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%0$503"5
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-6/*7&34*5²
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506-064&

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Institut National Polytechnique
฀ de Toulouse (INP Toulouse)

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Génie de Procédés฀et Environnement
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Mr Slim SMAOUI
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฀ 26 Mai 2010 ฀
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Purification et Caractérisation de Biomolécules à partir de microorganismes
฀ et identifiés
nouvellement isolés
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Pr. Néji GHARSALLAH฀ Président
Dr. Radhouane GDOURA ฀ Rapporteur
Dr. Bertrand AIGLE Rapporteur
Pr. Jean Luc PERNODET Examinateur

฀ ฀
Mécanique, Energétique, Génie civil et Procédés (MEGeP)
฀
฀ ฀ ฀
฀
Laboratoire de Génie Chimique (LGC- Toulouse)
฀ ฀ ฀
Pr. Florence MATHIEU Directeur de Recherches au LGC
Dr. Lotfi MELLOULI Directeur de thèse (Côté Tunisien)
฀
Dr. Radhouane GDOURA Rapporteur
Dr. Bertrand AIGLE Rapporteur
 République Tunisienne
*******
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université de Toulouse Université de Sfax

Ecole Nationale Supérieure Ecole Doctorale Mécanique, Laboratoire de Génie Faculté des Sciences de Sfax Centre de Biotechnologie de Sfax
Agronomique de Toulouse Énergétique, Génie Civil Chimique Département des Sciences de la Vie Laboratoire de Microorganismes et de
et Procédés Biomolécules

THÈSE
Présentée à

La Faculté des Sciences de Sfax

(Département des Sciences de la Vie)
en vue de l’obtention du

DOCTORAT
Dans la discipline : Sciences Biologiques

par

Slim SMAOUI
Purification et Caractérisation de Biomolécules à partir de microorganismes
nouvellement isolés et identifiés

Soutenue le 26 Mai 2010, devant le jury composé de:

Pr. Néji GHARSALLAH Président

Dr. Radhouane GDOURA Rapporteur
Dr. Bertrand AIGLE Rapporteur
Pr. Jean Luc PERNODET Examinateur
Dr. Lotfi MELLOULI Directeur de thèse
Pr. Florence MATHIEU Directeur de Recherches
au LGC

2009--2010
ANNEE UNIVERSITAIRE 2009
 Dédicace
Je dédie ce travail à

Mon père Mohamed Néjib, pour ses encouragements incessants et son soutien moral aux

moments difficiles qui furent pour moi les meilleurs gages de réussite. Qu’il trouve dans ce

travail la preuve modeste d’une reconnaissance infinie et d’un profond amour.

Mon adorable mère Raoudha, qui est toujours présente et continue de l’être pour faire mon

bonheur. Merci pour être sacrifiée pour que ces enfants grandissent et prospèrent. Que dieu la

protège et lui donne bonne santé et qu’elle trouve ici la preuve de ma reconnaissance infinie.

Mes frères Morsi et Becem pour leur disponibilité, leur soutien moral, leur encouragement

incessant, d’être coopératif et d’assumer à ma place certaine de mes responsabilités familiales.

Ma fiancée Hajer d’être toujours à mes côtés pour me soutenir, pour m’aider dans la mesure

du possible, mais surtout pour donner du goût à ma vie par son amour et sa tendresse, j’espère

qu’elle trouve ici le témoignage de mon profond amour, attachement et respect.

Ma belle-famille pour leur soutien, gentillesse et sympathie, pendant cette thèse parfois

Envahissante, que dieu les protège et leurs donne une vie pleine de réussite et de bonheur.
 Remerciements
Le présent travail de thèse, qui entre dans le cadre d’un programme de recherche
CMCU (thèse co-tutelle), a été réalisé dans le Laboratoire de Microorganismes et de
Biomolécules (LMB) du Centre de Biotechnologie de Sfax (CBS) et au Laboratoire de
Génie Chimique (LGC-ENSAT-Toulouse-France) sous la direction de Monsieur Lotfi
MELLOULI (Directeur de thèse côté Tunisien) et Mme Florence MATHIEU
(Directrice de thèse côté Français).
Avec une rigueur et un intérêt constant, Monsieur Lotfi MELLOULI Maître de
Conférences au Centre de Biotechnologie de Sfax a dirigé ce travail avec beaucoup
d’enthousiasme en me faisant bénéficier de ses compétences scientifiques. Je tiens à
lui exprimer ma très grande reconnaissance et le témoignage de mon profond
attachement pour l’attention qu’il a porté à cette thèse, pour les encouragements, pour
la confiance qu’il m’a toujours témoignée, sa constante disponibilité et la gentillesse
dont il a fait preuve à mon égard.
Je tiens aussi à exprimer ma profonde gratitude au Pr. Florence MATHIEU, Directeur
du LGC, pour avoir accepté d’être la directrice côté Français de cette thèse. Son enthousiasme
et son dynamisme m’ont chaque fois permis de rebondir dans les moments difficiles. Je la
remercie vivement pour l’aide scientifique précieuse et tous les conseils qu’il a pu me fournir.
Je remercie également Monsieur Samir BEJAR Chef du Laboratoire de
Microorganismes et de Biomolécules du Centre de Biotechnologie de Sfax pour
l’intérêt qu’il a porté à ce travail.
Je profite de cette occasion d’exprimer ma profonde reconnaissance à Monsieur
Ahmed LEBRIHI, Professeur et Directeur de l’Ecole National Supérieur Agronomique
de Toulouse pour les encouragements et les conseils qu’il n’a cessé de me prodiguer
durant mes séjours au (LGC-ENSAT-Toulouse-France) et pour la confiance qu’il m’a
toujours témoignée.
Que Messieurs : Bertrand AIGLE, Maitre de Conférences au Laboratoire de Génétique
et de Microbiologie à la Faculté des Sciences et Technique de l’Université Henri
Poincarré- Nancy. Radhouane GDOURA, Maitre de Conférences au Laboratoire de
Microbiologie et Pathologie Humaine à l’Hôpital Habib Bourguiba, trouvent ici
l’expression de mes vifs remerciements pour avoir bien voulu être les rapporteurs de
cette thèse malgré leurs nombreuses occupations et pour l’honneur qu’ils me font en
acceptant de participer au Jury de cette thèse. Par ailleurs, Je tiens à avouer
sincèrement ma profonde gratitude à Monsieur Néji GHARSALLAH Professeur au
Laboratoire de Biotechnologie microbienne à la Faculté des Sciences de Sfax, de
l’honneur qu’il me fait d’avoir accepter de présider le jury de ma thèse.
Je remercie vivement Monsieur Jean Luc Pernodet, Directeur de recherche CNRS à
l’Institut de Génétique et Microbiologie à l’Université Paris Sud11 qui me fait
l’honneur, malgré ses importantes charges, d’accepter de juger mes travaux de thèse en
tant qu’examinateur. Je remercie Monsieur Yannick COPPEL, Ingénieur au
Laboratoire de Chimie de Coordination de Toulouse pour son aide précieuse et à sa
disponibilité pour la réalisation des analyses spectroscopiques. Je remercie encore, Pr.
Georges Merlina, Ingénieur de Recherches au Laboratoire d’Ecologie Fonctionnelle
(EcoLab) à l’Ensat pour son aide et la réalisation des analyses des Acides gras.
Mes remerciements vont également à tous les membres du Centre de Biotechnologie
de Sfax : étudiants, chercheurs, ingénieurs, techniciens, secrétaires… et en particulier
les Ingénieurs et les techniciens du l’unité analyse du CBS et plus précisément (Mr
Hedi Aouissaoui, Mme Najla Masmoudi et Mlle Lobna Jlaiel) pour leurs aides et les
facilités analytiques qu’ils m’ont offertes.

Je suis également très redevable à tous les ami(e)s du Laboratoire de Microorganismes

et de Biomolécules, du Centre de Biotechnologie de Sfax qui n’ont jamais été en
retrait pour apporter leur aide et en particulier: Belagacem, Ines, Monia et Kamel qui
ont été toujours prés de moi; je les remercie pour leurs soutien moral et matériel.
Hajer, Lobna, Ameny, Wacim, Mounira, Bassem Jaouadi, Bassem Khemakhem, et
Samiha, je les remercie pour l’ambiance et l’amitié que j’ai trouvée auprès d’eux.
Je voudrais témoigner ma reconnaissance à toutes les personnes qui m’ont également
fait bénéficier de leurs conseils et de leurs expériences au sein du Laboratoire de Génie
Chimique : Dr. Riadh Ben Hlima, Dr Walid TRABELSI, Mohammed Hussnin, Dr.
Nafees, Dr. Ali, Dr. André, Patricia, Dr. Noureddine, Dr. Rafik, Dr. Abdelghani,
Atika, Dr. Anne Claire, Dr. Caroline, Dr. Gwenaelle, pour lesquels je ne trouve pas les
mots justes pour décrire ce que j’éprouve envers eux après ces années passées
ensemble. J’ai beaucoup apprécié leurs qualités humaines et les échanges scientifiques
et culturels que nous avons eus Grand MERCI à tous.
 LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADN : Acide désoxyribonucléique

Ala : Alanine

ARNr : Acides Ribonucléiques Ribosomaux

Asn : Asparagine

ATB : Antibiotique

AWDA : Agar Well Diffusion Assay

BHI : Brain Heart Infusion

C : Cytosine

CCE : Chromatographie sur couche Epaisse

CCM : Chromatographie sur Couche Mince

COSY : Correlation Spectroscopy

CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse

CTC : Chlorotétracycline
d : Doublet

DAP : Acide Diaminopimélique

DCM : Dichlrométhane
dd : Doublet de doublet

DKP : Dicétopipérazine

DMSO : Dimethyl Sulfoxide

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

ESI : Inonisation Electrospry

G : Guanine

Gln : Glutamine

GRAS : Generally Recognized As Safe

H : Constante de plank
h : Heure
HCl : Acide chlorhydrique

His : Histidine

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence

Hz : Hertz

IE : Ionisation Electronique

Ile : Isoleucine

ISP : International Streptomyces Project

J : constante de couplage

kDa : Kilodalton

LAB : Bactéries Lactiques

LB : Luria Bertani

LCMS : Liquid chromatography-mass spectrometry

Leu : Leucine
M : molaire
m : Multiplet
MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time-Of-Flight mass
spectrometry

MeOH : Méthanol
MHz : Megahertz
min : minute
ml : millilitre
mm : millimètre
mM : millimolaire

MRS : Man, Rogosa and Sharpe

Mso : Sulfoximine de Méthionine

multi : Multiplicité
nm : nanomètre

NOE : Nuclear Overhauser Effect

NOESY : Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Orn : Ornithine

PAGE : Polyacrylamide gel electrophoresis

p-anisaldehyde : 4-méthoxy-benzaldehide

PC : Phosphatidylcholine

PCR : Polymerase Chain Reaction

PDA : Potato Dextrose Agar

PE : Phosphatidylethanolamine

PG : Phospholipides contenant de la Glucosamine

Phe : Phenylalanine

PMSF : Phenylmethanesulphonylfluoride
ppm : partie par million
Pro : Proline
q : Quadruplet
Rf : Rapport frontal

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire

s : Singulet

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

t : Triplet

TC : Tétracycline

TFA : Trifluoroacetic acid

Thr : Thréonine

TIR : Terminal Inverted Repeats

TRH : Thyrotropin-releasing hormon

Trp : Tryptophane
trs/min : Tours/min

TSB : Tryptic Soy Broth

Tyr : Tyrosine

UFC : Unité Formant Colonies

UV : Ultraviloet

Val : Valine
δ : Déplacement chimique
λ : longueur d'onde de la radiation
µm : micromètre
Φ : Diamètre
 Introduction générale

INTRODUCTION GENERALE

Depuis des milliers d'années, les êtres humains se servent des microorganismes (bactéries,
levures et moisissures) pour fabriquer des produits comme le pain, la bière, le fromage, etc.
Ces microorganismes, omniprésents dans notre environnement (le sol, l'air et les eaux) et dans
quelques aliments que nous consommons, ne cessent d’occuper une place de plus en plus
importante dans notre vie et sont actuellement à l’origine de l’essor du domaine de la
biotechnologie. En effet, ils sont doués de plusieurs activités importantes et peuvent être
considérés comme étant des agents performants de transformation et certaines espèces
permettent l'obtention de produits alimentaires fermentés stables à partir de matières premières
d'origine naturelle. Les microorganismes sont également des agents de dégradation et leurs
propriétés métaboliques et cinétiques peuvent être exploitées pour permettre l'hydrolyse,
l'oxydation, la nitrification, la dénitrification, l'élimination des sulfates et des phosphates ainsi
que la méthanisation des effluents polluants. De plus, les microorganismes sont de
remarquables agents de production et on leur doit la production de nombreuses molécules
organiques obtenues par fermentation et utilisées pour leurs propriétés fonctionnelles dans des
domaines extrêmement variés. Parmi ces molécules, on peut citer les alcools, les acides
organiques, les acides aminés, les polysaccharides, les vitamines, les enzymes, les
antibiotiques, les antifongiques, les bactériocines, etc. Malgré ce côté très bénéfique des
microorganismes, certains d’entre eux causent des problèmes majeurs pour l’humanité. Il
s’agit de bactéries, de levures unicellulaires et de champignons filamenteux pathogènes pour
l’homme. A ce propos, actuellement on assiste à un problème très épineux qui est la résistance
de ces microorganismes pathogènes aux molécules antibactériennes et antifongiques
communément utilisées. De plus, dans le domaine agro-alimentaire, les aliments que nous
consommons sont en grande majorité d’origine biologique (végétale ou animale) et les
modifications microbiologiques (par le développement de microorganismes altérants et
pathogènes) qu’ils subissent, les rendent très vite inconsommables et voir impropres à la
consommation. Pour combattre ces microorganismes pathogènes, plusieurs travaux de
recherche sont actuellement orientés vers la découverte de nouvelles molécules bioactives, à
savoir des antibiotiques, des antifongiques et des bactériocines, pour des applications

1
 Introduction générale

pharmaceutiques, agricoles (remplacement des pesticides chimiques par des molécules

bioactives naturelles) et agro-alimentaires.

Vue la complexité de la structure chimique des molécules bioactives, le moyen le plus

utilisé pour la recherche de nouvelles molécules actives est le moyen naturel qui consiste à
chercher ces molécules notamment à partir de microorganismes. Les bactéries actinomycètes
du genre Streptomyces, sont les meilleurs candidats pour la production de métabolites
secondaires biologiquement actifs. Ce genre bactérien est à l’origine d’environ 70 % des
molécules actives produites à l’échelle industrielle pour les applications pharmaceutiques.
Outre ces applications, les molécules bioactives extraites à partir des bactéries du genre
Streptomyces connaissent diverses autres applications à savoir en agriculture et en agro-
alimentaire. Plusieurs (bactéries et champignons filamenteux ou unicellulaires) sont des
pathogènes qui peuvent contaminer les aliments et par la suite infecter les consommateurs. A
ce propos, on peut citer les salmonelloses, les listérioses et les candidoses. Comme substances
naturelles couramment utilisées dans l’industrie agro-alimentaire afin de prévenir les
contaminations, on peut citer les bactériocines, famille de peptides synthétisés naturellement
par certaines bactéries notamment les bactéries lactiques (LAB).
Les travaux de recherche de la présente thèse s’inscrivent dans le cadre de la recherche
de nouvelles molécules bioactives à partir de microorganismes pour des applications
pharmaceutiques, agricoles et agro-alimentaires. C’est une thèse en cotutelle suite à un projet
cmcu (N° 06S 0901, MELLOULI/AIGLE, 2006/2009), entre le Laboratoire de
Microorganismes et de Biomolécules du Centre de Biotechnologie de Sfax (LMB-CBS), et le
Laboratoire de Génie Chimique du Département « Bioprocédés et Systèmes Microbiens »
ENSAT-France.
Durant les travaux de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l’étude de trois
souches bactériennes : deux du genre Streptomyces appelées TN17 et Fr10 et une bactérie
lactique appelée TN635. Les résultats obtenus ainsi que leurs discussions seront présentées en
trois chapitres comme suit :
- Le premier portera sur l’identification et la classification des deux souches
d’actinomycètes, TN17 et Fr10.
- Le deuxième chapitre sera consacré pour l’optimisation des conditions de production
des biomolécules de la souche TN17 ainsi que la purification des biomolécules des deux

2
 Introduction générale

souches TN17 et Fr10 et la caractérisation chimique des trois molécules biologiquement

actives de la souche TN17.
- Le troisième chapitre s’intéressera à la sélection et l’identification de la souche
TN635 ainsi qu’à la purification et la détermination des caractéristiques biochimiques et
microbiologiques de la bactériocine (Bac TN635) secrétée par cette souche.

3
 Synthèse bibliographique

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Les microorganismes sont utilisés depuis des milliers d'années pour la transformation des
produits alimentaires (boissons alcoolisées, pain, fromages, etc.). Plus récemment, et avec l’essor
de la biotechnologie, des procédés exploitant certaines caractéristiques de microorganismes ont
été développés, soit pour dégrader de nombreuses molécules organiques ou minérales afin de
dépolluer les sols, les eaux ou l'air, soit pour la production de plusieurs métabolites primaires et
secondaires ayant des valeurs ajoutées et des activités biologiques très importantes.
Bien que la plupart des micro-organismes soient très bénéfiques et inoffensifs pour
l'homme, les animaux et les plantes, malheureusement certains sont néfastes et pathogènes en
provoquant plusieurs maladies qui peuvent être très graves, et d’autres sont à l’origine de
plusieurs dégâts en agriculture. Pour combattre cette pathogénicité, l’homme a utilisé depuis
l’antiquité des pâtes moisies sur les plaies infectées et malgré les effets bénéfiques, il ne
comprenait pas le phénomène en question. En 1928, le microbiologiste Alexander Fleming a
constaté que l’une de ses cultures bactériennes, une souche de Staphylococcus aureus, était
envahie par la moisissure, Penicillium notatum. Cette observation miraculeuse était à l’origine
d’une des plus grandes révolutions du monde médical par l’ouverture de l’ère des antibiotiques.
Par cette observation, Fleming déduisait que Penicillium notatum avait secrété une substance qui
avait inhibé la croissance de la souche Staphylococcus aureus. Il a nommé cette substance la
pénicilline. En 1938, le Français René Dubos a purifié le premier antibiotique, la Gramicidine ce
qui a permis à Florey et Chain en 1939 de purifier la pénicilline G. Cet antibiotique a été utilisé
pour la première fois en médecine humaine en 1941 pour le traitement des infections
bactériennes. Depuis, la quête de nouveaux antibiotiques se poursuit de plus belle. Avec la
découverte des antibiotiques, l’humanité a disposé d’un moyen et d’un remède extrêmement
efficace contre les bactéries pathogènes qui l’accablaient depuis des millénaires.
Lors de la découverte des antibiotiques, le mot antibiotique (du grec anti : « contre », et
bios : « la vie ») désigne une substance naturelle qui a une action d’inhibition ou de destruction
spécifique contre les bactéries. Actuellement, cette définition s’est encore élargie pour devenir :
toute substance naturelle, semi-synthétique ou synthétique qui a le pouvoir d’inhiber ou détruire

4
 Synthèse bibliographique

des microorganismes (bactéries et champignons) et également d’avoir des actions anti-

inflammatoires, anti-suppresseurs et anti-tumorales.
Concernant l’action antifongique des antibiotiques, il est à noter que plusieurs de ces
molécules, notamment celles de la famille des macrolides, en plus de leurs activités
antibactériennes possèdent des activités antifongiques. Au contraire, un antifongique possède une
action spécifique uniquement contre les champignons.
Ci-après, nous allons développer ces deux types de molécules bioactives : les
antibiotiques et les antifongiques.

A. LES ANTIBIOTIQUES

I. Classification et mode d’action des antibiotiques

La diversité et la complexité des molécules antibactériennes rendent nécessaire leur
classification. Les antibiotiques peuvent être classés selon leurs modes d'action sur les agents
infectieux, en fonction des microorganismes qu’ils inhibent ou bien selon leurs structures
chimiques. En utilisant ce dernier moyen de classement, nous pouvons distinguer plusieurs
familles, elles mêmes divisées en plusieurs classes à savoir, les aminoglycosides, les β-
lactamines, les céphalosporines, les chloramphénicols, les glycopeptides, les lincomycines, les
macrolides, les quinolones, les sulfamides, les tétracyclines, les antibiotiques peptidiques, les
dérivés de dicétopipérazines, les peptides cycliques, etc.
Les antibiotiques doivent tuer ou inhiber les micro-organismes sans détruire nos cellules.
En effet, pour pouvoir être utilisable en pratique clinique, un antibiotique doit se caractériser par
une action spécifique sur les germes visés sans perturber le fonctionnement des cellules de l’hôte.
Comme le montre la figure 1, le mode d'action des antibiotiques varie d'une classe à une autre.
On distingue des antibiotiques :

I.1. Inhibiteurs de la synthèse du peptidoglycane

De nombreux antibiotiques inhibent la synthèse du peptidoglycane, composant essentiel de
la paroi des bactéries à Gram+ et à Gram-. La synthèse de la paroi bactérienne comporte trois
étapes successives : la première qui se passe à l'intérieur de la bactérie, consiste en la formation
des unités de base, l'UDP-N-acéthyl-glucosamine et l'UDP-N-acéthylmuramyl-pentapeptide. La

5
 Synthèse bibliographique

deuxième étape permet le passage par un système de transporteurs lipidiques à travers la

membrane cytoplasmique de ces deux précurseurs et leur addition pour former une molécule de
disaccharide-pentapeptide. Au cours de la troisième étape, cette molécule s'intègre au
peptidoglycane préexistant et, à ce stade, deux enzymes essentielles interviennent : une
transglycosylase qui permet l'attachement des disaccharides-pentapeptides entre elles aboutissant
à la formation des chaînes polysaccharidiques, et une transpeptidase qui réticule les chaînes entre
elles par formation d'une liaison peptidique entre l'alanine-4 d'un disaccharide –pentapeptide et le
peptide d'une chaîne voisine.

Chacune de ces trois étapes peut être perturbée par l'action des antibiotiques. Par exemple,
les β-lactames inhibent la dernière étape de la synthèse du peptidoglycane.

I.2. Inhibiteurs de la synthèse protéique

Plusieurs antibiotiques agissent au niveau du cycle des ribosomes et la biosynthèse des
protéines des microorganismes. Dans cette classe on peut citer :

* Les phénicols, qui se fixent sur le ribosome au niveau du site aminoacyl. Ils inhibent
l'élongation de la chaîne peptidique ce qui arrête le mouvement des ribosomes le long de l'ARN
méssager.
* Les tétracyclines, qui se fixent sur le ribosome au niveau du site aminoacyl et aussi au
niveau du site peptidyl. La conséquence est l'arrêt de la fixation du nouvel aminoacyl-tRNA sur
le ribosome et un arrêt de l'élongation des chaînes peptidiques.
* L'acide fusidique, qui en se liant au site aminoacyl, bloque l'adjonction d'un nouvel acide
aminé dans la chaîne peptidique en formation (blocage de la translocation).
* Les aminosides agissent sur divers métabolismes cellulaires dont la synthèse des
protéines. Ils pénètrent dans le cytoplasme par un mécanisme actif nécessitant de l'énergie
(systèmes de transporteurs d’électrons et ATP). Ces antibiotiques sont des inhibiteurs de la
traduction. En effet, ils provoquent des erreurs de lecture du message porté par l'ARN messager
ce qui engendre plusieurs perturbations : altération fonctionnelle de la membrane cytoplasmique,
blocage des systèmes de sécrétion et de respiration, etc.
* Les macrolides inhibent la synthèse protéique en se fixant sur la sous-unité 50S du
ribosome. Les macrolides empêchent la translocation et par suite l'incorporation des aminoacides.

6
 Synthèse bibliographique

I.3. Inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques et de leurs

précurseurs
Dans cette classe, on trouve deux groupes d'antibiotiques. Un premier agit directement sur
la synthèse des acides nucléiques, et un deuxième groupe intervient au niveau de leurs
précurseurs de synthèse. Dans le premier groupe on peut distinguer :
* Les quinolones qui agissent sur les enzymes réglant la conformation de l'ADN telque les
topoisomérases (essentiellement l'ADN gyrase). L'arrêt de l'activité de ces enzymes bloque tout
changement de conformation et toute synthèse d'ADN.
* Les nitroimidazoles sont des antibiotiques limités aux bactéries anaérobies. La condition
nécessaire à l'activité de ces antibiotiques est la réduction partielle de leurs groupements NO2.
Les dérivés réduits se fixent sur l'ADN, notamment au niveau des régions riches en adénine et en
thymine, provoquant ainsi des coupures des brins et le déroulement de l'ADN (Le Minor et
Veron, 1989).
* Les nitrofuranes nécessitent la réduction préalable du groupement NO2 pour leur action.
Cette réduction est réalisée par les nitroréductases des bactéries aérobies. Les dérivés réduits
réagissent de façon électrostatique avec l'ADN, provoquant ainsi des coupures, substitutions de
bases et même un effet mutagène.
Le deuxième groupe d'antibiotiques agit sur les précurseurs de synthèse des acides
nucléiques qui sont les folates. Ces derniers et en particulier l'acide tétrahydrofolique joue un rôle
essentiel dans la synthèse des bases puriques et pyrimidiques. Pour ce deuxième groupe, on peut
citer les sulfamides et les 2-4-diaminopyrimidines.

Comme nous venons de le décrire, on distingue plusieurs classes d’antibiotiques qui

diffèrent selon leur structure chimique mais également selon leur mode d’action. Plusieurs
travaux de recherche ont été effectués sur les différentes classes d’antibiotiques. Dans ce qui suit,
nous allons développer quelques aspects concernant la classe des antibiotiques peptidiques
cycliques. Au sein de cette classe, on distingue les dipeptides cycliques appelés encore les dérivés
dicétopipérazines (DKP) et les autres peptides cycliques. La classe d’antibiotiques peptidiques
cycliques intéresse de plus en plus des laboratoires de recherche vue leurs intérêts thérapeutiques
énormes et la possibilité d’obtention de nouvelles molécules hybrides à partir de ces deux classes
par les moyens génétiques.

7
 Synthèse bibliographique

Figure 1. Principaux cibles et modes d'action des antibiotiques ( Davies et Mazel, 1997)

II. Les dicétopipérazines

II. 1. Définition et historique

Les dicétopipérazines (DKP) sont des molécules ayant un cycle piperazine (pipérazine-2,5-
dione ou 2,5-dioxopiperazines ou 2,5 DKP), substitué en position 3- et 6- par des acides aminés
(R1 et R2). (Figure 2).

Figure 2 : Cycle pipérazine des dérivés des dicétopipérazines

8
 Synthèse bibliographique

Les dérivés de DKP constituent une nouvelle classe de métabolites secondaires qui sont
produits principalement par des levures, des champignons filamenteux et quelques bactéries
comme les Streptomyces (Ben Ameur Mehdi et al., 2004 ; 2006). D’autres ont été isolés à partir
d’organismes marins comme les éponges.
Les DKP ont été longtemps hors d’attention car plusieurs dipeptides cycliques formés à
partir des hydrolysats protéiques et trouvés dans les milieux de culture de divers
microorganismes, avaient été considérés comme étant des artéfacts de fermentation indésirables
résultant de la dégradation des polypeptides (Son et al., 1999). Cependant, il a été vérifié par
Fdhila et al., 2003 que les dicétopiperazines ne sont pas générés par stérilisation thermique ni
incubation du milieu de culture durant le processus de fermentation. En effet, ces dipeptides
cycliques ne sont pas détectés dans les profils HPLC des extraits obtenus à partir du milieu de
culture stérlisé sans inoculation.

II. 2. Propriétés biologiques des DKP

Au début, les dipeptides cycliques ont été synthétisés chimiquement. La formation d’un
DKP est une réaction secondaire classique qui résulte le plus souvent de la rupture par aminolyse
intramoléculaire d’une liaison ester et plus rarement d’une liaison amide, conduisant à un
dipeptide cyclique. Cette réaction secondaire qui peut se produire en milieu acide et basique est
bien connue du côté C-terminal (c’est-à-dire quand elle résulte de la rupture d’une liaison ester)
mais elle est rarement observée du côté N-terminal (c’est-à dire quand elle résulte de la rupture
d’une liaison amide). Plusieurs travaux sont encore réalisés pour comprendre ce phénomène (Mc
Cleland et al., 2004). Récemment, des molécules plus complexes possédant un cycle pipérazine-
2,5-dione ont retenu de plus en plus l’attention vue qu’elles présentent diverses activités
biologiques et pharmaceutiques intéressantes.

II.2.1. Intérêt thérapeutique

Les DKP possèdent des activités antimicrobiennes, antisupprésseurs, antitumorales,

antivirales et antiprotozoaires. Pour les activités antiprotozoaires, on peut citer la molécule dérivée
de dicétopipérazines, la diméthylhyalodendrine tetrasufite, utilisée contre le Plasmodium
falciparum, agent de la malaria (Nilanonta et al., 2003).

Les deux DKP, cyclo (L-leucyl-L-propyl) et cyclo (L-phenyl-L-propyl), isolés à partir de

souches de Streptomyces (Rhee et al., 2001; Rhee, 2002), possèdent des activités antimicrobiennes

9
 Synthèse bibliographique

contre les VRE (enterococci vancomycin resistants), Bacillus subtilis, Micrococcus luteus,
Staphylococcus aureus et Saccharomyces cerevisiae. Ces deux DKP inhibent également la
croissance de plusieurs lignées de cellules tumorales, à savoir : HL60 et W937 (leucémie humaine)
et SNU-1 (cancer de l’estomac) (Rhee, 2002). De plus, et à côté des deux DKP cyclo (L-leucyl-L-
prolyl) et cyclo (L-phenyl-L-prolyl), il a été rapporté que d’autres dérivés de DKP tels que :
l’ambewelamide, la verticilline et la phényl-ahistine possèdent des activités antitumorales sur
plusieurs lignées cellulaires (Williams et al., 1998). Des études hématologiques et anticancéreuses
ont permis de déduire que les dicétopipérazines à histidine (cyclo (His-Ala) et cyclo (His-Gly))
constituent une nouvelle génération potentielle d’agents cytotoxiques avec des effets anti-
thrombotiques (Lucietto et al., 2006). Egalement, il a été rapporté que les trois DKP : le cyclo (L-
His-L-Pro), le cyclo (L-Phe-L-Pro) et le cyclo (L-Pro-L-Tyr) agissent sur le système nerveux
central où ils modulent un nombre remarquable de comportement humain (Prasad, 1995). Ceci en
fait n’est pas surprenant si on considère la similarité structurale entre ces trois DKPs et les peptides
signaux endogènes chez l’être humain à savoir la « thyrotropin-releasing hormon TRH ».

Récemment, une nouvelle activité pharmaceutique des dipeptides cycliques a été

découverte en tant qu’agent anti-mutagénique contre les deux souches Salmonella typhimurium
TA98 et TA100 (Rhee, 2004). Cette importante propriété évitera la formation de mutants naturels
à haute virulence à partir de ces deux espèces de Salmonella.

II.2.2. Intérêt agronomique

Outre leurs intérêts thérapeutiques, les dicétopipérazines connaissent de plus en plus

d’applications dans le domaine agronomique. Le champignon Pyricularia oryzae est par exemple
un des agents qui cause l’amincissement du riz, et possède un pouvoir destructif très sévère. Ce
pathogène fongique attaque directement la plante de riz à partir de l’extrémité du tube de
germination, comme il peut aussi attaquer les autres parties de la plante et il y persiste plusieurs
années (Manandhar et al., 1998 a et b). Des efforts sont de plus en plus fournis pour remédier à
cette situation par l’utilisation d’antifongiques de différentes sources dont on peut citer, ceux
obtenus par voie naturelle à savoir un dicétopipérazine nouvellement isolé à partir du champignon
du milieu marin Porphyra yezoensis (Byun et al., 2003).

La figure 3, montre la structure chimique de deux dérivés de dicétopipérazines qui sont : cis
cyclo (L-Phe, L-Pro) et cis cyclo (L-Leu, L-Pro). Ces dérivés de DKP, ont été purifiés et

10
 Synthèse bibliographique

caractérisés chimiquement à partir de la souche de Streptomyces TN97 et possèdent des activités

antibactériennes et antifongiques (Mehdi Ben Ameur et al., 2006).

O
10
3
O
9
1
12 H
3' 3
1' N H3C
1
11 9 N
N 7
5' H 5 CH3 N 7
13
H 5

O
cis-cyclo(L-phenyl,L-prolyl) O
cis-cyclo (Leucyl-prolyl)

Figure 3. Structure chimique de deux dérivés de DKP : cis cyclo (L-Phe, L-Pro) et
cis cyclo (L-Leu, L-Pro) (Mehdi Ben Ameur et al., 2006)

III. Les autres peptides cycliques

En 1975, Ovchainnikov et Ivanov notaient que l’importance des cyclopeptides était liée à leurs
propriétés antibiotiques. Depuis, les peptides cycliques ont continué à faire l’objet de nombreux
travaux et de nouvelles propriétés biologiques sont apparues à savoir: activité cytotoxique vis-à-vis
des cellules tumorales et activité immunosuppressive. Dans ce qui suit, nous allons développer
quelques aspects des peptides cycliques allants de trois jusqu’à dix acides aminés.

• Les cyclotripeptides, très peu sont naturels et les structures publiées sont en fait des
cyclopeptides alcaloides produits soit par des plantes surtout de la famille des
Rhamnaceae soit par des éponges marines (Joullet et Nutt, 1983).

• Les cyclotetrapeptides, ces molécules sont souvent décrites comme des produits naturels et
possèdent plusieurs activités biologiques intéressantes. A ce propos, on peut citer la
Rhodopeptine isolée à partir d’une bactérie du genre Rhodococcus. Cette molécule possède
des activités antifongiques (Chiba et al., 1999). La molécule cyclotetrapeptide appelée

apicidin a été isolée à partir d’une souche de Streptomyces et possède des activités
antitumorales (Okada et al., 2006).

11
 Synthèse bibliographique

• Les cyclopentapeptides, ces molécules sont très peu décrites naturellement. On peut citer
dans ce cas la Viscumamide, Cyclo (Leu-Ile-Leu-Ile-Leu), isolée à partir de la plante
Viscum album (Okumura et Sakurai, 1973).

• Les cyclohexapeptides, ces molécules ont été caractérisées chez les plantes supérieures, les
éponges marines et les microorganismes notamment les champignons (Whyte et al., 2000).

• Les cycloheptapeptides forment une classe relativement importante et ont été isolés à partir
de microorganismes, d’organismes marins et de plantes supérieures. Comme exemple, la
Rhizonine A, est une mycotoxine hepatotoxique isolée à partir du champignon Rhizopus
microsporus (Potgieter et al., 1989).

• Les cyclooctapeptides, très peu de données existent sur la structure tridimensionnelle des
peptides cycliques de huit résidus. Cependant, quelques peptides naturels de cette taille ont
été isolés à savoir l’Agardhipeptine B, cyclo (Trp-Leu-Pro-Trp-Ala-Pro-Trp-Val) secrété
par une souche de cyanobactérie. Cette molécule ne présente pas d’activité biologique
(Shin et al., 1996). Au contraire, la Cyclolinopeptide D, cyclo (Pro-Phe-Phe-Trp-Ile-Mso-
Leu-Leu), produite par le spongiaire Hymeciacidon, présente une importante activité
immunosuppressive (Morita et al., 1999).

• Les cyclononapeptides, comme exemple, on peut citer le Cyclolinopeptide A, cyclo (Pro-

Pro-Phe-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Val) isolé à partir des graines de la plante de lin Linum
Usitatissimum. Ce peptide très hydrophobe possède une forte activité immunosuppressive
(Mann, 2001).

• Les cyclodécapeptides, le cas le plus connu est le Tyrocidine, qui est un décapeptide
cyclique « D-Phe-Pro-Phe-D-Phe-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu » produit au début de la
phase stationnaire de croissance de Bacillus brevis ATCC 8185 (Fûrbass et al., 1991). Ce
décapeptide a des activités antibiotiques contre plusieurs bactéries Gram+. Dans le
surnageant de la culture de Bacillus brevis, la Tyrocidine est en fait produite sous forme
d’un mélange de quatre décapeptides qui sont les Tyrocidines A, B, C, et D. La différence
entre eux réside au niveau des résidus Phe et Tyr qui sont remplacés par Trp. Chaque
Tyrocidine contient deux acides aminés dans la configuration D et le résidu L-ornithine

12
 Synthèse bibliographique

nonprotéinogénique. Comme autre cyclodécapeptide naturel, on peut citer la Gramicidine

S, (Phe-Pro-Val-Orn-Leu)2, produite par la souche Bacillus brevis ATCC 9999 et possède
des activités antibactériennes (Krätzschmar et al., 1989). Récemment, un nouveau
décapeptide (Figure 4) désigné stylopeptide 2 a été isolé et caractérisé à partir d’une
éponge marine appelée Stylotella sp. Cette molécule possède des activités
antibactériennes (Brennan et al., 2008).

Figure 4: Structure chimique du cyclodécapeptide, Stylopeptide 2 (Brennan et al., 2008).

B. LES ANTIFONGIQUES
Les antifongiques sont des molécules bioactives utilisées contre les champignons. Ces
organismes forment un groupe phylogénétique homogène constitué de champignons
macroscopiques et de champignons microscopiques (mycètes) à savoir les levures et les
moisissures qui peuvent être saprophytes ou parasites. Dans ce dernier cas, ils peuvent attaquer
soit l’être humain et on parle de mycose, soit les plantes causant ainsi des maladies
cryptogamiques.

13
 Synthèse bibliographique

I. Les antifongiques luttant contre les mycoses

Les mycoses sont des maladies provoquées par des champignons microscopiques qui
touchent l’être humain. Elles sont à l’origine de plusieurs infections qui peuvent être soit
superficielles, sous-cutanées ou encore systémiques.
Pour lutter contre les mycoses, divers antifongiques sont utilisés. Actuellement, l'emploi
du terme antifongique s'est élargi pour inclure à côté des produits naturels élaborés au cours du
métabolisme secondaire de certains micro-organismes, des composés synthétiques et semi-
synthétiques. Selon l'activité qu'il exerce, un antifongique peut avoir un effet fongistatique (arrête
la croissance des champignons) ou fongicide (détruit complètement la cellule fongique).
Comparé aux infections bactériennes, le traitement des mycoses est souvent beaucoup plus
difficile. Cela s’explique par le fait que les cellules des mycètes sont très proches des cellules
humaines et animales, ainsi les produits qui sont toxiques pour le champignon pathogène peuvent
l’être aussi pour les cellules de leurs hôtes. Par conséquent, la mise au point de drogues ayant une
activité antifongique est délicate car ces composés peuvent perturber également le
fonctionnement des cellules hôtes.
Jusqu’à nos jours, les antifongiques les plus utilisés pour le traitement des mycoses sont
des molécules macrolides polyèniques. Toutes ces molécules sont cycliques, fermées par une
liaison ester interne et comprennent deux parties : une partie apolaire rigide constituée de doubles
liaisons conjuguées (2 à 7), et une partie polaire comportant un grand nombre de groupes
hydroxyles et un aminosucre qui est généralement la mycosamine (André et Leroy, 2004). Leur
spectre antifongique est très large et ne se limite pas aux micromycètes puisqu’ils sont actifs sur
certains protozoaires ou algues, mais ils ne possèdent aucune activité antibactérienne ou
antivirale. L’exemple type des macrolides polyèniques est l’amphotéricine B (Figure 5). Cette
dernière, secrétée par Streptomyces nodosus, est une molécule de référence qui représente le
premier antifongique d’administration intraveineuse et qui possède un effet fongicide le plus
efficace (Baginski et al., 2005).

14
 Synthèse bibliographique

Figure 5 : Structure chimique de l’amphotéricine B

Les effets de l’amphotéricine B sur les cellules fongiques sont multiples : l’étape initiale
de toxicité consiste en une interaction avec les stérols des membranes plasmiques pour former des
pores. Ce phénomène entraîne immédiatement un déséquilibre ionique à l’intérieur de la cellule
du champignon en particulier au niveau des ions monovalents Na+ et K+ et altère la perméabilité
cellulaire. Les pores (ou canaux) résultant de l’agrégation de plusieurs molécules de
l’amphotéricine B à l’intérieur de la bicouche lipidique de la membrane fongique, forment une
sorte de cylindre creux par lequel peuvent fuir les ions et les constituants cellulaires essentiels du
champignon (Baginski et al., 2005).
Malgré leur efficacité, les antifongiques polyèniques trouvent des limitations
d’applications en thérapeutique vue leur toxicité vis-à-vis des cellules hôtes. Ces effets
indésirables des polyènes sur les cellules eucaryotes des mammifères peuvent s’expliquer par
l’interaction de ces agents avec le cholestérol (Yilma et al., 2007) « présent essentiellement dans
le cerveau, le tissu nerveux est également le précurseur de plusieurs hormones comme la
progestérone, le cortisol, l’aldostérone, etc. ». En effet, le cholestérol humain a une structure très
proche de celle de l’ergostérol fongique, cible préférentielle des polyènes, d’où la toxicité de ce
type de molécules antifongiques. Ces dernières provoquent généralement une toxicité surtout
rénale (Knopik-Skrocka et al., 2003).

Actuellement, l’attention est de plus en plus orientée vers la recherche de molécules

antifongiques non polyèniques ayant comme sites d’action des cibles autres que l’érgostérol.
Globalement, on distingue deux types de macrolides non polyèniques :

15
 Synthèse bibliographique

• Les macrolides non polyèniques ayant surtout des activités antibactériennes. Leur
première utilisation en médecine remonte à 1952, date de la découverte de l'érythromycine
(Vara et al., 1989). Ils constituent un groupe d'antibiotiques surtout actifs sur les bactéries
Gram+, et sont très utilisés actuellement en milieu hospitalier pour le traitement des
infections microbiennes (Olano et al., 1998). Ces antibiotiques sont constitués d’un
macrocycle porteur d'une fonction lactone, sur laquelle viennent se greffer deux ou
plusieurs sucres dont l'un est aminé.
• Les macrolides non polyèniques ayant des activités surtout antifongiques. Ces derniers,
peuvent également avoir en plus des activités antibactériennes contre les Gram+. Ce genre
de molécules trouve des applications en médecine mais surtout des applications de plus en
plus dans le domaine agricole pour lutter contre les phytopathogènes causant des maladies
cryptogamiques.

II. Les antifongiques luttant contre les maladies cryptogamiques

Une maladie cryptogamique est une maladie causée par un champignon microscopique
parasitant une plante. Les différentes formes de maladies cryptogamiques représentent environ
90% des maladies des végétaux. Pour que la maladie d’une plante se développe, trois
composantes sont nécessaires : la plante et le pathogène, qui doivent se mettre en contact et
interagir, et les conditions de l’environnement qui favorisent la prolifération du pathogène
(Bouzid, 2002).

II. 1. Evolution générale d'une maladie cryptogamique

Une série d’événements s’opère et conduit au développement de la maladie. Ces
événements sont l’inoculation, la pénétration, l’infection, la dissémination du pathogène et la
conservation du pathogène (Bouzid, 2002).

II. 1. 1. L’inoculation

L’inoculation se réalise quand un pathogène se met en contact avec une plante. Les
propagules du champignon pathogène (spores, sclérotes, fragments mycéliens,…) qui se déposent

16
 Synthèse bibliographique

sur la plante sont appelées inoculum. Un inoculum en conservation provoque une contamination
primaire.

II. 1. 2. La pénétration

Le fragment mycélien ou le tube germinatif d’une spore en germination pénètre dans la

plante directement, par les ouvertures naturelles (stomates, lenticelles,…) ou par des blessures.

II. 1. 3. L’infection

L’infection commence quand le pathogène s’installe dans les cellules ou tissus sensibles
de la plante hôte et s’en procure des éléments nutritifs. Ainsi, le pathogène se multiplie de façon à
envahir la plante plus ou moins rapidement. Quand l’infection s’installe, les symptômes, qui sont
les changements visibles dus à la maladie, apparaissent. La période entre l’inoculation et
l’apparition des symptômes est appelée incubation. Nombreuses substances telles que les
enzymes, les toxines et autres sont libérées par les pathogènes dans les plantes hôtes. Elles
affectent l’intégrité structurale et les processus physiologiques des cellules hôtes. Pour réagir aux
pathogènes, les plantes hôtes répondent par divers mécanismes de défense, aboutissant à
différents degrés de protection allant de la sensibilité à la résistance.

II. 1. 4. La dissémination du pathogène

Les spores du champignon sont activement transportées par le vent. Pour la plupart des
cas, les spores sont passivement transportées par différents vecteurs tels que l’eau, l’air, les
semences, les animaux, l’homme, etc.

II. 1. 5. La conservation du pathogène

Les pathogènes se conservent principalement sous forme de spores, mais aussi sous forme
de fragments mycéliens et de sclérotes. Ils se conservent dans le sol, les débris des plantes
infectées et dans les semences. Les spores de dissémination, telles que les conidies se conservent
quelques semaines tandis que les spores de conservation (chlamydospores, téliospores,
ustilospores) peuvent se conserver plusieurs années. Les spores de dissémination sont produites
activement par les champignons durant la saison favorable pour propager la maladie tandis que les
spores de conservation sont produites par les champignons pour surmonter la saison défavorable
(Bouzid, 2002).

17
 Synthèse bibliographique

II. 2. Exemples de maladies cryptogamiques

II. 2. 1. La fusariose

La fusariose est une maladie causée par des champignons du genre Fusarium qui vivent
dans le sol, et attaquent de nombreuses plantes (Amzelloug, 1999). Il existe plusieurs espèces
recensées de ce champignon dont à savoir Fusarium oxysporum. Ce dernier est un agent
vasculaire qui se conserve dans le sol sous forme de chlamydospores et infecte les plantes via les
racines qu'elles pénètrent directement ou par des blessures d'origine mécanique ou biologique
(percées des racines secondaires, piqûres de nématodes,...). Les maladies dues à l’espèce F.
oxysporum sont largement répandues dans le monde. Elles sont dommageables pour de
nombreuses plantes maraîchères (tomate, cucurbitacées,…) et ornementales (œillet), ainsi que
pour des cultures en plein champ telles que le coton, le bananier (la maladie de Panama) et le
palmier dattier (maladie du Bayoud) causée par Fusarium oxysporum albedinis (Foa). Ce
champignon qui se trouve dans le sol, pénètre par les racines en cheminant la sève et envahissant
le bourgeon terminal du palmier dattier. Par conséquent, il provoque un desséchement puis un
dépérissement rapide des arbres. Le bayoud ou la fusariose du palmier dattier se caractérise par sa
résistance à la sécheresse et par sa capacité de rester dangereux après plus de trente ans passés
sous sol. Il est également très prolifique soit par le repiquage de rejets apparemment sains, soit par
l’irrigation, soit par les vents de sables qui peuvent transporter de minuscules éléments végétaux
(El Hadrami et al., 1998).

II. 2. 2. La verticilliose

La verticilliose est une maladie causée par des champignons du genre Verticillium comme
Verticillium dahliae qui se conserve dans le sol sous forme de microsclérotes. Il infecte aussi bien
les arbres fruitiers (abricotier, amandier, etc.) et les plantes maraîchères (Solanacées,
Cucurbitacées). Le champignon émet ses filaments qui pénètrent dans le système vasculaire de
l’arbre. Il s’y développe en se ramifiant vers les parties aériennes où il entrave la circulation de la
sève, provoquant le dessèchement de la ramification atteinte. Cette maladie est la plus grave pour
l’olivier et provoque des pertes très importantes (Matallah et al., 1997 ; Bellahcene et al., 2000).
Les méthodes de luttes utilisées contre les phytopathogènes sont généralement chimiques.
Ces fongicides agissent contre les champignons en dissolvant ou détruisant les membranes
cellulaires, en inhibant la synthèse de certaines substances des parois cellulaires et en complexant

18
 Synthèse bibliographique

ou inactivant certains coenzymes essentiels. Ces fongicides peuvent être organiques à savoir des
dérivés de composés aromatiques, hétérocycliques, des quinones ou inorganiques comme les
composés soufrés, carbonatés et phosphatés. Cependant, l’utilisation massive des fongicides
chimique a engendré des problèmes très graves sur l’environnement, la faune et la flore. Il est
donc grand temps de limiter voir même d’interdire leur application et les remplacer par des usages
biologiques. Actuellement, la tendance est orientée vers la lutte biologique selon deux approches :
- la première par le biais de microorganismes antagonistes. Elle consiste à utiliser des
microorganismes antagonistes qui se trouvent normalement dans la nature. Leur mode d’action
peut être par parasitisme direct, par concurrence ou effet toxique. Pour accroître l’efficacité de ces
microorganismes, l’homme essaie de les introduire dans les sols en grande quantité ou de stimuler
leur croissance. Il est à noter que cette méthode présente l’inconvénient de provoquer un risque de
deséquilibre de la composition de la flore microbienne du sol.
- La deuxième utilisant des molécules antifongiques produites par voies naturelles. Elle
consiste à isoler et à sélectionner des microorganismes capables de synthétiser des molécules
antifongiques non polyèniques naturelles.
Pour ces deux approches, les Streptomyces sont les candidats les plus potentiels pour
l’utilisation en lutte biologique. Environ 60% des antifongiques naturels développés en agriculture
ont pour origine des actinomycètes du genre Streptomyces (Tanaka et Omura, 1993).

A ce propos, nous pouvons citer la souche de Streptomyces sp. US80 qui produit trois
molécules macrolides non polyéniques qui sont : l'irumamycine, le X-14952 B et le 17-Hydroxy-
venturicidine A. Les deux premières molécules ont été déjà décrites à partir de deux souches de
Streptomyces (chacune produit une molécule). La structure chimique totale de la troisième
molécule n’a jamais été rapportée. La souche de Streptomyces sp. US80 est la seule bactérie
capable de produire ces trois molécules macrolides simultanément (Fourati et al., 2005).
Ces auteurs, après des études in vitro, ont essayé de tester, en pots, les activités antifongiques de
l’extrait brut d’une culture de la souche de Streptomyces US80 contre un champignon
phytopathogène, qui est le Fusarium oxysporum, responsable de la pourriture racinaire et du
flétrissement de la plante de tomate. Comme le montre la figure 6, l’étude in vivo a permis de
constater qu’il y a une absence totale des symptômes sur la plante inoculée par le champignon
phytopathogène puis traitée par une solution de l’extrait sec actif de la culture de la souche de

19
 Synthèse bibliographique

Streptomyces US80. La plante inoculée puis traitée se comporte comme la plante témoin saine
non infectée par le Fusarium oxysporum. Par contre pour la plante inoculée et non traitée par les
activités antifongiques de l’extrait actif de la souche de Streptomyces US80, il a été observé le
flétrissement des feuilles et par la suite la mort totale de la plante.

20
 Synthèse bibliographique

A T1 T2 T3

B T1 T2 T3

C T1 T2 T3

Figure 6 : Effet des activités antifongiques sur la croissance de la plante de tomate en fonction
du temps (T1 : 7 jours, T2 : 15 jours et T3 : 26 jours) en présence et en absence du Fusarium
oxysporum . A : Plante inoculée par Fusarium oxysporum et non traitée par l’extrait actif. B :
Plante de tomate inoculée par Fusarium oxysporum puis traitée au cours du temps par l’extrait
actif de la souche de Streptomyces US80. C : Plante de tomate saine (témoin), non inoculée.

21
 Synthèse bibliographique

C. LES STREPTOMYCES
Les Streptomyces (du grec Streptos : courbé, tordu et Myces : moisissure) sont des bactéries
filamenteuses à Gram+ et sporulantes (Molnar, 1994) dans des conditions de stricte aérobiose.
Elles appartiennent à la classe des Actinomycètes (groupes de bactéries filamenteuses et
ramifiées) (Larpent et Sanglier, 1989; Holt et al, 1994), à l'ordre des Actinomycétales et à la
famille des Streptomycetaceae (Waksman et Henrici, 1943; Kutzner, 1981) et appartient au
groupe des Streptomycetes.

I. Caractéristiques générales
I.1. Cycle de développement
Les Streptomyces ont un cycle de développement complexe qui se divise en plusieurs
étapes. Sur milieu solide (Figure 7), il débute par la germination d’une spore qui donne naissance
à un mycélium primaire formé d’hyphes non septés et plurinuclés, ramifié et ancré dans le milieu
solide. Un mycélium aérien se développe sur ce mycélium primaire. En effet ce dernier s’autolyse
et les produits de la lyse sont cannibalisés par le mycélium aérien. Les extrémités des hyphes
aériens se spiralisent puis se cloisonnent et se différencient pour former des chaînes de spores
uninuclées, ces spores sont des agents de dissémination.

Figure 7 : Cycle de développement des Streptomyces sur milieu solide (Hopwood et al., 1985)

En milieu liquide, les cellules se développent uniquement sous forme de mycélium

primaire, même si de très rares Streptomyces peuvent sporuler dans cet environnement. En milieu

22
 Synthèse bibliographique

solide, une différentiation morphologique est donc observée (formation du mycélium aérien)
tandis qu’en milieu liquide, la différentiation est généralement physiologique.

I.2. Importance Industrielle

La différenciation morphologique des Streptomyces est accompagnée d’une différenciation
métabolique. En effet, en milieu liquide et à la fin du cycle biologique, les Streptomyces
produisent un grand nombre de métabolites secondaires possédant des structures chimiques et des
activités biologiques très variées qui n’existent dans aucun autre genre bactérien. Les
Streptomyces produisent essentiellement la moitié des antibiotiques connus et plus de 70 % des
antibiotiques produits industriellement. Cette diversité considérable de composés biologiquement
actifs a pour conséquence la grande importance des Streptomyces dans l’industrie pharmaceutique
puisque les molécules produites par fermentation sont la deuxième source de revenus de
l’industrie biotechnologique après la brasserie (Thomson et al., 2004). Ces bactéries sont
considérées comme le paradigme des microorganismes capables de synthétiser des molécules
naturelles par le biais de leur métabolisme secondaire. L'espoir que ces bactéries soient à nouveau
une source majeure de découverte de nouveaux composés utiles est apparu suite au séquençage
des génomes de plusieurs Streptomyces (Bentley et al., 2002 ; Ikeda et al., 2003). En effet,
l'analyse fonctionnelle des gènes a révélé que les prédispositions génétiques de ces
microorganismes à produire des métabolites secondaires étaient très sous-estimées. Ces bactéries
possèdent en réalité un grand nombre de métabolites « cachés » ou « cryptiques ». Si on arrive à
induire la production de ces métabolites cryptiques, il serait possible d’obtenir plusieurs nouvelles
molécules d'intérêts thérapeutique et industriel.

I.3. Le génome des Streptomyces

Le génome des Streptomyces se caractérise par un contenu élevé en guanine et cytosine (G +
C). Cette richesse varie de 60% à 80%, selon la nature des gènes et des espèces, ce qui résulte un
usage des codons hautement biaisé par les Streptomyces avec une dominance remarquable de G
ou C à la troisième position du codon variant de 76 à 98% (Frank et Bibb, 1992).
L'ADN chromosomique des Streptomyces a une taille moyenne estimée par des
expériences d'électrophorèse en champs pulsé, d'environ 8000 kilobases (Gladek et Zakrzewska,

23
 Synthèse bibliographique

1984). C'est l'un des plus grands génomes bactériens. En effet, la taille des chromosomes
bactériens varie de 580 kb pour Mycoplasma genitalium, bactérie parasitaire à Gram+, à 9450 kb
pour Myxococcus xanthus (Goldman et al., 2006). Les Streptomyces sont les rares bactéries ayant
un chromosome linéaire avec une origine de réplication oriC localisée au centre du chromosome
(Kolsto, 1997). La séquence des bouts du chromosome des Streptomyces a montré de part et
d’autre de l’oriC des répétitions terminales inversées appelées TIR (Terminal Inverted Repeats)
dont la taille varie considérablement de 25 kb à 550 kb suivant les espèces. Chez la souche
S. ambofaciens, leur taille est d'environ 210 kb (Leblond et al., 1996).

II. Identification et classification des Actinomycètes « Streptomyces »

II. 1. Généralités
La taxonomie est une science ayant pour objectif de décrire les organismes vivants et de
les regrouper en entités appelées taxons (familles, genres, espèces, etc) afin de pouvoir les
nommer et les classer. Chez les bactéries, les taxons sont dans l’ordre hiérarchique : divisions,
classes, sous-classes, ordres, familles, sous-familles, tribus, sous-tribus, genres, sous-genres,
espèces et sous-espèces. Cependant parmi ces rangs hiérarchiques, il y a quelques uns qui sont
très peu utilisés. Par conséquent, pour une bactérie donnée on peut attribuer des rangs et pas
d’autres. Différentes approches taxonomiques sont utilisées pour la classification des bactéries :

II.1.1. La Taxonomie phénétique

Depuis la classification proposée par Cohn en 1872 et jusqu'au début des années 1960, la
définition d'une espèce (et d'une manière générale toute la taxonomie bactérienne) reposait sur
une classification phénétique ou phénotypique. Cette dernière utilise un faible nombre de
caractères considérés comme importants tels que la morphologie, la présence d'une spore, la mise
en évidence d'un caractère biochimique jugé essentiel, l'habitat, le pouvoir pathogène... Une
classification phénétique a l'inconvénient de ne refléter qu'une quantité d'information réduite.

