions, as reported by Brion and Billen (1998), and values
found in this study.

N2O production formulation

We hypothesized that nitrous oxide produced during nitrifier-denitrification process

is the fate of ammonium-oxidizing bacteria rather than specialized Anammox species. We
assume that N2O production results from the oxidation of NH4 by AOB using NO2- as an
alternative electron acceptor at low oxygen concentrations. The kinetic representation of the
processes is therefore:

N2O production = VmaxN2O × NH4/(NH4 + K’NH4) × NO2/(NO2 + K’NO2) × BMa

Where VmaxN2O is the specific rate of N2O production (mgN mgC-1), K’NH4 and K’NO2 are the
half-saturation constants for ammonium oxidation to N2O with respect to ammonium and
nitrite respectively.
RESULTS
Nitrification in batch and continuous culture experiments

168
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Batch experiments – An example of representative dissolved inorganic nitrogen (DIN)

variation in one of the 10L batch experiments is shown on Fig. 3, where high oxygenation (7.5
to 8 mg O2 L-1) and ammonia-enrichment (30-40 mg N-NH4+ L-1), led to complete
consumption of the ammonium accompanied by nitrite and nitrate production. During this
experiment, ammonium was added on 3 occasions, at the start of the experiment and after
140 and 190 hours. For the first 50 hours, the culture followed a lag-phase with little DIN
variation. Complete consumption of the ammonia accompanied by nitrite and nitrate
production was observed throughout the next 100 hours. This nitrifying culture was
subsequently used as a seed culture in chemostat experiment or for studies of nitrous oxide
production (cf. Fig. 1a).

Continuous-culture experiment - The variations in mineral nitrogen concentrations in

continuous cultures (Fig. 3), was similar for the 4 other continuous culture experiments. The
starting conditions are the final ones of the corresponding batch culture; during the first
stage of the continuous culture (100 hours), we observe a dilution by the inflowing feed water
that contains about 25-30 mg N-NH4+ L-1 and 5-8 mg N-NO3- L-1 (Fig. 3). Then, nitrifying
activity re-starts, indicated by ammonia consumption and nitrate production. The nitrite
concentration either decreased or remained low. A steady state was then reached with
relatively constant nitrifying activities (Table 2) and with ammonia and nitrate
concentrations at equilibrium. After about 100 hours of steady state the culture was
submitted to multiple oxic stresses (see below).

Fig. 3. One example of ammonium (N-NH4+), nitrite (N-NO2-) and nitrate (N-NO3-) concentrations,
during one batch and one chemostat experiments (experimental points are represented). The curves
are the results of the modeling of the nitrogen concentrations in batch and chemostat stages with one
set of kinetic parameters (see Table 2).

Table 2. Characteristics of the steady state reached by continuous cultures of natural assemblages
of nitrifying bacteria from the Seine estuary.

169
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Modeling the dynamics of nitrifying bacteria in batch and continuous culture.

We first analyzed whether the parameter values as cited by Brion & Billen (1998) (µmax
of 0.04 h-1 and 0.06 h-1 for pure culture AOB and NOB respectively and half-saturation
constants (KS) for ammonia and nitrite of 3 mg N L-1 and 0.3 mg N L-1 respectively, Table 1),
fit with those found for natural populations at steady state in the 4 chemostats all run with a
dilution rate of 0.02 h-1 (Table 2).
Using the equations given in material and method section and the value of Table 1 for
the growth yield (Y) (0.08 mgC mgN-1 and 0.02 mgC mgN-1 for AOB and NOB respectively),
we accurately simulated the time course of both the batch and the continuous cultures (Fig.
3). For the batch cultures we adjusted the bacterial mortality rate to 0.001 h-1 in the presence
of high substrate concentration, but increased it by a factor of 10 during periods of low
substrate concentration in order to account for lost activity after substrate depletion.
With these simulations (cf. Fig. 3), we were able to estimate AOB biomass during
steady state of continuous cultures (Table 2).

Ammonia-oxidizing bacterial population diversity

It is worth pointing out that the structure of ammonia oxidizing bacterial population
in the lower Seine river is relatively constant throughout the summer period and among years
(Cébron et al. 2004). We also studied the changes in the diversity of the populations of
ammonia oxidizing bacteria in the batch and continuous cultures, using the DGGE
(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) analyses to compare experimental results with in
situ diversity (Cébron et al. 2004). DGGE profiles obtained with nested PCR (Fig. 4a),
indicate populations present respectively at the beginning and the end of the batch culture
(lane 1 and 2, cf. sampling times on Fig. 3), while lanes 3 to 6 illustrate the populations
present during the continuous culture sampled at times indicated on Fig.3.
During the batch experiment the populations showed only slight changes (Fig. 4b). At
the beginning of the batch culture, the community was composed of two major AOBs
represented by bands Chem3-b30-A and Chem3-b34-B (band Chem3-b40-D is a non-AOB
species). These two bacteria are affiliated to the Nitrosomonas oligotropha and N. ureae –
like bacteria, belonging to cluster 6a (β-Proteobacteria). The same bacteria were still present
at the end of the nitrifying batch culture, but the Chem3-b30-A band appeared then as the
dominant bacteria. The non-AOB species disappeared, confirming selection for nitrifying
bacteria.
During the continuous culture, the AOB population diversified, with an increase from
2 to 4 unique bands within 600 hours. Bands Chem3-b30-A and Chem3-b34-B remained, but
two new bands (Chem3-b36 and Chem3-b39) appeared during steady state. These two new
bands are affiliated to the same Cluster 6a as the other bacteria and are even closer to N.
ureae and N. oligotropha. During steady state, the major band was Chem3-b34-B.

170
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

a) b)

Fig. 4. a) DGGE profile of ammonia-oxidizing bacteria of the β-subclass of the Proteobacteria,

obtained with nested PCR on batch and chemostat samples. Lane numbers (1 to 6) correspond to the
6 different sampling times in batch and chemostat (cf. Fig. 3). All observed bands are noted with
names Chem3 followed by numbers of the band with or without the letter A, B or D that refers to
Cébron et al. (2004).
b) All these bands have been cut and sequenced to determine the phylogeny of each ammonia-
oxidizing bacterium presented in the neighbor-joining tree based on a comparison of 152 bp of 16S
rRNA gene sequences, the tree is rooted with AOB belonging to the γ-subclass of Proteobacteria.

Effect of dissolved-oxygen concentration on N2O production

Low dissolved-oxygen concentration is frequently reported to control N2O production,

but the range of the values seems rather wide, from 1 to 5 mg O2 L-1. When the objective is to
rehabilitate ecosystems or implement a tertiary treatment in wastewater treatment plants,
such a range covers very different technical and costs requirements.
Oxic stresses studied during steady state of the 4 chemostats covered 13 different
dissolved-oxygen concentrations from 0.25 to 7.5 mg L-1 (Fig. 5). To compare the results
among the chemostats, the results are normalized to AOB biomass (mgC). All nitrous oxide
production rates were linear throughout the incubation (r2 above 0.88, cf. Fig. 2) and varied
from 0.02 to 3.59 µg N-N2O mg C-1 h-1 (0.036 to 5.96 µg N-N2O L-1 h-1, Fig. 5).
For oxygen concentrations above 2 mg L-1, a basal nitrous oxide production of 0.02 to
0.36 µg N-N2O mg C-1 h-1 was observed (Fig. 5). A reduction in oxygen concentration below 2
mg L-1 to 1.4 mg L-1 induced a N2O production increase to 1.22 µg N-N2O mg C-1 h-1. However,
when oxygen concentrations was further decreased to 1.25 - 1.1 mg O2 L-1, N2O production
increased drastically to 2.4 -3.6 µg N-N2O mg C-1 h-1. Below 0.8 mg O2 L-1, N2O production
become low again. N2O productions plotted as function of oxygen concentration in the
cultures, showed that peak of nitrous oxide production occurred within a narrow dissolved
oxygen range (1.1 – 1.25 mg O2 L-1).
Three of the oxygen conditions (0.8, 1.1 and 2.5 mg L-1) were run with and without
addition of nitrification inhibitors (allylthiourea that inhibits the ammonia monooxygenase
enzyme) to verify that the nitrous oxide was produced by nitrification. With a nitrification
inhibitor, the nitrous oxide production was very weak compared to the production without
inhibitor so that nitrous oxide produced in the experimental conditions defined here can be
considered to be due to nitrification alone (cf. Fig. 2).

171
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Fig. 5. Nitrous oxide production according to oxygen concentration in chemostat experiments.

Different symbols represent the 4 chemostat experiments.

Effect of ammonia and nitrite concentrations on N2O production

Our hypothesis, that nitrous oxide production depends on both ammonium and
nitrite concentrations, was tested in optimally oxygenated (1.25 mg O2 L-1) batch culture to
better understand their respective controls.
We tested 12 concentrations of N-NH4+ (Fig. 6), from 0.08 to 16.9 mg N L-1 and 13
concentrations of N-NO2- (Fig. 7), from 0.08 to 28 mg N L-1 under oxic stress, i.e. with the
oxygen level forced to 1.25 mg L-1 in the batch culture. Similarly, the plot of N2O
concentration as function of the incubation time leads to the N2O production for each of the
tested substrate concentrations. The nitrifying biomass in the different batch cultures varied
from 0.37 to 0.53 mg C L-1.

Fig. 6. Nitrous oxide production under oxic

stress (O2 = 1.25 mg.L-1) as a function of the
ammonium concentration present in the batch
culture. The different symbols represent the 3
different batch cultures. Two Michaëlis-
Menten curves are shown, their kinetics
parameters are: 1) VN2Omax = 4.3 µg N-N2O
produced .mgC-1.h-1 and K’NH4 = 1.5 mg N-
NH4+.L-1; 2) VN2Omax = 4 µg N-N2O produced
.mgC-1.h-1 and K’NH4 = 3 mg N-NH4+.L-1.

Effect of ammonia - To test the effect of different ammonia concentration, the nitrite
was supplied at a constant concentration of 2.2 to 2.5 mg N-NO2- L-1, supposed to be non-
limiting. The 5 lowest ammonia concentrations led to low N2O production (low slope of µg N-
N2O mg C-1 in function of time), with higher variability as shown by the relatively low,
although statistically significant, correlation coefficient (r2 between 0.65 and 0.84). At
identical ammonia and nitrite concentrations but higher oxygenation (7.5 mg O2 L-1), nitrous
oxide production was close to zero (data not shown).

172
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

When plotted against ammonia concentration, N2O production showed a regular

increase at low concentration, reaching then a plateau that represents the maximum rate for
N2O production in the experimental conditions, up to 3.8 µg N-N2O produced mg C-1 h-1 (e. g.
1.4 µg N-N2O produced L-1 h-1) (Fig. 6). The observations can be fitted by hyperbolic curves
(Michaëlis-Menten) that illustrate the enzymatic kinetics of N2O production, and Vmax and K
parameters can be determined. VmaxN2O, the maximum rate of N2O emission ranged from 4 to
4.3 µg N-N2O produced mg C-1 h-1 and K’NH4, the half-saturation constant varied from 1.5 to 3
mg N-NH4+ L-1.

Effect of nitrite – Conversely, the ammonia concentration was always maintained at

saturating values, close to 20 mg N-NH4+ L-1 to investigate only the effect of nitrite limitation
(Fig. 6). Similarly, this experiment was also run at the oxygen concentration found to be
optimal for N2O production.
The maximum specific N2O production rate reached 7.3 µg N-N2O mg C-1 h-1 (3.8 µg
N-N2O produced.L-1.h-1) (Fig. 7). At high nitrite concentrations (above 15 mg N-NO2- L-1) N2O
production is clearly inhibited. Again, the observations below this threshold can be fitted on a
Michaëlis-Menten curve with a VmaxN2O range from 8 to 9 µg N-N2O mg C-1 h-1 and K’NO2-
values varying from 1 to 4 mg N-NO2- L-1 (Fig.7).
The VmaxN2O obtained in Fig 6 with varying ammonium concentrations exactly
corresponds to half the value of the maximum specific rate measured at optimal
concentration of both nitrite and ammonium concentrations, showing that the nitrite
concentrations from 2.2 to 2.5 mg N-NO2-.L-1 were not saturating, but around the half-
saturation concentration (Fig 7). Interestingly, this maximal specific rate of N2O production
(VmaxN2O) by AOB (8 to 9 µg N-N2O mg C-1 h-1) is about 100 times lower only than the specific
rate of ammonium oxidation by AOB under oxic conditions (0.05 mmolN mg C-1 h-1, ie. 700
µg N mg C-1 h-1).

Fig. 7. Nitrous oxide production under

oxic stress (O2 = 1.25 mg.L-1) as a function
of the nitrite concentration present in the
batch culture. The different symbols
represent the 4 different batch cultures.
Two Michaëlis-Menten curves are shown,
their kinetics parameters are: 1) VN2Omax =
8 µg N-N2O produced .mgC-1.h-1 and K’NO2
= 1 mg N-NO2-.L-1; 2) VN2Omax = 9 µg N-
N2O produced .mg C-1.h-1 and K’NO2 = 4 mg
N-NO2-.L-1.

173
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

DISCUSSION

Nitrification process in the batch and continuous cultures

Due to the large ammonium input in secondarily treated wastewater effluent from
Paris (Brion & Billen 2000; Garnier et al. 2001; Cébron et al. 2003), nitrification in water
from the lower Seine River and freshwater estuary is a dominant N-transformation.
A molecular analysis by DGGE of the AOB community composition showed that the
two major AO bacteria present in the batch culture were the same as those that dominated in
situ (Cébron et al. 2004), belonging to Cluster 6a, represented by N. oligotropha and ureae-
like bacteria. The same two species also dominated in the continuous cultures; however, at
the end of the experiment, two other bacteria not previously identified in situ grew in the
culture (Cébron et al. 2004). On the whole however, the nitrifying bacterial community in the
cultures (batch or chemostat) can be considered representative of that in situ. The non-
nitrifying species (Band Chem3-b40-D, see (Cébron et al. 2004)) disappeared, indicating
selection for a true nitrifying community.
Bacterial cultures always began with a lag phase, followed within about 50 h by a
rapid ammonium consumption. Observed rates of ammonium oxidation (0.6-0.8 mg N-
NH4+.L-1.h-1) are much higher than the potential nitrifying activities measured for in situ
communities (Brion & Billen, 2000; Cébron et al. 2003). According to Féray (2000), as the
specific activities of AOB of the genus Nitrosomonas would ranged between 0.9 and 5 fmol
NO2- [Link]-1.h-1 (12.6-70 x 10-12 mg N- NO2- cell-1 h-1, considering that the lost N-N2O
is small in comparison), the ammonia oxidizing activities found in the batch cultures would
be supported by a bacterial community of 1 to 6×1010 cell L-1. Using the classical carbon
content of 20 fgC cell-1, the estimates of nitrifying bacterial biomass converge to a value of
0.2-1 mgC L-1 both in batch and continuous cultures, in good agreement with the ones
determined by modeling bacterial growth in the cultures (Table 2 and Fig 3).

N2O production by nitrifer-denitrification

Lack of denitrification activity in the continuous culture under aerobic conditions

(ammonia consumption = nitrate production), inhibition tests, and stable NO3- concentration
during oxic stresses all indicate N2O production by nitrifier-denitrification. N2O production
kinetics with and without the nitrification inhibitor allylthiourea (ATU), showed that the
inhibitor prevented N2O production, whereas without the inhibitor, the N2O production was
significant. Similarly, Anderson et al. (1993) who tested the effectiveness of the inhibitors N-
serve 10µg mL-1, allylthiourea 100µM and phenylacetylene 5µg mL-1, on NO and N2O
production from NO2- by N. europaea under reduced oxygen conditions (1 kPa of O2),
successfully inhibited their production.

Role of oxygen, ammonium and nitrite

Differences in substrate affinities can hardly explain the differences in the levels of
aerobic N2O production by the various ammonia-oxidizing bacteria. Jiang & Bakken (1999)
demonstrated that, in aerobic conditions, with a pure culture of mixed Nitrospira strains, the
level of N2O production increased gradually through the first part of the growth period and
reached more or less stable levels at 0.2 -0.3% of ammonia oxidation rates. With single
species cultures, of e.g. N. europaea and Nitrosospira multiformis, the proportion was
higher than 0.5%. We therefore tried to define the optimal conditions of N2O production by
natural Seine River freshwater ammonia oxidizing bacteria and to quantify N2O production
level in such natural mixed communities.

174
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Oxygen - According to Diab et al. (1993), oxygen limitation leads to physiological

modifications in nitrifying bacteria. The enzyme systems of Nitrosomonas quickly adapt to
changing redox conditions. Moreover, aerobic nitrifiers have been reported to be able to
switch from a nitrifying to denitrifying activity under conditions of oxygen stress, with
molecular hydrogen, hydroxylamine or organic matter (pyruvate, formate) as electron
donors, producing NO, N2O and N2 (Ritchie & Nicholas 1972; Abeliovich & Vonshak 1992;
Bock et al. 1995). Further, nitrification in sediment can remain quite high (>77% of the
aerobic activity) after 12 days in oxygen-limited conditions (<0.1 mg O2 L-1) (Philips et al.
2002).

To our knowledge, although, the N2O production by ammonia-oxidizers at low

dissolved-oxygen concentrations has already been mentioned in the case of both pure
cultures and natural environments, such systematic tests (13 oxic stresses in the cited oxygen
range) between 0.25 and 7.5 mg O2 L-1, and at short intervals of oxygen concentrations in the
lower range, have never been carried out regarding a mixed culture of natural nitrifying
communities.

The peak of N2O emission determined for low dissolved-oxygen concentrations

(between 1.1 and 1.25 mg O2 L-1) cannot be directly compared with other studies because, it is
not usually clear whether N2O was produced by nitrification, denitrification or other
mechanisms, e.g. Anammox. Although, Jianlong & Ning (2004) determined that optimal
conditions for incomplete nitrification to nitrite were pH = 7.5, dissolved oxygen = 1.5 mgO2
L-1 and T = 30°C in an experimental wastewater reactor at three dissolved-oxygen
concentrations (0.5, 1.5, 2.5 mg L-1). However they did not measure N2O production. In lake
sediments, ammonia oxidized to nitrite was further transformed into N2O by nitrifier-
denitrification at 0.2-1.0 mg O2 L-1 (Downes 1988). In addition, nitrite and oxygen compete
for electron removal during nitrification; thus, Anderson et al. (1993) working with N.
europaea found an optimal partial oxygen pressure of 0.4 kPa (2% air saturation = 1.68 mg
O2 L-1) for N2O production, but the oxygen effect disappeared when nitrite concentrations
exceeded 0.5 mM (nitrite addition). Finally, supporting our results, N2O production with
mixed cultures occurred at oxygen concentrations of between 1 and 4 mg L-1 with a higher
production at 1mg L-1 (Burgess et al. 2002). It is worth mentioning that according to a
number of authors, the N2O would not be the major gas produced by nitrifier-denitrification.
Kuai & Verstraete (1998) suggested that N2 is fortunately the dominant product (80%) of the
OLAND (Oxygen Limited Autotrophic Nitrification Denitrification) process, N2O
representing however 20% of the total N removed in batch cultures with dissolved oxygen
varying between 0.1 and 0.8 mgO2 L-1, a proportion much higher than ours (1-2 %). Such
lower proportions of N2O emissions were also reported by Kester et al. (1997) who incubated
N. europaea at 80 % (i.e. 210 µM O2 = 6.72 mg O2 L-1), 50, 20, 5, 1% (i.e. 0.84 mg O2 L-1) and
0% air saturation, and respectively found less than 0.9% and 0.15% of ammonium converted
into NO and N2O at 80% saturation, and 2.3% and 0.8% at 1% saturation, the fraction of N2O
being systematically smaller than that of NO.

Ammonium - In the environment, particularly in soil, N2O is produced by both

nitrifier-denitrification and heterotrophic denitrification. Avrahami et al. (2002) estimated
that the nitrification contribution to total N2O release changed from 25% at low ammonia
concentrations (6.5 µg N-NH4+ g dry weight soil-1) to 52 % at high ammonia concentrations
(395 µg N-NH4+ g dry weight soil-1). The N2O produced by nitrification in optimal dissolved-
oxygen conditions (1.25 mg O2 L-1) and with a non-limiting nitrite concentration in function
of ammonium concentrations followed the classical hyperbolic equation for which a range of
kinetic parameters was determined. In the range of tested ammonium concentrations (12
between 0.08 and 16.9 mg of N-NH4+ L-1), VN2Omax amounted to 4.0-4.3 µg of N-N2O
produced mgC-1 h-1 but the conditions were not optimal as nitrite was added to a
concentration near the K’N2O. Consequently VN2Omax, at optimum nitrite concentration should
reach 8-9 µgN-N2O produced mg C-1 h-1, i.e. 1-2 % of the specific ammonium oxidation rate at

175
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

saturating oxygen concentration. We did not observe any inhibition in the tested range,
although high concentrations of free ammonia and free nitrous acid can impede the activity
and growth of nitrifying bacteria (Anthonisen et al. 1993; Hwang & Hanaki 2000). Our
results support those by Burgess et al. (2002) who showed, in conditions similar but for
activated sludge (0.48 to 3.3 mg N-NH3 g SPM-1, 4.9 ± 0.3 mg O2 L-1 and pH of 7.2-7.5), an
increase of nitrous oxide production with the ammonium concentration, and a saturation for
ammonium higher than 1.6 mg N-NH3 g SPM-1. Differently from specific activities, K’NH4
values (1.5-3 mg N-NH4+ L-1) seem closer for both oxidation pathways of the AOB.

Nitrite – In environmental studies, nitrite is often ignored because its concentration is

very low in most field conditions (soils, freshwater, marine environments, Meybeck 1982). In
most studies, nitrite is lumped with nitrate and reported as NO3- + NO2-. Furthermore, most
studies disregard nitrite as a possible controller of N trace gas emissions (NO and N2O),
except Anderson et al. (1993) and Kester et al (1997) with N. europaea. As for ammonium,
within the range of the tested concentrations, the nitrous oxide production followed a
hyperbolic curve but we observed an inhibition for concentrations higher than 15 mg N-NO2-
L-1. At fully optimal oxygen and ammonium concentrations the maximum N2O production
rate (VmaxN2O) reached values between 8 and 9 µg N-N2O produced mg C-1 h-1, exactly the one
expected above at the optimal nitrite concentration. Definitively, the specific AOB activity
account for 1-2 % of N2O production at low oxygen concentration, with a range of K’NO2 values
from 1 to 4 mg N-NO2- L-1, i.e. a wide range of affinity for the substrate.

From determining kinetic parameters to modeling

Kinetics formulations and parameters values are now available for the 3 stages of the
nitrification process: the two known stages of aerobic nitrification (i. e. ammonia oxidation
and nitrite oxidation, Brion & Billen, 1998) and for nitrifier-denitrification (this study). For
ammonium and nitrite oxidations under oxic conditions however, our simulation of batch
and continuous cultures run with natural communities of nitrifying bacteria well confirmed
the range of parameters compiled and determined by Brion & Billen (1998) for pure culture
of AOB and NOB (cf. Table 1).

Regarding the nitrifier-denitrification at the origin of nitrous oxide production from

ammonia and nitrite consumption, the kinetics and parameter values of N2O production were
fully described for the first time (i.e., the half-saturation constant of 1.5 and 3 mg N L-1 for
ammonium and 1 and 4 mg N.L-1 for nitrite, a specific rate of N2O production VmaxN2O of 8-9
µg N-N2O produced mg C-1 h-1).

Our study opens the way for future modeling of the processes of nitrification and
nitrifier-denitrification in natural environments. In order to simulate N2O emission in the
Seine River, a next step will be to incorporate the description of these processes into the
RIVERSTRAHLER model to simulate N2O emission. This model which describes the
ecological functioning of the Seine River, already includes most microbial processes like algal
growth, heterotrophic bacterial activity, denitrification, etc. (see Billen & Servais 1989;
Lancelot et al. 1991; Billen et al. 1994; Garnier et al. 1995; Billen et al. 1999, Brion & Billen
2000). Once validated, the model will be used to explore the impact of management
measures, like tertiary treatment of urban effluents on the nitrification and N2O production
in the lower Seine River. More generally, the formulation of the process of N2O emission
could also be applied to other models, i.e. global scale where N2O emission is often
represented by simple statistical relationships (Setzinger & Kroeze 1998; Bouwman &
Boumans 2002), helping to further understand the nitrogen cycle in aquatic environments
and to better quantify N2O emissions.

176
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Acknowledgments
This work was undertaken within the framework of the PIREN-Seine programme
(initiated by the CNRS) and the Seine-Aval programme (supported by the Région Haute-
Normandie). We are indebted to André Ficht from the SNS (Service de Navigation de la
Seine) for his kind help in the field. We thank Anun Martinez for technical assistance.

REFERENCES
Abeliovich A, Vonshak A (1992) Anaerobic metabolism of Nitrosomonas europaea. Arch Microbiol
158: 267-270
Anderson IC, Poth M, Homstead J, Burdige D 1993. A comparison of NO and N2O production by the
autotrophic nitrifier Nitrosomonas europaea and the heterotrophic nitrifier Alcaligenes faecalis.
Appl Environ Microbiol 59: 3525-3533
Anthonisen AC, Loehr RC, Prakasam TBS, Srinath EG (1993) Inhibition of nitrification by ammonia
and nitrous acid. J Water Pollut Control Fed 48: 835-852
Avrahami S, Conrad R, Braker G (2002) Effect of soil ammonium concentration on N2O release and on
the community structure of ammonia oxidizers and denitrifiers. Appl Environ Microbiol 68: 5685-
5692
Billen G, Servais P (1989) Modélisation des processus de dégradation bactérienne de la matière
organique en milieu aquatique. In: Micro-organismes dans les écosystèmes océaniques. Bianchi et
coll. Masson. p. 219-245.
Billen G, Garnier J, Deligne C, Billen C (1999) Estimates of early-industrial inputs of nutrients to river
systems: implication for coastal eutrophication. The Science of The Total Environment 243-244:
43-52
Billen G, Garnier J, Hanset P (1994) Modelling phytoplankton development in whole drainage
networks: the RIVERSTRAHLER Model applied to the Seine river system. Hydrobiologia 289: 119-
137
Bock E, Schmidt I, Stüven R, Zart D (1995) Nitrogen loss caused by denitrifying Nitrosomonas cells
using ammonium or hydrogen as electron donors and nitrite as electron acceptor. Arch Microbiol
163: 16-20
Bonin P, Tamburini C, Michotey V (2002) Determination of the bacterial processes which are sources
of nitrous oxide production in marine samples. Water Research 36:722-732
Bouwman AF, Boumans LJM (2002) Modeling global and annual N20 and NO emissions from
fertilized fields. Global Geochemical Cycles 16: 28-1- 28-9
Brion N, Billen G (1998) Une réévaluation de la méthode d'incorporation de H CO3 pour mesurer la
14 -

nitrification autotrophe et son application pour estimer des biomasses de bactéries nitrifiantes.
Rev Sci eau 11: 283-302
Brion N, Billen G (2000) Wastewater as a source of nitrifying bacteria in river systems: the case of the
river Seine downstream from Paris. Wat Res 34: 3213-3221
Brion N, Billen G, Guezennec L, Ficht A (2000) Distribution of nitrifying activity in the Seine River
(France) from Paris to the estuary. Estuaries 23: 669-682
Burgess JE, Colliver BB, Stuetz RM, Stephenson T (2002) Dinitrogen oxide production by a mixed
culture of nitrifying bacteria during ammonia shock loading and aeration failure. J Ind Microbiol
Biotech 29: 309-313
Cébron A, Berthe T, Garnier J (2003) Nitrification and Nitrifying Bacteria in the Lower Seine River
and Estuary (France). Appl Environ Microbiol 69: 7091-7100
Cébron A, Coci M, Garnier J, Laanbroek HJ (2004) DGGE analysis of the Ammonia oxidizing bacterial
community structure in the lower Seine River: impact of the Paris wastewater effluents. Appl
Environ Microbiol (in press)

177
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Crutzen PJ (1981) Atmospheric chemical processes of the oxides of nitrogen, including nitrous oxide.
In: C. C. Delwiche [ed.], Denitrification, nitrification and nitrous oxide. pp. 17-44. New York: Wiley
& Sons.
Diab S, Kochba M, Avnimelech Y (1993) Nitrification pattern in a fluctuating anaerobic-aerobic pond
environment. Wat Res 27: 1469-1475
Dong LF, Nedwell DB, Underwood GJC, Thornton DCO, Rusmana I (2002) Nitrous oxide formation in
the Colne Estuary, England: the central role of nitrite. Appl Environ Microbiol 68:1240-1249
Downes MT (1988) Aquatic nitrogen transformations at low oxygen concentrations. Appl. Environ.
microbiol. 54: 172-175
Féray C (2000) Nitrification en sédiment d’eau douce : incidence de rejets de station d’épuration sur la
dynamique de communautés nitrifiantes. Ph.D. thesis. Univ. Lyon I, 202pp.
Garnier J, Billen G, Coste M (1995) Seasonal succession of diatoms and Chlorophyceae in the drainage
network of the Seine River: Observations and modelling. Limnol Oceanogr 40: 750-765
Garnier J, Servais P, Billen G, Akopian M, Brion N (2001) Lower Seine River and Estuary (France)
carbon and oxygen budgets during low flow. Estuaries 24: 964-976
Garnier J, Cébron A, Tallec G, Billen G, Sébilo M, Martinez A. Nitrous oxide emission in the Seine
River estuary (France): comparison with upstream sector of the Seine basin. (submitted)
Houghton JT, Meira Filho LG, Callander BA, Harris N, Kattenberg A, Maskell K (1996) Climate change
1995. In: The Science of Climate Change. pp. 1-572 Intergovernmental panel on climate change,
Cambridge Univ. Press.
Hutchinson GL, Guenzi WD, Livingston GP (1993) Soil water controls on aerobic soil emission of
gaseous nitrogen oxides. Soil Biol Biochem 25: 1-9
Hwang S, Hanaki K (2000) Effects of oxygen concentration and moisture content of refuse on
nitrification, denitrification and nitrous oxide production. Bioresour Technol 71: 159-165
Jiang Q-Q, Bakken LR (1999) Nitrous oxide production and methane oxidation by different ammonia-
oxidizing bacteria. Appl Environ Microbiol 65: 2679-2684
Jianlong W, Ning Y (2004) Partial nitrification under limited dissolved oxygen conditions. Process
Biochem 39: 1223-1229
Kester RA, De Boer W, Laanbroek HJ (1997) Production of NO and N2O by pure cultures of nitrifying
and denitrifying bacteria during changes in aeration. Appl Environ Microbiol 63: 3872-3877
Kowalchuk GA, Bodelier PLE, Hans G, Heilig J, Stephen JR, Laanbroek HJ (1998) Community
analysis of ammonia-oxidizing bacteria, in relation to oxygen availability in soils and root-
oxygenated sediments, using PCR, DGGE and oligonucleotide probe hybridization. FEMS
Microbiol Ecol 27: 339-350
Kuai L, Verstraete W (1998) Ammonium removal by the oxygen-limited autotrophic nitrification-
denitrification system. Appl Environ Microbiol 64: 4500-4506
Lancelot C, Billen G, Veth C, Becquevort S, Mathot S (1991) Modelling carbon cycling through
phytoplankton and microbes in the Scotia-Weddell Sea area during sea ice retreat. Marine
Chemistry 35: 305-324.
Meybeck M (1982) Carbon, nitrogen and phosphorus transport by world rivers. Am J Sci 282: 450
Muller EB, Stouthamer AH, Van Verseveld HW (1995) Simultaneous NH3 oxidation and N2 production
at reduced O2 tensions by sewage sludge subcultured with chemolithotrophic medium.
Biodegradation 6: 339-349
Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG 1993. Profiling of complex microbial populations by
denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes
coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 59: 695-700
Philips S, Wyffels S, Spengers R, Verstraete W (2002) Oxygen-limited autotrophic nitrification/
denitrification by ammonia oxidisers enables upward motion towards more favourable conditions.
Appl Microbiol Biotechnol 59: 557-566
Poth M, Focht DD (1985) N-15 kinetic analysis of N2O production by Nitrosomonas europaea-an
examination of nitrifier denitrification. Appl Environ Microbiol 49: 1134-1141
Ritchie GA, Nicholas DJ (1972) Identification of the sources of nitrous oxide produced by oxidative
and reductive processes in Nitrosomonas europaea. Biochem J 126: 1181-1191
Rodier J (1984) In: Dunod [ed.], L'analyse de l'eau (eaux naturelles, eaux résiduaires, eau de mer), 7th
ed.
Sébilo M (2003) Utilisation du traçage isotopique naturel pour caractériser et quantifier les processus
de nitrification et de dénitrification à l’échelle du réseau hydrographique de la Seine. Ph.D. thesis.
Univ. P. & M. Curie, 124pp.
Seitzinger SP, Kroeze C (1998) Global distribution of nitrous oxide production and N inputs in
freshwater and coastal ecosystems. Global Biochem Cycles 12: 93-113.

178
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Seitzinger SP, Kroeze C, Styles RV (2000) Global distribution of N2O emissions from aquatic systems:
natural emissions and anthropogenic effects. Chemosphere - Global Change Science 2: 267-279
Slavyck G, McIsaac JJ (1972) Comparison of two automated ammonium methods in a region of coastal
upwelling. Deep Sea Res 19: 1-4
Svensson JM, Enrich-Prast A, Leonardson L (2001) Nitrification and denitrification in a eutrophic lake
sediment bioturbated by oligochaetes. Aquat Microb Ecol 23:177-186
Wrage N, Velthof GL, Beusichem MLV, Oenema O (2001) Role of nitrifier denitrification in the
production of nitrous oxide. Soil Biol. Biochem. 33: 1723-1732
Wrage N, Velthof GL, Oenema O, Laanbroek HJ (2004) Acetylene and oxygen as inhibitors of nitrous
oxide production in Nitrosomonas europaea and Nitrosospira briensis: a cautionary tale. FEMS
Microbiol Ecol 47: 13-18

179
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Conclusion
Cette étude du processus de nitrification au niveau des trois étapes, nitrosation,
nitratation et nitrification-dénitrifiante, en conditions contrôlées de laboratoire (pH,
température, oxygénation, concentrations en ammonium et nitrite), nous a permis :
• De valider les paramètres cinétiques (Tableau III.5) attribués aux processus d’oxydation de
l’ammonium et du nitrite et réalisés par les populations bactériennes nitrifiantes
naturellement présentes dans la basse Seine.
• De déterminer les valeurs des paramètres (Tableau III.5) contrôlant la production de N2O
par nitrification-dénitrifiante et d’établir les gammes de concentrations en oxygène,
ammonium et nitrite pour lesquelles les flux de N2O sont maximums.

Tableau III.4. Paramètres cinétiques de nitrosation, de nitratation et contrôlant la production de

N2O par nitrification-dénitrifiante

180
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

III.1.1.5. Modélisation

Les paramètres cinétiques déterminés dans notre étude expérimentale en conditions

contrôlées, ont été utilisés dans la modélisation du processus de nitrification et des émissions
de N2O dans la basse Seine. Cette modélisation nous permet de simuler le fonctionnement
écologique de la basse Seine à l’actuel mais également d’établir de nombreux scénario de
prospective concernant l’état écologique en 2007 et 2015. A ces dates, il est prévu d’installer
des traitements de nitrification et dénitrification à Achères. Pour 2007, normalement la
nitrification devrait être totale et la dénitrification seulement efficace à 30%, et en 2015 le
traitement de dénitrification devrait atteindre un abattement de 70%. Nous avons donc
exploré les conséquences d’un tel changement sur le déroulement des processus dans la basse
Seine et estimer la pollution en oxyde nitreux induite par ce déplacement spatial des
processus de nitrification et dénitrification.

Publication 3. Modélisation des transformations de l’azote dans la basse Seine.

RÉSUMÉ
Un modèle du fonctionnement écologique global d’un hydrosystème à l’échelle de son
bassin (RIVERSTRAHLER : Billen et al., 1994 ; Garnier et al., 1995), a été développé sur le
bassin de la Seine pour décrire les transferts de nutriments (N, P, Si) à l’échelle de tout le
bassin de la Seine en prenant en compte l'activité humaine (les pratiques agricoles, la gestion
des milieux aquatiques, le traitement des eaux usées...).
Alors que le bassin amont est fortement influencé par une agriculture intensive, menant à des
concentrations élevées en nitrate, la basse Seine est fortement peuplée, l’agglomération
parisienne représentant près de 60 % de la population totale du bassin, soit 10 millions
d’habitants, de sorte qu'une grande quantité d'ammonium est apporté par les effluents
domestiques déversés, après traitement secondaire, en aval de Paris (station d’épuration
d'Achères, traitant environ 85 % des effluents parisiens). L'ammonium est complètement
nitrifié dans l'estuaire fluvial amont (200 à 250 kilomètres à l’aval des rejets d’Achères),
provoquant un fort déficit en oxygène en période estivale.
Une représentation conceptuelle de la nitrification a été élaborée, sur la base de
laquelle une analyse physiologique des étapes de la nitrification (nitrosation, nitratation et
nitrification dénitrifiante), en fonction des facteurs de contrôle (O2, NH4+, NO2-), a été
réalisée (Brion & Billen, 1998 ; Cébron et al., soumis, publication 2). La formulation
mathématique des cinétiques et les valeurs des paramètres ont été ajoutés au modèle global
du fonctionnement écologique du secteur fluvial de la Seine. Les résultats de campagnes
estivales différenciant deux périodes de 1993 à 1997 et de 1998 à 2003, en accord avec
l'amélioration des traitements des effluents (Garnier et al., soumis, publication 1), sont
employés pour valider le modèle. Le modèle permet de reproduire les évolutions spatiales et
temporelles des activités des deux communautés microbiennes nitrosantes et nitratantes,
aussi bien que les concentrations en oxygène et en azote (NH4+, NO2-, NO3-, N2O). Une fois
validé, le modèle est utilisé pour explorer la mise en place d'un traitement tertiaire à Achères
(STEP), comme prévu en 2007 dans le cadre de la directive européenne. Considérant qu'un
traitement de nitrification mène à une amélioration significative d'oxygénation et à la
réduction des émissions de N2O, le modèle prouve que la dénitrification doit être ajoutée
pour réduire de manière significative l’apport d'azote à la zone côtière.

Mots clés : Seine, transformations de l’azote, impact anthropique, modélisation, station

d’épuration, scénarios prospectifs.

