Chromatographie gazeuse (CPG) –

en pratique
S. Caspar-Bauguil, S. Allenbach, J. Garcia

1) Principes de séparation en CPG n° diapo

a) Différents processus de séparation D2-3
b) Facteurs théoriques de séparation D4-6
c) Amélioration de la résolution-influence D7-8
des facteurs de séparation

2) Description d’un appareillage de CPG D9-10

3) Définition des paramètres en CPG

a) Choix de la colonne- plateaux D11-15
théoriques- test de résolution
b) Choix du gaz vecteur D16
c) Influence de la température du four D17-20
et de la pression du gaz vecteur
d) Choix T° injecteur et détecteur D21

4) Intérêt de la CPG en analyse qualitative et quantitative D22

5) Exemple de séparation de molécules biologiques en CPG:

les acides gras des phospholipides
a) Généralités sur les acides gras D23-26
b) Principe du dosage D27-30
c) Interprétation des résultats D31

Différents chromatogrammes D32-36

Mise à jour Mars 2012

1) Principes de séparation en CPG
a) Différents processus de séparation
La CPG est une méthode de séparation de substances volatiles ou gazeuses qui
permet aussi de déterminer leurs proportions dans les mélanges.
Le principe de la chromatographie en phase gazeuse ou CPG est le partage de
l’échantillon à analyser entre deux phases: une phase mobile gazeuse et une phase
stationnaire liquide ou solide.

df ou dp est l’épaisseur du film de la phase

I.D. est le diamètre interne
O.D. est le diamètre externe

D2
Le partage d’une phase gazeuse mobile et d’une phase stationnaire liquide ou
solide a donné naissance a deux techniques: la chromatographie gaz-liquide (GLC)
et la chromatographie gaz-solide (GSC). Ces deux techniques ont été largement
appliquées dans les colonnes remplies. L’introduction des colonnes capillaires a
permis de mettre en œuvre une chromatographie en phase gazeuse de très haute
résolution.
Dans notre laboratoire, la phase stationnaire est un liquide uniformément réparti
sous forme de pellicule mince sur un support inerte de grande surface spécifique.
C’est la méthode la plus employée.

Support de
la colonne

gaz

Dans les deux cas, le gaz vecteur est le gaz qui véhicule les solutés ; la phase
mobile est constituée du gaz vecteur et des solutés gazeux.

injecteur

D3
 b) Facteurs théoriques de séparation

Le Facteur de rétention k’
Le facteur de rétention détermine le temps de séjour du soluté dans la phase
stationnaire par rapport au temps de séjour du soluté dans la phase mobile. k’
décrit l’équilibre dynamique du soluté entre phase stationnaire et phase mobile.

Il dépend de:
- la nature du soluté
- la nature de la phase stationnaire
- la température de la colonne
- le volume de la phase stationnaire
- le volume gazeux de la colonne

Le facteur de séparation
Le facteur de séparation (sélectivité) décrit la position relative de chacun des soluté
entre eux. Il doit tendre vers 1,5.

Il dépend :
- de la nature du soluté
- de la nature de la phase stationnaire
- de la température de la colonne
- des solutés désignés

Rq: ne dépend que des temps de rétention bruts mais n’est pas spécifique d’une
bonne séparation

D4
 Le nombre de plateaux théoriques Nth

L’efficacité d’une colonne s’exprime par le nombre de plateaux théoriques (Nth).

Le chromatogramme permet uniquement de mesurer l’efficacité du système
d’analyse.

Paramètres de l’efficacité:
- la géométrie de la colonne (diamètre interne ou diamètre des
particules, longueur et quantité de phase
- les contributions extra-colonnes (injecteur, détecteur, connexions
et opérateur)
- la température
- le soluté

D5
 Le facteur de résolution Rs

La résolution détermine le degré de séparation de 2 solutés consécutifs.

Elle tient compte du k’, de et de Nth (ou N dans la formule ci-dessous).
La valeur seuil usuelle est de 1,5.