II.1.2. La Taxonomie numérique

En 1957, Sneath développe une taxonomie qualifiée de numérique pour les bactéries. La
méthode consiste à étudier, pour chaque souche, plus d'une centaine de caractères
morphologiques, biochimiques, culturaux, structuraux... et à attribuer le même poids à chacun des

24
 Synthèse bibliographique

caractères qui sont codés 1 (présence du caractère) ou 0 (absence du caractère). Le but recherché
est de rassembler dans une classe de similitude les individus les plus semblables.

II.1.3. La Taxonomie phylogénétique

Dès 1936, Kluyver et van Niel proposaient l'utilisation d'une taxonomie phylogénétique,
mais les outils nécessaires au développement d'une telle taxonomie n'étaient pas disponibles et il
fallut attendre la deuxième moitié du 20ème siècle pour qu'une taxonomie phylogénétique
commence à se mettre en place.

* Détermination du (G+C %)

En 1949, Chargaff et al., montrent que le contenu en bases puriques et en bases

pyrimidiques de l'ADN pouvait varier, mais qu'il était relativement constant pour les individus
d'une même espèce. Chez les bactéries, les valeurs du (G+C %) sont très dispersées et elles
varient de 25 à 75 %. Actuellement, on admet que des bactéries dont les (G+C %) diffèrent de
plus de 5 % ne peuvent appartenir à une même espèce et que des bactéries dont les
(G+C %) diffèrent de plus de 10 % ne peuvent appartenir à un même genre. Bien sûr, des
valeurs du (G+C %) identiques n'impliquent pas que les bactéries sont proches car les bases
peuvent être disposées de manière très différente sur l'ADN.

* Etude des ARNr

Chez une bactérie, les gènes qui codent pour les ARNr sont organisés en opérons. Ces
opérons existent en un ou plusieurs exemplaires sur le chromosome. Le nombre de copies est
grossièrement corrélé à la taille du génome et à la vitesse de croissance des bactéries. L'ARNr
16S est le plus utilisé et le séquençage des gènes correspondants peut être automatisé et les
données concernant ces molécules s'accumulent en permanence. L'utilité du séquençage des
ARNr 16S est reconnue par tous les taxonomistes mais, comme cette technique n'analyse qu'une
faible partie du génome, elle ne permet pas de différencier les espèces proches les unes des
autres. En revanche le séquençage des ARNr 16S est très utile pour classer les bactéries dans un
rang hiérarchique supérieur à l'espèce. Pour Stackebrandt et Goebel 1994, lorsqu'il existe moins
de 97% de similarité entre les séquences des ARNr 16S de deux souches, ces souches
appartiennent à des espèces différentes. Par contre, si le pourcentage de similarité est égal ou

25
 Synthèse bibliographique

supérieur à 97, le placement de deux souches dans une unique espèce ou dans deux espèces
différentes doit reposer sur les résultats des hybridations ADN-ADN.

* Les hybridations ADN-ADN

Les hybridations ADN-ADN se sont révélées essentielles pour la définition d'une espèce
bactérienne. Leurs réalisations n'ont été possibles qu'après la découverte par Marmur (1961) du
phénomène de renaturation de l'ADN. Les hybridations ADN-ADN, utilisées en bactériologie,
sont réalisées à partir d'un mélange de deux ADN dénaturés provenant de deux bactéries
différentes. En fonction des similitudes de séquence, deux types de duplex hétérologues peuvent
se former : Si les ADN des deux bactéries présentent des similarités importantes, il se produit
d'abord un appariement étroit au niveau d'un segment qui porte des bases complémentaires (site
de nucléation), puis le duplex se complète de proche en proche. Si les ADN des deux bactéries
ont des séquences très différentes, il peut se produire un appariement au niveau de quelques bases
complémentaires situées dans une zone limitée, mais le reste des fragments ne s'associe pas ou
seulement par quelques liaisons hydrogène éparses.

II. 2. Identification des actinomycètes « Streptomyces »

Les actinomycètes comprennent des formes peu évoluées comme le genre
Mycobacterium ou très évoluées, comme le genre Streptomyces qui forme un véritable mycélium
non fragmenté et sporulant. La taxonomie des actinomycètes est basée sur plusieurs critères :
morphologiques, chimiques, physiologiques et moléculaires. L’identification des genres est
facilitée par les études morphologiques tandis que les critères physiologiques et moléculaires
(ex : hybridation ADN- ADN) séparent les espèces.
Cohn, dès 1875 décrit le premier actinomycète et deux années plus tard, Harz (1877) isola
Actinomyces bovis, agent responsable des actinomycoses du bétail (Lechevalier et Lechevalier,
1970a). Durant les 30 dernières années, la taxonomie des actinomycètes a évolué
considérablement. Elle fut marquée par quatre périodes essentielles dont chacune a apporté de
nouveaux critères de classification.
Durant la première période, seuls les critères macro et micro morphologiques (mycélium
fragmenté ou non, présence ou non de mycélium aérien, couleur des mycélia, production de
spores, etc.) permettaient de différencier les genres entre eux. Ceci a donné lieu à la création de

26
 Synthèse bibliographique

nombreux genres dont les limites entre eux n’étaient pas toujours nettes, ce qui a engendré
beaucoup de confusion (Waksman, 1943).
La seconde période voit l’utilisation de la chimiotaxonomie basée sur la composition
cellulaire en acides aminés (Becker et al., 1964), en sucres (Lechevalier et Lechevalier, 1970b),
en acides mycoliques (lipides pariétaux complexes et insaturés) (Mordarska et al., 1972) en
phospholipides membranaires (Lechevalier et al., 1977; Minnikin et al.,1977) et en
ménaquinones membranaires (collins et al., 1980). La chimiotaxonomie, combinée aux critères
morphologiques, fut d’un apport essentiel pour distinguer de nombreux genres entre eux, tels par
exemple, Streptomyces de Nocardia (Becker et al., 1964), Actinomadura de Nocardiopsis (Grund
et Kroppenstedt, 1990) ou encore certains genres apparentés phylogénétiquement aux
actinomycètes mais n’ayant pas un véritable mycélium, comme Corynebacterium, Cellulomonas,
Clavibacter, etc. (Bergey, 1989).
La troisième période qui a débuté dans les années 70 et a trouvé son apogée entre 1980 et
1990, combine l’outil informatique à de nombreux tests physiologiques pour différencier les
espèces de chaque genre entre elles. Ainsi est née la taxonomie numérique avec l’obtention de
dendrogrammes qui ont permis d’apporter beaucoup de clarté au niveau de la composition en
espèces des genres Rhodococcus (Goodfellow et Alderson, 1977), Nocardia (Orchard et
Goodfellow 1980), Streptomyces (Williams et al.,1983), Actinomadura (Athalye et al.,1985),
Nocardiopsis (Grund et Kroppenstedt,1990) et Actinophanes (Goodfellow et al., 1990).
La quatrième période a débuté durant les années 80 et s’étend jusqu’à l’heure actuelle.
Elle consiste en l’application des méthodes d’analyses génétiques et moléculaires, notamment
l’hybridation ADN-ADN et le séquençage de l’ARN ribosomique 16S, qui ont permis de tracer
toute la phylogénie des actinomycètes (Stackebrandt et Kroppenstedt 1987; Kinoshita et al.,
1999; Hu et al., 2004). Grâce au séquençage de l’ARN 16S, certains genres bactériens non
mycéliens furent inclus dans l’ordre des Actinomycetales, tandis que d’autres en furent exclus.
Le genre Streptomyces se distingue des autres genres bactériens par des caractéristiques
chimiques (présence de l'isomère de l'acide L-L-diamino-pimélique (DAP) et de glycine dans
leurs parois), et morphologiques (production de chaînes de spores). Il comprend de nombreuses
espèces dont la classification repose sur plusieurs critères telles que la détermination de la
couleur de différents milieux après croissance des souches, la croissance possible à 4°C, la
production de métabolites spécifiques ou la morphologie des chaînes de spores. D'autres critères

27
 Synthèse bibliographique

peuvent être également employés comme la tolérance au chlorure de sodium, la production de

molécules odorantes (Dietz, 1988).
Généralement, plusieurs techniques sont associées pour l’identification et la classification
des souches du genre Streptomyces:
• Coloration de Gram et observation microscopique.
• Aspect macroscopique et caractères culturaux. L’aspect phénotypique et les
caractères culturaux sont déterminés sur des milieux de cultures spécifiques à
savoir des milieux ISP (Petrosyan et al., 2003).
• Analyse chimique des constituants de la paroi cellulaire. Il s’agit de déterminer les
différents isomères de l’acide 2,6-diaminopimélique et les sucres pariétaux de la
paroi.
• Caractères physiologiques et biochimiques : il s’agit de suivre la croissance de la
souche à différentes températures, à différents pH, en présence de différentes
concentrations en NaCl, etc.
• Et hybridation ADN-ADN.
Il est à noter que chez les Streptomyces, les deux moyens largement utilisés pour
l’identification de ce genre bactérien, sont d’une part le suivi des aspects macroscopiques et des
caractères culturaux sur milieux de cultures spécifiques, et d’autre part, l’analyse de la séquence
nucléotidique du gène ARNr 16S. Ces deux moyens ont permis l’identification de plusieurs
souches appartenant à ce genre bactérien (Mellouli et al., 2003 ; Fourati et al., 2005 ; Ben Ameur
et al., 2006). Mehling et al, 1995 ont testé plusieurs amorces afin d'amplifier les gènes ARNr16S
des souches de Streptomyces. Quatre amorces (P1, P2, P3 et P4), ont été retenues pour leur
fiabilité d'amplification (Tableau 1).

Tableau 1: Séquences nucléotidiques et positionnement des amorces P1, P2, P3 et P4

sur les gènes ARNr16S (Mehling et al, 1995).

Amorces Séquences nucléotidiques 5' 3' Position (nt)

P1 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 8

P2 GTGGGCAATCTGCCCTTGCACTCT 120

P3 GTGAGTCCCCAGATCACCCCGAAG 1100

28
 Synthèse bibliographique

P4 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 1530

III. Production de métabolites secondaires

La production microbienne de métabolites secondaires est généralement influencée et

connectée au métabolisme primaire de la souche productrice. Les métabolites intermédiaires à
l'issue du métabolisme primaire servent de précurseurs pour la biosynthèse de ces métabolites
secondaires bioactifs. En effet, la composition du milieu de culture influence les capacités
métaboliques de l'organisme producteur ainsi que la biosynthèse de métabolites secondaires. Pour
découvrir de nouveaux composés ayant une bioactivité prometteuse, plusieurs méthodes
onéreuses, comme la recherche de nouveaux microorganismes producteurs par criblage de
différentes sources biologiques particulières, ont été utilisées (Mellouli et al., 2003 ; Miao et al,.
2006 ; Yu et al., 2008). Alternativement, une approche d’optimisation efficace des conditions de
production de biomolécules à partir de la souche sélectionnée peut être réalisée à travers des
études et des analyses des conditions physico-chimiques de la culture ainsi que la composition du
milieu de croissance et de production. Il y a couramment une étroite relation entre le taux de
croissance et le rendement maximal des métabolites secondaires biologiquement actifs. Le
rendement des composés bioactifs est généralement augmenté suite à l'optimisation des facteurs
chimiques (composition du milieu, précurseurs, inhibiteurs, oligoéléments, etc.) et physiques
(température, pH, aération, etc.) pour la croissance microbienne.
Les Streptomyces sont les meilleurs candidats pour la production des métabolites
secondaires biologiquement actifs. En effet, ce genre bactérien est à l’origine d’environ 70% des
molécules antibiotiques utilisées en médecine et 60% des antifongiques utilisés en agriculture
(Sujatha et al., 2005). Plusieurs travaux ont été menés pour augmenter la production de
métabolites d’intérêts à partir de ce genre bactérien. Il a été démontré l’importance majeure et
l’implication de l’influence des conditions de culture de la bactérie productrice sur la production
du ou des métabolites recherchés.

III. 1. Effet de la composition du milieu de culture

La nature et la concentration de certains composés dans le milieu de culture ont un effet
éminent sur la production des métabolites secondaires biologiquement actifs. En fait, les travaux

29
 Synthèse bibliographique

de Gesheva et al., 2005 ont montré que la nature des sources : de carbone, d’azote, de phosphore,
de potassium, de magnésium et de trace éléments minéraux (essentiellement Mn2+, Cu2+ et Fe2+),
affectent fortement la production de la molécule antifongique de type macrolide non polyènique,
la AK-111-81, par Streptomyces hygroscopicus. De plus, Mellouli et al., 2003 ont constaté que la
production des deux biomolécules actives : un dérivé de DKP le Cyclo (L-Phe, L-Pro) et la
molécule 3-indo-éthanol à partir d’une nouvelle bactérie de Streptomyces, est étroitement liée à la
nature de la source de carbone. Egalement, l’origine d’une même source de carbone peut affecter
la sécrétion des biomolécules par le microorganisme producteur. C’est le cas de l’antibiotique
aminoglycoside, la néomycine. Il a été démontré par Adinarayana et al., 2003, que la production
de cette molécule par la souche Streptomyces marinensis est fonction de l’origine céréalière de
l’amidon utilisé comme source de carbone.
Outre l’importance de la nature de la source de carbone, plusieurs travaux ont montré
l’implication d’autres nutriments dans la production de biomolécules par les microorganismes.
Pour la source d’azote, la production de l’antibiotique SBR-22 par Streptomyces BT-408 a été
étudiée sur plusieurs sources d’azotes inorganiques ou sous forme d’acides aminés. Il a été
rapporté que c’est la source d’azote inorganique (nitrate d’ammonium) qui donne la meilleure
production de la molécule SBR-22 (Sujatha et al., 2005). Ces mêmes auteurs ont montré
également l’importance de la nature de la source de phosphate dont certaines peuvent conduire à
l’arrêt de la production de la biomolécule SBR-22. Cette constatation a déjà été décrite pour la
production de la tétracycline, l'actinomycine et le candicidine (Kishimoto et al., 1996).
L'importance du magnésium et du potassium dans la production des antibiotiques par différentes
espèces de Streptomyces a été rapportée par plusieurs chercheurs. Mellouli et al., 2004, ont
constaté que le meilleur rendement de production de biomolécules de la nouvelle bactérie de
Streptomyces TN58 est obtenu en présence de potassium à 2 mM.
Il est à noter que plusieurs autres additifs comme le sulfate, le chlorure, l'acétate et
l'arginine peuvent influencer la production de plusieurs métabolites secondaires. C’est le cas des
deux biomolécules, l’antibiotique IM-111-81 et de l’azalomycine B, dont la production par la
souche Streptomyces hygroscopicus est stimulée par la présence de ces additifs (Gesheva et al.,
2005).

30
 Synthèse bibliographique

III. 2. Effet du pH, de la température, de l’agitation et du

temps d’incubation
Les conditions de culture comme le pH, la température, l’agitation et le temps
d’incubation, affectent énormément la production des métabolites secondaires. Depuis longtemps,
il a été démontré l’influence du pH sur la production de plusieurs métabolites organiques du
métabolisme secondaire. En effet, depuis 1973, Iwai et al., ont montré que la production, par le
champignon Cephalosporium caeruleus, de la cerulenine qui est une petite molécule inhibitrice
du métabolisme cellulaire du cholestérol et des lipides est affectée par la variation du pH du
milieu de culture. Cette observation a été constatée lors de la production de plusieurs métabolites
secondaires à savoir la production d’un antifongique par la souche Streptomyces rochei AK39. La
production de cet antifongique peut être stimulée ou inhibée par des variations de pH (Augustine
et al., 2005). De même, chez Streptomyces aureofaciens, le changement de pH pendant le procédé
de fermentation peut induire des modifications de l'équilibre entre la production du
chlorotétracycline (CTC) et de la tétracycline (TC) dans le milieu de culture. Un pH acide
favorise la production du CTC et un pH basique favorise la sécrétion de TC (Asanza-Teruel et al.,
1997).
Concernant la température, la souche marine Streptomyces BT-408 possède une gamme
assez large de température de croissance, entre 20 et 40°C avec un optimum à 30°C. La gamme
correspondante pour la production de l'antibiotique polykétide SBR-22 est beaucoup plus étroite
et varie entre 25 et 33°C (Sujatha et al., 2005). L’optimum de production est obtenu à 30°C qui
correspond à la température optimale de croissance. Dans ces cas, l'accroissement de la
température d'incubation de 25 à 30°C fait augmenter la croissance des cellules et la production
du métabolite SBR-22 d’un facteur de 3 et de 4,7 respectivement.
L'agitation affecte l'aération et le mélange des éléments nutritifs dans le milieu de
fermentation et par conséquent la production de métabolites secondaires. Il a été rapporté par
Mellouli et al., 2004, que pour la souche de Streptomyces TN58, qui produit cinq molécules
bioactives différentes, la meilleure production est obtenue à une agitation comprise entre 200 et
250 rpm. Pour des agitations faibles de l’ordre de 100 rpm ou fortes au voisinage de 300 rpm, la
production de biomolécules chute énormément.
Chez les Streptomyces, l’évolution de la production des métabolites secondaires en
fonction du temps, qui est un facteur déterminant, est variable d’une espèce à une autre. En effet,
pour la souche de Streptomyces TN58, la production des biomolécules commence après 60 h

31
 Synthèse bibliographique

d’incubation pour atteindre un maximum après 72 h. Elle reste stable jusqu’à 80 h puis elle
décroît progressivement pour disparaître à partir de 120 h (Mellouli et al., 2004). Cependant, pour
la souche Streptomyces rochei AK39, qui produit un métabolite antifongique, la production
commence après quatre jours d’incubation pour atteindre un maximum après huit jours
(Augustine et al., 2005).

IV. Purification et Caractérisation des Métabolites Secondaires

IV. 1. Purification
A l’échelle industrielle, lors d'une production naturelle à partir de microorganismes, les
métabolites secondaires biologiquement actifs sont produits dans des immenses cuves appelées
fermenteurs, qui peuvent contenir des milliers de litres d’un milieu de culture favorable à la
croissance du microorganisme producteur de ou des molécules recherchées. Généralement les
milieux de production utilisés pour la préparation naturelle de métabolites secondaires
biologiquement actifs sont complexes. Ces milieux peuvent devenir encore chargés vu que le
microorganisme producteur peut sécréter plusieurs autres métabolites outre la ou les molécule(s)
recherchée(s). L'extraction et la séparation de ces molécules d'intérêts du jus de fermentation,
constituent une étape délicate et souvent tributaire de leurs caractériqtiques.
Le schéma général consiste à séparer par centrifugation la biomasse du jus de
fermentation contenant les molécules d'intérêts. Par ailleurs, il est à noter que dans des cas assez
rares, certaines molécules ne sont pas secrétées en totalité dans le surnageant et une fraction reste
intracellulaire. Dans cette situation il faut traiter la biomasse par des moyens physiques.
L'extraction et la purification des molécules actives du jus de fermentation nécessitent
l'application de plusieurs techniques chimiques et physico-chimiques. Cependant, bien que le
schéma utilisé pour l'extraction et la purification des molécules bioactives soit assez général,
quelques étapes doivent être adaptés selon la nature de la molécule d'intérêt.
La figure 8 illustre le schéma général utilisé pour la préparation à l’état pur d’une
molécule biologiquement active.

32
 Synthèse bibliographique

IV. 2. Caractérisation
Après obtention de la molécule active à l’état pur et pour élucider sa structure chimique, il
est nécessaire d'appliquer plusieurs techniques spectroscopiques. Le nombre de techniques à
utiliser dépend de la nature de la molécule à savoir sa masse, sa géométrie dans l'espace, sa
polarité, etc. L’élucidation structurale des molécules organiques ayant des activités biologiques
telles que les antibiotiques est faite à l'aide de mesures de susceptibilité magnétique, des
techniques spectroscopiques (UV-visible, Infrarouge ou Résonance Paramagnétique
Electronique…..). Ces techniques sont complémentaires et généralement l'élucidation de la
structure chimique de la molécule recherchée est obtenue par la combinaison de leurs résultats.
Les spectres UV qui fournissent généralement moins de renseignements sur la structure
moléculaire des composés comparés aux spectres RMN et IR, sont utilisés soit pour une
confirmation soit pour une identification grâce à des règles empiriques et à la comparaison avec
des spectres de références.
Cependant, et malgré tous les techniques spectroscopiques innovantes qui sont de nos
jours de plus en plus utilisées pour l'élucidation totale de la structure chimique des biomolécules,
on se trouve parfois confronter à quelques problèmes de configuration de la molécule étudiée. En
effet, la molécule, Haliangicine (Figure 9), ayant des activités antibiotiques, antifongiques et
antitumorales a été décrite pour la première fois par Fudou et al., 2001. Cependant, Bangi et al.,
2003, ont constaté que cette molécule possède quatre autres isomères qui sont biologiquement
actifs (Tableau 2). Après l’élucidation du premier isomère par Fudou et al., 2001, en utilisant des
techniques spectroscopiques simples, Bangi et al., 2003 ont suggéré que cette molécule peut
présenter des isomères puisqu'elle contient un groupement époxyde traduisant la présence des
isomères trans et cis et le groupement polyènique traduisant la présence des isomères Z et E.
Cette suggestion a été confirmée par la technique spécifique de l’RMN 2D appelé NOESY
permettant de voir la corrélation des protons dans l’espace.

33
 Synthèse bibliographique

Milieu de culture+ microorganisme

Producteur de l’antibiotique

Fermentation

Centrifugation

Surnageant contenant Culot cellulaire

l’antibiotique

Plusieurs étapes
d’extractions - séparations

Concentration

Cristallisation

Dissolution et décoloration

Nouvelle cristallisation

Séchage

Antibiotique à l’état pur

34
Figure 8 : Schéma général conduisnant à l’obtention des antibiotiques à l’état pur
 Synthèse bibliographique

13 O 11
15 Me
9
Me
Me OMe
5 3
7

Me OMe CO2Me

Figure 9: Structure chimique de la Haliangicine (Fudou et al., 2001)

Tableau 2: Les isomères de la Haliangicine (Bangi et al., 2003)

Géométrie
Composés
C2 C4 C6 Epoxide

Haliangicine (1) E Z Z trans

Cis-haliangicine (2) E Z Z cis

Haliangicine B (3) Z Z Z trans

Haliangicine C (4) E E Z trans

Haliangicine D (5) E E E trans

D. RESISTANCE MICROBIENNES AUX

BIOMOLECULES

La découverte des antibiotiques à la fin des années 1940 a marqué une étape capitale dans
la lutte contre les maladies infectieuses. Ces traitements ont permis d'épargner un grand nombre
de vies et l'on a cru, un peu trop vite, que les maladies infectieuses seraient un jour toutes
jugulées. En effet, cette introduction aurait dû provoquer une catastrophe chez les microbes, mais
leur plasticité génétique leur a permis, non seulement de survivre, mais même de prospérer dans
cet environnement hostile. Ainsi, on assiste de plus en plus au développement de souches

35
 Synthèse bibliographique

microbiennes résistantes aux molécules bioactives. Plus la résistance est élevée, plus on prescrit
de biomolécules et on favorise l’émergence de nouvelles résistances et la survenue d’infections
incurables. On assiste à une sorte de spirale infernale de la résistance, avec ses graves
conséquences médicales.

I. Résistance aux antibiotiques

Les mécanismes de résistances aux différents antibiotiques ont été dans la plupart des cas
élucidés. Pour chacune des classes d'antibiotiques, il existe au moins un mécanisme permettant à
la bactérie résistante de se protéger. D'après (Davies et Mazel 1994), les diverses formes de
résistances aux antibiotiques (ATB) sont:

Réduction de la perméabilité cellulaire aux ATB ;

Inhibition du transport actif des ATB ;

Rejet des ATB hors de la cellule par efflux actif grâce à une pompe à protons ;

Modification de la cible d'ATB ;

Amplification de la cible de l'ATB ;

Inactivation de l'ATB par des enzymes bactériennes ;

Et apparition d’une voie métabolique alternative.
La résistance bactérienne aux antibiotiques est très complexe et peut être naturelle ou
acquise. La résistance naturelle est un caractère présent chez toutes les souches appartenant à la
même espèce. On peut citer par exemple, la résistance naturelle des entérobactéries et des
Pseudomonas aux macrolides. La résistance acquise peut être soit par acquisition de gènes
(résistance des Staphylocoques à la vancomycine), soit par mutation chromosomique (résistance
des Citrobacter aux céphalosporines).

II. Résistance aux antifongiques

A l’exemple des bactéries qui deviennent résistantes aux antibiotiques, les champignons
pathogènes pour l’homme (causant des mycoses) ainsi que les phytopathogènes développent des
formes de résistances aux antifongiques et aux fongicides respectivement.

36
 Synthèse bibliographique

Plusieurs familles thérapeutiques sont utilisables actuellement dans le traitement des

mycoses à savoir : les polyènes (nystatine et amphotéricine B), les azolés (imidazolés et
triazolés), etc. Les antifongiques agissent différemment selon leur famille chimique sur les
organites cibles des champignons (Viguié, 2000) on distingue:
• Action sur la synthèse de la paroi fongique : polyoxines, nikkomycines,
papulacandines.
• Action sur la membrane plasmique (polyènes, ciclopiroxolamine), ou l’ergostérol,
constituant spécifique de la paroi des cellules fongiques (allylamines, azolés,
terbinafine, thiocarbamate et amorphine).
• Blocage de la division cellulaire (griseofulvine).
• Inhibition de la synthèse des acides nucléiques (flucytosine).
• Inhibition de la chaîne respiratoire avec comme cible les mitochondries
(ciclopiroxolamine).
En agriculture, les antifongiques (qu’on appelle aussi "fongicides") sont devenus une
partie intégrale de production efficace. Plusieurs fongicides sont employés pour combattre des
infections fongiques dans l’environnement mais ne sont pas utilisés en médecine en raison de leur
toxicité. L’utilisation d’agents antifongiques de même classe chez l’homme et dans
l’environnement pose des problèmes potentiels, particulièrement le développement de
résistances. La résistance clinique d’Aspergillus fumigatus aux traitements par l’itraconazole, un
des antifongiques les plus utilisés en médecine pour combattre les aspegilloses, augmente de plus
en plus. Aspergillus fumigatus est aussi un organisme jouant un rôle important dans la
dégradation de composants organiques. Il se répand dans l’environnement par la dispersion de
spores de très petite taille. C’est l’espèce de champignon causant le plus d’infections (que l’on
nomme "aspergilloses") à l’échelle mondiale (Accoceberry et Noel , 2006).
Les mécanismes de résistance, mis en place par certaines souches de champignons, sont
maintenant mieux connus, en particulier chez les levures du genre Candida. Dans la majorité des
cas, ces mécanismes reposent soit sur des mutations qui ont pour effet de modifier la cible de
l'antifongique ou d'en bloquer l'accès, soit sur la surexpression de gènes codant pour la cible ou
pour des transporteurs membranaires impliqués dans un rejet actif de l'antifongique.

37
 Synthèse bibliographique

L’émergence de la résistance des bactéries et des champignons pathogènes aux

antibiotiques et aux antifongiques communément utilisés, constitue actuellement un problème
très épineux. Pour combattre cette situation alarmante, de nouvelles biomolécules sont
nécessaires. Ces dernières peuvent être obtenues par voie naturelle à partir de nouvelles souches
microbiennes notamment les Streptomyces, par semi-synthèse ou synthèse totale, par génie
génétique (manipulation des voies de biosynthèse pour obtenir des nouvelles biomolécules
hybrides). A côté de ces possibilités, s’ajoute celle des bactériocines.

E. LES BACTERIOCINES
Différentes définitions ont été données au cours du temps pour les bactériocines. Celle de
(Klaenhammer, 1988) définit les bactériocines comme des protéines, ou complexes de protéines,
avec une activité bactéricide contre des espèces proches de la souche productrice. Actuellement,
on admet une définition plus générale et le spectre d’activité des bactériocines peut être étroit et
confiné à des bactéries fortement apparentées à l’espèce productrice ou, à l’opposé, large et
agissent sur une variété d’espèces microbiennes.

I. Domaines d’applications des bactériocines

I.1. Le typage bactérien

Le pouvoir des bactériocines à inhiber certaines souches de la même espèce productrice et
parfois des souches des autres espèces a été largement utilisé pour l’identification d’espèces de
différents genres bactériens. La plupart des méthodes est basée sur l’inhibition d’une souche dite
indicatrice ou sensible aux bactériocines. Cette méthode a été utilisée avec succès pour certaines
bactéries Gram-négatif, telles que Pseudomonas aeruginosa (Pitt et Gaston 1995). L’utilisation
des bactériocines a permis aussi à Merino et al., 2000 de différencier les souches de Shigella.

I.2. Domaine alimentaire

L’utilisation des bactériocines dans le domaine alimentaire est avantageuse non seulement
à cause de leur large spectre d’activité, mais aussi parce qu’elles sont non toxiques, facilement
dégradables par les enzymes digestives et ne compromettent pas la prise des médicaments (Ryan

38
 Synthèse bibliographique

et al., 1998). Du fait qu’elles sont des substances naturelles, l’emploi des bactériocines
permettrait d’avoir des produits plus sains et réduirait l’utilisation des agents chimiques de
conservation (Harlander, 1993 ; Galvarez et al., 2007). Ces dernières années, l’application des
bactériocines dans la technologie a gagné une grande attention. En effet, plusieurs bactériocines
montrent des effets synergiques ou addititionnels lorsqu’elles sont utilisées en combinaison avec
d’autres agents antimicrobiens, incluant des conservateurs chimiques, des composés phénoliques
naturels (Grande et al., 2007), et même d’autres protéines antimicrobiennes. L’utilisation
combinée de bactériocines différentes, peut être aussi une approche attirante pour éviter le
développement de souches résistantes (Galvarez et al., 2007). La combinaison de bactériocines
avec des traitements physiques, comme le traitement à haute pression ou dans un champ
électrique, offre une conservation plus efficace des produits alimentaires, fournissant ainsi une
barrière complémentaire aux formes les plus résistantes comme les endospores bactériennes
(Galvarez et al., 2007).

Malgré le fait que la majorité des bactériocines soit des substances naturelles non
toxiques, seule la nisine est reconnue jusqu’à maintenant comme « GRAS » (Generally
Recognized As Safe) (Delves-Broughton, 1990). Ainsi, la nisine est utilisée comme additif dans
les aliments en conserves, notamment dans les produits laitiers, les soupes et les poudings à base
de céréales (Eckner et al., 1992). Par ailleurs, Rayman et al., 1981 ont démontré que l’interaction
synergique entre la nisine et les nitrites contre les spores de Clostridium botilinum permettrait de
réduire l’emploi de ces substances cancérigènes. A ce jour, plus de 45 pays ont approuvé
l’utilisation de la nisine comme agent de conservation, ce qui fait de la nisine la bactériocine la
plus utilisée à travers le monde (Riley et Wertz, 2002). Tout comme la nisine, l’utilisation de la
pédiocine dans la conservation des viandes, des salades et du fromage a été brevetée en Europe
(Chen et al., 1997a).

I.3. Domaines de la médecine humaine et vétérinaire

L’utilisation des bactériocines n’est pas restreinte au domaine alimentaire, plusieurs

études ont démontré que l’utilisation répandue des antibiotiques pour traiter et prévenir les
infections, engendrait de sérieux problèmes de toxicité et de résistance. Par leurs caractéristiques
mentionnées précédemment, les bactériocines ont été énormément appréciées comme étant des

39
 Synthèse bibliographique

agents de thérapie naturelle, alternative aux antibiotiques, puisque l’effet inhibiteur des
bactériocines pourrait réduire les effets nocifs engendrés par l’antibiothérapie.

Quelques lantibiotiques sont utilisables dans les applications médicales pour l’espèce
humaine et animale. L’épidermine produite par Staphylococcus epidermidis (Allgaier et al.,
1986) est active contre Propionibacterium acnes, qui cause l’acné. Ce lantibiotique est utilisé
dans la thérapie pour remplacer l’usage habituel de l’érythromycine et de la vitamine A. Cette
application montre plusieurs avantages tels que l’absence de résistance aux lantibiotiques et leur
faible coût de production par rapport aux antibiotiques. La nisine, quant à elle, peut être utilisée
dans le traitement des ulcères gastriques vu sa stabilité aux pHs acides et son activité contre
Helicobacter pylori (De Vuyst et Vandamme, 1993). Trois autres bactériocines produites par
Lactobacillus johnsonii LA1, Lactobacillus casei YIT 9029 et Lactobacillus amylovorus DCE
471 montrent une activité inhibitrice contre l’agent pathogène gastrique humain Helicobacter
pylori qui cause des ulcères gastriques (Avonts et De Vuyst, 2001). Cinnamycine produite par
différentes souches de Streptomyces spp est impliqué dans l’immunité humaine (prolifération des
leucocytes) et la régulation de la pression du sang avec l’intervention de phospholipase A2 et
l’enzyme de conservation de l’angiotensine. De plus, ce groupe peut être impliqué aussi dans la
protection contre le virus Herpes simplex (Marki et Franson, 1986). Une « bacteriocin-like
inhbitory substance » (BLIS) anti – Streptococcus pyogenes produite par Streptococcus salivarius
est appliquée dans la préservation de la pharyngite streptococcique (Tagg, 2004).

Dans le domaine de la médecine vétérinaire, les bactériocines pourraient être utilisées

avec les ionophores dans une stratégie visant à prévenir l’apparition d’une résistance.
L’utilisation d’une bactériocine à la place d’un antibiotique, par intermittence, aiderait à détruire
les populations résistantes. Les ionophores antibiotiques ont un très large spectre d’action, donc
ils peuvent agir sur à peu près la moitié de la flore naturelle trouvée dans le rumen des bovins,
alors que les bactériocines sont par contre extrêmement spécifiques, ce qui permet, par exemple,
de cibler seulement les bactéries qui dégradent des protéines alimentaires ou seulement celles qui
produisent du méthane. Un autre avantage qui s’ajoute, tient au fait que les bactériocines sont des
protéines non toxiques qui se digèrent facilement. Comme elles sont digérées par l’animal, il n’y
a aucun risque qu’il reste des résidus dans la viande ou le lait. Par contre, les ionophores

40
 Synthèse bibliographique

antibiotiques classiques ne sont pas digestibles, sont très toxiques et doivent être manipulés et
administrés avec précaution.

I.4. Domaine agricole

La protection des plantes contre les microorganismes phytopathogènes ainsi que la

préservation des semences, sont les objets de l’exploitation des bactériocines en agriculture. Dans
ce cas, les substances antibactériennes et substances antifongiques seront associées afin de lutter
contre les ravageurs phytopathogènes (Paik et al., 1997).

II. Microorganismes producteurs de bactériocines

De nombreuses souches bactériennes, à Gram positive et à Gram négative ont été

décrites pour leurs capacités à produire des bactériocines (Tableau 3). Pour les bactériocines du
genre Bacillus on peut citer : la subtiline produite par Bacillus subtilis ATCC 6633 (Klein et al.,
1993) similaire à la nisine, la coaguline secrétée par Bacillus coagulans I(4) (Le Marrec et al.,
2000), la bacillocine 490 produite par Bacillus licheniformis (Martirani et al., 2002), la
polyfermenticine SCD secrétée par Bacillus polyfermenticus (Lee et al., 2001), l’entomocine et la
thuricine produites par Bacillus thurigiensis (Cherif et al., 2008), etc.
Cependant, les bactéries lactiques restent les meilleures candidates pour la production de
bactériocines. Ces dernières sont l'objet d'une attention toute particulière depuis une dizaine
d'années en raison de l'intérêt tant fondamental qu'appliqué qu'elles suscitent. Produites par de
nombreuses espèces et dirigées contre des espèces homologues ou plus éloignées, comme
Listeria monocytogenes, leur structure primaire a permis de définir une classification en trois
classes (lantibiotiques, petites bactériocines, non lantibiotiques et bactériocines de grande taille).
Leur mode d'action a été également analysé et différents modèles existent pour expliquer la
perforation des membranes des cellules cibles de ces bactériocines. La formation de pores
membranaires se fait via un récepteur protéique (non lantibiotique) ou par une insertion directe
dans les bicouches phospholipidiques (lantibiotiques). Dans tous les cas, plusieurs molécules
d'une même bactériocine agissent en synergie.

41
 Synthèse bibliographique

Tableau 3 : Souches productrices de bactériocines (Gillor et al., 2005).

Bactériocines Souches indicatrices

Lantibiotiques
Ancovenin [Link]
Cinnamycin Streptoverticillum and Sytreptomyces spp.
Duramycin Streptoverticillum and Sytreptomyces spp.
Epidermin Staphylococcus epidermidis
Gallidermin Staphylococcus gallinarum
Lacticin Lactococcus lactis
Labthiopeptin Streptoverticillum cinnamonum
Mersacidin Bacillus subtilis
Mutacin Streptococcus mutans
Nisin Lactococcus lactis
Colicins
Ia, E1, E4,E7, E8, K et S8 [Link]
Microcins
24, B17 et J25 [Link]
E294 Klebsilla pneumoniae
Pyocins
S-35 Pseudomonas aeruginosa
Gram (-) productrices de bactériocines
Serracin-P Serratia plymithicium
Glycinicin Xanthomonas campestris
Carotovoricin Erwinia carotovora

III. Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques

Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques peuvent être associées à de

nombreux éléments. Elles résultent de l’effet combiné de différents facteurs biologiques
provenant de leurs activités métaboliques.

III-1 Le pH et les acides organiques

Les produits principaux du métabolisme des bactéries lactiques sont les acides organiques.
Les acides organiques sont produits soit par la voie homofermentaire, soit par la voie
hétérofermentaire. Le métabolisme du pyruvate conduit à la formation uniquement d’acide
lactique chez les homofermentaires tandis qu’il conduit à la formation d’acide lactique, acétique

42
 Synthèse bibliographique

et formique, d’éthanol et de dioxyde de carbone chez les hétérofermentaires (Liu, 2003). Grâce à
cette production d’acides organiques, les bactéries lactiques diminuent le pH du milieu dans
lequel elles se multiplient en inhibant une partie de la flore qui s’y développe. Outre la
diminution du pH du milieu, l’effet antagoniste des acides organiques résulte de l’action de leur
forme non dissociée. En effet, la forme non dissociée de l’acide peut traverser passivement la
membrane et acidifier le cytoplasme par libération du proton, ce qui affecte le métabolisme
cellulaire en inhibant certaines fonctions (Klaenhammer, 1993; Brul et al., 1999; Caplice et al.,
1999; Hsiao et al., 1999; Cotter et al., 2003; Janssen et al., 2007).
Les acides organiques sont un des agents classiques de préservation des aliments (Brul et
al., 1999) et sont reconnus comme des additifs alimentaires. Les acides couramment utilisés sont
les acides benzoïque, sorbique, acétique, fumarique, propionique et lactique. Ils sont utilisés pour
prévenir ou retarder la croissance des bactéries dégradant la nourriture (Hsiao et al., 1999). Le
principal problème consécutif à leur utilisation est la haute concentration nécessaire pour inhiber
les bactéries pathogènes ou indésirables et qui est parfois inacceptable pour le consommateur
(Kobilinsky et al., 2007). La concentration minimale inhibitrice (qui est la plus petite quantité
d’acide qui peut empêcher la croissance d’un microorganisme) de chacun de ces acides doit être
déterminée dans des conditions précises de pH mais aussi d’activité de l’eau, de température…
(Hsiao et al., 1999). Elle varie avec chaque microorganisme à inhiber. Hsiao et al., 1999 ont
montré qu’une concentration en acide acétique de 0,105 g/l inhibe la croissance de Bacillus
subtilis à un pH de 5,3 alors qu’il faut une concentration de 27,5 g/l pour inhiber Lactobacillus
plantarum et une concentration de 1,6 g/l pour inhiber Escherichia coli dans les mêmes
conditions. Listeria monocytogenes est inhibée par l’acide lactique et l’acide chlorhydrique à 9,0
g/l respectivement à un pH de 3,7 et 3,4 (Gravesen et al., 2004).

III. 2. Le peroxyde d’hydrogène

Les bactéries lactiques ne possèdent pas de catalase typique contenant un noyau hème
pour dégrader le peroxyde d’hydrogène en oxygène et en eau. Le peroxyde d’oxygène peut
s’accumuler et être inhibiteur de différents microorganismes par l’oxydation des lipides
membranaires et la destruction des structures des protéines cellulaires (Zalan et al., 2005).
Certaines bactéries lactiques peuvent néanmoins se protéger contre le peroxyde d’hydrogène

43
 Synthèse bibliographique

qu’elles produisent par la synthèse de catalase hexamérique ou tétramérique contenant du

manganèse et qui sont parfois décrites comme étant des pseudocatalases (Strus et al., 2006). La
concentration de peroxyde d’hydrogène produite par des Lactobacilli varie entre 0,001 et 8 mM,
en fonction de l’espèce, de la souche et des conditions de cultures (Sakamoto et al., 1998;
Kullisaar et al., 2002; Zalan et al., 2005; Strus et al., 2006). Son action se manifestera aussi bien
sur les germes indésirables que sur ceux qui sont indispensables au bon déroulement de la
fermentation. Il est donc rarement utilisé pour son activité inhibitrice. D’autre part, son action
oxydante peut avoir un effet néfaste sur la santé humaine (Zalan et al., 2005).

III.3. Le dioxyde de carbone

Celui-ci est formé pendant la fermentation hétérolactique et crée un environnement
anaérobie qui inhibe les microorganismes aérobies. L’accumulation de dioxyde de carbone dans
la bicouche lipidique peut causer un dysfonctionnement de la perméabilité (Ammor et al., 2006).

III.4. Le diacétyl
Il est synthétisé par différents genres de bactéries lactiques comme Lactococcus sp.,
Leuconostoc sp., Lactobacillus sp. et Pediococcus sp. Le diacétyl (C4H6O2) est un des
composants aromatiques essentiels du beurre. Il a des propriétés antimicrobiennes qui sont
dirigées contre les levures, les bactéries Gram-négatif et les bactéries Gram-positif non lactiques,
ces dernières y sont néanmoins moins sensibles (El Ziney et al., 1998). Les concentrations
nécessaires à l’obtention d’une inhibition sont de l’ordre de 100 ppm, et sont supérieures à celles
présentes dans le beurre et susceptibles de provoquer son arôme (2 à 7 ppm) (Caplice et al.,
1999).

III.5. La reutérine
La reutérine (ou 3-hydroxypropionaldehyde) est une substance antimicrobienne qui est
produite comme métabolite intermédiaire pendant la fermentation anaérobie du glycérol par
certaines espèces de Lactobacillus ainsi que par d’autres genres bactériens non lactiques tels que
Bacillus, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter et Clostridium (El-Ziney et al., 1998). La
fermentation du glycérol se déroule en deux étapes. Le glycérol sera tout d’abord deshydraté par

44
 Synthèse bibliographique

une «glycérol deshydratase» pour former de la reutérine qui sera ensuite réduite en 1,3-
propanediol par une oxydoréductase. La reutérine s’accumule alors dans le microorganisme
producteur. A haute concentration, elle est excrétée dans le milieu. Sa toxicité contre la cellule
productrice limite sa production, certaines espèces comme Lactobacillus reuteri y sont plus
résistantes (Vollenweider, 2004). La reutérine a un large spectre d’activité. Elle a une action
contre les bactéries (Gram-positif ou Gram-négatif), les champignons et les protozoaires. Elle
interfère avec la réplication de l’ADN. Elle a des applications aussi bien dans le domaine médical
que dans le domaine alimentaire (Vollenweider, 2004).

III.6. Les bactériocines

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en quatre classes
comme proposées par (Klaenhammer, 1993):

III.6.1. Classe I : Les lantibiotiques

Ce sont des peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la chaleur et qui contiennent des
acides aminés inhabituels soufrés formés post-traductionnellement, comme la lanthionine, la β-
méthyl lanthionine, la déhydrobutyrine et la déhydroalanine. Les lantibiotiques peuvent être
divisés en deux types : la classe Ia qui comprend des peptides cationiques hydrophobes allongés
contenant jusqu'à 34 acides aminés et la classe Ib qui comprend les peptides globulaires chargés
négativement ou sans charge nette et contenant jusqu'à 19 acides aminés (McAuliffe et al., 2001 ;
Twomey et al., 2002). Certains lantibiotiques sont par ailleurs constitués de deux peptides
agissant ensemble pour avoir une activité comme la lacticin 3147.

Les lantibiotiques interagissent avec la membrane cellulaire par des interactions

électrostatiques ou par la liaison à des récepteurs spécifiques tels que le lipide II (undecaprenyl-
pyrophosphoryl-MurNAc-pentapeptides-GlcNAc), un précurseur du peptidoglycane. Suite à cette
liaison, les lantibiotiques peuvent former des pores larges et non spécifiques dans la membrane
cytoplasmique, ce qui va causer l'efflux rapide des petits composés cytoplasmiques tels que les
ions, les acides aminés, l'ATP, etc. Cette augmentation de la perméabilité membranaire va
conduire à la mort de la cellule (McAuliffe et Hill., 2001 ; Twomey et al., 2002 ; Bauer et al.,
2005 ; Patton et al., 2005).

45
 Synthèse bibliographique

Les lantibiotiques composés de deux peptides comme la lacticine 3147 agissent également
par formation de pores dans la membrane des cellules cibles (McAuliffe et Hill., 2001). La
lacticine 3147 a un spectre d'action large. Le peptide A1 a une activité qui est plus élevée en
présence du peptide A2. Il a été récemment proposé que la lacticine 3147 A1 agit en se liant au
lipide II, inhibant la synthèse du peptidoglycane et permettant à la lacticine 3147 A2 de former un
pore dans la membrane de la cellule cible (Morgan et al., 2005 ; Wiedemann et al., 2006).

III. 6. 2. Classe II.

Ce sont des peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne contenant pas
d'acides aminés modifiés. Leur point isolélectrique varie entre 8 et 10. Le tableau 4, présente les
séquences de quelques bactériocines appartenant à cette classe. Cette dernière est subdivisée en
trois sous-classes.

- La sous-classe IIa. Ces bactériocines contiennent entre 27 et 48 acides aminés et ont

toutes une partie N-terminale hydrophobe contenant la séquence consensus YGNGV ainsi qu'un
pont disulfure et une partie C-terminale moins conservée, hydrophobe ou amphiphile qui
détermine la spécificité d'action (Fimland et al., 2000 ; Richard et al., 2006). Elles ont toutes une
activité contre Listeria monocytogenes. Certaines bactériocines de cette sous-classe contiennent
également un deuxième pont disulfure dans leur domaine C-terminale qui semble être important
dans la stabilisation de la structure tertiaire. Il semble par ailleurs qu'il leur conférerait une
meilleure activité antimicrobienne, une meilleure résistance à l'exposition à des hautes
températures et un spectre d'action plus large (Eijsink et al., 1998 ; Fimland et al., 2000 ; Drider
et al., 2006 ; Richard et al., 2006).

- La sous-classe IIb. Elle comprend les bactériocines ayant besoin de deux peptides pour
avoir une activité. Deux types de bactériocines de classe IIb peuvent être distingués : le type E
(Enhancing) où la fonction d'un des deux peptides est d'augmenter l'activité de l'autre et le type S
(Synergy) où les deux peptides sont complémentaires.

- La sous-classe IIc. Toutes les autres bactériocines de classe II ne pouvant pas être
classées dans les sous-classes a et b.

46
 Synthèse bibliographique

Tableau 4 : Séquences de quelques bactériocine de classe II

Le mécanisme d'action supposé des bactériocines de classe IIa est l'interaction de la

bactériocine avec la membrane ou un récepteur spécifique, la « mannose perméase », pour
ensuite former un pore dans la membrane de la cellule, ce qui induit la perméabilisation de la
membrane et par conséquent, la mort de la cellule (Dalet et al., 2000 ; Héchard et al., 2001 ;
Gravesen et al., 2002 ; Arous et al., 2004 ; Vadyvaloo et al., 2004 ; Bauer et Dicks., 2005). Le
mécanisme de formation des pores n'est pas bien connu, même si l'hypothèse la plus courante est
l'association de différentes molécules de la bactériocine (Ennahar et al., 2000 ; Fimland et al.,
2000 ; Diep et al., 2007). Les bactériocines de classe IIb ont en général un spectre d'action
inhibant une large gamme de bactéries Gram+. Elles forment des pores et rendent la membrane
perméable à différentes petites molécules à savoir les cations et les anions (Oppegard et al.,
2007). Le ratio optimal d'activité entre les deux sous-unités est en général de 1:1 mais il est de
4:1 pour la lactocine 705 (Castellano et al., 2007 ; Oppegard et al., 2007). Néanmoins, les
mécanismes d'interaction des deux bactériocines entre elles et avec la membrane cellulaire ne
sont que très peu connus. Il a été montré qu'il n'y avait pas de liaison au même récepteur que pour
les bactériocines de classe IIa (la « mannose perméase »). (Diep et al., 2007) et Castellano et al.,

47
 Synthèse bibliographique

2007) ont récemment montré que les deux peptides composant la lactocine 705 ont des activités
bien spécifiques. La lactocine 705α interagit avec la surface de la membrane cellulaire et la
déshydrate, ce qui permet à la lactocine 705β de former des pores.

III.6.3. Classe III

Ce sont des protéines de taille supérieure à 30 kDa et sensibles à la chaleur. La structure et

le mode d'action de ces bactériocines diffèrent complètement des autres bactériocines produites
par les bactéries lactiques. Cette classe ne contient que quatre bactériocines : l'helveticin J
produite par Lactobacillus helveticus A, l'enterolysin A produite par Enterococcus faecium, la
zoocin A produite par Spreptococcus zooepidemicus et la millericin B produite par Streptococcus
milleri (Nilsen et al., 2003 ; Papagianni, 2003 ; Nigutova et al., 2007).

Le mode d'action de ces bactériocines diffère complètement des bactériocines des autres
classes. En effet, l'enterolysin A, la zoocin A et la millericin B agissent par l'hydrolyse des liens
peptidiques du peptidoglycane des cellules sensibles. La zoocin A a un spectre d'action étroit
alors que l'enterolysin A et la millericin B ont un spectre d'action large. L'helveticin J a un mode
d'action bactéricide (Nilsen et al., 2003).

III. 6. 4. Classe IV

Ce sont des peptides requérant une partie carbohydratée ou lipidique pour avoir une activité.

IV. La production des bactériocines

Les bactériocines sont généralement produites à la fin de la phase exponentielle et au début de

la phase stationnaire de croissance. Elles peuvent ensuite être dégradées par les protéases
produites par la bactérie productrice (Savijoki et al., 2006) ou être adsorbées à sa surface, ce qui
mène à sa baisse de concentration de bactériocines dans le milieu de culture. Les facteurs
influençant la production de bactériocines sont principalement la souche productrice, la
température, le pH, la composition du milieu et la technologie de fermentation employée.

Comme l'ont montré Moretro et al., 2000 pour la production de sakacin P par L. sakei, une
même bactériocine peut être produite par des souches ou espèces différentes dont la capacité de

48
 Synthèse bibliographique

production peut être variable. Les conditions de culture influencent fortement la production de
bactériocines. En effet, l'optimisation de la croissance ne résulte pas nécessairement de
l'optimisation de la production de bactériocines (Parente et al., 1999). Il a même été suggéré que
des conditions de croissance défavorables permettent de stimuler leur production (Verluyten et
al., 2004). Les températures et pH optimaux de production sont souvent inférieurs à ceux
optimaux de la croissance. C'est par exemple le cas pour la production de sakacin P par
L. sakei CCUG42687 (Moretro et al., 2000), d'amylovorin L471 par L. amylovorus DCE471 (De
Vuyst et al., 1996) et de pediocin PA-1 par Pediococcus damnosus (Nel et al., 2001).

La composition du milieu, tout particulièrement les sources et concentrations de carbone et

d’azote, affectent fortement la production de bactériocines. Les bactéries lactiques productrices
requièrent de nombreux nutriments pour leur croissance et des milieux riches contenant de
l'extrait de viande, de levure et des hydrolysats de protéines sont nécessaires. Il a déjà été montré
que l'augmentation des concentrations en extrait de levure, extrait de viande ou peptone peut
permettre une augmentation de la production de bactériocines (Aasen et al., 2000 ; Nel et al.,
2001; Todorov et al., 2004 ; Verluyten et al., 2004). D'autre part, quelques études ont montré que
la source de carbone utilisée et sa concentration est un facteur important dans l'optimisation de la
production de bactériocines (Leal-Sanchez et al., 2002 ; Leroy et al., 2006 ; Chen et al., 2007 ;
Anastasiadou et al., 2008). L'ajout de ces nutriments lors d'une culture fed-batch permet souvent
d'augmenter la production comparativement à une culture en batch (Callewaert et al., 2000 ; Lv
et al., 2005 ; Pèrez Guerra et al., 2005). L'utilisation de la technique des cellules immobilisées
peut permettre d'augmenter la durée et la stabilité de la production de bactériocines. Les cellules
peuvent être immobilisées dans des biofilms ou des billes d'alginates de calcium. Cette technique
a déjà été utilisée avec succès pour la lacticine 3147 et la nisine (Scannell et al., 2000 ;
Pongtharangkul et al., 2006).

V. Le conditionnement des bactériocines

Il est très difficile de conditionner les bactériocines sous une forme purifiée. La
purification des bactériocines est une procédure longue et couteuse qui nécessite la mise en
œuvre de nombreuses techniques, à savoir une précipitation des protéines au sulfate
d'ammonium, différentes combinaisons de chromatographies sur colonne telles que des échanges

49
 Synthèse bibliographique

d'ions ou des interactions hydrophobes et une étape finale de chromatographie liquide à haute
performance en phase inverse. Ces traitements ne sont pas applicables à l'échelle industrielle. La
stratégie souvent mise en œuvre est la semi - purification. Les bactériocines semi-purifiées
peuvent alors être conditionnées sous forme sèche par atomisation ou lyophilisation (Parente et
al., 1999). La nisine, la seule bactériocine légalement approuvée comme additif alimentaire, est
commercialisée sous une forme semi-purifiée.

VI. L’application des bactériocines dans le secteur alimentaire

Les bactériocines peuvent être appliquées sous une forme purifiée, semi-purifiée ou sous
la forme d'un concentré obtenu après fermentation d'un substrat alimentaire. Les bactéries
productrices peuvent également être appliquées dans les produits alimentaires, la bactériocine
sera alors produite in situ.

VI. 1. Application de la bactériocine

Les bactériocines purifiées ou semi-purifiées sont appliquées après leur production en

fermenteur. D'un point de vue législatif, une telle préparation est considérée comme un additif
alimentaire. Jusqu'à présent, seule la nisine, un lantibiotique, est acceptée comme additif
alimentaire (E234) (Guinane et al., 2005). Les bactériocines peuvent également être appliquées
sous la forme d'un concentré obtenu après fermentation par la souche productrice. Cette
préparation sera considérée comme un ingrédient fermenté. Elle contiendra la bactériocine mais
également d'autres métabolites microbiens tels que l'acide lactique. La pédiocine, une
bactériocine de classe IIa, est commercialisée sous cette forme sous le nom ALTA 2341. Des
essais ont été récemment fait avec la lacticine 3147, un lantibiotique (Deegan et al., 2006 ;
Galvez et al., 2007).

Un autre mode d'application des bactériocines consiste en l’immobilisation sur des

cellules productrices dans des gels ou des films tels que l'alginate de calcium, la gélatine, la
cellulose, les protéines de soja, des films de polysaccharides, etc. La bactériocine sera alors
libérée dans le produit au cours de sa conservation. Depuis peu, des emballages en polyéthylène
ou d'autres films plastiques contenant des bactériocines ont été développés. Ces emballages
permettent de réduire la croissance des microorganismes pathogènes ou indésirables pouvant se

50
 Synthèse bibliographique

développer en surface durant la conservation du produit (Luchansky et al., 2004 ; Deegan et al.,
2006 ; Ghalfi et al., 2006 ; Galvez et al., 2007).

VI. 2. Application de la bactérie productrice de bactériocines

Les bactéries productrices de bactériocines peuvent être ajoutées comme starter dans des
produits fermentés ou comme culture protectrice. Elles doivent être capables de croître et de
produire des bactériocines dans l'aliment à conserver. La composition du produit (nutriments
accessibles, pH, additifs alimentaires, etc.) et les conditions de stockage (température,
atmosphère, activité d'eau, etc.) doivent donc permettre la croissance et la production de
bactériocines. Si les bactéries sont ajoutées en tant que starter dans des produits fermentés, elles
doivent pouvoir conférer au produit les propriétés organoleptiques désirables tout en produisant
des bactériocines. Les bactéries productrices de bactériocines peuvent être également ajoutées en
combinaison avec un autre starter qui conférera les propriétés organoleptiques désirables. Dans ce
cas, la bactérie productrice de bactériocines ne doit pas détériorer les qualités organoleptiques de
l'aliment fermenté et la bactériocine produite ne doit pas avoir d'activité contre le starter (Deegan
et al., 2006 ; Galvez et al., 2007).

Si la bactérie est appliquée en tant que culture protectrice, elle doit être capable de
produire sa bactériocine sans modifier les propriétés organoleptiques (Rodgers, 2001). La
concentration cellulaire maximale atteinte dans le produit doit par ailleurs être inférieure à la
limite de 106 cfu/g généralement admise pour les produits non fermentés.