181
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Draft, en vue d’une soumission à Hydrobiologia

Modelling nitrogen transformations in the lower Seine

river and estuary (France): impact of wastewater release
on oxygenation and N2O emission

Josette Garnier, Gilles Billen & Aurélie Cébron

UMR Sisyphe 7619, Fonctionnement des Hydrosystèmes, Université P. & M. Curie-CNRS, Boite 105, Tour 26, Etage 5, 4 place
Jussieu, 75005 Paris, France

ABSTRACT
A model of ecological functioning of a drainage network at the scale of the basin
(RIVERSTRAHLER: Billen et al., 1994; Garnier et al., 1995), has been developed on the Seine
Basin to describe nutrient (N, P, Si) transfer processes at the scale of the whole Seine Basin
taking into account human activity (agricultural practices, waterscape management, urban
wastewater management…).
Whereas the upstream basin is strongly influenced by an intensive agriculture, leading to
high nitrate concentrations, the lower Seine River and estuary is densely populated, Paris and
suburb representing alone up to 60 % of the population of the whole basin (10.106
inhabitants), so that a large amount of ammonium is brought by domestic effluents
discharged downstream from Paris (the Achères wastewater treatment plant –WWTP-
treating up to 85 % of the effluents). The ammonium loading is completely nitrified in the
upstream fluvial estuary (300 km farther the effluent outlet), which leads to a strong oxygen
deficit in summer.
A conceptual representation of nitrification was elaborated, including the intermediate
production of N2O, on the basis of which a physiological analysis of the two steps of the
nitrification (ammonium and nitrite oxidation) in function of controlling factors (O2, NH4+,
NO2-) was realized (Brion and Billen, 1998; Cébron et al., submitted). Mathematical
formulation of the kinetics and values of the parameters were included into the general
model of ecological functioning of the Seine fluvial sector and freshwater estuary. Results of
field summer studies from 1998 to 2003, following a first step in the improvement of the
effluent treatments (Garnier et al., submitted), are used to validate the model. It allows to
reproduce the spatial and temporal patterns of the activities of the two microbial
communities, as well as the concentrations of oxygen and nitrogen forms (NH4+, NO2-, NO3-
N2O). Once validated the model is used to explore the implementation of a tertiary treatment
at the Achères WWTP, as planned in 2007 in the framework of the European Directive (a 90
% reduction of the ammonium presently discharged by nitrification, and a 30 % reduction of
the nitrate by denitrification. Whereas a nitrification treatment leads to a significant
improvement of oxygenation and reduction of N2O emission, the model shows that only
further denitrification would significantly reduce the nitrogen delivery to the coastal zone.

Key-words: Seine river, nitrogen transformations, human impact, modelling, Waste water
treatment scenarios

182
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

INTRODUCTION
The model RIVERSTRAHLER (Billen et al., 1994; Garnier et al., 1995), developed on
the Seine River and applied to a number of other large rivers in Europe (Garnier et al., 1999;
Garnier et al., 2002; Billen et al., 2004), was used to further study the nitrogen
transformations in the downstream sector of the Seine River strongly impacted by the
wastewater effluents discharged downstream from Paris (by Achères wastewater treatement
plant, one of the largest in Europe treating 6.5 106 inhab.-equivalents, i.e. 65 % of the Parisian
agglomeration effluent and 40 % of the whole basin).
The nitrogen transformations in the drainage network was already refined in the
model to evaluate the role of the riparian zone for nitrate removal in the agricultural basin
(Billen & Garnier, 1999) and to quantify the nitrogen delivery to the coastal zone and the
Redfield ratios (N:P, Si:N, Redfield at al. 1963), that give insights on eutrophication problems
(Billen et al., 2001; Cugier et al., 2004). Also, more downstream, in the main branch of the
Seine River and freshwater estuary, nitrification of the ammonium brought by the effluents
has been previously studied (Brion et al., 2000). The calculation of the oxygen budget in the
sector from Paris to downstream limit of the freshwater estuary showed that nitrification is
predominant in the oxygen depletion of the estuary (Garnier et al., 2001).

To go further in the understanding of the nitrification process, the nitrifying bacterial

populations were investigated along the river continuum to better identify the bacteria at the
origin of the various nitrification pathways, including the N2O production (Cébron et al.,
2004; Cébron et al., 2004). More, experimental studies were particularly devoted to
determine the kinetics and the parameters of N2O production (Cébron et al., submitted),
whereas those of the classical steps of nitrification (ammonium and nitrite oxidation) were
previously determined (Brion et al., 1998).
The aim is here to finely represent the mathematical formulation of the kinetics and
values of the parameters of the two classical steps of the nitrification, as well as that of the
nitrifier-denitrification at the origin of N2O emissions, into the general model of ecological
functioning of the Seine fluvial sector. Once the variables gathered from 1998 to 2003 are
properly simulated, the model can be used to explore the implementation of a tertiary
treatment at the Achères WWTP, planned in the framework of the European directive. In
2007, nitrification should be almost complete whereas only 30 % denitrification should be
achieved (Rousselot & Ruquois, pers. comm.). Such a scenario will allow to calculate the gain
in oxygenation and to investigate the nitrogen delivery to the outlet of the river in relation
with the other nutrients. In addition, since 1970, the global rate of N2O emission has
increased at a rate of 0.2-0.3 % year-1, reaching the present level of about 313 ppb
(Rasmussen & Khalil 1986; Houghton et al. 1996; Garcia-Ruiz et al. 1998; Bange, 2000).
Although mostly attributed to agricultural activities, N2O transformations in rivers and
coastal zones being related to N loading at the global scale (Bouwman 1996; Bouwman et al.
1993; Bouwman et al. 2002; Seitzinger & Kroeze 1998), it is essential to quantify the amount
of N2O emission related to the WWTP tertiary treatment implementation, mainly to know
whether it will cease in the river and freshwater estuary. Modelling N2O emissions taking into
account explicitly the microbial processes involved, represent therefore a challenge, similarly
to the one still actual on the CO2 emissions.

183
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

The Riverstrahler model approach

The RIVERSTRAHLER Model (Billen et al., 1994; Garnier et al., 1995) is still one of the few
available means of modelling nutrient cycling and ecological functioning of entire drainage
networks as functions of the environmental constraints. The modelling strategy, e.g. the
geographical resolution of the whole basin, depends on the objectives (Garnier et al., 2004, in
press;). Here, in order to focus on the lower Seine river sector, downstream from Paris, we
divide the Seine basin into four main sub-basins (The Upstream Seine, the Marne, the Oise
and the Eure) and one branch from Paris (km 0) to the limit of the saline intrusion at
Caudebec (km 310), (Figure 1).
The RIVERSTRAHLER model takes into account the drainage network of each sub-basin
according to the concept of stream orders (Strahler, 1957): the complex network of tributaries
is represented by a regular scheme of the confluence of rivers of increasing stream orders
with mean morphological characteristics (Billen et al., 1994). One obvious limitation of this
approach is the fact that it only provides simulations of the mean behaviour of tributaries of
given orders, instead of describing a real river with its own local characteristics. The flow
from the direct watershed, i.e. the part of the watershed that does not belong to the
catchment of the affluents (see Billen et al. 1994) is calculated from precipitation and
potential evapotranspiration data with a classical rain-discharge conceptual model, taking
into account the role of a soil and an aquifer reservoir (see e.g. Bultot & Dupriez, 1976). The
flow is then routed through the drainage network structure, the flow at any order n being the
sum of the flow of the two n-1 order tributaries and that of lateral tributaries of order 1 to n-1.

Figure 1. Representation of the Riverstrahler model as used here, composed by 4 sub-basins (Seine,
Marne, Oise and Eure) and a main branch. Stagnant systems in connection with the rivers are taken
into account (including the main reservoirs). The same model of ecological processes Rive, (see the
green cartouche) is coupled to the hydro- morphological model.

The basic assumption in the RIVERSTRAHLER model is the unity of the microscopic
processes (biological and physical-chemical) involved in the functioning of river systems; that
means that the kinetics of each of the processes are the same from headwaters to downstream
sectors, while the hydrological constraints controlling their expression differ widely along the
upstream-downstream gradient together with the diffuse sources -which vary in function of
land use within the considered basin- and the point sources, -distributed in function of
stream orders in the upstream basins, but taken explicitly into account along the main
branch-. Therefore, the specificity of the ecological structure and function of the different

184
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

sectors of the river continuum relies on the constraints, rather than in the nature of the
processes involved (Billen et al., 1994; Garnier et al., 2004).

The RIVE Model is essentially the same as used in for several river systems. It consists of 23
variables, including nutrients (nitrate and ammonium, phosphate, dissolved silica), dissolved
and particulate organic matter (as two classes of biodegradability), two taxonomic groups of
phytoplankton (diatoms and non-diatoms), one group of zooplankton dominating in rivers
(rotifers), and bacteria. The description of the phytoplankton dynamics is based on the
formulation by Lancelot et al. (1991), a module that has been adapted to two groups of algae
(diatoms and non diatoms: Garnier et al. 1995) and that take into account the loss processes
by algal excretion and zooplankton grazing (Garnier & Billen 1993; Garnier et al., 1998). The
degradation of organic matter (of two classes of biodegradability) and the bacterioplankton
dynamics, described according to Billen and Servais (1989) and Billen (1991), considered the
allochtonous bacteria brought by the treated effluents (Garnier et al., 1991; Garnier et al.,
1992). The model also comprises an algorithm, based on the resolution of diagenetic
equations (see Berner 1980), calculating nutrient exchanges across the sediment-water
interface as a result of a given sedimentation fluxes of organic material, taking into account
organic matter degradation, associated ammonium and phosphate release and oxygen
consumption, nitrification and denitrification, phosphate and ammonium adsorption onto
inorganic material, mixing processes in the interstitial and in the solid phases, and accretion
of the sedimentary column by inorganic matter sedimentation (Billen et al. 1989; Sanchez,
1997; Billen et al., 1998). Phosphate adsorption to suspended inorganic particles in the water
column (and their subsequent sedimentation) are also taken into account in the RIVE model.

Implementation of N2O emission in the RIVE model

Experimental studies on the factor controlling the nitrous oxide production (Cébron et al.,
submitted) associated to the identification of the bacterial population (Cébron et al., 2003;
Cébron et al., 2004) allows a conceptual representation of the nitrifier-denitrification
process, in which ammonium oxidizing bacteria are also responsible for nitrous oxide
production (N2O). When oxygen concentration is lowered, a disequilibrium appears between
ammonium (NH4+) oxidation and nitrite (NO2-) oxidation, so that NO2- , accumulating in the
system is used instead of oxygen by the same ammonium oxidizing bacteria (Poth & Focht
1985 ; Colliver & Stephenson 2000; Wrage et al., 2001), (Figure 2).

Figure 2. Schematic conceptual

representation of the nitrification,
including the different steps of
ammonium and nitrate oxididation and
nitrifier-denitrification, as based on a
physiological experimental approach
(Brion & Billen, 1998; Cébron et al.,
submitted) and characterization of
nitrifying bacterial populations (Cébron
et al., 2003; Cébron et al., 2004).

The step until N2 production has not yet been specifically investigated, but taking into
account the abilities of nitrifying bacteria to grow in a range of environmental conditions
(Prosser 1989), we assume that the same “conventional” ammonium oxidizing bacteria were
the main actors in the whole process.

185
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Beside the conceptual representation of nitrification, the experimental studies on the rates of
N2O emissions in function of majors controlling factors (NH4+ and NO2- substrate
concentrations and oxygen levels) led to mathematically formulate the kinetics of these N2O
emissions as of Michaelis-Menten types and to determine the associated parameters (see
Cébron et al., submitted; Table 1). The kinetics representation of the classical steps of
ammonium and nitrite oxidization and the values of the parameters was based on the work
by Brion and Billen (1998). Parameters determined by Brion and Billen (1998) on cultivated
bacterial populations were confirmed on experiments using natural communities by Cébron
et al. (submitted).

Table 1. Physiological parameters of the three steps of the nitrification processes (ammonium and
nitrite oxidation and the nitrifier-denitrification) as implemented in the RIVE model.

Although the same bacteria are involved, maximal specific activity for N2O emission
(8.10–3 µgN-N2O µgC-1 h-1) were much less (1-2 %) than the maximal specific activities found
for ammonium oxidation (Brion & Billen, 1998: 0.5-0.7 µgN-NH4 µgC-1 h-1 (Table 1). Half-
saturation constants of the Michaelis-Menten relationships for substrates are relatively high,
i.e. low affinities for substrates, showing that nitrification can only be intense in rather
polluted environment (Table 1). Regarding oxygen, it seems that at low concentration,
around 1 mg l-1, a competition must exist, not only among the ammonium oxidizing bacteria
for the oxidation of ammonium, using either oxygen or nitrite, but also between ammonium
and nitrite oxidizing bacteria (Table 1). The dependency to the temperature is described by a
classical sigmoid relation (half-Gaussian) for which the optimum temperature (topt) and the
standard deviation (dti) have been determined (Brion & Billen, 1998).
Due to the lack of knowledge regarding the transformation of N2O to N2, the values of
the parameters were adjusted to similar specific activity and a high value, i.e. a low affinity or
the substrate; consequently this step plays a limited role in the calculations.
N2O production by denitrification at the water sediment interface was taken into
account considering that 10 % of the N-NO3 denitrified was converted into N-N2O.
SIMULATIONS BY THE MODEL
Validation of the model

As the kinetics included in the model as well as the values of the parameters are determined
separately, the comparison of the simulations with the observations represents a true

186
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

validation of the model. Although the discrepancies may be due to incomplete knowledge of
the processes involved, they can also be due to the quality of the validation data and to the
constraint values (point sources for example), that are difficult to precisely evaluate at a basin
scale.
Point sources given by the Institutions, e .g. SIAAP (Syndicat Interdépartemental de la
l’Assainissement de la Ville de Paris) and AESN (Agence de l’Eau Seine-Normandie), as
suspended solids, Kjelhdal nitrogen, total phosphorus and BOD5 (that is transformed into six
carbon compartments for the model according to Servais et al., 1999). The nitrifying bacteria
in the raw and treated effluents are expressed in function of suspended matter following
Garnier et al. (submitted a).
A rather good agreement between simulations and observations along the longitudinal profile
from Paris to Caudebec (the limit of the salinity intrusion) for all the variables considered
(oxygen, ammonium and nitrate, nitrous oxide, nitrite and nitrifying biomass for a typical
summer period (Figure 3).

a) b)
Figure 3. Simulations by the model of a) concentrations in oxygen, inorganic dissolved ammonium
and nitrate (NH4+, NO3-) and b) of nitrite (NO2-), nitrous oxide (N2O), and potential nitrifying
activities. Longitudinal profile in the lower Seine river, from Paris (km 0) to Caudebec (km 310) for a
typical low water (225 m3 s-1) summer situation. Simulations are compared to the observations
gathered from1998 to 2003.
Along the longitudinal profile from Paris to Caudebec, the model adequately reproduce the
two oxygen deficit, the first one immediately downstream from the Adheres effluents output
due to the heterotrophic utilisation of biodegradable organic matter, whereas the second in
the upstream part of the estuary originates mostly from the nitrification of a the large amount
of ammonium, also brought by the effluents, as shown by the increase in nitrate
concentration (Figure 3a). N2O and NO2-concentrations in the water increase immediately
downstream from the effluent output, but are slightly underestimated by the model. In the
upstream estuary, a better agreement is found at the maximum of nitrifying activity,

187
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

supporting an origin of N2O from nitrification (Figure 3b). However, nitrogen budget have
led to the conclusion that denitrification, that could be active at the sediment water interface
should also be responsible for N2O production (Garnier et al., submitted b). These results call
for a better description of the N2O emissions from denitrification in the model, still poorly
documented in literature.

Impact of a wastewater treatment improvement

Once the observations are correctly reproduced by the model, we can explore its responses to
various constraints, here a quasi complete nitrification treatment (90%) of the effluent at the
Achères wastewater treatment plant and a 30 % denitrification, as planned in 2007 (Figure
4). The characteristics of the treated effluents of Achères are therefore close to those
measured in the effluents issued from a wastewater treatment plant (Colombes WWTP)
already implemented with such a tertiary treatment (Garnier et al, submitted a).
Achères Poses Caudebec Achères Poses Caudebec

16 800 present 2007

present 2007

-1
12 N-NO2, µgN l 600
Oxy, mg l-1

8 400

4 200

0 0
0 100 200 300 0 100 200 300
Km Km

6 8
-1
N-N2O, µgN l
-1

6
N-NH4, mgN l

4
4
2
2

0 0
0 100 200 300 0 100 200 300
Km Km

8 40
-1
-1

N-NH4oxy , µgN l
N-NO3, mgN l

4 20

0 0
0 100 200 300 0 100 200 300
Figure 4. Simulations byKmthe model of concentrations in oxygen, inorganic
Km
dissolved nitrogen
(NH4+, NO3-, , NO2-), nitrous oxide (N2O), and potential nitrifying activities in the lower Seine
river, from Paris to Caudebec for a typical summer situation as planned in 2007 after the
implementation of a tertiary treatment. Simulations are compared to the present situation of the
figure 3.
As the implementation of the tertiary treatment at Achères WWTP will be
accompanied by an increase in BOD5 abatement, an improvement in the water oxygenation
downstream from the effluent input appears (Figure 4). As expected from a drastic
elimination of the ammonium in the treated effluents, the estuary is well oxygenated, due to
the subsequent reduction of nitrifying activity; the N2O and nitrite concentrations decrease
too. It is interesting to mention that a 30 % denitrification treatment in the WWTP reduce
the nitrate concentration at the outlet of the estuary, but the nitrogen delivery to the coastal
zone would still remain to high to reduce coastal eutrophication, 70 to 80 % being necessary
(Cugier et al., 2004).

188
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

DISCUSSION & CONCLUSION

The good agreement found between the observations and the simulations proved that
a further understanding of the nitrifying processes is gained. The originality of this
modelling approach lies on the capability to simulate the N2O production taking explicitly
into account the microbial processes and their controlling factors. Such a modelling
approach that makes a link between the understanding of fine physiological processes of N2O
production at the microscopic scale of the cell or/and genome, with integrative observations
at the regional scale of a river basin, conceptually differs from the statistical studies, most
often used to quantify nitrogen fluxes, but also N2O emission at a global scale (Setzinger &
Kroeze, 1998; Green et al., 2004; Bouwman et al., 2002). Although taken into account in the
model, through the diagenetic module, a refinement of N2O issued from denitrification
represent a next step before the mathematical formulations of N2O emission could be
transferred to models at a global scale, either those dedicated to the world watersheds ocean
input or others such GCM (Global Climatic Model).

Quantifications of nitrous oxide are still scarce but, as a very active component in both
global warming and destruction of the ozone layer, should require more and more attention.
Managements planned for rehabilitation of water quality will indeed lead to decrease the
dissolved inorganic forms of nitrogen, but an increase of gaseous component, in both urban
and rural areas is not excluded. For example, the generalisation of tertiary treatment in
WWTPs could enhance N2O emission, transferring thus the pollution from the aquatic
systems to the atmosphere of large cities. Moreover, it is recognized that denitrification in
riparian wetlands could be a mean to limit nitrate pollution in river waters. Mitigated by
suitable landscape-based measures such as buffer strips could unfortunately contribute to
increase N2O emission (Hanson et al., 1994; McDowell et al., 2003; Pieterse et al., 2003). A
reduction of nitrogen input at the source, i.e. a change in agricultural practices should be
therefore seriously debated.
A major biogeochemical fate is a spatial and functional distribution of the landscape
under human impact, together with the opening of the cycle at a local scale. Differently from
rural traditional agriculture, present agricultural practices imply the import of 120 kgN ha-1 y-
1 of industrial fertilizers among which 40 kgN ha-1 y-1 are exported to the hydrosystems, the

remaining entering into the good circulations towards the large cities and ultimately reaching
the WWTPs and again the hydrosystems. As a result, Howarth et al. (1996), estimated that
more than half of the anthropogenic net nitrogen input to the watersheds is store in soils
or/and aquifers or/and eliminated under gaseous forms during its transfer along the aquatic
continuum.
On a basic research point of view, the model can be currently used for sensitivity tests
of the values of the kinetics parameters within the range of their experimental determination,
but gradients of past or future environmental constraints can be further explored; concepts,
such as functional diversity, river continuum, etc. can be thus quantified. Regarding
management purposes, scenarios with alternative policies of wastewater nitrogen treatment,
can be applied. We have shown that reducing oxygen deficit in the Seine Estuary is
technically possible from a tertiary treatment implementation. But, such tests must be
accompanied by cost-benefit estimations.

189
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Acknowledgments
This work was undertaken in the framework of the programmes Seine-Aval, funded by the
Région Haute-Normandie and the Agence de l’Eau Seine-Normandie (AESN), and the
PIREN-Seine funded by the CNRS and several institutions involved in the water management
of the Seine River, including AESN and the Syndicat Interdépartemental pour
l’Assainissement de l’Agglomération Parisienne (SIAAP).

REFERENCES
Bange WH (2000) It’s not a gas. Nature, 408:301-302
Berner, R.A. (1980). Early diagenesis. A theoretical approach. Princeton University Press.
Billen, G., Servais P. (1989). Modélisation des processus de dégradation de la matière organique en milieu
aquatique. In Bianchi, M. et al. (Eds) : Microorganismes dans les écosystèmes océaniques, Chap. 8. 219-
245, Masson, Paris.
Billen, G., Dessery S., Lancelot C., Meybeck M. (1989). Seasonal and interannual variations of nitrogen diagenesis
in the sediment of a recently impounded basin. Biogeochemistry 8 73- 100
Billen, G. (1991). Protein degradation in Aquatic Environments. In: Microbial Enzyme in Aquatic Environments.
R. Chrost, ed., Springer Verlag, Berlin, pp. 123-143.
Billen G., Garnier J. et Hanset Ph. (1994). Modelling phytoplankton development in whole drainage networks: the
RIVERSTRAHLER model applied to the Seine river system. Hydrobiologia, 289:119-137.
Billen G. & Garnier J. (1999). Nitrogen transfers through the Seine drainage network: a budget based on the
application of the Riverstrahler model. Hydrobiologia, 410: 139-150.
Billen G., Garnier J., Ficht A. & Cun C. (2001). Modelling the response of water quality in the Seine Estuary to
human activity in its watershed over the last 50 years. Estuaries, 24(6) : 977-993.
Bouwman AF (1996) Direct emission of nitrous oxide from agricultural soils. Nutr. Cycling Agroecosyst., 46: 53-
70
Bouwman AF, Fung I, Matthews E & John J (1993) Global analysis of the potential for N2O production in natural
soils. Global Biogeochem. Cycles, 7: 557-597
Bouwman AF, Boumans JM, Batjes NH (2002) Emissions of N2O and NO from fertilied fields: Summary of
available measurement data. Global Biogeochem. Cycles, 16(4): 6/1-6/12
Bultot F. & Dupriez G. (1976). Conceptual hydrological model for an average-sized catchment area. J. hydrol.,
39:251-292.
Brion N., Billen G. (1998). Une réévaluation de la méthode d'incorporation de 14HCO3 pour mesurer la
nitrification autotrophe et son application pour estimer les biomasses de bactéries nitrifiantes. Rev. Sci.
Eau 11, 283-302.
Brion N, G. Billen, L. Guézennec, & A. Ficht (2000) Distribution of nitrifying activity in the Seine river (France)
from Paris to the estuary. Estuaries, 23:669-682.
Cébron A., Berthe T. & Garnier J. (2003). Nitrification and Nitrifying bacteria in the lower Seine River and
estuary. Appl. Environ. Microbiol., 69: 7091-7100
Cébron A., Coci M., Garnier J.& Laanbroek H.J. (2004). DGGE analysis of the Ammonia Oxidizing Bacterial
Community structure in the lower Seine River: impact of the Paris wastewater effluents. Appl. Environ.
Microbiol. 70:6726-6737
Cébron A., Garnier J. & Billen G. (submitted). Nitrous oxide production and nitrification kinetics by bacteria
communities naturally present in river water (the lower Seine, France). Aquatic Microbial Ecology
Colliver BB, Stephenson T. 2000. Production of nitrogen oxide and dinitrogen oxide by autotrophic nitrifiers.
Biotechnology Advances. 18: 219-232.
Cugier Ph., Billen G. , Guillaud, J.F., Garnier, J. & Ménesguen A. (2004). Modelling the eutrophication of the
Seine Bight (France) under historical, present and future riverine nutrient loading. J. Hydrol.
Garcia-Ruiz R, Pattinson SN & Whitton BA (1998) Kinetic parameters of denitrification in a river continuum.
Appl. Environ. Microb., 64: 2533-2538.
Garnier J., Servais P. et Billen G. (1991). Bacterioplankton in the Seine River: impact of the parisian urban
effluents. Can. J. Microbiol., 38: 56-64
Garnier J., Billen G., Servais P. (1992). Physiological characteristics and ecological role of small and large bacteria
in a polluted river (Seine River, France). Arch. Hydrobiol., Beih, 37, 83-94.
Garnier J. & Billen G. (1993). Ecological interactions in a shallow sand-pit lake (Créteil Lake, France). A modelling
approach. In: Nutrient dynamics and biological structure in shallow freshwater and brackish lakes.
Hydrobiologia, 275/276:97-114.
Garnier J., Billen G. & Coste M. (1995). Seasonnal succession of diatoms and Chlorophyceae in the drainage
network of the river Seine: Observations and modelling. Limnol. Oceanogr. 40: 750-765.
Garnier J., Billen G. & Palfner L. (1999). Understanding the oxygen budget od the Mosel drainage network with
the concept of heterotrophic/autotrophic sequences: the Riverstrahler approach. Hydrobiologia, 410: 151-
166.

190
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Garnier J., Servais P., Billen G., Akopian M. & Brion N. (2001). The oxygen budget in the Seine estuary: balance
between photosynthesis and degradation of organic matter. Estuaries 24(6) : 964-977.
Garnier J., Billen G., Hannon E., Fonbonne S., Videnina Y. & Soulie (2002)-Modeling transfer and retention of
nutrients in the drainage network of the Danube River. Estuar. Coast. Shelf Sci., 54: 285-308.
Garnier J. & Billen G. (2002). The Riverstrahler modelling approach applied to a tropical case study (The Red –
Hong- River, Vietnam): nutrient transfer and impact on the Coastal Zone. SCOPE, Coll. Mar. Res. W., 12:
51-65
Garnier J., Cébron A. Tallec G., Billen G., Sebilo M. & Martinez A. (submitted). Nitrous oxide emission in the
Seine River estuary (France): comparison with upstream sector of the Seine basin. Biogeochemistry.
Garnier J., Laroche L., Pinault S. (submitted). Characterization of the effluents of two large waste water plants of
the city of Paris (France): how to comply with the European directive ? Water Res.
Goreau TJ, Kaplan WA, Wofsy SC, McElroy MB, Valois FW, Watson SW. 1980. Production of nitrite and N2O by
nitrifying bacteria at reduced concentrations of oxygen. Appl. Environ. Microbiol. 40:526-532.
Green PA, Vörösmarty CJ, Meybeck M, Galloway JN, Peterson BJ, & EW Boyer (2004). Pre-Industrial and
Contemporary Fluxes of Nitrogen through Rivers: A Global Assessment Based on Typology. In press,
Biogeochemistry.
Hanson G.C., Groffman P.M. & Gold A.J. (1994). Denitrification in riparian wetlands receiving high and low
groundwater nitrate inputs. J. Environ. Qual. 23: 917-922
Houghton JT, Meira Filho LG, Callander BA Harris N, Kattenberg A & Maskell K (Eds) (1996) Climate change
1995. The Science of Published for Intergouvernmental panel on climate change, Cambridge Univ. Press.
pp 1-572)
Howarth R.W., Billen G, Swaney D., Townsend A., Jaworski N., Lajtha K., Downing J.A., Elmgren R., Caraco N.,
Jordan T., Berendse F., Freney J., Kudeyarov V., Murdoch P., and Zhao-liang Z. (1996). Regional nitrogen
budgets and riverine N & P fluxes for the drainages to the North Atlantic ocean: natural and human
influences. Biogeochemistry 35: 75-139.
Lancelot C., Veth C. & Mathot S. (1991). Modelling ice-edge phytoplankton bloom in the Scotia-Weddell Sea sector
of the Southern Ocean during spring 1988. Journal of Marine system, 2:333-346.
Piterse N.M., Bleuten W. & Jorgensen S.E. (2003). Contribution of point sources and diffuse sources to nitrogen
and phosphorus loads in lowland river tributaries. J. Hydrol. 271: 213-225.
Poth M, Focht DD. 1985. N-15 kinetic analysis of N2O production by Nitrosomonas europaea-an examination of
nitrifier denitrification. Appl. Environ. Microbiol. 49:1134-1141.
Rasmussen RA & Khalil MAJ (1986) Atmospheric trace gases : trends and distribution over the last decade.
Science, 232: 1623-1624
Redfield, A. C., Ketchum B. H., Richards F. A. (1963). The influence of organisms on the composition of sea-water.
In M. N. Hill (ed.), The Sea, John Wiley & Sons, New York, p. 12-37.
Servais P., Garnier J., Demarteau N., Brion N. & Billen G. (1999). Supply of organic matter and bacteria to aquatic
ecosystems through wastewater effluents. Water Research, 33: 3521-3531.
Sanchez N. (1997). Le processus de dénitrification dans les sédiments du barrage-réservoir de la Marne: étude de
sa cinétique et modélisation. Thèse Univ. P&M. Curie. 140 pp.
Seitzinger SP & Kroeze C (1998) Global distribution of nitrous oxide production and N inputs in freshwater and
coastal ecosystems. Global Biochem. Cycles, 12: 93-113
Strahler A. N. (1957). Quantitative analysis of watershed geomorphology. Transactions, American Geophysical
Union. Vol. 38. No. 6.

Conclusion

Cet exercice de modélisation nous a montré que nous avions une bonne
compréhension du processus de nitrification puisque les résultats de simulation du modèle
sont en accord avec les observations. Nous avons donc exploré un scénario en 2007 où la
nitrification à Achères serait complète et la dénitrification efficace à 30%. Les répercussions
d’un tel changement sur la basse Seine sont donc flagrantes, il n’y a plus de NH4+ rejeté par
Achères, il n’y a donc plus d’activité nitrifiante dans la basse Seine et ainsi la production de
N2O n’a plus lieu dans le milieu récepteur toutefois il faut rester prudent car ces émissions de
gaz à effet de serre peuvent avoir simplement été déplacées et avoir lieu dans la station
d’épuration.

191
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

III.1.2. La nitrification dans l’estuaire aval

Les estuaires sont décrits comme des milieux ayant leur propre système d’épuration,
avec une intense activité microbienne (Bianchi et al. 1994 ; Iriarte et al. 1996 ; Tappin et al.
2003 ; De Bie et al. 2002). Ces écosystèmes sont des environnements complexes, où les
processus sont souvent difficiles à mettre en évidence à cause du mélange de l’eau douce et de
l’eau de mer. La présence de plusieurs masses d’eau perturbe donc souvent l’interprétation
des résultats, toutefois il est intéressant de tenter d’identifier les processus se déroulant au
sein du bouchon vaseux et du gradient de salinité.

Nous nous intéresserons uniquement ici à l’évolution des différentes formes d’azote
inorganique et aux mesures d’activités nitrifiantes potentielles. La plupart des données sont
exprimées soit par unité de volume ou en fonction de la concentration en MES (Matières en
suspension) et seront interprétées en fonction de la salinité de l’échantillon analysé.

[Link] des différentes formes d’azote

Les résultats des concentrations en ammonium et nitrate pour l’ensemble des

campagnes sont présentés en fonction de la salinité afin de définir un schéma général de
fonctionnement en terme de dilution (Figure III.7).

Figure III.7. Évolution des concentrations en ammonium et nitrate dans le gradient de salinité
pour les campagnes de 2001 à 2003 présentées dans le tableau II.2.

L’ammonium étant presque entièrement consommé à l’arrivé de l’eau dans l’estuaire

aval, les concentrations observées sont très faibles, et sont souvent proches de la limite de
détection de la méthode. Ainsi au premier abord, nous n’observons pas vraiment d’effet de
dilution au sein du gradient de salinité ni de production significative d’ammonium issu du
« turnover » rapide de la matière organique au niveau du bouchon vaseux. Toutefois en
considérant chaque campagne indépendamment les unes des autres (Figure III.8), il apparaît
des tendances propres à chacune des campagnes. Les concentrations en ammonium tendent
à montrer une production (minéralisation de la matière organique) dans les plus fortes
salinités pour toutes les campagnes exceptées celles de printemps (avril et mai 2003) où le
bouchon vaseux n’est pas installé dans l’estuaire (Figure III.8). A noter qu’en 2003,
l’augmentation de la concentration en ammonium au sein du bouchon vaseux est de plus en
plus forte au cours de l’année, un signe d’une activité biologique croissante. La production
nette d’ammonium est très faible, toutefois la production réelle pourrait être plus importante
dans le cas où cette production serait contrebalancée par une activité nitrifiante consommant
une partie du NH4+ produit, le bilan des deux pourrait s’avérer quasiment nul. Pakulski et al.
(1995) montrent par exemple que dans l’estuaire du Mississippi, la concentration en

192
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

ammonium est très faible malgré une intense activité nitrifiante, prenant place aux salinités
intermédiaires et étant majoritairement responsable de la consommation en oxygène.

Figure III.8. Evolution des concentrations en ammonium dans le gradient de salinité présentée
séparément pour les campagnes NUTS01, NUTS02 et d’avril à octobre 2003.

Les données des concentrations en nitrite ne sont pas présentées car elles sont très
faibles dans tout le gradient de salinité (entre 0.01 et 0.03 mg N-NO2-.L-1) et aucun effet de
dilution, de consommation ou de production n’est observé.

En ce qui concerne la concentration en nitrate, il apparaît une décroissance linéaire

(Figure III.7) en fonction de la salinité mettant en évidence un comportement quasi
conservatif, comme si le nitrate était passivement dilué dans l’eau de mer, et que les
processus tels que la nitrification ou la dénitrification étaient de faible importance dans
l’estuaire aval.
Afin de mieux comprendre la dispersion des valeurs, nous avons également séparé les
résultats des différentes campagnes (Figure III.9). Même si la pente de la droite de dilution
varie, elle reste toutefois comprise entre -0.16 et -0.29. Présentés ainsi, les coefficients de
corrélation (R2) des droites de dilution sont assez élevés, ils sont compris entre 0.62 et 0.99.
La principale source de variabilité entre les différentes campagnes est la valeur en nitrate à
Caudebec (Km 310) de salinité 0 0/00 (4.2 - 6.1 mg N-NO3.L-1 pour la campagne NUTS01 ; 5.6
– 6.8 mg N-NO3.L-1 pour la campagne NUTS02 ; 6.3 – 8.5 mg N-NO3.L-1 pour les campagnes
de 2003). Cette concentration dépend des apports du bassin amont et de la quantité
d’ammonium nitrifié à l’aval d’Achères. Par exemple au moment du cycle de marée d’octobre
2003, la concentration en nitrate à l’entrée de l’estuaire est beaucoup plus élevée que pour
toutes les autres campagnes : elle atteint 8.5 mg N-NO3-.L-1.

Figure III.9. Évolution des concentrations en nitrate dans le gradient de salinité présentée
séparément pour les campagnes NUTS01, NUTS02 et d’avril à octobre 2003.
L’étude menée récemment sur la composition isotopique de l’azote des nitrates dans
ce secteur de la Seine montre que, contrairement au comportement conservatif des nitrates
par rapport à la salinité, la distribution de la composition isotopique de l’azote des nitrates
(δ15N), s’écarte sensiblement de la droite de dilution (Sébilo 2003). Les compositions

193
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

isotopiques sont systématiquement et significativement supérieures à celles qui seraient

attendues d’une simple dilution et indiquent la présence du processus de dénitrification dans
le gradient de salinité (Sébilo 2003).
Comme la concentration en nitrate suit la droite de dilution, nous pouvons supposer
que le processus de dénitrification est contrebalancé par l’activité nitrifiante. Ceci confirme
notre hypothèse émise plus haut de la présence d’une nitrification active au niveau du
gradient de salinité.
Cette compensation entre les processus de nitrification et de dénitrification a déjà été
observée par exemple dans des sédiments côtiers (en mer du Nord, mer Baltique,
Cheasapeake Bay et Fjords Scandinaves), où la nitrification, qui est active en surface des
sédiments, fournit du nitrate au processus de dénitrification (Seitzinger & Giblin 1996 ;
Rysgaard et al. 1994). De même les études effectuées sur l’estuaire du Rhône par Feliatra &
Bianchi (1993) et Bianchi et al. (1994) ont montré la présence simultanée des deux processus.

Les concentrations en oxyde nitreux (N2O) montrent, comme pour l’ammonium, des
profils variables étroitement dépendants des situations hydrologiques et des activités
biologiques (Figure III.10). Par rapport aux années 2001 et 2002, on observe une grande
variabilité lors de l’étiage de 2003. L’oxyde nitreux pouvant être produit par nitrification et
dénitrification, cette fluctuation des mesures est probablement liée aux variations de
l’intensité de ces deux processus au cours de la saison, auxquelles se superpose l’évolution
hydrologique de la situation d’étiage 2003. En 2001, il semble que la distribution du N2O en
fonction de la salinité suive une courbe de dilution. En 2002, la distribution est plus
complexe, avec tout d’abord une consommation de N2O aux faibles salinités (entre 0 et 3
0/ ), puis une concentration qui décroît linéairement suivant l’effet de dilution.
00

Figure III.10. Évolution des concentrations en oxyde nitreux dans le gradient de salinité présentée
séparément pour les campagnes NUTS01, NUTS02 et d’avril à octobre 2003.

L’intensité des émissions de N2O, dans les estuaires et les zones côtières, serait
étroitement liée à la quantité d’azote inorganique anthropique apporté à ces écosystèmes
(Seitzinger & Kroeze 1998 ; Naqvi et al. 2000). Bien que ne représentant que 18% de la
surface océanique, les régions côtières pourraient être à l’origine de 60% du flux net de N2O
des océans, principalement dû aux fortes émissions relevées dans les estuaires (Bange et al.
1996 ; Punshon & Moore 2004).

Le processus de dénitrification est anaérobie et la nitrification est susceptible de

produire du N2O en conditions de stress oxique et en présence d’ammonium (McElroy et al.
1978). Ainsi, ces deux processus produisant du N2O ont besoin de faibles concentrations en
oxygène. Ces conditions peuvent être rencontrées dans le bouchon vaseux, dans les premiers
cm du sédiment ou dans les particules en suspensions dans la colonne d’eau où sont
présentes des micro-niches anoxiques favorisant ces processus (Bianchi et al. 1994 ; Omnes
et al. 1996 ; Michotey & Bonin 1997). Une étude récente a d’ailleurs permis de montrer que le

194
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

processus de dénitrification était majoritairement responsable de la production de N2O dans

l’estuaire du Rhône laissant place à la nitrification en mer (Bonin et al. 2002).

III.1.2.2. Activités nitrifiantes potentielles

Les activités nitrosantes et nitratantes potentielles sont exprimées par unité de

matières en suspension afin de s’affranchir des variations apparaissant au cours des
différentes campagnes et pour observer uniquement l’effet de la salinité. La figure III.11
présente cependant les variations de quantités de matières en suspension dans le gradient de
salinité. Ce graphique permet d’illustrer la présence du bouchon vaseux qui se caractérise par
une forte concentration en MES entre les salinités 0 et 20 0/00.

Figure III.11. Quantité de Matières en

suspension (MES) en fonction de la salinité
pour les campagnes NUTS01, NUTS02 et de
2003.

Les valeurs des activités nitrosantes et nitratantes ne suivent pas la droite de dilution
que l’on attend du mélange entre l’eau douce et l’eau de mer ; la relation des activités
nitrifiantes en fonction de la salinité (Figure III.12) met au contraire en évidence que les
activités peuvent être maximales à des degrés variés de salinité selon les conditions.