L’équation de la résolution décrit les

paramètres affectant la séparation:

EN RESUME

la séparation est possible si:

- les composés sont suffisamment retenus (notion de facteur de rétention k’)
- les composés sont retenus différemment (notion de facteur de séparation )
- les pics sont suffisamment fins (notion d’efficacité Nth)

Rq: les meilleures rétentions s’obtiennent lorsque les composants de l’échantillon

correspondent chimiquement à la phase stationnaire (composés polaires ou
apolaires)

Pour optimiser la séparation, il faut faire varier:

- l’épaisseur du film de la colonne,
- son diamètre
- la nature de la phase stationnaire
- la température

D6
c) Amélioration de la résolution-influence
des facteurs de séparation

Augmenter la RETENTION (k’)

Augmenter la SELECTIVITE (

Augmenter l’EFFICACITE (Nth)

D7
 Influence de la rétention et de l’efficacité sur la séparation

Cas 1: séparation normale

Cas 2: efficacité diminue => changer la colonne
Cas 3: diminution de la température pour
augmenter les temps de rétention dans la colonne
ou augmenter épaisseur du film de la phase
stationnaire ou mauvaise vitesse d’injection ou
condensation dans le détecteur liée à un mauvaise
T° de l’injecteur et du détecteur
Cas 4 : on joue sur tous les paramètres ci-dessus

Influence de la sélectivité et de l’efficacité sur la séparation

Cas 1: séparation normale

Cas 2 : problème de manière d’injecter, de
colonne, de condensation dans le détecteur liée à
un mauvaise T° de l’injecteur et du détecteur
Cas 3 : problème lié à mauvaise T°du four ou
changer type de phase stationnaire de la colonne
Cas 4 : somme de 2 et 3

Influence de la rétention et de la sélectivité sur la séparation

Cas 1: séparation normale

Cas 2: problème lié à mauvaise T°four, épaisseur
du film de la phase stationnaire
Cas 3: problème lié à mauvaise T°du four ou
changer type de phase stationnaire de la colonne
Cas 4 :somme de 2 et 3

D8
 2) Description d’un appareillage de CPG

L’appareil peut être schématiquement représenté ainsi.

Il se compose d’un dispositif d’injection, d’une colonne de séparation placée dans un four thermostaté,
d’un détecteur et d’un système de collection des signaux (intégrateur ou ordinateur).

Les échantillons : les échantillons liquides sont injectés dans la chambre de vaporisation à l'aide d'une
micro-seringue. La température est telle que la vaporisation est immédiate. Le traitement de
l'échantillon varie selon les substances analysées:
- lorsque les solutés sont directement volatilisables, les substances sont solubilisées dans un solvant et
chromatographiées.
-lorsque les solutés ne sont pas volatils à la température du chromatographe ou bien sont décomposés à
cette température, il faut les transformer en dérivés volatils stables : les acides aminés sont ainsi
estérifiés par le butanol, les acides gras estérifiés par le méthanol, les oses réduits en alditols, puis
acétylés.

L’injecteur : Deux types d’injecteurs

- Type vaporisant: l’échantillon est vaporisé avant son dépôt en tête de colonne
-Injecteur de Rhoss (dépôt sur l’aiguille à l’état liquide, évaporation du solvant puis vaporisation dans
l’injecteur chaud)
-Injecteur split ou splitless (simple division de l’échantillon au moment de la vaporisation et
avant dépôt sur colonne). Le split (utilisé au laboratoire) permet la vaporisation instantanée de 10% de
l’échantillon qui passe dans la colonne. L’excès de solvant et d’échantillon s’évacue par la purge. Ce système
évite l’encrassement de la colonne
RQ: le split ou spliless peut être équipé du système PTV (programmation température variable).
Le principal avantage de l’injection PTV est de pouvoir injecter des composés très volatils, du
fait de sa rapidité de montée en température (de 400 à 900°C/min suivant l’appareil).
-Type froid:
- Injecteur « On colonne » l’échantillon est directement déposé à l’intérieur de la colonne
analytique. (permet d’éviter les volumes morts et utile en analyse traces)

Les colonnes : elles peuvent être métalliques ou en silice fondue.

Les constituants vaporisés sont entraînés par le gaz vecteur et cheminent à travers la colonne à des
vitesses inégales.

