Faculté des Sciences de la Nature et la vie / Département de biotechnologie
Nom : Boudjemai
Prénom : Mohammed
L3 Biologie Moléculaire
DIFFÉRENCES entre les MICRO-ARN et Arni ET Comparaison des
deux type d ampliphication de séquençage haut débit
Plan de Travail
A/DIFFÉRENCES entre les MICRO-ARN et Arni
1/ DIFFÉRENCES entre les MICRO-ARN et Arni
2/ Mécanisme d’action des siARN Arni médiée (exogène)
3/ Mécanisme d’action de miRNA véhiculée par Arni (endogène)
B/Comparaison des deux type d ampliphication de séquençage haut
débit
1/Comparaison entre la préparation des 2 Amplification
a/La technologie 454 (Émulsion)
b/La technologie Illumina/Solexa
2/Comparaison des deux type d ampliphication
1/DIFFÉRENCES entre les MICRO-ARN et Arni
L’interférence d’ARN double brin dans la traduction est un mécanisme qui peut être médié par deux
molécules distentas : miRNA (micro-ARN) et siRNA (petits ARN interférents, anglais).
Les micro-ARN est des produits naturels de la transcription chez les eucaryotes beaucoup. Ils sont
environ 70 nucléotides qui sont complémentaires entre eux, formant une pince.
Le siARN dérivées de molécules d’ARN double-brin long d’origine exogène (comme celles de virus à
ARN).
La figure montre l’enzyme DICER briser cette cassette longtemps endogène, formant ainsi, petite
siRNA
A/Mécanisme d’action des siARN Arni médiée (exogène)
Comme le montre la figure précédente, l’enzyme DICER coupe le ruban en petits fragments, avec 2
bases sur chaque bande, appelée, puis d’Arndb. Chaque groupe de vie a DICER différent. Chez les
mammifères, un seul type de DICER, chez la drosophile, deux, par exemple.
Les petits fragments d’Arndb sont ensuite chargés dans un complexe enzymatique formé par l’enzyme
Argonauta et certaines autres enzymes, comme une hélicase et une enzyme dont le domaine linker
dsRNA, appelé R2D2. Tout comme il est la forme complexe un Ribosome, traduction du RNA en
protéines, là c’est complexe pour la traduction.
L’un des sous-unités prend une des bandes et l’autre ARN. Il existe un mécanisme de l’instabilité dans
la région 5 dsRNA ´, qui favorise la permanence de la cassette supplémentaire dans le complexe (c’est
toujours à l’étude). La connexion entre le ruban et l’enzyme est Qu'argonauta du complexe est très
forte. Cette association est alors appelée le RISC complexes.
Maintenant il y aura un appariement entre le ruban à l’intérieur du complexe RISC et l’ARNm.
Si l’appariement se produit dans son intégralité (sans partie de restes de l’ARNm sans paire), le
complexe RISC dégrader l’ARNm.
Si l’appariement se produit partiellement, l’ARNm est déstabilisé. Dans cette condition, l’ARNm
déstabilisé peut être branchés aux soi-disant traitement corps (corps-P: citosólicas structures
responsables de la dégradation de l’ARNm). Dans les deux cas, il n’y aura aucun traduction en
protéine.
N’oubliez pas ces bandes de siARN qui ont été ignorés par le complexe RISC. Ils devrait être dégradés
par les enzymes de ribonucléases 3' -5 ' ou « -3' 5 RNAses selon le cas. Mais il peut y avoir une autre
transformation : il peut être transformé en double brin par RNApolimerase ARN-dépendante. Ainsi,
peut être disponible pour l’enzyme DICER, augmentant par ordre progressif.
B/Mécanisme d’action de miRNA véhiculée par Arni (endogène)
Le gène de miRNA formation conduit à la formation d’une protéine, ni a la configuration typique d’un
gène, en plus d’être trop petit. Depuis plusieurs années, resta inconnue mécanisme d’interférence
RNA. Quand un gène est transcrit, se traduit par une longue chaîne de séquences d’ARN qui sont
complémentaires dans sa propre prison, lui faisant plier et sécurisé, formant un clip, ou pinces
diverses, selon la quantité de répétitions de séquences qui sont complémentaires .
L’enzyme DROSHA qui se trouve dans le noyau s’attache à ces clips, ce qui les rend indépendant de
la chaîne de RNA qui a généré. Ces fragments seront transférés vers le cytoplasme où l’enzyme
DICER commence le complexe semblable à celle rapportée avec le siARN
1/Comparaison entre la préparation des 2 Amplification
a/La technologie 454 (Émulsion)
• Fractionnement aléatoire de l’ADN de l’échantillon à analyser en morceaux de 300 à 800 pb pour
obtenir une banque d’ADN simple brin matrice.