195
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Figure III.12. Évolutions des activités nitrosantes et nitratantes potentielles dans le gradient de
salinité présentées séparément pour les campagnes NUTS01, NUTS02 et d’avril à octobre 2003.

En 2001, lors des forts débits, l’activité nitrifiante potentielle est forte pour une
salinité nulle. Alors que pour les plus faibles débits de 2002 et 2003, les activités nitrifiantes
potentielles sont plus élevées au niveau des salinités moyennes (entre 5 et 15 0/00), ceci
concorde avec la zone de minéralisation de la matière organique et de production
d’ammonium. Généralement la même tendance est observée pour la nitrosation et la
nitratation, les valeurs potentielles de la nitratation étant toutefois environ 1.6 fois plus faible
que celles de la nitrosation (Figure III.13).

Figure III.13. Relation entre les activités

nitrosantes et nitratantes potentielles pour
l’ensemble des campagnes.

Nous avons effectué un test afin de connaître l’effet inhibiteur du chlorure de sodium
(NaCl) sur l’activité nitrifiante des populations bactériennes de la Seine adaptée au milieu
d’eau douce. Nous avons prélevé de l’eau à Duclair (station dans l’estuaire amont) sur
laquelle nous avons mesuré les activités nitrosantes et nitratantes potentielles. Nous avons
ajouté différentes quantités de NaCl (5, 10, 15 et 30 mg/L) et mesuré les activités nitrosantes
et nitratantes dans ces conditions variables de salinités (Figure III.14). Ce résultat montre

196
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

clairement une inhibition rapide de l’activité des bactéries nitrifiantes. Dès 50/00 de salinité,
l’activité potentielle est réduite à ¼ de sa valeur initiale à une salinité nulle. Puis très vite, les
activités nitrosantes et nitratantes tombent à des valeurs proches de zéro. Uygur & Kargi
(2004) ont testé l’effet de la salinité sur le recyclage des nutriments dont le NH4+ ; ils ont
observé que la consommation de l’ammonium diminuait linéairement plus la salinité
augmentait.

Figure III.14. Test de l’effet de la salinité

sur les activités nitrosantes et nitratantes
potentielles d’un échantillon d’eau de
Duclair. Les équations des courbes en
pointillés représentent l’effet inhibiteur de
la salinité.

Sur la Figure III.13 nous avons fait apparaître en pointillés les profils d’activités
supposés, si seul l’effet d’inhibition par la salinité était la cause de la diminution d’activité
nitrifiante. Si l’effet de dilution s’ajoute à l’inhibition nous devrions quasiment avoir des
valeurs nulles d’activité dès 2-3 0/00 de salinité. Néanmoins, nous observons des valeurs de
nitrosation et de nitratation bien au dessus de la courbe d’inhibition, il s’agit là de la preuve
qu’il y a une nitrification nette réalisée par des bactéries nitrifiantes s’étant spécifiquement
installées au niveau du bouchon vaseux. Cette communauté bactérienne présente dans
l’estuaire de Seine doit être halotolérante ou halophile et adaptée aux conditions particulières
de l’estuaire (forte charge en MES, faibles concentrations en ammonium et salinité variable).
Nous savons que les bactéries nitrifiantes préfèrent être attachées aux particules
plutôt que libres. Les bactéries nitrifiantes formes des amas, elles s’accrochent aux particules
et forment ainsi un floc. Dans l’estuaire de l’Elbe, entre 50 et 100% des bactéries nitrifiantes
sont attachées aux flocs (Stehr et al. 1995b). De même, dans l’estuaire de l’Urdaibai, l’activité
nitrifiante est associée à la fraction supérieure à 3 µm (Iriarte et al. 1996). Le matériel
particulaire ayant un temps de résidence plus élevé que l’eau, l’attachement des bactéries aux
particules en suspension leur permet de rester plus longtemps dans l’estuaire. Ainsi Owens
(1986) a montré une relation linéaire entre le taux de nitrification et la concentration en
MES. De même une corrélation positive, entre la concentration en MES et le nombre de
bactéries associées, a été démontrée dans les estuaires de Humber et Yorkshire Ouse (Uncles
et al. 1998 et références citées par ces auteurs).

Les activités potentielles les plus élevées mesurées pour chaque campagne
correspondent à des activités réelles relativement faibles comprises entre 0.45 et 6.79 µmol
N.L-1.j-1 (Tableau III.7 ; les valeurs de Km utilisées sont KmNH4 = 1 mg.L-1 et Km NO2 = 0.03
mg.L-1). Nos valeurs sont du même ordre de grandeur que celles mesurées dans les estuaires
du Rhône (de 1 à 2 µmol N.L-1.j-1) et le l’Urdaibai (entre 0.02 et 4.6 µmol N.L-1.j-1) et la rivière
Tamar (3 µmol N.L-1.j-1).

197
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Tableau III.5. Comparaison des activités nitrosantes et nitratantes potentielles et réelles de

l’estuaire de Seine avec certaines activités nitrifiantes réelles publiées (tableau adapté d’après De Bie
et al. 2002).

198
Chapitre III. Résultats 1. Etude du processus de nitrification

Conclusion

Cette partie n’étant encore que préliminaire, nous ne pouvons pas toujours confirmer
l’interprétation des résultats. Nous avons néanmoins pu établir certaines hypothèses
confortées par la plupart de nos observations in situ. Nous pouvons donc d’ors et déjà
formuler certaines conclusions :
• Les concentrations en NH4+ tendent à augmenter avec la salinité, il y aurait donc une
production nette d’ammonium.
• Les nitrates sont dilués linéairement en fonction de la salinité : il n’y a ni production ni
consommation apparente.
• Les deux processus de nitrification et dénitrification doivent se contrebalancer l’un l’autre.
• Il y a une production de N2O dans l’estuaire aval en situation d’étiage en 2003.

Ces conclusions peuvent être illustrées par les bilans d’azote, réalisés pour les campagnes
d’août 2001 et 2003 et illustrés en Figure III.16.
Nos observations montrent une faible élimination des nitrates dans le bouchon vaseux
contrairement à ce qui est généralement rapporté dans la littérature. De plus, alors que le
bouchon vaseux ne semble avoir qu’un rôle mineur concernant le cycle de l’azote, la
respiration de la matière organique (bactérienne et phytoplanctonique), produisant de
l’ammonium, est relativement forte.

Figure III.15. Bilan de l’azote pour deux situations contrastées (août 2001 et 2003) entre Caudebec
recevant les apports de l’estuaire amont et la Baie de Seine à la salinité 15 0/00. Les quantités d’azote
entre caudebec et la salinité 15 0/00 sont exprimées en Tonne de N et les flux en T N.j-1. Les flux
d’ammonium et de nitrate sont calculés à partir des concentrations mesurées à Caudebec, les
concentrations exportées en Baie de Seine sont déduites de l’extrapolation des droites de dilutions à 0
0/ . Les flux d’azote organique particulaire sont calculés à partir des flux de carbone (C :N=5). Les
00
stocks d’azote inorganiques sont basés sur la moyenne des concentrations dans la zone de turbidité
maximum, les stocks d’azote particulaire sont dérivés du contenu en carbone des matières en
suspension, la gamme étant obtenue à partir de données mesurées et obtenues par modélisation
(SiAM : S. Even & B. Thouvenin, pers. Comm.). Nous n’avons également considéré aucun export de
matériel particulaire dans ce secteur en période estivale.

199
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

200
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

III.2. Étude des populations bactériennes

nitrifiantes

Dans cette seconde partie du chapitre III « résultats », nous étudierons le processus
de nitrification à une autre échelle, celle de l’espèce. Il s’agit d’étudier la nitrification en
s’intéressant de plus près aux populations bactériennes responsables de l’activité nitrifiante.
Seule l’étude de la diversité phylogénétique des bactéries impliquées dans la nitrification in
situ permettait d’identifier les espèces bactériennes autochtones présentes dans la Seine à
l’amont de l’agglomération parisienne et les espèces allochtones apportées par les rejets
d’Achères. Il s’agissait en effet d’appréhender l’impact de l’ensemencement de bactéries
nitrifiantes par les effluents de cette station d’épuration sur le devenir et l’évolution de la
communauté bactérienne nitrifiante dans la basse Seine. Au même titre que l’activité
nitrifiante a été étudiée sous ses deux étapes pour mieux comprendre la nitrification-
dénitrifiante, il était essentiel d’étudier les deux groupes bactériens fonctionnels, les
nitrosantes et les nitratantes, tant d’un point de vue quantitatif que qualitatif. Cependant, il
est difficile d’étudier ces deux groupes avec la même approche expérimentale à cause de leur
différence taxonomique. En effet, les bactéries nitrosantes forment pour la plupart un groupe
monophylétique au sein de la sous-classe β des Protéobactéries alors que les bactéries
nitratantes sont divisées en plusieurs genres polyphylétiques, ce qui limite les outils
disponibles pour l’analyse de la communauté nitratante dans sa globalité. En revanche les
bactéries nitrosantes peuvent être ciblées toutes en même temps grâce aux outils
moléculaires. Nous avons ici réalisé une analyse approfondie de la communauté nitrosante,
grâce à l’utilisation d’amorces PCR spécifiques des bactéries de la sous classe β des
Protéobactéries en ciblant soit l’ADNr16S soit un fragment du gène amoA. En ce qui
concerne l’analyse des bactéries nitratante, comme il n’existe pas d’outil permettant de cibler
l’ensemble de la communauté, nous nous sommes intéressés aux deux genres
majoritairement rencontrés dans les milieux d’eau douce, Nitrobacter et Nitrospira, dont la
distribution dans la basse Seine est ensuite présentée.

201
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

III.2.1. Les bactéries nitrifiantes dans la basse Seine

Rappelons que parmi l’ensemble des profils longitudinaux étudiés du point de vue de
l’activité nitrifiante en basse Seine, les populations bactériennes nitrosantes et nitratantes ont
été étudiées sur ceux de septembre 1998, juillet 2002, septembre 2002 et septembre 2003.
Les populations bactériennes nitratantes ont également été étudiées dans des échantillons
prélevés dans des cours d’eau de tête de bassin (Bassin de l’Orgeval) et dans les deux
principaux affluents de la basse Seine : l’Oise et l’Eure (cf. partie III.1.1.2).

III.2.1.1. Les populations bactériennes nitrosantes

La diversité de la communauté bactérienne nitrosante a été étudiée par deux

approches moléculaires différentes mais complémentaires faisant chacune l’objet d’une
publication. Dans les deux cas nous avons quantifié les bactéries nitrosantes par PCR
compétitive.
Nous avons d’abord étudié la diversité bactérienne nitrosante en deux sites de la basse
Seine (à l’aval immédiat d’Achères et dans l’estuaire amont) grâce à l’emploi d’amorces PCR
ciblant un fragment du gène amoA. Deux banques de gène amoA ont été construites et
analysées par RFLP. Le séquençage de certains clones a permis d’établir la phylogénie de la
communauté nitrosante présente en chacun des deux sites.
Afin d’appréhender la variabilité spatiale et temporelle de la communauté nitrosante
le long du continuum, nous avons mis en oeuvre la technique DGGE, plus rapide, en utilisant
des amorces PCR ciblant un fragment de l’ADNr 16S spécifique des nitrosantes de la sous-
classe β des Protéobactéries. Nous avons ainsi pu analyser la diversité bactérienne nitrosante
en 16 à 18 stations entre la confluence de la Marne et de la Seine et l’estuaire aval, sur trois
campagnes différentes.

Publication 4. Nitrification et bactéries nitrifiantes dans la basse Seine, étude

des sites de Triel et Duclair

RÉSUMÉ
La station d’épuration d’Achères, située juste à l’aval de Paris, déverse ses effluents
dans la basse Seine. Les effluents traités d’Achères apportent de grandes quantités de matière
organique et d’ammonium, mais sont également source de bactéries hétérotrophes et de
bactéries nitrifiantes. La dégradation de la matière organique par les bactéries hétérotrophes
conduit à un déficit en oxygène observé immédiatement à l’aval du rejet des effluents. Les
bactéries nitrifiantes doivent apparemment atteindre une biomasse significative avant que
l’oxydation complète de l’ammonium ne provoque une baisse de la concentration en oxygène
dissous dans la colonne d’eau. Outre les activités nitrifiantes potentielles, les vitesses
potentielles d’oxydation de l’ammonium (nitrosation) et d’oxydation du nitrite (nitratation),
ont été mesurées en parallèle dans la basse Seine, de Paris à l’estuaire. Durant la période
estivale, l'activité nitrifiante potentielle maximale est observée dans l'estuaire amont, à
environ 200 km en aval d’Achères. Les quantités de bactéries nitrifiantes, celles des
nitrosantes basées sur le nombre de copies du gène amoA et celles des nitratantes à travers le
nombre de bactéries du genre Nitrobacter, dénombrées grâce au nombre de copie d’ADNr
16S, présentent des profils similiaires à ceux des activités nitrifiantes potentielles
correspondantes. La composition de la communauté bactérienne nitrosante a été étudiée en
deux sites : à la station de Triel située juste en aval d'Achères (km 84) et dans l'estuaire
amont, à la station de Duclair (km 278). À l'aide des amorces PCR ciblant le gène amoA, une

202
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

banque de gène a été construite pour chacun des deux sites d’échantillonnage. L'analyse
phylogénétique a montré que la majorité des clones aux deux stations étaient affiliés au genre
Nitrosomonas. Les clones proches phylogénétiquement de N. oligotropha et ureae
représentent près de 81% de la communauté nitrosante de Triel et 60% de celle de Duclair.
Les deux autres groupes de bactéries nitrosantes appartenant à la lignée représentée par N.
europaea et au phylum Nitrosospira, ont été détectés en plus faibles proportions. Le
changement principal de composition de la communauté nitrosante entre les deux stations
semble être l’augmentation de la proportion de Nitrosospira au détriment des bactéries
proches de N. oligotropha et ureae. Bien que la diversité des bactéries nitrosantes semble
être identique pour les deux sites, seule la moitié des profils de restriction sont communs aux
deux stations, ce qui s’explique par la différence de concentration en ammonium, très faible
au niveau de l'estuaire amont par rapport au site de Triel juste à l’aval des rejets, chargés en
ammonium. Ces résultats tendent à montrer une immigration et/ou une sélection de la
population bactérienne nitrosante le long du continuum de la Seine entre Paris et son
estuaire.

Mots-clés: nitrification, bactéries nitrosantes, amoA, Nitrobacter, cPCR, effluents de station

d’épuration, fleuve Seine et estuaire.

203
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

204
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

205
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

206
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

207
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

208
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

209
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

210
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

211
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

212
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

213
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Conclusion

Cette étude constitue une première approche phylogénétique de la diversité de la

communauté bactérienne nitrosante présente dans la basse Seine, à partir des deux banques
de gènes amoA (Figure III.16). Cette analyse permet de conclure que :
• Les trois groupes phylogénétiques majeurs des nitrosantes sont représentés dans
l’eau de la basse Seine.
• La diversité bactérienne nitrosante semble être identique pour les deux sites alors
que seulement la moitié des profils de restriction sont communs aux deux stations.
• La majorité des clones sont affiliés au genre Nitrosomonas oligotropha et urea (60-
80%), aux deux stations.
• La différence entre les populations de Triel et Duclair est faible ; les proportions de
chacun des 3 clusters principaux de bactéries nitrosantes sont relativement comparables,
toutefois il semble se produire une augmentation de la proportion de Nitrosospira dans
l’estuaire amont.

Figure III.16. Représentation schématique des proportions de chaque cluster bactérien nitrosant
aux sites de Triel et Duclair dans la Basse Seine.

Les différences de populations entre les deux stations semblent être principalement
liées aux variations des concentrations en substrat (ammonium). Toutefois, à ce stade, même
s’il apparaît une adaptation de la communauté aux conditions du milieu, les lieux de
changements de populations dans le continuum devraient permettre de mieux comprendre
leurs déterminismes.

Certaines questions restent à ce niveau sans réponse:

- A quel groupe phylogénétique les bactéries nitrifiantes apportées par Achères
appartiennent-elles ?
- Ces bactéries allochtones se maintiennent–elles dans le milieu et contribuent-elles à
l’activité nitrifiante in situ ?
- Quels sont les facteurs qui induisent des modifications au niveau de la communauté
nitrosante et où ces changements se passent-ils dans la basse Seine ?
C’est avec la technique de DGGE que nous avons choisi de les aborder.

214
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Publication 5. Analyse DGGE de la population bactérienne nitrosante dans la

basse Seine : Mise en évidence de l’impact de la station d’Achères

RÉSUMÉ
La Seine est fortement anthropisée par l’apport des effluents de l'usine de traitement
des eaux usées d'Achères déversés en aval de la ville de Paris. Le but de cette étude était
d'étudier la diversité de la population bactérienne nitrosante en identifiant les bactéries
autochtones provenant de l’amont de Paris et/ou les bactéries allochtonnes, rejetées par les
effluents d’Achères. Afin d’analyser l’évolution de la communauté nitrosante dans la basse
Seine et de mettre en évidence d’éventuelles variations spatiales et temporelles pour
plusieurs campagnes d’échantillonnage, nous avons effectué des mesures d'activités
nitrifiantes potentielles, utilisé la PCR compétitive et analysé grâce à la technique DGGE
(électrophorèse en gradient dénaturant) des fragments d’ADNr 16S spécifiques des bactéries
nitrosantes (AOB) de la sous-classe β des Protéobactéries. Nous avons prouvé que les
effluents inoculent le milieu récepteur en bactéries nitrifiantes et révélé une importante
stabilité des profils d’une campagne à l’autre. Comme les amorces CTO utilisées dans cette
étude, n’ont pas totalement été spécifiques des bactéries nitrosantes (une des bandes
majoritaires ne représentait pas une bactérie nitrosante), nous avons démontré qu’il est
important d’associer à l’analyse DGGE, le séquençage de toutes les bandes pour une
interprétation fiable. La majorité des bactéries nitrosantes (75-90%) présentes dans la basse
Seine en aval des effluents appartient à la lignée 6a représentée par les bactéries N.
oligotropha et ureae. Cette lignée dominante est représentée par trois bandes sur le profil
DGGE. L'espèce de la lignée 6a, introduite massivement par les effluents d’Achères, survit et
se développe dans le milieu récepteur loin en aval jusque dans l'estuaire, et représente près
de 40 % de la population nitrosante totale. Les deux autres espèces appartenant à la lignée 6a
semblent être des bactéries autochtones ; l'une apparaît quelques kilomètres en aval des
rejets d’Achères grâce à l’enrichissement du milieu en substrat ammoniacal, l'autre apparaît
dans la partie amont de l'estuaire (eau douce), plus adaptées aux conditions rencontrées dans
cette zone estuarienne (augmentation des matières en suspension, faible concentration en
ammonium, et fort renouvellement de la matière organique). Le reste de la population
bactérienne nitrosante est représenté dans des proportions égales par des espèces proches de
Nitrosospira et Nitrosococcus mobilis.

Mots-clés: bactéries nitrosantes, DGGE, Seine, activités nitrifiantes potentielles, cPCR

215
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

216
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

217
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

218
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

219
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

220
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

221
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

222
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

223
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

224
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

225
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

226
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

227
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Conclusion

La DGGE a fourni des résultats facilement analysables et très indicatifs sur la diversité
bactérienne nitrosante. Cette étude taxonomique a donc permis d’obtenir des réponses à nos
questions. Nous avons pu mettre en évidence l’apport de bactéries nitrosantes par Achères,
visualiser les changements apparaissant dans la communauté bactérienne et identifier les
lieux de ces changements de diversité le long du continuum de la basse Seine. L’analyse a été
facilitée par l’étonnante stabilité des profils DGGE d’une campagne à l’autre ce qui conduit à
résumer le comportement des bactéries nitrosantes de la basse Seine en une seule figure
(Figure III.17).

Figure III.17. Représentation schématique de la communauté bactérienne nitrosante le long du

continuum de la basse Seine depuis Paris jusqu’à l’estuaire pour la campagne de juillet 2002. Les
proportions de chaque bactérie ont été calculées à partir de l’intensité de chaque bande sur le gel
DGGE, ce qui équivaut à une proportion de chaque séquence par rapport à la quantité totale de
produit de PCR (Nested PCR, amorces 357F/518R). Nous avons volontairement gardé les bandes
correspondant à des bactéries non nitrosantes (Non-AOB) afin de conserver les proportions.

• La majorité des bactéries nitrosantes (75-90%) présentes dans la basse Seine en aval
des effluents appartient à la lignée 6a des β-Protéobactéries (N. oligotropha et ureae).
• L'espèce de la lignée 6a, introduite massivement par les effluents d’Achères (bande
A), survit et se développe dans le milieu récepteur jusque dans l'estuaire. Elle représente
alors près de 40 % de la population nitrosante totale.
• Les deux autres espèces appartenant à la lignée 6a semblent être des bactéries
autochtones. La bande B apparait grâce à l’enrichissement du milieu en ammonium, et la
bande C apparaît dans l’estuaire, sans doute adaptée aux conditions particulières de fortes
concentrations en MES, faibles concentrations en NH4+, mais un fort renouvellement de la
matière organique.
• Le reste de la population bactérienne nitrosante est représenté dans des proportions
faibles par des espèces proches de Nitrosospira et Nitrosococcus mobilis.
• Dans le gradient de salinité apparaissent des espèces nitrosantes halophiles
appartenant aux lignées représentées par Nitrosomonas marina et N. europaea.

Rappelons l’importance de séquencer toutes les bandes DGGE, les amorces PCR n’étant pas
totalement spécifiques des bactéries nitrosantes.

228
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Il est désormais clair que les effluents d’Achères n’apportent pas seulement des
nutriments (ammonium en particulier pour ce qui nous concerne ici), mais contribuent à
l’ensemencement de la Seine en bactéries nitrosantes qui se maintiennent et se développent
dans le milieu récepteur. Nous connaissons en outre l’évolution de la diversité
phylogénétique de la communauté bactérienne nitrosante le long du continuum de la basse
Seine.
Il reste toutefois à explorer davantage la population nitratante. Bien qu’aucun outil ne
permette encore de cibler de manière systématique l’ensemble des bactéries nitratantes, cette
communauté peut être appréhendée par PCR-compétitive à travers les deux genres
actuellement considérés comme majoritairement responsable de l’activité nitratante dans les
milieux aquatiques d’eau douce, Nitrobacter et Nitrospira.

229
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

III.2.1.2. La population bactérienne nitratante

Publication 6. Nitrobacter et Nitrospira deux genres représentatifs de la

communauté des nitratantes : détection, quantification et comportement dans
la Basse Seine

RÉSUMÉ
Les pollutions agricoles et celles des rejets d’effluents urbains, influencent le
fonctionnement écologique et les cycles biogéochimiques se déroulant dans la Seine. Le cycle
de l'azote est largement concerné et le processus de nitrification est stimulé en particulier à
l’aval des rejets de la station d’épuration d’Achères traitant les 3/4 des eaux usées
parisiennes. En effet, la station d’Achères traitant sans traitement tertiaire (ni nitrification, ni
dénitrification) 6.5 millions d'équivalent-habitant, les rejets en Seine contiennent des
quantités élevées d'ammonium, de matière organique et de microorganismes. La nitrification
de l’ammonium se déroule lentement dans la basse Seine jusqu’à l'estuaire. La deuxième
étape d'oxydation du nitrite (nitratation) est moins connue que l’oxydation de l’ammonium.
Si les activités nitrifiantes peuvent être mises en évidence dans la basse Seine en mesurant les
concentrations des composés azotés inorganiques et les activités potentielles, il est nécessaire
de s’intéresser aux compositions des communautés bactériennes pour comprendre la
contribution des divers apports latéraux (effluents d’Achères, eau provenant des bassins
agricoles amonts et affluents majeurs de la basse Seine) à ces activités. Actuellement, aucune
sonde moléculaire généraliste n'est disponible pour cibler l’ensemble des bactéries
nitratantes connues, comme nous l’avons fait pour les organismes nitrosants (Cébron et al.
2003 ; Cébron et al. 2004 sous presse). C’est pourquoi les deux genres Nitrobacter et
Nitrospira supposés être majoritairement responsables de la nitratation dans les milieux
d'eau douce sont ciblés ici. Grâce à leur quantification par PCR compétitive nous avons
montré que le genre Nitrobacter était globalement dominant dans les cours d’eau de tête de
bassin du bassin de la Seine alors que le genre Nitrospira semble être dominant à l’aval des
rejets d’Achères, même si ces deux genres sont équitablement présents dans les effluents
d’Achères. Dans l'estuaire de la Seine, au niveau du gradient de salinité, la proportion de
Nitrobacter augmente de nouveau alors que les bactéries du genre Nitrospira disparaissent
sous l’effet de la dilution par l’eau de mer.

Mots clés: bactéries nitratantes - Nitrobacter - Nitrospira – eau douce – La Seine – PCR
compétitive

230
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Draft, en vue d’une soumission à Canadian Journal of Microbiology

Nitrobacter and Nitrospira genera as representative

of the nitrite oxidizing bacteria: detection,
quantification and growth along the lower Seine River

Aurélie Cébron and Josette Garnier

UMR Sisyphe 7619, Université P. et M. Curie – Paris 6, BP 105, Tour 56-55, Étage 4, 4 place Jussieu, 75005 Paris, France. Tel :
(33)-(1)-44 27 51 34, Fax : (33)-(1)-44 27 45 88

ABSTRACT
The pollution of both agriculture and urban effluents influence the ecology and
biochemical cycle functioning in the Seine river water, highly anthropized. The nitrogen cycle
is largely affected and nitrification process is in particular greatly stimulated downstream
Parisian Wastewater Treatment Plant (WWTP) effluent discharge. Indeed, the Achères
WWTP, treating (no tertiary treatment, nor nitrification nor denitrification) wastewater from
6.5 million inhabitant equivalent from the Paris agglomeration, discharge effluents
containing high quantities of ammonium, organic matter and microorganisms. Ammonium,
brought to the river system, is slowly nitrified in the lower Seine River to the estuary.
Whereas ammonia oxidation has been widely studied, the second step of nitrite oxidation is
less known. The nitrifying activities can be evidenced by measuring inorganic nitrogen
compounds concentrations and potential activities. But to understand the contributions of
the WWTP effluents, of the upstream agricultural waters and of the Seine river tributaries it
is necessary to investigate the bacterial community. Whereas we already studied the
ammonium oxidizing bacterial (AOB) community, we here focus on nitrite oxidizing bacterial
(NOB) community composition. As no general molecular probe is currently available to
target all known NOB, we choose to target and quantify the two genera Nitrobacter and
Nitrospira though to contribute in majority to nitrite oxidation in freshwater environments
using competitive PCR. We globally found a dominance of Nitrobacter species in the
upstream Seine River basin but Nitrospira seems to be the dominant NOB downstream
WWTP, even if these two genera are equally represented in WWTP. In the Seine river
estuary, especially in the salinity gradient, Nitrobacter proportion increases and Nitrospira
disappears under the seawater dilution effect.

231
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

INTRODUCTION
The Seine river is greatly anthropized by the input of Achères Wastewater Treatment
plant (WWTP) effluents just downstream the City of Paris. This plant treating wastewater
from 6.5 million inhabitants equivalent, its effluents contain large quantities of nutrients
(organic matter and ammonium) and bacteria. This ammonium is oxidized into nitrate via
the nitrite all along the lower Seine River continuum to the estuary. Previous studies
highlight the nitrifying activity distributions along this transect. A peak in potential nitrifying
activity is mostly observed in the upper freshwater estuary in the maximum of turbidity and
minimum oxygen concentration sector.

Nitrifying activity is a two-step process performed by two different bacterial

functional groups. The oxidation of ammonia into nitrite and associated ammonia oxidizing
bacteria (AOB), had been fully studied in the lower Seine river (Cébron et al. 2003; Cébron et
al. 2004). Indeed, as the AOB present in freshwater environments belongs to a monophyletic
group from the β subclass of Proteobacteria, it is easy to target the global ammonia oxidizing
populations with molecular tools. However, the nitrite oxidizing bacteria that are responsible
for the second step of the nitrification process (oxidation of nitrite into nitrate) are less
studied, and the genera Nitrobacter has long been thought to be the sole nitrite oxidizer
(Bock & Koops 1992). The knowledge of this functional community is now larger and a
variety of techniques, among them were developed recently, allows to explore the nitrite
oxidizing community composition in the environment (Degrange & Bardin 1995; Aamand et
al. 1996; Wagner et al. 1996; Berthe et al. 1999; Bartosch et al. 1999; Daims et al. 2001;
Dionisi et al. 2002; Maron et al. 2003).

All isolated chemolithoautotrophic, nitrite-oxidizing bacteria belong to one of four

different genera (Bock and Koops 1992) Nitrobacter (belonging to the α subclass of
Proteobacteria), Nitrococcus (belonging to the γ subclass of Proteobacteria), Nitrospina
(belonging to the δ subclass of Proteobacteria) and Nitrospira (belonging to a distinct
phylum). Nitrobacter strains are ubiquitous in nature and have been isolated from several
environments, including soil, freshwater and sewage sludge (Chartrain et al. 1983; Bock et al.
1990). Differently from the genus Nitrobacter it has long been assumed that the other three
genera were confined to marine environments (Bock and Koops 1992). There are only two
Nitrospira cultured species: N. marina and N. Moscoviensis. However, in recent studies,
bacteria related to the genus Nitrospira were also found to occur in diverses habitats:
Nitrospira had been detected by immunological techniques in various soils (Bartosh et al.
2002) and numerous related bacterial 16S rDNA sequences were obtained from: i) nitrifying
bioreactors and biofilms (Burrell et al. 1998; Juretschko et al. 1998; Schramm et al. 1998;
Gieseke et al. 2001), ii) wastewater treatment plant (Daims et al. 2001), freshwater aquaria
(Hovanec et al. 1998) and iii) groundwater contaminated with livestock wastewater (Cho and
Kim 2000). As a whole, the Nitrobacter and Nitrospira genera are widely distributed in
nature and probably both would contribute significantly to global nitrite oxidation.

In the present paper, the aim was to detect and quantify the proportion of Nitrobacter
and Nitrospira genera along the lower Seine River continuum, strongly impacted by
wastewater effluents. We used competitive PCR specific to these two genera (Berthe et al.
1999; Dionisi et al. 2002), in parallel with their activity, in order to identify the sources of the
nitrite oxidizing bacteria, as already done for the ammonia oxidizing bacteria in the lower
Seine system (Cébron et al. 2003; Cébron et al. 2004). A complementary objective was, when
analysing the populations behaviour in a changing environment, as encountered in rivers
from head water to estuaries, to better understand the factors regulating their development.

MATERIALS AND METHODS

232
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Description of the study site

We studied a 356 km Seine River transect from upstream of the city of Paris (St
Maurice at the outlet of the Marne River, set at km 0) to the mouth of the estuary (Honfleur,
km 356); the weir at Poses (km 202) representing the physical limit between the riverine and
estuarine sections (Fig. 1). There is a salinity gradient between Caudebec (km 310) and
Honfleur (km 356), which is both influenced by amplitudes of tides and river flows.

The lower Seine River and estuary receive the pollution from the whole drainage
basin, greatly impacted by industrial activity, intensive agriculture and a population density
concentrated in the Paris region (Fig. 1). The domestic effluents from 6.5 million inhabitants
of Paris and its suburbs undergo a secondary treatment including activated sludge in the
wastewater treatment plant of Achères. The treated, but ammonium-rich Achères effluents
are discharged 70 km downstream from Paris.

Figure 1. Representation of the lower Seine River continuum with its tributaries. The numbers
represent the sampling stations in the Seine River. The numbers (1 to 18) represent the sampling
stations (1: Saint Maurice, 2: Maison Laffites, 3: Conflans, 4: Triel, 5: Porcheville, 6: Vernon, 7: Les
Andelys, 8: Poses, 9: Pont Arche, 10: Elbeuf, 11: Oissel, 12: Bassin des Docks, 13: La Bouille, 14:
Duclair, 15: Heurtauville, 16: Caudebec, 17: Tancarville, 18: Honfleur). The stars represent the
sampling stations in the upstream basin of the Orgeval River (black stars represent soil samples at
the Loge and Rognon stations), in the tributaries (Oise and Eure) and in the WWTPs (Rouen and
Achères).

Sample collection and treatments.

Water samples were collected at 18 stations in July 2002, at 16 stations in September

2002 (all stations except Les Andelys st. 7 and Pont Arche st. 9) and 16 stations in September
2003 (all stations except Vernon st. 6 and Pont Arche st. 9) along the Seine River from Paris
(km 0, immediately upstream of Paris, at St Maurice) to Honfleur (km 356, in the estuary)
(Fig. 1); the sampling stations are indicated by the numbers 1 to 18. Samples of raw and
treated water from Achères WWTP were also collected (these samples are designed by

233
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Achères IN and OUT). Treated water from Rouen WWTP, collected in july 2002, was also
analysed. We collected some samples from unanthropized upstream bassin stream: The
Orgeval river (tributary of the Grand Morin River that is one of the Marne River tributary) at
the stations Le Theil, Avenelles, Rognon and Loge and 2 samples of soil from the cultured
fields next to the stream. These six upstream samples stations are represented on the Figure
1. Finaly, we analysed samples from the Oise and Eure River from stations just uptream the
confluence with the lower Seine river.

During the period from July to September, the nitrifying activity is always at its
maximum, when water flows are low (185-250 m3 s-1) and temperatures high (18-21oC). 5L to
10 L of water is collected for chemical, biochemical and molecular analyses and brought to
the laboratory within 2 to 3 hours.

The water was filtered through glass-fiber membrane filters (Whatman, GF/F) and
frozen until analyzed for inorganic nitrogen compounds. Ammonium, nitrite and nitrate were
determined spectrophotometrically; ammonium and nitrite according to Slavyck and
MacIsaac (Slavyck & McIsaac 1972) and nitrate after Cd-reduction to nitrite (Rodier 1984).
Suspended matter was weighed on GF/F filters dried at 450°C. The potential nitrifying
activity and nitrite oxidation rates were determined directly after the sampling (see below).
For molecular analysis, between 150 and 250 mL of water (depending on the amount of
suspended particulate matter (SPM)) were filtered through 0.22µm nitrocellulose filters
(Durapore®, diam. = 45mm) in triplicates and the filters were frozen (-20°C) until DNA
extraction. The soil samples are directly froze at –20°C.

Measurement of potential nitrifying activities and nitrite oxidation rates

The potential nitrifying activities (pNA) were determined by the difference in H14CO3-
incorporation between the samples with and without specific nitrification inhibitors, all of
them incubated under optimal conditions, i.e. 7.5 mg O2.L-1, 20°C and 2 mM NH4Cl, (Brion
and Billen 1998). The inhibitors were allylthiourea (10 mg.L-1) and sodium chlorate (10 mM),
which inhibit the oxidation of ammonia and nitrite, respectively.

The potential nitrite oxidizing (pNO) activities were measured according to the
methods described in Cébron et al. (2003). The nitrite oxidation rates was based on
measurements of the changes in nitrite concentration (consumption) in the samples
incubated under optimal conditions and containing allylthiourea (10 mg.L-1), an inhibitor of
the ammonia oxidizing activity. These activities was made with water samples except for the
4 upstream river samples for which activities was measured on river water suspended
sediment (20g/L, i. e. 1g in the 50 mL “slurry incubation”) because the nitrite oxidizing
activities were not detected with water sample only. The pNO of soil sample were made on 1g
of soil (dry weight).

DNA extraction and purification

DNA was extracted from the filters or from 500mg soil sample by a bead-beating
method with the FastDNA spin Kit for soil (Bio 101, Lajolla, Calif., USA) according to the
manufacturer’s instructions. DNA extracts were then stored at –20°C until purification on a
Sephadex G-200 column and ethanol precipitation. Nucleic acids were quantified by
comparison between 1µL of a non-diluted environmental DNA sample and a range of known
DNA concentrations (various dilutions of SuperLadder, Eurogentec) on agarose gel colored
with ethidium bromide. To obtain suitable PCR amplicons, 10- to 100-fold dilutions of crude
DNA were used as templates for subsequent PCR reactions. DNA was visualized by UV

234
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

transillumination (Gel Doc 200, BioRad). Digital images of the gels were obtained with a
CCD camera controlled by software Quantity one (BioRad).

Quantification of Nitrobacter and Nitrospira by cPCR.

Nitrobacter cells were detected by amplification of a 397 bp specific fragment of the

Nitrobacter 16S rDNA gene with the FGPS 872 and FGPS 1269’ primers (Degrange & Bardin
1995). 16S rDNA primers NSR1113f and NSR1264r (Dionisi et al. 2002) were used to target
Nitrospira genera and amplify a 151 bp fragment.

Estimates of Nitrobacter and Nitrospira 16S rDNA gene copy number were made by
competitive PCR (cPCR) as described by Berthe et al. (1999) and Dionisi et al. (2002),
respectively. 16S rDNA gene copy number is equivalent to bacteria cell number because
Nitrobacter and Nitrospira species possess only one 16S ribosomal DNA operon (Navarro et
al. 1992; Dionisi et al. 2002). The cPCR for Nitrobacter had already been developed in the
laboratory (Cébron et al. 2003). Regarding cPCR on Nitrospira, we constructed a competitor
(119 bp fragment) and a DNA target template (151 bp fragment) as described by Dionisi et al.
(2002) by cloning both PCR fragments in pGEM-T (Promega). Two of our clones: NSR-
Comp-3 and NSR-Elb-3 were used as competitor and target plasmid DNA template,
respectively.

PCR amplifications were carried out in a total volume of 50 µL in 0.2 mL tubes using
a DNA-micycler (BioRad), according to the thermal profiles described in Table 1. The
reaction mixtures were prepared in a 1X buffer (75 mM Tris, pH 9.0, 20 mM (NH4)2SO4, 0.01
% Tween 20), 1.5 mM MgCl2, 1 ng of DNA and 0.5 U of Hot Start Taq DNA polymerase
(HotGoldtar, Eurogentec). Aliquots of amplification products were analyzed by gel
electrophoresis on 1.7 % (wt/vol) agarose gels (Eurogentec) for Nitrobacter PCR products
and 2.5 % (wt/vol) small fragments agarose gels (Eurogentec) for Nitrospira PCR products.
DNA band intensities were estimated with Imaging and analysis software (Quantity One, Bio-
Rad).

Table 1. PCR thermal cycle profils for Nitrobacter and Nitrospira

235
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

RESULTS AND DISCUSSION

Variations in inorganic nitrogen

To study the nitrifying activity in the lower Seine river, we have described the
inorganic nitrogen behavior along the river continuum. In addition to the data gathered from
the lower Seine river, from Paris to the estuary, we investigated the head waters of an
upstream basin, the WWTP effluents and the two major tributaries of the lower Seine River
to better determine the contribution of the effluents and of the lateral inputs compared with
the initial upstream conditions.

In the upstream Orgeval river basin (104 km2), located in an agricultural region of the
Marne tributary (Fig. 1), ammonium (NH4+) and nitrite concentrations (NO2-) are rather low
(Table 2), although variable (0.05 to 0.25 mg N-NH4+.L-1 and 0.005 to 0.1 mg N-NO2-.L-1
respectively); these upstream river waters contain however high quantities of nitrate (NO3-),
(8.0 to 11.2 mg N-NO3-.L-1).