D9
Les détecteurs : Les limites de sensibilité sont, selon les détecteurs utilisés, de
l'ordre du ng et même du pg. Le détecteur peut être un catharomètre ; photomètre
à ionisation de flammes (FID); capture d'électrons; spectrographie de masse.

Principe d’un détecteur FID: il est

presque universel et d’une grande
sensibilité. Il mesure la conductivité
électrique d’une flamme (air et H2).
Le composé est ionisé avec l’O2, il y
a formation de CHO+ + e-, ce dernier
étant collecté par l’anode qui est
l’électrode collectrice. La cathode
est la pointe de la flamme elle-
même. Le courant électrique généré
(de l’ordre du pico-ampère) après
amplification, est relié à un système
de collection de données.

L’électrode réceptrice doit avoir une résistance très faible. Seul le groupement CH3
répond bien au FID. (Il « répond » aux constituants organiques mais pas aux
inorganiques…)
La surveillance du signal analogique à la sortie du détecteur en fonction du temps
s’appelle chromatogramme et elle se compose d’une série de pics qui correspondent
aux composants situés sur une ligne de base droite et plane.
L’identification qualitative se fonde sur la durée de l’élution des pics après
l’injection(temps rétention) et l’analyse quantitative repose quant à elle sur la
comparaison des aires des pics obtenus par rapport à un standard interne.
Dans notre laboratoire, nous utilisons un appareil
SHIMADZU (installé en septembre 2010) avec un injecteur PTV et un passeur
d’échantillon utilisé en routine,

D10
3) Définition des paramètres en CPG
a) Choix de la colonne- plateaux théoriques –
test de résolution
L’élément central essentiel de la GPC est la colonne dans laquelle se déroule la
séparation. Elle peut être considérée comme le cœur du système et la qualité de la
séparation finale est directement liée à la qualité de la colonne.
Trois exigences importantes régissent le choix d’une colonne: le pouvoir séparateur (ou
résolution), la capacité d’échantillon c’est-à-dire la quantité maximale d’échantillon qui
peut être injectée sans causer de surcharge et les dimensions de la colonne (diamètre ,
longueur et épaisseur du film). Ces facteurs ne sont pas indépendants et même peuvent
s’opposer…

Colonne dans le four Une colonne capillaire peut mesurer de 15 à 100 m.

Elle se compose d’un tube vide et de liquide
stationnaire fixé (par simple dépôt ou par greffage
chimique) sur les parois internes de la colonne .le
diamètre intérieur est de 0,1 à 0,5 mm. Les colonnes
capillaires présentent des efficacités nettement
supérieures à celle des colonnes remplies en raison
de leur plus grande perméabilité au gaz vecteur.
Elles sont placées dans un four thermostaté.

La quantité de phase stationnaire se mesure par l’épaisseur de la couche appliquée sur la

paroi intérieure. La quantité de phase stationnaire est un paramètre important puisqu’il
influence la résolution, le temps d’analyse et la capacité de charge en échantillon.
Dans notre laboratoire nous utilisons pour les acides gras:
-Une colonne moyennement polaire CP WAX 58CB; longueur 50 m, diamètre intérieur
0,25 mm, épaisseur du film de phase stationnaire 0,2 µm.

D11
 Mesure des plateaux théoriques
La mesure des plateaux théoriques est importante pour évaluer l’efficacité d’une colonne
faite à chaque changement de colonne pour contrôler qu’elle soit bien installée.

Le pic utilisé est celui du standard interne C19: 0

L’injection se fait à T°C isotherme 200°C

CS = 1cm/min
TR

Dans un premier temps on se place à une vitesse de déroulement du papier (CS) de 1 cm/min
ce qui nous donne un TR pour le C19: 0 de 22,65 min

D12
 Dans un deuxième temps on se place à une vitesse de déroulement du papier (CS) de 20
cm/min (afin d’élargir le pic) pour faire le calcul suivant:

TR 2 2
22,65
NTh = 5,54 = 5,54 = 111021,27 pour 50 m = 2220 PT/m
1/2 0,16

TR= 22,65

CS =20 cm/min

Rq: actuellement, les logiciels de chromatographie permettent de «zoomer» les pics et

réalisent les calculs automatiquement).