51
 Matériel et méthodes

A. MATERIEL
I. Bactéries

I. 1. Souches d’E. coli pour les manipulations de clonage

Les souches d’E. coli utilisées lors des manipulations de clonage sont: DH5α: supE44,
∆lacU169, (Φ80 lacZ∆M15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relAl, et TOP 10: mcrA
∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 araD139 ∆(ara-leu) 7697 galU
galK rpsL endA1 nupG.

I. 2. Bactéries lactiques
I.2.1. Productrices de bactériocines

La sélection de souches de bactéries lactiques productrices de bactériocines a été réalisée

sur une collection de cinquante quatre souches préalablement isolée lors de travaux antérieurs
effectués au LEMP-CBS. Parmi les souches retenues, une appelée TN635 qui a fait l’objet d’une
partie du travail de cette présente thèse.

I.2.2. Utilisées comme cellules indicatrices

Lactobacillus casei DSM 20011, Lactobacillus sakei 2525, Lactobacillus delbrueckii

DSM 20081, Lactobacillus lactis ATCC 11454 et Lactobacillus lactis subsp cremoris DSM
11603).

I. 3. Autres bactéries indicatrices

Bactéries Gram positives: Micrococcus. luteus LB 14110, Staphylococcus aureus ATCC
6538, Listeria ivanovii BUG 496, Enterococcus faecalis JH 2-2 et Enterococcus faecium
ENSAIA 631. Bactéries à Gram negative Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella enterica
ATCC43972, Pseudomonas aerigunosa ATCC 49189, Hafnia sp et Serratia sp.

51
 Matériel et méthodes

I. 4. Streptomyces
Deux souches ont fait l’objet d’études approfondies durant ce présent travail. Il s’agit de
la souches TN17 et Fr10 qui ont été isolées, sélectionnées et identifiées lors de travaux antérieurs
réalisés au LMB-CBS. Pour les études taxonomiques, les souches utilisées sont:
- trois souches apparentées à la souche TN17 qui sont: Streptomyces lavendofoliae
NBRC 12882, Streptomyces gobitricini NBRC 15419 et Streptomyces lilaceus NBRC 13676
- Deux souches apparentées à la souche Fr10 qui sont: Streptomyces microflavus DSM
40331 et Streptomyces griseorubiginosus DSM 40469.

II. Champignons
Les activités antifongiques ont été déterminées contre le champignon filamenteux
Fusarium sp., isolé à partir d'un consortium microbien au CBS, et la levure unicellulaire
Candida tropicalis R2 CIP203 (CTR2), qui est une souche de référence résistante aux deux
antifongiques polyèniques majeurs : l’amphotéricine B et la nystatine.

III. Vecteur de clonage

Le vecteur utilisé pour le clonage du gène ARN 16S de la souche TN635 est le pIJ2925
(Janssen et Bibb, 1993) : C'est un vecteur dérivé du pUC18 ayant une taille de 2,71 kb et portant
le gène de la résistance à l'ampicilline. Il porte deux sites de restrictions BglII de part et d'autre
du site multiple de clonage "polylinker".

IV. Les milieux de cultures

Sauf indication, la composition des milieux indiqués provient de Sambrook et al., (1989)
pour E. coli, Hopwood et al., (1985) pour Streptomyces et de Man Rogosa et Sharpe (MRS) pour
les bactéries lactiques. Tous les milieux de culture sont stérilisés par autoclavage en cycle
humide 20 min à 120 °C.

IV. 1. Milieux solides

IV. 1. 1. Milieux utilisés pour les souches d’Escherichia coli

C’est le milieu LB (Luria Bertani) de la composition : 10 g peptone ; 5 g NaCl ; 5 g

extrait de levure ; H2O distillée q.s.p. 1l ; pH 7,2 et 15 g agar. Ce milieu est additionné si
nécessaire, par l'antibiotique voulu et par le X-gal et l'IPTG à des concentrations appropriées.
Pour le test des activités antibactériennes contre E. coli, le milieu utilisé est le LB à 5 g/l d’agar.

52
 Matériel et méthodes

IV. 1. 2. Milieux utilisés pour les cellules indicatrices

IV.1.2.1. Bactéries

Pour les bactéries lactiques de genre Lactobacillus (Lactobacillus casei DSM 20011,
Lactobacillus sakei 2525 et Lactobacillus delbrueckii DSM 20081) le milieu utilisé est le milieu
MRS «Man, Rogosa and Sharpe» dont la composition est : polypeptone (10g/l), extrait de viande
(10g/l), extrait autolytique de levure (5g/l), glucose (20g/l), Tween 80 (1,08g/l), phosphate
dipotassique (2g/l), acétate de sodium (5g/l), citrate d’ammonium (2g/l), sulfate de magnésium
(0,2 g/l) et sulfate de manganèse (0,05 g/l) . Pour les bactéries lactiques du genre Lactococcus
(Lactococcus lactis ATCC 11454 et Lactococcus lactis subsp cremoris DSM 11603) le milieu
utilisé est le milieu M17 dont la composition est : peptone (5 g/l), extrait de viande (2,5 g/1),
peptone de caséine (2,5/g), extrait de levure (2,5g/l), extrait de levure (5g/l), glucose (5 g/l), acide
ascorbique (0,5 g/l), sulphate de magnesium (0,25 g/l), hydrogénophosphate de dipotassium (13,3
g/l), dihydrogénophosphate de potassium (5,7 g/l) et agar (15 g/l). Pour Listeria ivanovii BUG
496, Enterococcus faecalis JH 2-2, Enterococcus faecium ENASAIA 631, Serratia [Link] Hafnia
sp. et le milieu de culture utilisé est le BHI (Brain Heart Infusion) dont la composition : perfusion
du cœur et du cerveau de porc (17,5g/l), gélatine de pancréas digéré (10g/l), chlorure de sodium
(5g/l), phosphate disodique (2,5 g/l) et glucose (2g/l).

IV.1.2.2. Champignons

Pour le champignon filamenteux, Fusarium sp., c’est le milieu PDA commercial (Potato
Dextrose Agar : Pomme de terre – Glucose – Agar) à raison de 39,5g/l. Concernant la levure
Candida tropicalis R2 CIP203, le milieu utilisé est le YP10 dont la composition est : 10 g/l
extrait de levure, 10 g/l peptone, 100 g/l glucose, 15 ml d’une solution d’adénine à 2 g/l et 15g/l
Agar.

IV. 1. 3. Milieux utilisés pour les bactéries lactiques productrices de

bactériocines

C’est le milieu MRS solide

IV. 1. 4. Milieux utilisés pour les souches de Streptomyces

IV.1.4.1. Milieux de sporulation

Pour la sporulation, deux milieux de cultures ont été utilisés :

53
 Matériel et méthodes

* Milieu Gruau : 30 g gruau ; 5 g glucose ; 5 g extrait de levure ; 1 g extrait de viande ; H2O

distillée q.s.p. 1l ; pH 7,2 et 15 g agar
* Milieu R2 (Okanish et al., 1974) : 103 g sucrose ; 0,25 g K2SO4 ; 10,12 g MgCl2,6H2O ; 10 g
Glucose ; 0,1 g casaminoacide ; H2O distillée q.s.p. 800 mL. Pour 80 ml du milieu R2, on
ajoute 2,2 g Agar et autoclaver, après autoclavage ajouter: 1ml KH2PO4 (0,5%) ; 8 ml CaCl2,
2H2O (3,68%) ; 1,5 ml L-proline (20%) ; 10 mL tampon TES (5,73% ; pH 7,2) ; 0,2 ml Oligo-
éléments ; 0,5 ml NaOH (1N) ; 0,75 ml Facteurs de croissance. Pour les oligo-éléments (/l): 40
mg ZnCl2 ; 200 mg FeCl3,6H2O ; 10 mg CuCl2,2H2O ; 10 mg MnCl2,4H20 ; 10 mg
Na2B4O7,10H2O ; 10 mg (NH4)6Mo7O24,4H2O.

IV.1.4.2. Milieux utilisés pour les études taxonomiques

Milieux ISP (International Streptomyces Project ; (Shirling and Gottlieb, 1966) ISP1 à
ISP9 dont la composition
* ISP1 : Extrait de levure 3 g, Tryptone 5 g, Agar 15 g, H2O qsp 1l.
* ISP2 : Extrait de levure 4 g, Extrait de malte 10 g, Dextrose 4 g, Agar 15 g, H2O qsp 1l.
* ISP3 : Farine d’avoine Agar (gruau 20 g, Agar 18 g), ajouter 1ml d’une solution saline dont la
composition est la suivante : FeSO4. H2O (1g /l) , MnCl2.4H2O (1g /l) et ZnSO4.7H2O (1g/l).
Agar 15 g, H2O qsp 1l
* ISP4 : Amidon soluble 10 g, K2HPO4 1g, MgSO4 1g, NaCl 1g, (NH4)2SO4 2g, CaCO3 2g,
ajouter 1 ml d’une solution saline dont la composition est la suivante : FeSO4. H2O (1g /l) ,
MnCl2.4H2O (1g /l) et ZnSO4.7H2O (1g/l). Agar 15 g, H2O qsp 1l
* ISP5 : glycérol 10 g, L-Asparagine 1g, K2HPO4 1g, MgSO4 0,5 g, ajouter 1 ml d’une solution
saline dont la composition est la suivante : FeSO4. H2O (1g /l) , MnCl2.4H2O (1g /l) et
ZnSO4.7H2O (1g/l). Agar 15 g, H2O qsp 1l.
* ISP6 : Peptone 20 g, Citrate ferrique d’ammonium 0,5g, K2HPO4 1g, Thiosulfate de sodium
0,08g, extrait de levure 1 g, Agar 15 g, H2O qsp 1l.
* ISP7 : glycérol 15 g, L-Asparagine 1,0g, L-Tyrosine 0,5g, K2HPO4 0,5g, MgSO4 0,5 g, NaCl
0,5g, FeSO4 0,01g, Agar 15 g, H2O qsp 1l.
* ISP 8 : Peptone 5g, Galactose 5g, Extrait de viande 3g, Na2HPO4 2,5, KNO3 1g , Agar 15 g,
H2O qsp 1l.

54
 Matériel et méthodes

* ISP9 : (NH4)2SO4 2, 64 g, KH2PO4 2,38g, MgSO4 1g, K2HPO4 5,65g, auquel on ajoute 1 ml
d’une solution saline dont la composition est : CuSO4.5H2O 6,4g/l, FeSO4.7H2O 1,1g/l,
MnCl2.4H2O 7,9g/l, ZnSO4.7H2O 1,5g/l, Agar 15 g, H2O qsp 1l.

* Milieu bouillon nitrate pour la mise en évidence de la nitrate réductase: Peptone : 1 g ;

extrait de viande : 1 g ; extrait de levure : 2 g ; KNO3 : 1 g ; eau distillée q.s.p. 1000 ml pH 7,5.

* Milieu pour l’utilisation des composés glucidiques comme source de carbone

(Goodfellow 1971): arabinose, inositol, mannose, raffinose, ribose, sucrose, tréhalose, fructose,
galactose, glucose, maltose, lactose, glycérol, rhamnose et xylose, la concentration du sucre est
de 10g/L, 10 g ; bacto-yeast-nitrogen base (Difco) : 6,3 g ; hydrolysat de caséine : 0,01 g ;
K2HPO4 : 2 g ; eau distillée q.s.p. 1000 ml pH 7,2.

* Milieu Gélose nutritive (Goodfellow 1971, Gordon et al., 1974) pour la détermination
de la capacité à hydrolyser: la tyrosine, l'hypoxanthine, la xanthine, l'adénine et la guanine :
peptone : 5 g ; extrait de viande : 1 g ; extrait de levure : 2 g ; NaCl : 5 g ; agar : 15 g ; eau
distillée q.s.p. 1000 ml pH 7,5.

* Milieu pour l’étude de dégradation de l’esculine et l’arbutine (Marchal et Bourdon,

1973) :
esculine (ou arbutine): 1 g ; citrate de fer ammoniacal : 1 g ; peptone : 10 g ; agar: 18 g ; eau
distillée q.s.p.: 1000 ml pH 7.

* Milieu pour l’étude de la dégradation du tween 80 (Sierra, 1957) : Tween 80 : 10 ml ;

NaNO3 : 1 g ; extrait de levure : 5 g ; solution saline: 50 ml ; CaC12, 2H2O: 0,1 g ; eau distillée
q.s.p. 1000 ml; agar : 18 g pH 7,2.

* Milieu pour l’utilisation des sels de sodium (Gordon et al., 1974): Sel de sodium
(Sulfate, Nitrate, Acétate, Tétraborate, Alginate, Hydrogen carbonate, Perchlorate,
Desoxycholate, Thiosulfate, Sulfite, benzoate, butyrate, citrate, oxalate, propionate, pyruvate,
succinate et tartrate): 2 g de l’un de ces sels, NaCl: 2 g ; MgSO4, 7H2O: 0,2 g ; (NH4)2HPO4: 1 g ;
KH2PO4 : 0,5g ; agar: 15 g ; eau distillée q.s.p. 1000 ml ; solution aqueuse de rouge de phénol.

* Milieu pour l’utilisation des acides aminés (Gordon et al., 1974). C’est le milieu ISP9
additionnée par 1ml d’une solution saline. La concentration d’acide aminé est de 10g/L. Les
acides aminés testés sont : Méthionine, Asparagine, Phénylalanine, Acide aspartique, Cystéine,

55
 Matériel et méthodes

Tyrosine, Histidine, Alanine, Leucine, Arginine, Isoleucine, Acide glutamique, Thréonine,

Proline, Sérine, Tryptophane.
* Milieu GYEA, pour tester la sensibilité à l’azide de sodium (à 0,001 et 0,01%), au phénol (à
0,05 et 0,1%) et à la lysozyme à 0,005% (Athalye et al., 1985) : extrait de levure : 10 g ; glucose
: 10 g ; agar : 18 g ; eau distillée q.s.p.: 1000 ml pH 6,8.

IV. 2. Milieux liquides

IV. 2. 1. Milieux utilisés pour E. coli

C'est le milieu LB liquide additionné si nécessaire de l’antibiotique approprié.

IV. 2. 2. Milieux utilisés pour les souches de Streptomyces

• Pour l'extraction d’ADN génomique, c'est le milieu TSB (Tryptic Soy Broth) à 30g
additionné de 5g/l d’extrait de levure. Ajuster le volume à 1l par H2O distillée et le pH à
7.
• Pour la production des molécules bioactives les milieux utilisés sont : Pour la souche TN17
c’est le milieu TSB (Bouillon triptyque de soja) à 30 g/l additionné de glucose à 1% (w/v)
et de (K2HPO4) 1 mmol/l. Pour la souche Fr10, il s’agit du milieu TSB à 30 g /l pour la
préculture et le milieu Bennett dont la composition est la suivante : Extrait de viande (1g/l),
extrait de levure (1g/l), tryptone (1g/l) et glycérol à 0,5% (w/v) pour la culture.

IV. 2. 3. Milieux utilisés pour les souches indicatrices

Pour les bactéries lactiques du genre Lactobacillus et Lactococcus le milieu utilisé est le
MRS. Pour les autres bactéries le milieu utilisé est le LB. Le soft correspondant à ce milieu est du
LB à 5g/l d'agar-agar. Concernant Fusarium sp. nous avons utilisé le milieu PDA à raison de 39,5
g/l. Pour Candida tropicalis R2 CIP203, le milieu utilisé est le YP10.

V. Tampons et Solutions

Sauf indication, la composition des tampons et des solutions utilisés sont décrites par
Sambrook et al., (1989).

56
 Matériel et méthodes

V. 1. Tampons
 T.E. 10X : 100 mM Tris base ; 10 mM EDTA ; H2O distillée q.s.p 1 l. Ajuster le pH à 8
avec du HCl et autoclaver 20 min à 120°C.
 T.B.E 10X : 108 g Tris base ; 55 g acide borique ; 7,44 g EDTA ; H2O distillée q.s.p 1 l.
Ajuster le pH à 8,3.
 Tampon de chargement de l’ADN : 50% Sucrose ; 75 mM EDTA ; 0.2% Xylène cyanol ;
0,2% Bleu de Bromophénol.
 Tampon CaCl2-MOPS-Glucose (pour la préparation des cellules compétentes d'[Link]) :
100mM CaCl2 ; 100mM MOPS ; 0,5% glucose ; H2O distillée q.s.p 1 l. Ajuster le pH à 8.
 Tampon de migration pour les protéines (10X) : Tris 0,25M pH 8,5, glycine 1M, SDS
1%.
 Tampon phosphate (0.1M): il est composé par les proportions des solutions A et B
suivantes:
- Solution A : tampon phosphate de sodium monobasique (0,2 M) : 27,8 g de NaH2PO4 dans
1000 ml.
- Solution B : tampon de phosphate de sodium dibasique (0,2 M) : 53,65 g de Na2HPO4, dans
1000 ml.
Vt = 100 ml (X ml de A + Y ml de B), Vt = volume total égal à 200ml (Tableau 5).

Tableau 5 : Composition et pH du tampon phosphate 0,1 M

X (ml) Y (ml) pH

93,5 6,5 5,7

87,7 12,3 6

68,5 31,5 6,5

39,0 61,0 7,0

16,0 84,0 7,5

5,3 94,7 8

 Tampons utilisés pour la purification des biomolécules de Streptomyces par HPLC : Deux
tampons d’élutions ont été utilisés :

57
 Matériel et méthodes

- Tampon A : H2O 99,9 % ; acide formique 0,1%.

- Tampon B : Acétonitrile 99,9% ; acide formique 0,1%.
 Tampons utilisés pour la purification des bactériocines de bactéries lactiques par HPLC :
deux tampons ont été utilisés avec un débit de 0.5 ml/min et λ= 280nm
- Tampon A : H2O 99,9 % ; acide trifluoroacétique ”TFA” 0,1%.
- Tampon B : Acétonitrile 99,9% ; TFA 0,1%.
Les conditions utilisées sont mentionnées dans le tableau suivant :

Tableau 6 : Condition HPLC pour la purification de la bactériocine de la souche TN635.

Temps Tampon Tampon

(min) A (%) B (%)
0 90 10
5 50 50
30 50 50
35 20 80
50 10 90
60 10 90

V. 2. Solutions
 Solution d'oligo-éléments : 40 mg ZnCl2 ; 200 mg FeSO4 ; 6,5 mg H3BO3 ; 13,5 mg
MoNa2O4,2H2O et 100 ml H2O.
 Solution de MgSO4, 7H2O (0,1M).
 Solution de K2HPO4 (0,1M).
 Solution de X-gal : dissoudre 20 mg de 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl β-D-galactoside (X-
gal) dans 1 ml diméthyl-formamide, puis garder à -20°C à l'abri de la lumière.
 Solution d’IPTG : dissoudre 0,2 g d'isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG) dans 10
ml d'eau distillée puis stériliser par filtration sur 0,22 µm et garder à -20°C.
 Solution saline pour l’étude de la dégradation du tween 80 : K2HPO4: 0,25 g ; MgSO4,
7H2O : 0,125 g ; NaCl : 0,125 g ; FeSO4, 7H2O : 0,00 1 g ; MnSO4 : 0,00 1 g ; eau
distillée q.s.p. 50 ml.

58
 Matériel et méthodes

 Solution aqueuse de rouge de phénol : 0,04% de rouge de phénol dans 20 ml H2OD, pH

6,8.
 Solution saline pour la détermination de l’utilisation des acides aminés: CuSO4: 0, 64 g,
FeSO4 : 0,11g, MnCl2 : 0,79g, ZnSO4: 0,15g, Eau distillée : 100ml.
 Solutions d’antibiotiques : Ces solutions sont préparées dans H2O distillée et sont
stockées à -20°C à des concentrations appropriées.
 Solutions HCl et NaOH (1N) pour l’ajustement du pH.
 Solution de catalase à 100 mg/ml pour la détection des activités bactériocines.
 Solution de trypsine (Sigma), pronase (Sigma), protéinase K (behringer), lipase A
(Sigama) et α-amylase (Sigma) utilisées à une concentration finale de 1 mg/ml.
 Solutions de surfactants (Tween 20, Tween 80, urée, Triton X-100, SDS « sodium
dodecyl sulphate », EDTA « ethylenediaminetetraacetic acid » et PMSF
« phenylmethanesulphonylfluoride ») utilisées à 1% (V/V).
 Solutions de solvants organiques (acétate d’éthyle, isopropanol et méthanol) utilisées à
50% (V/V).
 Solution de phosphate de sodium à pH 7.
 acrylamide 30%, Bis-acrymalide 0,8%.
 Solution de persulfate d’ammonium : 100 mg de Persulfate d’ammonium dans 1 l d’eau
distillée.
 Solution de bleu de charge (5x) : Tris HCl pH8 (100µl d’une solution de 10mM), EDTA
(20µl de 1mM), SDS (2,5 ml d’une solution de 2,5%), B-mercaptoéthanol (0,5 ml de
solution de 5%), Glycérol (1ml de solution 10%), Bleu de Bromophénol (5µg) et Eau
distillée (5,88ml)
 Solution de coloration : 0,25% Bleu Coomassie R-250 dans le mélange : éthanol, eau
distillée, acide acétique (5/5/1).
 Solution de décoloration : Ethanol 5%, acide acétique 7%, eau distillée 88%.
 Réactifs utilisés pour la purification des protéines : sulfate d’ammonium, réactif de
Bradford (BIO-RAD), TEMED : N,N,N’,N’-tétraméthyléthylénediamine, SAB (Sérum
Albumine Bovine), PMSF (Phénylméthylsulphonyle fluoride) et EDTA.
 Solutions pour la préparation de l'ADN plasmidique à partir d'E. coli:

59
 Matériel et méthodes

- Solution I : 45 ml glucose 20% ; 25 ml Tris-HCl 1M pH8 ; 20 ml EDTA 0,5 M à pH8 et

H2O distillée q.s.p. 1 l.
- Solution II : NaOH 0,2 M ; SDS 1%.
- Solution III : 3 M acétate de potassium ; 0,2 M acide acétique glacial ; H2O distillée,
q.s.p 11. Ajuster le pH à 4,8.
 Solutions pour la préparation de l'ADN total à partir de souches Streptomyces

- Solution I: Sucrose 0,3M; Tris-HCl (pH 8) 25mM; EDTA 25mM.

- Solution II : NaOH 0,2M / SDS 1%.

- Solution III : 3M acétate de potassium ; ajuster le pH à 4,8 par l'acide acétique glaciale et
filtrer sur millipore.

 Solution de Bromure d’Ethidium: solution de marquage d’ADN à 1µg/ml final.

 Solution de phénol (Maniatis et al., 1982): au phénol cristallisé fondu à 68°C, saturé et
équilibré par du Tris 0,1 M pH 8, ajouter de l'hydroxyquinoléine à une concentration finale
de 0,5%. Faire deux extractions par un volume égal de tampon Tris 1 M pH 8 suivi de
plusieurs extractions avec le tampon Tris 0,1 M pH 8, jusqu'à ce que le pH de la phase
aqueuse soit supérieur à 7,6. La phase phénolique est ensuite récupérée et conservée.
 Solutions et tampons pour la préparation de l'ADN total à partir de souches de bactéries
lactiques :

- Tampon I: Glucose 50mM ; Tris 25mM, EDTA 10mM.

- Solution I : Lysozyme (5mg/ml).

- Tampon II : Tris 10mM, NaCl 100mM, EDTA 5mM et SDS 1%.

- Solution II: phénol/chloroforme
- Solution III : acétate de sodium (3M)
 Solution de ninhydrine : révélateur des amines, des acides aminés, des osamines et des
phospholipides contenant la phosphatidyléthanolamine.

- Solution de vaporisation: dissoudre 0,2 g de ninhydrine dans 100 ml d’éthanol.

60
 Matériel et méthodes

- Traitement complémentaire: chauffer à 110°C (5 à 10 min) jusqu’au développement optimal

des taches (couleur violette ou rose).

 Réactif de Dragendorff selon Munier et Macheboeuf: utilisé pour révéler la

phosphatidylcholine.
- Solution a: dissoudre 0,85 g de nitrate de bismuth basique dans 10 ml d'acide acétique
cristallisable et 40 ml H2OD.
- Solution b: dissoudre 8 g d'iodure de potassium dans 20 ml H2OD.
- Solution de réserve: mélanger a et b (volumes égaux). Cette solution se conserve bien au
réfrigérateur (flacon sombre).
- Solution de vaporisation: avant emploi, mélanger 1 ml de solution de réserve, 2 ml d'acide
acétique cristallisable et 10 ml H2OD. Les taches de phosphatidylcholine apparaissent orange-
jaune.
 Solution de lugol : 1g d’iode et 2g d’iodure de potassium dans 100 H2OD.

VI. Enzymes, Kits et Oligonucléotides

VI. 1. Enzymes
* RNase pancréatique (RNase A) : la RNase A est solubilisée à une concentration de 10mg/ml. Cette
solution est traitée à 100°C pendant 15min. Après refroidissement à la température ambiante, la
solution est gardée en aliquote à -20°C.
* Protéinase K (pour la préparation de l’ADN): La protéinase K est solubilisée dans H2O distillée
stérile à raison de 5mg/ml et garder en aliquote à -20°C.
* Les endonucléases de restrictions sont utilisées selon les instructions du fournisseur.
* Phosphatase alcaline : la phosphatase alcaline d'intestin de veau "CIP" (Calf Intestinal alkaline
Phosphatase) est utilisée dans son tampon avec une activité optimale à 37°C.
* Ligase : la ligase utilisée est la T4 DNA ligase fournie par Amersham. Son activité optimale est
atteinte dans le tampon T4 DNA ligase fourni par le fabricant à une concentration finale de 1X.
* Taq DNA polymérase (Fermentas): enzyme utilisée pour les réactions d’amplifications par PCR.

61
 Matériel et méthodes

VI. 2. Kits
* Kit de clonage (clonage du gène ARNr 16S de la souche TN635) : Kit pGEM® T Easy Vector
System I de Promega.
* Kit de purification de l'ADN: Kit GFX d'Amersham.

VI. 3. Oligonucléotides
Pour l’amplification du gène ARN 16S de la souche TN635 par PCR, les
oligonucléotides utilisés sont préparés par Proligo ([Link]).

Oligo 1 (direct): P1 : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' et oligo 2 (reverse) P2: 5'-

ATGGCTCAGGACGAACGCT-3'

VII. Matériel chimique et spectroscopique

VII. 1. Purification des molécules actives

VII.1.1. A partir de Streptomyces

Le matériel utilisé pour la séparation et la purification des molécules actives des jus de
fermentation des souches de Streptomyces :

- Des plaques CCM : ce sont des feuilles d’aluminium recouvertes de gel de silice d’épaisseur
0,2 mm (gel 60 F254) fournies par Merck.

- Des plaques CCE : ce sont des plaques en verre recouvertes de gel de silice d’épaisseur 0,75
mm (gel 60 F254) fournies par Fluka.

- Des colonnes de longueur L et de diamètre Φ (selon la nécessité) bien tassées de gel

d’adsorption tel que le gel de silice 60 dont la taille des particules est comprise entre 0,035 –
0,070 mm fournie par Fluka, et de gel de filtration tel que le Sephadex LH20 dont la taille des
particules est comprise entre 25-100 µm fournie par Sigma-Aldrich.

- Une chromatographie de haute performance (HPLC) Shimadzu type LC-6A équipé d’un
détecteur Shimadzu UV Visible SPD-6AV et d’un intégrateur C-R6A, les colonnes utilisées,
sont des colonnes en C18 (analytique et semi-préparative).

62
 Matériel et méthodes

VII.1.2. A partir de bactéries lactiques (bactériocines)

Le matériel utilisé pour la séparation et la purification de la bactériocine de la souche de

Lactobacillus TN635 :

- Des Amicon Ultra à un seuil de coupure de 10kDa.

- Une colonne de chromatographie de longueur L= 70 cm et de diamètre Φ= 1,5cm bien

tassée de gel de filtration Sephadex G25 ayant une limite d'exclusion: 5000 Da, équilibrée avec
20mmol/l du tampon phosphate de sodium (pH7,0) et fournie par Sigma-Aldrich.

- Une chromatographie à haute performance (HPLC, Knauer) : les colonnes utilisées,

sont des colonnes en C18 (analytique et semi-préparative).

VII. 2. Identification des molécules actives

- La détermination des spectres d'absorption est réalisée par un spectrophotomètre de type

Shimadzu UV–160A.

- Les spectres IR sont détectés par un Spectrométrie infrarouge (IR).

- Trois types d'appareil résonance magnétique nucléaire RMN ont été utilisés qui sont: de genre
Bruker AMX 300 (300.135 MHz), de genre Varian unité 300 (300.145) et de genre Varian inova
500 (499.875).

- Pour la détermination des masses des molécules bioactives, on a utilisé un appareil LC/MSMS
Trap XCT – Electrospray (Agilent Technologies) équipé d’une HPLC Agilent 100 DAD detector
(C18 column Zorbax 300 2.1 x 150 mm).

63
 Matériel et méthodes

B. METHODES
I. Cultures des bactéries

I. 1. Souches d'E. coli

En milieu solide, les bactéries sont cultivées sur milieu LB solide additionné si nécessaire
d'antibiotique, d'X-gal et d'IPTG à des concentrations appropriées. Les boîtes de Pétri sont
incubées à 37°C pendant une nuit.
En milieu liquide, les cellules sont cultivées sur milieu LB additionné si nécessaire
d'antibiotique. La culture est incubée à 37°C sous une agitation constante de 250 trs/min pendant
une nuit.
Pour la conservation, les souches d'E. coli sont mises en culture dans le milieu LB liquide
additionné si nécessaire d'antibiotique. La suspension cellulaire est mélangée avec du glycérol
stérile à une concentration finale de 15%, elle est répartie dans des cryotubes puis conservée à -
80°C.

I. 2. Souches de Streptomyces
En milieu solide, les souches de Streptomyces sont cultivées sur milieux Gruau. Les
spores apparaissent après environ une semaine d'incubation à 30°C pour les deux souches TN17
et Fr10. Après sporulation, les cultures en milieux liquides sont inoculées à partir de spores
obtenues par filtration sur coton comme suit:
- Mettre 10 ml d'eau distillée sur une boite contenant la souche sporulée en question et gratter
soigneusement avec une anse de platine. Passer la solution de spores ainsi récupérée sur une autre
boite.
- Passer sur filtre à coton pour retenir le mycélium.
- Compléter le volume à 45 ml par de l'eau distillée et centrifuger 10 min à 5000 trs/min et à 4°C.
- Reprendre le culot de spores dans du glycérol à 15%, et compter le nombre de spores obtenues
sur cellule de Thomas.
- Conserver à -80°C.
Pour la production des biomolécules, des précultures sont préparées à partir des deux
souches dans des erlenmeyers de 1 litre contenant chacune 200 ml de milieu TSB (Tryptic Soy
Broth). L’inoculation est à 107 spores/l. Après culture à 30°C pendant 24h et sous une agitation

64
 Matériel et méthodes

de 250 rpm, ces précultures serviront pour la préparation des cultures en fermenteurs sous une
agitation de 500 rpm. La composition du milieu de ces cultures semi-préparatives est:
* Souche TN17 : TSB à 30 g/l supplémenté de glucose à 1% (w/v) et de potassium de phosphate à
1 mmol/l

* Souche Fr10 : milieu Bennett (2 g peptone ; 10 g glucose ; 1 g extrait de levure ; 1 g extrait de

viande ; pH 7,2 et H2O distillée q.s.p.1l) additionné de glycérol à 0,5% (w/v).

Les cultures de productions des biomolécules sont incubées durant trois jours à 30°C.

I. 3. Souche Lactobacillus plantarum sp. TN635

La souche Lactobacillus plantarum sp. TN635 (productrice de bactériocine) est cultivée
sur milieu MRS de (Man Rogosa et Sharpe) à 30°C et le stockage est fait à -80°C dans des
cryotubes après ajout de 20% (v/v) de glycérol. Avant utilisation, la souche est pré-cultivée deux
fois dans MRS pendant 12 h à 30°C. La culture de production de bactériocine est inoculée à 1%
(à partir de la deuxième préculture) sans agitation.

I. 4. Souches indicatrices
I.4.1. Bactéries

Pour la détermination des activités antibactériennes, les bactéries sont cultivées sur
milieu MRS pour les bactéries lactiques et sur LB pour les autres bactéries dans des conditions
d’aérobiose et à 30°C pour les souches suivantes : Lactobacillus casei DSM 20011,
Lactobacillus sakei 2525, Lactococcus lactis ATCC 11454, Lactococcus lactis subsp. cremoris
DSM 11603, Listeria ivanovii BUG 496, Salmonella enterica ATCC43972, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 49189 et Micrococcus. luteus LB 14110. Dans des conditions d’aérobiose et à
37°C pour les souches suivantes : Escherichia coli ATCC 8739 et Staphylococcus aureus ATCC
6538. Dans des conditions d’anaérobioses et à 30°C pour les souches : Enterococcus faecalis JH
2-2, Enterococcus faecium ENSAIA 631, Hafnia sp. et Serratia sp, et dans des conditions
d’anaérobiose à 37°C pour la souche Lactobacillus delbrueckii DSM 20081.

I.4.2. Champignons

Deux souches ont été utilisées. Un champignon filamenteux, Fusarium sp., et un

champignon unicellulaire, Candida tropicalis R2 CIP203. Le Fusarium sp., est cultivé sur boîtes

65
 Matériel et méthodes

de Pétri contenant du milieu PDA (Potato Dextrose Agar) puis incubées durant 7 jours à 30°C.
Les spores correspondantes sont collectées dans de l’eau distillée puis concentrée pour obtenir
une suspension d’environ 104 spores/ml. La levure Candida tropicalis R2 CIP203 est cultivée en
milieu YP10 à 30°C pendant 24h et sous une agitation de 200 rpm.

II. Détection des activités biologiques

II.1. Activités biologiques à partir des souches de
Streptomyces
Après la culture des deux souches étudiées (TN17 et Fr10), et observation microscopique
(vérification de l’absence de contaminants), nous procédons à une centrifugation de ces cultures à
8000 tr/min durant 20 min. Après récupération des surnageants, nous testons la présence des
activités antimicrobiennes (antibactériennes et antifongiques) soit directement sur les surnageants
bruts, soit après des étapes d’extraction et de purification.

II.1.1. Dosage de l’activité antimicrobienne dans le surnageant brut

- Couvrir une boite de Pétri contenant du milieu solide « LB » avec 3,5 ml de LB soft
(milieu LB à 5g/l agar-agar) contenant 30 µl d’une culture de 5 h (phase exponentielle) de la
souche indicatrice en question, ou 100 µl d'une suspension de spores du champignon filamenteux
Fusarium sp., ou 50 µl d'une culture de la levure Candida tropicalis R2 CIP203.

- Laisser sécher les boites environ 20 min dans des conditions stériles.
- Sur des disques de 8 mm de diamètre soigneusement mis sur la boite de Pétri, déposer
150µl du surnageant (par dépôts successifs de 20 µl chacun tout en évitant les débordements).
Laissez sécher les disques dans des conditions stériles.
- Placez les boites 2 h à 4°C pour faire diffuser l’activité biologique déposée sur le disque
vers le milieu de la boite de pétri.
- Incubez une nuit les boites à la température optimale de croissance de la souche
indicatrice

66
 Matériel et méthodes

La présence de l'activité antimicrobienne dans un surnageant donné est détectée par la

formation d’une zone d’inhibition de croissance de la souche indicatrice autour du disque. Plus le
diamètre de cette zone est grand, plus l’activité contenue dans le surnageant est importante.

II.1.2. Dosage de l’activité antimicrobienne après extraction des

biomolécules

Au volume du surnageant, nous ajoutons un volume égal de solvant organique, l’acétate

d’éthyle. Après extraction liquide - liquide, le volume de la phase organique obtenue est réduit
par évaporation (Rotavapor, LABOROTA 4000). Les activités antimicrobiennes au niveau de
cette phase organique sont effectuées dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-
dessus. La seule différence c’est la quantité déposée sur le disque qui est inférieure à 150 µl. Elle
varie selon la concentration de la phase organique (entre 20 et 60 µl). Comme témoin négatif,
nous déposons sur un disque et pour chaque souche indicatrice 60 µl du solvant d’extraction
(l’acétate d’éthyle).
Les molécules pures sont testées dans les mêmes conditions. Les quantités utilisées sont
de 50µg par boite.

II.2. Activités biologiques à partir des bactéries lactiques

Cinquante quatre souches de bactéries lactiques ont été testées pour leur capacité à
produire des bactériocines.

II.2.1 La méthode d'antagonisme différé

Pour vérifier la présence d'activité inhibitrice dans les surnageants de culture des souches
lactiques testées, nous avons utilisé la méthode d'antagonisme différé. Cette méthode consiste à
inclure la souche indicatrice dans une gélose LB pour les bactéries et dans le milieu PDA pour les
champignons. Ainsi, la souche indicatrice bactérienne ayant poussé dans un milieu liquide LB
durant environ 5 heures est diluée 60 fois (50µl dans 3ml de LB soft, un milieu LB contenant de
l'agar à 5g/l). La solution obtenue est ensuite homogéinisée et coulée sur une boite contenat déjà
un milieu gélosé LB. Pour les activités antifongiques, c’est le même principe sauf pour le
Fusarium sp., nous utilisons une suspension de spores diluée, et pour la levure Candida tropicalis
R2 CIP203 nous utilisons une dilution d’une culture de 24h. Après étalement de la cellule

67
 Matériel et méthodes

indicatrice, 20 µl des échantillons à tester sont déposés sur un disque de papier de diamètre 8 mm
délicatement mis sur la boite. Les boites sont ensuite placées à 4°C durant 2h pour faire diffuser
les biomolécules puis incubées à la température optimale de croissance de la souche indicatrice
en question. Comme contrôle négatif, 20µl de milieu MRS incubé sans ensemencement
microbien sont déposés sur un disque dans les mêmes conditions.

II.2.2 La méthode des dilutions (AWDA)

Pour doser le pouvoir inhibiteur du surnageant de la culture de la souche TN635, nous avons
utilisé la méthode Agar Well Diffusion Assay (AWDA) (Tagg et McGiven 1971). Pour
déterminer le nombre d’unités arbitraires du surnageant, nous avons réalisé différentes dilutions.
L’activité est définie comme étant l’inverse de la plus grande dilution montrant une zone
d’inhibition de la souche indicatrice. Elle est exprimée en unités arbitraires par millilitre (UA/ml).

III. Purification et caractérisation des biomolécules

III.1. A partir de souches de Streptomyces
III.1.1. Purification

Pour la purification des biomolécules et après leur extraction à partir du surnageant de la

culture de la souche étudiée en utilisant le solvant organique adéquat (acétate d’éthyle) la phase
organique obtenue est concentrée puis soumise à plusieurs étapes chromatographiques :

III.1.1.1. Chromatographie sur couche épaisse (CCE)

La chromatographie sur couche épaisse a le même principe que la chromatographie sur

couche mince sauf que cette dernière permet une analyse qualitative alors que la première permet
une étude quantitative. Après dépôt de l’extrait à analyser et élution avec le solvant qui nous
permet de détecter la bonne séparation, la révélation est effectuée sous UV ce qui permet de
marquer les différentes bandes qui existent.
Après grattage des différentes bandes séparément, le contenue correspondant est dissout
dans un solvant adéquat. Après filtration et évaporation du solvant, la solution en conséquence
est testée pour sa contenance des biomolécules. Si, cette dernière est biologiquement active, nous
poursuivons la purification tout en utilisant d’autres techniques chromatographiques. Par ailleurs,
et dans des rares cas, la séparation par CCE peut conduire à l’obtention de molécules pures.

68
 Matériel et méthodes

III.1.1.2. Chromatographie sur colonne

Dans la présente étude nous avons utilisé la chromatographie d’adsorption et la

chromatographie de filtration.

* Chromatographie d’adsorption : Ce genre de chromatographie consiste à séparer les

différentes molécules selon leurs polarités. La colonne utilisée présente une longueur et un
diamètre qui dépend de la quantité d’extrait à introduire. L’entassement est réalisé par un gel de
silice 60 dissout dans un solvant apolaire puis l’élution sera faite par le même solvant tout en
augmentant la polarité par un autre solvant plus polaire.
* Chromatographie d’exclusion : Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi
filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première
approximation sur la masse molaire des molécules à séparer. La phase stationnaire est constituée
de billes de polysaccharides, de type séphadex, gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution. Vu
que le volume des billes est très finement calibré, les molécules dont le volume est supérieur à
celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement. En revanche, les molécules dont
le volume est inférieur à celui des billes y pénètrent et y subissent des frottements qui les
retardent. En effet, si l'on connaît la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un
mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté: c'est celui dont le domaine de
fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion
partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier.

III.1.1.3. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une technique instrumentale

basée sur les mêmes principes que ceux que la chromatographie classique sur colonne. Elle peut
donc mettre en œuvre selon la nature de la phase stationnaire, aussi bien des phénomènes de
partage (qui sont les plus courants), que des phénomènes d’adsorption, d’échange d’ions ou
d’exclusion. Dans notre cas nous avons utilisé une colonne C18 et comme éluant: A = eau et B =
acètonitrile. Selon la nature de la séparation, on utilise un gradient d'élution ou on procède la
séparation par un phénomène isocratique
Généralement, pour aboutir à des biomolécules pures, il est indispensable d’utiliser toutes
ces différentes techniques chromatographiques. A chaque étape il faut tester l’activité biologique

69
 Matériel et méthodes

de la solution en question et également procéder à des tests chimiques par le biais de la

chromatographie sur couche mince CCM.

III.1.1.4. Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes
d’adsorptions; la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progressent le long
d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière
plastique ou d’aluminium. Après le dépôt de l’échantillon sur la phase stationnaire, les substances
migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant. Lorsque les composants de
l’échantillon à analyser sont colorés, leur séparation est relativement facile sur la plaque. Dans le
cas contraire, nous devons rendre les tâches visibles par révélation. Les méthodes de révélation
utilisées sont les suivantes:

* Révélation par Radiation UV : En exposant la plaque à une source de radiation UV de 365

nm ou de 254nm, certains composés apparaissent sous forme de tâches brillantes.

* Révélation chimique : p-anisaldehyde: (84 / 14/ 1/ 0,5) méthanol, acétate d’éthyle, acide
sulfurique, p-anisaldehyde. Ce genre de révélateur permet de mettre en évidence la présence de
plusieurs substances entre autres des glycosides, antioxydants, stéroïdes, sapoginines, phénols,
alcools et des macrolides.

III.1.2. Caractérisation chimique des biomolécules

Pour la détermination de la structure chimique des biomolécules purifiées à partir des

surnageants des cultures des souches de Streptomyces, nous avons utilisé plusieurs techniques
spectroscopiques :

III.1.2.1. Spectre Ulrat Violet (UV)

La région de l’UV s'étend de 10 nm à 400 nm mais les spectromètres UV usuels ne

permettent le tracé des spectres que pour les longueurs d'onde comprises entre 200 nm et 400 nm
(proche UV). Un spectre UV (ou visible) résulte de l'absorption de radiations UV (ou visibles)
par une molécule. Dans les régions UV et visible, les longueurs d'ondes correspondent à des
différences d'énergie DE = E2 - E1 (DE = hc/l avec l, longueur d'onde de la radiation) qui
affectent le domaine des transitions électroniques : passage d'une orbitale d'énergie E1 à une
orbitale d'énergie E2 plus élevée. Le retour de l'état excité à l'état fondamental se fait par

70
 Matériel et méthodes

restitution sous forme de lumière de l'énergie absorbée. Le principe de dosage par

spectrophotométrie UV–visible consiste à chercher l’absorbance à chaque valeur de la longueur
d’onde. On utilise un système de type monochromateur pour fixer la longueur d’onde et un
photomultiplicateur pour enregistrer l’absorbance correspondante. La variation de la longueur
d’onde sur une plage adéquate permet d’obtenir un spectre d’absorption.
Pour cette détermination :

- Dissoudre la molécule pure dans un solvant adéquat

- Préparer une cuve de solvant qui servira de référence.
- Faire un spectre d’absorption de la molécule dans un domaine compris entre 185 et 400 nm.

III.1.2.2. Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une méthode spectroscopique polyvalente

utile aussi bien en analyse quantitative que structurale. Elle est généralement utilisée en
complément des autres méthodes de spectroscopie classiques et de la spectrométrie de masse
pour localiser les atomes, de préciser la formule développée et la stéréochimie du composé
étudié.
Le spectre RMN est constitué d’un diagramme représentant des signaux de résonance
émis par certains noyaux atomiques de l’échantillon. Pour obtenir ces signaux, l’échantillon est
soumis à l’action conjointe de deux champs magnétiques dont l’un est intense et fixe, tandis que
l’autre est environ 10.000 fois plus faible et variable.
RMN 2D : Les spectres RMN 2D possèdent des données de déplacement chimiques sur deux
axes de fréquences. Ils permettent une corrélation des fréquences de résonance de différents
noyaux. On distingue des corrélations homo ou hétéronucléaire, selon que F1 ou F2 (les deux
axes de fréquence) contiennent des fréquences de noyaux de même espèce ou d’espèce différents.
* Expérience COSY (COrrelation SpectroscopY) :
Cette expérience permet de visualiser des taches de corrélations dites aussi signaux ou
pics d’intersections hors diagonale indiquant les noyaux qui sont couplés entre eux. L’expérience
permet à l’aide de ces pics d’intersection, de noter les corrélations entre protons géminés non
équivalents et vicinaux et d’obtenir des informations sur la structure moléculaire.

71
 Matériel et méthodes

* Expérience HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) :

Elle permet de visualiser sur un spectre à deux dimensions (1H-13C) les taches de
corrélation correspondantes au couplage direct 1J des protons avec les carbones qui les portent.
* Expérience HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) :
Elle permet de visualiser les taches de corrélation entre un noyau 13C et un noyau 1H via
un couplage à longue distance 2J et 3J. On peut ainsi observer les carbones quaternaires grâce aux
protons se trouvant à des distances 2J et 3J. Cette expérience permet de déterminer l’enchaînement
du squelette carboné de la molécule étudiée.

III.1.2.3. Spectroscopie de Masse

Parmi les différentes méthodes d’analyses structurales utilisées en chimie organique, la

spectrométrie de masse présente l’originalité de s’adresser à des substances analysées en phase
gazeuse et non en phase liquide condensée. Toutes les techniques de spectrométrie de masse font
appel non aux espèces moléculaires en tant que telles mais aux entités ioniques qui en
proviennent. Tous les procédés de spectrométrie de masse reposent en effet sur les déplacements
de particules chargées dans des champs électromagnétiques. Cela nécessite donc, pour que
l’analyse d’une substance organique soit réalisable en spectrométrie de masse, une étape
préalable d’ionisation de l’échantillon.
Un spectromètre de masse comporte trois parties distinctes : Une source d’ion, un
analyseur et un détecteur
III.[Link]. Source d’ions
Enceinte au sein de la quelle les ions sont formés à partir de l’échantillon vaporisé.
Les différentes sources d’ions sont :
* Ionisation Electronique (IE) : Elle s’adresse à des composés suffisamment volatils, apolaires et
stables à la chaleur pour que l’évaporation puisse avoir lieu sans pyrolyse. Les ions sont produits
par suite à un bombardement de la molécule M par des électrons de forte énergie émis par un
filament incandescent. En raison de l’énergie du faisceau d’électron utilisé, l’ion moléculaire M+
se décompose suivant un mécanisme qui dépend de la structure moléculaire pour fournir une
série d’ions caractéristiques de la molécule étudiée.
* Ionisation Electrospray (ESI) : L’électrospray repose sur l’introduction d’une solution aqueuse
du composé à analyser par un capillaire très fin porté à un haut potentiel. Le champ électrique
intense appliqué à la sortie du capillaire provoque la formation d’un nuage de gouttelettes

72
 Matériel et méthodes

chargées qui traversent simultanément un gradient de champ électrique et un gradient de pression

dans la direction de l’analyseur du spectromètre de masse.
Les spectres ESI présentent en général un ensemble de pics correspondant aux ions multichargés
de type [M+nH]n+ en mode positif où M correspondant à la masse moléculaire de la molécule
analysée, et n au nombre de charges portées par cette molécule ionisée. En mode négatif, la
formation d’espèces ionisées s’obtient par déprotonation, anionisation ou perte de contre cation
(Figure 10). Dans le présent travail, nous avons utilisé une source ESI.

III.[Link]. Analyseur
Pour chacune des espèces ioniques issues de la source d’ion, l’analyseur mesure le rapport
entre la masse (m) et la charge (z). On distingue deux types d’analyseurs :
* Analyseur quadripolaire : Il est constitué de quatre barreaux, de section hyperbolique ou
circulaire, disposés autour de la trajectoire des ions dans l’analyseur. Ces quatre barreaux sont
soumis deux à deux à un potentiel composé d’une tension continue (U) et d’une tension
alternative (V).
* Analyseur à trappe d’ions : Les ions produits par la source electrospray sont ensuite piégés
dans la trappe puis éjectés en fonction de leur m/z pour parvenir au détecteur. Il est bien sûr
possible de garder un ion dans la trappe. Cet ion parent peut alors y être fragmenté par collisions
avec un gaz rare induisant des dissociations et les ions fils formés sont alors éjectés de la trappe.
Il est possible dans certaines conditions de répéter tout le processus plusieurs fois ; c’est de la
MSn. Dans le présent travail, nous avons utilisé un spectromètre de masse à trappe d’ions.

Gouttelette chargée
Ions analytes
+ + Clusters de solvant
+ - +
+ -
+ - + Sels (paires d’ions)
- + + -
+
Neutres

Evaporation
+
+ + Ion solvaté
+ ++ + -- +
+
Lim ite de + +
--- +
+
+
Rayleigh - -
+ +
+ +
+
+ -- +
+
+
+ Ion analyte
Explosions Coulom biennes

Figure 10 : Ionisation Electrospray (ESI)

73
 Matériel et méthodes

III.[Link]. Détecteur
Le détecteur mesure en fonction des différentes valeurs de m/z, l’intensité de signal (I) qui
leurs corresponds.

III.2. A partir de la souche de Lactobacillus plantarum

TN635
Pour la purification de la bactériocine BacTN635 à partir de la souche
Lactobacillus plantarum sp. TN635, nous avons utilisé une culture de 900 ml (milieu MRS
ensemencé à 1% v/v par une préculture de la souche étudiée). Après 16h d’incubation à 30°C et
sans agitation, nous avons appliqué au surnageantde culture, quatre étapes de purification
différentes pour la purification de la bactériocine BacTN635. Ces étapes sont :

III.2.1. Précipitation fractionnée par le sulfate d’ammonium

Pour la purification des bactériocines, les protéines du surnageant brut sont

précipitées en présence de sulfate d'ammonium à 40, 60 et 80% de saturation, ajouté peu à peu
sous une douce agitation pendant 4h à 4°C. Après centrifugation à 9000 × g pendant 30 min à
4°C, le précipité est suspendu dans 10 ml de 20 mmol/l de tampon phosphate de sodium (pH 7).

III.2.2. Purification sur membrane cutoff (10 kDa)

Le précipité récupéré est dessalé dans des microconcentrators centrifuges

(Amicon, Inc), avec une membrane de coupure 10-kDa. Elle se fait par des centrifugations
successives à 4500 × g pendant 30 min à 4 ° C.

III.2.3. Gel filtration sur colonne de Séphadex G-25

La solution résultante de la deuxième étape de purification, est chargée sur une

colonne (70 × 1,5 cm) de gel filtration Sephadex G-25 équilibrée avec 20 mmol / l du tampon
phosphate de sodium (pH 7). L’élution des protéines est effectuée avec le même tampon avec un
débit de 30 ml / h. Cent quarante fractions (F1-F140) de 5 ml chacune ont été éluées de la
colonne et collectées automatiquement grace au suivi de l’absorption à 280nm. Ces 140 fractions
ont été regroupées en six échantillons (S1-S6): S1 (F1-F40), S2 (F41-F70), S3 (F71-F76), S4
(F77-F81), S5 (F82-F93) et S6 (F94-F140). L'activité antimicrobienne des différentes fractions

74
 Matériel et méthodes

recueillies a été testée contre Listeria ivanovii BUG 496, Salmonella enterica ATCC43972 et
contre Candida tropicalis R2 CIP203.

III.2.4. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

La fraction active a été soumise à une étape de purification par HPLC en phase
inverse en utilisant une colonne C18 (300 × 4,6 mm) à un débit de 0,5 ml/min, avec deux
solvants : le solvant A (99,9% d'eau, 0,1% d'acide trifluoroacétique "TFA") et le solvant B
(99,9% d'acétonitrile, 0,1% TFA). Le programme d’élution est le suivant : de 0 à 5 min (90% A,
10% B), de 5 à 30 min (50% A, 50% B), de 30 à 35 min (20% A , 80% B), de 35 à 50 min (10%
A, 90% B) et de 50 à 60 min (90% A, 10% B). Les protéines sont détectées par UV à une
longueur d’onde de 280 nm.

III.2.5. Effet des différents traitements sur l’activité bactériocine

Les souches indicatrices utilisées dans ces expériences sont : Listeria ivanovii BUG 496,
Salmonella enterica ATCC43972, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Enterococcus faecalis JH
2-2 et Enterococcus faecium ENSAIA 631 et le champignon pathogène Candida tropicalis R2
CIP203. Toutes ces expériences ont été menées simultanément trois fois dans les mêmes
conditions. Pour chaque détermination, des tests de contrôle ont été réalisés (sans le traitement
correspondant).

III.2.5.1. Effet de la température et du pH

La sensibilité à la chaleur de la bactériocine de la souche TN635 a été étudiée en traitant

le surnageant d’une culture de 16 h de cette souche incubée à 30° C (conditions optimales de
production de l’activité antimicrobienne d’après les études cinétiques préalablement réalisées), à
différentes températures : 45, 70, 85 et 100°C pendant 90 min et 2 h et à l'autoclave (20 min à
121°C).

Afin de déterminer la sensibilité de la bactériocine au pH, le surnageant de la culture de la

souche TN635 (30°C, 16 h d'incubation) est ajustée à différents pH allant de 1 à 14 (intervalle de
1,0) avec des solutions stériles de HCl ou de NaOH 1N. Après 6h de contact à 4°C, le surnageant
est ajusté à pH de 7. Les activités antimicrobiennes sont ensuite effectuées sur les différents
échantillons traités.

75
 Matériel et méthodes

III.2.5.2. Effet des enzymes et des surfactants

Pour la détermination de la nature de l'activité antimicrobienne produite par la souche

TN635, nous avons incubé un ml du surnageant d’une culture de cette souche pendant 3 h à 37°C
en présence de 1 mg de catalase (Boehringer). Un échantillon du même surnageant non traité a
servi de témoin. La sensibilité des composés antimicrobiens contenus dans le surnageant de la
culture de la souche TN635 à différentes enzymes : la trypsine, la pronase E (Sigma), la
protéinase K (Boehringer), la lipase A (Sigma) et α-amylase (Sigma) à concentration finale de 1
mg/ml, a été également étudiée. Pour ce faire, les échantillons ont été incubés pendant 2 h à 37°C
en présence de l’enzyme testée, et immédiatement après, l'activité résiduelle a été déterminée par
la méthode (AWDA). L’effet des surfactants a été également déterminé en utilisant les
surfactants suivants : le Tween 20, le Tween 80, l'urée, le Triton X-100, le SDS, l’EDTA et le
PMSF ajoutés au surnageant de la culture de la souche TN635 (30°C, 16 h) à une concentration
finale de 1% (v/v) et incuber à 30°C pendant 2 h. Les activités résiduelles sont ensuite
déterminées tout en réalisant des témoins de contrôles.

III.2.5.3. Effet des solvants organiques

Des échantillons du surnageant de la culture de la souche TN635 (30°C, 16 h) ont été

mélangés à des solvants organiques : l’acétate d'éthyle, l'isopropanol et le méthanol à une
concentration finale de 50% (v/v). Après une incubation de 1 h à température ambiante, le solvant
organique correspondant a été évaporé sous vide par un Rotavapor et l'activité antimicrobienne
résiduelle a été déterminée.

III.2.6. Electrophorèse en gel polyacrylamide (SDS-PAGE)

L’estimation de la masse moléculaire de la bactériocine purifiée a été réalisée par SDS-

PAGE, gel d'acrylamide à 20% (Laemelli 1970). La concentration en protéine est déterminée
selon la méthode de Bradford (Bradford 1976). Le marqueur de protéine utilisé est de BioLabs
(2-212 kDa). Après migration, le gel a été coupé en deux parties. La partie contenant l'échantillon
et le marqueur de protéine a été traitée par une solution de bleu brillant Coomassie R-250
(Biorad) à 0,25%. La deuxième partie qui contient uniquement l'échantillon, a été lavée avec une
solution à 10 mmol/l de tampon phosphate (pH 7.0) pendant 4 h, puis fixée et utilisée pour la
détection directe de l'activité antimicrobienne contre Listeria ivanovii BUG 496.