Table 2. Ammonium, nitrite and nitrate concentrations and potential nitrite oxidizing activities
(pNO-L and pNO-SPM) for samples from the upstream Orgeval River basin, the WWTPs (Achères -
IN and –OUT for raw and treated water, and Rouen WWTP) the 2 major Seine river tributaries
(Eure and Oise) and 3 Seine river stations (St Maurice, Conflans and Duclair) acting as reference
values. *: aberrant values.

Consequently, if ammonium fertilizer was added to the surrounding fields, the totality
of this nitrogen compounds had been consumed by plants and microorganisms and
consequently is not bring to the river by leaching contrary to nitrate that comes from excess
of fertilizers applied to the riverside fields. One of the sample (from the Loge station)
contains much less nitrate (3.7 mg N-NO3-.L-1) than the other ones, perhaps influenced by
riparian epuration (trees along the riverbank) and less fertilizer application because one
riverine side is covered by forest.

236
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

During the water transit from the upstream basin to the confluence of the Marne and
the Seine rivers (station 1, Fig. 1), the ammonia and nitrite concentrations remain at low
concentrations (0.1-0.3 mg N-NH4+.L-1, 0.02 to 0.07 mg N-NO2-.L-1, Fig. 2), but nitrate
concentrations decrease from 2.8 to 4.4 mg N-NO3-.L-1 (Fig. 2); such a decrease could be
explained by riparian denitrification (Billen & Garnier, 1999; Sebilo, 2003) or benthic
denitrification in the sector of river, affected by urbanisation as already the case upstream
from the city of Paris, as shown in Garnier et al. (submitted). Perhaps it can be also do to
dilution by fewer nitrates charged water during the water course.

Figure 2. Evolution of the mineral nitrogen forms (ammonium in open square, nitrite in circle and
nitrate represented by crosses) along the lower Seine River continuum for the sampling dates of July
2002, September 2002 and September [Link] arrows represent the Achères WWTP discharge site.

The Achères WWTP effluents are discharged in the Seine River downstream from
Paris, i.e. 70 km downstream the confluence of the Marne and Seine rivers (between stations
2 and 3). This WWTP treats wastewater from 6.5 million inhabitants equivalent without any
tertiary treatment. The impact of this discharge is characterized by a sudden increase in
ammonium concentrations: from 0.1-0.3 to 3.9-6.0 mg N-NH4+.L-1 (Fig. 2). The Achères
WWTP domestic effluents bring high concentrations of ammonia (33 mg N-NH4+.L-1, Table
2) and have the same nitrate concentration than the one found in the Seine river (3 to 3.5 mg
N-NO3-.L-1); thus no net nitrification activity is evidenced during the water transit in the
Achères WWTP, the ammonia concentration being rather similar between the raw and
treated water. However, a nitrifiying activity must be balanced by a production of ammonia
from mineralisation of organic matter and hydrolysis of urea. A significant decrease in nitrate
concentrations in the treated waters compared to the raw waters 3 to 3.5 against 11 to 16 mg
N-NO3-.L-1, shows a denitrification activity during treatment process. Both nitrifying and
denitrifying activities can explain the decrease in nitrite concentration between raw and
treated water (from 0.84-1.36 to 0.20-0.28 mg N-NO2-.L-1). In the river, downstream the
WWTP output, the ammonia is slowly consumed by nitrifying bacteria, oxidizing ammonia
into nitrate. For the 3 sampling dates (July 2002, September 2002 and September 2003),
ammonium is totally oxidized within a sector of 200-250 km from the treated wastewater
discharge (Fig. 2). Simultaneously, nitrate concentrations increase to maximal values when
ammonium is exhausted. Nitrate concentrations decrease rapidly in the estuary, between
station 17 and 18, due to sea water dilution. High variations in nitrite concentrations between
Paris and the estuary are observed as nitrite is a major product of ammonia oxidation by
ammonia oxidizing bacteria and is the substrate of nitrite oxidizing bacteria, equilibrium
between the two steps can be hampered by limitation conditions (oxygenation); in addition,
benthic denitrification in that sector (Garnier et al., submitted) can also be a source of nitrite.
A same nitrite general pattern is spatially observed for the three sampling dates: firstly an
increase in nitrite concentration (from 0.05-0.1 to 0.3-0.42 mg N-NO2-.L-1), then a stable
high concentration stage and finally, a rapid decrease in nitrite concentration in the estuary,
that would not be due to sea water dilution as it occurs in the freshwater estuary (September
2002 and 2003, see Fig. 2). Some differences in the amplitudes of the variations and the
spatial distribution between the three sampling dates can however be mentioned, depending
on the combination of residence time of the waters and of the growth rate of the organisms,
on the amount brought by the effluents, etc... In July 2002, nitrite concentrations remain
high from station 6 (140 km) to station 16 (311 km) and then fall to low values at the two last

237
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

stations. In September 2002, nitrite is produced farther downstream (station 8),

concentration hardly reaching 0.3 mg N-NO2-.L-1, nitrite being then consumed in the
freshwater estuary. Nitrite production and consumption are amplified in the low water flow
conditions of September 2003.

Potential nitrifying activities

Whereas the potential nitrifying activities (pNA) and nitrite oxidation rates have been
determined for the three sampling dates in the lower Seine River (Fig. 3), only potential
nitrite oxidation (pNO) rates were measured for the head water samples, WWTP and
tributaries samples (Table 2). The head water samples (Theil, Avenelles, rognon and Loge)
have comparatively high potential nitrite oxidizing activities when results are express by
volume unit (Table 2), however the activity had been measured on sample containing water
plus sediment (“slurry incubation”). Consequently, when data are expressed by suspended
particulate matter (SPM) unit, the activities are one to more than two orders of magnitude
lower than the other samples (WWTP, tributaries and lower Seine river samples), even in
regard to the values in the Seine upstream from the Achères WWTP effluents discharge
(stations 1), comparatively low for the Seine (1-4 µmol N. gSPM-1.h-1). Whereas the pNO
activity of the raw WWTP waters (-IN) is low and highly variable (data not show because of
aberrant values, see also Garnier et al., submitted a), that of the treated water (-OUT) is high
(5-7.65 µmol N. gSPM-1.h-1). This result again illustrates the role of the Achères effluents as a
seeding source for the Seine River (Servais et al. 1999; Brion et al. 2000; Cébron et al. 2004;
Garnier et al., submitted). As a result, pNA and pNO immediately increase downstream the
effluent output and farther downstream in the lower Seine River. The pNA and pNO patterns,
observed in the Seine River, are similar for the three sampling dates. A first peak of activity is
observed just downstream the effluent discharge (between stations 5 and 7, km 100-170 in
July 2002, between stations 5 and 8, km 100-200 in September 2002 and immediately
downstream WWTP input in September 2003); a second major peak generally occurs in the
upper estuary between the stations 13 and 16 (km 260 and 310) (see also Brion et al. 2000;
Cébron et al. 2003; Garnier et al., submitted b). For the 2 sampling dates of the year 2002,
the estuarine peak was the highest, while in September 2003 the maximum activities was
observed immediately downstream the effluents input. Note that the maximum potential
activity measured in July 2002 is twice higher than the maximum found for the September
sampling dates (see figure 3). Estuarine conditions (increase in volume –water section and
depth- and in SPM) are particularly favourable for this peak of activity and can be explained
as the association of nitrifying bacteria to particles in water masses with high residence time
and summer temperature (Brion et al. 2000); the peak is however very sharp, due to
ammonium limitation followed by nitrite limitation. Similarly, the high nitrifying activities
immediately downstream from the effluent discharge can be explained by the high content of
SPM in the effluents, previously colonized by nitrifying bacteria in the activated sludge of
WWTP.

Figure 3. Potential nitrifying activity (pNA) and potential nitrite oxidizing rate (pNO) along the
lower Seine river continuum for the sampling dates of July 2002, September 2002 and September
2003. Results of potential activities are express by litre and by gram of Suspended Particulate
Matter (SPM).

238
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Nitrite oxidizing bacterial population distribution: Nitrobacter and Nitrospira

To further understand the longitudinal pattern of nitrification and the seeding sources
of bacteria, here with a focus on the step of nitrite oxidation, we investigated the nitrite
oxidizing bacterial populations (NOB), as we already did with the ammonium oxidizing
bacteria (AOB) (Cébron et al. 2003; Cébron et al. 2004). The major genus identified belonged
to the lineage 6a represented by Nitrosomonas oligotropha and ureae-like bacteria
belonging to the β subclass of Proteobacteria. These species coming both from the upstream
river and from the WWTP effluents, and are respectively consider as autochtonous bacteria
that develop with the input of ammonia bring by Achères WWTP and as allochtonous
bacteria that contribute to seed the lower Seine River with AOB that maintain and develop in
the receiving medium till the estuary. Differently from approach used for the bulk of AOB,
targeting amoA gene fragment (Rotthauwe et al. 1997), we target a specific fragment of 16S
rDNA, for each NOB genera detection (Nitrobacter: Degrange & Bardin, 1995; Nitrospira:
Dionisi et al. 2002). These major genera were considered as possibly representative of the
whole NOB community, i) Nitrobacter a genus known to dominate in soils systems (Degange
& Bardin 1995; Degrange et al. 1997; Grundmann & Normand 2000), and consequently in
hydrosystems through soil erosion and ii) the genus Nitrospira, often found in wastewater
(Dionisi et al., 2002; Regan et al. 2003). These two NOB genera were specifically quantified
by competitive PCR (Zacchar et al. 1993; Berthe et al. 1999; Dionisi et al. 2002).

Table 3. Nitrobacter and Nitrospira 16S rDNA gene copy number for samples from the upstream
Orgeval River basin, the WWTPs (Achères and Rouen), the 2 major Seine river tributaries (Eure and
Oise) and 3 Seine river stations (St Maurice, Conflans and Duclair) acting as reference values. ND :
bacteria not detected.

In the upstream Orgeval River, similarly to the measurement of the activities, the
quantification of NOB was realized on sediment suspension because we didn’t detect any
nitrifying bacteria in only water sample. The Nitrobacter and Nitrospira 16S rDNA gene copy
number increased from the smallest stream of order 1 (Loge, Rognon) to higher orders 2
(Avenelles) and 3 (Le Theil) (Table 3): within about 8 km Nitrobacter increased 10 times,
from 1.0-1.9.107 to 1.7.108 16S rDNA gene copies.g SPM-1 less than Nitrospira that increased
by a factor of 20, from 4.1-4.4.106 to 9.6.107 16S rDNA gene copies.g SPM-1. In all these

239
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

samples Nitrospira were about 2 to 4 times less concentrated than Nitrobacter and even less
in soil samples where Nitrospira were 200 to 500 times less concentrated than Nitrobacter,
supporting the general idea that soil are a privileged habitat for Nitrobacter species
(Degrange et al. 1997; Grundmann & Normand 2000). Indeed looking at the results
expressed in NOB per total DNA extracted from the samples, the results showed that
Nitrospira were weakly represented in the soil microflora (10 to 30 16S rDNA gene copies. ng
total DNA-1), while Nitrobacter were highly present (1.4-3.5.104 16S rDNA gene copies. ng
total DNA-1). Therefore, soils can be considered as a seeding source of Nitrobacter (Degrange
et al. 1997; Grundmann & Normand 2000).

In the Achères WWTP treated effluents both nitrite oxidizing bacterial genera were
highly concentrated (1.25-3.8.1010 Nitrobacter 16S rDNA gene copies.g SPM-1 and 0.25-
3.4.1010 Nitrospira 16S rDNA gene copies.g SPM-1), revealing that the effluents of Achères
WWTP can be seeding source of NOB, as they were shown to be source of AOB (Cébron et al.,
2004). These results differ from those found in recent literature, where Nitrospira-like
bacteria are the dominant nitrite oxidizers both in most full-scale wastewater treatment
plants and in laboratory scale reactors (Wagner et al. 1996; Juretschko et al. 1998; Schramm
et al. 1998; Okabe et al. 1999). Nitrobacter was however also found in WWTP effluents at
high abundances (106-108 [Link]-1) and at high serotypes diversity (Montuelle et al. 1996).
Nitrobacter genera can grow heterotrophically, while the remaining known nitrite oxidizers,
Nitrospina, Nitrococcus and Nitrospira would not (Ehrich et al. 1995); this Nitrobacter
species specific ability can favour their growth in WWTP organic matter-rich effluents.
Regarding the Seine river continuum, a significant increase in NOB concentration occurs as
soon as the stations 3 and 4, due to the input of Achères WWTP effluents (Fig. 4 and 5), the
two nitrite oxidizing bacterial genera remaining at their respective levels; a same general
pattern was observed for the three sampling dates. However, from downstream the Achères
WWTP effluent outlet to the weir at Poses (km 200), Nitrospira spp. seems to be in majority
amounting about 3-4 times the Nitrobacter spp. level. The predominance of Nitrospira-like
species rather than Nitrobacter species responsible for oxidation of nitrite to nitrate was
reported for freshwater aquaria (Hovanec et al. 1998), nitrifying bioreactor and WWTP
(Burrell et al. 1998; Jureschko et al. 1998; Schramm et al. 1998 & 1999; Daims et al. 2000)
but not yet for natural, even impacted, hydrosystems. In the upper estuary, the dominance
was opposite, in the area of maximum concentrations of the two genera, Nitrobacter spp.
being more concentrated than Nitrospira. Finally, Nitrobacter must be present in marine
water dilution effect was observed whereas, Nitrospira concentration decrease in the salinity
gradient. We must note that the two nitrite-oxidizing bacterial genera do not exclude each
other, both are present in all stations in quite the same proportions except for the station
upstream the WWTP effluent input and in the salinity gradient.

Figure 4. Evolution of 16SrDNA gene copy number of Nitrobacter and Nitrospira along the lower
Seine river continuum for the sampling dates of a. July 2002, b. September 2002 and c. September
2003; results are expressed according to the quantity of DNA present in the PCR assays. It’s thus a
proportion of NOB according to total bacterial population.

240
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Figure 5. Evolution of 16SrDNA gene copy number of Nitrobacter and Nitrospira and amoA gene
copy number along the lower Seine river continuum for the sampling dates of a. July 2002, b.
September 2002 and c. September 2003.

All along the lower seine river continuum, the NOB were 10 to 100 times more
concentrated than AOB (Fig. 5, see also Cébron et al. 2004). These results are in agreement
with previous studies showing that the number of NOB might be 3-30 times higher than that
of AOB in sediment (Smorzewski & Schmidt 1991; Altmann et al. 2003), nitrifying aggregates
(Schramm et al. 1999) or biofilms (Gieseke et al. 2001). As NOB have weaker specific growth
rates, more NOB than AOB are necessary to equilibrate the two steps of nitrification process
to prevent a too high nitrite accumulation in the environment that may be toxic for aquatic
life.

It has been suggested that Nitrospira-like nitrite oxidizers represent K strategists with
high substrate affinities and low maximum growth rate adapted to low nitrite and oxygen
concentrations, while Nitrobacter sp., as an r strategist, have low substrate affinity, high
growth rate and develop large populations when nitrite and oxygen are present in high
concentrations (Schramm et al. 1999). Consequently, low nitrite environment may select for
a Nitrospira-dominated NOB community. Schramm et al. (1999) estimated a Km for
Nitrospira of 0.01 mM nitrite (0.14 mg N-NO2-.L-1) and Ehrich et al. (1995) reported
optimum growth of Nitrospira moscoviensis at 0.35 mM nitrite, with inhibition above 15
mM. This Km estimates range from 1 or 2 orders of magnitude lower than those reported
values for Nitrobacter strains (Keen & Prosser 1987; Painter 1970; Yoshiokaet al. 1982).
These findings are well illustrated on activated sludge or experimental studies. On activated
sludge, Nitrobacter and Nitrospira had been shown to be selectively enriched by varying the
substrate concentration (Bartosch et al. 1999). Nitrobacter is known to tolerate high nitrite
concentrations in the medium (>1g NaNO2 L-1, 14 mM) (Bock and Koops 1992), with a
preference higher than 0.5mM, whereas Nitrospira strains are inhibited under these
conditions and dominate in microenvironments with lower nitrite concentrations (0 to
0.5mM), (Ehrich et al. 1995). Nitrospira and Nitrobacter simultaneously grow at nitrite
concentrations of 0.2 g of NaNO2 L-1 (3 mM), but Nitrobacter was exclusively detected in
cultures enriched with 2 g of NaNO2 L-1 (28 mM) (Bartosh et al. 2002). However, the
competitive advantage of Nitrospira vs. Nitrobacter is still speculative as physiological
information are not yet available for these Nitrospira-like organisms in pure culture
experiments.

In the Seine river, nitrite concentrations were always under the inhibiting
concentration level for Nitrospira (0.2-0.4 mgN l-1, 14-28 µM) explaining its steady state,
whereas Nitrobacter species would be well adapted to relatively low nitrite concentration
contrary to those known in pure cultures, unless they would maintain in the river, attached to
SPM, nitrifying bacteria (and a fortiori the Nitrobacter well adapted to soil matrix) being
known to have the propensity to be attached to particles (Koops & Pommerening-Röser
2001). This would explain their increase in the estuary where suspended matter also
increase, and why they maintain downstream the estuary despite a dilution by sea water;

241
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

whereas the salinity gradient ranges from 2 to 15 p.m. only, the downstream estuarine sector
is the site of turbidity maximum where mudflats are re-suspended according to the tide
cycles.

Organic carbon is able to support growth of the majority of the Nitrobacter strains
through a mixotrophic or even heterotrophic pathway but the efficiency of organic carbon
utilization as an energy substrate varies strongly among strains (Bock et al. 1990), so that
Nitrobacter strains exhibit high and low capabilities to use organic carbon leading to their
coexistence in soil (Josserand & Cleyet-Marel 1979, Both 1992). For example, whereas N.
agilis strain AG is a preferentially autotrophic strain, Nitrobacter genomic species 2 strain
LL would be a mixotrophic one and N. hamburgensis strain X14 (preferentially
heterotrophic).

In addition, Gieseke et al. (Gieseke et al. 2003) suggested a lower growth rate of cells
of Nitrospira spp. than Nitrobacter. Therefore, the strategy of the Nitrospira strains might
not only consist of a high affinity towards oxygen as suggested earlier (Okabe et al. 1999;
Schramm et al. 1999); the cells, while being inactive, would maintain their ribosome content
for a long period of inactivity leading to a highly reactive population that immediately
recovers its activity in environments producing nitrite. It can explain why Nitrospira
dominated in the first 130 km downstream the Achères effluents output because this genus
may react more rapidly to the nitrite effluent input.

As a whole, along the Seine River continuum, nutritional conditions (N and C

substrates), but also hydro-sedimentary characteristics (flow velocity, particle dynamics) vary
largely, so that temporally limiting activity would allow the co-existence of both Nitrobacter
and Nitrospira NOB.
Besides, physiology being species-specific, a study at a species level, would be
necessary to go deeper into the shift between Nitrobacter and Nitrospira genera along the
Seine river continuum. In addition, the two phylogenetically unrelated groups of NOB
affiliated to the genera Nitrobacter and Nitrospira did not however exclude from the Seine
river system, the presence of any other.

CONCLUSIONS
This study shows that the two nitrite-oxidizing bacterial genera, Nitrobacter and Nitrospira,
coexist not only in the lower Seine River and its two principal tributaries (the Oise and the
Eure), but also in the sediments of the rivers of the upstream basin and the effluents of
Achères WWTP. The major results of this study are:
- An abundance of the nitrite-oxidizing bacteria from 10 to 100 times higher than that of
the ammonia-oxidizing bacteria.
- A predominance of the Nitrobacter genera in the sediments sampled in the upstream
rivers.
- An equal contribution of the two NOB genera in the Achères WWTP effluents.
- A prevalence of the Nitrospira genera in the 100km downstream the Achères effluents
discharge.
- A majority of Nitrobacter species in the estuary.
All these results show a "succession" of the nitrite-oxidizing bacterial genera all along the
Seine River continuum.

242
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Acknowledgements
This work was undertaken within the framework of two French programs: PIREN-
Seine (CNRS) and Seine-Aval (Région Haute-Normandie). We thank Inga Sagalakova for
participation to the study during her short stay in the laboratory. We are indebted to André
Ficht from the SNS (Service de Navigation de la Seine) for his kind help in the field. We
thanks Fabienne Petit laboratory for kindly provide DNA sample from Rouen WWTP.

LITERATURE CITED
Aamand J, Ahl T, Spieck E. 1996. Monoclonal antibodies recognizing nitrite oxidoreductase of Nitrobacter
hamburgensis, N. winogradskyi, and N. vulgaris. Appl. Environ. Microbiol. 62:2352-2355
Altmann D, Stief P, Amann R, De Beer D, Schramm A. 2003. In situ distribution and activity of nitrifying
bacteria in freshwater sediment. Environmental Microbiology 5:798-803
Bartosch S, Wolgast I, Spieck E, Bock E. 1999. Identification of nitrite-oxidizing bacteria with monoclonal
antibodies recognizing the nitrite oxidoreductase. Appl. Environ. Microbiol. 65:4126-4133
Bartosch S, Hartwig C, Spieck E, Bock E. 2002. Immunological detection of Nitrospira-like bacteria in
various soils. Microbial Ecology 43:26-33
Berthe T, Garnier J, Petit F. 1999. Quantification de bactéries nitrifiantes du genre Nitrobacter en milieux
aquatiques (l'estuaire de la Seine, France). Compte Rendu Académie des Sciences Paris, Sciences de la
vie, Ecologie 322:517-526
Billen G, Garnier J. 1999. Nitrogen transfers through the Seine drainage network: a budget based on the
application of the Riverstrahler model. Hydrobiologia, 410: 139-150
Bock E, Koops H-P. 1992. The genus Nitrobacter and related genera. In: A. Balows, Trüper HG, Dworkin M,
Harder W, Shleifer K-H (eds) The prokaryotes, 2nd ed. edn. Springer Verlag, New York, pp 2302-2309
Bock E, Koops H-P, Möller UC, Rudert M, 1990. A new facultatively nitrite oxidizing bacterium, Nitrobacter
vulgaris sp. nov. Arch. Microbiol. 153:105-110
Both GJ, Gerards S, Laanbroek HJ. 1992. temporal and spatial variation in the nitrite-oxidizing bacterial
community of a grassland soil. FEMS Microbiol. Ecol. 101:99-112
Brion N, Billen G. 1998. Une réévaluation de la méthode d'incorporation de H14CO3- pour mesurer la
nitrification autotrophe et son application pour estimer des biomasses de bactéries nitrifiantes. Rev. Sci.
Eau 11:283-302
Brion N, Billen G, Guézennec L, Ficht A. 2000. Distribution of nitrifying activity in the Seine river (France)
from Paris to the estuary. Estuaries, 23:669-682
Burrell PC, Keller J, Blackall LL. 1998. Microbiology of a nitrite-oxidizing bioreactor. Appl. Environ.
Microbiol. 64:1878-1883
Cébron A, Berthe T, Garnier J. 2003. Nitrification and nitrifying bacteria in the lower Seine River and estuary
(France). Appl. Environ. Microbiol. 69:7091-7100
Cébron A, Coci M, Garnier J, Laanbroek HJ. 2004. DGGE analysis of the ammonia oxidizing bacterial
community structure in the lower Seine River: impact of the Paris wastewater effluents. Appl. Environ.
Microbiol. 70:6726-6737.
Chartrain M, Rizet M, Faup G. 1983. Isolation of Nitrobacter from sewage and drinking water. Water Res.
17:831-832
Cho J-C, Kim SJ. 2000. Increase in bacterial community diversity in subsurface aquifers receiving livestock
wastewater input. Appl. Environ. Microbiol. 66:956-965
Daims H, Nielsen JL, Nielsen PH, Schleifer K-H, Wagner M. 2001. In situ characterisation of Nitrospira-
like nitrite-oxidizing bacteria active in wastewater treatment plants. Appl. Environ. Microbiol. 67:5273-
5284
Degrange V, Bardin R. 1995. Detection and counting of Nitrobacter populations in soil by PCR. Appl. Environ.
Microbiol. 61:2093-2098
Degrange V, Lensi R, Bardin R. 1997. Activity, size and structure of a Nitrobacter community as affected by
organic carbon and nitrite in sterile soil 24:173-180
Dionisi HM, Layton AC, Harms G, Gregory IR, Robinson KG, Sayler GS. 2002. Quantification of
Nitrosomonas oligotropha-like ammonia-oxidizing bacteria and Nitrospira spp. from full-scale
wastewater treatment plants by competitive PCR. Appl. Environ. Microbiol. 68:245-253
Ehrich S, Behrens D, Lebedeva E, Ludwig W, Bock E. 1995. A new obligately chemolithoautotrophic,
nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship. Arch.
Microbiology 164:16-23
Garnier J, Laroche L, Pinault S. (submitted a). Characterization of the effluents of two large waste water
plants of the city of Paris (France): how to comply with the European directive ? Water Res.
Garnier J, Cébron A, Tallec G, Billen G, Sebilo M, Martinez A. (submitted b). Nitrous oxide emission in
the Seine River estuary (France): comparison with upstream sector of the Seine basin. Biogeochemistry
Gieseke A, Bjerrum L, Wagner M, Amann R. 2003. Structure and activity of multiple nitrifying bacterial
populations co-existing in a biofilm. Environ. Microbiol. 5:355-369

243
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Gieseke A, Purkhold U, Wagner M, Amann R, Schramm A. 2001. Community structure and activity
dynamics of nitrifying bacteria in a phosphate-removing biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 67:1351-1362
Grundmann GL, Normand P. 2000. Microscale diversity of the genus Nitrobacter in soil on the basis of
analysis of genes encoding rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 66:4543-4546
Hovanec TA, Taylor LT, Blakis A, Delong EF. 1998. Nitrospira-like bacteria associated with nitrite
oxidation in freshwater aquaria. Appl. Environ. Microbiol. 64:258-264
Josserand A, Cleyet-Marel JC. 1979. Isolation from soils of Nitrobacter and evidence for novel serotypes
using immunofluorescence. Microb. Ecol. 5:197-205
Juretschko S et al. 1998. Combined molecular and conventional analysis of nitrifying bacterium diversity in
activated sludge: Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populations. Appl.
Environ. Microbiol. 64:3042-3051
Keen GA, Proseser JI. 1987. Steady state and transient state growth of autotrophic nitrifying bacteria Arch.
Microbiol. 147:73-79
Koops HP, Pommerening-Röser A. (2001) Distribution and ecophysiology of the nitrifying bacteria
emphasizing cultured species. FEMS Microbiol. Ecol. 37:1-9
Maron, PA, Cœur C, Pink C, Clays-Josserand A, Lensi R, Richaume A, Potier P. 2003. Use of
polyclonal antibodies to detect and quantify the NOR protein of nitrite oxidizers in complex
environments. J. Microbiol. Methods 53:87-95
Montuelle B, Volat B, Torio-Fernandez MM, Navarro E. 1996. Changes in Nitrobacter serotypes
biodiversity in a river: impact of a wastewater treatment plant discharge. Water Res. 30:1057-1064
Navarro E, Fernandez MP, Grimont F, Clays-Josserand A, Bardin R. 1992. Genomic heterogeneity of
the genus Nitrobacter. Int. J. Syst. Bacteriol. 42:554-560
Okabe S, Satoh H, Watanabe Y. 1999. In situ analysis of nitrifying biofilms as determined by in situ
hybridization and the use of microelectrodes. Appl. Environ.l Microbiol. 65:3182-3191
Painter HA. 1970. “A review of literature on inorganic nitrogen metabolism in microorganisms.” Water
Research. 4: 393-450.
Regan JM, Harrington GW, Baribeau H, DeLeon R, Noguera DR. 2003. Diversity of nitrifying bacteria
in full-scale chloraminated distribution systems. Water Research 37:197-205
Rodier J. 1984. In: Dunod (ed) L'analyse de l'eau (eaux naturelles, eaux résiduaires, eau de mer), 7th edn
Rotthauwe J-H, Witzel K-P, Liesack W. 1997. The ammonia mono-oxygenase structural gene amoA as a
functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations. Applied and
Environmental Microbiology 63:4704-4712
Schramm A, DeBeer D, VanDenHeuvel JC, Ottengraf S, Amann R. 1999. Microscale distribution of
populations and activities of Nitrosospira and Nitrospira spp. along a macroscale gradient in a nitrifying
bioreactor: quantification by in situ hybridization and the use of microsensors. Appl. Environ. Microbiol.
65:3690-3696
Schramm A, DeBeer D, Wagner M, Amann R. 1998. Identification and activities in situ of Nitrosospira and
Nitrospira spp. as dominant populations in a nitrifying fluidized bed reactor. Appl. Environ. Microbiol.
64:3480-3485
Sebilo M. 2003. Utilisation du traçage isotopique naturel pour caractériser et quantifier les processus de
nitrification et dénitrification à l’échelle du réseau hydrographique de la Seine. Thèse Doct. Univ. Paris 6,
124pp
Servais P, Garnier J, Demarteau N, Brion N, Billen G. 1999. Supply of organic matter and bacteria to
aquatic ecosystems through waste water effluents. Water Research 33:3521-3531
Slavyck G, McIsaac JJ. 1972. Comparison of two automated ammonium methods in a region of coastal
upwelling. Deep Sea Res. 19:1-4
Smorczewski WT, Schmidt EL. 1991. Numbers, activities and diversity of autotrophic ammonia-oxidizing
bacteria in a freshwater, eutrophic lake sediment. Can. J. Microbiol. 37:828-833.
Wagner M, Rath G, Koops H-P, Flood J, Amann R 1996. In situ analysis of nitrifying bacteria in sewage
treatment plants. Water Sci. Technol. 34:237-244
Yoshioka T, Terai H, Saijo Y. 1982. Growth kinetic studies of nitrifying bacteria by the immunofluorescent
counting method. J. Gen. Appl. Microbiol. 28:169–180.
Zachar V, Thomas RA, Goustin AS. 1993. Absolute quantification of target DNA: a simple competitive PCR
for efficient analysis of multiple samples. Nucleic Acid Research 21:2017-2018.

244
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Conclusion

Cette étude montre que les deux genres bactériens nitratants Nitrobacter et
Nitrospira coexistent non seulement dans la basse Seine et ses deux principaux affluents
(l’Oise et l’Eure), mais aussi dans les sédiments des cours d’eau de tête de bassin, les effluents
d’Achères. Les résultats majeurs de cette étude sont :
• Une abondance des bactéries nitratantes de 10 à 100 fois plus élevée que celle des bactéries
nitrosantes.
• Une dominance du genre Nitrobacter dans les sédiments prélevés dans les cours d’eau de
tête de bassin.
• Un apport d’égale importance des deux genres nitratants par les effluents d’Achères.
• Une prédominance du genre Nitrospira dans les 100km à l’aval des rejets d’Achères.
• Le genre Nitrobacter est majoritaire dans l’estuaire.
L’ensemble de ces résultats montre une « succession » des genres nitratants le long du
continuum, toutefois les deux genres nitratant ne s’exclus pas l’un l’autre, tous deux sont
détectés dans tous les échantillons.

245
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

III.2.2. Les bactéries nitrifiantes dans l’estuaire

Les activités nitrifiantes significatives dans le gradient de salinité du bouchon vaseux

(partie III.1.2.2) témoignent donc de la présence de bactéries nitrifiantes actives dans cet
environnement halophile. En outre, les analyses par DGGE et PCRc ont clairement montré
un changement significatif des communautés nitrifiantes au niveau de la station de Honfleur
à travers l’apparition d’espèces nitrosantes halophiles et l’augmentation de la proportion du
nombre de bactéries du genre Nitrobacter. Ces observations, nous conduisent donc à
analyser plus en détail le processus de nitrification dans cet écosystème particulier qu’est le
bouchon vaseux, où les teneurs en ammonium sont relativement faibles, compte tenu de la
nitrification quasi-complète des effluents d’Achères dans l’estuaire fluvial amont. Toutefois
les résultats sont encore préliminaires, l’étude de la nitrification ayant logiquement été
focalisée sur le secteur le plus concerné ; les populations bactériennes halophiles n’ont donc
pas été étudiées sur tous les échantillons.

Sur l’ensemble des échantillons analysés sur le plan de la nitrification (cf Tableau
II.1), seuls certains de la campagne NUTS02 (septembre 2002) ont été étudiés du point de
vue de la composition bactérienne (tableau III.6).

Tableau III.6. Caractéristiques physico-chimiques des échantillons utilisés dans l’analyse des
populations bactériennes nitrifiantes au niveau de l’estuaire de Seine. Campagnes NUTS02 réalisée
en septembre 2002. F2 : flot, F3 : Pleine mer, F4 : jusant. S : Surface ; M : milieu ; F : fond ; V : Vase.

246
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

III.2.2.1. La population bactérienne nitrosante

Le nombre de copies de gène amoA par unité de volume semble relié à la quantité de
MES, mais les données manquent dans la gamme de 1000 à 3000 mg.L-1 pour établir une
corrélation (Figure III.18a). Bien que nos résultats ne soient pas suffisamment démonstratifs,
les bactéries nitrosantes sont connues pour être majoritairement liées aux matières en
suspension (Allison & Prosser 1993 ; Stehr et al. 1995b). Les espèces bactériennes seraient
même différentes entre la communauté nitrosante planctonique et celle liée aux matières en
suspension (Stephen et al. 1996 ; Phillips et al. 1999).
Le nombre de copies du gène amoA, déterminés sur trois profondeurs montrent des
profils assez peu variables aux trois périodes d’un cycle de marée (Figure III.19a). Le nombre
de copies de gène amoA est ainsi compris entre 8.8.106 et 5.0.107 copies. g MES-1 dans le
bouchon vaseux. Il existe un parallélisme marqué entre le nombre de copies du gène amoA et
les activités nitrosantes potentielles (Figure III.18b et III.19). Ces activités nitrosantes
potentielles varient à peu près dans un même rapport de 0.27 à 1.31 µmol N oxydé. g MES-1.h-
1 (Figure III.19b), le coefficient de corrélation n’étant toutefois pas significativement différent

de zéro (Figure III.18b).

D’une manière générale, les nombres de copies de gène amoA et les activités
nitrosantes sont les plus élevés pour les prélèvements effectués au fond (5.0.107 copies. g
MES-1 et 1.31 µmol N oxydé. gMES-1.h-1 respectivement) et les plus faibles à la profondeur
intermédiaire (2.0.107 copies. g MES-1 et 0.27 µmol N oxydé. gMES-1.h-1) (Figure III.19b). Il
n’apparaît pas de différence claire entre les différentes phases du cycle de marée. Aucune
relation des nombres de copies de gène amoA et la salinité ne peut être mise en évidence
(Figure III.18c). Il n’y aurait donc pas d’effet dû à la dilution par l’eau de mer. Les bactéries
nitrosantes de la sous-classe β des Protéobactéries ont effectivement été détectées dans des
milieux marins et des environnements salés juqu’à des salinités de 100 0/00 (Stephen et al.
1996 ; McCaig et al. 1999 ; Phillips et al. 1999 ; Bano & Hollibaugh 2000 ; Ward et al. 2000).
Les bactéries peuvent donc survivre dans les milieux salins en maintenant leur cytoplasme à
la même osmolarité que l’environnement extérieur (Oren 1999). Au delà d’une salinité de 100
0/ , l’oxydation de l’ammonium n’est plus observée à cause de la contrainte énergétique
00
qu’impose l’halophilisme (Oren 1999).

a. b. c.
Figure III.18. Nombre de copies de gène amoA dans l’estuaire, en fonction a) des matières en
suspension (MES), b) de l’activité nitrosante potentielle et c) de la salinité dans les échantillons
réalisés dans l’estuaire lors du flot, de la pleine mer et du jusant d’un cycle de marée en septembre
2002 (campagnes NUTS02)

247
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

a.

b.

Figure III.19. Quantification du nombre de copies de gène amoA (a) et activités nitrosantes
potentielles (b) des échantillons réalisés dans l’estuaire. Les prélèvements ont été faits à différentes
profondeurs lors du flot, de la pleine mer et du jusant d’un cycle de marée en septembre 2002
(campagnes NUTS02)

Pour mieux comprendre le devenir de la communauté nitrosante au niveau du

gradient de salinité, nous avons analysé ces échantillons par DGGE, technique moléculaire
illustrant la diversité bactérienne nitrosante de la sous classe β des Protéobactéries.
L’approche DGGE a montré qu’au niveau du maximum de turbidité, la communauté
bactérienne nitrosante est homogène en fonction de la profondeur au cours des différentes
phases du cycle de marée (flot, pleine mer et jusant) (Figure III.20).
Après purification des bandes et séquençage, l’affiliation phylogénétique montre que
la seule espèce (Bande D) qui n’apparaît qu’en surface ou à mi-profondeur n’est pas une
bactérie nitrosante (cf. Cébron et al. 2004, publication 5). Dans le maximum de turbidité, les
bactéries nitrosantes sont dominées par des espèces halophiles proches de Nitrosomonas
aestuarii (bande H) et Nitrosococcus mobilis (bande F). Bollmann & Laanbroek (2002) ont
détecté dans l’estuaire de l’Escaut l’apparition de nouveaux groupes bactériens nitrosants
dans la zone saumâtre et ont montré que la salinité favorisait l’installation de bactéries du
cluster 6b représenté effectivement par N. marina et N. aestuarii. De même Nicolaisen &
Ramsing (2002) ont noté l’apparition de ce cluster bactérien dans le Fjord Kysing
(Danemark) à une salinité constante de 14 0/00. En plus de son action sur l’activité nitrifiante
(Somville 1984 ; Rysgaard et al. 1999), la salinité influencerait également la structure de la
communauté nitrosante (Pommerening-Röser et al. 1996 ; Stephen et al. 1998 ; Purkhold et
al. 2000).

La bande K appartient au phylum Nitrosospira, espèce visiblement adaptée à

l’estuaire puisqu’elle n’apparaît qu’à partir de Tancarville ou de Honfleur (Cébron et al.
2004 ; Publication 5). Bano & Hollibaugh (2000) ont également montré la présence de
Nitrosospira du cluster 1 dans 88% de leurs échantillons prélevés dans l’océan Arctique. Ce
groupe bactérien nitrosant, dont il n’existe aujourd’hui aucun représentant en culture pure,
est par ailleurs dominant dans des sédiments marins anoxiques (Loch Duich- Ecosse : Freitag
& Prosser 2003) et dans d’autres milieux marins (Kowalchuk et al. 1999 ; Phillips et al. 1999 ;
Stephen et al. 1996).

248
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Figure III.20. Profil DGGE d’échantillons prélevés durant un cycle de marée. Identification des
bactéries nitrosantes de la sous-classe β des Protéobactéries ciblées par Nested PCR. L’analyse a été
effectuée sur 10 échantillons d’un cycle de marée (flot, pleine mer et jusant) en point fixe dans le
maximum de turbidité. Campagne de septembre 2002. S : Surface ; M : milieu ; F : fond ; V : Vase.
Les différentes bandes sont identifiées par une lettre correspondant aux bandes détectées dans
Cébron et al. (2004) (cf. publication 5) et leur affiliation phylogénétique est précisée entre
paranthèses.