• Préparation en ajoutant des adaptateurs spécifiques des extrémités 3' et 5’.
• Immobilisation de chaque brin sur une bille. Un fragment d’ADN = une bille.
• Émulsion des billes avec les produits d’amplification dans un mélange eau-huile. Création de
microréacteurs contenant une seule bille.
• PCR en émulsion. Amplification de chaque séquence dans son microréacteur. Amplification de toute
la banque en parallèle. Plusieurs millions de copies par bille.
• Purification et chargement des fragments sur plaque. Le diamètre des puits ne permet qu’une seule
bille à la fois.
• Ajout des enzymes de séquençage et envoi des nucléotides individuels les uns après les autres.
• Les bases complémentaires du brin matrice s’ajoutent une ou plusieurs à la fois.
• Le signal chimie luminescent est enregistré par une caméra CCD.
• Séquençage par synthèse avec émission de lumière, on parle de pyroséquençage
La lecture est effectuée en simultanée sur plusieurs bases incorporées. Le « flowgram » est alors lu
pour obtenir la séquence.
• On obtient : - 400 000 lectures ; - chacune de 250 bases ; - 100 Mb par run.
• Les erreurs majeures de séquences proviennent avec cette méthode des homopolymères.
b/La technologie Illumina/Solexa
• Génération d’une banque d’ADN double brin à partir de l’échantillon à analyser par fractionnement
aléatoire en morceaux de 200 pb.
• Ajout d’adaptateurs spécifiques aux extrémités.
• Dénaturation de l’ADN en simple brin.
• Fixation de l’extrémité des simples brins aléatoirement à la surface du « flowcell ».
• PCR « bridge » en phase solide. Création d’un double brin. Dénaturation et création de groupes
(clusters) denses où les fragments sont amplifiés.
• Le premier cycle de séquençage commence en ajoutant les 4 terminateurs réversibles marqués, les
amorces et l’ADN polymérase.
• Après excitation par un laser, la fluorescence émise par chaque cluster est récupérée et la première
base est lue.
• Le cycle suivant continue en ajoutant les 4 terminateurs réversibles marqués.
• Après excitation l’image est acquise de la même façon et la deuxième base est lue.
• Les cycles de séquences sont répétés pour lire chaque base les unes après les autres.
• La lecture est effectuée à chaque position sur toutes les séquences en parallèle.
• On obtient : - 45 000 000 de lectures ; - chacune de 36 bases ; - 1 Gb par run.
• Les erreurs majeures de séquences proviennent d’erreur de séquençage (99%)
2/Comparaison des deux type d ampliphication
La technologie 454 (Émulsion) La technologie Illumina
chemistry Reversible terminators
Pyrosequencing standard
Fragment
Run time 7 hours 3 days
Read lengths(pb) 250 35,50
[Link] per Run 400k 85*1000000
Date per Run 100MB Up to 4,3 GB
Troughtput 100 MB 1,4 GB/Day
Passer à la langue suivante : anglaisChromas est un visualiseur de traces
gratuit destiné aux projets simples de séquençage d’ADN ne nécessitant pas
l’assemblage de séquences multiples. Chromas présente les caractéristiques
suivantes:
Ouvre les fichiers de chromatogramme .ab1 des séquenceurs d’ADN d’Applied
[Link] Les fichiers de chromatogramme de format SCF et ZTR
créés par d’autres séquenceurs ou extraits de bases de donné[Link]
au format .scf ou Applied Biosystems au format .[Link] un
chromatogramme avec des options permettant d’agrandir ou de zoomer sur
une page. Suppression automatique des séquences de faible qualité (lorsque
les données de qualité sont disponibles) ou des séquences de
[Link] des séquences au format texte brut, FASTA, FASTQ, EMBL,
GenBank ou GCG, ou formatées avec une numérotation de base pour la
pré[Link] la séquence dans le presse-papier en texte brut, au
format FASTA ou FASTQ pour le coller dans d’autres applications.Réversez et
complétez la séquence et le [Link] les sous-séquences
par correspondance exacte ou alignement [Link] les traductions
dans 3 cadres avec la sé[Link] une image d’une section de
chromatogramme pour coller dans des documents ou des présentations.
Traitement par lots, y compris conversion de format, exportation de
séquences avec suppression de vecteurs, impression et exportation en lots de
données brutes. 1 fichiers utilisant le composant RP PeakTrace de Nucleics Pty
Ltd pour améliorer la lisibilité des pics et extraire davantage de bases de
haute qualité.
Résultat Web avec des liens annexes
Google Traduction
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Ce service gratuit de Google traduit instantanément des mots, des
expressions et des pages Web du français vers ...
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