76
 Matériel et méthodes

III.2.7. Mode d’inhibition

Pour la détermination du mode d’action de la bactériocine, nous avons utilisé deux

microorganismes indicateurs: Listeria ivanovii BUG 496 et Candida tropicalis R2 CIP203. La
bactériocine de la souche TN635 partiellement purifiée à 400 UA/ml (la fraction obtenue par
chromatographie de filtration sur gel et lyophilisé), a été ajoutée à 200 ml d’une culture de
Listeria ivanovii BUG 496 (en milieu LB) et 200 ml d’une culture du champignon unicellulaire
Candida tropicalis R2 CIP203 (en milieu YP10) en début de la phase exponentielle de croissance
soit avec environ de 107 UFC/ml. Les variations de la turbidité des cultures ont été enregistrées à
une DO à 600nm et le nombre d'UFC a été déterminé pour chaque culture

III.2.8. Détermination de la masse de BacTN635

Afin de déterminer la masse moléculaire exacte de BacTN635, nous avons utilisée la

technique de spectrométrie de masse (MALDI-TOF Applied Biosystems). La matrice utilisée est
l’acide α-cyano-hydroxycinnamique préparé à 5 mg/ml dans 50% acétonitrile contenant 0.1%
l’acide trifluoroacétique.

IV. Techniques d’extraction et de manipulation de l’ADN

IV. 1. Extraction de l'ADN plasmidique à partir d'E. coli
IV. 1. 1. Les mini préparations (Birnboim et Doly "1979" modifiée)

Les bactéries hybergeant les plasmides sont mises en culture de 2 ml en milieu LB

additionné de l'antibiotique adéquat. L'ADN plasmidique est préparé comme suit :
- centrifuger 1,5 ml de cette culture dans un tube « Eppendorf » ;
- resuspendre le culot dans 100 µl de solution I, puis bien homogénéiser ;
- ajouter ensuite 200 µl de solution II préparée extemporanément ;
- mélanger pendant 2 min à température ambiante et garder 5 min dans la glace ;
- ajouter 150 µl de la solution III glacée, homogénéiser, garder 10 min dans la glace puis
centrifuger 10 min à 12000 trs/min ;
- ajouter au surnageant 0,6 volume d’isopropanol, garder 10 min à température ambiante puis
centrifuger 10 min à 12000 trs/min et reprendre le culot dans 100 µl de TE1X ;
- faire un traitement par la RNase A ;

77
 Matériel et méthodes

- ajouter un volume de phénol, bien homogénéiser, centrifuger pendant 3min ;

- prendre la phase supérieure et refaire une extraction par un volume égal de phénol/
chloroforme suivie d’une autre extraction par du chloroforme ;
- ajouter à la phase aqueuse 2 volumes d’éthanol et 1/10 du volume NaCl 5 N, homogénéiser
et garder 15 min à -80°C ;
- centrifuger pendant 15 min, rincer le culot à l’éthanol 70%, sécher puis resuspendre dans 50
µl environ du tampon TE1X et conserver à -20°C.

IV. 1. 2. Les maxi préparations (lyse alcaline)

Le principe est le même que celui des mini préparations.

Les bactéries contenant les plasmides sont mises en culture (400 ml) en milieu LB,
additionné d'antibiotique adéquat, à 37°C durant une nuit. L’ADN est préparé comme suit :
- centrifuger pendant 5 min à 8000 trs/min ;
- resuspendre le culot dans 20 ml de solution I, puis bien l’homogénéisé ;
- ajouter ensuite 40 ml de solution II et garder 10 min à 0°C ;
- ajouter 30 ml de la solution III glacée, homogénéiser, garder 10 min dans la glace puis
centrifuger 10 min à 10000 trs/min ;
- ajouter au surnageant 0,6 volume d’isopropanol, garder 30 min à température ambiante puis
centrifuger 15 min à 12000 trs/min et resuspendre le culot dans du TE1X ;
- faire un traitement par la RNase A puis par la protéinase K ;
- ajouter un volume de phénol, bien homogénéiser, centrifuger pendant 3min ;
- prendre la phase supérieure et refaire une extraction par un volume égal de phénol/
chloroforme suivie d’une autre extraction par du chloroforme ;
- ajouter à la phase aqueuse 2 volumes d’éthanol et 1/10 du volume NaCl 5N, homogénéiser et
garder 15 min à -80°C, centrifuger pendant 15 min ;
- rincer le culot à l’éthanol 70%, sécher puis resuspendre dans du TE1X.

IV. 2. Extraction de l'ADN génomique à partir des souches

de Streptomyces (méthode de Marmur, 1961 modifiée)
Les souches de Streptomyces sont mises en cultures (500 ml) pendant 48 h, puis:
- centrifuger 10 min à 10000 trs/min et à 4°C ;

78
 Matériel et méthodes

- éliminer le surnageant et remettre le culot en suspension dans 200 ml de tampon TES et

centrifuger à nouveau ;
- reprendre le culot dans 60 ml de tampon TES contenant du lysosyme à 2 mg/ml ;
- homogénéiser et placer la suspension environ 20 min à 37°C ;
- ajouter 40 ml d’une solution de SDS à 10%, porter à 60°C durant 5 min et laisser refroidir à
température ambiante ;
- traiter la préparation par un volume égal d’un mélange phénol-chloroforme-alcool
isoamylique (24/24/1) et agiter vigoureusement ;
- séparer les deux phases par centrifugation 5 min à 5000 trs/min ;
- sur la phase supérieure, effectuer 5 traitements successifs comme précédemment .
- ajouter à la phase aqueuse des petites quantités d’éthanol froid (-20°C) et agiter doucement.
- récupérer, à l’aide d’une pipette pasteur effilée, les filaments d’ADN apparus ;
- remettre en solution les filaments d’ADN dans 20 ml de tampon TE1X ;
- faire un traitement par la RNase A puis par la protéinase K ;
- traiter la solution par un volume égal de chloroforme-alcool isoamylique (24/24/1) ;
- précipiter l’ADN 2 heures à –20°C. ;
- reprendre le précipité dans du tampon TE1X

IV.3. Extraction de l’ADN génomique de la souche

Lactobacillus plantarum sp. TN635 (Leenhouts 1990)
Après culture (40 ml) de la souche Lactobacillus plantarum sp. TN635 pendant 16h à
30°C:
- centrifuger 10 min à 10.000 rpm,
- eliminer le surnageant et laver le culot cellulaire obtenu une fois avec 10 ml d'eau distillée,
- mettre en suspension le culot dans 4 ml de solution de lyse (25 mM acide chlorhydrique Tris
[pH 8], 50 mM EDTA, 50 mM de glucose) pendant 20 min.
- centrifuger et reprendre le culot dans 4 ml de tampon de lyse contenant du lysozyme à (5
mg/ml)
- homogénéiser et incuber la suspension 30 min à 37°C
- centrifuger 15min à 5000 et à 4°C,
- au surnageant ajouter 150µl de protéinase K à 20 mg/ml et 350µl de SDS 10%.
- incuber la suspension pendant 30 min à 60 ° C.

79
 Matériel et méthodes

- extraire 5 fois le lysat avec un volume égal de phénol-chloroforme-alcool isoamylique

(25:24:1) et deux fois avec un volume égal de chloroforme-alcool isoamylique (24:1)
- ajouter (0.1 V) d’une solution d’acétate de sodium (3M) et 2V d’éthanol
- placer à -20°C pendant 2h
- centrifuger 15 min à 10000 tr/min
- reprendre le culot obtenu dans 300µl de TE (1x)
- estimer la quantité et la qualité de l’ADN en déposant 2µl sur gel d’agarose 0,8%

IV.4. Quantification de l’ADN

La concentration d’ADN peut être déterminée soit par spectrophotométrie (Sambrook et
al., 1989), soit par estimation de la quantité après électrophorèse sur gel d’agarose.

IV.4.1. Méthode spectrophotométrique

La lecture des densités optiques est effectuée à 280 nm et à 260 nm. Une unité
d’absorbance correspond à une concentration de 50 µg/ml d’ADN double brin. La pureté de
l’ADN est estimée par le rapport DO260/DO280. Ce rapport doit être compris entre 1,8 et 2.

IV.4.2. Méthode utilisant la fluorescence émise par le BET (méthode

empirique)

L’intensité de la fluorescence émise par les molécules de BET intercalées au sein de

l’ADN est proportionnelle à la masse totale de ce dernier. Ainsi, la quantité d’ADN présente
dans l’échantillon est estimée par comparaison de la fluorescence de l’échantillon et celle d’une
gamme de concentration connue après électrophorèse sur gel d’agarose.

IV. 5. Digestion de l’ADN par des endonucléases de

restriction
La digestion de l’ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction se fait selon les
instructions du fournisseur. Le mélange réactionnel contenant l'ADN, le tampon de réaction
adéquat et l'enzyme de restriction (généralement à raison de 3 à 5 unités/µg d'ADN), est incubé
pendant environ 2 heures à la température adéquate. Cette digestion est suivie par électrophorèse
d'un aliquot du milieu réactionnel.

80
 Matériel et méthodes

IV.6. Déphosphorylation de l'ADN

La phosphatase alcaline d'intestin de veau "CIP" catalyse l'hydrolyse des groupements
phosphates situés en 5' des molécules d'acides nucléiques linéaires. Elle est utilisée pour éviter la
fermeture du vecteur de clonage sur lui-même lors de la ligation. Le mélange réactionnel,
contenant l'ADN plasmidique linéarisé par une ou plusieurs endonucléases de restriction et le
tampon de réaction et l'enzyme "CIP", est incubé à 37°C durant 30 min. Ensuite, l'enzyme est
inactivée par la chaleur (10 min à 70°C). Le mélange est extrait aux phénol, phénol-chloroforme,
chloroforme et précipité à l'éthanol.

IV.7. Ligation de l'ADN

L'ADN ligase permet la formation d'une liaison covalente entre une extrémité 3'
hydroxylée et une extrémité 5' phosphate de deux molécules d'ADN. La réaction de ligation
contenant le vecteur linéarisé et déphosphorylé, l'ADN à insérer et le tampon de ligation et l'ADN
ligase, est faite selon les instructions du fournisseur de l’ADN ligase.

IV.8. Electrophorèse sur gel d’agarose

Ce protocole est décrit par Sambrook et al., (1989). Il s’agit de séparer les fragments
d'ADN selon leur taille sur un gel d’agarose (0,8 à 1,4%) dans du tampon TBE1X. La migration
se fait dans un champ électrique à voltage constant.

IV.9. Purification de l’ADN

Pour purifier des fragments d’ADN, nous avons utilisé la technique d’élution à partir de
gel d’agarose. Cette technique utilise un agarose spécifique ayant un point de fusion bas vers
65°C (NuSieve® GTG® Agarose). Le protocole expérimental est le suivant :

- après séparation des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose, visualiser la bande
à purifier et découper la partie du gel qui la contient ;

- ajouter un volume suffisant de TE1X de façon à recouvrir l’agarose et porter à 65°C pendant
10 min jusqu’à liquéfaction complète de l’agarose ;

- faire une extraction au phénol (préchauffé à 60°C), au phénol/chloroforme, puis au

chloroforme ;

81
 Matériel et méthodes

- précipiter l’ADN en présence du glycogène (200 µg/ml) ;

- centrifuger puis reprendre le culot d’ADN dans du TE1X.

IV.10. Séquençage de l’ADN

La méthode utilisée est celle automatisée en utilisant un séquenceur automatique. Les
séquenceurs automatiques sont capables de réaliser à la fois les réactions ainsi que la
détermination de la séquence nucléotidique du fragment d’ADN étudié. Les fragments d'ADN
sont marqués grâce à des marqueurs fluorescents. Une fois la réaction de séquence terminée, la
taille des fragments obtenus est déterminée par une chromatographie. Le séquenceur détecte la
fluorescence émise par les colonnes de chromatographie, repérant ainsi les fragments d'ADN et
leur taille précise. Le résultat est présenté sous forme de courbes présentant la fluorescence
détectée et par suite la séquence nucléotidique qui en résulte.
Au cours de ce travail, nous avons utilisé le séquenceur automatique ABIPrism3100
(Applied Biosystem) du Centre de Biotechnologie de Sfax (CBS). Les réactions de séquences
ont été réalisées dans des plaques PCR de 96 puits en utilisant l’appareil PCR « GeneAmp PCR
system 9700 » et le kit de séquençage « Bigdye Terminator version 3.1 ABI ». Le volume de
réaction est 10 µl contenant : 2 µl de produit à séquencer ; 1,5 µl de tampon (ABI 5X seq
buffer) ; 1 µl d’un mélange d’enzyme/dNTP/ddNTP marqués (Rrmix 2,5X) ; 0,25 µl de
différents primers (200 ng/µl = 30 µM) et l’eau ultra pure q.s.p à 10 µl. Le programme de la
réaction comporte 25 cycles : 10 sec de dénaturation à 96°C ; 5 sec d’hybridation à 50°C et 4
min d’élongation à 60°C.

IV.11. Analyse des Séquences nucléotidiques

Les séquences obtenues sont analysées par le logiciel "Oméga" qui contient plusieurs
programmes permettant de déterminer les phases de lectures ouvertes et la position potentielle
des codons d'initiation et d'arrêt. L'alignement des séquences nucléotidiques a été réalisé par
utilisation du programme "Blast Search Algorithm".
Les analyses phylogénétiques ont été réalisées par l’utilisation du programme PHYLIP
package (Felsenstein, 1989), et les arbres phylogénétiques ont été construits par le programme
algorithmique (NJ) »Neighbor Joining » (Saitou and Nei, 1987).

82
 Matériel et méthodes

IV.12. Amplification par PCR

La PCR est une technique d’amplification spécifique d’une séquence d’ADN grâce à
l’emploi de deux oligonucléotides de synthèse qui s’hybrident avec des séquences qui leurs sont
complémentaires et qui bordent la séquence à amplifier. Nous avons utilisé la technique de PCR
pour amplifier le gène ARN 16S de la souche de Lactobacillus plantarum sp. TN635. Les
conditions opératoires sont :
Mélange réactionnel :
1 µl ADN matrice (200 ng)
1 µl oligo 1 (150 pmoles/µl)
1 µl oligo 2 (150 pmoles/µl)
5 µl tampon DNA polymérase 10X
1 µl dNTP 10 mM
1 µl DNA polymérase ADN dépendante (pfu)
q.s.p 50 µl H2O bidistillée.
Les cycles PCR sont précédés par une étape de dénaturation de la matrice pendant 3
minutes à 94°C. 40 cycles sont utilisés dont chacun comprend :
- une étape de dénaturation : 30 sec à 94°C ;
- une étape d’hybridation des oligonucléotides à la matrice : 1 min à 60°C
- une étape de polymérisation : 3 min à 72°C.
Les deux oligonucléotides utilisés sont :
Direct Oliogo 1 : 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’
Réverse oligo 2 : 5’ ATGGCTCAGGACGAACGCT 3’

V. Transformation d’E. coli

La méthode utilisée est celle au CaCl2. Une culture de 30 ml de cellules en phase
exponentielle (DO600nm : 0,4-0,5) est centrifugée. Le culôt obtenu est repris dans le tampon
MOPS-glucose-CaCl2. Après 30 min à 4°C, les cellules sont centrifugées puis reprises dans 2 ml
de nouveau dans le même tampon. Pour la transformation, l’ADN est ajouté à 0,2 ml de ces
cellules puis gardé 1h à 4°C avant de réaliser un choc thermique à 42°C pendant 2 min. Par la
suite, 1,7 ml du milieu LB sont ajoutés et l’ensemble est incubé (90 min) à 37°C pour
l’expression du phénotype. L’étalement est effectué sur le milieu de sélection contenant

83
 Matériel et méthodes

l’antibiotique. L’efficacité de la transformation est généralement de 106 à 107 transformants par

µg d’ADN pour un ADN plasmidique et de 104 à 105 pour une ligation.

VI. Identification et classification des souches de Streptomyces

Dans le présent travail, nous nous sommes intéressés aux études des critères
morphologiques, aux analyses des constituants de la paroi et aux études physiologiques

VI.1. Critères Morphologiques

Cette étude consiste à noter, aux 7ème, 14ème et 21ème jour d’incubation à 30°C, la
croissance des deux souches d’actinomycètes TN17 et Fr10, l’aspect et la couleur des mycéliums,
la production et la couleur des pigments diffusibles sur les milieux de culture suivants : l’ISP2,
l’ISP3 et l’ISP4, Sabouraud, Agar nutritif et Bennett (Shirling et Gottlieb, 1966).

VI. 2. Analyse des constituants de la paroi

Ces analyses sont effectuées sur des extraits ou des hydrolysats cellulaires. Concernant la
détermination de l’isomère de l’acide diaminopimélique ou DAP (forme LL ou DL) et la
présence de la glycine, la technique utilisée est la chromatographie descendante sur papier. Pour
connaître la composition cellulaire en sucres et en phospholipides membranaires, la technique
utilisée est la chromatographie ascendante sur couche mince. La détermination des acides gras est
réalisée par chromatographie en phase gazeuse.

VI. 2.1. Obtention de la biomasse mycélienne

Les deux souches: TN17 et Fr10 sont cultivées sur milieu ISP2 liquide (50 ml par
Erlenmeyer de 250 ml) en agitation permanente (à 250 rpm) à 30°C. Après 3 jours, lorsque les
cultures deviennent denses, le mycélium est recueilli par filtration, lavé plusieurs fois à l’eau
distillée, séché à 37°C durant une nuit puis conservé à -20°C pour les analyses ultérieures.

VI. 2.2. Analyse des acides aminés pariétaux

Il s’agit dans ce cas de déterminer l’isomère de l’acide diaminopimélique (DAP), qui peut
être sous forme LL ou DL (= méso) et de noter la présence ou non de glycine.
La méthode utilisée est celle de Becker et al. (1964). Dix mg de mycélium sec sont
hydrolysés pendant 18 h à 100°C par 1 ml de HCl 6N dans des tubes à vis hermétiquement
fermés. Après refroidissement, les hydrolysats sont filtrés sur membranes en verre pour éliminer

84
 Matériel et méthodes

les débris mycéliens. Les filtrats sont évaporés à sec dans un bain de sable chaud. Des lavages à
l’eau distillée sont effectués jusqu’à l’élimination complète du HCl et l’obtention d’un pH
compris entre 5,5 et 7.
Le résidu sec est repris dans 0,3 ml d’eau distillée. 15 microlitres sont chromatographiés
sur papier Wathman n° 1. Les papiers sont développés pendant 18 h par chromatographie
descendante à front perdu dans un solvant composé de méthanol, eau distillée, HCl 10N et
pyridine (8 - 17,5 - 2,5 - 10 en volumes). Dix microlitres d’une solution à 0,01M d’acide
diaminopimélique (mélange des isomères LL et DL) et d’une solution de glycine à 0,2 % sont
utilisés comme standards et chromatographiés.
La révélation des chromatogrammes se fait par une solution de ninhydrine à 0,2 %. Les
tâches de DAP sont de couleur olive virant par la suite au jaune. La forme LL migre plus
rapidement que la forme DL (Becker et al., 1964). La glycine apparaît de couleur violette et
migre plus rapidement que les deux isomères de DAP.

VI. 2.3. Analyse des sucres cellulaires

La méthode d’analyse est celle de Lechevalier et Lechevalier (1970b). Cinquante

milligrammes de mycélium sec sont hydrolysés par 2 ml de H2SO4 1N dans des tubes
hermétiquement fermés, pendant 2 h à 100°C. Après refroidissement, l’acide est neutralisé avec
une solution saturée d’hydroxyde de baryum. Le précipité blanc obtenu est éliminé par
centrifugation (7500g durant 20 min). Le surnageant est recueilli, évaporé à sec puis dissout dans
0,3 ml d’eau distillée. Vingt microlitres d’hydrolysat sont déposés sur papier Wathman n°1, de
même que 15 µl de solutions aqueuses standards à 0,1% des sucres suivants : arabinose, xylose,
ribose, galactose, glucose, mannose, et rhamnose.
Les papiers sont développés durant 36 h par chromatographie descendante (à front perdu)
dans un système de solvant composé par la partie supérieure d’un mélange de n-butanol - eau
distillée - pyridine - toluène (5/3/3/4 en volumes).
Les chromatogrammes sont séchés à température ambiante puis révélés par une solution
acide de phtalate d’aniline. Après chauffage à 100°C pendant 5 min, les tâches apparaissent de
couleur rose pour les pentoses et brune pour les hexoses.

85
 Matériel et méthodes

VI. 2.4. Analyse des phospholipides membranaires

C’est une étape importante dans la classification des actinomycètes et surtout dans la
différenciation entre certains genres proches d’actinomycètes. Selon Lechevalier et al., (1977), le
Streptomyces possède le type PII ce type est caractérisé par la présence de la PE
(phosphatidyléthanolamine).
La méthode utilisée est celle préconisée par Minnikin et al., (1977). Quatre cent mg de
mycélium sec sont mis dans un Erlenmeyer de 250 ml hermétiquement fermé, contenant 40 ml
du mélange chloroforme - méthanol (2-1; v/v) puis laissé en agitation (250 rpm) durant une nuit à
température ambiante. L’extrait organique est ensuite récupéré et évaporé à sec à 37°C. Le résidu
est dissout dans 0,3 ml du même mélange de solvants, puis 10 µl de cet échantillon sont déposés
en double dans deux plaques de gel de silice G60 (Fluka) et développés par chromatographie
ascendante dans un solvant composé d’un "mélange chloroforme - méthanol - eau distillée" (65
- 25 - 4, en volumes). De même, 10 µl des solutions témoins (0,01g dans 1ml de chloroforme) de
phosphatidylcholine (PC) et de phosphatidyléthanolamine (PE) sont également
chromatographiés.
La première plaque est révélée avec le réactif de Dragendorff pour la détection de la PC
dont les tâches apparaissent de couleur jaune - orange vif et la seconde plaque, avec la solution de
ninhydrine (0,2% dans de l’acétone) pour la détection de la PE, de couleur violette, après un
chauffage de 5 min à 100°C.

VI. 2.5. Analyse des acides gras cellulaires

• Extraction des acides gras des souches Streptomyces (Quatre étapes sont utilisées) :
- la saponification : 45 g d’hydroxyde de sodium, 150 ml de MeOH et 150 ml d’eau
distillée
- la méthylation : 325 ml de HCl à 6N et 275 ml de MeOH permettant d’abaisser le pH
jusqu’ à 1,5
- l’extraction : 200 ml d’hexane et 200 ml de méthyltertiobutyléther : permettant d’extraire
les esters méthyliques d’acides gras dans la phase organique pour l’utilisation avec le
chromatographe en phase gazeuse.
- le lavage : 10,8g de NaOH dissout dans 900 ml d’eau distillée.

86
 Matériel et méthodes

• Chromatographie en phase gazeuse (CPG) : les caractéristiques de la CPG sont les

suivantes :
 Mode d’injection : Splitless
 Température = 26°C
 Temps d’ouverture de Splitless : 0,5 min en mode Surge 100kPa
 Débit : 1ml/min
 Colonne Zebron (ZB 5MS, 30 mètres, 0,25 nm, 0,25µm) société Phenomenex (USA)
 Les conditions chromatographiques sont : Tempréture de Four 65°C pendant 0,5 min
60°C jusqu’à 140°C pendant 4min 4°C/min jusqu’à 240°C pendant 15min
 Détection (ligne de transfert) à 220°C
 Thermo Fisher Trace GC2000
 Détecteur TF DSQ2
 Mode scan avec 1633V (emv)
 Température de source d’ions à 200°C
 Mass range (40-450) en UMA (Unité de masse atomique).
• Un standard pour la détermination des acides gras pariétaux : « Bacterial Acid Methyl
Esters Mix » Catalog No 47080-U- Supelco, Bellefonte, Philadelphia.

VI. 3. Etudes physiologiques

VI. 3. 1. Production de pigments mélanoïdes

L’observation des pigments mélanoïdes est réalisée sur les milieux gélosés ISP1, ISP6 et
ISP7 recommandés à cet effet par Shirling et Gottlieb (1966).

VI. 3. 2. Production de nitrate réductase

La mise en évidence du nitrate réductase se fait sur bouillon nitrate. La recherche du nitrate
réductase est effectuée grâce au réactif de Griess (commercialisé) (Marchal et Bourdon, 1973).

VI. 3. 3. Utilisation des composés glucidiques comme seules sources de

carbone

Les glucides sont ajoutés au milieu de culture à raison de 1 %. Les lectures se font par
comparaison de la croissance des actinomycètes en présence des glucides ou en leur absence
(témoin négatif). Le milieu contenant du glucose sert de témoin positif. Les glucides testés

87
 Matériel et méthodes

comme seule source de carbone sont les suivants : arabinose, inositol, mannose, raffinose,
ribose, sucrose, tréhalose, fructose, galactose, glucose, maltose, lactose, glycérol, rhamnose et
xylose.

VI. 3. 4. Dégradation de divers autres composés organiques

* Hydrolyse de la tyrosine, de l'hypoxanthine, de la xanthine, de l'adénine, de la guanine

(Goodfellow 1971, Gordon et al., 1974). La dégradation se manifeste par une auréole claire
autour des colonies.

* Hydrolyse de la gélatine. Le réactif de Frazier (commercial), permet de mettre en

évidence la dégradation de gélatine (auréole claire autour des colonies).

* Dégradation de la caséine du lait (Gordon et al., 1974). L’apparition d’une auréole claire
autour des colonies indique la dégradation de la caséine.

* Dégradation de l’esculine et de l'arbutine (Marchal et Bourdon, 1973). La dégradation

de ces 2 hétérosides se manifeste par l'apparition d'un pigment brun à noir autour des colonies.

* Dégradation de l'amidon (Marchal et Bourdon, 1973). Une goutte d’une solution de

lugol permet de mettre en évidence la dégradation.

* Dégradation du tween 80 (Sierra, 1957) : Tween 80 : 10 ml ; NaNO3 : 1 g ; extrait de

levure : 5 g ; solution saline: 50 ml ; CaC12, 2H2O: 0,1 g ; eau distillée q.s.p. 1000 ml; agar : 18 g.
pH 7,2. La dégradation du tween 80 se manifeste par une auréole opaque autour des colonies.

* Utilisation des sels de sodium. La dégradation est notée positivement après virage de
l'indicateur coloré du jaune au rouge-rose. (Gordon et al., 1974).
* Utilisation des acides aminés. Les lectures se font par comparaison de la croissance des
actinomycètes en présence des acides aminés ou en leur absence (témoin négatif). Le milieu
contenant de l’acide aminé sert de témoin positif (Gordon et al., 1974).

VI. 3. 5. Tests de sensibilité à divers agents physiques et chimiques

Pour évaluer la sensibilité des souches TN17 et Fr10 vis-à-vis de certains composés, à des
concentrations définies, certains tests préconisés dans la taxonomie des actinomycètes (Athalye et
al., 1985) sont choisis à savoir :
- Sensibilité au lysozyme à 0,005% (Gordon et Barnett, 1977).

88
 Matériel et méthodes

- Sensibilité à l’azide de sodium (à 0,001 et 0,01%) et au phénol (à 0,05 et 0,1%). Le milieu

de base utilisé est le GYEA (Athalye et al., 1985).
- Sensibilité aux pH 5 et 9 (sur GYEA liquide), aux températures : 12, 20, 30, 37, 40, 45 et 50
°C et aux antibiotiques (sur GYEA solide) suivants : érythromycine, streptomycine et
pénicilline, (10 mg/l pour chacun), rifampicine, gentamicine, vancomycine (5 mg/l pour chacun),
chloramphénicol, oxytétracycline et kanamycine (25 mg/l pour chacun).
- Sensibilité à différentes concentrations de NaCl à savoir : 0, 5, 7 et 10% sur milieu Nutrient
Agar (Gélose nutritif)-Fluka.

89
 Résultats et discussion

RESULTATS ET DISCUSSION

Bien que le nombre de molécules bioactives obtenu par voie naturelle, notamment à partir
des microorganismes ne cesse d’augmenter, il n’y a qu’une faible proportion de ces molécules
qui peuvent aboutir à des applications. Il est donc évident d’orienter les cribles vers des niches
particulières, et également de s’assurer que la bactérie productrice est bien nouvelle, non déjà
décrite pour augmenter les chances d’avoir des biomolécules nouvelles. Par ailleurs, il est à
signaler que les manipulations d’extraction, de purification et de caractérisation chimique des
biomolécules sont très délicates, fastidieuses et coûteuses. En effet, la détermination complète de
la structure chimique d’une molécule biologiquement active nécessite d’une part, la combinaison
de plusieurs techniques d'extractions et de purifications et la disposition d’une quantité assez
importante (quelques mgs) de la molécule à l’état pur, une telle quantité ne peut être obtenue que
dans des conditions semi-préparatives ou même préparatives, et d’autre part, l’utilisation de
plusieurs techniques physico-chimiques et spectroscopiques.

L’objectif de ce premier chapitre relatif aux travaux de cette présente thèse, concerne
l’étude taxonomique des deux souches TN17 et Fr10.

90
 Résultats et discussion

A. CARACTERISTIQUES TAXONOMIQUES DES

SOUCHES TN17 ET FR10

I. Rappel des résultats antérieurs

Les souches TN17 et Fr10 ont été isolées durant un programme de recherche de nouvelles
souches d’actinomycètes à partir de différents habitats Tunisiens. Ces souches ont été
sélectionnées pour leurs activités biologiques (antibactériennes et antifongiques) importantes
(Figure 11). En utilisant le moyen moléculaire (amplification, séquençage et analyse de la
séquence nucléotidique des gènes codant pour l’ARN 16S correspondant), il apparait que les
souches TN17 et Fr10 sont de nouvelles souches d’actinomycètes, et qu’elles appartiennent au
genre Streptomyces.

A B C A B C
Souche TN17 Souche Fr10

Figure 11 : Activités biologiques des souches TN17 et Fr10 contre : Fusarium sp (A) et Verticillum
dahliae (B) et contre Micrococcus luteus (C) estimées en milieu solide après une durée d’incubation
spécifique pour chaque souche cible. Les souches TN17 et Fr10 sont ensemencées en un point central de
la boite de pétri.

Vu l’importance des activités biologiques et notamment antifongiques des deux souches

TN17 et Fr10, nous nous sommes proposés d’approfondir leur identification. Plusieurs critères
classiques sont utilisés dans la classification et l’identification des microorganismes et peuvent
être globalement classés en deux groupes : les critères classiques qui englobent les critères
morphologiques, chimiotaxonomiques et physiologiques, et les critères moléculaires qui

91
 Résultats et discussion

concernent les analyses de la séquence des gènes codant pour l’ARN 16S, la phylogénie, les
hybridations ADN-ADN, etc.

II. Etudes morphologiques des souches TN17 et Fr10

Les analyses morphologiques sont importantes en taxonomie microbienne, elles sont
généralement faciles à étudier et sont bien significatives vu que les critères morphologiques
dépendent de l’expression de gènes qui sont souvent génétiquement stables.
Dix milieux de cultures ont été utilisés : Milieux ISP1 à ISP7, milieu Bennett, milieu
gélose nutritive et milieu Sabouraud. Ces différents milieux sont généralement utilisés pour les
bactéries actinomycètes du genre Streptomyces (Shirling et Gottlieb, 1966). D’après les résultats
présentés sur les tableaux 7 et 8, nous pouvons déduire que:
* L’isolat TN17 présente une croissance et une sporulation abondantes sur les milieux
ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 et ISP7 et Bennett. La croissance est aussi abondante sur ISP1 mais sans
production de mycélium aérien; elle est par contre moyenne sur ISP6, gélose nutritive et
Sabouraud.
La couleur du mycélium végétatif est globalement brun jaunâtre, et celle du mycélium
aérien est grise ou blanche. Les pigments mélanoïdes ne sont pas produits sur les milieux ISP1,
ISP6 et ISP7, conçus spécialement pour la production de ces pigments, ce qui implique que la
souche TN17 ne produit pas de pigments mélanoïdes.
* L’isolat Fr10 présente une croissance et une sporulation abondantes sur les milieux
ISP2, ISP3, ISP5 et Bennett. La croissance est aussi abondante sur ISP1 et ISP6 mais sans
production de mycélium aérien; elle est par contre moyenne sur gélose nutritive et ISP4 et faible
sur le milieu Sabouraud.
La couleur du mycélium végétatif est grisâtre ou jaune en fonction du milieu de culture, et
celle du mycélium aérien est jaune, jaune verdâtre. Comme la souche TN17, la souche Fr10 ne
produit pas de pigments mélanoïdes et ce suite aux résultats obtenus sur les milieux de cultures
ISP1, ISP6 et ISP7.

92
 Résultats et discussion

Tableau 7. Caractéristiques culturales de l’isolat TN17

Croissance et sporulation: ++++ = abondante; +++ = bonne; ++ = moyenne; + = faible; - = nulle.

Milieux de Croissance Sporulation Mycélium Mycélium Pigments

culture végétatif aérien solubles

ISP n° 1 ++++ - brun jaunâtre non non produits

produits
ISP n° 2 ++++ ++++ brun jaunâtre grisâtre brun jaunâtre

ISP n° 3 ++++ +++++ brun jaunâtre blanchâtre brun jaunâtre

ISP n° 4 ++++ +++ blanc jaunâtre blanchâtre blanc

jaunâtre

ISP n° 5 ++++ ++++ brun grisâtre brun

ISP n° 6 ++ ++ brun jaunâtre grisâtre non produits

ISP n° 7 ++++ +++ brun jaunâtre grisâtre non produits

Bennett +++ + ++ brun jaunâtre grisâtre brun jaunâtre

Gélose ++ + brun jaunâtre grisâtre non produits

nutritive

Sabouraud ++ ++ jaunâtre grisâtre jaunâtre

93
 Résultats et discussion

Tableau 8. Caractéristiques culturales de l’isolat Fr10

Croissance et sporulation: ++++ = abondante; +++ = bonne; ++ = moyenne; + = faible; - = nulle.

Milieux de Croissance Sporulation Mycélium Mycélium Pigments

culture végétatif aérien solubles

ISP n° 1 + ++ - brun jaunâtre non produits non produits

ISP n° 2 ++++ ++++ brun jaunâtre Jaune verdâtre jaunâtre

ISP n° 3 ++++ ++++ brun jaunâtre jaunâtre brun jaunâtre

ISP n° 4 ++ ++ blanc jaunâtre jaunâtre Jaunâtre

ISP n° 5 + ++ +++ grisâtre jaune verdâtre grisâtre

ISP n° 6 +++ - grisâtre non produits non produits

ISP n° 7 + + + jaunâtre Jaunâtre non produits

Bennett + + ++ ++++ jaune jaune verdâtre jaunâtre

Gélose ++ ++ jaunâtre jaune verdâtre jaunâtre

nutritive

Sabouraud + + grisâtre Jaunâtre Jaunâtre

III. Etudes chimiotaxonomiques

La chimiotaxonomie se base sur l'étude des constituants de la paroi. Les plus utilisés sont
le peptidoglycane (Schleifer et Kandler, 1972), les sucres, les quinones (présence de
ménaquinones ou d'ubiquinones), les lipides polaires et les acides mycoliques. Pour le genre
Streptomyces, la chimiotaxonomie repose surtout sur la mise en évidence et la détection d'acide

94
 Résultats et discussion

diaminopimélique sous forme L comme acide aminé particulier du peptidoglycane, la présence de

la glycine et l’absence de glucides caractéristiques des autres actinomycètes (Murray et al.,
1989).

III. 1. Analyse des acides aminés et des sucres pariétaux

D’après nos études, nous avons révélé dans la paroi des isolats TN17 et Fr10, la présence
de l’isomère LL de l’acide diaminopimélique, la présence de glycine et l’absence des sucres :
xylose, arabinose, galactose et rhamnose. Ces résultats indiquent que la paroi des deux souches
est du type I (Murray et al., 1989). En effet, d’après Murray et al., (1989), et comme le montre le
tableau 9, la présence ou l’absence de quelques glucides dans la paroi cellulaire permet la
classification des actinomycètes en différents groupes. La présence d’arabinose et de galactose
est caractéristique de la grande majorité des Nocardioformes et des Micropolysporas (paroi type
IV). La présence du madurose (3-Ométhyl-D-galactose) caractérise les Maduromycetes,
Dermatophilus et certaines souches du genre Frankia. La richesse des parois cellulaires en xylose
et arabinose indique que les isolats appartiennent au groupe des Actinoplanètes et au genre
Glycomyces. Alors que la présence du rhamnose et du galactose caractérise le genre
Saccharothrix.

Tableau 9 : Différents types de parois et leurs constituants majeurs chez les actinomycètes (Murray et al.,
1989)

Type de paroi Constituants pariétaux Groupe/Genre

majeurs
I L-DAP+Glycine Arachnia, Pimelobacter, Nocardioides,
Streptomycetes
II Méso-DAP+Glycine Actinoplanes, Actinomyces
III Méso-DAP Dermatophilus, Maduromycetes, Frakia,
Geodermatophilus, Thermonospora,
Kitasatospria, Spirillosporia,
Thermoactinomyces
IV Méso-DAP+Arabinose Micropolyspora, Nocardioformes
V Lysine+Ornithine Actinomyces
VI Présence variable de l’acide Microbacterium, Oerskovia,
asparatique et du galactose Promicromonospora, Actinomyces,
Arcanobacterium
VII Acide Agromyces, Clavibacter
diamonobutyrique+Glycine
VIII Ornithine Aureobacterium, Curtobacterium,

95
 Résultats et discussion

Cellulomonas
DAP : Acide Diaminopimélique
Les données obtenues à ce niveau, confortent que les deux isolats étudiés sont des
actinomycètes du genre Streptomyces. Ces mêmes données ont été rapportées par d’autres auteurs
à savoir Dastager et al., 2007, qui ont démontré la présence de l’isomère LL de l’acide
diaminopimélique, la présence de glycine et l’absence des sucres (xylose, arabinose, galactose et
rhamnose) dans la paroi de la nouvelle bactérie de Streptomyces gulbargensis sp. nov..

III. 2. Analyse des lipides membranaires

Pour la classification et l’identification des actinomycètes, trois sortes de lipides sont
généralement recherchées : les acides gras à longue chaîne, les ménaquinones et les
phospholipides (Minnikin et Goodfellow, 1981).
Dans la présente étude, nous avons analysé la présence et la nature des phospholipides et
des acides gras au niveau des parois des souches TN17 et Fr10.

III. 2. 1. Les phospholipides

L’analyse des phospholipides a montré la présence de la phosphatidyléthanolamine (PE)

dans les parois cellulaires des deux isolats (TN17 et Fr10) revelée par la ninhydrine. En revanche
aucune trace de phosphatidylcholine (PC) n’a été décelée. A ce propos, il est à noter que la
composition des membranes cellulaires en phospholipides a permis de diviser les actinomycètes
en 5 types (Lechevalier et al., 1977):
- Type P I: il se distingue par l’absence de phospholipides azotés tels que la
phosphatidyléthanolamine (PE) et la phosphatidylcholine (PC). Ex: Spirillospora, Actinomadura.
- Type P II: il est caractérisé par la présence de la PE. Ex: Streptomyces Saccharothrix,
Nocardia, Amycolatopsis, Spirillospora.
- Type P III: présence de la PC. Ex: Nocardiopsis, Saccharopolyspora.
- Type P IV: présence de PE et de phospholipides contenant de la glucosamine (PG). Ex:
Streptosporangium, Planomonospora, Saccharothrix.
- Type PV: présence de PG et de phosphatidylglycérol. Ex: Oerskovia, Cellulomonas,
Promicromonospora.
D’après notre étude de la nature des phospholipides des parois des souches TN17 et Fr10,
on peut déduire que ces deux souches sont des actinomycètes de type PII et du genre

96
 Résultats et discussion

Streptomyces. Par ailleurs, il est à signaler que les actinomycètes du genre Streptomyces sont
caractérisés par la présence du phospholipide (PE) dans leur paroi. L’autre type de phospholipide
(PC) peut être présent ou absent. En effet, la paroi cellulaire de la souche Streptomyces
gulbargensis sp. nov. contient les deux types de phospholipides « PE + PC » (Dastager et al.,
2007) et la paroi cellulaire de la souche de Streptomyces mayteni sp. nov. qui contient, comme la
paroi des souches TN17 et Fr10, uniquement le « PE » (Chen et al., 2009).

III. 2. 2. Les acides gras

Les acides gras constituent les éléments essentiels des lipides cellulaires chez les bactéries
et leur proportion majeure est localisée au niveau des membranes cellulaires (Kroppenstedt,
1985). En se basant sur la composition cellulaire en acides gras, les actinomycètes se divisent en
trois groupes majeurs :
- Type à acides gras iso et anteiso : c’est la composition en acide gras la plus rencontrée
chez les bactéries à Gram-positif et plusieurs genres d’actinomycètes ont ce type de composition
(Okami et al., 1968).
- Type à chaînes linéaires mono-insaturées : les chaînes longues 16 :1 et 18 :1 sont les
acides gras dominants dans ce type. Généralement, les chaînes sont branchées à des acides 10-
méthyliques et en particulier l’acide 10-méthyl octadécanoïque (Suziki, 1988).
- Type complexe : dans ce type, la composition en acides gras est constituée non
seulement par des acides iso et anteiso mais aussi par des acides gras à chaîne linéaire
monoinsaturée et des acides 10–méthyliques.
La composition en acide gras de la paroi des souches TN17 et Fr10 est présentée sur le
tableau 10. Nous remarquons que les acides gras dominants au niveau de la paroi sont :
* Souche TN17 : l’anteiso C15:0 (29,889 %), suivi de l’iso C16:0 (28,529 %) et de l’iso C15:0
(23,583 %). Ces acides gras et leur richesse dans la paroi de cette souche sont semblables à ceux
de la bactérie de Streptomyces gulbargensis sp. nov., (Dastager et al., 2007). La paroi de cette
dernière possède une composition et une richesse en acides gras comme suit : l’anteiso C15:0 (26
%), suivi de l’iso C16:0 (20%) et de l’iso C15:0 (10 %) (Dastager et al., 2007).
* Souche Fr10 : l’iso C16:0 (43,124%), suivi de l’anteiso C15:0 (24,192%), l’iso C15:0
(12,082%) et C16:0 (6,812%). Concernant cette souche, on distingue une abondance des mêmes
types d’acides gras que la souche TN17 et Streptomyces gulbargensis sp. nov., mais avec des
richesses différentes. Par ailleurs, il est à noter que pour la souche Fr10, les deux acides gras les

97
 Résultats et discussion

plus abondants au niveau de la paroi à savoir l’iso C16:0 et l’anteiso C15:0, sont les mêmes que
pour la paroi de la souche de Streptomyces mayteni sp. nov. La paroi de cette dernière possède la
composition suivante en acides gras : l’iso C16:0 (28,1%), l’anteiso C15:0 (16,2%), l’anteiso C17:0
(14,8%) (Chen et al., 2009).
D’après ces données, on peut déduire que les parois des souches TN17 et Fr10 sont du
type iso et ante-iso caractéristique de la plupart des actinomycètes (Okami et al., 1968). De plus,
les parois des deux souches étudiées ont une composition en acides gras presque similaire à celle
des souches Streptomyces gulbargensis sp. nov. et Streptomyces mayteni sp. nov.,
respectivement. Une fois de plus on confirme l’appartenance des deux souches étudiées au genre
Streptomyces.

Tableau 10. Profil des acides gras des isolats TN17 et Fr10

Acides gras % d’acides gras de % d’acides gras

la souche TN17 de la souche Fr10
Acide undécyclique 11 :0 - -
Acide 2-Hydroxy caprique 10 :0 - -
Acide laurique 12 :0 0,094 -
Acide tricéclique 13 :0 - 0,316
Acide 2 hydroxy laurique 12 :0 0,026 -
Acide 3 hydroxy laurique 12 :0 1,611 0,579
Acide myristique 14 :0 0,453 1,184
Acide iso 13-méthylmyristique 15 :0 23,583 12,082
Anteiso 12-méthylmyristique 15 :0 29,889 24,192
Acide pentadécyclique 15 :0 3,120 2,846
Acide 2 hydroxy myristique 14 :0 0,152 -
Acide 3 hydroxy myristique 14 :0 - -
Acide methyl pentadecyclique 16 :0 28,529 43,124
Acide palmitoléique16 :19 3,578 3,523
Acide palmitique 16 :0 4,490 6,812
Acide iso 15 méthylpalmitique 17 :0 3,891 2,540
Acide cis 9,10 méthylenepalmitique 17 :0∆ 0,3508 2,035
Acide margarique 17 :0 0,146 0,515
Acide 2 hydroxymargarique 16 :0 - -
Acide α linolénique 18 : 29.12 0,0701 -
Acide oléique 18 :19 0,0109 0,0639
Acide stéarique 18 :0 - -
Acide α nonadécyclique 19 : 0∆ - -
Acide nonadécyclique 19 :0 - -
Acide arachidique 20 :0 - -

98
 Résultats et discussion

Comme nous venons de le développer par les études morphologiques et

chimiotaxonomiques, nous pouvons conclure que les deux souches étudiées sont bien des
actinomycètes appartenant au genre Streptomyces. Ces données confirment en réalité les résultats
obtenus lors des travaux antérieurs se rapportant à la détermination et l’analyse de la séquence
nucléotidique des gènes ARN 16S de ces deux souches.
Avant d’aborder les études physiologiques, nous nous sommes proposés de définir l’arbre
phylogénique des deux souches de Streptomyces TN17 et Fr10 et pouvoir ainsi, déterminer les
souches apparentées en conséquence. En réalité, nous avons décidé de réaliser cette étude avant
les études physiologiques dans le but d’effectuer ces dernières sur nos deux souches et également,
sur les souches apparentées en même temps.

IV. Arbres phylogéniques des souches de Streptomyces TN17 et Fr10

Comme nous l’avons signalé, les gènes codant pour l’ARN 16S des deux souches de
Streptomyces TN17 et Fr10 ont été amplifiés par PCR, clonés et séquencés lors de travaux
antérieurs réalisés au sein de notre laboratoire. Ces gènes ont une taille de 1521 pb pour la souche
TN17 et 1430 pb pour la souche Fr10. L’alignement de ces séquences nucléotidiques avec les
banques de données a révélé une similarité très forte, allant de 97 à 99%, avec les séquences
nucléotidiques des gènes codant pour l’ARN 16S de souches bactériennes du genre Streptomyces
uniquement.
Pour la souche Streptomyces TN17, le pourcentage de similarité le plus élevé (99%) est
obtenu avec la souche de Streptomyces lilaceus AB 184457.
Concernant, la souche Streptomyces Fr10, le pourcentage de similarité le plus élevé (99%)
est obtenu avec la souche Streptomyces microflavus HBUM 174043.
En utilisant les séquences nucléotidiques des gènes codant pour l’ARN 16S :
- des deux souches TN17 et Fr10 ;
- des souches de Streptomyces ayant les plus fortes similarités (détectés par l’alignement
des séquences nucléotidiques), nous avons élaboré les arbres phylogéniques des deux souches,
Streptomyces TN17 (Figure 12) et Streptomyces Fr10 (Figure 13).
Comme le montre la figure 12, les souches les plus apparentées à la souche TN17 sont:
Streptomyces lavendofolia AB 184217, Streptomyces gobitricini AB 184666 et Streptomyces
lilaceus AB 184457.

99
 Résultats et discussion

D’après la figure 13, les souches les plus apparentées à la souche Fr10 sont : Streptomyces
microflavus HBUM 174043 et Streptomyces griseorubiginosus.

Figure 12: Arbre phylogénique de la souche de Streptomyces TN17

100
 Résultats et discussion

Figure 13: Arbre phylogénique de la souche de Streptomyces Fr10

Dans ce qui suit, nous abordons le côté physiologique des deux souches de Streptomyces
ainsi que les souches apparentées standardisées reçues à partir des banques internationales de
souches NBRC et DSM :
* Pour la souche de Streptomyces TN17, les souches apparentées reçues sont :
Streptomyces lavendofoliae NBRC 12882 ; Streptomyces lilaceus NBRC 13676 et
Streptomyces gobitricini NBRC 15419.
* Pour la souche de Streptomyces Fr10, les souches apparentées reçues sont :
Streptomyces griseorubiginosus DSM 40469 et Streptomyces microflavus DSM 40331.

Les études physiologiques permettent de regrouper les espèces d’actinomycètes

appartenant à un même genre. Plusieurs types de tests sont ainsi utilisés. Ils portent sur la
dégradation ou non de plusieurs composés glucidiques, lipidiques, protéiques ou autre et la

101
 Résultats et discussion

sensibilité ou la résistance à quelques agents physiques et chimiques (pH, température,

concentration ionique, antibiotiques, etc.).

V. Etudes Physiologiques

V. 1. La souche Streptomyces TN17 et les trois souches de

Streptomyces apparentées
Le tableau 11 résume toutes les données à savoir :
* L’hydrolyse des bases puriques et leurs dérivés.
* la dégradation des glucides, des acides aminés, des surfactants et des sels de sodium.
* La réduction des nitrates.
* La production des pigments mélanoïdes.
* La croissance à différentes températures et valeurs de pH.
* La tolérance au lysozyme, au phénol, à l’azide de sodium et au chlorure de sodium.
* La résistance aux antibiotiques.

Tableau 11 : Caractéristiques physiologiques de la souche Streptomyces TN17 (A) et des trois

souches apparentées : Streptomyces lavendofoliae NBRC 12882 (B) ; Streptomyces lilaceus NBRC
13676 (C) ; et Streptomyces gobitricini NBRC 15419 (D).

Caractéristiques Souche Streptomyces TN17 et les souches apparentées

A B C D
Hydrolyse des bases
puriques et leurs dérivés

Adénine - - - -
Guanine - - - +
Xanthine - + - +
Hypoxanthine + + + +
Utilisation des glucides

Arbutine - + - -
Esculine - + + -
Amidon + + + +

102
 Résultats et discussion

Arabinose + - + +
Fructose + + + -
Galactose + - + +
Glucose + - + -
Glycérol + - + +
Inositol - + - -
Lactose + - + +
Maltose + + - +
Mannose + - + +
Raffinose - + - -
Rhamnose - + - +
Ribose + - - +
Sucrose + + + -
Tréhalose + - - +
Xylose - + - +
Utilisation des acides
aminés et des protéines

Méthionine + + + +
Asparagine - + - +
Phénylalanine + - + -
Acide aspartique - + - -
Cystéine + - - +
Tyrosine - + + -
Histidine + + + -
Alanine + + + +
Leucine + - + -
Arginine + - + -
Isoleucine + - + -
Acide glutamique - - - -
Thréonine - - - +
Proline + - + +
Sérine + - + +
Tryptophane - + - -
Caséine + + + +
Gélatine + + + -
Utilisation des sels de
sodium
Acétate + + + -
Alginate - + - -

103
 Résultats et discussion

Benzoate - + - -
Butyrate - - + +
Citrate + + + +
Desoxycholate - + + -
Hydrogen carbonate - + - -
Nitrate - - + +
Oxalate - + - +
Perchlorate + - + +
Propionate - - + +
Pyruvate - + + -
Succinate + + - -
Sulfite - + - -
Tartrate - - + -
Tétraborate - + + -
Thiosulfate + - + +
Décomposition de
surfactants
Tween 80 + + + +
Réduction des nitrates + + + +
Production des pigments - + - +
mélanoides
Croissance à différentes
Températures
12°C - - - -
20°C - - + -
30°C + + + +
37°C + + + +
40°C + - + +
45 °C - - - +
50 °C - - - -
Croissance à différents
pH : (pH initial)
pH 5.0 + + + +
pH 6.0 + + + +
pH 7.0 + + + +
pH 8.0 + + - -
pH 9.0
+ + - -
Tolérance à

Lysozyme (0,05%) + + + +
Phénol (0,05%) + + + +
Phénol (0,1%) - - - -

104
 Résultats et discussion

Azide de sodium - + - +
(0,001%)
NaCl (5 %) + + - -
NaCl (7%) - - - -
NaCl (10%) - - - -
Résistance aux
antibiotiques

Chloramphénicol (25µg/ml) - - - -
Erythromycine (10µg/ml) - - - -
Gentamicine (5 µg/ml) + + - +
Kanamycine (25 µg/ml) - + + -
Oxytétracycline (25 µg/ml) + - + -
Pénicilline (10 µg/ml) - - - -
Rifampicine (5 µg/ml) - + + -
Streptomycine (10 µg/ml) + + - -
Vancomycine (5 µg/ml) + - - -

Il est à noter que toutes les analyses effectuées et présentées dans le tableau 11 ont été
réalisées trois fois et les résultats sont reproductibles. D’après les données ainsi obtenues, nous
pouvons déduire les caractéristiques suivantes pour la souche Streptomyces TN17:
* Elle est incapable d’hydrolyser les bases puriques.
* Elle utilise la plupart des glucides testés comme seule source de carbone sauf l’arbutine,
l’esculine, l’inositol, le raffinose, le rhamnose et le xylose.
* Elle est capable d’utiliser la plupart des acides aminés comme source d’azote.
* Elle a une capacité réduite pour la dégradation des sels de sodium.
* Elle peut croître en présence de Tween 80 à 1% et a la capacité de réduire les nitrates.
* Elle ne produit pas des pigments mélanoides.
* Elle croît à des températures comprises entre 30 et 40°C et par conséquent elle est
mésophile.
* Elle tolère des pH initiaux de culture entre 5 et 9.
* Elle tolère des concentrations en NaCl jusqu’à 5%.

105
 Résultats et discussion

* Sur les neuf antibiotiques testés, la souche Streptomyces TN17 peut croître en présence
des antibiotiques suivants : Gentamicine, Oxytétracycline, Streptomycine et Vancomycine à des
concentrations respectives de 5, 25, 10 et 5 µg/ml.

En tenant compte de toutes les analyses chimiotaxonomiques, phylogéniques et

physiologiques, nous confirmons bien que notre souche TN17 est une nouvelle espèce du genre
Streptomyces. Si on considère les critères physiologiques, nous remarquons que la souche étudiée
présente des caractéristiques très proches de la souche apparentée Streptomyces lilaceus NBRC
13676. Par conséquent, nous proposons la nomenclature suivante pour la souche TN17 :
Streptomyces lilaceus sp. TN 17.

V. 2. La souche Streptomyces Fr10 et les deux souches de

Streptomyces apparentées

Ce sont les mêmes études réalisées que pour Streptomyces TN17. Le tableau 12 illustre les
résultats des caractéristiques physiologiques de la souche Streptomyces Fr10. Toutes les analyses
ont été effectuées trois fois et les résultats sont bien reproductibles.

Tableau 12 : Caractéristiques physiologiques de la souche Streptomyces Fr10 (A) et des deux souches
apparentées : Streptomyces griseorubiginosus DSM 40469 (B) Streptomyces microflavus DSM 40331
(C).

Caractéristiques Souche Streptomyces Fr10 et les souches

apparentées
A B C
Hydrolyse des bases
puriques et dérivés

Adénine + - +
Guanine - + +
Xanthine - - -
Hypoxanthine - + -

106
 Résultats et discussion

Utilisation des glucides

Arbutine - - -
Esculine - + -
Amidon + + +
Arabinose - - +
Fructose + - -
Galactose + - +
Glucose + - -
Glycérol + + +
Inositol - - -
Lactose - + -
Maltose + - +
Mannose + - -
Raffinose - + -
Rhamnose - + +
Ribose + + +
Sucrose + - +
Tréhalose - - -
Xylose + + -
Utilisation des acides
aminés et des protéines

Méthionine + - +
Asparagine + - -
Phénylalanine + + +
Acide aspartique - - -
Cystéine + - +
Tyrosine - - -
Histidine - + +
Alanine + + +
Leucine - + -
Arginine + - -
Isoleucine - + -
Acide glutamique - - -
Thréonine + - +
Proline + + +
Sérine + + +
Tryptophane + - -
Caséine + - +
Gélatine + + -
107
 Résultats et discussion

Utilisation des sels de

sodium
Acétate - + +
Alginate + + -
Benzoate - - -
Butyrate - + -
Citrate + + +
Desoxycholate - - -
Hydrogen carbonate - - -
Nitrate + - +
Oxalate - + -
Perchlorate - + +
Propionate - - +
Pyruvate - - +
Succinate + - +
Sulfite - + -
Tartrate - - +
Tétraborate - - -
Thiosulfate + - +
Décomposition de
surfactants
Tween 80 - - +
Réduction des nitrates + + +
Production des pigments - + +
mélanoides
Croissance à différentes
Températures
12°C - - -
20°C - - +
30°C + + +
37°C + + +
40°C + + +
45 °C - - -
50 °C - - -
Croissance à différents
pH : (pH initial)
pH 5.0 + + +
pH 6.0 + + +
pH 7.0 + + +
pH 8.0 + + -

pH 9.0 + - -

108
 Résultats et discussion

Tolérance à

Lysozyme (0,05%) + + +
Phénol (0,05%) + + +
Phénol (0,1%) - + +
Azide de sodium - + +
(0,001%)
NaCl (5 %) + + +
NaCl (7%) + - -
NaCl (10%) - - -
Résistance aux
antibiotiques

Chloramphénicol (25µg/ml) - - +
Erythromycine (10µg/ml) - - -
Gentamicine (5 µg/ml) - + -
Kanamycine (25 µg/ml) + + -
Oxytétracycline (25 µg/ml) + - +
Pénicilline (10 µg/ml) - - -
Rifampicine (5 µg/ml) + - +
Streptomycin(10 µg/ml) + + +
Vancomycine (5 µg/ml) - - -

D’après les données ainsi obtenues, nous pouvons déduire que Streptomyces Fr10:
* Elle est incapable d’hydrolyser les bases puriques.
* Elle utilise la plupart des glucides testés comme seule source de carbone sauf l’arbutine,
l’esculine, l’arabinose, l’inositol, le lactose, le raffinose, le rhamnose et le tréhalose.
* Elle est capable d’utiliser la plupart des acides aminés comme source d’azote.
* Elle a une capacité réduite pour la dégradation des sels de sodium.
* Elle ne peut pas croître en présence de Tween 80 à 1%. Elle est nitroréductice.
* Elle ne produit pas de pigments mélanoïdes.
* Elle croît à des températures comprises entre 30 et 40°C et par conséquent elle est
mésophile.