La communauté bactérienne nitrosante appartenant à la sous-classe β des

Protéobactéries ne varie pas au cours du cycle de marée. La présence d’autres bactéries
nitrosantes, n’étant pas ciblées par les outils moléculaires utilisés ici, mais contribuant à
l’activité nitrosante potentielle, n’est pas exclue. En effet, il existe des bactéries nitrosantes
marines appartenant à la sous classe γ des Protéobactéries, représentées par les espèces
cultivées Nitrosococcus oceanii et Nitrosococcus halophilus. Elles ont été détectées dans des
environnements très variés, allant de la mer au sud de la Californie à des lacs salés de
l’Antarctique (Ward & Carlucci 1985 ; Voytek et al. 1998). Des bactéries nitrosantes de la
sous-classe γ pourraient être apportées par les eaux marines et seraient présentes au niveau
du gradient de salinité, leur contribution à l’activité nitrosante pouvant être très importante
comparée à celles des bactéries nitrosantes de la sous-classe β des Protéobactéries. Nous
pourrions donc envisager des investigations supplémentaires sur ce point en utilisant des
amorces PCR spécifiques de ce groupe phylogénique tel que les amorces NOC-1/NOC-2
décrites par Voytek (1996).

249
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

III.2.2.2. La population bactérienne nitratante

Les deux genres bactériens nitratants ne semblent pas corrélés avec la quantité de
MES présente dans l’échantillon (Figure III.21a). Cette observation peut par exemple
s’expliquer par le fait que les bactéries nitratantes sont, pour partie, fixées aux MES, et pour
partie libres dans la colonne d’eau. Le nombre de bactéries nitratantes est exprimé en
fonction de la nitratation potentielle (Figure III.21b). D’une part l’on observe que le nombre
de bactéries du genre Nitrobacter est positivement corrélé (R2 =0.45) à l’activité nitratante
potentielle alors que le nombre de bactéries du genre Nitrospira est négativement corrélé (R2
= 0.49). Il apparaît donc que le genre Nitrobacter serait majoritairement responsable de
l’activité nitratante puisqu’il est présent en majorité dans l’estuaire. Cette conclusion est en
accord avec les résultats que l’on obtient en comparant les quantifications des deux genres
nitratants avec la salinité des échantillons (Figure III.21c). Nous observons que le nombre de
Nitrobacter croît avec la salinité, tendant à démontrer la présence de ce genre bactérien dans
l’eau de mer ou du moins à montrer qu’il existe des espèces halophiles appartenant au genre
Nitrobacter. En ce qui concerne le genre Nitrospira, celui-ci décroît avec l’augmentation de
la salinité, il suit visiblement une droite de dilution. Le genre Nitrospira ne serait donc pas
présent dans l’eau de mer, les espèces considérées ne doit pas être adapté aux conditions
halophiles. Cependant, il existe des espèces bactériennes appartenant au genre Nitrospira et
présentes dans les milieux marins tels que Nitrospira marina (Watson et al. 1986). A notre
connaissance très peu d’études se sont intéressées à la diversité bactérienne nitratante dans
les milieux salins, il nous est donc difficile de comparer nos résultats avec d’autres données
environnementales.

a. b. c.
Figure III.21. Nombre de bactéries du genre Nitrobacter et Nitrospira dans l’estuaire, en fonction
a) des MES, b) de l’activité nitratante potentielle et c) de la salinité dans les échantillons réalisés dans
l’estuaire lors du flot, de la pleine mer et du jusant d’un cycle de marée en septembre 2002
(campagnes NUTS02)

Le genre Nitrobacter domine le genre Nitrospira d’un 1 à 3 Log. Le nombre de copies

d’ADNr 16S spécifiques de Nitrobacter est compris entre 4.9.108 et 3.5.109 copies .g MES-1
alors que le nombre de copies d’ADNr 16S spécifiques de Nitrospira est de l’ordre de 1.106 à
1.3.107 copies .g MES-1. Les diffrérents échantillons ont des activités nitratantes potentielles
variant peu, elles sont de l’ordre de 0.30 à 0.38 µmol N oxydé. gMES-1. Les échantillons
prélevés au fond ont quant à eux une plus grande variabilité au niveau des mesures de
nitratation potentielle allant de 0.06 à 0.55 µmol N oxydé. gMES-1.

250
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

Figure III.22. Quantification des bactéries nitratantes. Nombre de bactéries du genre a)

Nitrobacter et b) Nitrospira (nombre de copie d’ADNr 16S par cPCR) dans les échantillons réalisés
dans l’estuaire lors du flot, de la pleine mer et du jusant d’un cycle de marée en septembre 2002
(campagnes NUTS02).

Figure III.23. Activités nitratantes potentielles dans l’estuaire. Echantillons réalisés dans l’estuaire
lors d’un cycle de marée au moment du flot, de la pleine mer et du jusant en septembre 2002
(campagnes NUTS02).

Conclusion

Cette étude concernant les populations bactériennes nitrifiantes dans le gradient de

salinité n’est encore que préliminaire, toutefois certaines tendances générales peuvent en être
déduites :
• Les bactéries nitrosantes de la sous-classe β des Protéobactéries restent présentes
dans le gradient de salinité à des concentrations élevées de l’ordre de 107 copies de amoA.g
MES-1.
• Les espèces bactériennes nitrosantes sont les mêmes (N. marina/aestuarii,
Nitrosococcus mobilis et Nitrospira) quel que soit le moment du cycle de marée (flot, pleine
mer ou jusant) et quelle que soit la profondeur de prélèvement.
• La quantité de bactéries nitrosantes de la sous-classe β des Protéobactéries est
parrallèle à la mesure d’activité nitrosante potentielle, mais ces deux mesures ne sont pas
significativement corellées. La présence d’une autre population nitrosante (par exemple
appartenant à la sous-classe γ des Protéobactéries) non recherchée dans cette étude, mais
active in situ, n’est pas exclue.
• Le genre Nitrobacter serait présent dans l’eau de mer, car il ne subit pas de dilution
dans le gradient de salinité alors qu’au contraire, le genre Nitrospira, dilué dans le gradient
de salinité et tendant à disparaître, ne serait pas présente dans l’eau de mer en Baie de Seine.

251
Chapitre III. Résultats 2. Etude des populations bactériennes nitrifiantes

252
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

IV. CONCLUSIONS et PERSPECTIVES

253
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

254
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

En conclusion générale de ce travail, nous pourrons tout d’abord déterminer si les

résultats obtenus ont permis de remplir les objectifs que nous nous étions fixés au départ, et
nous essaierons de mettre en évidence les apports de cette étude à la connaissance du
processus de nitrification, sur les plans conceptuels, expérimentaux et de l’environnement. Il
s’agit également de ré-évaluer le rôle de la nitrification dans la compréhension du
fonctionnement écologique global de la Seine. Enfin, de nouvelles perspectives
expérimentales seront proposées.

IV.1. La nitrification, ses étapes intermédiaires,

ses populations

Notre premier objectif était de contribuer à l’approfondissement de nos connaissances

concernant le processus de nitrification, en considérant les trois étapes de nitrosation,
nitratation et nitrification-dénitrifiante. En nous attachant à l’étude du processus de
nitrification in situ, nous avons tout d’abord confirmé les précédentes observations c’est à
dire un processus de nitrification largement amplifié dans la basse Seine après l’apport des
effluents traités d’Achères fortement chargés en ammonium. Cet élément est totalement
consommé au niveau de l’estuaire amont. Cette étude permet ici, de quantifier les émissions
de N2O dans ce secteur et de montrer que le processus de nitrification y serait
majoritairement responsable (cf. bilans sur une période de 11 ans). A l’aval immédiat des
rejets des effluents d’Achères en revanche, une activité hétérotrophe intense liée à l’apport de
matière organique dans les effluents prend place, la dénitrification benthique et donc
favorisée. L’activité dénitrifiante serait, dans ce secteur, majoritairement responsable des
émissions de N2O. Les deux processus de nitrification et de dénitrification seraient donc
conjointement responsables de la production de N2O dans la basse Seine.
L’étude du processus de nitrification en conditions contrôlées nous a conduit à
déterminer les paramètres cinétiques gouvernant les différentes étapes et notamment ceux de
la nitrification-dénitrifiante, étape encore peu connue. Les expériences en batch et
chémostat, en nous permettant de mieux explorer les conditions qui favorisent la mise en
place de cette étape, ont abouti à un contrôle reproductible de l’induction de ce processus
d’émission de N2O et à en identifier les facteurs de contrôle principaux tels que l’oxygénation
et les concentrations optimales en substrats (ammonium et nitrite). L’expérimentation a en
effet montré que la production de N2O par nitrification-dénitrifiante est induite pour des
valeurs d’oxygénation du milieu comprises entre 1.1 et 1.5 mg O2.L-1. La production de N2O
est visiblement dépendante des concentrations en ammonium et en nitrite suivant des
cinétiques de type Michaëlis-Menten dont les paramètres sont Vmax N2O = 8-9 µg N-N2O prod .
mg C-1 . h-1, KsNH4 = 1.5–3 mg N-NH4+ . L-1, KsNO2 = 1–4 mg N-NO2- . L-1. Nous avons ainsi,
pour la première fois, défini en condition de stress oxique des gammes de valeurs pour les
constantes d’affinité des bactéries nitrosantes vis-à-vis de l’ammonium et du nitrite pour
l’étape de production de N2O (nitrification-dénitrifiante). Outre l’amélioration des
connaissances sur le processus de nitrification, ces valeurs ont été intégrées au modèle du
fonctionnement écologique de la Seine afin de modéliser les émissions de N2O.

Pour mieux comprendre les étapes du processus de nitrification, nous avons jugé
important d’étudier les communautés bactériennes qui les réalisent, à l’échelle de la
population et sur un plan fonctionnel. Nous nous sommes intéressés tant à la diversité de la
communauté nitrosante qu’aux populations nitratantes avec les objectifs de : 1) déterminer la
diversité bactérienne nitrifiante dans un gradient d’intensité de la nitrification et connaître
l’affiliation phylogénétique des populations présentes dans la basse Seine, 2) déterminer

255
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

quelles sont les bactéries nitrifiantes allochtones apportées par les effluents domestiques, en
déterminant leur affiliation phylogénétique et étudier leur devenir dans le milieu récepteur,
3) analyser les facteurs influençant la diversité bactérienne.
L’utilisation de plusieurs outils moléculaires (clonage, DGGE et PCRc) nous a permis
de montrer que 60 à 90% de la communauté nitrosante le long du continuum de la basse
Seine était composée de bactéries appartenant au cluster 6a, lignée représentée par
Nitrosomonas oligotropha et Nitrosomonas ureae, le reste de la communauté nitrosante
étant, à parts égales, constituée par des membres des groupes représentés par Nitrosomonas
europaea et Nitrosospira. Dans l’estuaire aval au niveau du gradient de salinité apparaissent
de nouvelles espèces bactériennes nitrosantes à caractère halophile appartenant aux groupes
représentés par Nitrosomonas marina / aestuarii et Nitrosococcus mobilis. En ce qui
concerne la communauté nitratante, nous avons étudié la répartition des deux genres
bactériens nitratants majoritairement représentés dans les milieux limniques : Nitrobacter et
Nitrospira. Alors que le genre Nitrobacter semble dominer la population au niveau des cours
d’eau de tête de bassin ainsi que dans l’estuaire, le genre Nitrospira est majoritaire à l’aval
des rejets de la station d’épuration d’Achères.

L’impact de la station d’Achères se traduit, au niveau de la diversité bactérienne

nitrosante, par l’apport d’une espèce nitrosante (Bande A) appartenant au cluster 6a, qui se
maintient dans le milieu récepteur jusque dans l’estuaire. Cette bactérie allochtone y
représente près de 40% de la population nitrosante. Les effluents d’Achères apportent en
Seine une grande quantité de bactéries nitratantes appartenant en proportions équivalentes
aux deux genres nitratants étudiés.

Il existe au total le long du continuum étudié, une succession d’espèces bactériennes

nitrosantes, aux origines autochtones et allochtones, que les facteurs environnementaux
favorisent plus ou moins. L’apport de substrat (ammonium) par la station d’Achères permet
le développement d’une nouvelle bactérie, caractérisée par une bande B sur les profils DGGE.
La bande C apparaissant spécifiquement dans l’estuaire amont, doit être mieux adaptée aux
faibles concentrations en ammonium et aux plus fortes teneurs en matières en suspension.
Enfin, la salinité représente un autre facteur induisant un changement populationnel. Si les
outils utilisés pour appréhender la communauté bactérienne nitratante n’étaient pas destinés
à l’étude approfondie de la diversité, ce travail montre d’une part que le genre Nitrobacter ne
peut plus être, comme par le passé, considéré comme un représentant unique de la
communauté des nitratantes, et que les deux genres considérés ici, Nitrospira et Nitrobacter,
présentent des niches écologiques différenciées.

256
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

IV.2. Les facteurs de diversité des populations

nitrifiantes

Cette étude s’inscrit dans la problématique d’estimation de la capacité d’auto-

épuration d’un milieu en aval d’un rejet anthropique, insuffisamment connue en ce qui
concerne la nitrification. En effet, de nombreux travaux sont développés sur les
communautés nitrifiantes à l’intérieur même des stations d’épuration, au niveau des
systèmes de traitement tertiaire, dans le but d’améliorer le rendement d’élimination de
l’azote avant le rejet dans le milieu. Comme il existe encore peu de stations d’épuration
possédant ces installations, mais que l’application de la directive cadre européenne les
prévoit dans un délai relativement bref (2007), il est nécessaire d’approfondir les
connaissances sur les effets des rejets sur le milieu récepteur.
Dans la majorité des cas, les rejets anthropiques sont fortement dilués à leur arrivée
dans le milieu récepteur, l’impact étant donc minimisé. Le site choisi est exemplatif pour ce
type de recherche car les effluents d’Achères peuvent représenter dans certains cas jusqu’à
1/5 du débit de la Seine. Un tel impact modifiant significativement la richesse et la diversité
spécifique de la communauté, ainsi que sa structure, influence nécessairement sa dynamique.
Une question importante en écologie microbienne est celle du maintien des espèces
bactériennes allochtones dans le milieu récepteur. Ce travail met clairement en évidence que
les bactéries nitrosantes ensemencées par les rejets d’Achères survivent et persistent dans le
milieu récepteur et se développent jusque dans l’estuaire. La survie dans le milieu récepteur,
de colonie de Nitrobacter associées à des particules et émanant de rejets de stations
d’épuration a été étudiée par Bonnet et al. (1997). Ces auteurs ont montré que ces amas de
Nitrobacter peuvent s’installer dans le sédiment du cours d’eau récepteur (106 cellules.g de
sédiment sec-1) et ainsi coloniser les sédiments de rivière. Brion & Billen (2000) avaient
également émis l’hypothèse que les bactéries nitrifiantes rejetées par les effluents de station
d’épuration pouvaient être actives dans le milieu récepteur. Nous ne pouvons pas comparer
des bactéries nitrifiantes avec des bactéries hétérotrophes comme par exemple des bactéries
fécales qui une fois rejetées dans l’environnement ne peuvent se développer car elles se
retrouvent dans un milieu hostile à leur croissance, la température étant souvent trop faible
et le milieu trop pauvre en nutriments, elles disparaissent ou se maintiennent dans un état
dit « viable mais non cultivable » (Garcia-Armisen & Servais 2004).

Une autre grande question importante en écologie des populations est l’adaptation et
la sélection par le milieu des espèces bactériennes les mieux adaptées physiologiquement aux
facteurs environnementaux. Les résultats de notre étude confortent une théorie tout à fait
robuste, émanant de la littérature, qui tend à montrer une sélection des populations
nitrifiantes par leur milieu. En effet des certains facteurs environnementaux tels que les
concentrations en substrats, la teneur en oxygène et en matière en suspension ou encore la
salinité, favoriseraient le développement de certaines espèces bactériennes par rapport aux
autres ; l’effet de la température ou du pH, appartiennent également à cet ensemble de
facteurs de contrôle.
Il existe une diversité physiologique relativement large parmi les bactéries nitrosantes
et nitratantes, bien qu’aujourd’hui on en connaisse qu’une infime partie ; la connaissance est
en effet limitée par les études en cultures pures qui restent difficiles à réaliser. Comme les
bactéries nitrifiantes ont un taux de croissance très lent, les espèces les plus étudiées
aujourd’hui en culture pure ne sont pas forcément les espèces majoritairement présentes
dans l’environnement. Les milieux de cultures se doivent en effet d’être sélectifs afin d’éviter
le développement de bactéries hétérotrophes lors de l’isolement des bactéries nitrifiantes, de
telle sorte que les apports en substrats azotés sont souvent beaucoup plus importants que les
concentrations rencontrées dans les milieux naturels. Ainsi, les genres Nitrosomonas
europaea et Nitrobacter sont les deux genres les plus étudiés en cultures pures, on connaît
aujourd’hui leur physiologie et une grande partie de leur information génétique ; toutefois il

257
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

semble que les espèces majoritairement présentes dans l’environnement ne possèdent pas
nécessairement les même propriétés physiologiques.
Les bactéries nitrifiantes, comme les autres communautés de microorganismes,
présentent des affinités différentes pour le substrat, certaines espèces seront favorisées dans
les environnements riches en ammonium ou en nitrite, d’autres dans les milieux avec de très
faibles concentrations. Les Nitrosospira du cluster 3 sont par exemple favorisés dans les sols
fortement fertilisés (Kowalchuk et al. 2000 ; Avrahami et al. 2003) alors que le cluster 9 sera
rencontré principalement dans les sols ayant une faible teneur en ammonium (Oved et al.
2001 ; Avrahami et al. 2003). Dans la Seine, une bactérie nitrosante supplémentaire (bactérie
appartenant au cluster 6a et représentée par la bande B sur le profil DGGE) apparaît après
rejets des effluents d’Achères, alors qu’elle n’est pas apportée par les effluents, elle se
développe donc grâce à l’apport d’ammonium.
Les expériences réalisées ici en conditions contrôlées avec une communauté naturelle
ont montré que certaines populations nitrosantes s’adaptent rapidement aux faibles
pressions en oxygène, en contrant le déficit en oxygène grâce à leur capacité à dénitrifier le
nitrite (nitrification-dénitrifiante). Les bactéries nitratantes, le genre Nitrobacter notamment
aux voies métaboliques diversifiées, s’adaptent à des milieux variés telles que les conditions
anaérobies, ce qui lui permet certainement d’être plus compétitif que Nitrospira dans le
bouchon vaseux de l’estuaire (Smith & Hoare 1968; Bock 1976; Kalthoff et al. 1979; Freitag et
al. 1987).
Nous avons également analysé l’effet de salinité comme facteur de sélection des
populations nitrifiantes. Nous avons clairement identifié une modification de la communauté
nitrosante et nitratante au niveau de l’estuaire aval de la Seine, au sein du gradient de
salinité, modification identique à celle observée dans l’Escaut. (De Bie et al. 2001 ; Bollmann
& Laanbroek, 2002). Le gradient de salinité est surtout caractérisé par les espèces halophiles
Nitrosomonas marina et Nitrosomonas aestuarii, alors que dans la basse Seine, les
membres du cluster 6a (Nitrosomonas oligotropha et ureae), espèces halosensibles, sont
détectés en majorité (Pommerening-Röser 1996 ; Speknijder et al. 1998 ; Purkhold et al.
2000).
La quantité de matières en suspension, et donc indirectement la quantité de matière
organique, semble un facteur important de la diversité bactérienne de la Seine. Les
modifications sensibles de la communauté nitrosante dans l’estuaire amont reflète de toute
évidence, l’augmentation de la matière en suspension dans la zone estuarienne qui en
favorisant l’attachement des bactéries, accroît leur temps de séjour, et permet leur adaptation
et leur sélection. En s’organisant ainsi en flocs, agrégats et biofilms, les bactéries acquièrent
des avantages écologiques la matière organique contenue dans les MES, source potentielle
d’ammonium, constituant un facteur sélectif supplémentaire.

Les différentes espèces bactériennes détectées dans la colonne d’eau de la basse Seine
et retrouvées lors des expériences de batch et chémostat, sont certainement caractéristiques
de températures de l’ordre de 20°C. La composition de la communauté bactérienne
nitrifiante est donc également influencée par ce facteur constituant une sélection par la
température. D’autres études rapportent également la sélection des espèces suivant la
température, Avrahami & Conrad (2003) ont détecté des modifications au niveau de la
diversité nitrosante, dans des sols à 30°C, les Nitrosospira appartenant aux clusters 3 et 9
dominent la population alors qu’à 25°C les auteurs détectent principalement des membres du
cluster 4.

La plupart des études expérimentales s’intéressent à l’effet d’un seul facteur

environnemental sur la diversité bactérienne, les autres étant maintenus constants. La
concentration en substrat est le plus souvent explorée, mais le substrat azoté est souvent
apporté à des concentrations non limitantes qui peuvent s’avérer très élevées par rapport à
celles rencontrées dans le milieu naturel, ce qui peut biaiser l’interprétation des résultats.
Quelques études expérimentales montrent toutefois que l’adaptation de la communauté
nitrifiante, aux modifications de milieu, est relativement lente. Après 4 à 6 semaines aucun
changement de diversité n’est souvent ressenti (Avrahami et al. 2002), et il faut même dans

258
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

certains cas attendre plus de 16 semaines pour observer un changement significatif

(Avrahami et al. 2003).

Les interprétations des résultats obtenus sur des échantillons environnementaux,

doivent être effectuées avec prudence, surtout quand s’ajoute une contrainte hydrologique
importante, comme c’est le cas en rivière, avec des apports et des ensemencements latéraux à
la fois anthropiques (rejets de stations d’épuration) et naturels (érosion des sols et des rives,
apports par les affluents). Avec une composition de la communauté bactérienne constituée à
un moment donné, d’espèces autochtones adaptées au milieu et d’espèces allochtones
apportées dans la Seine, nos résultats, acquis sur ce long secteur de 350 km, en périodes
estivales stables du point de vue météorologique (conditions stationnaires), révèlent une
grande stabilité et une grande reproductibilité, tant sur le plan de la composition de la
communauté bactérienne que de son comportement et de son activité.

259
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

IV.3. La nitrification et le fonctionnement

écologique de la Seine

Un intérêt majeur de cette étude est qu’elle relève aussi bien de l’écologie microbienne
fondamentale que de l’application pour la gestion des milieux naturels. La double approche
adoptée (outils biogéochimiques et moléculaires) à une large échelle géographique, a permis
d’élaborer une vision globale du fonctionnement du processus de nitrification dans la basse
Seine. Les différentes étapes de notre travail se complètent, permettant de faire le lien entre
les observations, mesures in situ et les expériences réalisées en laboratoire (Figure IV.1).
Si la vitesse de nitrification est classiquement quantifiée in situ par la consommation
de l’ammonium, rejeté par la station d’épuration d’Achères, et la production de nitrate et
d’oxyde nitreux, les diverses approches moléculaires nous ont permis d’appréhender
simultanément la composition et diversité bactérienne nitrifiante in situ. Cette approche est
nécessaire pour appréhender l’origine et le devenir de la communauté dans un vaste gradient
de conditions environnementales. Cette connaissance in situ est utile pour pouvoir valider les
expériences en laboratoire, c’est à dire s’assurer que les communautés naturelles sont bien
celles que nous étudions en batch et/ou chémostat. Sur cette base nous avons pu définir les
cinétiques des processus et déterminer les paramètres cinétiques de contrôle, résultats qui
peuvent être intégrés à la modélisation du fonctionnement écologique de la basse Seine. Les
expériences en batch et chémostat ne sont pas destinées à reproduire la dynamique complexe
des processus du milieu naturel, mais à déterminer des paramètres cinétiques en conditions
optimales que la démarche de modélisation se chargera de moduler en fonction des
contraintes prises en compte dans le modèle et de la complexité des interactions écologiques
représentées. L’adéquation entre les observations in situ et les résultats du modèle sont alors
une mesure de la compréhension du système. Les expériences ont été réalisées avec des
cultures d’eau de Seine plutôt qu’avec des cultures pures de bactéries nitrifiantes car les
cinétiques de croissances en conditions contrôlées des bactéries nitrifiantes en cultures pures
sont, pour la plupart, connues et nous souhaitions être le plus proche possible des conditions
de la Seine, et en particulier de la communauté nitrifiante endogène.

L’approche utilisant la DGGE a permis de faire le lien entre les données in situ et
celles obtenues au laboratoire, l’étape de modélisation nous permet en retour de valider nos
observations in situ puis d’explorer des modifications de contraintes, prévues dans un futur
proche pour améliorer la qualité de l’eau de la Seine (Figure IV.1).

IN SITU IN LABO
3 : DGGE ADNr 16S
260 Même bactéries nitrosantes
majoritairement présentes

(cluster 6a N. oligotropha-ureae)
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

Figure IV.1. Schéma récapitulatif illustrant notre démarche d’étude.

261
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

IV.4. Perspectives

Ces travaux ont permis d’obtenir des résultats nouveaux qui modifient sensiblement
notre vision de la nitrification tant sur le plan de l’écologie fondamentale que sur celui du
fonctionnement écologique de la basse Seine. Comme dans tout travail de recherche, de
nouvelles perspectives de recherches s’ouvrent encore concernant notamment 1)
l’approfondissement de notre connaissance concernant la diversité des populations
bactériennes nitrifiantes in situ, et plus particulièrement la diversité des bactéries nitratantes
en utilisant une approche similaire à celles des bactéries nitrosantes, basée sur des gènes de
fonction, 2) la détermination des bactéries actives in situ, 3) l’étude du processus de
dénitrification en se focalisant sur son rôle dans la production du N2O, 4) la mesure des
activités réelles in situ, en recherchant des méthodes plus sensibles que celles que nous avons
mises en œuvre.

- L’étude de la diversité bactérienne nitrosante in situ pourra être complétée par

l’étude des bactéries nitrosantes appartenant à la sous-classe γ des Protéobactéries. Ces
bactéries ont jusqu’à présent, été uniquement détectées dans les milieux marins, mais leur
présence n’est pas exclue dans les autres milieux. Nous pourrons également chercher la
présence de Planctomycètes Anammox dans la Seine, à la fois dans la colonne d’eau ou les
sédiments benthiques et dans les effluents d’Achères. L’étude moléculaire de ces deux
populations bactériennes, décrite par Freitag & Prosser (2003), pourrait constituer une base
méthodologique pour leur détection dans la Seine.
- La diversité bactérienne nitratante, que nous avons abordé par la succession des
deux genres Nitrobacter et Nitrospira dans la Seine, pourrait être approfondie à un niveau
spécifique. Grâce à des amorces PCR ciblant la NOR, à l’utilisation d’anticorps spécifiques de
la NOR (Maron et al. 2003), au clonage et séquençage de fragments d’ADNr 16S spécifiques
de chacun des deux genres bactériens ou encore grâce à l’analyse de profils en acide gras
(PLFA) (Lipski et al. 2001a et b) nous pourrions accéder à la diversité spécifique de la
population nitratante.

- Un complément à la présente étude de la diversité bactérienne nitrosante serait de

parvenir à cibler la population bactérienne active in situ. Pour cela nous pourrions utiliser la
technique RT-PCR ciblant l’ARN plutôt que l’ADN et permettant ainsi de détecter et
quantifier la population active, par rapport à la communauté totale. Cette technique a été
appliquée à la population nitrosante par Ebie et al. (2004) qui ont ainsi ciblé le gène amoA à
la fois au niveau des ARNm (RT-PCR) et de l’ADN (PCR), puis comparé les résultats par
DGGE. En conditions contrôlées, nous pourrions détecter les populations bactériennes
nitrifiantes actives au moyen de la technique de SIP (Stable Isotop Probing) permettant au
moyen de substrat marqué avec un isotope stable (dans notre cas par exemple du 13CO2) de
mettre en évidence les bactéries actives qui en utilisant ce substrat carboné vont avoir leur
ADN et ARN marqués au 13C (Radajewski et al. 2003).

- Compte tenu des variations physiologiques qui peuvent exister entre les différents
clusters d’une même communauté fonctionnelle, nous pourrions, afin d’approfondir les
connaissances en matière de physiologie et afin affiner la représentation des processus dans
les modèles mathématiques, isoler en conditions contrôlées de laboratoire, des bactéries
nitrosantes du cluster 6a, majoritairement présentes dans la Seine et dans les effluents
d’Achères. La technique « d’extinction dilution » proposée par Aakra et al. (1999) pour isoler
des souches nitrosantes nous paraît prometteuse.

262
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

- De récent progrès ont été fait pour déterminer la production de N2O en tenant
compte du rôle relatif des processus de nitrification et dénitrification grâce à l’utilisation
d’inhibiteur tels que l’acétylène (Bonin et al. 2002 ; De Bie et al. 2002). Toutefois, ces deux
processus sont, d’une certaine manière, sensibles à ce composé (Bonin et al. 2002), et l’on ne
met pas en évidence in situ la production et la consommation simultanée de N2O par l’un ou
l’autre de ces deux processus. Une alternative est l’approche isotopique de Barnes & Owens
(1999) qui consiste à extraire le N2O, après incubation des échantillons d’eau avec du 15NH4
ou 15NO3, et à analyser son enrichissement en 15N. Celle de Punshon & Moore (1999), permet
de différencier le N2O produit par nitrification et par dénitrification en utilisant non
seulement du 15NH4 et 15NO3 comme substrat, mais aussi du 15N2O et un standard interne
(15N218O) qui conduit à une précision de ±1%. Cette méthodologie va être prochainement
appliquée aux échantillons de la Seine afin de déterminer plus en détail au niveau spatial et
d’une manière quantitative l’importance relative des deux processus de nitrification et
dénitrification aux émissions de N2O à l’échelle du bassin (collaboration avec A. Mariotti et
M. Sébilo).

- Bien que les outils moléculaires qui conduisent à appréhender les communautés
bactériennes dénitrifiantes sont difficiles à mettre en œuvre car le processus de
dénitrification est connu pour être réalisé par des groupes bactériens phylogénétiquement
plus diversifiés et moins spécifiques que ceux intervenant dans la nitrification, nous
projetons d’associer à l’étude de la dénitrification et production de N2O, une analyse de la
communauté bactérienne (Mounier et al. 2004), au même titre que nous l’avons fait pour la
nitrification.

Il nous faut toutefois souligner qu’en 2015, la station d’épuration d’Achères, équipée
de traitement tertiaire des eaux usées, ne devrait plus déverser autant d’ammonium dans la
Seine, les premières améliorations devant être effectives dès 2007. Avec une réduction
drastique d’ammonium, ainsi que nous l’avons montré par la modélisation, le processus de
nitrification sera beaucoup moins actif à l’aval des rejets parisiens. Il en va d’ailleurs de
même pour la dénitrification, puisque l’amélioration des traitements devrait conduire à une
diminution en charge carbonée et à une meilleure oxygénation du milieu. Les enjeux relatifs
aux apports azotés dans la Seine concerneront alors les apports diffus de nitrates par les
engrais agricoles et leur dénitrification dans les zones ripariennes, thématiques largement
étudiées dans le cadre du programme PIREN-Seine (Benoit et al. 1995 ; Gomez et al. 2002 ;
Sébilo 2003 ; Sebilo et al. 2003).

Afin de poursuivre notre compréhension du cycle de l’azote, en particulier des

processus de nitrification, mais aussi de dénitrification, dans une perspective plus large de
réduction des gaz à effet de serre (N2O en l’occurrence), cette approche pourrait être
appliquée et développée, dans d’autres systèmes fortement anthropisés par les effluents
domestiques, dans des gradients d’anthropisation et/ou climatiques.

263
 Chapitre IV. Conclusions et Perspectives

264
 Bibliographie

BIBLIOGRAPHIE

265
 Bibliographie

266
 Bibliographie

~A~
Aakra A, Utaker JB, Nes IF, Bakken LR. 1999. An evaluated improvement of the extinction dilution method
for isolation of ammonia-oxidizing bacteria. Journal of Microbiological Methods. 39:23-31.
Aakra A, Hesselsoe M, Bakken LR. 2000. Surface attachment of ammonia-oxidizing bacteria in soil.
Microbial Ecology, 39:222-235.
Aakra A, Utaker JB, Pommerening-Röser A, Koops H-P, Nes IF. 2001. Detailed phylogeny of ammonia-
oxidizing bacteria determined by rDNA sequences and DNA homology values. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 51:2021-2030.
Aamand J, Ahl T, Spieck E. 1996. Monoclonal antibodies recognizing nitrite oxidoreductase of Nitrobacter
hamburgensis, N. winogradskyi, and N. vulgaris. Appl. Environ. Microbiol. 62:2352-2355
Abd El Haleem D, von Wintzingerode F, Moter A, Moawad H, Göbel UB. 2000. Phylogenetic analysis of
rhizosphere-associated β-subclass proteobacterial ammonia oxidizers in a municipal wastewater
treatment plant based on rhizoremediation technology. Lett. Appl. Microbiol. 31:34-38.
Abeliovich A. 1987. Nitrifying bacteria in wastewater reservoirs. Appl. Environ. Microbiol. 53:754-760.
Abeliovich A, Vonshak A. 1992. Anaerobic metabolism of Nitrosomonas europaea. Arch. Microbiol. 158:267-
270.
Adams DD. 1991. Sediment pore water sampling, in Handbook of techniques for aquatic sediments sampling,
CRC Press, pp171-202.
Admiraal W, van Zanten B. 1988. Impact of biological activity on detritus transported in the lower river
Rhine: an exercise in ecosystem analysis. Freshwater Biol, 20:215–25.
Akiyama H, Tsuruta H, Watanabe T. 2000. N2O and NO emissions from soils after the application of
different chemical fertilizers. Chemosphere—Global Change Science 2:313-320.
Alexander RB, Smith RA, Schwartz GE. 2000. Supplementary information for Effect of stream channel size
on the delivery of nitrogen to the Gulf of Mexico;
[Link]
Allison SM, Prosser JI. 1993. Ammonia oxidation at low pH by attached populations of nitrifying bacteria. Soil
Biol. Biochem. 25:935-941.
Altmann D, Stief P, Amann R, de Beer D, Schramm A. 2003. In situ distribution and activity of nitrifying
bacteria in freshwater sediment. Environ. Microbiol. 5:798-803.
Alzerreca JJ, Norton JM, Klotz MG. 1999. The amo operon in marine, ammonia-oxidizing gama-
proteobacteria. FEMS Microbiol. Lett. 180:21-29.
Amann RI, Krumholz L, Stahl DA. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for
determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172:762-770.
Amann RI, Ludwig W, Schleifer K-H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual
microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59:143-169.
Amann R, Ludwig W. 2000. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology.
FEMS Microbiol. Rev. 24:555-565.
Amann R, Fuchs BM, Behrens S. 2001. The identification of microorganisms by fluorescence in situ
hybridisation. Curr. Opin. Biotechnol. 12:231-236.
An S, Joye SB. 2001. Enhancement of coupled nitrification-denitrification by benthic photosynthesis in shallow
estuarine sediments. Limnol. Oceanogr. 46:62-74.
Anderson IC, Levine JS. 1986. Relative rates of nitric oxide and nitrous oxide production by nitrifiers,
denitrifiers, and nitrate respirers. Appl. Environ. Microbiol. 51:938-945.
Anderson IC, Poth M, Homstead J, Burdige D. 1993. A comparison of NO and N2O production by the
autotrophic nitrifier Nitrosomonas europaea and the heterotrophic nitrifier Alcaligenes faecalis. Appl.
Environ. Microbiol. 59:3525-3533
Anthonisen AC, Loehr RC, Prakasam TBS, Srinath EG. 1976. Inhibition of nitrification of ammonia and
nitrous acid. J. Water Pollution Control Fed. 48:835-852.
Arp DJ, Sayavedra-Soto LA. 2002. Molecular biology and biochemistry of ammonia oxidation by
Nitrosomonas europaea. Arch. Microbiol. 178:250-255.
Arvin E, Dyreborg S, Menck C, Olsen J. 1994. A mini-nitrification test for toxicity screening, MINNTOX.
Wat. Res. 28:2029-2031.
ASIA 2000. Assemblée des Syndicats Intercommunaux d’Assainissement d’Ile de France, Diversifier les filières
de gestion des boues, perspectives nouvelles, Actes de la rencontre de l’Assemblée des Syndicats
Intercommunaux d’Assainissement d’Ile de France, 23 Novembre 2000, Paris, Parc des expositions, 49
pp.
Atlas RM, Bartha R. 1998. Microbial ecology, fundamentals and applications, 4th éditions. Benjamin-
Cummings Science (ed).
Audic JM, Faup GM, Navarro JM. 1984. Specific activity of Nitrobacter through attachment of granular media.
Water Res. 18:745-750 .
Avrahami S, Conrad R, Braker G. 2002. Effect of soil ammonium concentration on N2O release and on the
community structure of ammonia oxidizers and denitrifiers. Appl. Environ. Microbiol. 68:5685-5692.
Avrahami S, Conrad R. 2003. Patterns of community change among ammonia oxidizers in meadow soils upon
long-term incubation. Appl. Environ. Microbiol. 69:6152-6164.
Azam F, Fenchel T, Field JG, Gray JS, Meyer-Reil LA, Thingstad F. 1983. The ecological role of water-
column microbes in the sea. Mar. Ecol. Prog. Ser. 10:257-263.

267
 Bibliographie

~B~
Bäckman JSK, Hermansson A, Tebbe CC, Lindgren P-E. 2003. Liming induces growth of a diverse flora
of ammonia-oxidizing bacteria in acid spruce forest soil as determined by SSCP and DGGE. Soil Biology
& Biochemistry. 35:1337-1347.
Bange HW, Rapsomanikis S, Andreaa MO. 1996. Nitrous oxide in coastal waters. Global Biochemical cycles
10:197-207.
Bano N, Hollibaugh JT. 2000. Diversity and distribution of DNA Sequences with affinity to ammonia-
oxidizing bacteria of the beta-subdivision of the class Proteobacteria in the Artic Ocean. Appl. Environ.
Microbiol. 66:1960-1969.
Barillier A, Garnier J. 1993. Influence of temperature and substrate concentration on bacterial growth yield in
Seine River water batch cultures. Appl. Environ. Microbiol. 59:1678-1682.
Barraclough D, G. Puri, 1995. The use of 15N pool dilution and enrichment to separate the heterotrophic and
autotrophic pathways of nitrification, Soil Biology & Biochemistry 27:17-22.
Bartosch S, Wolgast I, Spieck E, Bock E. 1999. Identification of nitrite-oxidizing bacteria with monoclonal
antibodies recognizing the nitrite oxidoreductase. Appl. Environ. Microbiol. 65:4126-4133.
Bartosch S, Hartwig C, Spieck E, Bock E. 2002. Immunological detection of Nitrospira-like bacteria in
various soils. Microb. Ecol. 43:26-33.
Batchelor S, Cooper M, Chhabra S, Glover L, Stewart G, Williams P, Prosser JI. 1997. Cell density-
regulated recovery of starved biofilm populations of ammonia-oxidizing bacteria. Appl. Environ.
Microbiol. 63:2281-2286.
Baumann B, Snozzi M, Zehnder AJB, Van Der Meer JR. 1996. Dynamics of denitrification activity of
Paracoccus denitrificans in continuous culture during aerobic-anaerobic changes. Journal of
Bacteriology 178:4367-4374.
Beaumont HJ, Hommes NG, Sayavedra-Soto LA, Arp DJ, Arciero DM, Hooper AB, Westerhoff HV,
van Spanning RJ. 2002. Nitrite reductase of Nitrosomonas europaea is not essential for production of
gaseous nitrogen oxides and confers tolerance to nitrite. J. Bacteriol. 184:2557-2560.
Beaumont HJE, van Schooten B, Lens SI, Westerhoff HV, van Spanning RJM. 2004. Nitrosomonas
europaea Expresses a Nitric Oxide Reductase during Nitrification. J. Bacteriol. 186:4417-4421.
15
Beline F, Martinez J, Marol C, Guiraud G. 2001. Application of the N technique to determine the
contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from aerated pig slurry.
Water Research 35:2774-2778.
Belser LW. 1979. Population ecology of nitrifying bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 33:309-333.
Belser LW, Mays EL. 1980. Specific inhibition of nitrite oxidation by chlorate and its use in assessing
nitrification in soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 39:505-510.
Belser LW, Schmidt EL. 1980. Growth and oxidation kinetics of three genera of ammonia-oxidizing nitrifiers.
FEMS Microbiol. Lett. 7:213-216.
Belser LW. 1984. Bicarbonate uptake by nitrifiers: effects of growth rate, pH, substrate concentration and
metabolic inhibitors. Appl. Environ. Microbiol. 48:1100-1104.
Berounsky VM, Nixon SW. 1990. Temperature and annual cycle of nitrification in waters of Narragansett Bay.
Limnol. Oceanog. 35:1610-1617.
Berthe T, Garnier J, Petit F. 1999. Quantification de bactéries nitrifiantes du genre Nitrobacter en milieux
aquatiques (l'estuaire de la Seine, France). Compte Rendu Académie des Sciences Paris, Sciences de la
vie, Ecologie 322:517-526.
Berthe T, Garnier J, Philippon X, Pinault S, Laroche L. Activités nitrifiantes et hétérotrophes dans le
continuum réseau d'assainissement-station d'épuration- milieu naturel. R.A. PIREN-Seine 2000. 26pp
Bianchi M, Bonin P, Feliatra F. 1994. Bacterial nitrification and denitrification rates in the Rhône River
plume (northwestern Mediterranean Sea). Mar. Ecol., Prog. Ser. 103:197-202
Bianchi M. 1998. Nouvelles approches d'étude des réseaux microbiens. Annls Limnol. 34:465-473.
Bianchi M, Feliatra, Lefevre D. [Link] in the NW Mediterranean. I. Regulation of processes in
the land-ocean contact area of the Rhône River plume. Aquat. Micro. Ecol., 18 :301-312.
Bianchi M, Fosset C, Conan P. 1999b. Nitrification in the NW Mediterranean. II. Nitrification rates in the NW
Mediterranean Sea. Aquat. Micro. Ecol., 17 :267-278 .
Biesterfeld S, Farmer G, Russell P, Figueroa L. 2003. Effect of alkalinity type and concentration on
nitrifying biofilm activity. Water Environment Research. 75:196-204.
Billen G. 1976. Evaluation of nitrifying activity in sediments by dark 14C-bicarbonate incorporation. Water
Research 10:51-57.
Billen G. 1982. Modelling the processes of organic matter degradation and nutrients recycling in sedimentary
systems. In: Nedwell DB, Brown CM. (eds) Sediment microbiology. Academic Press, New York, pp 15–
52.
Billen G, Garnier J, Hanset P. 1994. Modelling phytoplankton development in whole drainage networks: the
RIVERSTRAHLER Model applied to the Seine river system. Hydrobiologia 289:119-137
Billen G, Garnier J, Meybeck M. 1998a. Les sels nutritifs : l'ouverture des cycles. In: La Seine en son bassin :
Fonctionnement écologique d'un système anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De Marsily, E. Fustec. Chapitre
12 pp. 531-565.

268
 Bibliographie

Billen G, Garnier J, Meybeck M. 1998b. Les transformations bactériennes de l’azote. In: La Seine en son
bassin : Fonctionnement écologique d'un système anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De Marsily, E. Fustec.
Chapitre 13 pp. 567-592.
Billen G, Garnier J. 1999. Nitrogen transfers through the Seine drainage network: a budget based on the
application of the Riverstrahler model. Hydrobiologia, 410:139-150.
Billen G, Garnier J, Deligne C, Billen C. 1999. Estimates of early-industrial inputs of nutrients to river
systems: implication for coastal eutrophication. The Science of the Total Environment, 243/244:43-52.
Billen G, Garnier J, Ficht A, Cun C. 2001. Modeling response of water quality in the Seine river estuary to
human activity in its watershed over the last 50 years. Estuaries, 24: 977-993.
Bjerrum L, Kjaer T, Ramsing NB. 2002. Enumerating ammonia-oxidizing bacteria in environmental samples
using competitive PCR. J. Microbiol. Methods 51:227-239.
Blackburn TH. 1983. The microbial nitrogen cycle. In: Krumbein CWE. (Ed.) Microbial Geochemistry.
Blackwell, Oxford, England, pp. 63-89.
Blackmer AM, Bremner JM, Schmidt EL. 1980. Production of nitrous oxide by ammonia-oxidizing
chemoautotrophic microorganisms in soil. Appl. Environ. Microbiol. 40:1060-1066.
Bock E. 1976. Growth of Nitrobacter in the presence of organic matter. II. Chemoorganotrophic growth of
Nitrobacter agilis. Arch. Microbiol. 108:305-312.
Bock E, Sundermeer-Klinger H, Stackebrandt E. 1983. New facultative lithoautotrophic nitrite-oxidizing
bacteria. Arch. Microbiol. 136:281-284.
Bock E, Koops HP, Harms H. 1986. Cell biology of nitrifying bacteria. In : Nitrification, pp. 17-38. Prosser J. I.
(ed.), IRL Press, Oxford.
Bock E, Koops HP, Harms H. 1989. Nitrifying bacteria. In: Autotrophic bacteria, pp. 81-96. Schlegel H. G. et
Bowien B. (ed.), Springer-Verlag, Berlin.
Bock E, Koops H-P, Möller UC, Rudert M. 1990. A new facultatively nitrite oxidizing bacterium, Nitrobacter
vulgaris sp. nov. Arch. Microbiol. 153:105-110.
Bock E, Koops H-P. 1992. The genus Nitrobacter and related genera. In The prokaryotes, ed. A. Balows, H. G.
Trüper, M. Dworkin, W. Harder, K.-H. Shleifer. pp. 2302-2309. New York: Springer Verlag.
Bock E, Koops H-P, Ahlers B, Harms H. 1992. Oxidation of inorganic nitrogen compounds as energy source.
In The Prokaryotes., ed. A. Balows, H.G. Trüper, M. Dworkin, W. Harder, K.-H. Schleifer. pp. 414–430.
New York: Springer Verlag.
Bock E, Schmidt I, Stüven R, Zart D. 1995. Nitrogen loss caused by denitrifying Nitrosomonas cells using
ammonium or hydrogen as electron donors and nitrite as electron acceptor. Archives of Microbiology
163:16-20.
Bock E, Wagner M. 2001. Oxidation of Inorganic Nitrogen Compounds as an Energy Source In M. Dworkin et
al., eds. The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community third
edition, release 3.13, Springer-Verlag, New York.
Böckelmann U, Manz W, Neu TR, Szewzyk U, 2000. Characterization of the microbial community of lotic
organic aggregates (‘‘river snow’’) in the Elbe river of Germany by cultivation and molecular methods.
FEMS Microbiol. Ecol. 33:157-170.
Böckelmann U, Manz W, Neu TR, Szewzyk U. 2002. Investigation of lotic microbial aggregates by a
combined technique of fluorescent in situ hybridization and lectin-binding-analysis. Journal of
Microbiological Methods. 49:75-87.
Bodelier PLE, Libochant JA, Blom CW, Laanbroek HJ. 1996. Dynamics of nitrification and denitrification
in roots-oxygenated sediments and adaptation of ammonia-oxidizing bacteria to low-oxygen or anoxic
habitats. Appl. Environ. Microbiol. 62:4100-4107.
Bodelier PL, Frenzel P. 1999. Contribution of methanotrophic and nitrifying bacteria to CH4 and NH4+
oxidation in the rhizosphere of rice plants as determined by new methods of discrimination. Appl.
Environ. Microbiol. 65:1826-1833.
Bohlen PJ, Groffman PM, Fahey TJ, Driscoll CT, Siccama TG. 2001. Plant-soil-microbial interactions in
a northern hardwood forest. Ecology 82:965–978.
Bollmann A, Conrad R. 1998. Influence of O2 availability on NO and N2O release by nitrification and
denitrification in soils. Global Change Biology 4:387-396.
Bollmann A, Laanbroek HJ. 2001. Continuous culture enrichments of ammonia-oxidizing bacteria at low
ammonium concentrations. FEMS Microbiology Ecology, 37:211-221.
Bollmann A, Laanbroek HJ. 2002. Influence of oxygen partial pressure and salinity on the community
composition of ammonia-oxidizing bacteria in the Schelde estuary. Aquatic Microbial Ecology, 28:239-
247.
Bonin, P. 1996. Anaerobic nitrate reduction to ammonium in two strains isolated from coastal marine sediment:
a dissimilatory pathway. FEMS Microbiol. Ecol. 19:27-38.
Bonin P, Omnes P, Chalamet A. 1998. Simultaneous occurence of denitrification and nitrate ammonification
in sediment of the French Mediterranean coast. Hydrobiologia 389:169–182.
Bonin P, Tamburini C, Michotey V. 2002. Determination of the bacterial processes which are sources of
nitrous oxide production in marine samples. Water Research 36:722-732.
Boon N, Top EM, Verstrate W, Siciliano SD. 2003. Biaugmentation as a tool to protect the structure and
function of activated sludge microbial community against a 3-chloroaniline shock load. Appl. Environ.
Microbiol. 69:1511-1520.

269
 Bibliographie

Both GJ, Gerards S, Laanbroek HJ. 1990a. Enumeration of nitrite oxidizing bacteria in grassland soils using
a most probable technique: Effect of nitrite concentration and sampling procedure. FEMS Microbiol.
Ecol. 74:277-285.
Both GJ, Gerards S, Laanbroek HJ. 1990b. Most probable numbers of chemlitho-autotrophic nitrite-
oxidizing bacteria in well drained grassland soils: Stimulation by high nitrite concentrations. FEMS
Microbiol. Ecol. 74:287-293.
Boulton AJ, Findlay S, Marmonier P, Stanley EH, Valett HM. 1998. The functional significance of the
hyporheic zone in streams and rivers. Ann. Rev. Ecolog. Syst., 29:59-81.
Bouwman AF, Lee DS, Asman WAH, Dentener FJ, Van der Hoeck KW, Olivier JGJ, 1997. A global
high-resolution emission inventory for ammonia. Global Biogeochemical Cycles 11:561-587.
Brion N. 1998 Etude du processus de nitrification à l'échelle de grands réseaux hydrographiques anthropisés.
Thèse. Université libre de Bruxelles, Belgique.
Brion N, Billen G. 1998. Une réévaluation de la méthode d'incorporation de H14CO3- pour mesurer la
nitrification autotrophe et son application pour estimer des biomasses de bactéries nitrifiantes. Rev. Sci.
Eau 11:283-302
Brion N, Billen G. 1999, Wastewater as a source of nitrifying bacteria in river systems: the case of the river
Seine downstream from Paris, Wat. Res., 34, 12, 3213-3221.
Brion N, Billen G, Guezennec L, Ficht A. 2000. Distribution of nitrifying activity in the Seine River (France)
from Paris to the estuary. Estuaries 23: 669-682
Brown CM. 1988. Nitrate metabolism by aquatic bacteria, p. 367-388. In B. Austin (ed.), Methods in aquatic
bacteriology. John Wiley & Sons, Inc., New York.
Bruns MA, Stephen JR, Kowalchuk GA, Prosser JI, Paul EA. 1999. Comparative diversity of ammonia
oxidizer 16S rRNA gene sequences in native, tilled and successional soils. Appl. Environ. Microbiol.
65:2994-3000.
Budzinski H, Raymond N, Nadalig T, Gilewicz M, Garrigues P, Bertrand JC, Caumette P. 1998.
Aerobic biodegradation of alkylated aromatic hydrocarbons by a bacterial community. Org. Geochem.
28:337-348.
Bultot F, Dupriez GL. 1976. Conceptual hydrological model for an average-sized catchment area, I. Concepts
and relationships. J. Hydrol., 29: 251-272.
Burgess JE, Colliver BB, Stuetz RM, Stephenson T. 2002. Dinitrogen oxide production by a mixed culture
of nitrifying bacteria during ammonia shock loading and aeration failure. Journal of Industrial
Microbiology and Biotechnology 29:309-313.
Burrell PC, Keller J, Blackall LL. 1998. Microbiology of a nitrite-oxidizing bioreactor. Appl. Environ.
Microbiol. 64:1878-1883.
Burrell P, Keller J, Blackall LL. 1999. Characterisation of the bacterial consortium involved in nitrite
oxidation in activated sludge. Water Sci. Technol. 39:45-52.
Burrell PC, Phalen CM, Hovanec TA. 2001. Identification of bacteria responsible for ammonia oxidation in
freshwater aquaria. Appl. Environ. Microbiol. 67:5791-5800.
Butler J, Elkins JW, Thompson TM, Egan KB. [Link] and dissolved N2O of the West Pacific
and East Indian Oceans during the El Niño Southern oscillation event of 1987. J. Geophys. Res. 94:865-
877.
Butturini A, Sabater F. 1998. Ammonium and phosphate retention in a Mediterranean stream: hydrological
versus temperature control. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 55:1938-1945.
Butturini A, Battin TJ, Sabater F. 2000. Nitrification in stream sediment biofilms: the role of ammonium
concentration and DOC quality Water Res. 34:629-639.

~C~

Calvó L, Garcia-Gil J. 2004. Use of amoB as a new molecular marker for ammonia-oxidizing bacteria. Journal
of Microbiological Methods. In press.
Campos JL, Garrido-Fermindez JM, Mondez R, Lema JM. 1999. Nitrification at high ammonia loading
rates in an activated sludge unit. Bioressource Technology 68: 141-148.
Capone DG. 1991. Aspects of the marine nitrogen cycle with relevance to the dynamics of nitrous and nitric
oxide. In: Rogers JE, Whitman WB. (Eds.), Microbial Production and Consumption of Greenhouse
Gases: Methane, Nitrogen Oxides, and Halomethanes. American Society for Microbiology, Washington,
pp. 255–275.
Caraco NF, Cole JJ. 1999. Human impact on nitrate export: An analysis using major world rivers. Ambio,
28:167-170.
Carlucci AF. Strickland JDH. 1968. The isolation, purification and some kinetic studies of marine nitrifying
bacteria. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 2:156-166.
Carnol M, Kowalchuk GA, De Boer W. 2002. Nitrosomonas europaea-like bacteria detected as the
dominant b-subclass Proteobacteria ammonia oxidisers in reference and limed acid forest soils. Soil
Biology & Biochemistry, 34:1047-1050.
Carpenter SR, Kitchell JF. 1993. The trophic cascade in lakes. Cambridge University Press, New York, USA.
Casciotti KL, Ward BB. 2001. Dissimilatory nitrite reductase genes from autotrophic ammonia-oxidizing
bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 67:2213-2221.

270
 Bibliographie

Castignetti D, Hollocher TC. 1984. Heterotrophic nitrification among denitrifiers. Appl. Environ. Microbiol.
47:620-623.
Caumette P, Baleux B. 1980. Etudes des eaux rouges dues à la prolifération des bactéries photosynthétiques
sulfo-oxydantes dans l’étang du Prévost, lagune saumâtre méditerranéenne. Mar. Biol. 56 :183-194.
Cébron A. 2001. Adaptation de la technique FISH pour l’évaluation de la diversité de populations nitrifiantes en
sédiment d’eau douce. DEA, Université Lyon I, 25p.
Cébron A, Berthe T, Garnier J. 2003. Nitrification and nitrifying bacteria in the lower Seine River and
estuary (France). Appl. Environ. Microbiol. 69:7091-7100.
Chain P, Lamerdin J, Larimer F, Regala W, Lao V, Land M, Hauser L, Hooper A, Klotz M, Norton
J, Sayavedra-Soto L, Arciero D, Hommes N, Whittaker M, Arp D. 2003. Complete Genome
sequence of the ammonia-oxidizing bacterium and obligate chemolithoautotroph Nitrosomonas
europaea. J. bacteriol. 185:2759-2773.
Chartrain M, Rizet M, Faup G. 1983. Isolation of Nitrobacter from sewage and drinking water. Water Res.
17:831-832.
Chevreuil M, Thévenot D, Scribe P, Blanchard M, Duclos Y, Garmouna M, Gonzalez Calderon A,
Irace S, Teil MJ. 1998. Micropolluants organiques : une boîte de Pandore. In: La Seine en son bassin :
Fonctionnement écologique d'un système anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De Marsily, E. Fustec. Chapitre
10 pp. 439-481.
Chesterikoff A, Garban B, Ollivon D. 1991. Qualité et dynamique des matières en suspension et des
sediments en aval de Paris en ralation avec la station d’épuration d’Achères, Rapport 1/91/05
Fonctionnement de l’écosystème, Piren-Seine, IHC, Lab. géologie appliqué, Université Paris VI, Paris,
43p.
Chesterikov A, Thévenot D, Mouchel JM, Poulin M, Garban B, Ollivon D. 1998. Le fleuve dans la ville.
In: La Seine en son bassin : Fonctionnement écologique d'un système anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De
Marsily, E. Fustec. Chapitre 7 pp. 301-344.
Cho JC, Kim SJ. 2000. Increase in bacterial community diversity in subsurface aquifers receiving livestock
wastewater input. Appl. Environ. Microbiol. 66:956-965.
Christ MJ, Peterjohn WT, Cumming JR, Adams MB. 2002. Nitrification potentials and landscape, soil and
vegetation characteristics in two central Appalachian watersheds differing in NO3- export. For. Eco.
Manage. 159:145–58.
Christensen PB, Rysgaard S, Sloth NP, Dalsgaard T, Schwaerter S. 2000. Sediment mineralization,
nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord
with sea cage trout farms. Aquat. Microb. Ecol. 21:73–84.
Christofi N, Preston T, Stewart WDP. 1981. Endogenous nitrate production in an experimental freshwater
enclosure. Water Research 15:343-349.
Clark C, Schmidt EL. 1967a. Growth response of Nitrosomonas europaea to amino acids. J. Bacteriol.
93:1302-1308.
Clark C, Schmidt EL. 1967b. Uptake and utilization of amino acids by resting cells of Nitrosomonas europaea.
J. Bacteriol. 93:1309-1315.
Clays-Josserand A, Lensi R, Gourbiere F. 1988. Vertical distribution of nitrification potential in an acidic
forest soil. Soil Biology and Biochemistry 20:405-406.
Cole JJ, Findlay S, Pace ML. 1988. Bacterial production in fresh and saltwater ecosystems: a cross-system
overview. Mar. Ecol. Prog. Ser. 43:1-10.
Colliver BB, Stephenson T. 2000. Production of nitrogen oxide and dinitrogen oxide by autotrophic nitrifiers.
Biotechnology Advances. 18: 219-232.
Conley DJ, Kilhman S. 1989. Differences in silica content between marine and freshwater diatoms. Limnol.
Oceanogr., 34:205-213.
Conley DJ, Schelske CL, Stoermer EF. (1993). Modification of silica biogeochemistry with eutrophication in
aquatic systems. Mar. Ecol. Prog. Ser., 101:179-192.
Conley DJ. 2002. Terrestrial ecosystems and the global biogeochemical silica cycle. Global Biogeochemical
cycles. 16:1121.
Conrad R. 1996. Soil micoorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CH4, OCS, N2O and NO).
Microbiological Reviews, 60:609-640.
Cooper AB. 1984. Activities of benthic nitrifiers in stream and their role in oxygen consumption. Microbiol. Ecol.
10 :316-333.
Crubellier M, Demouy P, Tebib RR, Bourcelot H, Duménil C, Choiselle R, 1987. Champagne Ardenne:
cadre naturel, histoire, art, littérature, langue, économie, traditions populaires, 399 pp.
Crutzen PJ. 1981. Atmospheric chemical processes of the oxides of nitrogen, including nitrous oxide. In:
Delwiche CC. (Ed.) Denitrification, nitrification and atmospheric nitrous oxide. Wiley, New York, pp 17–
44
Crutzen PJ, Stoermer E. 2000. The “anthropocene”. IGBP Newsletter 41:17-18.

~D~
Daims H, Nielsen PH, Nielsen JL, Juretschko S, Wagner M. 2000. Novel Nitrospira-like bacteria as
dominant nitrite-oxidizers in biofilms from wastewater treatment plants: diversity and in situ physiology.
Water Sci. Technol. 41:85-90.

271
 Bibliographie

Daims H, Nielsen JL, Nielsen PH, Schleifer K-H, Wagner M. 2001a. In situ characterisation of
Nitrospira-like nitrite-oxidizing bacteria active in wastewater treatment plants. Appl. Environ.
Microbiol. 67:5273-5284.
Daims H, Purkhold U, Bierrum L, Arnold E, Wilderer PA, Wagner M. 2001b. Nitrification in
sequencing biofilm batch reactors: lessons from molecular approaches. Water Sci. Technol. 43:9-18.
Davidson EA, Hart SC, Shanks CA, Firestone MK. 1991. Measuring gross nitrogen mineralisation,
immobilisation and nitrification by 15N isotopic pool dilution in intact soil cores. Journal of Soil Science
42:335-349.
De Beer D, Sweerts J-P. van den Heuvel JC. 1991. Microelectrode measurement of ammonium profiles in
freshwater sediments. FEMS Microbiology Ecology. 86:1-6.
De Beer D, van den Heuvel J, Ottengraf S. 1993. Microelectrode measurements of the activity distribution
in nitrifying bacterial aggregates. Applied and Environmental Microbiololgy 59:573–579.
De Beer D, Schramm A. 1999. Micro-environments and mass transfer phenomena in biofilms studied with
microsensors. Water Sci. Technol. 39:173-178.
De Bie MJM, Speksnijder AGCL, Kowalchuk GA, Schuurman T, Zwart G, et al. 2001. Shifts in the
dominant populations of ammonia-oxidizing beta-subclass Proteobacteria along the eutrophic Schelde
estuary. Aquat. Microb. Ecol. 23:225-236.
De Bie MJM, Starink M, Boschker HTS, Peene JJ, Laanbroek HJ. 2002. Nitrification in the Schelde
estuary: methodological aspects and factors influencing its activity. FEMS Microbiol. Ecol. 42:99-107.
De Boer W, Klein Gunnewiek PJA, Veenhuis M, Bock E, Laanbroek HJ. 1991. Nitrification at low pH by
aggregated chemolithotrophic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:3600-3604.
De Boer,W, Tietema A, Klein Gunnewiek PJA, Laanbroek HJ. 1992. The autotrophic ammonium-
oxidizing community in a nitrogen-saturated acid forest soil in relation to pH-dependent nitrifying
activity. Soil Biology & Biochemistry 24: 229-234.
De Boer W, Kowalchuk GA. 2001. Nitrification in acid soils: microorganisms and mechanisms. Soil Biol.
Biochem. 33:853–866.
Degrange V, Bardin R. 1995. Detection and counting of Nitrobacter populations in soil by PCR. Appl. Environ.
Microbiol. 61:2093-2098.
De Wilde HPJ, De Bie MJM. 2000. Nitrous oxide in the Schelde estuary: production by nitrification and
emission to the atmosphere. Marine Chemistry 69:203-216.
Diab S. Shilo M. 1988. Effect of adhesion to particles on the survival and activity of Nitrosomonas sp. and
Nitrobacter sp. Archives of Microbiology 150:387-393.
Diab S, Kochba M, Mires D, Avnimelech Y. 1992. Combined intensive-extensive (CIE) pond system. A:
Inorganic nitrogen transformations. Aquaculture 101:33–39.
Dionisi HM, Layton AC, Harms G, Gregory IR, Robinson KG, Sayler GS. 2002. Quantification of
Nitrosomonas oligotropha-like ammonia-oxidizing bacteria and Nitrospira spp. from full-scale
wastewater treatment plants by competitive PCR. Appl. Environ. Microbiol. 68:245-253.
Diviacco S, Norio P, Zentilin L, Menzo S, Clementi M, Falaschi A, Giacca M. 1992.A novel procedure
for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates. Gene, 122: 3013-
3020.
Dodds WK, Jones RD. 1987. Potential rates of nitrification and denitrification in an oligotrophic freshwater
sediment system. Microb. Ecol. 14:91-100.
Dodds WK, Priscu JC. 1990. Mesocosm studies on the influence of phosphate enrichment on ammonium and
nitrate flux in an oligotrophic lake. Hydrobiologia 206:235–43.
Dodds WK, Evans-White MA, Gerlanc NM, Gray L, Gudder DA, Kemp MJ, Lopez AL, Stagliano D,
Strauss EA, Tank JL, Whiles MR, Wollheim WM. 2000. Quantification of the Nitrogen Cycle in a
Prairie Stream. Ecosystems 3:574-589.
Dong LF, Nedwell DB, Underwood GJC, Thornton DCO, Rusmana I. 2002. Nitrous oxide formation in
the Colne Estuary, England: the central role of nitrite. Appl. Environ. Microbiol. 68:1240-1249.
Dugdale RC. Goering JJ. 1967. Uptake of new and regenerated forms of nitrogen in primary productivity.
Limnol. Oceanogr. 12:196-206.
Dundee L, Hopkins DW. 2001. Different sensitivities to oxygen of nitrous oxide production by Nitrosomonas
europaea and Nitrosolobus multiformis, Soil Biology & Biochemistry 33:1563-1565.

~E~
Egli K, Langer C, Siegrist H-R, Zehnder AJB, Wagner M, Van der Meer JR. 2003. Community analysis
of ammonia and nitrite oxidizers during start-up of nitritation reactors. Appl. Environ. Microbiol.
69:3213-3222.
Enriquez S, Duarte CM, Sand-Jensen K. 1993. Patterns in decomposition rates among photosynthetic
organisms: the importance of detritus C:N:P content. Oecologia 94:457-471.
Ehrich S, Behrens D, Lebedeva E, Ludwig W, Bock E. 1995. A new obligately chemolithoautotrophic,
nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship. Arch.
Microbiol. 164:16-23.

272
 Bibliographie

~F~
Falconer IR. 1996. Potential impact on human health of toxic cyanobacteria. Phycologia 35:6-11.
FAO. 2002. Food and Agriculture Organization (UN) FAOSTAT ([Link]
Feliatra F, Bianchi M. 1993. Rates of nitrification and carbon uptake in the Rhône river plume (northwestern
Mediterranean Sea). Microb. Ecol. 26:21-28.
Féray C, Volat B, Degrange V, Clays-Josserand A, Montuelle B. 1999. Assessment of three methods for
detection and quantification of nitrite-oxidizing bacteria and Nitrobacter in freshwater sediments (MPN-
PCR, MPN-Griess, immunofluorescence). Microb. Ecol. 37:208-217.
Féray C, Montuelle B. 2003. Chemical and microbial hypotheses explaining the effect of wastewater treatment
plant discharges on the nitrifying communities in freshwater sediment. Chemosphere, 50:919-928.
Ferm, M. 1998. Atmospheric ammonia and ammonium transport in Europe and critical loads: a review. Nutrient
Cycling in Agroecosystems 51:5-17.
Filippelli GM. 2002. The Global Phosphorus Cycle. Chapitre 10. In: Reviews in mineralogy and geochemistry:
Phosphates; geochemical, geobiological and materials importance (Kohn, M.J., Rakovan, J. & Hughes J.
eds). Mineralogical Society of America, Ribbe, P.H Series Editor, Geochemical Society, Rosso, J.J Series
Editor, 48:392-425.
Firestone MK, Davidson EA. 1989 Microbiological basis of NO and N2O production and consumption in
[Link]: Andrea MO, Schimel DS (Eds.), Exchange of Trace Gases between Terrestrial Ecosystems and the
Atmosphere. pp. 7-21. John Wiley, Toronto.
Fisk MC, Schmidt SK, Seastedt TR. [Link] patterns of above- and belowground production and
nitrogen cycling in alpine tundra. Ecology, 79:2253-2266.
Flipo N, Even S, Poulin M, Tusseau-Vuillemin M-H, Ameziane T, Dauta A. 2004 Biogeochemical
modelling at the river scale: plankton and periphyton dynamics: Grand Morin case study,
France. Ecological Modelling, 176:333-347.
Focht DD, Verstraete W. 1977. Biochemical ecology of nitrification and denitrification. Adv. Microbial Ecol.
1:135-214.
Fortuna A, Harwood RR, Robertson GP, Fisk JW, Paul EA. 2003. Seasonal changes in nitrification
potential associated with application of N fertilizer and compost in maize systems of southwest Michigan.
Can. J. Fish. Aquat. Sci. 53: 2466–2472.
Frankland PF, Frankland GC. 1890. The nitrifying process and its specific ferment. Part I. Phil. Trans. R. Soc.
B 181:107-128.
Freitag A, Rudert M, Bock E. 1987. Growth of Nitrobacter by dissimilatoric nitrate reduction. FEMS
Microbiol. Lett. 48:105-109.
Freitag TE, Prosser JI. 2003. Community structure of ammonia-oxidizing bacteria within anoxic marine
sediments. Appl. Environ. Microbiol. 69:1359-1371.
Freitag TE, Prosser JI. 2004. Differences between beta-Proteobacterial ammonia-oxidizing communities in
marine sediments and those in overlying water. Appl. Environ. Microbiol. 70:3789-3793.
Friedl G, Wuest A. 2002. Disrupting biogeochemical cycles-consequences of damming. Aquatic Sciences,
64:55-65.
Fuhrman JA, Azam F. 1982. Thymidine incorporation as a measure of heterotrophic bacterioplankton
production in marine surface waters: evaluation and field results. Mar. Biol. 66:109-120.
Fuller ME, Scow KM. 1996. Effects of toluene on microbially-mediated processes involved in the soil nitrogen
cycle. Microb. Ecol. 32:171-184.
Fuller ME, Scow KM. 1997. Impact of trichloroethylene and toluene on nitrogen cycling in soil. Appl. Environ.
Microbiol. 63:4015-4019.
Fustec E, Greiner I, Schanen O, Gaillard S, Dzana JG. 1998. Les zones humides riveraines : des milieux
divers aux multiples fonctions. In: La Seine en son bassin : Fonctionnement écologique d'un système
anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De Marsily, E. Fustec. Chapitre 5 pp. 211-262.

~G~
Galloway JN, Schlesinger WH, Levy H, Michaels A, Schnoor JL. 1995. Nitrogen fixation: anthropogenic
enhancement-environmental response. Global Biogeochemical Cycles 9:235–252.
Garban B, Motelay-Masseï A, Blanchoud H, Ollivon D. 2004. Single Law to Describe Atmospheric
Nitrogen Bulk Deposition versus Rainfall Amount: Inputs at the Seine River Watershed Scale. Water, Air,
and Soil Pollution, 155:339-354.
Garcia-Ruiz R, Pattinson SN, Whitton BA. 1998. Kinetic parameters of denitrification in a river continuum.
Appl. Environ. Microbiol. 64:2533-2538.
Garnier J, Billen G. 1993. Ecological interactions in a shallow sand-pit lake (Créteil lake, France). A modelling
approach. In: Nutrient dynamics and biological structure in shallow freshwater and brackish lakes.
Hydrobiologia, 275/276:97-114.
Garnier J, Billen G, Coste M. 1995. Seasonal succession of diatoms and chlorophyceae in the drainage
network of the Seine River : observations and modeling. Limnol. Oceanogr. 40 :750-765.
Garnier J, Billen G, Levassor, A. 1998a. Réservoirs : fonctionnement et impacts écologiques. In: La Seine en
son bassin : Fonctionnement écologique d'un système anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De Marsily, E.
Fustec. Chapitre 6 pp. 263-300.

273
 Bibliographie

Garnier J, Billen G, Hanset P, Testard P, Coste M. 1998b. Développement algal et eutrophisation dans le
réseau hydrographique de la Seine. In: La Seine en son bassin : Fonctionnement écologique d'un système
anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De Marsily, E. Fustec. Chapitre 14 pp. 593-626.
Garnier J, Leporcq B, Sanchez N, Philippon X. 1999. Biogeochemical massbalances (C, N, P, Si) in the
three large reservoirs of the Seine basin (France). Biogeochemistry, 47:119-146.
Garnier J, Billen G, Sanchez N, Leporcq B. 2000. Ecological functioning of the Marne reservoir (upper
Seine basin, France). Regul. Rivers : Res. Mgmt, 16: 51-71.
Garnier J. Servais P, Billen G, Akopian M, Brion N. 2001. Lower Seine river and estuary (France) : carbon
and oxygen budgets during low flow. Estuaries, 24:964-976.
Garnier J, Billen G, Berthe T, Martinez A, Pinault S, Desruelle M, Cébron A. 2002. Nitrification de
l’ammonium dans la basse Seine: impact de l’anthropisation de Paris à l’estuaire. Rapport de Synthèse
Piren-Seine 1998-2001, 20p.
Garnier J, Laroche L, Pinault S. (soumis). Characterization of the effluents of two large waste water plants of
the city of Paris (France): how to comply with the European directive ? Water Res.
Garrido F, Hénault C, Gaillard H, Pérez S, Germo JC. 2002. N2O and NO emissions by agricultural soils
with low hydraulic potentials. Soil Biol. Biochem. 34:559-575.
Gay G, Josserand A, Bardin R. 1983. Growth of two serotypes of Nitrobacter in mixotrophic and
chemoorganotrophic conditions. Can. J. Microbiol. 29:394-397.
Gay G, Corman A. 1984. Comparative study of the growth of two strains of Nitrobacter in batch and continuous
culture. Microbial Ecology 10:99-105.
Gieseke A, Purkhold U, Wagner M, Amann R, Schramm A. 2001. Community structure and activity
dynamics of nitrifying bacteria in a phosphate-removing biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 67:1351-
1362.
Gieseke A, Bjerrum L, Wagner M, Amann R. 2003. Structure and activity of multiple nitrifying bacterial
populations co-existing in a biofilm. Environ. Microbiol. 5:355-369.
Gilliam FS, Yurish BM, Adams MB. 2001. Temporal and spatial variation of nitrogen transformations in
nitrogen-saturated soils of a central Appalachian hardwood forest. Can. J. For. Res. 31:1768–1785.
Glover HE. 1985. The relationship between inorganic nitrogen oxidation and organic carbon production in batch
and chemostat cultures of marine nitrifying bacteria. Arch. Microbiol. 142:45-50.
Gödde M, Conrad R. 2000. Influence of soil properties on the turnover of nitric oxide and nitrous oxide by
nitrification and denitrification at constant temperature and moisture. Biol. Fertil. Soils 32:120-128
Gomez E. 2002. Modélisation intégrée du transfert de nitrate à l'achelle régionale dans un système hydrologique.
Thèse ENS MP, 291pp.
Goñi-Urriza M, Capdepuy M, Arpin C, Raymond N, Caumette P, Quentin C. 2000. Impact of an urban
effluent on antibiotic resistance of riverine Enterobacteriaceae and Aeromonas spp. Apll. Environ.
Microbiol. 66:125-132.
Goodale CL, Aber JD. 2001. The long-term effects of land-use history on nitrogen cycling in northern
hardwood forests. Ecol Appl 11:253–67.
Goreau TJ, Kaplan WA, Wofsy SC, McElroy MB, Valois FW, Watson SW. 1980. Production of nitrite
and N2O by nitrifying bacteria at reduced concentrations of oxygen. Appl. Environ. Microbiol. 40:526-
532.
Gould GW. Lees H. 1960. The isolation and culture of nitrifying organisms. Part 1. Nitrobacter. Can. J.
Microbiol., 6:299-307.
Groeneweg J, Sellner B, Tappe W. 1994: Ammonia oxidation in Nitrosomonas at NH3 concentrations near
Km: effects of pH and temperature. Wat. Res. 12: 2561-2566.
Grunditz C, Dalhammar G. 2001. Development of nitrification inhibition assays using pure cultures of
Nitrosomonas and Nitrobacter. Wat. Res. 35:433-440.
Grundmann GL, Normand P. 2000. Microscale diversity of the genus Nitrobacter in soil on the basis of
analysis of genes encoding rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 66 :4543-4546.
Guerrini MC, Mouchel JM, Meybeck M, Penven MJ, Hubert G, Muxart T. 1998. Le bassin de la Seine :
la confrontation du rural et de l’urbain. In: La Seine en son bassin : Fonctionnement écologique d'un
système anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De Marsily, E. Fustec. Chapitre 1 pp. 29-75.
Guézennec L. 1998. Hydrodynamique de transport en suspension du matériel particulaire fin dans la zone
fluviale d'un estuaire macrotidal: l'exemple de l'estuaire de la Seine. Thèse, l'Université de Rouen, 222p.
Gürtler V, Stanisich VA. 1996. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S
rDNA spacer region. Microbiology 142:3-16.

~H~
Haag D, Kaupenjohann M. 2001. Landscape fate of nitrate fluxes and emissions in Central Europe: A critical
review of concepts, data, and models for transport and retention. Agriculture, Ecosystems &
Environment, 86:1-21.
Hageman RH, Redd AJ. 1980. Nitrate reductase from higher plants. Methods Enzymol. 69:270-281.
Hagopian DS, Riley JG. 1998. A closer look at the bacteriology of nitrification. Aquacultural Engineering,
18:223-244.
Hall GH. 1986. Nitrification in lakes. In Nitrification, ed. J. I. Prosser. pp. 127–156. Washington , DC: IRL press.
Hall RW Jr, Peterson BJ, Meyer J. 1998. Testing a nitrogen cycling model of a forest stream by using a
nitrogen-15 tracer addition. Ecosystems 1:283–98.