109
 Résultats et discussion

* Elle tolère des pH initiaux de culture entre 5 et 9.

* Elle tolère des concentrations en NaCl jusqu’à 7%.
* Sur les neuf antibiotiques testés, la souche Streptomyces Fr10 peut croître en présence
des antibiotiques suivants : Kanamycine, Oxytétracycline, Rifampicine et Streptomycine à des
concentrations respectives de 25, 25, 5 et 10 µg/ml.

En tenant compte de toutes les analyses chimiotaxonomiques, phylogéniques et

physiologiques, nous confirmons bien que notre souche Fr10 est une nouvelle espèce du genre
Streptomyces. Si on considère les critères physiologiques, nous remarquons que la souche étudiée
présente des caractéristiques très proches de la souche apparentée Streptomyces microflavus DSM
40331. Par conséquent, nous proposons la nomenclature suivante pour la souche Fr10 :
Streptomyces microflavus sp. Fr10.

110
 Résultats et discussion

Conclusion

Les travaux de recherche de ce premier chapitre de la présente thèse ont été orientés vers
l’identification des deux souches TN17 et Fr10. Pour ce faire, nous avons utilisé plusieurs études
qui sont :
* Des études morphologiques utilisant dix milieux de culture solides. Les résultats obtenus
confortent l’hypothèse que les deux souches étudiées sont des bactéries actinomycètes du genre
Streptomyces.

* Des études chimiotaxonomiques qui se basent sur l’analyse des constituants de la paroi.
Durant ces analyses nous nous sommes intéressés à :
- L’analyse des acides aminés et des sucres pariétaux : Nous avons constaté que la paroi
des deux souches TN17 et Fr10, contient l’isomère LL de l’acide diaminopimélique et la glycine.
Ces résultats indiquent que la paroi des deux souches est du type I. Ce dernier est caractéristique
des bactéries du genre Streptomyces.
- L’analyse des lipides membranaires à savoir les phospholipides et les acides gras. Nous
avons démontré la présence de phosphatidyléthanolamine (PE) et l’absence de
phosphatidylcholine (PC) dans les parois cellulaires des deux isolats (TN17 et Fr10). Ce résultat
nous a permis de déduire que ces deux souches sont des actinomycètes de type II. De plus, et suite
aux analyses des acides gras pariétaux, nous avons remarqué que les parois des souches TN17 et
Fr10 sont de type iso et ante-iso caractéristique de la plupart des actinomycètes.

* Des études phylogéniques qui se basent sur les analyses des séquences nucléotidiques
du gène codant pour l’ARN16S. Par le bais de programmes spéciaux, nous avons élaboré les
arbres phylogéniques des deux souches TN17 et Fr10. D’après les résultats obtenus, nous
constatons que les souches les plus apparentées à la souche TN17 sont: Streptomyces
lavendofolia AB 184217, Streptomyces gobitricini AB 184666 et Streptomyces lilaceus AB
184457. Pour la souche Fr10, les souches les plus apparentées sont : Streptomyces microflavus
HBUM 174043 et Streptomyces griseorubiginosus.

111
 Résultats et discussion

* Des études physiologiques qui s’intéressent à la capacité des isolats à hydrolyser les
bases puriques et leurs dérivés, à dégrader les glucides, les acides aminés, les surfactants et les
sels de sodium, à réduire les nitrates, à produire des pigments mélanoïdes, à tolérer différentes
températures, différents pH initiaux, le lysozyme, le phénol, l’azide de sodium, le chlorure de
sodium et les antibiotiques. Ces études ont permis de conforter l’idée que les deux isolats TN17
et Fr10 sont des actinomycètes du genre Streptomyces et que ces deux bactéries sont des
nouvelles espèces de Streptomyces.

Compte tenu de toutes les analyses morphologiques, chimiotaxonomiques, phylogéniques

et physiologiques, nous confirmons bien que les deux souches TN17 et Fr10 sont deux nouvelles
espèces du genre Streptomyces, et nous proposons les nomenclatures suivantes : Streptomyces
lilaceus sp. TN 17 et Streptomyces microflavus sp. Fr10.

112
 Résultats et discussion

B. OPTIMISATION DES CONDITIONS DE

PRODUCTION, PURIFICATION ET
CARACTERISATION CHIMIQUE DES
BIOMOLECULES DE LA SOUCHE DE Streptomyces
lilaceus sp. TN17. PURIFICATION DES
BIOMOLECULES DE LA SOUCHE DE Streptomyces
microflavus sp. Fr10

Comme nous l’avons signalé dans la partie bibliographique, les métabolites secondaires
biologiquement actifs (antibiotiques, antifongiques,..) sont généralement liés et influencés par le
métabolisme primaire de la bactérie productrice. Un ou plusieurs métabolites intermédiaires du
métabolisme primaire servent fréquemment comme précurseur pour leur synthèse. Toutefois, la
composition du milieu de culture gouverne la capacité et la quantité de métabolites secondaires
produit par le micro-organisme en question. Plusieurs travaux ont montré que la nature de la
source de carbone ainsi que les additifs chimiques à savoir le potassium (K2HPO4), le magnésium
(MgSO4, 7H2O) et les oligo-éléments influencent énormément la capacité de production des
antibiotiques chez les Streptomyces (Mellouli et al., 2003 – 2004 ; Fourati ben Fguira 2005 ; Ben
Ameur Mehdi et al., 2006).

I. Optimisation des conditions de production des biomolécules de la

souche de Streptomyces lilaceus sp. TN 17

I. 1. Sources de carbone
En utilisant comme milieu de base (pour la pré-culture et la culture) le milieu TSB
(Bouillon tryptique de Soja) à 30 g/l nous avons testé cinq sources de carbone (le glucose,
l’amidon, le fructose, le saccharose et le glycérol) à 1% (w/v). Les cinq cultures de 200 ml

113
 Résultats et discussion

chacune de 18h par la pré-culture correspondante. Après 72 h d'incubation à 30°C sous une
agitation à 250 rpm, les surnageants des cinq cultures ont été séparés de la biomasse par
centrifugation. Un double extraction par l’acétate d’éthyle (2v/v) a été réalisé sur chacun des cinq
surnageants obtenus. Après évaporation, les extraits actifs correspondants ont été repris dans 2 ml
de mélange de « dichlorométhane 90 % et méthanol 10 % », puis utilisés pour la détermination
des activités biologiques en utilisant les tests d'inhibitions de la croissance des cellules indicatrices
suivantes : une bactérie à Gram+ (Micrococcus luteus LB 14110), une bactérie à Gram-
(Salmonella enterica ATCC 43972) et un champignon filamenteux (Fusarium sp.)
Comme le montre la figure 14, des zones d'inhibitions (plus au moins importantes) ont été
obtenues pour toutes les sources de carbones contre tous les microorganismes cibles testés. La plus
forte inhibition est observée avec la source de carbone glucose. En utilisant cette source de
carbone, nous avons testé quatre concentrations différentes (0,5%; 0,75%; 1% et 1,5% w/v). Pour
se faire, quatre cultures de 200 ml chacune, ont été réalisées et étudiées dans les mêmes conditions
utilisées pour la détermination de la meilleure source de carbone. En se basant sur les tests
d’inhibitions de la croissance des trois souches indicatrices, nous avons constaté que la
concentration en glucose de 1% (w/v) est celle qui donne la meilleure activité biologique : le
glucose est un précuseur n écaessaire pour la production de ces métabolites.

Micrococcus luteus
30
Salmonella enterica
Fusarium sp
25

20
Diamètre d'inhibition
(mm)
15

10

5
glucose fructose saccharose amidon glycérol

Sources de carbones

Figure 14 : Effet des sources de carbones à 1% (w/v) sur les activités biologiques de la souche de
Streptomyces lilaceus sp. TN17

114
 Résultats et discussion

I. 2. Eléments chimiques
Comme la source de carbone, les additifs chimiques tels que le magnésium, le potassium et
les oligo-éléments peuvent influencer la production des métabolites secondaires biologiquement
actifs chez les bactéries et notamment les Streptomyces (Elleuch et al., 2009). Dans le présent
travail, nous avons testé l’effet des trois additifs chimiques : MgSO4, 7H2O (2 mM), K2HPO4 (1
mM) et les oligo-éléments à raison de 7,5 ml /l d’une solution contenant (40 mg ZnCl2, 200 mg
FeSO4.7H2O, 6,5 mg H3BO3 et 13,5 mg MoNa2O4.2H2O pour 100 ml d'eau distillée) sur la
production des activités antimicrobiennes de la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN 17. Pour
ce faire, huit cultures de 200 ml chacune sur milieu TSB compléter avec 10g/l de glucose ont été
réalisées comme suit : La première culture (témoin) sans additifs chimiques, la deuxième contient
du MgSO4,7H2O, la troisième est additionnée de K2HPO4, la quatrième contient la solution
d’oligoéléments, la cinquième est additionnée des deux additifs MgSO4,7H2O et K2HPO4, la
sixième contient du MgSO4,7H2O et la solution d’oligoéléments, la septième est additionnée de
K2HPO4 et de la solution d’oligoéléments et la huitième culture est enrichie par les trois additifs
chimiques testés. Les huit cultures sont incubées durant 72h à la température 30°C est sous une
agitation de 250 rpm.
Après une double extraction par l’acétate d’éthyle des surnageants des huit cultures, les
phases organiques correspondantes ont été évaporées à sec puis les extraits secs correspondants
ont été repris chacun dans 2 ml de mélange de « dichlorométhane 90% et méthanol 10% », puis
utilisés pour la détermination des activités biologiques contre : Micrococcus luteus LB 14110,
Salmonella enterica ATCC 43972 et le champignon filamenteux Fusarium sp.
Les résultats obtenus montrent que la présence du K2HPO4 dans le milieu de culture affecte
positivement la production des biomolécules de la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN17 alors
que, la présence des oligoéléments affecte négativement cette production. Concernant l’additif
MgSO4,7H2O nous n’avons pas constaté d’effet ni positif et ni négatif. Le milieu de culture retenu
pour les cultures de la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN17 dans des conditions semi-
préparatives (en fermenteur) est le TSB à 30 g/l additionné de glucose à 1% (w/v) comme source
de carbone et de K2HPO4 (1mM) comme additif chimique.
Par ailleurs, il est à noter que ces mêmes constations (effet positif de l’additif K2HPO4 et
négatif des oligoéléments sur la sécrétion de métabolites secondaires biologiquement actifs) ont
été déjà rapportées pour la souche de Streptomyces sp. TN58 (Mellouli et al., 2004). Cependant, la

115
 Résultats et discussion

nature de l’influence de ces additifs chimiques n’est pas toujours la même et elle varie selon la
souche étudiée. En effet, alors que les oligoéléments influencent négativement la sécrétion de
métabolites secondaires chez les deux bactéries Streptomyces lilaceus sp. TN 17 et Streptomyces
TN58. Ces mêmes oligoéléments augmentent (influencent positivement), la production des
métabolites secondaires biologiquement actifs chez la souche de Streptomyces sp. US24 (Mellouli
et al., 2003).

II. Extraction, purification et caractérisation chimique des

biomolécules de la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN 17
II.1. Extraction
La nouvelle souche de Streptomyces lilaceus sp. TN 17 a été sélectionnée pour des études
approfondies lors de travaux antérieurs pour ses activités antimicrobiennes importantes contre les
bactéries à Gram+ et à Gram- et contre des champignons. Pour la purification et la caractérisation
chimique des biomolécules de cette souche nous avons préparé un volume de surnageant actif de
30 litres (6 fermentations de 5 litres chacune). Pour ce faire, à partir d’une préculture de 24 h
inoculée à 107 spores/l, les 5 litres du milieu de culture du fermenteur (milieu TSB à 30 g/l
additionné de glucose à 1 % w/v et de K2HPO4 à 1mM) sont ensemencés à 5 % v/v. Après
incubation de 72 h à 30°C, le jus de fermentation est filtré puis centrifugé. Le surnageant obtenu
est extrait deux fois par un volume égal d’acétate d’éthyle. La phase organique contenant le
composé actif est évaporé à sec par Rotavapor. Les six extraits secs obtenus sont de couleur
marron. Ils ont été mélangés pour donner une masse totale de 2,8 g et puis dissous dans 5 ml de
dichloro-méthane - méthanol (DCM 90% - MeOH 10%).

Les tests biologiques réalisés sur les extraits secs collectés montrent un fort pouvoir
inhibiteur de ces extraits contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et les champignons (Tableau 12).

116
 Résultats et discussion

Tableau 12 : Activités biologiques des extraits secs collectés de la souche de Streptomyces lilaceus sp.
TN 17: Pour chaque test, 50 µl (du mélange 5 ml de DCM–MeOH (9 :1) ont été déposés.

Cellules M. luteus S. aureus S. enterica E. Coli [Link]

indicatrices LB 14110 ATCC 6538 ATCC43972 ATCC 8739

Φ(mm) 24 22 23 21 21

II. 2. Purification
La figure 15, présente le schéma global adopté pour la purification des trois molécules
bioactives (M1, M2 et M3) de la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN 17

117
 Résultats et discussion

Culture liquide 30 litres

Filtration et Centrifugation

Culot cellulaire Surnageant

Extraction deux fois par l’acétate

d’éthyle

Evaporation

Colonne gel de silice (DCM / MeOH)

Colonne gel Sephadex LH-20 (DCM /MeOH (9 :1) Extrait sec (2,8 g)
CCE = Chromatographie sur Couche Epaisse (DCM
96%/MeOH 4%) Sephadex LH-20
HPLC : Haute Performance Liquide Chromatographie (DCM 90%/MeOH 10%)

FI FII FIII

Gel de silice CCE CCE

HPLC HPLC HPLC

M1 M2 M3

Figure 15 : Schéma de purification des trois biomolécules de la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN17

118
 Résultats et discussion

Les 2,8 g d’extrait sec actif obtenus ont été dissous dans 5 ml de dichlorométhane -
méthanol (DCM 90% - MeOH 10%) puis déposés sur une colonne de chromatographie (Séphadex
LH-20) en utilisant comme tampon d’élution un mélange de dichlorométhane - méthanol (DCM
90% - MeOH 10%). Cette première étape de purification nous a permis d’obtenir sept fractions qui
ont été réduites à trois fractions (FI, FII et FIII) suite aux analyses chromatographiques sur couche
mince (CCM).

II. 2. 1. Fraction I (FI)

Après concentration, cette fraction biologiquement active a été soumise à deux autres
étapes chromatographiques successives :
* Chromatographie sur colonne de gel de silice éluée par un gradient allant de « 100%
dichlorométhane - 0% méthanol » à « 0% dichlorométhane – 100% méthanol ». Plusieurs sous
fractions ont été collectées et en se basant sur des tests microbiologiques nous avons constaté
qu’une seule sous fraction présente une activité biologique.
* Chromatographie liquide à haute performance (HPLC). La sous fraction active de la
fraction FI a été le siège d’une étape de purification HPLC à travers une colonne C18 (250x7).
L’élution a été réalisée avec un gradient linéaire utilisant deux solutions A (eau) et B
(acétonitrile) à un débit de 1ml/min. Les proportions utilisées sont les suivantes : De 100% A à
50% A et 50% B pendant 35 min puis jusqu’à 100% B et 0% A pendant 10 min (jusqu’à 45 min).
Le chromatogramme obtenu montre plusieurs pics bien développés et séparés entre les temps de
rétentions 5 et 45 min. Les différents pics ont été collectés séparément, concentrés puis testés
pour leurs activités biologiques. Seule la solution correspondant au pic ayant un temps de
rétention de 39 min est biologiquement active. La molécule correspondante est nommée M1.

II. 2. 2. Fractions II et III (FII et FIII)

Ces deux fractions ont fait chacune l’objet de deux étapes de séparation qui sont : La
chromatographie sur couche épaisse (CCE) suivie par une Chromatographie Liquide Haute
Performance (HPLC). Les conditions de purification HPLC utilisées pour les deux sous fractions
issues de la purification CCE des fractions FII et FIII, sont les mêmes que celles utilisées pour la
sous fraction issue de la fraction FI. Les tests microbiologiques ont montré que les molécules
obtenues M2 et M3 sont biologiquement actives.

119
 Résultats et discussion

II. 3. Caractérisation chimique de M1, M2 et M3

II. 3. 1. Molécule M1

Plusieurs techniques spectroscopiques ont été appliquées pour la caractérisation chimique

de cette molécule M1. Les techniques ainsi que les interprétations des résultats obtenus sont
présentés dans ce qui suit.

* Spectre RMN 1H de M1 :
Le spectre RMN 1H à 600MHz dans DMSO (Figure 16) de la molécule M1 montre un
signal dans la région aromatique et douze signaux dans la région aliphatiques.

Figure 16: Spectre RMN 1H (600MHz, DMSO) de la molécule M1

Le tableau 13 résume les donnés relatives aux études RMN 1H de M1

120
 Résultats et discussion

Tableau 13 : RMN 1H (600MHz, DMSO) de M1

1
H (ppm) multi Integration et J(Hz) RMN 1H
7,96 s NH
4,19 dd (1H, J=8.1, 8.0) Ces quatre signaux correspondent aux
4,01 dd (CH, J=6.9, 5.9)
hydrogènes proches d’éléments
3,41 m 1H
3,28 m 1H électronégatifs (O ou N).
2,13 m 1H
1,92 m 1H
1,90 m 1H
1,79 m 1H Ces huit signaux correspondent à des
1,77 m 1H H aliphatiques.
1,37 m 1H
0,88 d (1H, J=7.0)
0,87 d (1H, J=7.0)

* Spectre RMN 13C de M1 :

Le spectre RMN 13C de M1, réalisé à 150 MHz dans le DMSO (Figure 17), présente 11
signaux relatifs à 11 carbones différents. Chaque singulet correspond à un carbone différent. Le
Tableau14, résume les donnés spectrale de l’étude RMN 13C de M1.

Figure 17: Spectre RMN 13C de M1

121
 Résultats et discussion

Tableau 14 : RMN 13C (150MHz, DMSO) de M1

13
C (ppm) RMN 13C
170,8 C=O avec X=O, ou X=N
167,0
X
59,0 CH
53,1 CH
45,3 CH2 aliphatique
38,3 CH2 aliphatique
27,9 CH2 aliphatique
24,6 CH
23,2 CH3
22,9 CH2 aliphatique
22,4 CH3
13
D’après le spectre RMN δC
C, il est possible de discerner deux groupes carbonyle (δ
δC 59.0, 53.1
170,8 et 167,0), trois sp3-carbures hybridées portant un hétéroatome électronégatif (δ
δC 38.3, 27,9, 24,6 et 22,9) et deux groupes de
et 45.3), quatre sp3-hybridées de carbone (δ
δC 23.3 et 22.4). Les données spectrales, RMN 1H et RMN 13C de la molécule M1, sont
méthyle (δ
insuffisantes pour déterminer la structure chimique de cette molécule. Il est donc nécessaire de
réaliser des expériences RMN multidimensionnelles qui vont permettre de corréler les
hydrogènes et les carbones entre eux.
* Spectre HH COSY : Cette étude (Figure 18) permettra de corréler les protons entre eux par
couplage scalaire (interaction à 2, 3 voir 4 liaisons). Le tableau 15 résume les corrélations en
conséquences.

Figure 18: Spectre HH COSY de M1.

122
 Résultats et discussion

Tableau 15 : Corrélations HH COSY de M1

1 1
H (ppm) multi H (ppm) multi H-H COSY
2,13 m 1,79 m CH2-CH2
2,13 m 1,92 m CH2-CH2
2,13 m 4,19 dd
1,79 m 3,28 m
X
1,79 m 4,19 d
3,28 m 4,19 d X-N-CH-CH2-CH2-CH2-N-X
1,79 m 1,92 m CH2-CH2
1,77 m 1,90 m CH2-CH2
1,77 m 1,37 m CH2-CH2
1,90 m 0,88 d
1,90 m 0,87 d
1,90 m 4,01 m
1,92 m 4,19 d
1,37 m 4,01 d
1,37 d 1,90 m CH2-CH2
4,01 dd 4,19 dd

L’ensemble de ses résultats montre la structure suivante (figure 19).

Figure 19: Structure chimique de M1 déduite selon les analyses spectrales réalisées

Toutes ces informations sont toujours insuffisantes pour donner une structure exacte de
M1. Pour cette raison, nous avons réalisé l’expérience HSQC qui permet de corréler les
hydrogènes avec les carbones à une liaison. Nous avons réalisé une expérience en mode « edité »
qui permet de distinguer les CH/CH3 (positif) des CH2 (négatif).

123
 Résultats et discussion

* Spectre HSQC : La figure 20 présente le spectre obtenu et le Tableau 16, illustre les
corrélations en conséquence.

Figure 20: Spectre HSQC de M1.

Tableau 16: Corrélations HSQC de M1

13 1 1
C (ppm) H (ppm) multi H (ppm) multi HSQC
59,0 4,19 dd - CH-N
53,1 4,01 dd - CH-N
45,3 3,41 m 3,28 m CH2-N
38,3 1,37 m 1,77 m CH2 aliphatique
27,9 1,92 m 2,13 m CH2 aliphatique
24,6 1,9 m - CH2 aliphatique
23,3 0,88 d - CH-N
22,4 0,87 d - CH3
22,9 1,79 m - CH2 aliphatique

124
 Résultats et discussion

Les données obtenues sont toujours insuffisantes d’élucider la structure chimique complète
de M1. Nous étions amenés à réaliser le spectre HMBC qui permet de rétablir les corrélations des
protons et les 13C à deux, trois ou à quatre liaisons.

* Spectre HMBC : La figure 21 présente le spectre obtenu et le tableau 17, illustre les
corrélations en conséquences

Figure 21: Spectre HMBC de M1

125
 Résultats et discussion

Tableau 17: Corrélations HMBC de M1

13 1 1
C (ppm) H (ppm) multi H (ppm) multi HSQC

O
170,8 2,13 m 4,19 d

C
CH2
CH N
N
167 ,0 1,77 m 4,01 d

170,8 2,13 m 4,19 d

170,8 0,88 d -

Les données des analyses RMN de M1 sont résumées dans le Tableau18.

Tableau 18: Données des analyses RMN de M1

Donnés de RMN du Produit 1 dans le DMSO

Position δC, mult. δΗ, mult (J)
Leu
1 167.0, qC
2 53.1, CH 4.01, dd (6.9, 5.9)
3 38.3, CH2 1.37, m
1.77, m
4 24.6, CH 1.9, m
5 22.4, CH3 0.87, d (7.0)
5' 23.3, CH3 0.88, d (7.0)
Arg
1 170.8, qC

126
 Résultats et discussion

2 59.0, CH 4.19, dd (8.1, 8.0)

3 27.9, CH2 1.92, m
2.13, m
4 22.9, CH2 1.79, m
5 45.3, CH2 3.41, m
3.28, m
NH 7.96, br s

* Elucidation de la structure chimique complète de M1 :

Les expériences de la 2D 1H-1H et 1H-13C montrent deux fragments leucine et arginine. La
δH 7,96) est observée et les corrélations HMBC et NOE ont permis
présence d'un proton NH (δ
d'identifier le composé M1 en tant qu’un dipeptide (L-Leu-L-Arg). Sur la base de ces données,
deux structures possibles ont été proposées pour M1. La première est une structure linéaire et
dans ce cas le poids moléculaire correspondant (MW) sera 287 g/mol (Figure 22 a), et la seconde
est une structure cyclique est le MW sera 269 g/mol (Figure 22 b).
Pour déterminer la nature de structure de la biomolécule M1, nous avons réalisé une
analyse LC/MS. Comme le montre la figure 23, la masse obtenue pour M1 est de 269 Da. Ceci
implique que la molécule M1 est le dérivé de dikétopipérazine (DKP) : (L-Leu, L-Arg) ayant une
structure cyclique. C’est donc le Cyclo (L-Leu, L-Arg) ce qui correspond à la structure présentée
par la figure 22a. La formule moléculaire correspondante à M1 est : C12H23O2N5.

127
 Résultats et discussion

Figure 22 : Structures chimiques possibles de M1.

Intens. 1. +M S, Line, 12.4-12.5m in (#891-#895), 100%=13448432

x10 7
1.5 269.0

1.0

283.2

0.5
295.2
199.0 343.2 452.3
148.9
177.0 243.0 255.1 309.2 328.3 364.3 391.3 408.2 419.2
211.1 227.1 434.4
135.1 165.0
0.0
x10 7 1. +M S2(269.1), Line, 12.4-12.5m in (#892-#896), 100%=8984623

1.0
254.9

0.8

0.6

0.4

0.2
227.0
0.0
150 200 250 300 350 400 450 m /z

Figure 23: Spectre LC/MS de M1

128
 Résultats et discussion

II. 3. 2. Molécule M2

Cette molécule est de couleur blanche à l’état solide. Son Rf = 0,411 (CH2Cl2 / MeOH
4%). Comme la molécule M1, l’identification chimique de cette molécule a été déterminée par le
biais de plusieurs techniques spectroscopiques.

* Spectre RMN 1H de M2: Comme le montre la figure 24, dix signaux ont été obtenus
dont deux dans la région aromatique et 8 signaux dans la région aliphatiques. Le tableau 19,
résume les données relatives aux études RMN 1H de M2.

Figure 24 : Spectre RMN 1H de M2

Le spectre RMN 1H de M2 a montré un système caractéristique AA’BB’ à 7.74 et 7.59

ppm (JAA’ =0,7 Hz, JAB=JA’B’=JBB’=7,8Hz et JAB’=JA’B= 1,1 Hz obtenus à partir de simulation).

129
 Résultats et discussion

Tableau 19 : Corrélations RMN 1H de M2

1 Intégration et J (Hz)
H (ppm) multi
7,74 m

7,59 m

4,25 dd (CH2O, J=10.8, 5 .6)

4,21 dd (CH2O, J=10.8, 6.0)
1,71 m CH2 aliphatique
1,46 m CH2 aliphatique
1,40 m CH2 aliphatique
1,36 m CH2 aliphatique
0,96 t (CH3, J=7.3)
0,94 t (CH3, J=7.0)

* Spectre RMN 13C de M2 : Le spectre obtenu présente 12 signaux relatifs à 12 carbones

différents (Figure 25).

Figure 25 : Spectre RMN 13C de M2

13
L’analyse du spectre RMN C de M2 a permis de distinguer les corrélations suivantes
(Tableau 20).

130
 Résultats et discussion

Tableau 20 : RMN 13C de M2

13
C (ppm) RMN 13C
162,5
132,5
130,9
128,7
68,0 CH2=O
38,8
30,4
28,9 CH2 aliphatiques
23,8
23,0
13,8 CH3

13
D’après les résultats des analyses en RMN C de M2, il est possible de discerner un
carbonyle du groupe (δC 162,5), trois sp -carbures hybridées (δC 132,5, 130,9 et 128,7), une sp3-
2

hybridées de carbone portant un hétéroatome électronégatif (δC 68.0), cinq sp3-carbures

hybridées (δC 35.8 et 23,8) et deux groupes de méthyles (δC 13.8 et10.7).
* Spectre HH COSY de M2 : Les données sont portées sur la Figure 26 et le Tableau 21

Figure 26. Spectre HH COSY de M2.

131
 Résultats et discussion

Tableau 21: Corrélations HH COSY de M1.

1 1
H (ppm) multi H (ppm) multi H-H COSY

7,74 m 7,59 m

4,21 d 1,36 m CH2-CH

1,36 m 0,96 m CH2-CH3
1,71 m 1,36 m CH-CH2

L’ensemble des résultats montre la structure suivante (Figure 27).

CH3

CH2

O CH2 CH

CH2

CH3

Figure 27: Structure partielle déduite selon les études RMN

Les données obtenues suite aux différentes études spéctrales RMN (1H et 13
C) restent
insuffisantes pour l’élucidation totale de la structure de la molécule de M2. Nous avons alors
poussée les études spectroscopiques :

* Spectre HSQS de M2 : Les résultats obtenus suite à ces études sont montrés par la
Figure 28 et le Tableau 22.

132
 Résultats et discussion

Figure 28: Spectre HSQC de M2

Tableau 22: Corrélations HSQC de M2

13 1
C (ppm) H (ppm) multi HSQC
128,7 7,74 m CH typiques d’un cycle
130,9 7,59 m aromatique
68,0 4,25 dd CH2-O
68,0 4,21 dd
38,8 1,71 m CH
30,4 1,40 m
28,9 1,36 m CH2
23,0 1,36 m
13,8 0,94 t CH3
23,8 1,46 m CH2
10,7 0,96 t CH3

133
 Résultats et discussion

* Spectre HMBC de M2 : (Figure 29) Cette étude a permis de distinguer :

C (168,5ppm) H (4,14ppm) H (7,74ppm) qui correspond à un noyau benzénique

(Figure 30).

Figure 29: Spectre HMBC de M2.

Figure 30: Noyau benzénique de M2 suite aux études HMBC

134
 Résultats et discussion

L’ensemble des données des études RMN de M2 sont représentées dans le tableau
suivant :

Tableau 23: Données RMN de M2.

Données de RMN du produit 1 dans CD2Cl2

Position δC, mult. δΗ, mult (J)

1 162.5, qC
2 132.5, qC
3 128.7, CH 7.74, m
4 130.9, CH 7.59, m
1' 68.0, CH2 4.25, dd (10.8, 5.6)
4.21, dd (10.8, 6.0)
2' 38.8, CH 1.71, m
3' 30.4, CH2 1.40, m
4' 28.9, CH2 1.36, m
5' 23.0, CH2 1.36, m
6' 13.8, CH3 0.94, t, (7.0)
7' 23.8, CH2 1.46, m
8' 10.7, CH3 0.96, t, (7.3)

Ces données sont en accord avec un composé qui a une di ortho-substitués

aromatique. Tenant compte de ces résultats ainsi que des recherches dans AntiBase, le
composé M2 a été identifié comme di-(2-éthylhexyl) phtalate (Figure 31). La formule
moléculaire correspondante, est C24H38O4 avec une masse de 390 g/mol.

Figure 31: Structure chimique de la biomolécule M2.

135
 Résultats et discussion

II. 3. 3. Molécule M3.

Cette molécule présente un Rf = 0,353 (CH2Cl2 / MeOH 4%). Les différentes études
spectroscopiques ayant permis la détermination de la structure chimique de M3 sont :
* spectre RMN 1H de M3: Le spectre obtenu (Figure 32), montre trois signaux dans la
région aromatique et neuf signaux dans la région aliphatique. Le Tableau 24 présente les
corrélations en conséquence.

Figure 32: Spectre RMN 1H de M3

Tableau 24: Corrélations RMN 1H de M3

1 Intégration et J(Hz)
H (ppm) multi
7,98 s NH
7,27 m H Les H sont de type benzénique
7,20 m H
4,36 t (H, J=5.1) Ces six signaux correspondent
4,09 d H à des hétéro éléments, de type
3,40 m H de CH ou CH-N ou CH-O
3,28 m H
3,08 dd (H, J=14.2, 5.1)
3,02 dd (H, J=14.2, 5.1)
2,01 m Ces trois signaux correspondent à des CH
1,73 m aliphatiques
1,43 m

136
 Résultats et discussion

* Spectre RMN de 13C de M3 : D’après la Figure 33, on peut distinguer 12 signaux relatifs à 12
carbones différents. Chaque signal correspond à un carbone différent. Le tableau 25 donne les
corrélations en conséquence.

Figure 33: Spectre RMN de 13C de M3

Tableau 25: Corrélations Spectre RMN de 13C de M3

13
C (ppm) RMN 13C
169,5 X- C=O avec X=O, ou X=N
165,53
137,74
130,2
128,4
126,79
58,86 CH2-N
56,2
45,04 C- C=O
35,8
28,22 CH2 aliphatique
22,35

137
 Résultats et discussion

La RMN 13C, montre qu’il est possible de discerner deux groupes carbonyle (δC 169,5 et 165,5),
quatre carbones sp2-hybridées (δC 137,7 à 126,8), trois sp3-carbures hybridés portant un
hétéroatome électronégatif (δC 58.9, 56.2 et 45.0) et trois sp3-carbures hybridés (δC 35.8, 28.2 et
22.4).
* Spectre HH COSY de M3: La figure 34 présente le spectre obtenu est le tableau 26
illustre les corrélations correspondantes.

Figure 34: Spectre HH COSY de M3

138
 Résultats et discussion

Tableau 26: Corrélations HH COSY de M3

1 1 1
H (ppm) multi H (ppm) multi H (ppm) multi H-H COSY

7,20 m 7,27 m

1,43 m 1,73 m 2,01 m

X-N-CH-CH2-CH2-CH2-N-X
1,73 m 3,28 m 3,40 m
I
1,43 m 2,01 m 4,09 d X

2,01 m 4,09 d
2,01 m 1,43 m 1,73 m CH2-CH2
1,73 m 3,28 m 4,09 d
3,08 d 4,36 d CH-CH2
4,36 d 4,09 d

L’ensemble des analyses réalisées sur la molécule M3 permet de déduire que cette dernière
contient une structure chimique présentée sur la figure ci-dessous.

NH
CH2 I
CH2

Figure 35: Une composante chimique de la molécule M3

139
 Résultats et discussion

* Spectre HSQS de M3 : La figure 36, montre le spectre obtenu et le tableau 27 les

corrélations correspondantes.

Figure 36: Spectre HSQS de M3

Tableau 27: Corrélations HSQS de M3

13 1 1
C (ppm) H (ppm) multi H (ppm) multi HSQC
130,2 7,27 m -
126,8 7,20 d - CH typiques de cycle aromatique
128,4 7,27 m
58,9 4,09 d - CH-N
56,2 4,36 t - CH-N
45,0 3, 4 m 3,28 m CH2-N
35,8 3,08 d 3,02 d
28,2 2,01 m 1,43 m CH2 aliphatique
22,4 1,73 m -

* Spectre HMBC de M3 : Ci après le spectre obtenu (Figure 37) et les corrélations en

conséquence (Tableau 28).

140
 Résultats et discussion

Figure 37: Spectre HMBC de M3

141
 Résultats et discussion

Tableau 28: Corrélations HMBC de M3

13 1 1
C (ppm) H (ppm) multi H (ppm) multi HSQC

169,5 1,43 m 4,09 d

C
CH2
CH N
N

165,5 3,08 d 4,36 d NH

169,5 1,43 m 4,09 d NH

CH2 lié au quatrième carbone de

benzène
137,7 3,02 d -

CH2
CH

Les données obtenues suite aux études HMBC, montrent qu’il s’agit d’une Phénylalanine
(Figure 38).

Figure 38: Présence d’une Phénylalanine dans M3

Par ailleurs, les données combinées des expériences HMBC et HSQC, montrent la présence
d’une proline dans la molécule M3 (Figure 39).

142
 Résultats et discussion

Figure 39: Présence d’une Proline dans M3

Le tableau ci-après englobe toutes les données d’analyses RMN réalisées sur la molécule
M3.

Tableau 29: Résultats des analyses RMN de la molécule M3

Données de RMN du produit 1 dans CD3OD

Position δC, mult. δΗ, mult (J)
Phe
1 165.5, qC
2 56.2, CH 4.36, t (5.1)
3 35.8, CH2 3.08, dd (14.2, 5.1)
3.02, dd (14.2, 5.1)
4 137.7, qC
5 130.2, CH 7.27, m
6 128.4, CH 7.27, m
7 126.8, CH 7.20, m
NH 7.98, s
Pro
1 169.5, qC
2 58.9, CH 4.09, dd (9.0, 7.0)
3 28.2, CH2 2.01, m
1.43, m
4 22.4, CH2 1.73, m
5 45.0, CH2 3.40, m
3.28, m

Les expériences 2D 1H-1H et 1H-13C montrent la présence de deux fragments proline et

phénylalanine. Les corrélations HMBC de CH2 proline-5 protons à l'amide respectifs carbonyles
établit une structure de type tétrapeptide cyclique. Tenant compte de toutes les analyses
spectroscopiques, la structure de la molécule M3 (figure 40) a été fixée à :

143
 Résultats et discussion

1 - [2 - (cyclopentanecarbonyl-3-phenylpropionyl] - pyrrolidine-2-carboxylique (1-carbamoyl-

propyl)-amide.
La formule moléculaire correspondant à M3 est C28H32O4N4 avec une masse de 488
g/mol.

Figure 40: Structure chimique de la molécule M3

II. 4. Activités biologiques des biomolécules M1, M2 et M3.

La nouvelle souche de Streptomyces lilaceus sp. TN17 secrète simultanément trois
molécules biologiquement actives qui sont M1 (Cyclo [L-Leu, L-Arg]), M2 (di-(2-éthylhexyl)
phtalate) et M3 (1 - [2 - (cyclopentanecarbonyl-3-phenylpropionyl] - pyrrolidine-2-carboxylique
(1-carbamoyl-propyl)-amide).
Nous avons déterminé les activités biologiques de ces trois biomolécules à l’état pur contre
les deux bactéries à Gram+ (M. luteus LB 14110 et S. aureus ATCC 6538), la bactérie à Gram –
(E. coli ATCC 8739) et contre le champignon filamenteux Fusarium sp. Les activités biologiques
obtenues sont portées sur le Tableau 30.

144
 Résultats et discussion

II. 4. 1. La biomolécule M1

Cette molécule M1 Cyclo (L-Leu, L-Arg), est un dérivé de dikétopipérazines

« DKP ». Ces dérivés sont produits naturellement par plusieurs microorganismes et possèdent
différentes activités biologiques très intéressantes à savoir : antibactériennes, antifongiques,
herbicides, immunosuppresseurs, antitumorales etc (Magyar et al., 1999). Plusieurs dérivés de
DKP ont été purifiés et caractérisés à partir de souche de Streptomyces (Rhee 2002 ; Ben Ameur
Mehdi et al., 2004 – 2006). Par ailleurs, il est à noter que ces dérivés intéressent de plus en plus
plusieurs groupes de recherche afin de produire des nouveaux dérivés de DKP hybrides et ce par
le biais des techniques de la biologie moléculaire. En effet, et bien que les voies de biosynthèse
des dérivés de DKP demeurent en grande partie encore inconnues, les premières recherches
montrent que ces molécules actives semblent généralement être produites par les voies
nonribosomales (NRPS : Non Ribosomal peptide synthétases). Par analogie au polyketide
synthases de type I (PKSI), les NRPSs présentent une architecture modulaire et un module peut
être encore subdivisé en différents domaines, chacun responsable d'une réaction biochimique bien
déterminée. Cette architecture modulaire des dérivés de DKP, offre une potentialité réelle pour la
construction de nouveaux peptides hybrides ayant des activités biologiques intéressantes par
génie génétique (Sioud et al., 2007).
Suite aux tests d’inhibitions de la croissance des microorganismes (bactéries et
champignon), et comme le montre le Tableau 30, la molécule M1 inhibe la croissance de toutes les
souches indicatrices testées et par conséquent elle présente des activités antibactériennes contre les
bactéries à Gam+ et à Gram- et également une activité antifongique.

II. 4. 2. La biomolécule M2

La deuxième molécule (M2) produite par la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN17 est
le dérivé de phtalate le di-(2-éthylhexyl) phtalate. Les phtalates sont généralement connus comme
étant des sous produits de la pétro-chimie. Cependant, plusieurs molécules de cette famille ont été
déjà décrites produites à partir d’algues marines, à partir de plantes et également à partir de
microorganismes et notamment les bactéries du genre Streptomyces (Lee et al., 2000). Comme
exemple on peut citer le dérivé dibutyl phthalate produit par trois souches de Streptomyces qui
sont : Streptomyces nasri (El Naggar 1997), Streptomyces albidoflavus (Roy et al., 2006) et

145
 Résultats et discussion

Streptomyces melanosporofaciens (Lee, 2000). Notre molécule M2 a été déjà décrite, produite par
la souche de Streptomyces bangladeshiensis (Al Bari et al., 2006).
D’après nos tests microbiologiques, la molécule M2 possède des activités antibactériennes
contre les bactéries à Gram+ et une activité antifongique (Tableau 30).

II. 4. 3. La biomolécule M3

La molécule M3 produite par Streptomyces lilaceus sp. TN 17, est un tetracyclopeptide : 1 -

[2 - (cyclopentanecarbonyl-3-phenylpropionyl] - pyrrolidine-2-carboxylique (1-carbamoyl-
propyl)-amide. Comme nous l’avons mentionné dans la partie bibliographique, l’importance des
cyclopeptides est liée à leurs propriétés antibiotiques uniquement (Ovchainnikov et Ivanov, 1975).
Depuis, les peptides cycliques ont continué à faire l’objet de nombreux travaux et de nouvelles
propriétés biologiques sont apparues à savoir: activité cytotoxique vis-à-vis des cellules tumorales
et activité immunosuppressive (Horton et al., 2008).

Plusieurs biomolécules tétrapeptides cycliques ont été décrites notamment à partir de bactéries
à savoir la Rhodopeptine, purifiée à partir d’une bactérie du genre Rhodococcus et cette
biomolécule se caractérise par ses activités antifongiques (Chiba et al., 1999). L’apicidin, un
tetrapeptide cyclique produit par une souche bactérienne du genre Streptomyces et possèdent des
activités antitumorales (Okada et al., 2006).

Concernant la molécule M3 secrétée par notre souche, elle a été récemment décrite à partir
d’une autre souche de Streptomyces (Lebrihi et al., 2008). Ces auteurs ont breveté la molécule M3
pour ses activités antifongiques applicables dans le domaine agronomique contre des
phytopathogènes. Selon nos tests d’inhibitions de la croissance des microorganismes utilisés, nous
avons constaté que cette molécule outre ses activités antifongiques, elle possède des activités
antibactériennes contre les bactéries à Gram+ (Tableau 30).

146
 Résultats et discussion

Tableau 30. Activités microbiennes des molécules pures M1, M2 et M3: La quantité déposée pour chaque
molécule est de 50 µg. Les diamètres d’inhibitions des cellules indicatrices sont donnés en mm.

Microorganismes testés Diamètres des zones d’inhibitions (mm)

M1 M2 M3

M. luteus LB 14110 20 17 19
S. aureus ATCC 6538 14 12 15
E. coli ATCC 8739 11 ND ND
Fusarium sp. 21 14 17

III. Extraction et purification des biomolécules de la souche de

Streptomyces microflavus sp. Fr10

III. 1. Extraction
La nouvelle souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10 a été sélectionnée durant des
travaux antérieurs pour ses activités antimicrobiennes importantes contre les bactéries à Gram+ et
à Gram- et les champignons. Les conditions de production de biomolécules de cette souche ont été
également optimisées lors de travaux antérieurs réalisés au LMB-CBS. Les meilleurs conditions
retenues sont : Le milieu Bennett ayant comme source de carbone le glycérol à 0,5% ; une
température de croissance de 30°C avec une agitation de 250 rpm. Les additifs chimiques testés
« MgSO4, 7H2O (2 mM) ; K2HPO4 (1 mM) et les oligo-éléments » n’ont pas d’effet sur la
production de biomolécules.
Pour l’extraction et la purification des biomolécules de cette souche nous avons préparé un
volume de surnageant actif de 35 litres (7 fermentations de 5 litres chacune) utilisant les conditions
optimales décrites ci-dessus. Après incubation de 72 h à 30°C, le jus de fermentation est filtré puis
centrifugé. Le surnageant obtenu est extrait deux fois par un volume égal d’acétate d’éthyle. La
phase organique biologiquement active, est évaporée à sec par Rotavapor. Les sept extraits secs
obtenus (des sept fermentations successives) de couleur marron ont été mélangés pour donner une

147
 Résultats et discussion

masse totale de 3g et puis dissous dans 5 ml de dichloro-méthane - méthanol (DCM 95% - MeOH
5%).
Les tests biologiques réalisés sur les extraits secs collectés montrent un fort pouvoir
inhibiteur de ces extraits contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et les champignons (Tableau 31).

Tableau 31. Activités biologiques des extraits secs collectés de la souche de Streptomyces microflavus
sp. Fr10: Pour chaque test, 50 µl (du mélange 5 ml de dichloro-méthane – méthanol) ont été déposés.

Cellules M. luteus S. aureus S. enterica E. Coli [Link]

indicatrices LB 14110 ATCC 6538 ATCC43972 ATCC
8739

Φ(mm) 22 23 25 19 20

III. 2. Purification
La figure 41, présente le schéma global adopté pour la purification de six molécules
bioactives (M1 – M6) de la souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10

148
 Résultats et discussion

Bactérie Streptomyces microflavus sp.Fr10

Culture liquide 35 litres

Centrifugation

Culot cellulaire Surnageant

Extraction deux fois par l’acétate

d’éthyle

Evaporation

Extrait sec (3,0 g)

CCE

FI FII FIII FIV FV FVI

HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Figure 41 : Les différentes étapes utilisées pour la purification des six biomolécules de la souche de
Streptomyces microflavus sp. Fr10

CCE = Chromatographie sur Couche Epaisse (DCM 95%/MeOH 5%)

HPLC= traitement par colonne RP-18

149
 Résultats et discussion

Les six molécules bioactives ont été obtenues à l’état pur suite à deux étapes
chromatographiques : Une chromatographie sur couche épaisse suivie par une chromatographie
en phase liquide à haute performance (HPLC). Les tests d’inhibition de la croissance des
microorganismes utilisés comme cellules indicatrices ont montré que :

* Les molécules M1, M2 et M6, à l’état pur, possèdent une forte activité inhibitrice contre
les champignons et les bactéries à Gram+ et à Gram-.

* Les molécules M3, M4 et M5, à l’état pur, possèdent des activités antibactériennes
uniquement contre les bactéries à Gram+. Egalement, ces molécules possèdent des activités
antifongiques qui sont moins importantes que celles des molécules M1, M2, et M6.

Nous avons déterminé, par la technique LC/MS/MS, les masses de ces six biomolécules pures
(Figure 42 A-F). Ces masses MW en Da sont : M1 = 413 ; M2 = 300 ; M3 = 279 ; M4 = 194 ; M5
= 239 et M6 = 290g/mol.

Figure 42 A : Masse moléculaire MW de la biomolécule pure M1

150
 Résultats et discussion

Figure 42 B : Masse moléculaire MW de la biomolécule pure M2

Intens. +MS, Line, 2.0min (#64), 100%=50592828

x10 7
278.7
5

1 153.9
168.8 201.8 388.7
110.8
0
100 200 300 400 500 600 700 800 m /z

Figure 42 C : Masse moléculaire MW de la biomolécule pure M3

Intens. +MS, Line, 2.0min (#68), 100%=28289912
x10 7 191.8

2.5

2.0

1.5

1.0
151.9
0.5 214.9
124.9 282.8
0.0
100 200 300 400 500 600 700 800 m /z

Figure 42 D : Masse moléculaire de la biomolécule pure M4

151
 Résultats et discussion

Intens. 1. +M S, Line, 6.1-6.4min (#188-#200), 100%=44994181

x10 7
5 238.8

2
216.8

1
145.9 177.8
99.9
0
x10 4 1. +M S2(238.9), Line, 6.1-6.4m in (#189-#201), 100%=67355

4
256.7
238.7
278.2
3 628.7

2 351.6

329.6 412.8
1 124.9
97.9 190.9 380.3 520.5
449.9 593.3
83.9 494.0
0
100 200 300 400 500 600 700 800 m /z

Figure 42 E: Masse moléculaire de la biomolécule M5

Intens. 4. +MS, Line, 2.4m in (#76), 100%=13027433

x10 7
1.5 289.8

1.0

238.8
0.5
145.9
121.9 210.9 311.7
59.1 422.6
0.0
x10 7 4. +M S2(290.0), Line, 2.4min (#77), 100%=7941802
1.0

196.8
0.8

0.6

0.4

0.2
126.9 154.8
0.0
100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

Figure 42 F: masse moléculaire de la biomolécule pure M6

Les analyses spectroscopiques sont actuellement en cours pour la détermination de la structure

chimique de ces six biomolécules pures.

152
 Résultats et discussion

Conclusion

Les résultats des travaux de recherche se rapportant à ce deuxième chapitre, peuvent

être résumés comme suit :

* Nous avons optimisé les conditions de production des biomolécules de la souche de

Streptomyces lilaceus sp. TN17. Les conditions de cultures retenues sont : milieu TSB à 30 g/l
additionné de glucose à 1 % w/v et de K2HPO4 « 1mM ». La température d’incubation est de 30°C
avec une agitation de 250 rpm en Erlenmayer. En utilisant ces conditions nous avons préparé une
culture de 30 litres dans un fermenteur (500 rpm et 30°C).

* Après une double extraction du surnageant par l’acétate d’éthyle, l’extrait sec actif
obtenu a été soumis à plusieurs étapes chromatographiques (Séphadex LH-20, Chromatographie
sur couche épaisse et chromatographie en phase liquide à haute performance). Trois molécules
pures biologiquement actives (M1, M2 et M3) ont été obtenues et les structures chimiques
correspondantes ont été caractérisées par le biais de plusieurs techniques spectroscopiques. Il
s’agit de :
- M1 (MW = 269 g/mol) c’est un dérivé de DKP (L-Leu, L-Arg). Cette molécule
possède des activités antibactériennes contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et
antifongiques.
- M2 (MW = 390 g/mol), c’est un dérivé de phtalate le di-(2-éthylhexyl) phtalate.
Cette molécule possède des activités antibactériennes contre les Gram+ et des activités
antifongiques.
- M3 (Mw = 488 g/mol), c’est tétrapeptide cyclique;
le 1 - [2 -(cyclopentanecarbonyl-3-phenylpropionyl] - pyrrolidine-2-carboxylique (1-carbamoyl-
propyl)-amide. Cette molécule possède des activités antibactériennes contre les Gram+ et des
activités antifongiques.

* Nous avons également préparé une culture de 35 litres à partir de la deuxième souche
étudiée, la souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10. Après une double extraction par l’acétate

153
 Résultats et discussion

d’éthyle du surnageant correspondant, l’extrait sec actif a été soumis à deux étapes de
purification : Une chromatographie sur couche épaisse suivie par une chromatographie en phase
liquide à haute performance (HPLC). Six molécules bioactives ont été obtenues (M1-M6). Les
masses moléculaires de ces dernières sont : M1 = 413 ; M2 = 300 ; M3 = 279 ; M4 = 194 ; M5 =
239 et M6 = 290g/mol.

Les travaux de recherche relatifs à la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN17 ont fait
l’objet d’un article publié dans le Journal à Comité de lecture Internationale : Natural Product
Research et un brevet National :

Article

Slim Smaoui, Lotfi Mellouli*, Ahmed Lebrihi, Yannick Coppel, Lilia Fourati-Ben Fguira and
Florence Mathieu (2009). Purification and structure elucidation of three naturally bioactive
molecules from the new terrestrial Streptomyces sp. TN17 strain. Natural Product Research. In
press

154
 Résultats et discussion

Brevet

Slim SMAOUI, Florence MATHIEU, Ahmed LEBRIHI, Yannick COPPEL, Lilia FOURATI
Ben FGUIRA, Lobna ELLEUCH, Samir BEJAR et Lotfi MELLOULI* (2009). Trois molécules
biologiquement actives, dont une nouvelle dérivé de dikétopipérazine, produites simultanément à
partir d’une nouvelle souche bactérienne appelée Streptomyces sp. TN17. INNORPI TUNISIE
TN2009/0065.

155
 Résultats et discussion

C. SELECTION ET IDENTIFICATION DE LA
SOUCHE Lactobacillus plantarum sp. TN635. ETUDE
DES CARACTERISTIQUES BIOCHIMIQUES ET
MICROBIOLOGIQUES ET PURIFICATION DE LA
BACTERIOCINE BACTN635

Avec la découverte des antibiotiques, l’humanité a disposé d’un moyen et d’un remède
extrêmement efficaces contre le fléau des bactéries pathogènes qui l’accablaient depuis des
millénaires. Depuis la découverte de la pénicilline, des milliers d’antibiotiques sont produits et
différentes classes ont été décrites. L’utilisation des antibiotiques a représenté alors le plus grand
succès thérapeutique et cette utilisation sauve annuellement des millions de vies.
Malheureusement, l'utilisation massive et répandue des antibiotiques en médecine humaine et
vétérinaire, a engendré un problème très épineux qui est la résistance des bactéries pathogènes
aux traitements par les antibiotiques. Les scientifiques ont observé que les bactéries qui étaient
auparavant sensibles pouvaient y devenir résistantes, et plus on utilise d'antibiotiques, plus cette
résistance s'accroît. On s’est rendu compte que le miracle « antibiotique » a ses limites.
Actuellement, il existe des souches de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas aeruginosa qui
résistent à tous les antibiotiques connus. La question est donc comment remédier à cette
situation ?
Outre la recherche de nouvelles molécules antibiotiques, l’une des solutions pour
surmonter le problème de la résistance des bactéries pathogènes aux biomolécules, pourrait être
l’utilisation des bactériocines. En effet, les bactériocines ont été énormément appréciées comme
étant des agents de thérapie naturelle, complémentaire aux antibiotiques. Les domaines
d’utilisation des bactériocines sont multiples à savoir :
- dans le domaine agronomique où l’utilisation est avantageuse parce que les bactériocines
sont non toxiques, facilement dégradables par les enzymes digestives et du fait qu’elles sont des
substances naturelles, leur emploi permettrait d’avoir des produits plus sains et réduirait
l’utilisation des agents chimiques de conservation.

156
 Résultats et discussion

- Dans le domaine agricole où l’exploitation des bactériocines en agriculture, pour la

protection des plantes contre les microorganismes phytopathogènes, connaît un essor qui
intéresse de plus en plus les chercheurs.

- Dans les domaines de la médecine humaine et vétérinaire et bien que cette utilisation ne
soit pas encore répandue, mais plusieurs études s’orientent actuellement vers cet axe de recherche
pour résoudre les problèmes de résistance des microorganismes pathogènes aux antibiotiques.

De nombreuses souches bactériennes, à Gram positif et à Gram négatif ont été décrites
pour leur capacité à produire des bactériocines. Cependant, les bactéries lactiques restent les
meilleures candidates pour la production de ce genre de biomolécules.

Dans cette troisième partie de cette présente thèse, notre intérêt s’est porté vers les
biomolécules de nature bactériocine produites par des bactéries lactiques, pour des éventuelles
applications en agro-alimentaire, en agronomie et en médecine humaine. Ci-après nous
développons les principaux résultats obtenus.

I. Sélection des bactéries lactiques productrices de bactériocines

Durant des travaux antérieurs réalisés au LMB-CBS, une collection de cinquante quatre
bactéries lactiques a été construite. Ces bactéries ont été isolées à partir de plusieurs origines
(viandes, fruits, végétaux et produits laitiers). Nous avons testé ces bactéries pour leur capacité à
produire des biomolécules (bactériocines) en utilisant cinq souches indicatrices qui sont :
Lactobacillus casei DSM 20011, Listeria ivanovii BUG 496, Salmonella enterica ATCC 43972,
Fusarium sp et Candida tropicalis R2. Comme le montre le tableau 32, nous avons obtenu
différents profils d’inhibition pour les souches indicatrices. Cependant, neuf bactéries lactiques
(TN600, TN606, TN615, TN618, TN623, TN627, TN635, TN644 et TN653) parmi les
cinquante quatre testées, présentent des activités biologiques ayant des spectres d’actions qui
semblent être intéressants. Nous avons alors sélectionné ces neuf bactéries pour des tests plus
poussés, tout en utilisant un nombre plus important de souches indicatrices. Il s’agit de :
bactéries à Gram+ (Micrococcus luteus LB 14110, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Listeria
ivanovii BUG 496, Enterococcus faecalis JH 2-2 et Enterococcus faecium ENSAIA 631), des
bactéries à Gram- (Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella enterica ATCC43972,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 49189, Hafnia sp et Serratia sp.), des lactobacilles

157
 Résultats et discussion

(Lactobacillus casei DSM 20011, Lactobacillus sakei 2525, Lactobacillus delbrueckii DSM
20081, Lactobacillus lactis ATCC 11454 et Lactobacillus lactis subsp cremoris DSM 11603) et
deux champignons, Fusarium sp. (champignon filamenteux) et Candida tropicalis R2
(champignon unicellulaire). Comme le montre le tableau 33, l’isolat TN635 inhibe la croissance
de toutes les souches indicatrices testées. A ce propos, il est à noter que les bactériocines
extraites des bactéries lactiques sont généralement dirigées vers les bactéries à Gram+ et rares
sont celles qui possèdent un spectre d’action large (Atanassova et al., 2001). Le spectre large de
la biomolécule (bactériocine) de l’isolat TN635 pourrait être intéressant, ce qui nous a amené à
étudier les caractéristiques et purifier cette bactériocine.

Tableau 32. Spectre d’action des isolats (TN600-TN653) contre cinq souches cibles testées.

Isolats Microorganismes indicateurs

Lb. casei Listeria ivanovii Salmonella enterica Fusarium sp. Candida tropicalis
DSM 20011 BUG 496 ATCC43972 R2 CIP203
TN600 6 12 22 14 8
TN601 - 7 - - -
TN602 - - - - -
TN603 8 - - - 6
TN604 - - - 8 8
TN605 10 16 7 7 -
TN606 7 18 16 16 9
TN607 6 5 - - -
TN608 8 8 8 - -
TN609 9 - 7 8 -
TN610 - 13 15 - -
TN611 - - - - -
TN612 - - - - -
TN613 9 17 10 - 8
TN614 - 6 7 8 15
TN615 7 6 18 19 5
TN616 8 - - 16 -
TN617 - - - 18 -
TN618 8 14 16 18 9
TN619 8 7 - 10 -
TN620 7 16 - - -
TN621 6 - - 20 -
TN622 - 7 5 - 6
TN623 7 20 18 17 19
TN624 8 8 7 7 -
TN625 7 6 17 - -
TN626 - - - - -
TN627 8 9 12 14 10

158
 Résultats et discussion

TN628 - - 6 16 -
TN629 7 - - 6 -
TN630 9 9 - 6 6
TN631 - 18 17 9 -
TN632 - 8 8 - -
TN633 9 - - - 7
TN634 6 - 7 7 -
TN635 9 22 21 23 21
TN636 9 6 - 7 -
TN637 8 7 - 15 -
TN638 7 - 7 16 -
TN639 - 7 7 18 7
TN640 7 7 8 6 -
TN641 - 16 17 - 15
TN642 6 - - 16 -
TN643 - 6 7 17 6
TN644 7 16 6 22 6
TN645 6 7 8 - -
TN646 - - - 18 7
TN647 7 - 6 8 -
TN648 8 8 - 18 -
TN649 - - 8 16 6
TN650 - 16 - 17 17
TN651 6 - 7 7 6
TN652 - 8 - 12 7
TN653 7 16 17 18 8

Tableau 33. Spectre d’action des neuf isolats pré-sélectionnés (TN600, TN606, TN615, TN618, TN623,
TN627, TN635, TN 644 and TN653) contre les quinze bactéries et les deux champignons utilisés
comme souches indicatrices.

Souches indicatrices TN600 TN606 TN615 TN618 TN623 TN627 TN635 TN644 TN653

Bactérie Gram positive

Micrococcus luteus 23 14 6 14 14 6 23 14 11
LB 14110
Staphylococcus aureus 12 15 16 14 9 16 22 21 8
ATCC 6538
Listeria ivanovii 12 18 6 16 20 9 22 16 16
BUG 496
Enterococcus faecalis 6 18 8 - 15 16 22 7 8
JH 2-2
Enterococcus faecium 6 14 7 - 14 14 21 8 6
ENSAIA 631

159
 Résultats et discussion

Bactérie Gram negative

5 22 13 15 15 23 22 13 22
Escherichia coli
ATCC 8739
Salmonella enterica 22 16 18 16 18 12 21 6 17
ATCC43972
Pseudomonas 22 16 6 9 14 9 22 8 9
aeruginosa ATCC 49189
[Link] 5 15 6 13 24 6 24 5 7
[Link] 12 6 12 15 21 7 23 8 9
bactérie Lactobacilli

Lactobacillus casei
DSM 20011 6 7 7 8 7 8 9 7 7

Lactobacillus - 6 8 - - 9 9 6 -
delbrueckii DSM 20081
Lactobacillus sakei - 6 7 - 7 6 9 - -
2525
lactococcus lactis - - 6 5 6 7 9 - 9
ATCC 11454
lactococcus lactis - - 5 7 7 9 8 - 8
cremoris
DSM 11603

Champignons
14 16 19 18 17 14 23 22 18
Fusarium. Sp
Candida tropicalis 8 9 5 9 19 10 21 6 8
R2 CIP203

II. Identification de l’isolat TN635

Avant d’initier la caractérisation et la purification de la biomolécule (bactériocine) de
l’isolat TN635, il est bien entendu primordial de s’assurer que cette bactérie est nouvelle et n’a
jamais était décrite. Pour cette réalisation, nous avons appliqué la technique d’identification
moléculaire qui consiste à amplifier, séquencer et analyser la séquence nucléotidique du gène
codant pour l’ARN 16S de la souche TN635. Après préparation de l’ADN total de cette souche,
nous avons utilisé deux oligonucléotides P1 et P2 (P1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' et
P2: 5'-ATGGCTCAGGACGAACGCT-3’) pour amplifier le gène codant pour l’ARN 16S de la
souche TN635. L’analyse du produit de PCR a montré l’amplification d’un seul fragment d’ADN

160
 Résultats et discussion

ayant une taille attendue d’environ 1500 pb. Ce fragment a été purifié puis cloné dans un vecteur
approprié. Après transformation de cellules compétentes d’E. coli par le produit de ligation, nous
avons analysé les ADNs plasmidiques de quelques transformants ce qui nous a permis d’obtenir
le plasmide recombinant pSS1 contenant comme insert le fragment d’ADN d’environ 1500 pb.
Ce fragment a été séquencé dans les deux sens et la séquence nucléotidique correspondante est de
1540 pb (Figure 43).

5’TGATCCAGCCCCAGGTCCTCTTACGGCTACCATAATACAACTTCAGCTTAATCATCT
GTCCCACCTTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACA
AACTCTCAGGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGG
CATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTAC
AATCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCG
TTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGAAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTG
ACCTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTT
AATGGTGGCAACTGTTAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATATC
AGTTCAGGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACG
TCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGTCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTT
CGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTC
AGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAA
GGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTA
TCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAG
CCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAG
TTCCACGGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGA
GCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATA
AATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTAAGCC
GTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGATGTTCTCAGATATGTTCTTC
TTTAACAACAGAGTTTTACGTGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCAT
CAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCC
GTGTCTCACTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCAT
GGTGAGCCGTTACCTCGCCGTCTACCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATA
GCCCAAGCCATCTTTCAAGGTAGGACCATGCGGTCCAAGGGGTTGTGCGGTATTAGC

161
 Résultats et discussion

CTCTGTTTCGAGGTGTTATCCCCCGCTTTTAGGAAGGTTTCCCACGTGTTACTCAACT
GTTCGCCACTCACTCAAATGGAAAACATGGTGCAAGCACCAATCAATACCAGACTTG
GTCCAAGTTGCATGTATTAGGGACCCCGGTAGCGGTCGTCCTGAGCCAT3’

Figure 43 : Séquence nucléotidique du gène codant pour l’ARN 16S de la souche TN635.

L’alignement de cette séquence nucléotidique avec celles des gènes codant pour l’ARN
16S des banques de données a montré une forte similarité (entre 97 et 99%) avec les gènes codant
pour l’ARN 16S du genre lactobacillus. Le score d’identité le plus élevé a été obtenu avec la
séquence nucléotidique du gène ARN 16S de la souche Lactobacillus plantarum NRIC 0383.
L’étude de la phylogénie de la souche TN635 (Figure 44) a confirmé ce résultat.

Figure 44: Arbre phylogénique de la souche TN635.

En tenant compte de la séquence nucléotidique du gène codant pour l’ARN 16S de l’isolat
TN635 ainsi que de l’arbre phylogénique correspondant, nous constatons que cette souche est une
nouvelle espèce du genre lactobacillus et nous proposons sa désignation comme étant
Lactobacillus plantarum sp. TN635.

162
 Résultats et discussion

III. Température optimale et cinétique de production de la

biomolécule (bactériocine)
Pour tester l'effet de la température et la durée d'incubation sur la croissance bacteriennes
et la production de l'activité antimicrobienne, cinq cultures de la souche Lactobacillus plantarum
TN635 en milieu MRS liquide dans des conditions anaérobies, ont été maintenues à quatre
températures différentes (25, 30, 37 et 45°C). La croissance a été suivie en mesurant la densité
optique (DO) à 600 nm et l'activité antimicrobienne a été déterminée contre les trois micro-
organismes indicateurs: Listeria ivanovii BUG 496, Salmonella enterica ATCC43972 et Candida
tropicalis R2 CIP203. Des aliquots ont été prélevés à des intervalles de 3h de temps. Les résultats
obtenus montrent que la production de l'activité biologique est corrélée avec la production de la
biomasse. La croissance la plus dense et la meilleure activité antimicrobienne ont été obtenues à
30°C. Cette activité optimale a été notée pour un temps d’incubation de 16h (Figure 45).
L’activité reste stable entre 13 et 20 h, puis elle diminue progressivement.

35 8

7
30

6
Inhibitory Zone Diameter (mm)

25

Diamètre 20 OD 600 nm
d’inhibition 4 DO 600
(mm) 15 nm
3

10
2

5 1

0 0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Incubation time (h)
Temps d’incubation

Figure 45. Cinétique de production de la biomolécule (bactériocine) de la souche L. plantarum

TN635 à 30°C, (■) densité optique à 600nm. Activité inhibitrice contre Candida tropicalis R2 CIP203
(▲); contre S. enterica ATCC43972 (●) et contre L. ivaonvii BUG 496 (♦).

163
 Résultats et discussion

IV. Effets des différents traitements sur l’activité antimicrobienne de

la souche TN635
IV.1. Effet de la catalase, des enzymes protéolytiques, de la
lipase et de l’α -amylase
Les analyses antimicrobiennes contre les cellules indicatrices: L. ivanovii BUG 496, S.
enterica ATCC43972 et C. tropicalis R2 CIP203, du surnageant de culture de la souche Lb.
plantarum sp. TN635 (culture de 16h à 30°C), ont montré que l’activité biologique n’est pas
affectée par l’addition de catalase. Ce résultat implique que l’inhibition de la croissance des
cellules indicatrices n’est pas due à la production de peroxidase d’hydrogène mais elle est
vraisemblablement due à la production de biomolécule(s). Par contre, le traitement du surnageant
par les enzymes protéolytiques (Trypsine, Pronase E et Proteinase K) fait perdre totalement
l’activité biologique. Cette constatation implique que la biomolécule en question est de nature
protéique.
Par comparaison au témoin, nous avons constaté également que les activités biologiques
du surnageant de culture de la souche Lb. plantarum sp. TN635 sont insensibles à l’action de la
lipase et de l’α-amylase. Ce résultat implique que la (les) molécule(s) bioactive(s) en questions
ne contiennent pas des composés lipidiques et des carbohydrates (Aktypis et al., 1998).
Ces analyses nous permettent d’avancer que la ou les biomolécules secrétée(s) par la
souche Lb. plantarum sp. TN635 est une bactériocine du type I qu’on a nommée BacTN635.

IV. 2. Effet des surfactants et des solvants organiques

L’effet des surfactants suivants : le Tween 20, le Tween 80, l'urée, le Triton X-100, le
SDS, l’EDTA et le PMSF sur BacTN635 a été également analysé. Ces surfactants ont été ajoutés
au surnageant bioactif à une concentration finale de 1% (v/v) et incubées à 30°C pendant 2h.
L’analyse des activités biologiques résiduelles (par comparaison aux activités du surnageant sans
traitement « témoin positif »), sont ensuite déterminées tout en réalisant des témoins de contrôles.
Les résultats obtenus montrent qu’il y a une diminution de l’activité biologique de l’ordre de 15%
en présence de l’agent SDS. Les autres surfactants affectent négativement BacTN635 à un taux
d’environ 40%. Ces mesures sont éffectuées par rapport des diamétres d’inhibitions.

164
 Résultats et discussion

Concernant les solvants organiques (l’acétate d'éthyle, l'isopropanol et le méthanol) testés

à une concentration finale de 50% (v/v), nous n’avons pas remarqué d’effet négatif sur l’activité
biologique de BacTN635.

IV. 3. Effet de la température

Nous avons testé l’effet de différents traitements de températures (45, 70, 85 et 100°C
durant 90 min et 2 h et à l'autoclave (20 min à 121°C) du surnageant de culture de la souche Lb.
plantarum sp. TN635 (contenant BacTN635). Comme le montre le tableau 34, pour un traitement
de 100°C pendant 90 min, BacTN635 garde presque 80% de ses capacités inhibitrices contre les
cellules indicatrices testées. Après un traitement à 100°C pendant 2h, l’activité biologique
résiduelle de BacTN635 est d’environ 50%. Cette activité est totalement perdue par autoclavage
(20 min à 121°C).

Tableau 34: Effet de la température sur l'activité inhibitrice de BacTN635 contre les cellules indicatrices
testées : Listeria ivanovii BUG 496, Salmonella enterica, Fusarium sp et Candida tropicalis R2.

Activités inhibitrices (mm)

Traitement Listeria ivanovii Salmonella enterica Fusarium sp. Candida tropicalis R2
BUG 496 ATCC43972
Témoin 22 21 23 21
45°C à 90 min 22 21 23 21
70°C à 90 min 20 20 19 18
85°C à 90 min 20 19 19 17
100°C à 90min 18 18 17 17
45°C à 120 min 22 21 23 21
70°C à 120 min 20 20 19 18
85°C à 120 min 16 15 15 17
100°C à 120min 12 10 10 11
121°C à 20min - - - -

165
 Résultats et discussion

IV. 4. Effet du pH
Afin de déterminer la sensibilité de BacTN635 aux pH, le surnageant de la culture de la
souche TN635 (30°C, 16 h d'incubation) est ajustée à différents pH allant de 1 à 14 (intervalle de
1,0). Les activités antimicrobiennes sont ensuite effectuées sur les différents échantillons traités.
D’après le tableau 35, nous pouvons déduire que BacTN635 présente une activité dans une large
gamme de pH comprise entre 3 et 11 avec un optimum de 7. Approximativement, une activité
résiduelle de 50% est maintenue à pH 12. Cette activité est totalement détruite à des pH 1, 2, 13
et 14.

Tableau 35: Effet du pH sur l'activité BacTN35 contre les cellules indicatrices testées : Listeria ivanovii
BUG 496, Salmonella enterica, Fusarium. sp et Candida tropicalis R2.

Activités inhibitrices (mm)

pH Listeria ivanovii Salmonella enterica Fusarium. sp Candida tropicalis R2
BUG 496 ATCC43972
Témoin 22 21 23 21
1 - - - -
2 - - - -
3 10 8 9 10
4 16 11 13 15
5 18 20 18 18
6 22 20 20 21
7 22 21 23 21
8 20 19 20 20
9 16 12 14 15
10 15 12 10 12
11 12 11 9 10
12 10 9 - 9
13 - - - -
14 - - - -

166
 Résultats et discussion

V. Purification de BacTN635
Pour la purification de BacTN635 à partir de la souche Lactobacillus plantarum sp.
TN635, nous avons utilisé une culture de 900 ml. Après 16h d’incubation à 30°C et sans
agitation, nous avons appliqué, sur le surnageant obtenu, quatre étapes de purification différentes
qui sont :

* Précipitation fractionnée par le sulfate d’ammonium : Suite aux tests antimicrobiens, le

maximum d’activité a été obtenu entre des concentrations de 60 et 80% de sulfate d’ammonium.

* Purification sur membrane cutoff (10 kDa) : Le précipité récupéré par la première étape
de purification a été resuspendu dans le tampon phosphate 0,1 M et passé à travers des
microconcentrateurs centrifuges (Amicon, Inc), avec une membrane de coupure de 10-kDa.

* Gel filtration sur colonne de Séphadex G-25 : La solution non retenue résultante de la
deuxième étape de purification, a été passée sur une colonne de gel filtration Sephadex G-25.
Cent quarante fractions (F1-F140) ont été collectées. Comme le montre la figure 46, ces 140
fractions détectées au moyen de mesures d'absorbance à 280 nm ont été regroupées en six
échantillons (S1-S6): S1 (F1-F40), S2 (F41-F70), S3 (F71-F76), S4 (F77-F81), S5 (F82-F93) et
S6 (F94-F140). L'activité antimicrobienne des différentes fractions recueillies a été testée contre
Listeria ivanovii BUG 496, Salmonella enterica ATCC43972 et contre Candida tropicalis R2
CIP203. Seul l’échantillon S5 (F82-F93), présente une activité inhibitrice contre les trois
souches indicatrices testées.

S5
3.5

2.5

DO
OD 280nm

2
280nm
1.5

0.5

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150

Nombre de fraction
Fraction number

Figure 46. Fractions obtenues suite à la purification de BacTN635 par filtration sur gel G-25.

167
 Résultats et discussion

* Chromatographie liquide à haute performance (HPLC) : L’échantillon S5 biologiquement

actif a été soumis à une quatrième étape de purification HPLC en phase inverse en utilisant une
colonne C18. Comme l’illustre la figure 47, trois pics bien définis (P1-P3) ont été obtenus ayant
respectivement les temps de rétention suivants: P1: 34.55 min, P2: 38.38 min et P3: 39.31 min.
Seule la fraction du pic P3 possède une activité antimicrobienne contre les trois microorganismes
testés et aucune activité n'a été observée pour les deux autres fractions correspondantes aux pics
P1 et P2

Absorbance (280nm)
xE+3
1.0

P3 39.317

0.5
mAU

38.383

P2

P1
34.550
18.500

31.133

0.0

0 10 20 30 40 50 60 70
Time (min)
Temps de rétention (min)

Figure 47. Profil d’élution de BacTN635 par HPLC (quatrième étape de purification)

Sur le tableau 36, nous résumons toutes les données relatives aux différentes étapes de
purifications à savoir : La teneur en protéines, l’activité totale, l’activité spécifique, le rendement
et le facteur de purification.

168
 Résultats et discussion

Tableau 36. Bilan de purification de la bactériocine BacTN635.

Etape de Volume Protéine Activité Activité Rendement Facteur de

purification (ml) totale totale spécifique (%) purification
(mg) (UA) (UA/mg)
5
Surnageant 900 2160 45. 10 2083 100 1
brut
Précipitation 50 52,5 5,2. 105 9904 11,55 4,75
par Sulfate
d’Ammonium
AMICON 32 23,2 3,32. 105 14310 7,38 6,87
Gel de 3,5 1,54 2,25. 105 146104 5 70,14
filtration
HPLC 0,7 0,57 1,125. 105 197368 2,5 94,75

Les résultats présentés sur le tableau 36, montre que les différentes étapes de purification
adoptées ont permis l’obtention de la BacTN635 avec un degré de pureté d’environ 95 fois que
celle existante dans le surnageant brut. Le rendement de purification est de 2,5%. L’activité
spécifique de BacTN635 purifiée est de l’ordre de 197368 UA/mg de protéines.

VI. Détermination de la masse de BacTN635

Dans une première étape nous avons essayé d’estimer la masse moléculaire de BacTN635
purifiée par SDS-PAGE. Après migration, le gel a été coupé en deux parties. La partie contenant
l'échantillon et le marqueur de protéine a été traitée par une solution de bleu brillant Coomassie
R-250 (Biorad) à 0,25%. La deuxième partie qui contient uniquement l'échantillon, a été lavée
avec une solution à 10 mmol/l de tampon phosphate (pH 7,0) pendant 4 h, puis fixée et utilisée
pour la détection directe de l'activité antimicrobienne contre la cellule indicatrice Listeria
ivanovii BUG 496.

169
 Résultats et discussion

Comme le montre la figure 48a, une seule bande a été révélée avec une masse moléculaire
d’environ 4 kDa. Ce résultat implique que BacTN635 a été purifiée à homogénéité. De plus, le
test antimicrobien contre la cellule indicatrice utilisée, Listeria ivanovii BUG 496, montre une
zone d’inhibition de croissance (figure 48b) au même niveau que la bande détectée

MM
1 2 1
(kDa)
55.6
42.7
34.6
27.0
20.0
14.3
6.5
3.4

a b

Figure 48. Electrophorèse et zymogramme de Bac TN635. a : gel SDS-PAGE. Colonne 1: marqueur de

taille ; colonne 2: BacTN635 ; b : zymogramme contre L. ivaonvii BUG 496

Afin de déterminer la masse moléculaire exacte de BacTN635, nous avons utilisée la

technique de spectrométrie de masse (MALDI-TOF). La matrice utilisée est l’acide α-cyano-
hydroxycinnamique préparé à 5 mg/ml dans 50% acétonitrile contenant 0,1% l’acide
trifluoroacétique. La masse exacte de BacTN635 est de 3847 Da (figure 49).

170
 Résultats et discussion

Figure 49 : Spectre de masse de BacTN635

Au cours des dernières années, plusieurs bactériocines ont été décrites à partir de bactéries
Lactobacillus. Cependant, la plus part de ces bactériocines présentent des activités inhibitrices
dirigées uniquement contre les bactéries à Gram+. Les bactériocines ayant des activités contre les
bactéries à Gram- et les champignons sont très rares. Ce genre de bactériocines sont généralement
des dérivés de dicétopipérazines à faible masse moléculaire inférieure à 1 kDa (Lavermicocca et
al., 2000). De rares bactériocines sont décrites à partir de Lactobacillus ayant une masse
moléculaire supérieure à 1 kDa et ayant une activité antifongique. Dans ce cas, nous pouvons
mentionner la bactériocine de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei M3 avec une masse
moléculaire de 43 kDa (Atanassova et al., 2003) et pentocine TV35b produite par Lactobacillus
pentosus, dont la masse moléculaire est de 3930 Da (Okkers et al., 1999).

171
 Résultats et discussion

Toutes ces données suggèrent fortement que BacTN635 produite par la nouvelle
Lactobacillus plantarum isolées sp. TN635 est une nouvelle bactériocine originale ayant un
spectre d’action très large contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et contre les champignons
filamenteux et unicellulaires.

VII. Mode d’action de BacTN635

Pour la détermination du mode d’action de la bactériocine BacTN635, nous avons utilisé
deux microorganismes indicateurs: Listeria ivanovii BUG 496 (action antibactérienne) et
Candida tropicalis R2 CIP203 (action antifongique). La bactériocine de la souche TN635
partiellement purifiée à 400 UA/ml (après la troisième étape de purification sur gel de Sephadex
G-25), a été ajoutée à 200 ml d’une culture de Listeria ivanovii BUG 496 (en milieu LB) et 200
ml d’une culture du champignon unicellulaire Candida tropicalis R2 CIP203 (en milieu YP10) en
début de la phase exponentielle de croissance à raison de 107 UFC (Unité Formant Colonies) /ml.
Les variations de la turbidité des cultures ont été enregistrées à une DO à 600nm et le nombre
d’UFC a été déterminé pour chaque culture.

Nous avons constaté que l’ajout de BacTN635, engendre une diminution rapide du
nombre de cellules viables de Listeria ivanovii BUG 496. En effet, on passe de 107 UFC / ml à
moins de 10 UFC/ml) pour une période de 5h (figure 50). De plus, dès l’ajout de BacTN635, la
densité optique de la culture de Listeria ivanovii BUG 496 a resté constante (figure 50).
Ces données indiquent que BacTN635 a un effet bactéricide contre Listeria ivanovii BUG
496.
Concernant le mode d’action de BacTN635 contre Candida tropicalis R2 CIP203, et
comme le montre la figure 51, nous constatons que la densité optique de la culture de ce
champignon est très similaire à celle du témoin (sans ajout de BacTN635). Cependant, nous
remarquons qu’à partir de 20h de croissance, une augmentation de cellules viables en absence de
BacTN635 (figure 51). Ces données indiquent que BacTN635 a un effet fongistatique contre
Candida tropicalis R2 CIP203.

172
 Résultats et discussion

Addition de BacTN635
10
1,4
9
8 1,2
(CF U m l -1 )

7
1
6

600n m
0,8
5

OD
4 0,6
10
L og

3
0,4
2
0,2
1
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Temps d’incubation
Incubation time (h)

Figure 50 : Effet de BacTN635 sur la croissance de L. ivanovii BUG 496 : Densité optique à 600 nm en
absence (♦) et en présence (▲) de BacTN635. CFU/ml en absence () et en presence (■) de BacTN635.

9,5 5
4,5
9
4
Addition de BacTN635
Log 10 (CFU m l -1 )

8,5 3,5

600n m
3
8
2,5
7,5
OD
2
7 1,5
1
6,5
0,5
6 0
0 4 8 10 12 16 20 24 28 32 36 40 44
Temps d’incubation
Incubation (h) (h)
time

Figure 51 : Effet de BacTN635 sur la croissance de Candida tropicalis R2 CIP203: Densité optique à
600 nm en absence (♦) et en présence (▲) de BacTN635. CFU/ml en absence () et en presence (■) de
BacTN635.

173
 Résultats et discussion

Conclusion

Dans la troisième partie des travaux de recherche de cette présente thèse, notre intérêt a
été porté vers les biomolécules de nature bactériocine à partir de bactéries lactiques. Il est à noter
que durant des travaux antérieurs réalisés au LMB-CBS, une collection de cinquante quatre
bactéries lactiques (TN600-TN653) a été construite. Ces bactéries ont été isolées à partir de
plusieurs origines (viande, fruits, végétaux et produits laitiers).

Dans une première étape, nous avons testé ces bactéries pour leur capacité de produire des
biomolécules (bactériocines) tout en utilisant différentes cellules indicatrices. Cette étude a
permis la présélection de neuf isolats (TN600, TN606, TN615, TN618, TN623, TN627, TN635,
TN644 et TN653). Ces derniers ont été ensuite testés une deuxième fois tout en utilisant d’autres
cellules indicatrices (bactéries à Gram+ et à Gram- et des champignons). L’isolat TN635 a été
retenu pour ses activités biologiques importantes contre toutes les cellules indicatrices testées.

Pour l’identification de l’isolat TN635, nous avons appliqué la technique d’analyse de la

séquence nucléotidique du gène ARN 16S. Tenons compte de cette analyse ainsi que de l’arbre
phylogénique correspondante, nous avons constaté que notre souche est une nouvelle bactérie du
genre lactobacillus et nous avons proposé sa désignation comme étant Lactobacillus plantarum
sp. TN635.

L’étude de la cinétique de production des biomolécules par la souche Lactobacillus

plantarum sp. TN635 a montré une activité optimale pour un temps d’incubation de 16 h à 30°C.
L’activité reste stable entre 13 et 20 h, puis elle diminue progressivement. L’analyse des effets de
la catalase, des enzymes protéolytiques, de lipase et d’α-amylase sur l’activité biologique du
surnageant de la culture de la souche étudiée, nous a permis de déduire qu’il s’agit d’une
biomolécule de nature protéique, vraisemblablement une bactériocine de classe I qu’on a désigné
BacTN635. Cette biomolécule garde presque 80 % de ses capacités inhibitrices après un
traitement de 90 min à 100°C. BacTN635 présente une activité dans une large gamme de pH
large comprise entre 3 et 11 avec un optimum de 7.

Pour la purification de BacTN635 à partir de la souche Lactobacillus plantarum sp.

TN635, nous avons utilisé quatre étapes de purification différentes qui sont : une précipitation

174
 Résultats et discussion

fractionnée par le sulfate d’ammonium à 80 %, une purification sur membrane cutoff (10 kDa),
un passage à travers le Gel filtration sur colonne de Séphadex G-25 et la quatrième étape une
Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC). Ces différentes étapes de purification
ont permis l’obtention de la BacTN635 avec un degré de pureté d’environ 95 fois que celle
existante dans le surnageant brut. Le rendement de purification est de 2,5 %. L’activité spécifique
de BacTN635 purifiée est de l’ordre de 197368 UA/mg de protéines. La masse de BacTN635
pure a été estimée par SDS-PAGE à environ 4 kDa. La masse exacte déterminée par
spectroscopie de masse est de 3847 Da.

Les études de mode d’action de BacTN635, ont montré que BacTN635 a un effet
bactéricide contre Listeria ivanovii BUG 496 et fongistatique contre Candida tropicalis R2
CIP203.
Les données obtenus à ce niveau de travail, suggèrent fortement que BacTN635, produite
par la nouvelle Lactobacillus plantarum sp.TN635, est une nouvelle bactériocine originale ayant
un spectre d’action très large contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et contre les champignons
filamenteux et unicellulaires (Fusarium sp. et Candida tropicalis R2) .

175
 Résultats et discussion

Le travail de recherche relatif à la souche Lactobacillus plantarum sp. TN635 et la

bactériocine bacTN635, a fait l’objet d’un article publié dans le Journal à Comité de Lecture
Internationale Applied Biochemistry and Biotechnology.

176
 Conclusion générale

CONCLUSION GENERALE

Dans ce présent travail de thèse, qui entre dans le cadre de l’axe de recherche métabolites
secondaires biologiquement actifs du Laboratoire de Microorganismes et de Biomolécules
(LMB) du Centre de Biotechnologie de Sfax (CBS), nous nous sommes intéressés aux aspects
microbiologiques, taxonomiques, biochimiques et spectroscopiques des activités
antimicrobiennes de nouvelles souches bactériennes. Trois parties ont été développées :

* Les travaux de recherche de la première partie ont été orientés vers la classification des
deux actinomycètes TN17 et Fr10, isolés et sélectionnés lors de travaux antérieurs pour leur
capacité de produire des activités antimicrobiennes (antibactériennes et antifongiques). Pour se
faire, nous avons développé plusieurs études qui sont :
- Des études morphologiques utilisant dix milieux de culture solides. Les résultats obtenus
laissent penser fortement que les deux souches étudiées sont des actinomycètes du genre
Streptomyces.
- Des études chimiotaxonomiques qui se basent sur l’analyse des constituants de la paroi.
Durant ces analyses nous nous sommes intéressés d’une part à l’analyse des acides aminés et des
sucres pariétaux, et d’autre part à l’analyse des lipides membranaires à savoir les phospholipides
et les acides gras. Nous avons constaté que la paroi des deux souches TN17 et Fr10 contient
l’isomère LL de l’acide diaminopimélique et la glycine. Ces résultats indiquent que la paroi de
nos deux souches est du type I. Ce dernier est caractéristique des bactéries du genre Streptomyces.
Egalement, nous avons démontré la présence de la phosphatidyléthanolamine (PE) et l’absence de
phosphatidylcholine (PC) dans les parois cellulaires des deux isolats (TN17 et Fr10). Ce résultat
nous a permis de déduire que nos deux souches sont des actinomycètes du type II. De plus, et suite
aux analyses des acides gras pariétaux, nous avons remarqué que les parois des souches TN17 et
Fr10 sont du type iso et ante-iso caractéristique de la plupart des actinomycètes.

- Des études phylogéniques qui se basent sur les analyses des séquences nucléotidiques
des gènes ARN16S. Par le bais de programmes spéciaux, nous avons élaboré les arbres

178
 Conclusion générale

phylogéniques des deux souches TN17 et Fr10. D’après les résultats obtenus, nous constatons
que les souches les plus apparentées à la souche TN17 sont: Streptomyces lavendofolia AB
184217, Streptomyces gobitricini AB 184666 et Streptomyces lilaceus AB 184457. Pour la
souche Fr10, les souches les plus apparentées sont : Streptomyces microflavus HBUM 174043 et
Streptomyces griseorubiginosus.
- Des études physiologiques qui s’intéressent à la capacité des isolats à hydrolyser les
bases puriques et leurs dérivés, à dégrader les glucides, les acides aminés, les surfactants et les
sels de sodium, à réduire les nitrates, à produire des pigments mélanoides, à tolérer différentes
températures, différents pH, le lysozyme, le phénol, l’azide de sodium, le chlorure de sodium et
les antibiotiques. Ces études ont permis de renforcer de plus en plus que les deux isolats TN17 et
Fr10 sont des actinomycètes du genre Streptomyces et que ces deux bactéries sont des nouvelles
espèces de Streptomyces.
En tenant compte de toutes les analyses morphologiques, chimiotaxonomiques,
phylogéniques et physiologiques, nous confirmons bien que nos deux souches TN17 et Fr10 sont
deux nouvelles espèces du genre Streptomyces, et nous leurs proposons les nomenclatures
suivantes : Streptomyces lilaceus sp. TN 17 et Streptomyces microflavus sp. Fr10.
En perspectives pour cette première partie de travaux de thèse, nous projetons de
compléter les différentes analyses citées ci-dessus, par des études moléculaires qui consistent à
comparer le degré d’hybridation des ADN totaux des souches Streptomyces lilaceus sp. TN 17 et
Streptomyces microflavus sp. Fr10, avec les ADN totaux des souches les plus apparentées.

* Concernant les travaux de recherche relatifs à la deuxième partie de la présente thèse,

les études réalisées ainsi que les résultats obtenus peuvent être résumés comme suit :
- Optimisation des conditions de production des biomolécules de la souche de
Streptomyces lilaceus sp. TN17. Les conditions de cultures retenues sont : milieu TSB à 30 g/l
additionné de glucose à 1 % w/v et de K2HPO4 à une concentration de « 1 mM ». La température
d’incubation est de 30°C avec une agitation de 250 rpm. En utilisant ces conditions nous avons
préparé une culture de 30 litres.
- Après une double extraction du surnageant par l’acétate d’éthyle, l’extrait sec actif obtenu
a été soumis à plusieurs étapes chromatographiques (Sephadex LH-20, Chromatographie sur
couche épaisse et Chromatographie en phase liquide à haute performance). Trois molécules pures

179
 Conclusion générale

biologiquement actives (M1, M2 et M3) ont été obtenues et les structures chimiques
correspondantes ont été caractérisées par le biais de plusieurs techniques spectroscopiques. Il
s’agit de : M1 (Masse moléculaire = 269 g/mol) c’est un dérivé de DKP (L-Leu, L-Arg). Cette
molécule possède des activités antibactériennes contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et
antifongiques. M2 (Masse moélculaire = 390 g/mol), c’est un dérivé de phtalate le di-(2-
éthylhexyl) phtalate. Cette molécule possède des activités antibactériennes contre les Gram+ et des
activités antifongiques. M3 (masse moléculaire = 488 g/mol), c’est un tétrapeptide cyclique, le 1 -
[2 -(cyclopentanecarbonyl-3-phenylpropionyl] - pyrrolidine-2-carboxylique (1-carbamoyl-propyl)-
amide. Cette molécule possède des activités antibactériennes contre les Gram+ et des activités
antifongiques.

- Nous avons également préparé une culture de 35 litres à partir de la deuxième souche
étudiée, la souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10. Après une double extraction par l’acétate
d’éthyle du surnageant correspondant, l’extrait sec actif a été soumis à deux étapes de
purification : Une chromatographie sur couche épaisse suivie par une chromatographie en phase
liquide à haute performance (HPLC). Six molécules bioactives ont été obtenues (M1-M6). Les
masses moléculaires de ces dernières, déterminées par spectroscopie de masse, sont : M1 = 413 ;
M2 = 300 ; M3 = 279 ; M4 = 194 ; M5 = 239 et M6 = 290 g/mol.

En perspectives à cette deuxième partie de travail de thèse, nous comptons caractériser, par
applications de différentes techniques spectroscopiques, la structure chimique complète de
chacune des six biomolécules pures secrétées par la souche de Streptomyces microflavus sp. De
plus, et vue l’importance des activités biologiques sécrétées par les deux souches étudiées, et
notamment les activités antifongiques, une des perspectives la plus immédiate est l’essai in vivo de
ces biomolécules contre quelques phytopathogènes qui causent des dégâts dans le domaine
agronomique.

* Dans la troisième partie des travaux de recherche de cette présente thèse, notre intérêt
s’est porté vers des biomolécules de nature bactériocine produite par des bactéries lactiques. Il est
à noter que durant des travaux antérieurs réalisés au LMB-CBS, une collection de cinquante quatre
bactéries lactiques (TN600-TN653) a été construite. Ces bactéries ont été isolées à partir de
plusieurs origines (viande, fruits, végétaux et produits laitiers). Les travaux réalisés sont :

180
 Conclusion générale

- Nous avons testé ces bactéries pour leur capacité à produire des biomolécules
(bactériocines) actives contre différentes souches indicatrices. Cette étude a permis la présélection
de neuf isolats (TN600, TN606, TN615, TN618, TN623, TN627, TN635, TN644 and TN653). Ces
derniers ont été ensuite testés une deuxième fois en élargissant leur spectre d’action avec d’autres
souches indicatrices (bactéries à Gram+ et à Gram- et des champignons). L’isolat TN635 a été
retenu pour ses activités biologiques importantes contre toutes les souches indicatrices testées.

- Pour l’identification de l’isolat TN635, nous avons appliqué la technique d’analyse de la

séquence nucléotidique du gène codant pour l’ARN 16S. Tenons compte de cette analyse ainsi
que de l’arbre phylogénique correspondant, nous avons constaté que notre souche est une
nouvelle bactérie du genre lactobacillus et nous avons proposé sa désignation comme étant
Lactobacillus plantarum sp. TN635. L’étude de la cinétique de production des biomolécules par
la souche Lactobacillus plantarum sp. TN635 a montré une activité optimale pour un temps
d’incubation de 16 h à 30°C. L’activité reste stable entre 13 et 20 h, puis elle diminue
progressivement. L’analyse des effets de la catalase, des enzymes protéolytiques, de la lipase et
de l’α-amylase sur l’activité biologique provenant du surnageant de culture de la souche étudiée
nous a permis de déduire qu’il s’agit d’une biomolécule de nature protéique, vraisemblablement
une bactériocine du type I désignée BacTN635. Cette biomolécule garde presque 80% de ses
capacités inhibitrices après un traitement de 90 min à 100°C. BacTN635 présente une activité à
une large gamme de pH compris entre 3 et 11 avec un optimum à pH 7.
- La purification de BacTN635 à partir de la souche Lactobacillus plantarum sp. TN635, a
été réalisée en quatre étapes: une précipitation fractionnée par l’ajout d’une solution saturée de
sulfate d’ammonium à 80%, une purification sur membrane de type Amicon de seuil de coupure
10 kDa, une filtration sur gel sur colonne Séphadex G-25 pour finir avec une Chromatographie
Liquide à Haute Performance (HPLC). Ces différentes étapes de purifications ont permis
l’obtention de la BacTN635 avec un degré de pureté d’environ 95 fois par rapport à sa forme
existant dans le surnageant brut. Le rendement de purification est de 2,5 %. L’activité spécifique
de BacTN635 purifiée est de l’ordre de 197368 UA/mg de protéines. La masse de BacTN635
pure a été estimée par SDS-PAGE à environ 4 kDa. La masse exacte déterminée par
spectroscopie de masse est de 3847 Da.

181
 Conclusion générale

- Les études de mode d’action de BacTN635 ont montré que BacTN635 a un effet
bactéricide contre Listeria ivanovii BUG 496 et fongistatique contre Candida tropicalis R2
CIP203.
En perspectives à ce travail, nous projetons la détermination de la séquence N-H2
terminale de BacTN635. Egalement, des essais de cette bactériocine dans le domaine agro-
alimentaire seraient très intéressants vu le spectre d’action très large de BacTN635 contre les
bactéries à Gram+ et à Gram- et contre les champignons filamenteux et unicellulaires.

182
 Références bibliographiques

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
A

Aasen I.M., Møretrø T., Katla T., Axelsson L. and Storrø I. (2000) Influence of complex
nutrients, temperature and pH on bacteriocin production by L. sakei CCUG 42687. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 53: 159-166.

Accoceberry I. and Noël T. (2006) Antifongiques : cibles cellulaires et mécanismes de

résistance. Thérapie 61 (3): 195-199.

Adinarayana K., Ellaiah P., Srinivasulu B., Bhavani Devi R. and Adinarayana G. (2003)
Response surface methodological approach to optimize the nutritional parameters for neomycin
production by Streptomyces marinensis under solid-state fermentation. Process Biochem. 38:
1565-1572.

Al-Bari, M.A.A., Abu Sayeed, M., Sazedur Rahman, M., and Ashik Mossadik. M. (2006)
Characterization and Antimicrobial Activities of a Phthalic Acid Derivative Produced by
Streptomyces bangladeshiensis A Novel Species Collected in Bangladesh. Research Journal of
Medicine and Medical Sciences, 1(2): 77-81

Aktypis, A., Kalantzopoulos, G., Huis IN’T Veld, J. H. J., and Ten Brink, B. (1998).
Purification and characterization of thermophilin T, a novel bacteriocin produced by
Streptococcus thermophilus ACA-DC 0040. Journal of Applied Microbiology, 84, 568–576.

Allgaier H., Jung G., Werner R. G., Schneider U. and Zahner H. (1986) Epidermin
Squencing of a heterodet tetracyclic 21- peptide amide antibiotic. Eur. J. Biochem. 160: 9-22.

Ammor S., Tauveron G., Dufour E. and Chevallier I. (2006) Antibacterial activity of lactic
acid bacteria against spoilage and pathogens bacteria isolated from the same meat small-scale
facility. Food Control 17: 454-468.

Amzelloug A. (1999) Des espoirs pour anéantir le bayoud. Ecologie. LE MATIN

181
 Références bibliographiques

Anastasiadou S., Papagianni M., Ambrosiadis I. and Koidis P. (2008) Rapid quantifiable
assessment of nutritional parameters influencing pediocin production by Pediococcus acidilactici
NRRL B5627. Bioresource Technol., 99(14): 6646-6650.

André J. M. and Leroy G. (2004) All-electrons band structure of polyene. Int. J. Quantum
Chem. 5 (5): 557-563.

Arous S., Dalet K. and Héchard Y. (2004) Involvement of the mpo operon in resistance to
class IIa bacteriocins in L. monocytogenes. FEMS Microbiol. Lett., 238: 37-41.

Asanza-Teruel M. L., Gontier E., Bienaime C., Nava-Saucedo J. E. and Barbotin J. N.

(1997) Response surface analysis of chlortetracycline and tetracycline production with K-
carrageenan immobilized Streptomyces aureofaciens. Enzyme Microb. Technol. 21: 314-320.

Athalye M., Goodfellow M., Lacey J. and White R.P. (1985) Numerical classification of
Actinomadura and Nocardiopsis. Int. J. Syst. Bacteriol. 35, 86-98.

Atanassova, V., Meindl, A., and Ring, C. (2001). Prevalence of Staphylococcus aureus and
staphylococcal enterotoxins in raw pork and uncooked smoked ham--a comparison of classical
culturing detection and RFLP-PCR. International Journal of Food Microbiology, 68:105– 113.

Atanassova M, Choiset Y, Dalgalarrondo M, Chobert JM, Dousset X, Ivanova I, Haertlé T.

(2003). Isolation and partial biochemical characterization of a proteinaceous anti-bacteria and
anti-yeast compound produced by Lactobacillus paracasei subsp. paracasei strain M3.
International Journal of Food Microbiology, 8, 63–73.

Augustine S.K., Bhavsar S.P. and Kapadnis B.P. (2005) Production of a growth dependent
metabolite active against dermatophytes by Streptomyces rochei AK 39. Indien J. Med. Res. 121:
164-170.

Avonts L. and De Vuyst L. (2001) Antimicrobial potential of probiotic lactic acid bacteria
Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol. Wet. 66: 543-50.

182
 Références bibliographiques

B
Baginski M., Sternal K., Czub J. and Borowski E. (2005) Molecular modelling of membrane
activity of amphotericin B, a polyene macrolide antifungal antibiotic. Acta Biochim. Polon.
52(3): 655–658.

Bangi A., Kundim Y., Youji I., Ryosuke F., Takashi I., Shigeru Y. and Makoto O. (2003)
New Haliangicin isomers, potent antifungal metabolites produced by a marine myxobacterium. J.
Antibiotics, 56 (7): 630-638.

Bauer R. and Dicks L.M.T. (2005) Mode of action of lipid II-targeting lantibiotics. Int. J. Food
Microbiol., 101 : 201-216.

Bellahcene M., Forats Z., Geiger J. P., Matallah A. and Henni D. (2000) La verticilliose de
l’olivier en Algérie: répartition géographique et importance de la maladie. Olivae. 82: 41–43.

Becker B., Lechevalier M.P., Gordon R.E. and Lechevalier H.A. (1964) Rapid differentiation
between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates. Appl.
Microbiol., 12, 421-423

Ben Ameur-Mehdi R., Mellouli L., Chabchoub F., Fotso S. and Bejar S. (2004) Purification
and Structure Elucidation of two Biologically Active Molecules from a new Isolated
Streptomyces sp. US24 strain Chemistry of Natural Compounds: 40 (5): 510-513.

Ben Ameur Mehdi R., Sioud S., Fourati Ben Fguira L., Bejar S. and Mellouli, L. (2006)
Purification and structure determination of four bioactive molecules from a newly isolated
Streptomyces sp. TN97 strain. Process Biochemistry. 41: 1506-1513.

Bentley S.D., Chater K.F., Cerdeño-Tárraga A.M., Challis G.L., Thomson N.R., James K.D.,
Harris D.E., Quail M.A., Kieser H., Harper D., Bateman A., Brown S., Chandra G., Chen
C.W., Collins M., Cronin A., Fraser A., Goble A., Hidalgo J., Hornsby T., Howarth S.,
Huang C.H., Kieser T., Larke L., Murphy L., Oliver K., O'Neil S., Rabbinowitsch E.,
Rajandream M.A., Rutherford K., Rutter S., Seeger K., Saunders D., Sharp S., Squares R.,

183
 Références bibliographiques

Squares S., Taylor K., Warren T., Wietzorrek A., Woodward J., Barrell B.G., Parkhill J. and
Hopwood D.A. (2002) Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces
coelicolor A3(2). Nature. 417 : 141-147.

Birnboim H. and Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for engineering of
coryneform bacteria. Trends Biotechnol. 3: 305-310.

Bouzid N. (2002) Fungal disease development and means of control Main fungal diseases of
food legumes in Tunisia. Collection M, Sciences de l’ingénieur. 22-30
Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.

Brennan M.R., Costello C.E., Maleknia S.D., Pettit G.R. and Erickson K.L. (2008)
Stylopeptide 2, a Proline-Rich Cyclodecapeptide from the Sponge Stylotella sp. J. Nat. Prod. 71
(3): 453-456.

Brötz H., Bierbaum G., Leopold K., Reynolds P.E. and Sahl H.G. (1998) The lantibiotic
mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II. Antimicrob Agents Chemother.
42(1):154-60.

Brul S. and Coote P. (1999) Preservative agents in foods: Mode of action and microbial
resistance mechanisms. Int. J. Food Microbiol. 50(1-2): 1-17.

Byun H.G., Zhang H., Mochizuki M., Adachi K., Shizuri Y., Lee W.J. and Kim S.K. (2003)
Novel antifungal diketopiperazine from marine fungus. J. Antibiot (Tokyo), 56:102-106.

Callewaert T. and De Vuyst L. (2000) Bacteriocin production with L. amylovorus DCE471 is

improved and stabilized by fed-batch fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 66(2): 606-613.

184
 Références bibliographiques

Castellano P., Vignolo G., Farías R.N., Arrondo J.L. and Chehín R. (2007) Molecular view
by Fourier transform infrared spectroscopy of the relationship between lactocin 705 and
membranes: speculations on antimicrobial mechanism. Appl. Environ. Microbiol., 73(2): 415-

420.

Caplice E. and Fitzgerald G. (1999) Food fermentations: role of microorganisms in food

production and preservation. Int. J. Food Microbiol. 50(1-2): 131-149.

Chargaff, E. and Vischer E. (1949) The composition of the desoxypentose nucleic acids of
thymus and spleen. J. Biol. Chem. 177:405–416.

Chen H. H., Qin S., Lee J. C., Kim C. J., Xu L. H., Li W.J. (2009) Streptomyces mayteni sp.
nov., a novel actinomycete isolated from a Chinese medicinal plant. Antonie Van Leeuwenhoek.
95(1):47-53.

Chen Y.S., Srionnual S., Onda T. and Yanagida F. (2007) Effects of prebiotic
oligosaccharides and trehalose on growth and production of bacteriocins by lactic acid bacteria.
Lett. Appl. Microbiol., 45: 190-193.

Chen Y., Ludescher R. D. and Montville T. J. (1997a) Electrostatic interactions but not the
YGNGV consensus motif, govern the binding of pediocin PA-1 and its fragments to
phospholipids vesicules. App. Environ. Microbiol. 63 : 4770-4777.

Cherif A., Rezgui W., Raddadi N., Daffonchio D. and Boudabous A. (2008) Characterization
and partial purification of entomocin 110, a newly identified bacteriocin from Bacillus
thuringiensis subsp. Entomocidus HD110 Microbiological Research, 163(6): 684-692.

Chiba H., Agematu H., Dobashi K. and Yoshioka T. (1999) Rhodopeptins, novel cyclic
tetrapeptides with antifungal activities from Rhodococcus sp. II. Structure elucidation. J.
antibiotics 52: 700.

Gladek A. and Zakrzewska J.(1984) Genome size of Streptomyces. FEMS Microbiol. Lett. 24:
73-76.

185
 Références bibliographiques

Cohn F. (1972) Genus Bacillus. In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Williams and
Wilkins, Baltimore. 1105-1139

Cotter P.D. and Hill C. (2003) Surviving the acid test: response of Gram-Positive bacteria to
low pH. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67(3): 429-453.

D
Dalet K., Briand C., Cenatiempo Y. and Héchard Y. (2000) The rpoN gene of Enterococcus
faecalis directs sensitivity to subclass IIa bacteriocins. Curr. Microbiol., 41(6): 441-443.

Damasko C., Konietzny A., Kaspor H., Appel B., Dersch P. and Strauch E. (2005) Studies of
the efficacy of enterocoliticin, a phage-tail like bacteriocin, as antimicrobial agent against Yersina
enterocolitica serotype O3 in a cell culture system and a mice. J. Vet. Med. B. 52: 171-179.

Dastager S. G., Li W. J., Agasar D., Sulochana M.B., Tang S. K., Tian X. P. and Zhi X.Y.
(2007) Streptomyces gulbargensis sp. nov., isolated from soil in Karnataka, India. Antonie van
Leeuwenhoek. 91:99–104.

Davies J. and Mazel D. (1997). Comment la résistance vient aux bactéries. Biofutur. 170: 14-17.

Deegan L.H., Cotter P.D., Hill C. and Ross P. (2006) Bacteriocins: biological tools for bio-
preservation and shelf-life extension. Int. Dairy J., 16: 1058-1071.

Delves-Broughton, I. (1990) Nisin and its uses as a food preservative. Food Technol. 44: 100.

De Vuyst L. and Vandamme E. J. (1993) Nisin, a lantibiotic produced by Lactococcus lactis

subspp. Lactis: properties, biosynthesis, fermentation and applications, in bacteriocins of Lactic

186
 Références bibliographiques

Acid Bacteria: Microbiology, Genetics and applications (De Vuyst, L and Vandamme, E. J.,
Eds): 151-221. London: Chapman et Hall.

De Vuyst L., Callewaert R. and Crabbé K. (1996) Primary metabolite kinetics of bacteriocin
biosynthesis by L. amylovorus and evidence for stimulation of bacteriocin production under
unfavourable growth conditions. Microbiology, 142: 817-827.

Diep D., Salehian Z., Holo H. and Nes I.F. (2007) Common mechanisms of target cell
recognition and immunity for class II bacteriocin. Proc. Natl Acad. Sci., 104: 2384-2389.

Dietz A. (1988) Practical and proposed cooperative investigational criteria for taxonomic studies
of Actinomycetales. In biology of Actinomycetes 88. Okami, Y., Beppu, T. And Ogawara, H.
(eds). Tokyo: Japan scientific societies press.

Drider D., Fimland G., Héchard Y., Mc Mullen L.M. and Prevost H. (2006) The continuing
story of class IIa bacteriocin. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70 (2): 564-582.

E
Eijsink V.G.H., Skeie M., Middelhoven P.H., Brurberg M.B. and Nes I.F. (1998)
Comparative studies of class IIa bacteriocins of lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol.
64(9): 3275-3281.

El Hadrami I., Bellaj M., Idrissi A., J’Aiti F., Jaafari S. and Daayf F. (1998) Biotechnologie
végétales et amelioration du palmier dattier (Phoenix dactilifera L.), pivot de l’agriculture
oasienne marocaine. Cahiers Agriculture. 7 (6): 463-468.

Elleuch L., Shaaban M., Smaoui S., Mellouli L., Karray-Rebai I., Fourati-Ben Fguira L.,
Shaaban, K.A. and Hartmut Laatsch. (2009) Bioactive Secondary Metabolites from a New
Terrestrial Streptomyces sp. TN262. Appl Biochem Biotechnol. DOI 10.1007/s12010-009-8808-4.

El-Naggar, M.Y.M. (1997) Dibutyl phthalte and the antitumor agent F5A1, two metabolites
produced by Streptomyces nasri submutant H35Biomed. Lett. 55, 125.

187
 Références bibliographiques

El-Ziney M.G., Uyttendaele M., Debevere J. and Jakobsen M. (1998) Characterization of

growth and metabolite production of Lb. reuteri during glucose/glycerol cofermentation in batch
and coutinuous cultures. Biotechnol. Lett. 20(10): 913-916.

Ennahar S., Sashihara T., Sonomoto K. and Ishizaki A. (2000) Class IIa bacteriocins:
biosynthesis, structure and activity. FEMS Microbiol. Rev., 24: 85-106.

Favret M.E. and Yousten A.A. (1989) Thuricin: The bacteriocin produced by Bacillus
thuringiensis. Journal of Invertebrate Pathology, 53 (2): 206-216.

Fdhila F., Vázquez V., Sánchez J.L. and Riguera R. (2003) dd-diketopiperazines: antibiotics
active against Vibrio anguillarum isolated from marine bacteria associated with cultures of
Pecten maximus. J. Nat. Prod, 66: 1299-1301.

Felsenstein, J. (1989). PHYLIP-phylogeny inference package, version 3.2. Cladistics, 5, 164–

166.

Fimland G., Johnsen L., Axelsson L., Brurberg M.B., Nes I.F., Eijsink [Link]. and Nissen-
Meyer J. (2000) A C-terminal disulfide bridge in pediocin-like bacteriocins renders bacteriocin
activity less temperature dependent and is a major determinant of the antimicrobial spectrum. J.
Bacteriol., 182: 2643-2648.

Fourati Ben Fguira L., Fotso S., Ben Ameur Mehdi R., Mellouli L. and Laatsch H. (2005)
Purification and Structure Elucidation of Antifungal and Antibacterial Activities from a Newly
Isolated Streptomyces sp. US80 strain. Research in Microbiology. 156 (3): 341-347.

Frank W. and Bibb M. J. (1992) Codan usage in the G+C-rich Streptomyces genome. Gene
113: 55-65.

188
 Références bibliographiques

Fudou R., Iiusika T. and Yamanaka S. (2001) Haliangicin, a novel antifungal metabolite
produced by a marine myxobacterium. Isolation and structure elucidation. J. Antibiotics ; 54:
153-156.

Fûrbass R., Gocht M., Zuber P. and Marahiel M.A. (1991) Interaction of AbrB, a
transcriptional regulator from Bacillus brevis, with promoters of the transition state-activated
genes tycA and spoVG. Mol. Gen. Genet, 225: 347-354.

G
Gahan C. and Hill C. (1999) The relationship between acid stress responses and virulence in
Salmonella Typhimurium and L. monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 50(1-2): 93-100.

Galverz A., Abriouel H., Lopez R. L. and Omar N.B. (2007) Bacteriocin- based strategies for
food bioservation. Int. J. Food Microbiol. 120 (1-2):51-70.

Gesheva V., Ivanova V. and Gesheva R. (2005) Effects of nutrients on the production of AK-
111-81 macrolide antibiotic by Streptomyces hygroscopicus. Microbiol. Res. 160: 243-248.

Ghalfi H., Allaoui A., Destain J., Benkerroum N. and Thonart P. (2006) Bacteriocin activity
by L. curvatus CWBI-B28 to inactivate Listeria monocytogenes in cold-smoked salmon during
4 degrees C storage. J. Food Protect. 69: 1066-1071.

Gillor O., Nigro L.M. and Riley M.A. (2005) Genetically bacteriocins and their potential as the
next generation of antimicrobials. Current Pharmaceutical Design, (11)

Goodfellow M. (1971) Numerical taxonomy of some nocardioform bacteria. J. Gen. Microbiol.,

69, 33-90.

Goldman B. S., Nierman W. C., Kaiser D., Slater S. C., Durkin A. S., Eisen J., Ronning C.
M., Barbazuk W. B., Blanchard M., Field C., Halling C., Hinkle G., Iartchuk O., Kim H. S.,

189
 Références bibliographiques

Mackenzie C., Madupu R., Miller N., Shvartsbeyn A., Sullivan S. A., Vaudin M., Wiegand
R., and Kaplan H. B. (2006) Evolution of sensory complexity recorded in a myxobacterial
genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:15200-15205.

Gordon R.E., Barnett D.A., Handarhan J.E. and Hor-Nay-Pang C. (1974) Nocardia
coeliaca, Nocardia autotrophica and the nocardin strains. Int. J. Syst. Bacteriol., 24, 54-63.

Grande M. J., Lopez R. L., Abriouel H., Valdivia E., Ben Omar N., Maqueda M., Martinez-
Canamero M. and Galvez A. (2007) Treatment of vegetable sauces with enterocin AS-48 alone
oa a combinaison with phenolic compounds to inhibit proliferation of Staphylococcus aureus. J.
Food Prot. 70: 405-11.

Gravesen A., Ramnath M., Rechinger K.B., Andersen N., Jänsch L., Héchard Y., Hastings
J.W. and Knøchel S. (2002) High-level resistance to class IIa bacteriocins is associated with one
general mechanism in L. monocytogenes. Microbiology, 148: 2361-2369.

Guinane C.M., Cotter P.D., Hill C. and Ross P. (2005) A review: microbial solutions to
microbial problems; lactococcal bacteriocins for the control of undesirable biota of food. J. Appl.
Microbiol., 98: 1316-1325.