274
 Bibliographie

Halling-Sorensen B, Jorgensen SE. 1993. The removal of nitrogen compounds from wastewater. Chapter 3.
Process chemistry and biochemistry of nitrification pp55-91. Elsevier (Ed.).
Hamamura N, Yeager CM, Arp DJ. 2001. Two distinct monooxygenases for alkane oxidation in Nocardioides
sp. strain CF8. Appl. Environ. Microbiol. 67:4992-4998.
Hart SC, Stark JM, Davidson EA, Firestone MK. 1994. Nitrogen mineralization, immobilization, and
nitrification. In: Weaver RW, Angle JS, Bottomley BS. (Eds.), Methods of Soil Analysis. Part 2.
Microbiological and Biochemical Properties. SSSA Book Series, No. 5. SSSA, Madison, WI, pp. 1011–
1016.
Hastings RC, Saunders JR, Hall GH, Pickup RW, McCarthy AJ. 1998. Application of molecular biological
techniques to a seasonal study of ammonia oxidation in a eutrophic freshwater lake. Appl. Environ.
Microbiol. 64:3674-3682.
Hastings RC, Butler C, Singleton I, Saunders JR, McCarthy AJ. 2000. Analysis of ammonia-oxidizing
bacteria populations in acid forest soil during conditions of moisture limitation. Letters in Applied
Microbiology, 30:14-18.
Hatayama R, Takahashi R, Ohshima M, Shibasaki R, Tokuyama T. 2000. Ribulose-1,5-Bisphosphate
carboxylase/oxygenase from an ammonia-oxidizing bacterium, Nitrosomonas sp. K1: Purification and
properties. J. Biosci. Bioeng. 90:426-430.
Head IM, Hiorns WD, Embley TM, McCarthy AJ, Saunders JR. 1993. The phylogeny of autotrophic
ammonia-oxidizing bacteria as determined by analysis of 16S ribosomal RNA gene sequences. J. Gen.
Microbiol. 139:1147-1153.
Head IM, Saunders JR, Pickup RW. 1998. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal
RNA analysis of uncultivated microorganisms. Microb. Ecol. 35:1-21.
Hecky RE, Kilham P. 1988. Nutrient limitation of phytoplankton in freshwater and marine environments: a
review of recent evidence on the ejects of enrichment. Limnol. Oceanogr. 33:796-822.
Helder W. De Vries RTP. 1983. Estuarine nitrite maxima and nitrifying bacteria (Ems- Dollard estuary). Neth.
J. Sea Res., 17:1-18.
Helmer C, Kunst S. 1998. Simultaneous nitrification/denitrification in an aerobic biofilm system. Water
Science and Technology. 37:183-187.
Henault C, Devis X, Lucas JL, Germon JC. 1998. Influence of different agricultural practices (type of crop,
form of N-fertilizer) on soil nitrous oxide emissions. Biol. Fertil. Soils 27:299–306.
Henriksen K, Kemp WM. 1988. Nitrification in Estuarine and Coastal Marine Sediments, pp. 207-249 in T.H.
Blackburn and J. Sorensen (eds.), Nitrification in Estuarine and Coastal Marine Sediments. Nitrogen
Cycling in Coastal Marine Environments, John Wiley and Sons Ltd.
Herbert RA. 1999. Nitrogen cycling in coastal ecosystems. FEMS Microbiology Reviews, 23:563-590.
Hermansson A, Lindgren PE. 2001. Quantification of ammonia-oxidizing bacteria in arable soil by real-time
PCR. Appl. Environ. Microbiol. 67:972-976.
Hill DT, Payton JD, 1998. Influence of temperature on treatment efficiency of constructed wetlands.
Transactions of the ASAE. 41:393-396.
Hiorns WD, Hastings RC, Head IM, McCarthy AJ, Saunders JR, Pickup RW, Hall GH. 1995.
Amplification of 16S ribosomal RNA genes of autotrophic ammonia-oxidizing bacteria demonstrates the
ubiquity of Nitrosospira in the environment. Microbiology 141:2793-2800.
Hobbie JE, Daley RJ, Jasper S. 1977. Use of nuclepore filters for counting bacteria by fluorescence
microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 33:1225-1228.
Hollibaugh JT, Bano N, Ducklow HW. 2002. Widespread distribution in polar oceans of a 16S rRNA gene
sequence with affinity to Nitrosospira-like ammonia-oxidizing bacteria. Appl. Environ. Microbiol.
68:1478-1484.
Holt MS. 2000 Sources of chemical contaminants and routes into the freshwater environment. Food and
Chemical Toxicology 38:S21-S27.
Hommes NG, Sayavedra-Soto LA, Arp DJ. 1996. Mutagenesis of hydroxylamine oxidoreductase in
Nitrosomonas europaea by transformation and recombination. J. Bacteriol. 178:3710-3714.
Hommes NG, Sayavedra-Soto LA, Arp DJ. 1998. Mutagenesis and expression of amo, which codes for
ammonia monooxygenase in Nitrosomonas europaea. J. Bacteriol. 180:3353-3359.
Hommes NG, Sayavedra-Soto LA, Arp DJ. 2001. Transcript analysis of multiple copies of amo (encoding
ammonia monooxygenase) and hao (encoding hydroxylamine oxidoreductase) in Nitrosomonas
europaea. J. Bacteriol. 183:1096-1100.
Hommes NG, Sayavedra-Soto LA, Arp DJ. 2003. Chemolithoorganotrophic growth of Nitrosomonas
europaea on fructose. J Bacteriol 185:6809-6814
Hooper AB. 1968. A nitrite-reducing enzyme from Nitrosomonas europaea. Preliminary characterization with
hydroxylamine ad electron donor. Biochim Biophys Acta. 162:49-65.
Hooper AB, Terry KR. 1974. Photoinactivation of ammonia oxidation in Nitrosomonas. J. Bacteriol. 119:899-
906.
Hooper AB, Terry KR. 1979. Hydroxylamine oxidoreductase of Nitrosomonas production of nitric oxide from
hydroxylamine. Biochim Biophys Acta 571:12–20.
Hooper AB, Vannelli T, Bergmann DJ, Arciero DM. 1997. Enzymology of the oxidation of ammonia to
nitrite by bacteria. Ant. van Leeuwenhoek 71:59-67.
Horne AJ, Commins ML. 1987. Macronutrient controls on nitrogen fixation in planktonic cyanobacterial
populations. J. Mar. Freshwater Res. 21:413–423.

275
 Bibliographie

Horrigan SG, Montoya JP, Nevins JL, McCarthy JJ, Ducklow HW, Goericke R, Malone T.1990.
Nitrogenous nutrient transformations in the spring and fall in the Chesapeake Bay. Estuar. Coast. Shelf
Sci. 30:369-391.
Horz H-P, Rotthauwe J-H, Lukow T, Liesack W. 2000. Identification of major subgroups of ammonia-
oxidizing bacteria in environmental samples by T-RFLP analysis of amoA PCR products. J. Microbiol.
Methods 39:197-204.
Houghton JT. 1996. “Climate Change 1995: the science of climate change.” Contribution of WGI to the Second
Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change, Intergovernamental Panel on
Climate Change; Cambridge University Press, Cambridge University Press; New York, 572.
Hovanec TA, Taylor LT, Blakis A, Delong EF. 1998. Nitrospira-like bacteria associated with nitrite
oxidation in freshwater aquaria. Appl. Environ. Microbiol. 64:258-264.
Howarth RW, Marino R, Lane J, Cole JJ. 1988. Nitrogen fixation in freshwater, estuarine and marine
ecosystems. I. Rates and importance. Limnol. Oceanogr. 33:619-687.
Howarth RW, Billen G, Swaney DP, Townsend A, Jaworski N, Lajtha K, Downing JA, Elmgren R,
Caraco N, Jordan T, Berendse F, Freney J, Kudeyarov V, Murdoch P, Zhao-liang Z. 1996.
"Riverine Inputs of Nitrogen to the North Atlantic Ocean: Fluxes and Human Influences".
Biogeochemistry, 35:75-139.
Hulth S, Aller RC, Gilbert F. 1999. Coupled anoxic nitrification/manganese reduction in marine sediments.
Geochim. Cosmochim. Acta 63:49-66.
Humborg C, Conley DJ, Rahm L, Wulff F, Cociasu A, Ittekkot V. 2000. Silicon retention in river basins:
far-reaching effects on biogeochemistry and aquatic food webs in coastal marine environments. Ambio,
29:45-50.
Hunt PG, Stone KC, Humenik FJ, Matheny TA, Johnson MH. 1999. In-stream wetland mitigation of
nitrogen contamination in a USA coastal plain stream. J. Environ. Qual., 28:249-256.
Hyman M, Arp D. 1995. Effects of ammonia on the de novo synthesis of polypeptides in cells of Nitrosomonas
europaea denied ammonia as an energy source. J. Bacteriol. 177:4974-4979.
Hynes HBN. 1983. Groundwater and stream ecology. Hydrobiologia, 100:93-99.
Hynes RK, Knowles R. 1984. Production of nitrous oxide by Nitrosomonas europaea: effect of acetylene, pH
and oxygen. Can J Microbiol, 30:1397–404.

~I~

Igarashi N, Moriyama H, Fujiwara T, Fukumori YNT. 1997. The 2.8 A structure of hydroxylamine
oxidoreductase from a nitrifying chemoautotrophic bacterium, Nitrosomonas europaea. Nat. Struct.
Biol. 4:276-284.
Iizumi T, Nakamura K. 1997. Cloning, nucleotide sequence, and regulatory analysis of the Nitrosomonas
europaea dnaK gene. Appl. Environ. Microbiol. 63:1777-1784.
IPCC 2001. Intergovernmental Panel on climate Change, Climate Change 2001. The Scientific Basis. Cambridge
University Press. Cambridge.
Iriarte A, Madariaga I, de Diez-Garagarza F, Revilla M, Orive E. 1996. Primary plankton production,
respiration and nitrification in a shallow temperate estuary during summer. J. Exp. Mar. Biol. Ecol.
208:127-151.
Irwin JG, Williams ML. 1988. Acid rain: chemistry and transport. Environmental Pollution 50 :29–59.
Islam MS, Tanaka M. 2004. Impacts of pollution on coastal and marine ecosystems including coastal and
marine fisheries and approach for management : a review and synthesis. Marine Pollution Bulletin
48:624-649.
~J~
Jaffe DA. 1992. The nitrogen cycle. In: Butcher SS., Charlson ŽRJ, Orians GH, Wolfe GV. (Eds.) Global
Biogeochemical Cycles. Academic Press, London, pp. 263–284.
Jannasch HW, Jones GE. 1959. Bacterial populations in seawater by different methods of enumeration.
Limnol. Oceanogr. 4: 128-139.
Jensen K, Revsbech NP, Nielsen LP. 1993. Microscale distribution of nitrification activity in sediment
determined with a shielded microsensor for nitrate. Appl. Environ. Microbiol. 59:3287-3296.
Jetten MSM, Strous M, Van de Pas-Schoonen KT. Schalk J, Van Dongen LGJM, Van de Graaf AA,
Logemann S, Muyzer G, Van Loosdrecht MCM, Kuenen JG. 1999. The anaerobic oxidation of
ammonium. FEMS Microbiology Reviews 22:421-437
Jiang Q-Q, Bakken LR. 1999. Nitrous oxide production and methane oxidation by different ammonia-oxidizing
bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65:2679-2684.
Jianlong W, Ning Y. 2004. Partial nitrification under limited dissolved oxygen conditions. Process
Biochemistry 39:1223-1229.
Jing SR, Lin YF. 2004. Seasonal effect on ammonia nitrogen removal by constructed wetlands treating polluted
river water in southern Taiwan. Environ Pollut. 127:291-301.
Johnstone BH, Jones RD. 1988. Physiological effects of long-term energy-source deprivation on the survival
of a marine chemolithotrophic ammonium oxidizing bacterium. Mar. Ecol. Prog. Ser. 49:295-303.
Jones RD, Morita RY. 1983. Methane oxidation by Nitrosococcus oceanus and Nitrosomonas europaea. Appl.
Environ. Microbiol. 45:401-410.

276
 Bibliographie

Jonsson K, Grunditz C, Dalhammar G, Jansen JL. 2000. Occurrence of nitrification inhibition in Swedish
municipal wastewaters. Water Res. 34:2455-2462.
Josserand A, Cleyet-Marel JC. 1979. Isolation from soils of Nitrobacter and evidence for novel serotypes
using immunofluorescence. Microb. Ecol. 5:197-205.
Josserand A. 1983. Apport de l'immunofluorescence à l'étude écologique des germes nitrifiants (genre
Nitrobacter). Thèse de Doctorat. Université Lyon I. 151p.
Juretschko S, Timmermann G, Schmid M, Schleifer K-H, Pommerening-Röser A, Koops HP,
Wagner M. 1998. Combined molecular and conventional analysis of nitrifying bacterium diversity in
activated sludge: Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populations. Appl.
Environ. Microbiol. 64:3042-3051.

~K~
Keen GA, Prosser JI. 1987. Steady state and transient growth of autotrophic nitrifying bacteria. Arch.
Microbiol. 147:73-79.
Keeney DR, Nelson DW. 1982. Nitrogen-inorganic forms. In: Page AL, Miller RH, Keeney DR. (eds.) Methods
of soil analysis. Part 2 - Chemical and microbiological properties. (2nd Ed.). Agronomy 9:643-698.
Kennedy IR. 1992. Acid Soil and Acid Rain, second ed. Wiley, New York.
Kester RA, Meijer ME, Libochant JA, de Boer W, Laanbroek HJ. 1997a. Contribution of nitrification and
denitrification to the NO and N2O emission of an acid forest soil, a river sediment and a fertilized
grassland soil. Soil Biol Biochem 29: 1655-1664.
Kester RA, de Boer W, Laanbroek HJ. 1997b. Production of NO and N2O by pure cultures of nitrifying and
denitrifying bacteria during changes in aeration. Appl Environm Microbiol 63: 3872-3877.
Khalil K, Mary B, Renault P. 2004. Nitrous oxide production by nitrification and denitrification in soil
aggregates as affected by O2 concentration. Soil Biology and Biochemistry 36:687-699.
Killham K. 1986. Heterotrophic nitrification. In: Nitrification, ed. J. I. Prosser. pp. 117-126. Oxford, UK: IRL
Press
King DH, Nedwell DB. 1987. The adaptation of nitrate-reducing bacterial communities in estuarine sediments
in response to overlying nitrate load. FEMS Microbiol. Ecol. 45:15-20.
Kirstein K, Bock E. 1993. Close genetic relationship between Nitrobacter hamburgensis nitrite oxidoreductase
and Escherichia coli nitrate reductases Arch. Microbiol., vol. 160, pp. 447–453
Klotz MG, Norton JM. 1998. Multiple copies of ammonia monooxygenase (amo) operons have evolved under
biased AT/GC mutational pressure in ammonia-oxidizing autotrophic bacteria. FEMS Microbiol. Lett.
168:303-311.
Knowles G, Downing AL, Barrett MJ. 1965. Determination of kinetic constants for nitrifying bacteria in
mixed culture with the aid of an electronic computer. Journal of General Microbiology 38:263-278.
Koops H-P, Harms H, Wehrmann H. 1976. Isolation of a moderate halophilic ammonia-oxidizing bacterium,
Nitrosococcus mobilis nov. sp. Arch. Microbiol. 10:277-282.
Koops H-P, Böttcher B, Möller UC, Pommerening-Röser A, Stehr G. 1990. Description of a new species
of Nitrosococcus. Arch. Microbiol. 154:244-248.
Koops H-P, Böttcher B, Möller UC, Pommerening-Röser A, Stehr G. 1991. Classification of eight new
species of ammonia-oxidizing bacteria: Nitrosomonas communis sp. nov., Nitrosomonas ureae sp. nov.,
Nitrosomonas aestuarii sp. nov., Nitrosomonas marina sp. nov., Nitrosomonas nitrosa sp. nov.,
Nitrosomonas eutropha sp. nov., Nitrosomonas oligotropha sp. nov., and Nitrosomonas halophila sp.
nov. J. Gen. Microbiol. 137:1689-16990.
Koops H-P, Pommerening-Röser A. 2001. Distribution and ecophysiology of the nitrifying bacteria
emphasizing cultured species. FEMS Microbiol. Ecol. 37:1-9.
Koops H-P, Purkhold U, Pommerening-Röser A, Timmermann G, Wagner M. 2003. The
Lithoautotrophic Ammonia-Oxidizing Bacteria. In M. Dworkin et al., eds. The Prokaryotes: An Evolving
Electronic Resource for the Microbiological Community third edition, release 3.13, Springer-Verlag, New
York.
Kors LJ, Moorman JHN, Wind APM, Van der Hoek JP. 1998. Nitrification and low temperature in a raw
water reservoir and rapid sand filters. Wat. Sci. Tech. 37:169.
Kowalchuk GA, Stephen JR, Boer WD, Prosser JI, Embley TM, Woldendorp JW. 1997. Analysis of
ammonia-oxidizing bacteria of the β-Subdivision of the Class Proteobacteria in coastal sand dunes by
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and sequencing of PCR-amplified 16S ribosomal DNA
Fragments. Appl. Environ. Microbiol. 63:1489-1497.
Kowalchuk GA, Bodelier PLE, Hans G, Heilig J, Stephen JR, Laanbroek HJ. 1998. Community
analysis of ammonia-oxidizing bacteria, in relation to oxygen availability in soils and root-oxygenated
sediments, using PCR, DGGE and oligonucleotide probe hybridization. FEMS Microbiol. Ecol. 27:339-
350.
Kowalchuk GA, Naoumenko ZS, Derikx PJL, Felske A, Stephen JR, Arkhipchenko IA. 1999.
Molecular analysis of ammonia-oxidizing bacteria of the β-subdivision of the class Proteobacteria in
compost and composted materials. Appl. Environ. Microbiol. 65:396–403.
Kowalchuk GA, Stienstra AW, Heiling GHJ, Stephen JR, Woldendorp JW. 2000. Molecular analysis of
ammonia-oxidizing bacteria in soil of successional grasslands of the Drentsche A (The Netherlands).
FEMS Microbiology Ecology, 31:207-215.

277
 Bibliographie

Kowalchuk GA, Stephen JR. 2001. Ammonia-oxidizing bacteria: A model for molecular microbial ecology.
Ann. Rev. Microbiol. 55:485-529.
Kroez C, Seitzinger S. 1998. Nitrogen inputs to rivers, estuaries and continental shelves and related nitrous
oxide emissions in 1990 and 2050: a global model. Nutrient Cycling in Agroecosystems 52: 195-212.
Kuai L, Verstraete W. 1998. Ammonium removal by the oxygen-limited autotrophic nitrification-
denitrification system. Appl. Environ. Microbiol. 64:4500-4506

~L~
Laanbroek HJ, Gerards S. 1993. Competition for limiting amounts of oxygen between Nitrosomonas
europaea and Nitrobacter winogradskyi grown in mixed continuous cultures. Arch. Microbiol. 159:453-
459.
Laanbroek HJ, Bodelier PLE, Gerards S. 1994. Oxygen consumption kinetics of Nitrosomonas europaea
and Nitrobacter hamburgensis in mixed continuous cultures at different oxygen concentrations. Arch.
Microbiol. 161:156-162.
Larsen LH, Revsbech NP, Binnerup SJ. 1996. A microsensor for nitrate based on immobilized denitrifying
bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 62:1248-1251.
Larsen LH, Kjaer T, Revsbech NP. 1997. A microscale NO3- biosensor for environmental applications. Anal.
Chem. 69:3527-3531.
Laudelout H, Lambert R, Pham ML. 1976. Influence du pH et de la pression partielle en oxygène sur la
nitrification. Annales de Microbiologie (Institut Pasteur) 127A:367-382.
Lee DS, Kohler,I, Grobler E, Rohrer F, Sausen R, Gallardoklenner L, Olivier JGJ, Dentener FJ,
Bouwman AF. 1997. Estimations of global NOx emissions and their uncertainties. Atmospheric
Environment 31:1735-1749.
Lensi R, Gourbière F, Josserand A. 1985. Measurement of small amounts of nitrate in an acid soil by N2O
production. Soil Biology and Biochemistry. 17:733-734.
Lensi R, Gourbière F, Josserand A. 1986. Rapid determination of the nitrification potential of an acid forest
soil and assessment of its variability. Soil Biology and Biochemistry. 18:239-240.
Li L, Kato C, Horikoshi K. 1999. Bacterial diversity in deep-sea sediments from different depths. Biodivers.
Conserv. 8:659-677.
Lin JT, Stewart V. 1998. Nitrate assimilation by bacteria. Adv. Microb. Physiol. 39:1-30.
Lipschultz F, Zafiriou OC, Wofsy SC, McElroy MB, Valois FW, Watson SW. 1981. Production of NO
and N2O by soil nitrifying bacteria. Nature 294: 641-643.
Lipski A, Spieck E. Makolla A, Altendorf K. 2001a. Fatty acid profiles of nitrite-oxidizing bacteria reflect
their phylogenetic heterogeneity. Systematic and Applied Microbiology 24, 377-384.
Lipski A, Friedrich U, Altendorf K. 2001b. Application of rRNA-targeted oligonucleotide probes in
biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology 56, 40-57.
Lorenzen J, Larsen LH, Kjar T, Revsbech N-P. 1998. Biosensor determination of the microscale
distribution of nitrate, nitrate assimilation, nitrification, and denitrification in a diatom-inhabited
freshwater sediment. Appl. Environ. Microbiol. 64:3264-3269.
Lusby FE, Gibbs MM, Cooper AB, Thompson K. 1998. The fate of groundwater ammonium in a lake edge
wetland. Journal of Environmental Quality 27: 459–466.

278
 Bibliographie

~M~
Majumdar D, Pathak H, Kumar S, Jain MC. 2002. Nitrous oxide emission from a sandy loam Inceptisol
under irrigated wheat in India as influenced by different nitrification inhibitors. Agriculture, Ecosystems
and Environment. 91:283-293.
Mansch R, Bock E. 1998. Biodeterioration of natural stone with special reference to nitrifying bacteria.
Biodegradation 9:47-64.
Manz W, Arp G, Schumann-Kindel G, Szewzyk U, Reitner J. 2000. Widefield deconvolution
epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial
arrangement of bacteria in sponge tissue. J. Microbiol. Meth. 40:125-134.
Marilley L, Aragno M. 1999. Phylogenetic diversity of bacterial communities differing in degree of proximity of
Lolium perenne and Trifolium repens roots. Appl. Soil Ecol. 13:127-136.
Mariotti A. 1982. Apports de la géochimie isotopique à la connaissance du cycle de l’azote. Thèse, Université
Paris VI, p.476.
Maron PA, Coeur C, Pink C, Clays-Josserand A, Lensi R, Richaume A, Potier P. 2003. Use of
polyclonal antibodies to detect and quantify the NOR protein of nitrite oxidizers in complex
environments. Journal of Microbiological Methods. 53:87-95.
Martin-Laurent F, Philippot L, Hallet S, Chaussod R, Germon JC, Soulas G, Catroux G. 2001. DNA
extraction from soils: old bias for new microbial diversity analysis methods. Appl. Environ. Microbiol.
67:2354-2359.
Martiny H, Koops H-P. 1982. Incorporation of organic compounds into cell protein by lithotrophic, ammonia-
oxidizing bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 48:327-336.
Marty D, Bonin P, Michotey V, Bianchi M. 2001. Bacterial biogas production in coastal systems affected by
freshwater inputs. Continental Shelf Research 21:2105-2115.
Matulewich VA, Strom PF, Finstein MS. 1975. Length of incubation for enumerating nitrifying bacteria
present in various environments. Appl. Microbiol. 29:265-268.
McCaig AE, Phillips CJ,Stephen JR, Kowalchuk GA, Harvey SM, Herbert RA, Embley TM, Prosser
JI. 1999. Nitrogen cycling and community structure of proteobacterial beta-subgroup ammonia-
oxidizing bacteria within polluted marine fish farm sediments. Appl. Environ. Microbiol. 65:213-220
McElroy MB, Elkins JW, Wofsy SC, Kolb CE, Duran AP. Kaplan WA. 1978. Production and release of
N2O from the Potomac Estuary. Limnol. Oceanogr. 23:1168-1182.
McTavish H, Fuchs JA, Hooper AB. 1993a. Sequence of the gene coding for ammonia-monooxygenase in
Nitrosomonas europaea. J. Bacteriaol. 175:2436-2444.
McTavish H, LaQuier F, Arciero D, Logan M, Mundfrom G, Fuchs JA, Hooper AB. 1993b. Multiple
copies of genes coding for electron transport proteins in the bacterium Nitrosomonas europaea. J.
Bacteriol. 175:2445-2447.
Meincke M, Krieg E, Bock E. 1989. Nitrosovibrio spp., the dominant ammonia-oxidizing bacteria in building
sandstone. Appl. Environ. Microbiol. 55:2108-2110.
Meincke M, Bock E, Kastrau D, Kroneck PMH. 1992. Nitrite oxidoreductase from Nitrobacter
hamburgensis: redox centers and their catalytic role. Arch. Microbiol. 158:127-131.
Mendum TA, Sockett RE, Hirsch PR. 1999. Use of molecular and isotopic techniques to monitor the
response of autotrophic ammonia-oxidizing populations of the β-subdivision of the class Proteobacteria
in arable soils to nitrogen fertilizer. Appl. Environ. Microbiol. 65:4155-4162.
Meybeck M. 1982. Carbon. Am. J. Sci. 282:401-450.
Meybeck M. 2001. River basin under anthropocene conditions. In: B. von Bodungen, K. Turner (eds.) Science
and Integrated Basin Management. Dahlem workshop series, Wiley, 25-294.
Michotey V, Bonin P. 1997. Evidence for anaerobic bacterial processes in the water column: denitrification and
disimilatory nitrate ammonification in Northwestern Mediteranean Sea. Mar Ecol Progr Ser. 160:47–56.
Minshall GW, Petersen RC, Cummins KW, Bott TL, Sedell JR, Cushing CE, Vannote RL. 1983. Inter-
biome comparison of stream ecosystem dynamics. Ecological Monographs, 53:1-25.
Mintie AT, Heichen RS, Cromack K, Myrold DD, Bottomley PJ. 2003. Ammonia-oxidizing bacteria along
a meadow-to-forest transects in the Oregon cascade mountains. Apll. Environ. Microbiol. 69:3129-3136.
Mitsch WJ. 1992. Landscape design and the role of created, restored and natural riparian wetlands in
controlling nonpoint source pollution. Ecol. Eng., 1:27-47.
Mobarry BK, Wagner M, Urbain V, Rittmann BR, Stahl DA. 1996. Phylogenetic Probes for analyzing
abundance and spatial organization of nitrifying bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 62:2156-2162.
Motelay-Massei A, Ollivon D, Garban B, Teil MJ, Blanchard M, Chevreuil M. 2004. Distribution and
spatial trends of PAHs and PCBs in soils in the Seine River basin, France. Chemosphere, 55:555-565.
Mouchel JM, Dispan J, Servais P, Georges I, Tusseau MH, Le Réveillé G, Garnier J, Philippon X,
Pinault S, Poulin M. "Une ville à l'amont : Troyes". Colloque PIREN-Seine, 18 et 19 Janvier 2000,
Paris.
Mulholland PJ, Tank JL, Sanzone DM, Wollheim WM, Peterson BJ, Webster JR, Meyer JL. 2000.
Nitrogen cycling in a forest stream determined by a 15N tracer addition. Ecol Monogr 70:471–493.
Muyzer G, De Waal EC, Uitterlinden AG. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing
gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA.
Appl. Environ. Microbiol. 59: 695-700.
Muyzer G. 1999. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems. Curr. Opin. Microbiol.
2:317-322.

279
 Bibliographie

~N~
Naqvi SWA, Jayakumar DA, Narvekar PV, Nalk H, Sarma VV, D’Souza W, Joseph S, George MD.
2000. Increased marine production of N2O due to intensifying anoxia on the Indian continental shelf.
Nature 408:346-349.
Navarro E, Fernandez MP, Grimont F, Clays-Josserand A, Bardin R. 1992. Genomic heterogeneity of
the genus Nitrobacter. Int. J. Syst. Bacteriol. 42:554-560
Nemery J. 2003. Origine et devenir du phosphore dans le continuum aquatique de la Seine, des petits bassins
amont à l’estuaire : Rôle du phosphore échangeable sur l’eutrophisation. Thèse, Université Paris VI-
Pierre et Marie Curie, pp.264.
Neu TR. 2000. In situ cell and glycoconjugate distribution in river snow studied by confocal laser scanning
microscopy. Aquat. Microb. Ecol. 21:85-95.
Newbold JD, Elwood JW, O’Neill RV, Van Winkle W. 1981. Measuring nutrient spiralling in streams. Can.
J. Fish. Aquat. Sci., 38:860-863.
Nicolaisen MH, Ramsing NB. 2002. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) approaches to study the
diversity of ammonia-oxidizing bacteria. [Link]. Methods 50:189-203.
Nielsen LP, Christensen PB, Revsbech NP, Sorensen J. 1990. Denitrification and photosynthesis in
stream sediment studied with microsensor and whole-core techniques. Limnol. Oceanogr. 35:1135-1144.
Nishio T, Fujimoto T. 1990. Kinetics of nitrification of various amounts of ammonium added to soils. Soil
Biology and Biochemistry 22:51–55.
Norton JM, Alzerreca JJ, Suwa Y, Klotz MG. 2002. Diversity of ammonia monooxygenase operon in
autotrophic ammonia-oxidizing bacteria. Arch. Microbiol. 177:139-149.

~O~
Okabe S, Satoh H, Watanabe Y. 1999. In situ analysis of nitrifying biofilms as determined by in situ
hybridization and the use of microelectrodes. Appl. Environ. Microbiol. 65:3182-3191.
Okabe S, Naitoh H. Satoh H, Watanabe Y. 2002. Structure and function of nitrifying biofilms as determined
by molecular techniques and the use of microelectrodes. Water Science & Technology 46:233–241
Olson RJ. 1981. Differential photoinhibition of marine nitrifying bacteria: a possible mechanism for the
formation of the primary nitrite maximum. Journal of Marine Research 39:227-238.
Omnes P, Slawyk G, Garcia N, Bonin P. 1996. Evidence of denitrification and nitrate ammonification in the
river Rhône plume (north-western Mediterranean Sea). Mar Ecol Progr Ser. 141:275–81.
O'Neil JG, Wilkinson JF. 1977. Oxidation of ammonia by methane-oxidizing bacteria and the effect of
ammonia on methane oxidation. J. Gen. Microbiol. 100:407-412.
Oremland RS, Capone DC. 1988. Use of specific inhibitors in biogeochemistry and microbial ecology.
Advances in Microbial Ecology. 10:285-383.
Oren A. 1999. Bioenergetic aspect of halophilism. Mic. Mol. Biol. Rev. 2: 334-348.
Orso S, Gouy M, Navarro E, Normand P. 1994. Molecular Phylogenetic analysis of Nitrobacter spp. Int. J.
Syst. Bacteriol. 44:83-86.
Owens NJP. 1986. Estuarine nitrification: a naturrally occuring fluidized bed reaction. Estuar Coast. Shelf. Sci.
22:31-44.

~ P-Q ~
Pace ML, Cole JJ. 1996. Regulation of bacteria by resources and predation tested in whole-lake experiments.
Limnol. Oceanogr. 41:1448-1460.
Paerl HW. 1990. Physiological ecology and regulation of N2 fixation in natural waters. Advances in Microb. Ecol.
11:305-344.
Paerl HW, Whitall DR. 1999. Anthropogenically derived atmospheric nitrogen deposition, marine
eutrophication and harmful algal bloom expansion: is there a link? Ambio, 28:307–11.
Painter HA, 1970. A review of literature on inorganic nitrogen metabolism in microorganisms. Water Research,
4:393-450.
Painter HA. 1986. Nitrification in the treatment of sewage and waste-water, p. 185-211. In J. I. Prosser (ed.),
Nitrification. IRL Press, Oxford, United Kingdom.
Pakulski JD, Benner R, Amon R, Eadie B, Whitledge T. 1995. Community metabolism and nutrient
cycling in the Mississippi River plume: evidence for intense nitrification at intermediate salinities. Mar.
Ecol., Prog. Ser. 117:207-218.
Papen H, Von Berg R, Hinkel I, Thoene B, Rennenberg H. 1989. Heterotrophic nitrification by
Alcaligenes faecalis: NO2-, NO3-, N2O, and NO production in exponentially growing cultures. Appl.
Environ. Microbiol. 55:2068-2072.
Pauer JJ, Auer MT. 2000. Nitrification in the water column and sediment of a hypereutrophic lake and
adjoining river system. Water Res. 34:1247-1254.
Peterson BJ, Bahr M, Kling GW. 1997. A tracer investigation of nitrogen cycling in a pristine tundra river.
Can J Fish Aquat Sci 54:2361–67.

280
 Bibliographie

Philips S, Wyffels S, Spengers R, Verstraete W. 2002. Oxygen-limited autotrophic

nitrification/denitrification by ammonia oxidisers enables upward motion towards more favourable
conditions. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:557-566.
Phillips CJ, Smith Z, Embley TM, Prosser JI. 1999. Phylogenetic differences between particle-associated
and planktonic Ammonia-Oxidizing Bacteria of the β subdivision of the class Proteobacteria in the
Northwestern Mediterranean Sea. Appl. Environ. Microbiol. 65:779-786.
Phillips CJ, Paul EA, Prosser JI. 2000. Quantitative analysis of ammonia-oxidizing bacteria using
competitive PCR. FEMS Microbiology Ecology 32:167-175.
Pinck C, Coeur C, Potier P, Bock E. 2001. Polyclonal antibodies recognizing the AmoB protein of ammonia
oxidizers of the b-Subclass of the Class Proteobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 67:118-124.
Pitcairn CER, Skiba UM, Sutton MA, Fowler D, Munro R, Kennedy V. 2002. Defining the spatial
impacts of poultry farm ammonia emissions on species composition of adjacent woodland groundflora
using Ellenberg Nitrogen Index, nitrous oxide and nitric oxide emissions and foliar nitrogen as marker
variables. Environmental Pollution 119 :9–21.
Pommerening-Röser A, Rath G, Koops H-P. 1996. Phylogenetic diversity within the genus Nitrosomonas.
Syst. Appl. Microbiol. 19:344-351.
Porter KG, Feig YS. 1980. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnol. Oceanogr
25: 943-948.
Poth M, Focht DD. 1985. N-15 kinetic analysis of N2O production by Nitrosomonas europaea-an examination of
nitrifier denitrification. Appl. Environ. Microbiol. 49:1134-1141.
Poth M. 1986. Dinitrogen production from nitrite by a Nitrosomonas isolate. Appl. Environ. Microbiol. 52:957–
959.
Pourriot R, Meybeck M. 1995. Limnologie générale. Masson, Paris, 956 pp.
Powell SJ, Prosser JI. 1991. Protection of Nitrosomonas europaea colonizing clay minerals from inhibition by
nitrapyrin. J Gen Microbiol. 137:1923-1929.
Pringle CM, Naiman RJ, Bretschko GK, Karr JR, Oswood MW, Welcomme RL, Winterbourn MJ.
1988. Patch dynamics in lotic systems. J. N. Am. Benthol. Soc. 7 :503–524.
Prosser JI. 1989. Autotrophic nitrification in bacteria. Adv. Micro. Physiol. 30:125-181.
Punshon S, Moore RM. 2004. A stable isotope technique for measuring production and consumption rates of
nitrous oxide in coastal waters. Marine Chemistry. 86:159-168.
Purkhold U, Pommerening-Röser A, Juretschko S, Schmid MC, Koops H-P, Wagner M. 2000.
Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rRNA and amoA
sequence analysis: implications for molecular diversity surveys. Appl. Environ. Microbiol. 66:5368-
5382.
Pynaert K, Smets BF, Wyffels S, Beheydt D, Siciliano SD, Verstraete W. 2003. Characterisation of an
autotrophic nitrogen-removing biofilm from a highly loaded lab-scale rotating biological contactor. Appl.
Environ. Microbiol. 69:3626-3635.

~R~
Rabalais NN, Turner RE. 2001. Coastal hypoxia: consequences for living resources and ecosystems. Coastal
and Estuarine Studies 58, American Geophysical Union, Washington, D.C.
Rabouille C, Mackenzie FT, Ver LM. 2001. Influence of the human perturbation on carbon, nitrogen and
oxygen biogeochemical cycles in the global coastal ocean. Geochimica & Cosmochimica Acta, 65:3615-
3641.
Radajewski S, McDonald IR, Murrell JC. 2003. Stable-isotope probing of nucleic acids: a window to the
function of uncultured microorganisms. Current Opinion in Biotechnology, 14:296-302.
Rademaker JLW, Louws FJ. De Bruijn FJ. 1998. Characterization of the diversity of ecologically important
microbes by rep-PCR genomic fingerprinting. Mol. Microb. Ecol. Man. 3:1-27.
Ramade F. 2003. Eléments d'écologie : Ecologie fondamentale. Paris : Dunod (ed.), 3ème édition.
Redfield AC, Ketchum BH, Richards FA. 1963. The influence of organismes on the composition of sea water.
In: The sea, Hill MN. (Ed.), Vol 2, Wiley, New York, pp.26-27.
Regan JM, Harrington GW, Noguera DR. 2002. Ammonia- and nitrite-oxidizing bacterial communities in a
pilot-scale chloraminated drinking water distribution system. Appl. Environ. Microbiol. 68:73-81.
Remde A, Conrad R. 1990. Production of nitric oxide in Nitrosomonas europaea by reduction of nitrite. Arch.
Microbiol. 154:187-191.
Revsbech NP, Nielsen LP, Christensen PB, Sorensen J. 1988. Combined oxygen and nitrous oxide
microsensor for denitrification studies. Appl. Environ. Microbiol. 54:2245-2249.
Risgaard-Petersen N, Rysgaard S, Nielsen LP, Revsbech NP. 1994. Diurnal variation of denitrification
and nitrification in sediments colonized by benthic microphytes. Limnol. Oceanogr. 39:573-579.
Risgaard-Petersen N, Jensen K. 1997. Nitrification and denitrification in the rhizosphere of the aquatic
macrophyte Lobelia dortmanna. Limnol. Oceanogr. 42:529-537.
Ritchie GA, Nicholas DJ. 1972. Identification of the sources of nitrous oxide produced by oxidative and
reductive processes in Nitrosomonas europaea. Biochem J. 126:1181-1191.
Ritchie GA, Nicholas DJ. 1974. The partial characterization of purified nitrite reductase and hydroxylamine
oxidase from Nitrosomonas europaea. Biochem J. 138:471-480.