Harlander S. K. (1993) Regulatory aspects of bacteriocin use. In: Hoover, D. G. and Steenson,
L. R., Editors, 1993. Bacteriocins of Lactic Acid Bcteria, Academic Press, New York, 233-236.

Héchard Y., Pelletier C., Cenatiempo Y. and Frère J. (2001) Analysis of sigma(54)-dependent
genes in Enterococcus faecalis: a mannose PTS permease (EII(Man)) is involved in sensitivity to
a bacteriocin, mesentericin Y105. Microbiology, 147: 1575-1580.

Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A., Staley J. T. and Williams S. T. (1994) Bergey’s
manual of determinative bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore.

190
 Références bibliographiques

Hopwood D.A., Bibb M. J., Chater K.F., Kieser T., Bruton C.J., Kieser H.M., Lydiate D.J.,
Smith C. P., Ward J.M. and Schremph H. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces: A
Laboratory Manual. Norwich, UK: John Innes Foundation.

Horton, D.A., Bourne, G.T., Coughlan, J., Kaiser, S.M., Jacobs, C.M., Jones, A., Ruhmann,
A., Turner, J.Y., and Smythe, M.L. (2008) Cyclic tetrapeptides via the ring contraction
strategy: chemical techniques useful for their identification. Org. Biomol. Chem. 6, 1386

Hsiao, C. and Siebert K. (1999) Modeling the inhibitory effects of organic acids on bacteria. Int.
J. Food Microbiol. 47(3): 189-201.

I
Ikeda H., Ishikawa J., Hanamoto A., Shinose M., Kikuchi H., Shiba T., Sakaki Y. Hattori
M. and Omura S. (2003) Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial
microorganism Streptomyces avermitilis. Nat Biotechnol. 21: 526-531.

Iwai Y., Awaya J., Kesado T., Yamada H., Omura S. and Hat T. (1973) Selective
fermentation of cerulenin by Cephalosporin caeruleus. J. Ferment. Technol. 51: 575-578.

J
Janssen G. R. and Bibb M. J. (1993) Derivatives of pUC18 that have BglII sites flanking a
modified multiple cloning site and that retain the ability to identify recombinant clones by
visual screening of [Link] colonies. Gene. 124: 133-134.

Janssen M., Geeraerd A.H., Cappuyns A., Garcia-Gonzalez L., Schockaert G., Houteghem
N.V., Vereecken K.M., Debevere J., Devlieghere F. and Impe, J. (2007) Individual and
combined effects of pH and lactic acid concentration on L. innocua inactivation: Development of
a predictive model and assessment of Experimental Variability. Appl. Environ. Microbiol. 73(5):
1601-1611.

191
 Références bibliographiques

Joullié M.M. and Nutt R.F. (1983) Cyclopeptides alkaloids in “Alkaloids, chemical and
biological perspectives”. S. W. Pelletier. J. Willey & Son, N.Y., 113-168.

Kishimoto K., Park Y.S., Okabe M. and Akiyama S. (1996) Effect of phosphate ion on
mildiomycin production by Streptoverticillium rimofaciens. J. Antibiotics. 49: 775-780.

Klaenhammer T.R. (1988) Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 70: 337-349.

Klaenhammer T.R. (1993) Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS
Microbiol. Rev. 12(1-3): 39-85.

Klein C., Kaletta C. and Etian K.D. (1993) Biosynthesis of the lantibiotic subtilin is regulated
by ahistidine kinase/responce regulator system. [Link]. Microbiol. 59:296–303.

Kluyver A. J. and Van Niel C. B. (1936) Prospects for a natural system of classification of
bacteria. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyb Abt II 94: 369–403.

Kobilinsky A., Nazer A.I. and Dubois-Brissonnet F. (2007) Modeling the inhibition of
Salmonella Typhimurium growth by combination of food antimicrobials. Int. J. Food Microbiol.
115: 95-109.

Kolsto A. B. (1997) Dynamic bacterial genome organization. Mol. Microbiol. 24: 241-248.

Kroppenstedt, R. M. (1985) Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related
organisms. In Chemical Methods in Bacterial Systematics, pp. 173–199. Edited by M.
Goodfellow & D. E. Minnikin. New York: Academic Press.

192
 Références bibliographiques

Kullisaar T., Zilmer M., Mikelsaar M., Vihalemm T., Annuk H., Kairane C. and Kilk, A.
(2002) Two antioxidative Lactobacilli strains as promising probiotics. Int. J. Food Microbiol.
72(3): 215-224.

Knopik-Skrocka A., Bielawski J., Glab M., Klafaczynska A. and Wulkiewicz M. (2003) A
kinetics study of pig erythrocyte hemolysis induced by polyene antibiotics. Cell. Mol. Biol. Lett.
8: 439-454.

Krätzschmar J., Krause M. and Marahiel M.A. (1989) Gramicidin S Biosynthesis Operon
Containing the Structural Genes grsA and grsB Has an Open Reading Frame Encoding a Protein
Homologous to Fatty Acid Tioesterases. J. Bacteriol, 171: 5422-5429.

Kutzner H. J. (1981) The family Streptomycetaceae. In the prokaryotes: a handbook on habitats,

isolation and identification of bacteria. Starr M.P., Stolp H., Truper H.G., Balows A., and Schegel
H. (eds). Berlin: Springler-Verlag KG,pp.

L
Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

Larpent J. P. and Sanglier J. J. (1989) La biotechnologie des antibiotiques. Masson, Paris.

Lavermicocca P, Valerio F, Evidente A, Lazzaroni S, Corsetti A and Gobbetti M. (2000)

Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough
Lactobacillus plantarum strain 21B. Applied and Environmental Microbiology, 66, 4084–4090.

Leal-Sánchez M.V., Jiménez-Díaz R., Maldonado-Barragán A., Garrido-Fernández A. and

Ruiz-Barba J.L. (2002) Optimization of bacteriocin production by batch fermentation of
L. plantarum LPCO10. Appl. Environ. Microbiol., 68 : 4465-4471.

193
 Références bibliographiques

Lebrihi, A., Errakhi, R., and Barakate, M. (2008) Patent deposed: INP / AGRONUTRITION,
FR08 54053.

Lechevalier H.A. and Lechevalier M.P. (1970a) A critical evaluation of genera of aerobic
actinomycetes. In: The Actinomycetales. Prauser H. (Eds.). G. Fisher Verlag, Jena, 393-405.

Lechevalier M.P. and Lechevalier H.A. (1970b) Composition of whole-cell hydrolysates as a

criterion in the classification of aerobic actinomycetes. In: The Actinomycetales. Prauser H.
(Eds.) G. Fisher Verlag, Jena, 311-316.

Lechevalier M.P., De bievre C. and Lechevalier H.A. (1977) Chemotaxonomy of aerobic

actinomycetes: phospholipid composition. Biochem. Syst. Ecol., 5, 249-260.

Lee, K. H.; Kim, J. H.; Lim, D. S.; Kim, C. H. (2000) Anti-leukaemic and antimutagenic
effectsof di ([Link]) phthalate isolated from aloe linne. J. Pharm. Pharmacol. 52, 593.

Leenhouts, K. J., Kok, J. and Venema, G. (1990) Stability of Integrated Plasmids in the
Chromosome of Lactococcus lactis. Applied and Environmental Microbiology, 56: 2726– 2735

Leblond P., Fischer G., Francou F.X., Berger F., Guerineau M. et Decaris B. (1996) The
unstable region of Streptomyces ambofaciens includes 210 kb terminal inverted repeats flanking
the extremities of the linear chromosomal DNA. Mol. Microbiol. 19: 261-27

Le Marrec C., Hyronimus B., Bressollier P., Verneuil B. and Urdaci, M.C. (2000)
Biochemical and genetic char- acterization of coagulin, a new antilisterial bacteriocin in the
pediocin family of bacteriocins, produced by Bacillus coagulans . [Link].66 :
5213–5220.

Le Minor L. and Veron M. (1989) Bacteriologie medicale. 2ème édition. Medecine. Sciences
Flammarion.

194
 Références bibliographiques

Leroy F., De Winter T., Adriany T., Neysens P. and De Vuyst L. (2006) Sugars relevant for
sourdough fermentation stimulate growth of and bacteriocin production by L. amylovorus DCE
471. Int. J. Food Microbiol., 12 : 102-111.

Liu, S. (2003) Practical implications of lactate and pyruvate metabolism by lactic acid bacteria in
food and beverage fermentations. Int. J. Food Microbiol. 83(2) : 115-131.

Luchansky J.B. and Call J.E. (2004) Evaluation of nisin-coated cellulose casings for the control
of L. monocytogenes inoculated onto the surface of commercially prepared frankfurters. J. Food
Prot., 67: 1017-1021.

Lúcia L.F., Farias F.F., Eustáquio C.J., Auxiliadora M., Carvalho R., Alviano C.S. and
Farias L.M. (2002) Bacteriocin production by Actinobacillus actinomycetemcomitans isolated
from the oral cavity of humans with periodontal disease, periodontally healthy subjects and
marmosets. Research in Microbiology 153: 45–52.

Lucietto F.R., Milne P.J., Kilian G., Frost C.L. and Van De Venter M. (2006) The biological
activity of the histidine-containing diketopiperazines cyclo(His-Ala) and cyclo(His-Gly).
Peptides, 27: 2706-2714.

Lv W., Zhang X. and Cong W. (2005) Modelling the production of nisin by Lactococcus lactis
in fed-batch culture. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 322-326.

Magyar, A., Zhang, X., Abdi, F., Kohn, H., and Widger, W. (1999) Identifying the
Bicyclomycin Binding Domain through Biochemical Analysis of Antibiotic-resistant Rho
Proteins J. Biol. Chem. 274, 7316.

195
 Références bibliographiques

Manandhar H.K., Lyngs Jørgensen H.J., Mathur S. B. and Smedegaard-Petersen V. (1998

a) Smedegaard-Petersen Suppression of Rice Blast by Preinoculation with Avirulent Pyricularia
oryzae and the Nonrice Pathogen Bipolaris sorokiniana. Plant Disease, 88: 735-739.

Manandhar H.K., Lyngs Jørgensen H.J., Smedegaard-Petersen V. and Mathur S.B. (1998
b) Seedborne Infection of Rice by Pyricularia oryzae and Its Transmission to Seedlings. Plant
Disease, 82: 1093-1099.

Maniatis T., Fritsch E. F. And Sambrouk J. (1982) Molecular cloning. Cold. Spring. Harbor.
Laboratory, New York.

Mann J. (2001) Natural products as immunosuppressive agents. Nat. Prod. Rep., 18: 417-430.

Marchal N. and Bourdon J.L. (1973) Milieux de culture et identification biochimique des
bactéries. Doin (Eds.), Paris.

Marmur J., (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms.
J. Mol. Microbiol. 3: 208-218.

Martirani L., Varcamonti M., Naclerio G. and De Felice M. (2002) Purification and partial
characterization of bacillocin 490, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of
Bacillus licheniformis. Microb Cell Fact. 18: 1(1):1.

Marmur, J. (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms.
J. Mol. Biol. 3: 208-218.

Matallah-Boutiba A., Nicole M., Fortas Z., Bellahcene M., Henni D. and Geiger J. P. (1997)
Defense responses of inoculated olive tree seedlings to Verticillium dahliae. In: 7th International
Verticillium Symposium. Athens (GR).

196
 Références bibliographiques

Mataragas M., Metaxopoulos J., Galiotou M. and Drosinos E.H. (2003) Influence of pH and
temperature on bacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides L124 and L. curvatus
L442. Meat Sci., 64: 265-271.

McCleland K., Milne P.J., Lucieto F.R., Frost C., Brauns S.C., Van De Venter M., Du
Plessis J. and Dyason K. (2004) An investigation into the biological activity of the selected
histidine-containing diketopiperazines cyclo (His-Phe) and cyclo (His-Tyr). J Pharm Pharmacol
56: 1143–1153

Mehling A., Whmeir Udo F. and Peipersberg W. (1995) Nucleotide sequence of Strptomycete
16S using PCR. Microbiology. 141:2139-2147.

Mellouli L., Ben Ameur-Mehdi R., Sioud S., Salem M. and Bejar S. (2003) Isolation,
purification and partial characterization of antibacterial activities produced by a new isolated
Streptomyces sp. US24 strain. Research in Microbiology 154: 345-352.

Mellouli L., Karray-Rebai .I, Sioud S., Ben Ameur-Mehdi R., Naili B, Bejar S. (2004)
Efficient transformation procedure of a newly isolated Streptomyces sp. TN58 strain producing
antibacterial activities. Current Microbiology 49(6) : 400-406.

Merino L. A., Hrenuk G. E., Alonso J. M and Ronconi M. C. (2000) Interêt de l’antibiotypie
et la bactériocinotypie pour différencier les souches de Shigella isolées en Argentine. Manuscrit
n° 2166 « Bactériologie ».

Messens W., Verluyten J., Leroy F. and De Vuyst L (2003) Modelling growth and bacteriocin
production by L. curvatus LTH1174 in response to temperature and pH values used for European
sausage fermentation processes. Int. J. Food Microbiol., 81 : 41-52

197
 Références bibliographiques

Miao L., Kwong T. F. N. and Qian P. Y. (2006) Effect of culture conditions on mycelial
growth, antibacterial activity, and metabolite profiles of the marine-derived fungus Arthrinium
c.f. saccharicola. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 1063-1073.

Minnikin D.E., Patel P.V., Alshamaony L. and Goodfellow M. (1977) Polar lipid composition
in the classification of Nocardia and related bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol., 27,104-107.

Minnikin D.E. & Goodfellow M., (1981) Lipids in the classification of actinomycetes. Zbl.
Bakteriol. Hyg. Suppl. 11: 99-109.

Molnar I. (1994) Secretory Production of Homologous Proteins by Recumbent Streptomyces:

What has been Accomplished? pp: 181-104 dans Recombinant Microbes For Industrial And
Agricultural Applications. Murooka Y. and Imanaka T. (éditeurs), Marcel Dekker INC.

Moretro T., Aasen I.M., Storro I. and Axelsson L. (2000) Production of sakacin P by L. sakei
in a completely defined medium. J. Appl. Microbiol., 88(3): 536-545.

Morgan S.M., O’connor P.M., Cotter P.D., Ross. P. and Hill C. (2005) Sequential actions of
the two component peptides of the lantibiotic lacticin 3147 explain its antimicrobial activity at
nanomolar concentration. Antimicrob. Agents Chemother., 49(7): 2606-2611.

Morita H., Shishido A., Matsumoto T., Itokawa H. and Takeya K. (1999)
Cyclolinopeptides B-E, new cyclic peptides from Linum usitatissinum.
Tetrahedron, 55: 967-976.

Murray R.G.E., Brenner D.J., Holt J.G., Krieg N.R., Mulder J.W., Pfenning N., Sneath
P.H., Stoley J.T. and Williams S.T., (1989) In “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology”.
Williams & Wilkins Eds. Vol. 4, pp: 2333-2648.

198
 Références bibliographiques

Nel H.A., Bauer R., Vandamme E.J. and Dicks L.M. (2001) Growth optimization of
Pediococcus damnosus NCFB1832 and the influence of pH and nutrients on the production of
pediocin PD-1. J. Appl. Microbiol., 91: 1131-1138.

Nigutova K., Morovsky M., Pristas P., Teather R.M., Holo, H. and Javorsky, P. (2007)
Production of enterolysin A by rumen Enterococcus faecalis strain and occurrence of enlA
homologues among ruminal Gram-positive cocci. J. Appl. Microbiol. 102(2): 563-569.

Nilanonta C., Isaka M., Kittakoop P., Saenboonrueng J., Rukachaisirikul V., Kongsaeree P.
and Thebtaranonth Y. (2003) New diketopiperazines from the entomopathogenic fungus
Verticillium hemipterigenum BCC 1449. J. Antibiot.. 56: 647-51.

O
Okada T., Tanaka K., Nakatani F., Sakimura R., Matsunobu T., Li X., Hanada
M.,Okumura Y.A. and Sakurai Y. (1973) Chemical studies on the mistletoe. II. Stucture of
vascumamide, a new cyclic peptide isolated from Viscum album var coloratum.
Bull. Chem. Soc. Jap, 46: 2190-2193.

Okada, T., Tanaka. K., Nakatani, F., Sakimura, R., Matsunobu, T., Li, X., Hanada, M.,
Nakamura, T., Oda, Y., Tsuneyoshi, M., and Iwamoto, Y. (2006) Involvement of P-
glycoprotein and MRP1 in resistance to cyclic tetrapeptide subfamily of histone deacetylase
inhibitors in the drug-resistant osteosarcoma and Ewing's sarcoma cells International journal of
Cancer. 118, 90.

Okami Y., Hamada M. and Ueda N. (1968) Proceed. of the first Intern. Conference on Culture
Collection (Iizuka H. & Hasegawa T. Ed.) pp: 457-475.

199
 Références bibliographiques

Okanish M., Suzuki K. and Umezawa H. (1974) Formation and reversion of Streptomycete
protoplasts: culture conditions and morphological study. J. Gen. Microbiol. 80: 389-400.

Okkers D.J., Dicks L.M.T., Silvester M., Joubert J.J. and Odendaal H.J. (1999)
Characterization of pentocin TV35b, a bacteriocin-like peptide isolated from Lactobacillus

pentosus with a fungistatic effect on Candida albicans. J. Applied Microbiology. 87(5):726-734.

Olano C., Rodriguez A. M., Michel J. M., Mendez C., Raynal C. and Salas J. A. (1998)
Analysis of a Streptomyces antibioticus chromosomal region involved in oleandomycin
biosynthesis, which encodes two glycosyltransferases responsible for glycosylation of
macrolactone ring. Mol. Gen. Genet. 259: 299-308.

Oppegard C., Rogne P., Emanuelsen L., Kristiansen P.E., Fimland G. and Nissen-Meyer J.
(2007) The two-peptide class II bacteriocins: structure, production and mode of action. J. Mol.
Microbiol. Biotechnol. 13(4): 210-219.

Ovchinnikov Y. A. and Ivanov V. T. (1975) Conformational states and biological activity of

cyclic peptides. Tetrahedron. 31: 2177-2209.

P
Paik H. D., Bae S. S., Park S. H and Pan J.G. (1997) Identification and partial characterization
of tochicin, a bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis subsp. Tochigiensis. J. Ind.
Microbiolo. Biot. 19: 294-298.

Papagiannin M. (2003) Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties:

biosynthesis, structure, function and applications. Biotechnol. Adv. 21(6): 465-499.

Parente E. and Ricciardi A. (1999) Production, recovery and purification of bacteriocins from
lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 52: 628-638.

200
 Références bibliographiques

Patton G.C. and Van Der Donk W.A. (2005) New developments in lantibiotic biosynthesis and
mode of action. Curr. Opin. Microbiol., 8: 543-551.

Pérez Guerra N., Bernárdez P.F., Agrasar A.T., López Macías C. and Castro L.P. (2005)
Fed-batch pediocin production by Pediococcus acidilactici NRRL B-5627 on whey. Biotechnol.
Appl. Biochem., 42: 17-23.

Petrosyan P., Garcia-Varela M., Luz-Madrigal A., Huitron C. and Flores M. E. (2003)
Streptomyces mexicanus sp. Nov., a xylanolytic microorganism isolated from soil. Inter. j. Syst.
Evol. Microbiol. 53: 269-273.

Pitt T. L. and Gaston A.M. (1995) Bacteriocin typing. Methods in molecular biology. Edited by
Haward, J. et Whitecombe, D.M. Edition: Human [Link]. Totowa, New Jersey (NJ). 46: 5-14.

Pongtharangkul T. and Demirci A. (2006) Evaluation of culture medium for nisin production
in a repeated-batch biofilm reactor. Biotechnol. Prog., 22: 217-224.

Potgieter M., Steyn P.S., Van Heerden F.R., Van Rooyen P.H. and Wessels, P.L. (1989)
Conformational analysis of the cyclic peptide rhizonin A in solution and crystalline state.
Tetrahedron, 45: 2337-2350.

Prasad C. (1995) Bioactive cyclic dipeptides. Peptides, 16:151–64.

R
Rayman M. K., Aris B. and Hurst A. (1981) Nisin: a possible alternative of adjunct to nitrite in
the preservation of meats. Appl. [Link]. 41: 375-380.

Rhee K.H., Choi K.H., Kim C.J. and Kim C.H. (2001) Identification of Streptomyces sp.
AMLK-335 producing antibiotic substance inhibitory to VRE (vancomycin-resistant
enterococci). J. Micribiol. Biotechnol, 11: 469–74.

201
 Références bibliographiques

Rhee K.H. (2002) Isolation and characterization of Streptomyces sp. KH-614 producing anti-
VRE (vancomycin-resistant enterococci) antibiotics. J. Gen. Appl. Microbiol, 48:321–7.

Rhee K.H. (2004) Cyclic dipeptides exhibit synergistic, broad spectrum antimicrobial effects and
have anti-mutagenic properties. Int. J. Antimicrob. Agents. 24: 423-427.

Richard C., Canon R., Naghmouchi K., Bertrand D., Prévost H. and Drider D. (2006)
Evidence on correlation between number of disulfide bridge and toxicity of class IIa bacteriocins.
Food Microbiol. 23(2): 175-183.

Riley M. A. and Wertz J. E. (2002) Bacteriocin diversity: ecological role of bacteriocins in

bacterial competition. Trends Microbiol. 7: 129-133.

Rodgers S. (2001) Preserving non-fermented refrigerated foods with microbial cultures: a

review. Trends Food Sci. Technol., 12: 276-284.

Roy, R.N., Laskar, S., Sen., S.K. (2006). Dibutyl phthalate, the bioactive compound produced

by Streptomyces albidoflavus 321.2. Microbiological Research 161, 121.

Ryan M.P., Meaney W.J., Ross R.P. and Hill C. (1998) Evaluation of laciticin 3147 and a teat
seal containing this bacteriocin for inhibition of mastitis pathogens. Appl. Environ Microbiol. 64:
2287-2290.

Saitou N. and Nei M. (1987) The neighbor-joining metod: a new method for reconstructing
phylognetic tres. Mol. Biol. Evol., 4, 406-425

Sakamoto M., Tano Y., Uchimura T. and Komagata K. (1998) Aerobic growth of some lactic
acid bacteria enabled by the external addition of peroxidase (horseradish) to the culture
medium. J Fermentation and Bioengineering 85(6): 627-629.

202
 Références bibliographiques

Sambrook J. E., Fritsh E. F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

Sasser M., (2001) Identification of bacteria by Gas Chromatography of cellular fatty acids.
Technical note 101. [Link].

Savijoki K., Ingmer H. and Varmanen P. (2006) Proteolytic systems of lactic acid bacteria.
Appl. Microbiol. Biotechnol., 71: 394-406.

Scannell A.G., Hill C., Ross R.P., Marx S., Hartmeier W. and Arendt E.K. (2000)
Continuous production of lacticin 3147 and nisin using cells immobilized in calcium alginate. J.
Appl. Microbiol., 89: 573-579.

Schleifer K.H. and Kandler (1972) Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their
taxonomic implications. Bacteriol. Rev., 36, 407-477.

Shin H.J., Matsuda, H., Murakami, M. and Yamaguchi, K. (1996) Agardhipeptins A and B,
two new cyclic hepta and octapeptide, from the cyanobacterium Oscillatoria agardhii (NIES-
204). Tetrahedron, 52: 13129-13136.
Shirling E.B. and Gottlieb D. (1966) Methods for characterization of Streptomyces species Int
J Syst Bacteriol 16: 313–340.

Sioud S, Karray-Rebai I, Aouissaoui H, Aigle B, Bejar S. and Mellouli L. (2007) Targeted

gene disruption of the Cyclo (L-Phe, L-Pro) biosynthetic pathway in Streptomyces sp. US 24
strain. Journal of Biomedicine and Biotechnology. ID : 91409 , doi : 10.1155/2007/91409.

Sierra G., (1957) A Simple method for the detection of lipolytic activity of microorganisms and
some observations on the influence of the contact between cells and fatty substrates. Antonie Van
Leeuwenhoek, 23, 15-22.

203
 Références bibliographiques

Sneath P.H.A. (1957) The application of computers to taxonomy. [Link]. Microbiol. 17: 201-
226.

Son B.W., Jensen P.R., Kauffman C.A. and Fenical W. (1999) New cytotoxic
epidithiodioxopiperazines related to verticillin A from a marine isolate of the fungus Penicillium.
Nat. Prod. Lett, 13: 213.

Stackebrandt E. and Goebel B.M. (1994) Taxonomic note: A place for DNA-DNA
reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology.
Int. J. Syst. Bacteriol., 44: 846-849.

Strus M., Gosiewski T., Kochan P. and Heczko P.B. (2006) The in vitro effect of hydrogen
peroxide on vaginal microbial communities. FEMS Immuno. Medical Microbiol. 48: 56- 63.

Sujatha P., Bapi-Raju K. V. V. S. N. and Ramana T. (2005) Studies on a new marine

streptomycete BT-408 producing polyketide antibiotic SBR-22 effective against methicillin
resistant Staphylococcus aureus. Microbiol. Res. 160: 119-126.

Suziki K., (1988) Cellular fatty acid analysis in actinomycetes taxonomy. In “Biology of
Actinomycetes” 88, ed. Okami, Y., Beppu, T. & Ogawara, H., Scientific Societies Press, Tokyo:
Japan, pp: 251-256.

T
Tagg, J.R. and McGiven, A.R. (1971) Appl. Microbiol. 21: 943.

Tanaka Y. and Omura S. (1993) Agroactive compounds of microbial origin. Annu. Rev.
Microbiol. 47: 57-87.

204
 Références bibliographiques

Thomson C.J., Power E., Ruebsamen-Waigmann H. and Labischinski H. (2004)

Antibacterial research and development in the 21st Century-an industry perspective of the
challenges. Curr. Opin. Microbiol. 7 (5): 445-50.

Todorov S.D. and Dicks L.M. (2004) Influence of growth conditions on the production of a
bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis ST34BR, a strain isolated from barley beer. J.
Basic Microbiol., 44: 305-316.

Twomey D., Ryan M., Meaney B. and Hill C. (2002) Lantibiotics produced by lactic acid
bacteria: structure, function and applications. Antonie van Leeuwenhoek, 82: 165-185.

Vadyvaloo V., Snoep J.L., Hasting J.W. et Rautenbach M. (2004) Physiological implications
of class IIa bacteriocin resistance in L. monocytogenes strains. Microbiology, 150: 335-340.

Vara J., Lewandowska-Skarbek M., Wang Y. G., Donadio S. and Hutchinson C.R. (1989)
Cloning of genes governing the deoxysugar portion of the erythromycin biosynthesis pathway in
Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus). J. Bacteriol. 171: 5872-5881.

Verluyten J., Leroy F. and De Vuyst L. (2004) Influence of complex nutrient source on growth
of and curvacin A production by sausage isolated L. curvatus LTH 1174. Appl. Environ.
Microbiol., 70, 5081-5088.

Viguié C (2000) Médecine thérapeutique. 3, (3), Thérapeutique.

Vollenweider S. (2004) 3-hydroxypropionaldehyde: applications and perspectives of

biotechnological production. Appl. Microbiol. Biotech. 64: 16-27.

205
 Références bibliographiques

W
Waksman S.A. and Henrici A.T. (1943) The nomenclature and classification of the
actinomycetes. J. Bacteriol. 46: 337-341.

Whyte A.C., Joshi B.K., Gloer J.B., Wicklow D.T. and Dowd P.F. (2000) New cyclic peptide
and bisindolyl benzoid metabolites from the Sclerotia of Aspergillus sclerotiorum. J. Nat. Prod.,
63: 1006-1009.

Wiedemann I., Böttiger T., Bonelli R.R., Wiese A., Hagge S.O., Gutsmann T., Seydel U.,
Deegan L., Hill C., Ross P. and Sahl H.G. (2006) The mode of action of the lantibiotic lacticin
3147 - a complex mechanism involving specific interaction of two peptides and the cell wall
precursor lipid II. Mol. Microbiol., 61(2): 285-296.

Willey J.M. and Van der Donk W.A. (2007) Lantibiotics: peptides of diverse structure and
function. Annu. Rev. Microbiol., 61: 477-501.

Williams D.E., Bombuwala K., Lobkovsky E., Dilip de Silva E., Karunaratne V., Allen
T.M., Clardy J. and Andersen R.J. (1998) Ambewelamides A and B, antineoplastic
epidithiapipera- zinediones isolated from the lichen Usnea sp. Tetrahedron Lett. 39: 9579–9582.

Y
Yilma S., Cannon-Sykora J., Samoylov A., Loc T., Liu N., Brinker C. J., Neely W. C. and
Vodyanoy V. (2007) Large-conductance cholesterol–amphotericin B channels in reconstituted
lipid bilayers. Biosensors Bioelectron. 22: 1359–1367.

Yu J., Liu Q., Liu Q., Liu X., Sun Q., Yan J., Qi X. and Fan S. (2008) Effect of liquid culture
requirements on antifungal antibiotic production by Streptomyces rimosus MY02. Bioresource
Technol. 99: 2087-2091.

206
 Références bibliographiques

Zalan Z., Barath A. and Halasz A. (2005) Influence of growth medium on hydrogen peroxide
and bacteriocin production of Lactobacillus strains. Food Technol. Biotech. 43(3): 219- 225.

207
 TABLE DE MATIERE

INTRODUCTION GENERALE......................................................................................................1

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................................4

A. LES ANTIBIOTIQUES ..............................................................................................................5

I. Classification et mode d’action des antibiotiques........................................................................5
I.1. Inhibiteurs de la synthèse du peptidoglycane ........................................................................5
I.2. Inhibiteurs de la synthèse protéique.......................................................................................6
I.3. Inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques et de leurs précurseurs...............................7
II. Les dicétopipérazines ..................................................................................................................8
II. 1. Définition et historique ........................................................................................................8
II. 2. Propriétés biologiques des DKP ..........................................................................................9
II.2.1. Intérêt thérapeutique .............................................................................................................. 9
II.2.2. Intérêt agronomique ............................................................................................................. 10
III. Les autres peptides cycliques ...................................................................................................11
B. LES ANTIFONGIQUES...........................................................................................................13
I. Les antifongiques luttant contre les mycoses..............................................................................14
II. Les antifongiques luttant contre les maladies cryptogamiques .................................................16
II. 1. Evolution générale d'une maladie cryptogamique.............................................................16
II. 1. 1. L’inoculation ..................................................................................................................... 16
II. 1. 2. La pénétration .................................................................................................................... 17
II. 1. 3. L’infection ......................................................................................................................... 17
II. 1. 4. La dissémination du pathogène........................................................................................... 17
II. 1. 5. La conservation du pathogène ............................................................................................ 17
II. 2. Exemples de maladies cryptogamiques .............................................................................18
II. 2. 1. La fusariose ...................................................................................................................... 18
II. 2. 2. La verticilliose ................................................................................................................... 18
C. LES STREPTOMYCES ............................................................................................................22
I. Caractéristiques générales...........................................................................................................22
I.1. Cycle de développement ......................................................................................................22
I.2. Importance Industrielle ........................................................................................................23
I.3. Le génome des Streptomyces ...............................................................................................23
II. Identification et classification des Actinomycètes « Streptomyces »........................................24
II. 1. Généralités .........................................................................................................................24
II.1.1. La Taxonomie phénétique .................................................................................................... 24
II.1.2. La Taxonomie numérique .................................................................................................... 24
 II.1.3. La Taxonomie phylogénétique ............................................................................................. 25
II. 2. Identification des actinomycètes « Streptomyces » ...........................................................26
III. Production de métabolites secondaires ....................................................................................29
III. 1. Effet de la composition du milieu de culture ...................................................................29
III. 2. Effet du pH, de la température, de l’agitation et du temps d’incubation .........................31
IV. Purification et Caractérisation des Métabolites Secondaires ...................................................32
IV. 1. Purification.......................................................................................................................32
IV. 2. Caractérisation .................................................................................................................33

D. RESISTANCE MICROBIENNES AUX BIOMOLECULES ..................................................35

I. Résistance aux antibiotiques .......................................................................................................36
II. Résistance aux antifongiques.....................................................................................................36

E. LES BACTERIOCINES............................................................................................................38
I. Domaines d’applications des bactériocines ................................................................................38
I.1. Le typage bactérien ..............................................................................................................38
I.2. Domaine alimentaire ............................................................................................................38
I.3. Domaines de la médecine humaine et vétérinaire................................................................39
I.4. Domaine agricole .................................................................................................................41
II. Microorganismes producteurs de bactériocines ........................................................................41
III. Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques..........................................................42
III-1 Le pH et les acides organiques..........................................................................................42
III. 2. Le peroxyde d’hydrogène.................................................................................................43
III.3. Le dioxyde de carbone ......................................................................................................44
III.4. Le diacétyl .........................................................................................................................44
III.5. La reutérine .......................................................................................................................44
III.6. Les bactériocines ...............................................................................................................45
III.6.1. Classe I : Les lantibiotiques ................................................................................................ 45
III.6.2. Classe II. ............................................................................................................................ 46
III.6.3. Classe III ............................................................................................................................ 48
III.6.4. Classe IV ............................................................................................................................ 48
IV. La production des bactériocines...............................................................................................48
V. Le conditionnement des bactériocines .....................................................................................49
VI. L’application des bactériocines dans le secteur alimentaire ....................................................50
VI. 1. Application de la bactériocine..........................................................................................50
VI. 2. Application de la bactérie productrice de bactériocines ..................................................51

A. MATERIEL...............................................................................................................................51
I. Bactéries......................................................................................................................................51
I. 1. Souches d’E. coli pour les manipulations de clonage.........................................................51
I. 2. Bactéries lactiques ..............................................................................................................51
I.2.1. Productrices de bactériocines................................................................................................. 51
I.2.2. Utilisées comme cellules indicatrices..................................................................................... 51
 I. 3. Autres bactéries indicatrices ...............................................................................................51
I. 4. Streptomyces .......................................................................................................................52
II. Champignons .............................................................................................................................52
III. Vecteur de clonage ...................................................................................................................52
IV. Les milieux de cultures ............................................................................................................52
IV. 1. Milieux solides .................................................................................................................52
IV. 1. 1. Milieux utilisés pour les souches d’Escherichia coli.......................................................... 52
IV. 1. 2. Milieux utilisés pour les cellules indicatrices..................................................................... 53
IV. 1. 3. Milieux utilisés pour les bactéries lactiques productrices de bactériocines ......................... 53
IV. 1. 4. Milieux utilisés pour les souches de Streptomyces............................................................. 53
IV. 2. Milieux liquides ...............................................................................................................56
IV. 2. 1. Milieux utilisés pour E. coli .............................................................................................. 56
IV. 2. 2. Milieux utilisés pour les souches de Streptomyces............................................................. 56
IV. 2. 3. Milieux utilisés pour les souches indicatrices .................................................................... 56
V. Tampons et Solutions ................................................................................................................56
V. 1. Tampons ............................................................................................................................57
V. 2. Solutions............................................................................................................................58

VI. Enzymes, Kits et Oligonucléotides ..........................................................................................61

VI. 1. Enzymes ...........................................................................................................................61
VI. 2. Kits ...................................................................................................................................62
VI. 3. Oligonucléotides ..............................................................................................................62
VII. Matériel chimique et spectroscopique ....................................................................................62
VII. 1. Purification des molécules actives..................................................................................62
VII.1.1. A partir de Streptomyces.................................................................................................... 62
VII.1.2. A partir de bactéries lactiques (bactériocines) ................................................................... 63
VII. 2. Identification des molécules actives ...............................................................................63

B. METHODES .............................................................................................................................64
I. Cultures des bactéries .................................................................................................................64
I. 1. Souches d'E. coli .................................................................................................................64
I. 2. Souches de Streptomyces ....................................................................................................64
I. 3. Souche Lactobacillus plantarum sp. TN635 ......................................................................65
I. 4. Souches indicatrices............................................................................................................65
I.4.1. Bactéries ............................................................................................................................... 65
I.4.2. Champignons ........................................................................................................................ 65
II. Détection des activités biologiques ...........................................................................................66
II.1. Activités biologiques à partir des souches de Streptomyces...............................................66
II.1.1. Dosage de l’activité antimicrobienne dans le surnageant brut................................................ 66
II.1.2. Dosage de l’activité antimicrobienne après extraction des biomolécules ............................... 67
 II.2. Activités biologiques à partir des bactéries lactiques .........................................................67
II.2.1 La méthode d'antagonisme différé ......................................................................................... 67
II.2.2 La méthode des dilutions (AWDA) ....................................................................................... 68
III. Purification et caractérisation des biomolécules ......................................................................68
III.1. A partir de souches de Streptomyces.................................................................................68
III.1.1. Purification......................................................................................................................... 68
III.1.2. Caractérisation chimique des biomolécules ......................................................................... 70
III.2. A partir de la souche de Lactobacillus plantarum TN635 ................................................74
III.2.1. Précipitation fractionnée par le sulfate d’ammonium ........................................................... 74
III.2.2. Purification sur membrane cutoff (10 kDa) ......................................................................... 74
III.2.3. Gel filtration sur colonne de Séphadex G-25 ....................................................................... 74
III.2.4. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)............................................... 75
III.2.5. Effet des différents traitements sur l’activité bactériocine ................................................... 75
III.2.6. Electrophorèse en gel polyacrylamide (SDS-PAGE) ........................................................... 76
III.2.7. Mode d’inhibition .............................................................................................................. 77
III.2.8. Détermination de la masse de BacTN635 ............................................................................ 77
IV. Techniques d’extraction et de manipulation de l’ADN ...........................................................77
IV. 1. Extraction de l'ADN plasmidique à partir d'E. coli..........................................................77
IV. 1. 1. Les mini préparations (Birnboim et Doly "1979" modifiée)............................................... 77
IV. 1. 2. Les maxi préparations (lyse alcaline) ................................................................................ 78
IV. 2. Extraction de l'ADN génomique à partir des souches de Streptomyces ..........................78
IV.3. Extraction de l’ADN génomique de la souche Lactobacillus plantarum sp. TN635 .......79
IV.4. Quantification de l’ADN...................................................................................................80
IV.4.1. Méthode spectrophotométrique........................................................................................... 80
IV.4.2. Méthode utilisant la fluorescence émise par le BET (méthode empirique) ........................... 80
IV. 5. Digestion de l’ADN par des endonucléases de restriction...............................................80
IV.6. Déphosphorylation de l'ADN............................................................................................81
IV.7. Ligation de l'ADN.............................................................................................................81
IV.8. Electrophorèse sur gel d’agarose ......................................................................................81
IV.9. Purification de l’ADN.......................................................................................................81
IV.10. Séquençage de l’ADN.....................................................................................................82
IV.11. Analyse des Séquences nucléotidiques ...........................................................................82
IV.12. Amplification par PCR....................................................................................................83
V. Transformation d’E. coli ...........................................................................................................83
VI. Identification et classification des souches de Streptomyces ...................................................84
VI.1. Critères Morphologiques...................................................................................................84
VI.2. Analyse des constituants de la paroi .................................................................................84
VI. 2.1. Obtention de la biomasse mycélienne ................................................................................ 84
 VI. 2.2. Analyse des acides aminés pariétaux.................................................................................. 84
VI. 2.3. Analyse des sucres cellulaires ............................................................................................ 85
VI. 2.4. Analyse des phospholipides membranaires ........................................................................ 86
VI. 2.5. Analyse des acides gras cellulaires..................................................................................... 86
VI. 3. Etudes physiologiques......................................................................................................87
VI. 3. 1. Production de pigments mélanoïdes ................................................................................. 87
VI. 3. 2. Production de nitrate réductase ......................................................................................... 87
VI. 3. 3. Utilisation des composés glucidiques comme seules sources de carbone ........................... 87
VI. 3. 4. Dégradation de divers autres composés organiques ........................................................... 88
VI. 3. 5. Tests de sensibilité à divers agents physiques et chimiques ............................................... 88
RESULTATS ET DISCUSSION...................................................................................................90
A. CARACTERISTIQUES TAXONOMIQUES DES SOUCHES TN17 ET FR10 .....................91
I. Rappel des résultats antérieurs....................................................................................................91
II. Etudes morphologiques des souches TN17 et Fr10...................................................................92
III. Etudes chimiotaxonomiques ...................................................................................................94
III. 1. Analyse des acides aminés et des sucres pariétaux ..........................................................95
III. 2. Analyse des lipides membranaires ..................................................................................96
III. 2. 1. Les phospholipides ........................................................................................................... 96
III. 2. 2. Les acides gras.................................................................................................................. 97
IV. Arbres phylogéniques des souches de Streptomyces TN17 et Fr10.........................................99
V. Etudes Physiologiques.............................................................................................................102
V. 1. La souche Streptomyces TN17 et les trois souches de Streptomyces apparentées ..........102
V. 2. La souches Streptomyces Fr10 et les deux souches de Streptomyces apparentées..........106

[Link] DES CONDITIONS DE PRODUCTION, PURIFICATION ET

CARACTERISATION CHIMIQUE DES BIOMOLECULES DE LA SOUCHE DE
Streptomyces lilaceus sp. TN17. PURIFICATION DES BIOMOLECULES DE LA SOUCHE
DE Streptomyces microflavus sp. Fr10 ........................................................................................113
I. Optimisation des conditions de production des biomolécules de la souche de Streptomyces
lilaceus sp. TN 17.........................................................................................................................113
I. 1. Sources de carbone ...........................................................................................................113
I. 2. Eléments chimiques ..........................................................................................................115
II. Extraction, purification et caractérisation chimique des biomolécules de la souche de
Streptomyces lilaceus sp. TN 17 ..................................................................................................116
II.1. Extraction..........................................................................................................................116
II. 2. Purification ......................................................................................................................117
II. 2. 1. Fraction I (FI) .................................................................................................................. 119
II. 2. 2. Fractions II et III (FII et FIII) ........................................................................................... 119
II. 3. Caractérisation chimique de M1, M2 et M3....................................................................120
II. 3. 1. Molécule M1.................................................................................................................... 120
 II. 3. 2. Molécule M2.................................................................................................................... 129
II. 3. 3. Molécule M3.................................................................................................................... 136
II. 4. Activités biologiques des biomolécules M1, M2 et M3. .................................................144
II. 4. 1. La biomolécule M1 .......................................................................................................... 145
II. 4. 2. La biomolécule M2 .......................................................................................................... 145
II. 4. 3. La biomolécule M3 .......................................................................................................... 146
III. Extraction et purification des biomolécules de la souche de S. microflavus sp. Fr10 ...........147
III. 1. Extraction .......................................................................................................................147
III. 2. Purification .....................................................................................................................148

[Link] ET IDENTIFICATION DE LA SOUCHE Lactobacillus plantarum sp. TN635.

ETUDE DES CARACTERISTIQUES BIOCHIMIQUES ET MICROBIOLOGIQUES ET
PURIFICATION DE LA BACTERIOCINE BACTN635...........................................................156
I. Sélection des bactéries lactiques productrices de bactériocines ...............................................157
II. Identification de l’isolat TN635 ..............................................................................................160
III. Température optimale et cinétique de production de la biomolécule (bactériocine) .............163
IV. Effets des différents traitements sur l’activité antimicrobienne de la souche TN635 ...........164
IV. 1. Effet de la catalase, des enzymes protéolytiques, de la lipase et de l’α -amylase .........164
IV. 2. Effet des surfactants et des solvants organiques ............................................................164
IV. 3. Effet de la température ...................................................................................................165
IV. 4. Effet du pH.....................................................................................................................166
V. Purification de BacTN635.......................................................................................................167
VI. Détermination de la masse de BacTN635..............................................................................169
VII. Mode d’action de BacTN635................................................................................................172
CONCLUSION GENERALE ......................................................................................................178
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .....................................................................................181
 AUTHOR QUERIES

Journal id: GNPL_A_398794

Corresponding author: Lotfi Mellouli

Title: Purification and structure elucidation of three naturally

bioactive molecules from the new terrestrial Streptomyces sp.
TN17 strain

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Natural Product Research

Vol. ??, No. ?, Month?? 2009, 1–9

Purification and structure elucidation of three naturally bioactive

molecules from the new terrestrial Streptomyces sp. TN17 strain
Slim Smaouia, Lotfi Melloulia*, Ahmed Lebrihib, Yannick Coppelc,
Lilia Fourati Ben Fguiraa and Florence Mathieub
a
5 Laboratoire d’Enzymes et de Me´tabolites des Procaryotes (LEMP), Centre de
Biotechnologie de Sfax (CBS), Route de Sidi Mansour Km 6, B.P. ‘1177’, 3018 Sfax,
Tunisie; bDe´partement Bioproce´de´s & Syste`mes Microbiens, Universite´ de Toulouse,
Laboratoire de Ge´nie Chimique UMR 5503 (CNRS/INPT/UPS). INP-ENSAT, 1 Av,
de l’Agrobiopôle, BP 32607, 31326 Castanet-Tolosan, France; cLaboratoire de Chimie de
10 Coordination UPR8241 (CNRS) 205 route de Narbonne, Universite´ de Toulouse, 31 077
Toulouse Cedex 4, France
(Received 21 January 2009; final version received 10 April 2009)

Thirty litres of fermentation broth was extracted from the newly isolated
Streptomyces sp. strain TN17 and various separation and purification
15 steps led to the isolation of three pure bioactive compounds (1–3).
Compound 1: Cyclo (L-Leu-L-Arg), a diketopiperazine ‘DKP’ derivative;
2: di-(2-ethylhexyl) phthalate, a phthalate derivative and 3: Cyclo
1-[2-(cyclopentanecarbonyl-3-phenyl-propionyl]-pyrrolidine-2-carboxylic
acid (1-carbamoyl-propyl)-amide, a cyclic tetrapeptide derivative. The
20 chemical structure of these three active compounds was established on the
basis of spectroscopic studies MS and NMR and by comparing with data
from the literature. According to our biological studies, we showed in this
work that the pure compounds (1–3) possess antibacterial and antifungal
activities.
25 Keywords: Streptomyces sp. TN17; purification; chemical structure; cyclo
(L-Leu-L-Arg); phthalate derivative; cyclic tetrapeptide

1. Introduction
Increase in the frequency of multi-resistant pathogenic bacteria created an urgent
demand in the pharmaceutical industry for more rational approaches and strategies
30 to screen new antibiotics. Currently available bioactive molecules can be classified
into different ways based on the bacterial spectrum, the type of activity (bactericidal
or bacteriostatic) and the chemical structure. Using the chemical structure
classification, several classes of antibiotics can be distinguished: -lactams chemically
characterised by a -lactam ring; chloramphenicol, a nitro benzene derivative of
35 dichloroacetic acid; macrolides, macrocyclic lactones divided in two main subgroups:
polyene macrolide and non-polyenic macrolide antibiotics; glycopeptides, they
consist of glycosylated cyclic or polycyclic nonribosomal peptides; polyethers, which

*Corresponding author. Email: [Link]@[Link]

ISSN 1478–6419 print/ISSN 1029–2349 online

ß 2009 Taylor & Francis
DOI: 10.1080/14786410902986225
[Link]
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2 S. Smaoui et al.

contain a number of cyclic ether and ketal units and have a carboxylic acid group;
aminoglycosides, which characteristically contain amino sugars; tetracyclines, char-
40 acterised as containing a polyhydronaphthacene nucleus; cyclic tetrapeptides family;
diketopiperazine derivatives ‘DKP’ (piperazine 2,5-diones, 2,5-dioxopiperazines or
cyclodipeptides); phthalate derivatives; etc.
It has been well established that microorganisms are an unlimited source
of natural products, many of which have potential therapeutic applications.
45 Filamentous soil bacteria belonging to the genus Streptomyces are widely recognised
as industrially important microorganisms because of their ability to produce many
kinds of secondary metabolites including antibiotics and bioactive compounds
valued in human and veterinary medicine and agriculture (Williams et al., 1983).
These bacteria produce about 75% of commercially and medically useful antibiotics,
50 and approximately 60% of antibiotics, which have been developed for agricultural
use were isolated from Streptomyces species (Miyadoh, 1993; Tanaka & Mura, 1993).
This genus of bacteria represents at least 90% of actinomycetes isolated from
soil (Anderson & Wellington, 2001). Active molecules of Streptomyces species
are generally extracellular and their isolation in highest purity from the complex
55 fermentation broth needs the application of a combination of various separation
steps such as solvent extraction, chemical precipitation, ion exchange chromato-
graphy, HPLC purification, etc.
From Tunisian soil we have isolated a new actinomycete strain called
Streptomyces sp. TN17 producing diverse biological activities (data not shown).
60 The present article describes the extraction, the purification (using different
chromatographic techniques) and the structure elucidation of three bioactive
molecules from a liquid culture broth of this strain. The biological activity of
these pure compounds is addressed as well.

2. Results and discussion

65 2.1. Structure elucidation of the active compounds
2.1.1. Cyclo (L-Leu-L-Arg) (1)
Compound 1 was obtained as a yellowish UV-absorbing solid. In DMSO, the 13C
and HSQC spectra showed 11 carbon signals. From the 13C data, it was possible to
discern two carbonyl groups (c 170.8 and 167.0), three sp3-hybridised carbons
70 bearing an electronegative heteroatom (c 59.0, 53.1 and 45.3), four sp3-hybridised
carbon (c 38.3, 27.9, 24.6 and 22.9) and two methyl groups (c 23.3 and 22.4). The
2D 1H–1H and 1H–13C experiments permitted to assign two fragments to leucine and
arginine. The presence of a NH proton (H 7.96) and observed HMBC and NOE
correlations enabled to identify compound 1 as a (L-Leu-L-Arg) dipeptide. Based on
75 these data, two possible structures were suggested for this compound. The first one is
a linear structure where the corresponding molecular weight (MW) will be 287,
and the second one is a cyclic structure where the MW will be 269 (Figure 1a and b).
To distinguish between these two situations, we have determined the mass of
compound 1 using the LC/MS technique. Obtained result, [M–H]þ ¼ 268.5, shows
80 that the corresponding MW is 269. Consequently, we can deduce that compound 1
possesses a cyclic structure (Figure 1b) and the corresponding molecular formula
is C12H23O2N5.
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Natural Product Research 3

(b)
(a) HN NH2
4 O
HMBC
HN 1
COSY 4
NH
2
NOE HN
O 2
1
+ 1 2
H3N O HMBC O
2 NH 4
1 COSY
–
H3C O HN NH2
NOE
4
CH3 NH

Figure 1. HMBC, COSY and NOE correlations of the two proposed structures (a and b) of
compound 1.

HMBC
COSY
O 7'
3 3'
2 1'
4 1 O 5'

Figure 2. HMBC and COSY correlations of compound 2.

2.1.2. Di-(2-ethylhexyl) phthalate (2)

Compound 2 was obtained as a white coloured solid. In CD2Cl2, the 13C and HSQC
85 spectra showed 12 carbon signals. From the 13C data, it was possible to discern one
carbonyl group (c 162.5), three sp2-hybridised carbons (c 132.5, 130.9 and 128.7),
one sp3-hybridised carbon bearing an electronegative heteroatom (c 68.0), five
sp3-hybridised carbons (c 35.8–23.8) and two methyl groups (c 13.8 and 10.7). The
1
H NMR spectrum showed a characteristic AA0 BB0 system at 7.74 and 7.59 ppm
90 (JAA0 ¼ 0.7 Hz, JAB ¼ JA0 B0 ¼ JBB0 ¼ 7.8 Hz and JAB0 ¼ JA0 B ¼ 1.1 Hz obtained from
simulation). These data established a compound that has a di ortho-substituted
aromatic ring. Based on the revealed spectral data and search in AntiBase,
compound 2 was identified as di-(2-ethylhexyl) phthalate (Figure 2). The
corresponding molecular formula is C24H38O4 with a MW of 390.

95 2.1.3. Cyclo 1-[2-(cyclopentanecarbonyl-3-phenyl-propionyl]-pyrrolidine-

2-carboxylic acid (1-carbamoyl-propyl)-amide (3)
Compound 3 was obtained as a white coloured solid. In CD3OD, the 13C and HSQC
spectra showed 12 carbon signals. From the 13C data, it was possible to discern two
carbonyl groups (c 169.5 and 165.5), four sp2-hybridised carbons (c from 137.7
100 to 126.8), three sp3-hybridised carbons bearing an electronegative heteroatom
(c 58.9, 56.2 and 45.0) and three sp3-hybridised carbons (c 35.8, 28.2 and 22.4).
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4 S. Smaoui et al.

HMBC
5 7
COSY

O 3
H
N O
N 1 1
2 3
2
4
N
O N 5
H
O

Figure 3. HMBC and COSY correlations of compound 3.

The 2D 1H–1H and 1H–13C experiments permitted to assign two fragments to proline
and phenylalanine. The HMBC correlations from the -protons and proline CH2-5
protons to the respective amide carbonyls established the cyclic tetrapeptide. The
105 structure of compound 3 was determined to be 1-[2-(cyclopentanecarbonyl-3-phenyl-
propionyl]-pyrrolidine-2-carboxylic acid (1-carbamoyl-propyl)-amide (Figure 3).
The corresponding molecular formula is C28H32O4N4 with a MW of 488.

2.2. Biological activities of the three characterised compounds

The new isolated Streptomyces sp. strain TN17 produced simultaneously three active
110 compounds belonging to three different structure types.
The first active compound (1) is the cyclo (L-Leu-L-Arg), a diketopiperazine
(DKP) derivative. DKP derivatives, produced naturally by many organisms and
microorganisms, display a very wide diversity of structures and biological functions,
making them useful chemical entities for the discovery and development of new
115 drugs. Useful biological properties have already been demonstrated for some of
them, such as antibacterial, fungicidal, herbicidal, antiviral, immunosuppressor,
antitumour activities, etc. (Magyar, Zhang, Abdi, Kohn, & Widger, 1999). Several
DKP derivatives have been purified and characterised especially from Streptomyces
species (Ben Ameur-Mehdi, Mellouli, Chabchoub, Fotso, & Bejar, 2004; Ben
120 Ameur-Mehdi, Sioud, Fourati Ben Fguira, Bejar, & Mellouli, 2006; Rhee, 2002).
Concerning compound 1, it has been previously described as a natural product from
Streptomyces species (Tatsuta, Tsuchiya, Umezawa, Naganawa, & Hamao, 1972) or
obtained by chemical synthesis (Sasaki et al., 1982). According to our antimicrobial
activities studies, we have observed that compound 1 possesses antibacterial activities
125 against Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as antifungal activities
(Table 1).
The second active compound produced by the Streptomyces sp. TN17 is the
di-(2-ethylhexyl) phthalate (2). Phthalate compounds are petrochemicals used as
plasticisers or solvents in a variety of industrial products. Nevertheless, many
130 phthalate derivatives have been isolated from terrestrial and marine organisms
including plants (Lee, Kim, Lim, & Kim, 2000), marine algae (Chen, 2004), fungal
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Natural Product Research 5

Table 1. Antimicrobial activities of compounds 1–3.

Diameter of inhibition zones (mm)

Test organism 1 2 3

M. luteus LB 14110 20 17 19
S. aureus ATCC 6538 14 12 15
E. coli ATCC 8739 11 ND ND
Fusarium sp. 21 14 17

Note: A total of 50 mg per platelet, diameter of inhibition zones in mm. ND:

activity not detected. For each pure active compound and indicator
microorganism, the experiment was carried out simultaneously three times
in the same conditions. In each case, all obtained diameters of inhibition
zones were quite similar and the reported inhibition zones (mm) are the
average of the three experiments.

(Amade, Mallea, & Bouaicha, 1994) and bacterial culture broths, especially those
belonging to the genus Streptomyces. Compound 2 has been already described from
Streptomyces bangladeshiensis (Al-Bari, Abu Sayeed, Sazedur Rahman, & Ashik
135 Mossadik, 2006). Other phthalate derivatives have been isolated from Streptomyces
species, such as the dibutyl phthalate (El-Naggar, 1997; Lee, 2000; Roy, Laskar, &
Sen, 2006). Phthalate derivatives which possess several antimicrobial activities are
also effective compounds against demodicidosis (Yuan, Guo, Qin, Deng, & Huang,
2001), as well as endocrine disruptors with estrogenic activity (Marchetti et al., 2002)
140 and drug channelling agents (Makhija & Vavia, 2003). Our antimicrobial studies
show that compound 2 possesses antibacterial activities against Gram-positive
bacteria and fungi (Table 1).
The third active compound (3), produced by the studied TN17 strain is the
cyclo 1-[2-(cyclopentanecarbonyl-3-phenyl-propionyl]-pyrrolidine-2-carboxylic acid
145 (1-carbamoyl-propyl)-amide, a cyclic tetrapeptide derivative. Cyclic tetrapeptides
are a class of natural products that have been shown to possess broad-ranging
biological activities and good pharmacokinetic properties (Horton et al., 2008).
Several groups of cyclic tetrapeptides have been described, such as rhodopeptins
isolated from Rhodococcus species having antifungal activities (Chiba, Agematu,
150 Dobashi, & Yoshioka, 1999), cyclic tetrapeptides group of protein synthesis
inhibitors described from Streptomyces genus (Brandi et al., 2006), apicidin
tetrapeptides group acting as antitumour agents that can induce cell cycle arrest
and apoptosis in various cancer cells (Okada et al., 2006). Compound 3 has been
recently isolated from the Streptomyces barakatei J2 and a patent for the use of this
155 active molecule in plants treatment has been deposed (Lebrihi, Errakhi, & Barakate,
2008). According to our microbiological tests, compound 3 shows inhibitory
activities against Gram-positive bacteria and fungi (Table 1).

3. Experimental
An NMR sample was prepared by dissolving the pure compounds (1–3) in
160 600 mL of DMSO, CD2Cl2 and CD3OD, respectively. 1D and 2D 1H and 13C NMR
experiments were recorded on a Bruker Avance 500 spectrometer equipped with
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6 S. Smaoui et al.

a 5 mm triple resonance inverse Z-gradient probe (TBI 1H, 31P, BB) or a Bruker
Avance 600 spectrometer equipped with a 5 mm triple resonance inverse (TCI 1H,
13
C, 15N) Z-gradient cryoprobe. All chemical shifts for 1H and 13C are relative to
165 TMS using 1H (residual) or 13C chemical shifts of the solvent as a secondary
standard. The temperature was set at 298K. All the 1H and 13C signals were assigned
on the basis of chemical shifts, spin–spin coupling constants, splitting patterns and
signal intensities, and by using 1H–1H COSY45, 1H–13C HMQC and 1H–13C HMBC
experiments.
170 The LC/MS analysis of compound 1 was performed using an LC/MSD Trap
XCT – Electrospray (Agilent Technologies), equipped with an HPLC Agilent 100
DAD detector (C18 column Zorbax 300 2.1  150 mm). [M – H]+ of 1 is 268.5,
which involves a corresponding MW of 269.

3.1. Microorganisms
175 The Streptomyces sp. TN17 strain was isolated and selected as a producer of
potent antimicrobial activities. Bacterial strains: Micrococcus luteus LB 14110,
Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Escherichia coli ATCC 8739 were used as
indicator microorganisms for the antibacterial activity essays. Antifungal activity
was determined against the filamentous fungus, Fusarium sp.

180 3.2. Culture conditions and biological assays of antimicrobial activities

Indicator microorganisms were grown overnight in LB medium at 30 C for M. luteus
LB14110 (Gram-positive bacteria) and at 37 C for S. aureus ATCC 6538 (Gram-
positive bacteria) and E. coli ATCC 8739 (Gram-negative bacteria), then diluted
1 : 100 in LB medium and incubated for 5 h under constant agitation of 200 rpm at
185 the appropriate temperature. Fusarium sp. was grown in potato dextrose agar (PDA)
for 7 days at 30 C. Spores were collected in sterile distilled water and then adjusted
to a spore density of approximately 104 spores L1. Antimicrobial activities were
determined by the agar diffusion test: a paper disk (8 mm Ø) was impregnated
with 50 mL of the corresponding sample and then laid on the surface of an agar
190 plate containing 3 mL of top agar inseeded by 40 mL of a 5-h-old culture of the
corresponding microorganism. For antifungal activity against the Fusarium sp.,
100 mL of spores suspension were added to the 3 mL of top agar. After 2 h at 4 C,
plates containing M. luteus LB 14110 and Fusarium sp. were incubated at 30 C and
those inoculated with S. aureus ATCC 6538 and E. coli ATCC8739 were incubated
195 overnight at 37 C. The antimicrobial activities of the three pure compounds (1–3)
were determined under the same conditions mentioned above. The quantity used for
each pure active compound was 50 mg per disk. Plates were examined for evidence of
antimicrobial activities represented by a zone of inhibition of growth of the
corresponding indicator microorganisms around the paper disk.

200 3.3. Extraction and purification of active compounds

Spores at 107 L1 of Streptomyces strain TN17 were used to inoculate 1000 mL
Erlenmeyer flasks with four indents, containing 200 mL of TSB (Tryptic Soy Broth)
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Natural Product Research 7

medium at 30 gL1 supplemented with 1% (w/v) of glucose and potassium

phosphate at 1 mmolL1. After incubation at 30 C for 24 h in an orbital incubator
205 with shaking at 200 rpm, this pre-culture was used to inoculate (5% v/v) a total
volume of 30 L culture medium having the same composition of the pre-culture.
The shaker culture broth was harvested after 3 days to separate mycelium and
supernatant. The resulting supernatant was extracted two times by ethyl acetate
(v/v). The obtained organic phases were evaporated to dryness under vacuum,
210 to give a brown crude extract (2.8 g) which was dissolved in 5 mL of dichloro-
methane–methanol (DCM/90% MeOH/10%) and then subjected to a column
chromatography on Sephadex LH-20 using a dichloromethane–methanol (DCM/
90% MeOH/10%) giving seven fractions, which were reduced to three fractions
(FI–FIII) by monitoring of TLC.

215 3.3.1. Fraction FI

The biologically active fraction FI was then subjected to a series of chromato-
graphic systems: a column chromatography on silica gel eluted with a gradient of
100%DCM–0%MeOH to 0%DCM–100%MeOH. An active sub-fraction was
obtained at 85%DCM–15%MeOH. This sub-fraction was then fractioned by
220 HPLC (waters: controller 600, pump 600, dual  absorption detector 2487, Linear
Recorder); column C18 (250  7) 8 mm UP ODS). Elution was at a flow rate of
1 mL min1 with a linear gradient of two solutions A (water) and B (acetonitrile)
from 100% buffer A to 50% buffer A and 50% buffer B over the first 35 min,
followed by a linear gradient to 100% buffer B from 35 to 45 min. Detection was
225 carried out by using a wavelength of 280 nm. Different well-developed peaks having
a retention time between 5 min and 45 min were collected separately, concentrated
and then tested for the inhibitory activity against the used indicator microorganisms.
Only the compound corresponding to the peak having a retention time of 39 min (1)
possesses biological activities.
230 Compound (1): Cyclo (L-Leu-L-Arg). 1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz)  7.96 (1H, br
s, Arg-NH),  4.19 (1H, dd, J ¼ 8.1, 8.0 Hz, Arg-H2),  4.01 (1H, dd, J ¼ 6.9, 5.9 Hz,
Leu-H2),  3.41 (1H, m, Arg-H5),  3.28 (1H, m, Arg-H5),  2.13 (1H, m, Arg-H3), 
1.92 (1H, m, Arg-H3),  1.90 (2H, m, Leu-H4),  1.79 (2H, m, Arg-H4),  1.77 (1H,
m, Leu-H3),  1.37 (1H, m, Leu-H3),  0.88 (3H, d, J ¼ 7.0 Hz, Leu-H5),  0.87 (3H,
235 d, J ¼ 7.0 Hz, Leu-H50 ); 13C NMR (DMSO-d6, 150MHz)  170.8 (C, Arg-C1),  167.0
(C, Leu-C1),  59.0 (CH, Arg-C2),  53.1 (CH, Leu-C2),  45.3 (CH2, Arg-C5),  38.3
(CH2, Leu-C3),  27.9 (CH2, Arg-C3),  24.6 (CH, Leu-C4),  23.3 (CH3, Leu-C5), 
22.9 (CH2, Arg-C4) and  22.4 (CH3, Leu-C50 ).

3.3.2. Fractions FII and FIII

240 These two active fractions were subjected separately to two other purification steps:
preparative thin-layer chromatography (PTLC) and HPLC fractionation, using the
conditions similar to those for compound 1 to obtain the two pure active compounds
(2 and 3) having retention times of 11.2 and 23.5 min, respectively.
Compound (2): Di-(2-ethylhexyl) phthalate. 1H NMR (CD2Cl2, 500 MHz)
245  7.74 (1H, m, H3),  7.59 (1H, m, H4),  4.25 (1H, dd, J ¼ 10.8, 5.6 Hz, H10 ),
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8 S. Smaoui et al.

 4.21 (1H, dd, J ¼ 10.8, 6.0 Hz, H10 ),  1.71 (1H, m, H20 ),  1.46 (2H, m, H70 ),  1.40
(2H, m, H30 ),  1.36 (4H, m, H40 , H50 ),  0.96 (3H, t, J ¼ 7.3 Hz, H80 ),  0.94
(3H, t, J ¼ 7.0 Hz, H60 ); 13C NMR (CD2Cl2, 125 MHz)  162.5 (C, C1),  132.5
(C, C2),  130.9 (CH, C4),  128.7 (CH, C3),  68.0 (CH2, C10 ),  38.8 (CH, C20 ),
250  30.4 (CH2, C30 ),  28.9 (CH2, C40 ),  23.8 (CH2, C70 ),  23.0 (CH2, C50 ),  13.8
(CH3, C60 ) and  10.7 (CH3, C80 ).
Compound (3): Cyclo 1-[2-(cyclopentanecarbonyl-3-phenyl-propionyl]-pyrro-
lidine-2-carboxylic acid (1-carbamoyl-propyl)-amide. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz)
 7.98 (1H, br s, Phe-NH),  7.27 (4H, m, Phe-H5, Phe-H6),  7.20 (1H, m, Phe-H7),
255  4.36 (1H, t, J ¼ 5.1 Hz, Phe-H2),  4.36 (1H, dd, J ¼ 9.0, 7.0 Hz, Pro-H2),  3.40
(1H, m, Pro-H5), 3.28 (1H, m, Pro-H5),  3.08 (1H, dd, J ¼ 14.2, 5.1 Hz, Phe-H3), 3.02
(1H, dd, J ¼ 14.2, 5.1 Hz, Phe-H3), 2.01 (1H, m, Pro-H3), 1.73 (2H, m, Pro-H4),
1.43 (1H, m, Pro-H3); 13C NMR (CD3OD, 125MHz)  169.5 (C, Pro-C1),  165.5
(C, Phe-C1),  137.7 (C, Phe-C4),  130.2 (CH, Phe-C5),  128.4 (CH, Phe-C6),  126.8
260 (CH, Phe-C7),  58.9 (CH, Pro-C2),  56.2 (CH, Phe-C2),  45.0 (CH2, Pro-C5),  35.8
(CH2, Phe-C3),  c28.2 (CH2, Pro-C3) and  22.4 (CH2, Pro-C4).

Acknowledgements
This work was supported by the CMCU project No: 06/S 0901 ‘MELLOULI/AIGLE’. The

265
authors are grateful to Mr H. Aouissaoui and Ms L. Jlail for the LC/MS determination and
to Ms L. Elleuch and M.I. Karray-Rebai for generous help.
3

1 References

Al-Bari, M.A.A., Abu Sayeed, M., Sazedur Rahman, M., & Ashik Mossadik, M. (2006).
Research Journal of Medicine and Medical Sciences, 1, 77.
Amade, P., Mallea, M., & Bouaicha, N. (1994). The Journal of Antibiotics, 47, 201.
270 Anderson, A.S., & Wellington, E.M.H. (2001). International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 51, 797.
Ben Ameur-Mehdi, R., Mellouli, L., Chabchoub, F., Fotso, S., & Bejar, S. (2004). Chemistry
of Natural Compounds, 40, 510.
Ben Ameur-Mehdi, R., Sioud, S., Fourati Ben Fguira, L., Bejar, S., & Mellouli, L. (2006).
275 Process Biochemistry, 41, 1506.
Brandi, L., Lazzarini, A., Cavaletti, L., Abbondi, M., Corti, E., Ciciliato, I., et al. (2006).
Biochemistry, 45, 3692.
Chen, C.Y. (2004). Water Research, 38, 1014.
Chiba, H., Agematu, H., Dobashi, K., & Yoshioka, T. (1999). The Journal of Antibiotics,
280 52, 700.
El-Naggar, M.Y.M. (1997). Biomedical Letters, 55, 125.
Horton, D.A., Bourne, G.T., Coughlan, J., Kaiser, S.M., Jacobs, C.M., Jones, A., et al.
(2008). Organic and Biomolecular Chemistry, 6, 1386.
Lee, D.S. (2000). Journal of Bioscience and Bioengineering, 89, 271.
285 Lebrihi, A., Errakhi, R., & Barakate, M. (2008). Patent deposed: INP/AGRONUTRITION,
FR08 54053.
2
Lee, K.H., Kim, J.H., Lim, D.S., & Kim, C.H. (2000). The Journal of Pharmacy and
Pharmacology, 52, 593.
XML Template (2009) [12.5.2009–3:03pm] [1–9]
K:/Journals/Inprocess/TandF/GNPL/GNPL_A_398794.3d (GNPL) [FPP Stage]

Natural Product Research 9

Magyar, A., Zhang, X., Abdi, F., Kohn, H., & Widger, W. (1999). The Journal of Biological
290 Chemistry, 274, 7316.
Makhija, S.N., & Vavia, P.R. (2003). Journal of Controlled Release, 89, 5.
Marchetti, L., Sabbieti, M.G., Menghi, M., Materazzi, S., Hurley, M.M., & Manghi, G.
(2002). Histology and Histopathology, 17, 1061.
Miyadoh, S. (1993). Actinomycetologica, 9, 100.
295 Okada, T., Tanaka, K., Nakatani, F., Sakimura, R., Matsunobu, T., Li, X., et al. (2006).
International journal of Cancer, 118, 90.
Rhee, K.H. (2002). Journal of General and Applied Microbiology, 48, 321.
Roy, R.N., Laskar, S., & Sen, S.K. (2006). Microbiological Research, 161, 121.
Sasaki, Y., Akutsu, Y., Matsui, M., Suzuki, K., Sakurada, S., Sato, T., et al. (1982). Chemical
300 and Pharmaceutical Bulletin, 12, 4435.
Tanaka, Y.T., & Mura, S.O. (1993). Annual Review of Microbiology, 47, 57.
Tatsuta, K., Tsuchiya, T., Umezawa, S., Naganawa, H., & Hamao, U. (1972). The Journal of
Antibiotics, 25, 674.
Williams, S.T., Goodfellow, M., Alderson, G., Wllington, E.M., Sneath, P.H., & Sacki, M.J.
305 (1983). Journal of General Microbiology, 129, 1747.
Yuan, F.S., Guo, S.L., Qin, Z.X., Deng, S.H., & Huang, G.H. (2001). Chinese Journal of
Parasitology and Parasitic Diseases, 9, 160.
Appl Biochem Biotechnol
DOI 10.1007/s12010-009-8821-7

Inhibition of Fungi and Gram-Negative Bacteria

by Bacteriocin BacTN635 Produced by Lactobacillus
plantarum sp. TN635

Slim Smaoui & Lobna Elleuch & Wacim Bejar & Ines Karray-Rebai & Imen Ayadi &
Bassem Jaouadi & Florence Mathieu & Hichem Chouayekh & Samir Bejar &
Lotfi Mellouli

Received: 18 August 2009 / Accepted: 11 October 2009

# Humana Press 2009

Abstract The aim of this study was to evaluate 54 lactic acid bacteria (LAB) strains
isolated from meat, fermented vegetables and dairy products for their capacity to produce
antimicrobial activities against several bacteria and fungi. The strain designed TN635 has
been selected for advanced studies. The supernatant culture of this strain inhibits the growth
of all tested pathogenic including the four Gram-negative bacteria (Salmonella enterica
ATCC43972, Pseudomonas aeruginosa ATCC 49189, Hafnia sp. and Serratia sp.) and
the pathogenic fungus Candida tropicalis R2 CIP203. Based on the nucleotide sequence of
the 16S rRNA gene of the strain TN635 (1,540 pb accession no FN252881) and the
phylogenetic analysis, we propose the assignment of our new isolate bacterium as
Lactobacillus plantarum sp. TN635 strain. Its antimicrobial compound was determined as a
proteinaceous substance, stable to heat and to treatment with surfactants and organic
solvents. Highest antimicrobial activity was found between pH 3 and 11 with an optimum
at pH=7. The BacTN635 was purified to homogeneity by a four-step protocol involving
ammonium sulfate precipitation, centrifugal microconcentrators with a 10-kDa membrane
cutoff, gel filtration Sephadex G-25, and C18 reverse-phase HPLC. SDS-PAGE analysis of
the purified BacTN635, revealed a single band with an estimated molecular mass of
approximately 4 kDa. The maximum bacteriocin production (5,000 AU/ml) was recorded
after a 16-h incubation in Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) medium at 30°C. The mode of

S. Smaoui : L. Elleuch : W. Bejar : I. Karray-Rebai : I. Ayadi : B. Jaouadi : H. Chouayekh : S. Bejar :

L. Mellouli
Laboratoire d’Enzymes et de Métabolites des Procaryotes (LEMP), Centre de Biotechnologie de Sfax
(CBS), Route de Sidi Mansour Km 6, B.P. “1177”, 3018 Sfax, Tunisia

F. Mathieu
Département « Bioprocédés & Systèmes Microbiens » INP-ENSAT, Université de Toulouse, Laboratoire
de Génie Chimique UMR 5503 (CNRS/INPT/UPS), 1 Av, de l’Agrobiopôle, BP 32607, 31326 Castanet-
Tolosan, France

L. Mellouli (*)
Laboratoire d’Enzymes et de Métabolites des Procaryotes, Centre de Biotechnologie de Sfax, B.P
“1177”, Route Sidi Mansour Km 6, 3018 Sfax, Tunisia
e-mail: [Link]@[Link]
 Appl Biochem Biotechnol

action of the partial purified BacTN635 was identified as bactericidal against Listeria
ivanovii BUG 496 and as fungistatic against C. tropicalis R2 CIP203.

Keywords Lactobacillus plantarum sp. TN635 . Identification . BacTN635 . Purification .

Broad inhibitory spectrum

Introduction

During the last two decades, with the misuse use of existing antibiotics in human and
veterinary medicine and in agriculture, the effectiveness of currently available antibiotics is
decreasing due to the increasing number of resistant pathogenic strains. This is presently an
urgent focus of research and it becomes inevitable to discover new antimicrobial agents for
combating such a problem. Numerous antibacterial agents are now being considered, such
as bacteriophage [1], probiotic bacteria [2], antimicrobial peptides [3], and bacteriocins [4].
Bacteriocins are ribosomally synthesized peptides with a narrower spectrum of antimicro-
bial activity than most antibiotics [5]. Their antimicrobial activity has been found more
effective against closely related strains [6]. Actually, attention is turning to the potential
application of bacteriocins in the protection of human health [7], in agriculture [8], and in
food preservation [9]. Although bacteriocins are produced by many Gram-positive and
Gram-negative bacteria, those produced by lactic acid bacteria (LAB) are of particular
interest because they are known as “good bacteria” and can be used as natural preservatives
in food industry [10]. During the last few years, a large number of new LAB bacteriocins
have been identified and characterized. However, only few have been described to possess
activities against Gram-negative bacteria, e.g., plantaricin 35d produced by Lactobacillus
plantarum [11], bacteriocin ST34BR produced by L. lactis subsp. Lactis [12], bacteriocins
ST26MS and ST28MS produced by L. plantarum [13] and bacteriocin AMA-K produced
by L. plantarum AMA-K [14].
During our search program for bioactive compounds from LAB, a new bacterium called
TN635 was selected. This paper describes the selection, identification, and phylogenetic
determination of this bacterium. The purification and the characterization of a bacteriocin-
like substance called BacTN635, from the supernatant culture of this new strain are also
reported.

Materials and Methods

Bacterial Strains and Plasmids

The TN635 strain was selected as a producer of potent antimicrobial activities and was used
as the source of chromosomal DNA to amplify the 16S rRNA gene. E. coli TOP10
(Invitrogen), F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ 80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1
araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG, and E. coli DH5α [15] were used
as host strains. Bacterial strains: Gram-positive bacteria (Micrococcus luteus LB 14110,
Staphylococcus aureus ATCC 6538, Listeria ivanovii BUG 496, Enterococcus faecalis JH
2-2 and Enterococcus faecium ENSAIA 631), Gram-negative bacteria (Escherichia coli
ATCC 8739, Salmonella enterica ATCC43972, Pseudomonas aeruginosa ATCC 49189,
Hafnia sp. and Serratia sp.), and lactic acid bacteria: (Lactobacillus casei DSM 20011,
Lactobacillus sakei 2525, Lactobacillus delbrueckii DSM 20081, Lactococcus lactis ATCC
Appl Biochem Biotechnol

11454 and Lactococcus lactis subsp. cremoris DSM 11603) were used as indicator
microorganisms for the antibacterial activity assays. Antifungal activity was determined
against the Fusarium sp. and Candida tropicalis R2 CIP203.
pIJ2925 [16] derivative of pUC18 and pCR-Blunt vector (Invitrogen) Col E1 origin
(pUC-derived) KnR were used as the cloning vectors. pSS1, derivative of pCR-Blunt vector
carrying a 1,540-bp DNA fragment corresponding to the whole 16S rRNA gene of the
TN635 strain (this work).

Culture Conditions

E. coli DH5α was grown on Luria Bertani (LB) plates supplemented with ampicillin
(50 μg/ml) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (40 μg/ml) when
appropriate [17]. Transformation of E. coli DH5α with pIJ2925 derivatives was carried
out according to Hanahan [15]. Growth and transformation of TOP10 E. coli strain with the
pCR-Blunt vector derivative were carried out according to the manufacturer’s instructions
(Invitrogen). For determination of antibacterial activities, indicator microorganisms were
grown overnight in LB medium in aerobic conditions at 30°C for Lb. casei DSM 20011,
Lb. sakei 2525, Lc. lactis ATCC 11454, Lc. lactis subsp. cremoris DSM 11603, L. ivanovii
BUG 496, S. enterica ATCC43972, P. aeruginosa ATCC 49189, and M. luteus LB 14110,
in aerobic conditions at 37°C for E. coli ATCC 8739 and S. aureus ATCC 6538, in
anaerobic conditions at 30°C for E. faecalis JH 2-2, E. faecium ENSAIA 631, Hafnia sp
and Serratia sp, and in anaerobic conditions at 37°C for Lb. delbrueckii DSM 20081. For
antifungal activities determination, Fusarium sp. was grown in potato dextrose agar (PDA)
for 7 days at 30°C. Spores were collected in sterile distilled water and then concentrated to
produce a suspension with approximately 104 spores/ml. C. tropicalis R2 CIP203 was
grown in YP10 medium (10 g/l yeast extract, 10 g/l peptone, 100 g/l glucose, 15 ml of 2 g/
l adenine solution) at 30°C for 24 h in an orbital incubator with shaking at 200 rpm. The
TN635 strain was maintained as frozen stocks at −80°C in Man, Rogosa, and Sharpe
(MRS) broth containing 20% (v/v) glycerol. Before experimental use, the cultures were
propagated twice in MRS medium at 30°C for 12 h and the transfer inoculum was 1% (v/v).

DNA Isolation and Manipulation

Total DNA preparation from TN635 strain was carried out according to the method of
Leenhouts et al. [18] with slight modifications as described by Lee et al. [19]. Small-scale
plasmid preparations from E. coli were performed as described by Sambrook et al. [17].
Digestion with restriction endonucleases, separation of DNA fragments by agarose gels
electrophoresis, dephosphorylation with alkaline calf intestinal phosphatase, ligation of DNA
fragments, and transformation of E. coli were performed according to Sambrook et al. [17].

PCR Amplification of the 16S rRNA Gene of TN635 Strain

PCR amplification of the 16S rRNA gene of TN635 strain was performed using two specific
primers P1: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ and P2: 5′-ATGGCTCAGGAC
GAACGCT-3′. Approximately 200 ng genomic template DNA was used with 150 pmol of
each primer per 50 μl reaction volume. Amplification was performed in an automated
thermocycler (Perkin Elmer) using 1 U Pfu DNA polymerase (Stratagene) according to the
following amplification profile: 94°C (3 min) followed by 40 cycles of denaturation at 94°C
(30 s), annealing at 60°C (1 min), and extension at 72°C (3 min).
 Appl Biochem Biotechnol

DNA Sequencing and Analysis

Nucleotide sequence of the whole 16S rRNA gene of TN635 strain was determined on both
strands by an automated 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems) using specific
primers. Homology search was performed using Blast Search algorithm. The nucleotide
sequence of the whole 16S rRNA gene (1,540 pb) of TN635 strain has been assigned
GenBank (EMBL) under accession number FN252881. Multiple sequence alignment was
carried out using CLUSTAL W [20] at the European Bioinformatics Institute website
([Link] Phylogenetic analyses were performed using programs
from the PHYLIP package [21] and phylogenetic tree was constructed by the neighbor-
joining (NJ) algorithm [22] using Kimura ten-parameter distance. The robustness of the
inferred tree was evaluated by bootstrap (100 replications).

Antimicrobial Activities Determination

The ability of TN635 strain to produce diffusible metabolites was tested by the agar well
diffusion assay [23]. The diameters of the inhibition zones were measured. The bacteriocin
samples to be spotted were serially diluted twofold, and the reciprocal of the highest
inhibitory dilution was used to calculate the arbitrary activity units (AU) per milliliter. The
un-inoculated media were also tested for inhibitory zones as a control.

Effect of Different Treatments on the Antimicrobial Activity of the TN635 Strain

The indicator strains used in these experiments were: L. ivanovii BUG 496, S. enterica
ATCC43972, S. aureus ATCC 6538, E. faecalis JH 2-2 and E. faecium ENSAIA 631, and
the pathogenic fungus C. tropicalis R2 CIP203. All determinations were carried out
simultaneously three times under the same conditions. For each determination, control tests
were realized without the corresponding treatment.

Effect of Temperature and Stability at Different pH

Cultures of the TN635 strain in MRS broth under anaerobic condition were maintained at
different temperatures (25, 30, 37, and 45°C). The growth was followed by measuring the
optical density (OD) at 600 nm. Sensitivity to heat of antimicrobial compounds was
investigated by treating the 16-h culture supernatant of the TN635 strain growing at 30°C
in water bath at 45, 70, 85, and 100°C for 90 min and 2 h and by autoclaving (20 min at
121°C). In order to determine the sensitivity of the bacteriocin to pH, the supernatant of the
TN635 strain culture (30°C, 16 h incubation) was adjusted to pH levels ranging from 1 to
14 (intervals of 1.0) with sterile 1 N HCl or 1 N NaOH and kept at 4°C for 6 h. The treated
supernatants were adjusted to pH 7.0 and tested for their antimicrobial activities as
previously described.

Sensitivity to Different Enzymes and Surfactants

In order to determine the biological nature of the antimicrobial activity produced by the
strain TN635, 1 ml of the cell-free supernatant was incubated for 3 h at 37°C in the
presence of 1 mg/ml catalase (Boehringer). The untreated bacteriocin-containing cell-free
supernatant served as control. Sensitivity to proteolytic, lipolytic and α-amylase enzymes of
antimicrobial compounds was investigated by the addition of Trypsin, pronase E (Sigma),
Appl Biochem Biotechnol

Proteinase K (Boehringer), lipase A (Sigma) and α-amylase (Sigma) at final concentration

of 1 mg/ml to the culture supernatants of the TN635 strain (30°C, 16 h). The samples were
incubated for 2 h at 37°C and immediately after, the residual activity was determined as
described above. The surfactants used were Tween 20, Tween 80, urea, Triton X-100,
sodium dodecyl sulfate (SDS), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and phenyl-
methanesulfonylfluoride (PMSF) which were added to the culture supernatants of the
TN635 strain (30°C, 16 h) at a final concentration of 1% (v/v) and incubated at 30°C for
2 h. Surfactants at 1% in MRS broth were used as controls. All surfactants were prepared at
10% in water and filter-sterilized before use.

Effect of Organic Solvents

The culture supernatants of the TN635 strain (30°C, 16 h) were mixed with various organic
solvents (ethyl acetate, isopropanol and methanol) at a final concentration of 50% (v/v).
After incubation for 1 h at room temperature, the organic solvent was evaporated in a
vacuum concentrator and the residual antimicrobial activity was determined.

Bacteriocin Purification, Molecular Weight Determination, and Zymogram Analysis

Strain TN635 was inoculated (1% v/v) into 900 ml (Duran bottles, containing 900 ml of MRS
broth), and incubated without agitation at 30°C until early stationary phase (16 h)
corresponding to maximum bacteriocin production. For bacteriocin purification, proteins of
the crude supernatant fluid (CSF) were precipitated with 40, 60, and 80% saturated
ammonium sulfate, gradually added by slow stirring during 4 h at 4°C. After centrifugation at
9,000×g for 30 min at 4°C, the precipitate was suspended in 10 ml of 20 mmol/l sodium
phosphate buffer (pH 7.0) and desalted in centrifugal microconcentrators (Amicon, Inc.) with
a 10-kDa membrane cutoff. The resulting solution (3.5 ml) was loaded on a column (70×
1.5 cm) of gel filtration Sephadex G-25 equilibrated with 20 mmol/l sodium phosphate buffer
(pH 7). Elution of proteins was performed with the same buffer at 30 ml/h; 140 fractions (F1–
F140) with 5 ml each were eluted from the Sephadex G-25 column and collected
automatically. These 140 fractions detected using absorption measurements at 280 nm were
fractioned into six samples (S1–S6): S1 (F1–F40), S2 (F41–F70), S3 (F71–F76), S4 (F77–
F81), S5 (F82–F93), and S6 (F94–F140). The antimicrobial activity of the different collected
fractions was tested using L. ivanovii BUG 496, S. enterica ATCC43972, and C. tropicalis
R2 CIP203 as an indicator strains. The active fraction was then applied to a second round of
purification by a reverse-phase HPLC method using a C18 column (300×4.6 mm) at a flow
rate of 0.5 ml/min. Bacteriocin was eluted from the column with two mobile phases: A
(99.9% water, 0.1% trifluoroacetic acid “TFA”) and B (99.9% acetonitrile, 0.1% TFA); from
0 to 5 min (90% A, 10% B), from 5 to 30 min (50% A, 50% B), from 30 to 35 min (20% A,
80% B), from 35 to 50 min (10% A, 90% B) and from 50 to 60 min (90% A, 10% B).
Proteins were monitored at 280 nm. The pooled biological active fraction obtained from
HPLC elution was concentrated and stored at −20°C. The estimated molecular weight of the
purified bacteriocin was determined by SDS-PAGE according to Laemmli [24] with 20%
acrylamide gel. Protein concentration was measured using BSA as reference as described by
Bradford [25]. The used protein marker is from BioLabs with a broad range of 2–212 kDa.
To determine the apparent molecular mass of the bacteriocin, the gel was cut into two vertical
parts after SDS-PAGE. The part of the gel containing the sample and the protein marker was
stained with 0.25% Coomassie brilliant blue R-250 (BioRad), while the remaining part,
containing only the sample, was washed in 10 mmol/l phosphate buffer (pH 7) for 4 h, then
 Appl Biochem Biotechnol

fixed and used for direct detection of antimicrobial activity by overlaying with LB soft agar
containing 100 μl of a 5 h culture of L. ivanovii BUG 496.

Mode of Action of BacTN635

For this realization, we have used two indicator microorganisms: L. ivanovii BUG 496 and
C. tropicalis R2 CIP203. Partially-purified BacTN635 (the fraction obtained from gel
filtration chromatography and freeze-dried) at 400 AU/ml, was added to 200 ml LB culture
of L. ivanovii BUG 496 and 200 ml YP10 of C. tropicalis R2 CIP203 at in early
exponential phase (107 colony-forming units (CFU)/ml). The two indicator microorganisms
growing in LB (L. ivanovii BUG 496) and YP10 (C. tropicalis R2 CIP203) in the absence
of bacteriocin were used as controls. Changes in the turbidity of the cultures were recorded
at an O.D. of the 600 nm and the number of CFU was determined by plaiting the samples
on LB or YP10 agar.

Results and Discussion

Screening of LAB Strains Producing Bacteriocin

During previous works (data not shown), a collection of 54 LAB strains were isolated from
several isolates (meat, fermented vegetables, and dairy products). We have tested these
bacteria for their capacity to produce antimicrobial activities against the following indicator
microorganisms: Lb. casei DSM 20011, L. ivanovii BUG 496, S. enterica ATCC43972,
Fusarium sp., and C. tropicalis R2 CIP203. As shown in Table 1, different profiles of
inhibition were observed. Nine strains (TN600, TN606, TN615, TN618, TN623, TN627,
TN635, TN644, and TN653) were characterized by the broad-spectrum inhibition. These
nine isolates were tested for their capacity to inhibit the growth of other microorganisms
(Table 2). The largest spectrum of inhibition was showed by TN635 strain which inhibited
all used indicator microorganisms. Moreover, the active molecule(s) of the TN635 strain
presents the highest inhibitory effect against all tested microorganisms including the
pathogenic Gram-positive bacteria (L. ivanovii BUG 496, S. aureus ATCC 6538, E. faecalis
JH 2-2 and E. faecium ENSAIA 631), the four pathogenic Gram-negative bacteria (S.
enterica ATCC43972, P. aeruginosa ATCC 49189, Hafnia sp. and Serratia sp.), and the
pathogenic fungus C. tropicalis R2 CIP203. Since bacteriocins often have a narrow killing
spectrum and inhibit only bacteria closely related to those from which they have been
formed, bacteriocins from Gram-positive bacteria are generally not effective against Gram-
negative bacteria and have no effect with yeasts and fungi [26, 27]. The search for new
bacteriocins with a wider spectrum of activity which can be used in human health,
agriculture, and the food industry is being studied by several research groups. According to
its large inhibitory spectrum, our finding, BacTN635 of the new isolated TN635 strain, may
be of applied interest as food preservation and/or in the protection of human health.

Identification and Phylogenetic Analysis of TN635 Strain

Using the two specific primers: forward P1: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ and

reverse P2: 5′-ATGGCTCAGGACGAACGCT-3′ and the TN635 strain genomic DNA as
template, we have amplified by PCR a DNA fragment having an expected size of
approximately 1,500 pb. After purification, this DNA fragment was cloned in the pGEM-T
Appl Biochem Biotechnol

Table 1 Inhibitory spectrum (zone of inhibition/mm) of the isolated 54 LAB (TN600- TN653) against Lb.
casei DSM 20011, L. ivanovii BUG 496, S. enterica ATCC43972, [Link], and C. tropicalis R2
CIP203: L (listeria); Lb (Lactobacillus); C (Candida).

Isolates Indicator microorganisms

Lb. casei L. ivanovii S. enterica Fusarium sp. C. tropicalis

DSM 20011 BUG 496 ATCC43972 R2 CIP203

TN600 6 12 22 14 8
TN601 – 7 – – –
TN602 – – – – –
TN603 8 – – – 6
TN604 – – – 8 8
TN605 10 16 7 7 –
TN606 7 18 16 16 9
TN607 6 5 – – –
TN608 8 8 8 – –
TN609 9 – 7 8 –
TN610 – 13 15 – –
TN611 – – – – –
TN612 – – – – –
TN613 9 17 10 – 8
TN614 – 6 7 8 15
TN615 7 6 18 19 5
TN616 8 – – 16 –
TN617 – – – 18 –
TN618 8 14 16 18 9
TN619 8 7 – 10 –
TN620 7 16 – – –
TN621 6 – – 20 –
TN622 – 7 5 – 6
TN623 7 20 18 17 19
TN624 8 8 7 7 –
TN625 7 6 17 – –
TN626 – – – – –
TN627 8 9 12 14 10
TN628 – – 6 16 –
TN629 7 – – 6 –
TN630 9 9 – 6 6
TN631 – 18 17 9 –
TN632 – 8 8 – –
TN633 9 – – – 7
TN634 6 – 7 7 –
TN635 9 22 21 23 21
TN636 9 6 – 7 –
TN637 8 7 – 15 –
TN638 7 – 7 16 –
TN639 – 7 7 18 7
 Appl Biochem Biotechnol

Table 1 (continued).

Isolates Indicator microorganisms

Lb. casei L. ivanovii S. enterica Fusarium sp. C. tropicalis

DSM 20011 BUG 496 ATCC43972 R2 CIP203

TN640 7 7 8 6 –
TN641 – 16 17 – 15
TN642 6 – – 16 –
TN643 – 6 7 17 6
TN644 7 16 6 22 6
TN645 6 7 8 – –
TN646 – – – 18 7
TN647 7 – 6 8 –
TN648 8 8 – 18 –
TN649 – – 8 16 6
TN650 – 16 – 17 17
TN651 6 – 7 7 6
TN652 – 8 – 12 7
TN653 7 16 17 18 8

Table 2 Inhibitory spectrum (zone of inhibition/mm) of TN600, TN606, TN615, TN618, TN623, TN627,
TN635, TN 644 and TN653 strains against Gram-positive and Gram-negative bacteria, LAB and fungi: L
(listeria); Lb (Lactobacillus); Lc (Lactococcus); C (Candida).

Indicator strains TN600 TN606 TN615 TN618 TN623 TN627 TN635 TN644 TN653

Gram-positive bacteria
M. luteus LB 14110 23 14 6 14 14 6 23 14 11
S. aureus ATCC 6538 12 15 16 14 9 16 22 21 8
L. ivanovii BUG 496 12 18 6 16 20 9 22 16 16
E. faecalis JH 2-2 6 18 8 – 15 16 22 7 8
E. faecium ENSAIA 631 6 14 7 – 14 14 21 8 6
Gram-negative bacteria
E. coli ATCC 8739 5 22 13 15 15 23 22 13 22
S. enterica ATCC43972 22 16 18 16 18 12 21 6 17
P. aeruginosa ATCC 49189 22 16 6 9 14 9 22 8 9
Hafnia sp. 5 15 6 13 24 6 24 5 7
Serratia sp. 12 6 12 15 21 7 23 8 9
LAB
Lb. Casei DSM 20011 6 7 7 8 7 8 9 7 7
Lb. delbrueckii DSM 20081 – 6 8 – – 9 9 6 –
Lb. Sakei 2525 – 6 7 – 7 6 9 – –
Lc. lactis ATCC 11454 – – 6 5 6 7 9 – 9
Lc. lactis cremoris DSM 11603 – – 5 7 7 9 8 – 8
Fungi
Fusarium sp. 14 16 19 18 17 14 23 22 18
C. tropicalis R2 CIP203 8 9 5 9 19 10 21 6 8
Appl Biochem Biotechnol

Easy vector, yielding the pSS1 plasmid. Total nucleotide sequence of 1,540 pb (accession
number FN252881) of the whole 16S rRNA gene of strain TN635 was determined in both
strands. The alignment of this sequence through matching with reported 16S rRNA gene
sequences in gene bank shows high similarity (97–99%) to the Lactobacillus 16S rRNA
genes. The organism most similar to the new isolate TN635 strain was L. plantarum NRIC
0383 (Fig. 1). Based on the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of the TN635 strain
and the phylogenetic analysis, we propose the assignment of our new isolate bacterium as
L. plantarum sp. TN635 strain.

Growth and Bacteriocin Production

To test the effect of incubation temperature on cell growth and antimicrobial activity
production, cultures of the L. plantarum sp. TN635 strain in MRS broth under anaerobic
conditions were maintained at different temperatures (25, 30, 37, and 45°C). The growth
was followed by measuring the OD at 600 nm and the antimicrobial activity was
determined against the three indicator microorganisms: L. ivanovii BUG 496, S. enterica
ATCC43972, and C. tropicalis R2 CIP203. Aliquots were withdrawn at 3 h time intervals.
Obtained results show that the secretion of biological activity is correlated with biomass
production. Highest growth and antimicrobial activity were obtained at 30°C (Fig. 2). We
can deduce that the extracellularly antimicrobial activity was produced in the logarithmic
growth phase and the production profile was a typical growth associated patter. The
maximum antimicrobial activity was detected 16 h after incubation. This activity remains
stable between 13 and 20 h and then gradually decreased.

88

6
24
18 88
51
40
95
53

4 76
66 94

92

10
1
10

Fig. 1 Phylogenetic trees derived from 16S rDNA sequence of L. plantarum sp. TN635 strain. All the
sequences used here were from LAB type strains
 Appl Biochem Biotechnol

35 8

7
30
Inhibitory Zone Diameter (mm)

6
25

OD600 nm
20
4
15
3

10
2

5 1

0 0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Incubation time (h)

Fig. 2 BacTN635 production during growth of L. plantarum TN635 in MRS broth at 30°C. (filled square)
Optical density at 600 nm; activities of BacTN635 against C. tropicalis R2 CIP203 (filled upright triangle);
against S. enterica ATCC43972 (filled circle), and against L. ivanovii BUG 496 (filled diamond) were
measured by diameter (mm) of zone of inhibition

Effects of Enzymes, Heat, pH, Surfactants and Organic Solvents

Enzymatic tests showed that the antimicrobial activity against the three tested indicator
microorganisms, L. ivanovii BUG 496, S. enterica ATCC43972, and C. tropicalis R2
CIP203, of the supernatant culture of the L. plantarum sp. TN635 strain was not affected by
the addition of catalase, indicating that the observed growth inhibition was not due to
hydrogen peroxide production. In contrast, treatment with the proteolytic enzymes (Trypsin,
pronase E, and Proteinase K) caused complete inactivation of the antimicrobial compounds,
which therefore identified them as proteinaceous substances. The sensitivity of the
inhibitory compounds to heat treatment showed that inhibitory activity was not significantly
altered by boiling for 90 min showing that the antagonistic activity of the culture
supernatant is heat-resistant. The activity of the sample was insensitive to lipase and α-
amylase, which eliminates the possibility that synthesized active compounds are included in
the group of complex biologically active substances containing a lipid or carbohydrate
component [28]. Concerning the sensitivity to pH, the supernatant culture of the Lb.
plantarum sp. TN635 (30°C, 16 h incubation) was adjusted to pH levels ranging from 1 to
14 (intervals of 1.0). The obtained results show that bacteriocin activity was highest when
the pH of the supernatant was between 3 and 11, with an optimum at pH 7. About 50%
activity was maintained at pH 12 and was completely inactivated above pH 12. Exposure to
surfactants caused about 15% inactivation of the antimicrobial activity for the SDS agent
and about 40% for the other tested surfactants (Tween 20, Tween 80, Triton X-100, Urea,
EDTA, and PMSF). Concerning the treatment with organic solvents (ethyl acetate,
methanol, and isopropanol), no significant alteration of the BacTN635 activity was
observed.
Appl Biochem Biotechnol

3,5 S5
3

2,5
OD280nm

1,5

0,5

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
Fraction number

Fig. 3 Purification of BacTN635 by cation-exchange chromatography using Sephadex G-25 monitoring by

absorbance at 280 nm (filled square)

Bacteriocin Purification and Molecular Weight

BacTN635 was purified to homogeneity from a cell-free culture supernatant of Lb.

plantarum sp. TN635 strain by a four-step protocol. Maximum antimicrobial activity was
obtained when the cell-free culture supernatant was precipitated with 80% ammonium
sulfate. One hundred forty fractions (F1–F140) with 5 ml each were eluted from a
Sephadex G-25 column. These 140 fractions detected using absorption measurements at
280 nm were fractioned into six samples (S1–S6). After concentration, the antagonistic
activity of each sample was essayed using L. ivanovii BUG 496, S. enterica ATCC43972,
and C. tropicalis R2 CIP203 as indicator microorganisms. Only sample S5 (F82–F93)
possesses inhibitory activity against the three tested cells (Fig. 3). Sample S5 was then
applied to another round of purification using the HPLC technique. Three well-defined

1.0

P3
39.317
Absorbance (AU) at 280 nm

0.5

P2
38.3 83

P1
34.550
18.500

31.133

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Retention time (min)
Fig. 4 Elution profile of bacteriocin using HPLC reverse-phase chromatography on C18 column monitoring
by absorbance at 280 nm
 Appl Biochem Biotechnol

Table 3 Purification of BacTN635 produced by Lactobacillus plantarum sp. TN635 strain.

Step Volume Total activity Total Specific activity Purification Yield

(ml) (AU)a protein (mg) (AU/mg) fold %

Culture supernatant 900 45×105 2,160 2,083 1 100

Ammonium sulfate precipitation 50 5.2×105 52.5 9,904 4.75 11.55
Microconcentrators 32 3.32×105 23.2 14,310 6.87 7.38
Gel filtration 3.5 2.25×105 1.54 146,104 70.14 5
HPLC 0.7 1.125×105 0.57 197,368 94.75 2.5

a
Antibacterial activity (in arbitrary units [AU]) was assayed by agar well diffusion assay using L. ivanovii
BUG 496 as an indicator strain

peaks (P1–P3) were obtained having, respectively, the following retention times: P1:
34.55 min, P2: 38.38 min, and P3: 39.31 min (Fig. 4). Only the fraction of the peak P3
possesses an antimicrobial activity against the three tested microorganisms mentioned
above and no activity has been observed for the two other fractions. The yield, activity, and
purification fold of the BacTN635 of the four various purification steps were summarized in
Table 3. SDS-PAGE analysis of the purified BacTN635, revealed a single band with an
estimated molecular mass of approximately 4 kDa indicating that this bacteriocin had been
purified to homogeneity (Fig. 5a). Antibacterial activity determination against L. ivanovii
BUG 496 strain, reveals a growth inhibitory zone at the same position than that visualized
in the stained gel (Fig. 5b). During the last few years, a large number of new bacteriocins
produced by LAB bacteria have been identified and characterized. However, a few
bacteriocins produced by this species have been reported to be active against Gram-
negative bacteria and particularly against fungi. Most of the described bacteriocins as
antifungal agents from Lactobacillus are organic compounds or diketopiperazine
derivatives with low molecular mass, lower than 1 kDa [29]. Too rare are the bacteriocins
described from LAB bacteria with a molecular mass higher than 1 kDa and having
antifungal activities [30].

Fig. 5 Electrophoretic and zy- MM

mogram analyses of the purified 1 2 1
BacTN635. Coomassie brilliant
(kDa)
blue R-250 stained SDS-PAGE
gel. Lane 1 molecular mass 55.6
markers; lane 2 purified 42.7
BacTN635 (a). Portion of the
renaturated SDS-PAGE, overlaid 34.6
with LB soft agar containing L. 27.0
ivanovii BUG 496 (b)
20.0

14.3

6.5
3.4

a b
Appl Biochem Biotechnol

Mode of Action of the BacTN635

The addition of partial purified BacTN635 (the fraction obtained from gel filtration
chromatography and freeze-dried) at 400 AU/ml, to cells of L. ivanovii BUG 496 (3 h old)
and C. tropicalis R2 CIP203 (10 h old) in their early logarithmic growth phase, resulted in a
rapid decrease in the number of L. ivanovii BUG 496 viable cells (from 107 CFU/ml to less
than 10 CFU/ml) over a period of 5 h (Fig. 6a). The optical density readings of this
indicator microorganism remained constant since the addition of the BacTN635 (Fig. 6a).
These results indicate that the studied bacteriocin exhibits bactericidal effect against L.
ivanovii BUG 496 strain. Concerning the C. tropicalis R2 CIP203, the optical density
readings were very similar in presence and absence of BacTN635 (Fig. 6b). However, we
notice an increase of the number of viable cells grown in the absence of the bacteriocin at

a
10 1.5
Addition of BacTN635
9
8 1.2
Log10 (CFU ml-1)

7
6 0.9

OD 600nm
5

4 0.6
3
2 0.3
1

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Incubation time (h)

b 9.5 5
4.5
9 Addition of BacTN635
4
Log10 (CFU ml-1)

8.5 3.5
OD 600nm

8 3
2.5
7.5 2
7 1.5
1
6.5
0.5
6 0
0 4 8 10 12 16 20 24 28 32 36 40 44

Incubation time (h)

Fig. 6 The effect of BacTN635 on the growth of L. ivanovii BUG 496. Optical density at 600 nm in absence
(▲) and in presence (■) of BacTN635. Viable cell counts (CFU/ml) in absence (♦) and in presence (■) of
BacTN635 (a). The effect of BacTN635 on the growth of C. tropicalis R2 CIP203. Optical density at 600 nm
in absence (♦) and in presence (▲) of BacTN635. Viable cell counts (CFU/ml) in absence (□) and in
presence (■) of BacTN635 (b)
 Appl Biochem Biotechnol

40 h of growth (Fig. 6b). These data indicate that BacTN635 acts with a fungistatic effect
against C. tropicalis R2 CIP203.

Conclusions

A new LAB strain has been selected for its antimicrobial activity against pathogenic Gram-
negative bacteria and fungi. Based on the analysis of the nucleotide sequence (1,540 pb) of
the whole 16S rRNA gene (accession no: FN252881) and the phylogenetic study, we
propose the assignment of our new isolate bacterium as Lb. plantarum sp. TN635 strain.
The antimicrobial compound of this strain was determined as a proteinaceous substance.
The maximum bacteriocin-like substance (BacTN635) production (5,000 AU/ml) was
recorded after a 16-h incubation in MRS medium at 30°C. BacTN635 was stable to heat
and to treatment with surfactants and organic solvents. Highest antimicrobial activity was
found between pH 3 and 11 with an optimum at pH=7. The purified BacTN635, revealed a
single band with an estimated molecular mass of approximately 4 kDa. BacTN635
produced by Lb. plantarum sp. TN635 strain, may possess potential practical applications,
since it was able to inhibit important Gram-negative pathogenic bacteria such as (S.
enterica ATCC43972, P. aeruginosa ATCC 49189, Hafnia sp., and Serratia sp.) and
pathogenic fungi such as C. tropicalis R2 CIP203. S. enterica is an important cause of
human salmonellosis and food-poisoning associated with consumption of contaminated
chicken eggs and poultry products [31]. P. aeruginosa is an opportunistic pathogen of
humans. It causes urinary tract infections, respiratory system infections, gastrointestinal
infections, and a variety of systemic infections, particularly in patients with severe burns
and in cancer and AIDS patients who are immunosuppressed [32]. Serratia and Hafnia sp.
are usually found in the intestinal tract. These pathogenic bacteria cause s wide variety of
infections primarily pneumonia, wound, and urinary tract infections. Moreover, it should be
noted that the number of patients with fungal infections has been rising in recent years. In
addition to the species Candida albicans and Candida stellatoidea, C. tropicalis is one of
the significant pathogenic yeasts in humans belonging to the genus Candida [33].

Acknowledgments This work was supported by the Tunisian government (Contract Program CBS-LEMP)
and the CMCU project (2006-2008) No 06/S 0901 “MELLOULI/AIGLE”. We are grateful to Dr. M.
Ferchichi for providing the indicator bacteria.

References

1. Alisky, J., Iczkowski, K., Rapoport, A., & Troitsky, N. (1998). Journal of Infection, 36, 5–15.
2. Macfarlane, G. T., & Cummings, J. H. (2002). Current Opinion in Infectious Diseases, 15, 501–506.
3. Papagianni, M. (2003). Biotechnology Advances, 21, 465–499.
4. Twomey, D., Ross, R. P., Ryan, M., Meaney, B., & Hill, C. (2002). Antonie Van Leeuwenhoek, 82,
165–18.
5. Brooks, G. F., Butel, J. S., & Morse, S. A. (1998). Jawetz, Melnick, and Adelberg’s medical
microbiology (p. 269). Upper Saddle River, New Jersey, USA: Appleton & Lange.
6. Settanni, L., & Corsetti, A. (2008). International Journal of Food Microbiology, 121, 123–138.
7. Nawaz, S. K., Riaz, S., Riaz, S., & Hasnain, S. (2009). African. J. Biotechnol., 8, 365–368.
8. Hammami, I., Rhouma, A., Jaouadi, B., Rebai, A., & Nesme, X. (2009). Letters in Applied
Microbiology, 48, 253–260.
Appl Biochem Biotechnol

9. Diop, M. B., Dubois-Dauphin, R., Tine, E., Ngom, A., Destain, J., & Thonart, P. (2007). Biotechnology,
Agronomy, Society and Environment, 11, 275–281.
10. Paul, R. R., Morgan, S., & Hill, C. (2002). International Journal of Food Microbiology, 79, 3–16.
11. Messi, P., Bondi, M., Sabia, C., Battini, R., & Manicardi, G. (2001). International Journal of Food
Microbiology, 64, 193–198.
12. Todorov, S. D., & Dicks, L. M. (2004). Journal of Basic Microbiology, 44, 305–316.
13. Todorov, S. D., & Dicks, L. M. (2005). Enzyme and Microbial Technology, 36, 318–326.
14. Todorov, S. D., Nyati, H., Meincken, M., & Dicks, L. M. T. (2007). Food Control, 18, 656–664.
15. Hanahan, D. (1983). Journal of Molecular Biology, 16, 557–580.
16. Janssen, G. R., & Bibb, M. J. (1993). Gene, 124, 133–134.
17. Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual (2nd ed.).
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
18. Leenhouts, K. J., Kok, J., & Venema, G. (1990). Applied and Environmental Microbiology, 56, 2726–
2735.
19. Lee, C. M., Sieo, C. C., Abdullah, N., & Ho, Y. W. (2008). FEMS Microbiology Letters, 287, 136–141.
20. Thompson, J. D., Higgins, D. G., & Gibson, T. J. (1994). Nucleic Acids Research, 22, 4673–4680.
21. Felsenstein, J. (1989). PHYLIP-Phylogeny Inference Package, version 3.2. Cladistics, 5, 164–166.
22. Saitou, N., & Nei, M. (1987). Molecular Biology and Evolution, 4, 406–425.
23. Tagg, J. R., & McGiven, A. R. (1971). Applied Microbiology, 21, 943.
24. Laemmli, U. K. (1970). Nature, 227, 680–685.
25. Bradford, M. M. (1976). Analytical Biochemistry, 72, 248–254.
26. Karunasagar, I., Krohne, G., & Goebel, W. (1993). Infection and Immunity, 61, 162–169.
27. Atanassova, V., Meindl, A., & Ring, C. (2001). International Journal of Food Microbiology, 68, 105–
113.
28. Aktypis, A., Kalantzopoulos, G., Huis IN’T Veld, J. H. J., & Ten Brink, B. (1998). Journal of Applied
Microbiology, 84, 568–576.
29. Lavermicocca, P., Valerio, F., Evidente, A., Lazzaroni, S., Corsetti, A., & Gobbetti, M. (2000). Applied
and Environmental Microbiology, 66, 4084–4090.
30. Atanassova, M., Choiset, Y., Dalgalarrond, D., Chobert, J. M., Dousset, X., Ivanova, I., et al. (2003).
International Journal of Food Microbiology, 8, 63–73.
31. Erich, L., & Martin, J. (1997). Antimicrobial food additives, characteristics, uses, effects (2nd Ed.).
Translated by S.F. Laichena Berlin: Springer.
32. Wiblin, R. T. (1997). Nosocomial pneumonia. In R. P. Wenzel (Ed.), Prevention and control of
nosocomial infections (3rd ed., pp. 807–819). Baltimore: Williams and Wilkins.
33. Kobayashi, H., Matsuda, K., Ikeda, T., Suzuki, M., Takahashi, S., Suzuki, A., et al. (1994). Infection and
Immunity, 62, 615–622.
 Résumé :
Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés aux études taxonomiques
des deux souches TN17 et Fr10 qui sont deux nouvelles espèces du genre Streptomyces dont
nous avons proposé les nomenclatures suivantes : Streptomyces lilaceus sp. TN17 et
Streptomyces microflavus sp. Fr10.
A partir de la souche Streptomyces lilaceus sp. TN17, trois molécules on été purifiées
et identifiées par le biais de plusieurs techniques spectroscopiques, il s’agit d’un dérivé de
DKP (L-Leu, L-Arg), un dérivé de phtalate le di-(2-éthylhexyl) phtalate et un tértrapeptide
cyclique : le 1 - [2 -(cyclopentanecarbonyl-3-phenylpropionyl] - pyrrolidine-2-carboxylique
(1-carbamoyl-propyl)-amide. Ces trois molécules présentent des activités antibactériennes et
antifongiques.
Suite au criblage des souches de bactéries lactiques productrices de bactériocines de la
collection de notre laboratoire et leurs caractérisations, nous avons identifié une nouvelle
souche de Lactobacillus nommée Lactobacillus plantarum sp.TN635 qui produit une
bactériocine « BacTN635 » de 3,8 KDa. Cette dernière a été purifiée à homogénéité, elle
possède un spectre d’action très large contre les bactéries à Gram+, à Gram- et contre les
champignons filamenteux et unicellulaires. BacTN635 a un effet bactéricide contre Listeria
ivanovii BUG 496 et fongistatique contre Candida tropicalis R2 CIP203.

Mots clés : Streptomyces, taxonomie, structure chimique, Lactobacillus plantarum sp

TN635, bactéricocine, purification.

Abstract :

In This Thesis, we are interested in taxonomic studies of two strains TN17 and Fr10
which are two new species of the genus Streptomyces, and we have proposed the following
names: Streptomyces lilaceus sp. TN17 and Streptomyces microflavus sp. Fr10.

From Streptomyces lilaceus strain sp. TN17, three molecules have been purified and
identified by means of several spectroscopic techniques, it is a derivative of DKP (L-Leu, L-
Arg), a derivative of phthalate di-(2-ethylhexyl) phthalate and cyclic peptide 1 - [2 -
(cyclopentanecarbonyl-3-phenylpropionyl] - pyrrolidine-2-carboxylic acid (1-carbamoyl-
propyl)-amide. All three molecules exhibit antibacterial and antifungal activities.

A novel strain of lactic acid bacteria was isolated and characterized from a collection
of our laboratory. It’s identified as a new strain of Lactobacillus, named Lactobacillus
plantarum sp.TN635 producing a new bacteriocin "BacTN635" of 3.8 kDa, purified to
homogeneity and spectrum with a very broad action against Gram + and Gram-, filamentous
and unicellular fungi. BacTN635 has a bactericidal effect against Listeria ivanovii BUG 496
and fungistatic against Candida tropicalis R2 CIP203.

Key-words: Streptomyces, taxonomy, chemical structure, Lactobacillus plantarum sp TN635,

bacteriocin, purification