281
 Bibliographie

Rieger PG, Meier HM, Gerle M, Vogt U, Groth T, Knackmuss HJ. 2002. Xenobiotics in the environment:
present and future strategies to obviate the problem of biological persistence. Journal of Biotechnology
94:101-123
Robertson GP, Tiedje JM. 1987. Nitrous oxide sources in aerobic soils: nitrification, denitrification, and other
biological processes. Soil Biology and Biochemistry 19:187-193.
Robertson LA, Kuenen JG. 1988. Heterotrophic nitrification in Thiosphaera pantotropha - oxygen uptake
and enzyme studies. J. Gen. Microbiol.,134:857–863
Rodier J. 1984. L'analyse de l'eau (eaux naturelles, eaux résiduaires, eau de mer), ed. Dunod
Romana LA, Thouvenin B, Sammari C. 1992. Modèle mathématique sur la nitrification et le cycle de
l’oxygène dissous en estuaire de la Seine. Rapport DEL/CCM,AESN, IFREMER, Direction de
l’environnement littoral et de l’aménagement, Laboratoire chimie des contaminants et modélisation.
Rosenberg R, Lindahl O, Blanck H. 1988. Silent spring in the sea. Ambio 17:289-290.
Ross DS, Hales HC. 2003. Sampling-induced increases in net nitrification in the Brush brook (Vermont)
Watershed. Soil Science Society of America Journal 67:318-326.
Rotthauwe JH, de Boer W, Liesack W. 1995. Comparative analysis of gene sequences encoding ammonia
monooxygenase of Nitrosospira sp. AHB1 and Nitrosolobus multiformis C-71. FEMS Microbiol. Lett.
133:131-135.
Rotthauwe J-H, Witzel K-P, Liesack W. 1997. The ammonia mono-oxygenase structural gene amoA as a
functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations. Appl.
Environ. Microbiol. 63:4704-4712.
Rowan AK, Snape JR, Fearnside D, Barer MR, Curtis TP, Head IM. 2003. Composition and diversity of
ammonia-oxidizing bacterial communities in wastewater treatment reactors of different design treating
identical wastewater. FEMS Microbiology Ecology. 43:195-206.
Roy R, Knowles R, Charlton MN. 1996. Nitrification and methane oxidation at the sediment surface in
Hamilton Harbour (Lake Ontario). Can. J. Fish. Aquat. Sci. 53: 2466–2472.
Rupf S, Merte K, Kneist S, Al-Robaiy S, Eschrich K. 2003. Comparison of different techniques of
quantitative PCR for determination of Streptococcus mutans counts in saliva samples. Oral Microbiol.
Immunol. 18:50-53
Rysgaard S, Risgaard-Petersen N. Nielsen LP, Revsbech NP. 1993. Nitrification and denitrification in
lake and estuarine sediments mesured by the 15-N dilution technique and isotop pairing. Appl. Environ.
Microbiol. 59:2093-2098
Rysgaard S, Risgaard-Petersen N, Sloth NP, Jensen K, Nielsen LP. 1994. Oxygen regulation of
nitrification and denitrification in sediments. Limno. Oceanogr. 39:1643-1652.
Rysgaard S, Nielsen TG, Hansen BW. 1999. Seasonal variation in nutrients, pelagic primary production and
grazing in a high-arctic coastal marine ecosystem, Young Sound, Northeast Greenland. Marine Ecology
Progress Series, 179:13–25.

~S~
Sanchez N. 1997. Le processus de dénitrification dans les sediments du barrage-réservoir de la Marne. Etude de
sa cinétique et modélisation. Thèse, Université Pierre et Marie Curie-Paris VI, 151p.
Satoh H, Okabe S, Norimatsu N, Watanabe Y. 2000. Significance of substrate C/N ratio on structure and
activity of nitrifying biofilms determined by in situ hybridization and the use of microelectrodes. Wat.
Sci. Tech. 41:317-321.
Sayavedra-Soto LA, Hommes NG, Arp DJ. 1994. Characterization of the gene encoding hydroxylamine
oxidoreductase in Nitrosomonas europaea. J. Bacteriol. 176:504-510.
Sayavedra-Soto LA, Hommes NG, Alzerreca JJ, Arp DJ, Norton JM, Klotz MG. 1998. Transcription of
the amoC, amoA and amoB genes in Nitrosomonas europaea and Nitrosospira sp. NpAV. FEMS
Microbiol. Lett. 167:81-88.
Schindler DW. 1977. Evolution of phosphorus limitation in lakes. Science, 195:260-262.
Schmid M, Twachtmann U, Klein M, Strous M, Juretschko S, Jetten M, Metzger JW, Schleifer KH,
Wagner M. 2000. Molecular evidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing
anaerobic ammonium oxidation. System. Appl. Microbiol. 23:93-106.
Schmidt I, Bock E. 1997. Anaerobic ammonia oxidation with nitrogen dioxide by Nitrosomonas eutropha.
[Link]. 167: 106-111.
Schmidt I, Bock E. 1998. Anaerobic ammonia oxidation by cell-free extracts of Nitrosomonas eutropha.
[Link] [Link].M. 73: 271-278.
Schmidt I, Zart D, Bock E. 2001. Effects of gaseous NO2 on cells of Nitrosomonas eutropha previously
incapable of using ammonia as an energy source. Antonie van Leeuwenhoek 79:39-47.
Schmidt I, Sliekers O, Schmid M, Cirpus I, Strous M, Bock E, Kuenen J G, Jetten MSM. 2002.
Aerobic and anaerobic ammonia oxidizing bacteria, competitors or natural partners? FEMS Microbiology
Ecology 39:175-181.
Schön G. 1965. Untersüchungen über der Nutzeffekt von Nitrobacter winogradsky. Arch. Mikrobiol., 50: 111-
132.
Schramm A, Larsen LH, Revsbech NP, Ramsing NB, Amann R, Schleifer K-H. 1996. Structure and
function of a nitrifying biofilm as determined by in situ hybridization and the use of microelectrodes.
Appl. Environ. Microbiol. 62:4641-4647.

282
 Bibliographie

Schramm A, DeBeer D, Wagner M, Amann R. 1998. Identification and activities in situ of Nitrosospira and
Nitrospira spp. as dominant populations in a nitrifying fluidized bed reactor. Appl. Environ. Microbiol.
64:3480-3485.
Schramm A, DeBeer D, VanDenHeuvel JC, Ottengraf S, Amann R. 1999. Microscale distribution of
populations and activities of Nitrosospira and Nitrospira spp. along a macroscale gradient in a nitrifying
bioreactor: quantification by in situ hybridization and the use of microsensors. Appl. Environ. Microbiol.
65:3690-3696.
Schramm A, De Beer D, Gieseke A, Amann R. 2000. Microenvironments and distribution of nitrifying
bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ. Microbiol. 2:680-686.
Schramm A. 2003. In situ analysis of structure and activity of the nitrifying community in biofilms, aggregates,
and sediments. Geomicrobiology J. 20:313-333
Sébilo M. 2003. Utilisation du traçage isotopique naturel pour caractériser et quantifier les processus de
nitrification et de dénitrification à l’échelle du réseau hydrographique de la Seine. Thèse, Université Paris
VI. 124p.
Sébilo M, Billen G, Grably M, Mariotti A. 2003. Isotopic compositions of nitrate-nitrogen as a marker of
riparian and benthic denitrification at the scale of the Seine River system. Biogeochemistry, 63:35-51.
Sengupta S, Shaila MS, Rao GR. 1996. Purification and characterization of assimilatory nitrite reductase from
Candida utilis. Biochem. J. 331:147-155.
Seidl M, Servais P, Mouchel JM. 1998. Organic matter transport and degradation in the River Seine (France)
after a combined sewer overflow. Wat. Res. 32:3569-3580
Seitzinger SP, Giblin AE. 1996. Estimating denitrification in North Atlantic continental shelf sediments.
Biogeochemistry 35:235-260
Seitzinger SP, Sanders RW. 1997. Contribution of dissolved organic nitrogen from rivers to estuarine
eutrophication. Marine Ecology Progress Series 159:1-12.
Seitzinger SP, Kroeze C. 1998. Global distribution of nitrous oxide production, N inputs in freshwater, coastal
marine ecosystems. Global Biogoechemical Cycles 12: 93-113.
Seitzinger SP, Kroeze C, Styles RV. 2000. Global distribution of N2O emissions from aquatic systems:
natural emissions and anthropogenic effects. Chemosphere-Global Change Science 2:267-279.
Servais P, Garnier J. 1993. Contribution of heterotrophic bacterial production to the carbon budget of the
River Seine (France). Microbial Ecology, 25:19-33.
Servais P, Garnier J, Demarteau N, Brion N, Billen G. 1999. Supply of organic matter and bacteria to
aquatic ecosystems through waste water effluents. Water Research. 33: 3521-3531.
Shears JH, Wood PM. 1985. Spectroscopic evidence for a photosensitive oxygenated state of ammonia
monooxygenase. Biochem. J. 226:499-507.
Sheibley RW, Jackman AP, Duff JH, Triska FJ. 2003. Numerical modeling of coupled nitrification–
denitrification in sediment perfusion cores from the hyporheic zone of the Shingobee River. Advances in
Water Resources. 26:977-987.
Shimel JP, Firestone MK, Killham KS. 1984. Identifition of heterotrophic nitrification in a sierran forest
soil. Appl. Environ. Microbiol. 48:802-806.
Shrestha NK, Hadano S, Kamachi T, Okura I. 2002. Dinitrogen production from ammonia by
Nitrosomonas europeaea, Appl. Catal., A: General 237:33-39.
Siegrist H, Reithaar S, Koch G, Lais P. 1998. Nitrogen loss in a nitrifying rotating contactor treating
ammonium-rich wastewater without organic carbon. Water Science and Technology 38:241-248.
Skiba U, Smith KA. 2000. The control of nitrous oxide emissions from agricultural and natural soils.
Chemosphere-Global Change Science, 2:379-386.
Skinner FA. Walker N. 1961. Growth of Nitrosomonas europea in batch and continuous culture. Arch.
Mikrobiol., 38:339-349.
Slangen JHG, Kerkhoff P. 1984. Nitrification inhibitors in agriculture and horticulture: A literature review.
Fertilizer Res. 5:1-76
Slavyck G, McIsaac JJ. 1972. Comparison of two automated ammonium methods in a region of coastal
upwelling. Deep Sea Res. 19:1-4.
Sliekers AO, Derwort N, Campos Gomes JL, Strous M, Kuenen JG, Jetten MSM. 2002. Completely
autotrophic nitrogen removal over nitrite in one single reactor. Water research 36:2475-2482.
Sliekers AO, Third K, Abma W, Kuenen JG, Jetten MSM. 2003. CANON and Anammox in a gas-lift
reactor. FEMS Microbiol. Lett. 218:339-344.
Smith SV, Hollibaugh JT. 1993. Coastal metabolism and the oceanic organic carbon balance. Reviews of
Geophysics 31:75-89.
Smith Z, McCaig AE, Stephen JR, Embley TM, Prosser JI. 2001. Species diversity of uncultured and
cultured populations of soil and marine ammonia oxidizing bacteria. Microb. Ecol. 42:228-237.
Smorczewski WT, Schmidt EL. 1991. Numbers, activities and diversity of autotrophic ammonia-oxidizing
bacteria in a freshwater, eutrophic lake sediment. Can. J. Microbiol.37:828-833.
Soetaert K. et al. 1995. Meiobenthic distribution and nematode community structure in five European
estuaries. Hydrobiologia 311:185-206.
Soina VS, Lebedeva EV, Golyshina OV, Fedorov-Davydov DG, Gilichinsky DA. 1991. Nitrifying bacteria
from permafrost deposits of the kolyma lowland. Microbiologia, 60:187-190.
Solomonson LP, Vennesland B. 1972. Properties of a nitrite reductase of Chlorella. Biochim. Biophys. Acta
267:544-557.

283
 Bibliographie

Sorokin DY, Muyzer G, Brinkhoff T, Kuenen JG, Jetten MS. 1998. Isolation and characterisation of a
novel facultatively alkaliphilic Nitrobacter species, N. alkalicus sp. nov. Arch. Microbiol. 170:345-352.
Somville M. 1976. A method for mesurement of nitrification rates in water. Water Research 12:843-848.
Somville M. 1984. Use of nitrifying activity measurements for describing the effect of salinity on nitrification in
the Scheldt estuary. Appl. Environ. Microbiol. 47:424-426.
Sorokin DY, Tourova T, Schmid M, Wagner M, Koops HP, Kuenen JG, Jetten M. 2001. Isolation and
properties of obligately chemolithoautotrophic and extremely alkalitolerant ammonia oxidizing bacteria
from Mongolian soda lakes. Arch. Microbiol. 176:170-177.
Spalding RF, Exner ME. 1993. Occurrence of nitrate in groundwater: a review. J. Environ. Qual. 22:392-402.
Speksnijder AG, Kowalchuk GA, Roest K, Laanbroek HJ. 1998. Recovery of a Nitrosomonas-like 16S
rDNA sequence group from freshwater habitats. System. Appl. Microbiol. 21:321-330.
Spieck E, Aamand J, Bartosch S, Bock E. 1996. Immunocytochemical detection and localisation of the
membrane-bound nitrite oxidoreductase in cells of Nitrobacter and Nitrospira. FEMS Microbiol. Lett.
139:71-76.
Spieck E, Ehrich S, Aamand J, Bock E. 1998. Isolation and immunocytochemical location of the nitrite
oxidizing system in Nitrospira moscoviensis. Arch. Microbiol. 169:225-230.
Stanley PM, Schmidt EL. 1981. Serological diversity of Nitrobacter spp. from soil and aquatic habitats. Appl.
Environ. Microbiol. 41:1069-1071.
Stehr G, Bottcher B, Dittberner P, Rath G, Koops H-P. 1995a. The ammonia-oxidizing nitrifying
population of the river Elbe estuary. FEMS Microbiol. Ecol. 17:177-186.
Stehr G, Zörner S, Böttcher B, Koops H-P. 1995b. Exopolymers: An ecological characteristic of a floc-
attached, ammonia-oxidizing bacterium . Microb. Ecol. 30:115-126.
Stein L, Arp DJ. 1998. Loss of ammonia monooxygenase activity in Nitrosomonas europaea upon exposure to
nitrite. Appl. Environ. Microbiol.64:4098-4102.
Steinmuëller W, Bock E. 1976. Growth of Nitrobacter in the presence of organic matter. I. Mixotrophic
growth. Arch. Microbiol. 108:299-304.
Stephen JR, McCaig AE, Smith Z, Prosser JI, Embley TM. 1996. Molecular diversity of soil and marine
16S rRNA gene sequences related to β-subgroup ammonia-oxidizing bacteria. Appl. Environ. Microbiol.
62:4147-4154.
Stephen JR, Kowalchuk GA, Bruns MA, McCaig AE, Phillips CJ, Embley TM, Prosser JI. 1998.
Analysis of β-subgroup Proteobacterial ammonia oxidizer populations in soil by denaturing gradient gel
electrophoresis analysis and hierarchical phylogenetic probing. Appl. Environ. Microbiol. 64:2958-2965
Stephen JR, Chang Y-J, Macnaughton SJ, Kowalchuk GA, Leung KT, Flemming CA, White DC.
1999. Effect of toxic metals on indigenous soil β-subgroup Proteobacterium ammonia oxidizer
community structure and protection against toxicity by inoculated metal-resistant bacteria. Appl.
Environ. Microbiol. 65:95-101.
Stevens RJ, Laughlin RJ, Burns LC, Arah JRM, Hood RC. 1997. Measuring the contributions of
nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biol. Biochem. 29:139–151.
Stief P, de Beer D. 2002. Bioturbation effects of Chironomus riparius (Diptera) on microbial nitrogen
conversions in freshwater sediments as measured using microsensors and microbiologic assys. Aquat.
Microb. Ecol. 277:175-185.
Stief P, Schramm A, Altmann D, de Beer D. 2003. Temporal variation of nitrification rates in experimental
freshwater sediments enriched with ammonia or nitrite. FEMS Microbiol. Ecol. 46:63-71.
Stouthamer AH. 1988. Dissimilatory reduction of oxidized nitrogen compounds. In: Biology of Anaerobic
Microorganisms (Zehnder, A.J.B., Ed.), pp. 179-24-l. John Wiley. New York.
Strahler AN. 1957. Quantitative analysis of watershed geomorphology. American Geophysical Union
Transactions. 38:913-920.
Strauss EA, Dodds WK. 1997. Influence of protozoa and nutrient availability on nitrification rates in
subsurface sediments. Microbial Ecology. 34:155-165.
Strous M, Fuerst J, Kramer EHM, Logemann S, Muyzer G, van de Pas-Schoonen KT, Webb R,
Kuenen JG, Jetten MS. 1999. Missing lithotroph identified as new planctomycete. Nature 400:446-
449.
Stüven R, Vollmer M, Bock E. 1992. The impact of organic matter on nitric oxide formation by Nitrosomonas
europaea. Arch. Microbiol. 158:439–443.
Sundermeyer-Klinger H, Meyer W, Warninghoff B, Bock E. 1984. Membrane-bound nitrite
oxidoreductase of Nitrobacter : evidence for a nitrate reductase system. Arch. Microbiol. 140:153-158.
Suzuki I, Dular U, Kwok S-C. 1974. Ammonia or ammonium ion as substrate for oxidation by Nitrosomonas
cells and extracts. J. Bacteriol. 120:556-558.
Suwa Y, Imamura Y, Suzuki T, Tashiro T, Urushigawa Y. 1994. Ammonia-oxidizing bacteria with
different sensitivities to (NH4)2SO4 in activated sludges. Wat. Res. 28:1523-1532.
Suwa Y, Sumino T, Noto K. 1997. Phylogenetic relationships of activated sludge isolates of ammonia oxidizers
with different sensitivities to ammonium sulfate. J. Gen. Appl. Microbiol. 43:373-379.
Svenson A, Sanden B, Dalhammar G, Remberger M, Kaj L. 2000. Toxicity identification and evaluation
of nitrification inhibitors in wastewaters. Environ. Toxicol. 15:527-532.
Svensson JM, Enrich-Prast A, Leonardson L. 2001. Nitrification and denitrification in a eutrophic lake
sediment bioturbated by oligochaetes. Aquat. Microb. Ecol. 23:177-186.
Swift S, Throup JP, Williams P, Salmond GP, Stewart GS. 1996. Quorum sensing: a population-density
component in the determination of bacterial phenotype. Trends Biochem. Sci. 21:214-219.

284
 Bibliographie

~T~
Tanaka H, Nakamura E, Hoshkawa H, Tanak Y. 1993. Development of he ammonia biosensor monitoring
system. Water Sci. Technol. 28:435-445.
Tank JL, Meyer JL, Sanzone DM, Mulholland PJ, Webster JR, Peterson BJ, Wollheim WM,
Leonard NE. 2000. Analysis of nitrogen cycling in a forest stream during autumn using a 15N-tracer
addition. Limnol. Oceanogr. 45:1013–1029.
Tappin AD, Harris JRW, Uncles RJ. 2003. The fluxes and transformations of suspended particles, carbon
and nitrogen in the Humber estuarine system (UK) from 1994 to 1996: results from an integrated
observation and modelling study. The Science of the Total Environment 314 –316: 665–713.
Teissier S, Torre M. 2002. Simultaneous assessment of nitrification and denitrification on freshwater epilithic
biofilms by acetylene block method. Water Res. 36:3803-3811 .
Teske A, Alm E, Regan JM, Toze S, Rittmann BE, Stahl DA. 1994. Evolutionary relationships among
ammonia-and nitrite-oxidizing bacteria. J. bacteriol. 176:6623-6630.
Thévenot DR, Meybeck M, Chesterikov A, Chevreuil M. 1998. Métaux : sources multiples et accumulation.
In: La Seine en son bassin : Fonctionnement écologique d'un système anthropisé, ed. M. Meybeck, G. De
Marsily, E. Fustec. Chapitre 9 pp. 391-437.
Thornton I, Jeffrey A. 1999. Assessment and control of nonpoint source pollution of aquatic ecosystems: a
practical approach. (Man and the biosphere; v. 23)
Todorov JR, Chistoserdov AY, Aller JY. 2000. Molecular analysis of microbial communities in mobile
deltaic muds of southeastern Papua New Guinea. FEMS Microbiol. Ecol. 33:147-155.
Tréguer P, Nelson DM, Van Bennekom AJ, DeMaster DJ. 1995. The silica balance in the world ocean: a
reestimate. Science, 268:375-379.
Trogler WC. 1999. Physical properties and mechanisms of formation of nitrous oxide. Coord. Chem. Rev.
187:303-327.
Tsapakis M, Stephanou EG, Karakassis I. 2003. Evaluation of atmospheric transport as a nonpoint source
of polycyclic aromatic hydrocarbons in marine sediments of the Eastern Mediterranean. Marine
Chemistry, 80:283-298.
Tsien H-C, Lambert R, Laudelout H. 1968. Fine structure and the localization of the nitrite oxidizing system
of Nitrobacter winogradskyi. Antonie van Leeuwenhoek 34:483-494.
Tuffey TJ, Hunter JV, Matulewich VA. 1974. Zones of nitrification. Water Resources Bulletin 10:555-564.
Turner R, Qureshi N, Rabalais N, Dortch Q, Justic D, Shaw R, Cope J. 1998 Fluctuating silicate: nitrate
ratios and coastal plankton food webs. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:13048-13051.
Tusseau-Vuillemin MH, Le Reveillé G, Mouchel JM, Dispan J, Delbec M, Servais P. Biodégradabilité
de la matière organique en sortie de station d’épuration. Rapport d’activité PIREN-Seine 1999. Février
2000. P 4.4-22.

~U~
Uncles RJ, Joint I, Stephens JA. 1998. Transport and retention of suspended particulate matter and bateria
in the Humber-Ouse Estuary, UK, and their relation to hypoxia and anoxia. Estuaries 21:597-612.
Utåker JB, Bakken L, Jiang QQ, Nes IF. 1995. Phylogenetic analysis of seven new isolates of ammonia-
oxidizing bacteria based on 16S rRNA gene sequences. Syst. Appl. Microbiol. 18:549-559.
Utåker JB, Nes IF. 1998. A qualitative evaluation of the published oligonucleotides specific for the 16S rRNA
gene sequences of the ammonia-oxidizing bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 21:72-88.
Utåker JB, Andersen K, Aakra A, Moen B, Nes IF. 2002. Phylogeny and functional expression of ribulose
1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from the autotrophic ammonia-oxidizing bacterium
Nitrosospira sp. isolate 40KI. J. Bacteriol. 184:468-478.

~V~
Vandamme P, Pot B, Gillis M, De Vos P, Kersters K. Swings J. 1996. Polyphasic taxonomy, a consensus
approach to bacterial systematics. Microbiol. Rev. 60 :407-438.
Vaneechoutte M. (1996) DNA fingerprinting techniques for microorganisms. Mol. Biotechnol. 6:115-142.
Vannote RL, Minshall GW, Cummins KW, Sedell JR, Cushing CE. 1980. The river continum concept.
Can. J. Fish. Aquat. Sci., 37:130-137.
Venterea R, Groffman P, Verchot L, Magill A, Aber J, Steudler P. 2003a. Nitrogen oxide gas emissions
from temperate forest soils receiving long-term nitrogen inputs. Global Change Biol. 9:346–357.
Venterea R, Lovett G, Groffman P, Schwarz P. 2003b. Landscape patterns of net nitrification in a northern
hardwood-conifer forest. Soil Sci. Soc. Am. J. 67:527–539.
Ver LMB, Mackenzie FT, Lerman A. 1999. Carbon cycle in the coastal zone: effects of global perturbations
and change in the past three centuries. Chemical Geology, 159:283-304.
Verbanck M, Vanderborght J-P, Wollast R. 1994. Major ion content of urban wastewater: assessment of per
capita loading. J. Water Pollut. Cont. Fed. 61:1722-1728.

285
 Bibliographie

Verhagen FJM, Duyts H, Laanbroek HJ. 1993. Effects of grazing by flagellates on competition for
ammonium between nitrifying and heterotrophic bacteria in soil columns. Appl. Environ. Microbiol. 59:
2099-2106.
Verhagen F, Laanbroek HJ, Woldendorp J. 1995. Competition for ammonium between plantroots and
nitrifying and heterotrophic bacteria and the effects of protozoan grazing. Plant Soil 170:241-250.
Verstraete W, Alexander M. 1973. Heterotrophic nitrification in samples of natural ecosystems. Environ. Sci.
Technol. 7:39-42.
Visser SA. 1964. Origin of nitrates in tropical rainwater. Nature 201:35-36.
Vitousek PM, Aber JD, Howarth RW, Likens GE, Matson PA, Schindler DW, Schlesinger WH,
Tilman DG. 1997. Human alteration of the global nitrogen cycle: sources and consequences. Ecological
Applications 7:737-750.
Völsch A, Nader WF, Geiss HK, Nebe G, Birr C. 1990. Detection and analysis of two serotypes of ammonia-
oxidizing bacteria in sewage plants by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 56:2430-2435.
Vollenweider RA. 1968. Scientific fundamentals of the eutrophication of lakes and flowing waters, with
particular reference to nitrogen and phosphorus as factors of eutrophication. O.C.D.E. Paris, Technical
Report, 250 p.
Vollenweider RA, Marchetti RA. 1992. Coastal marine eutrophication: principles and Control. P. 1-20. In :
Vollenweider RA, Marchetti R, Viviani R. (Eds.) Marine Coastal Eutrophication. The response of marine
transitional systems to human impact: problems and perspectives for restoration. Science of the Total
Environment Supplement. Elsevier Scientific, Amssterdam, The Netherlands.
Von Der Wiesche M, Wetzel A. 1998. Temporal and spatial dynamics of nitrite accumulation in the River
Lahn. Wat. Res. 32:1653-1661
Voytek MA, Ward BB. 1995. Detection of ammonium-oxidizing bacteria of the beta-subclass of the class
Proteobacteria in aquatic samples with the PCR. Appl. Environ. Microbiol. 61:1444-1450.
Voytek MA. 1996. Detection, abundance and diversity of aquatic nitrifying bacteria. Ph.D. dissertation.
University of California, Santa Cruz.
Voytek MA, Ward BB, Priscu JC. 1998. The abundance of ammonia-oxidizing bacteria in Lake Bonney,
Antarctica determined by immunofluorescence, PCR amplification and in situ hybridization. In:
“McMurdo Dry Valleys: A Cold Desert Ecosystem” J.C. Priscu (ed.) AGU Press Washington, D.C.

~ W-X-Y-Z ~
Wagner M, Assmus B, Hartmann A, Hutzler P, Amann R. 1994. In situ analysis of microbial consortia in
activated sludge using fluorecently labelled, rRNA-targeted oligonucleotide probes and confocal scanning
laser microscopie. J. Microsc. 176:181-187.
Wagner M, Rath G, Amann R, Koops H-P, Schleifer K-H. 1995. In situ identification of ammonia-
oxidizing bacteria. System. Appl. Microbiol. 18:251-264.
Wagner M, Rath G, Koops H-P, Flood J, Amann R. 1996. In situ analysis of nitrifying bacteria in sewage
treatment plants. Water Sci. Technol. 34:237-244.
Wallace W, Knowles SE, Nicholas DJ. 1970. Intermediary metabolism of carbon compounds by nitrifying
bacteria. Arch. Mikrobiol. 70:26-42.
Ward BB, Carlucci AF. 1985. Marine ammonia-and nitrite-oxidizing bacteria: serological diversity determined
by immunofluorescence in culture and in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 50:194-201.
Ward BB, Martino DP, Diaz MC, Joye SB. 2000. Analysis of ammonia-oxidizing bacteria from hypersaline
Mono Lake, California, on the basis of 16S rRNA sequences. Appl. Environ. Microbiol. 66:2873-2881.
Ward JV. 1989. The four-dimensional nature of lotic ecosystems. J. N. Am. Benthol. Soc., 8:2-8.
Warren N, Allan IJ, Carter JE, House WA, Parker A. 2003. Pesticides and other micro-organic
contaminants in freshwater sedimentary environments-a review. Applied Geochemistry, 18:159-194.
Watson SW. 1965. Characteristics of a marine nitrifying bacterium, Nitrosocystis oceanus sp. Limnol. Oceanogr.
10:R274-R289.
Watson SW, Novitsky TV, Quinby HL, Valois FW. 1977. Determination of bacterial number and biomass in
the marine environment. Appl. Environ. Microbiol. 33: 940-946.
Watson SW, Valois FW, Waterbury JB. 1981. The family Nitrobacteraceae. In: Starr MP, Stolp H, Trüper
HG, Balows A, Schlegel HG. (Eds.) The Prokaryotes. Springer-Verlag New York, NY. vol. 1, pp. 1005–
1022.
Watson SW, Bock E, Valois EW, Waterbury JB, Schlosser U. 1986. Nitrospira marina gen. nov. sp. nov.:
A chemolithotrophic nitrite-oxidizing bacterium. Arch. Microbiol. 144:1-7.
Watson SW, Bock E, Harms H, Koops H-P, Hooper AB. 1989. Nitrifying bacteria. In Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology, ed. R. G. E. Murray, D. J. Brenner, M. P. Bryant, J. G. Holt, N. R. Krieg, J. W.
Moulder, N. Pfennig, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, S. Williams. pp. 1808-1834. Vol. 3. Baltimore: Williams
and Wilkins.
Webster EA, Hopkins DW. 1996. Contributions of different microbial processes to N2O emission from soil
under different moisture regimes. Biol. Fertil. Soils 22:331-335.
Wetzel RG. 1983. Limnology. Second Edition. Saunders College Publishing. 860 pp.
Wezernak CT. Gannon JJ. 1967. Oxygen - nitrogen relationships in autotrophic nitrification. Appl. Microbiol.,
15:1211-1214.

286
 Bibliographie

Whitby CB, Saunders JR, Rodriguez J, Pickup RW, McCarthy A. 1999. Phylogenetic differentiation of
two closely related Nitrosomonas spp. that inhabit different sediment environments in an oligotrophic
freshwater lake. Appli. [Link]. 65:4855-4862.
Whitby CB, Hall G, Pickup R, Saunders JR, Ineson P, et al. 2001. 13 C incorporation into DNA as a means
of identifying the active components of ammonia-oxidizer populations. Lett. Appl. Microbiol. 32:398-
401.
Willison TW, Baker JC, Murphy DV, Goulding KWT. 1998. Comparison of wet and dry 15-N isotopic
dilution technique as a short-term nitrification essay. Soil Biology and Biochemistry 30:661-663.
Willner E, Katz E, Lapidot N. 1992. Bioelectrocatalysed reduction of nitrate utilizing polythiophene
bipyridinium enzyme electrodes. Bioelectrochem. Bioenerg. 29:29-45.
Wimpenny JWT. 1992. Microbial systems: Patterns in time and space. Advances in Microbial Ecology. 12:469-
522.
Winely CL, San Clemente CL. 1970. Effects of pesticides on nitrite oxidation by Nitrobacter agilis. Appl.
Microbiol. 19 :214-219.
Winogradsky S. 1890. Recherches sur les organismes de la nitrification. Ann. Inst. Pasteur. 4:257-275.
Winogradsky S. 1892. Contributions à la morphologie des organismes de la nitrification. Arch. Sci. Biol.
[Link]. 1:86-137.
Whittaker M, Bergmann D, Arciero D, Hooper AB. 2000. Electron transfer during the oxidation of
ammonia by the chemolithotrophic bacterium Nitrosomonas europaea. Biochim. Biophys. Acta.
1459:346-355.
Woese CR, Weisburg WG, Paster BJ, Hahn CM, Tanner RS, Krieg NR, Koops H-P, Harms H,
Stackebrandt E. 1984. The phylogeny of purple bacteria: The beta subdivision. Syst. Appl. Microbiol.
5:327-336.
Wolf I, Brumme R, 2002. Contribution of nitrification and denitrification sources for seasonal N2O emissions
in an acid German forest soil. Soil Biology & Biochemistry 34:741–744.
Wrage N, Dixon L, Estavillo JM, Nawalany P. Oenema O. 2000. The influence of soil pH and nitrogen
fertilizer application on N2O production by nitrifier denitrification: Some preliminary results. In: Effects
of Liming and Nitrogen Fertilizer Application on Soil Acidity and Gaseous Nitrogen Oxide Emissions in
Grassland Systems (Oenema, O. and Sapek, A., Eds.), Falenty IMUZ, Falenty.
Wrage N, Velthof GL, Van Beusichem ML, Oenema O. 2001. Role of nitrifier denitrification in the
production of nitrous oxide. Soil Biol. Biochem. 33:1723-1732.
Wrage N, Velthof GL, Oenema O, Laanbroek HJ. 2004. Acetylene and oxygen as inhibitors of nitrous oxide
production in Nitrosomonas europaea and Nitrosospira briensis: a cautionary tale. FEMS Microbiology
Ecology 47:13-18.
Zahn JA, Duncan C, DiSpirito AA. 1994. Oxidation of hydroxylamine by cytochrome P-460 of the obligate
methylotroph Methylococcus capsulatus. Bath. J. Bacteriol. 176:5879-5887.
Zart D, Bock E. 1998. High rate of aerobic nitrification and denitrification by Nitrosomonas eutropha grown in
a fermentor with complete biomass retention in the presence of gaseous NO2 or NO. Arch. Microbiol.
169:282-286.
Zart D, Schmidt I, Bock E. 2000. Significance of gaseous NO for ammonia oxidation by Nitrosomonas
eutropha. Ant. v. Leeuwenhoek 77:49-55.
Zimmermann K, Mannhalter JW. 1996. Technical aspects of quantitative competitive PCR. Biotechniques.
21:268-272, 274-279.
Zumft, W. G. 1997. Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:533-616.

287
 NITRIFICATION, NITRIFYING BACTERIA AND N2O
EMISSIONS.
The Seine River downstream from Paris

Summary:

In the lower Seine river, during the summer, the maximum nitrifying activity occurs
in the upper freshwater estuary, about 200 km downstream of the Achères Wastewater
Treatment Plant (WWTP) effluents output. The effluents contain high quantities of nutrients,
organic matter, ammonia and bacteria.
The aim of this study was to contribute to the knowledge of the global ecological
functioning of the Seine River downstream the WWTP effluent discharge, and to try the
modeling of the nitrification process in the lower Seine River. Both in situ as well as laboratory
experiment were carried out. We showed that the nitrifying process contribute to a nitrous
oxide (N2O, greenhouse gas) production by nitrifier-denitrification process in the low
oxygenated zones. We quantified and studied the diversity of nitrifying bacterial populations
all along the lower Seine River continuum. Finally we studied the nitrification and nitrifier-
denitrification processes in controlled conditions to determine the optimal conditions for N2O
production and kinetics parameters (Vmax, Km) of the 3 steps of the nitrification.
The quantities of nitrifying bacteria were determined by competitive PCR, based on
amoA gene copy numbers for the ammonia oxidizing bacteria (AOB) and on 16S rRNA gene
copy number for Nitrobacter and Nitrospira. The concentration of nitrifying bacteria is more
or less correlated with the potential nitrifying activities; we observed a significant increase just
downstream the WWTP output and a second peak in the upper freshwater estuary where the
totality of ammonia is consumed.
The species composition of AOB of the β-subclass of Proteobacteria was investigated by
two methods. Two amoA gene libraries were created from a sample just downstream WWTP
output and another in the Seine freshwater estuary. The second approach was based on DGGE
(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) analysis of β-AOB with the use of PCR primers
targeting specific fragments of 16S rDNA. These two phylogenetic analyses revealed a good
agreement among the results. The majority (60-80%) of the analyzed clones at both sites were
affiliated to the Cluster 6a represented by Nitrosomonas oligotropha- and Nitrosomonas
urea-like bacteria. Two other ammonia-oxidizing clusters, i.e. Nitrosomonas europaea- and
Nitrosospira-like bacteria lineages, were found in smaller proportions. The DGGE analysis
revealed that the major lineage (75-90% cluster 6a) was represented by three different bands
corresponding to three different bacterial strains. The first one brought by the WWTP
effluents, maintains and develops all along the Seine River continuum to the estuary and
represents about 40% of the AOB population. The two other members of the 6a lineage seems
to be autochthonous bacteria, one develop thanks to the ammonia input by the WWTP
effluents and the other in the upper estuary in the maximum of turbidity.
In the same part of the lower Seine river high quantities of the greenhouse N2O gas are
produced, in part by nitrifier-denitrification. Chemostat and Culture batch experiments led us
to determine kinetics parameters associated with N2O production. We tested the influence of
oxygen, ammonia and nitrite concentrations on the production of N2O by Seine River
freshwater natural nitrifying bacterial population (confirmed by DGGE). We determined
kinetics parameters, that were integrated in the RIVE model, the model of ecological processes
of the RIVERSTAHLER, a regional scale model of the Seine River.

Key words: Nitrification, Seine River, ammonia-oxidizing and nitrite-oxidizing bacterial

populations, N2O production, modelling.
 NITRIFICATION, BACTERIES NITRIFIANTES ET EMISSIONS
DE N2O.
La Seine en aval de Paris

Résumé :

En période estivale, l’activité nitrifiante maximale apparaît dans la basse Seine au niveau de
l’estuaire amont, environ 200km à l’aval des rejets de la station d’épuration (STEP)
d’Achères. Ces effluents sont chargés en matière organique, ammonium et bactéries. Le but
de notre étude était de contribuer à la connaissance du fonctionnement écologique global de
la basse Seine en aval des rejets d’Achères et de tenter de modéliser le processus de
nitrification dans la basse Seine. Des expériences ont été réalisées à la fois in situ et en
laboratoire. Nous avons montré que le processus de nitrification contribue à la production
d’oxyde nitreux (N2O gaz à effet de serre) par nitrification-dénitrifiante en condition de faible
oxygénation. Nous avons quantifié et étudié la diversité des populations bactériennes
nitrifiantes le long du continuum de la basse Seine. Pour finir nous avons étudié la
nitrification et la nitrification-dénitrifiante en conditions contrôlées afin de déterminer les
conditions optimales de production de N2O et les paramètres cinétiques (Vmax, Km) des 3
étapes de la nitrification.
Les quantités de bactéries nitrifiantes ont été déterminées par PCR compétitive, basée sur le
nombre de copies de gène amoA pour les bactéries nitrosantes et sur le nombre de copies
d’ADNr 16S pour Nitrobacter et Nitrospira. La concentration en bactéries nitrifiante est plus
ou moins corrélée aux mesures d’activités nitrifiantes potentielles; nous observons
néanmoins une augmentation significative à l’aval immédiat d’Achères et un second pic dans
l’estuaire amont où la totalité de l’ammonium est consommé.
La composition de la communauté bactérienne nitrosante appartenant à la sous-classe β des
Protéobactéries a été étudiée par deux approches. Deux banques de gène amoA ont été crées
pour deux échantillons, l’un situé à l’aval immédiat des rejets d’Achères et le second dans
l’estuaire amont. La seconde approche utilise la DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis) et cible des fragments d’ADNr 16S spécifique de la population nitrosante.
Ces deux analyses phylogénétiques donnent des résultats concordants. La majorité (60-80%
des clones analysés aux deux sites sont affiliés au cluster 6a représenté par Nitrosomonas
oligotropha et Nitrosomonas urea. Les deux autres groupes bactériens nitrosants
(Nitrosomonas europaea et Nitrosospira) sont présents en faibles proportions. L’analyse
DGGE a révélé que le cluster 6a majoritaire (75-90%) était représenté par trois bandes
différentes correspondant à trios souches bactériennes nitrosantes. La première est apportée
par les effluents d’Achères, elle se maintient et se développe le long du continuum et jusque
dans l’estuaire et représente environ 40% de la population nitrosante. Les deux autres
membres du cluster 6a semblent être des bactéries autochtones, une se développe grâce à
l’apport d’ammonium par Achères et l’autre dans l’estuaire amont au niveau du maximum de
turbidité.
Dans la même partie de la basse Seine, de fortes quantités de N2O sont produites, en partie
par nitrification-dénitrifiante. Des expériences en batch et chémostat nous ont permis de
déterminer les paramètres cinétiques associés à cette production de N2O. Nous avons testé
l’influence de l’oxygène, de l’ammonium et du nitrite sur la production de N2O par la
population bactérienne nitrifiante naturellement présente dans la basse Seine. Les
paramètres cinétiques ont été ensuite intégrés au modèle RIVE, le module représentant les
processus écologiques du modèle régional RIVERSTAHLER.

Mots clés : Nitrification, Seine, populations bactériennes nitrosantes et nitratantes,

production de N2O, modélisation.