D13
 Test de résolution d’une colonne

2 TR 2 – TR 1 La colonne a une bonne résolution si R > 0,8

=R
2+ 1

Exemple d’une colonne neuve:

On trace les tangentes des pics et on mesure la largeur à la base des tangentes = 1 et 2.
Il faut diviser ces valeurs par le CS (ici 20 cm/min). On trace les perpendiculaires à la base
passant par les sommets des pics 1 et 2. On mesure la distance entre les 2 (TR 2 - TR 1) que
l’on divise par le CS.

TR 2 – TR 1 = 4,6/20 = 0,23

Largeur du pic à la base (en min):

1 = 3,3/20 = 0,165
2 = 3,2/20 = 0,160

CS= 20 cm/min

2 TR 2 – TR 1 2 x 0,23
R= = = 1,4
2+ 1 0,325

D14
 2 TR 2 – TR 1 2 x 0,15
Exemple d’une colonne de deux ans R= = = 0,81
2+ 1 0,370
TR 2 – TR 1 = 0,15
3
Largeur du pic à la base:
1 = 3,6/20 = 0,18
2 = 3,8/20 = 0,19 2

1 = 3,6 2 = 3,8

Exemple d’une colonne en fin de vie

1 2 3

CALCUL NON REALISABLE…

D15
b) Choix du gaz vecteur
Selon leur fonction, les gaz utilisés en GC peuvent être classés en gaz vecteurs et en
gaz de détecteur. Le gaz vecteur ou porteur se charge de transporter les
composants de l’échantillon à travers le système. Il influence l’efficacité et le temps
de l’analyse.

Nature: constitué par un gaz pur pour éviter tout bruit de fond, contenu dans une
bouteille sous pression ou fourni par un générateur.
Qualités: il doit être inerte, de faible diffusion gazeuse, choisi en fonction de la
séparation à réaliser. Tout comme les liquides, les gaz possèdent une certaine
viscosité.

D’après le graphique, l’hydrogène est le gaz

idéal car il a une viscosité plus basse que
He
N2 les autres gaz. Cela signifie que, à une
certaine pression, l’hydrogène possède une
vitesse supérieure par rapport à d’autres
gaz. De plus, il permet de travailler à des
H2 pressions de gaz faibles ce qui diminue le
risque de fuite dans les raccords de la
colonne avec le chromatographe.
En revanche, l’hydrogène présente des
risques d’explosion!...

Dans notre laboratoire, on utilise:

-HELIUM utilisé comme gaz vecteur depuis mars 2007 remplace l’hydrogène
- AIR: utilisé pour la détection FID en tant que comburant
- HYDROGENE: dans la détection FID en tant que combustible
- L’hydrogène en tant que gaz vecteur a été remplacé en 2007 par l’hélium en
augmentant le débit par rapport à celui de l’H2 pour ne pas trop rallonger le temps
d’analyse.

-D’autre part, grâce aux régulateurs électroniques , nous pouvons travailler à débit
constant pour réduire le temps d’analyse:
La pression du gaz (liée à sa viscosité) est fonction de la température.
Pour maintenir un débit constant, il faut réguler la pression en l’augmentant au fur et
à mesure que la température augmente. (Ex: P= 1,27bar à T=60°C et P=2,05b à
T=230°C pour un débit de 1 ml/min).

c) Influence de la température du four et de la pression

du gaz vecteur (pour une même colonne)

D16
Si un pic est mal résolu (ex du C18:1 n-7), est ce que le ralentissement du temps de
l’analyse par une baisse de la pression du gaz vecteur (PGV de 0,8B à 0,6B) permet
d’améliorer cette résolution?

Graphe n°1 Graphe n°2

C16:0
C16:0

S Résolution
I C18:1n-7
TR=19,94 min

Résolution
C18:1n-7
TR=17,58 min

C19:0

6°C/min 6°C/min
150°C 250°C 150°C 250°C
0,8B 0,6B

TR C16 = 13.61 min TR C16 = 15.70 min

TR C19 = 18.95 min TR C19 = 21.08 min
(TR DHA = 36.47 min) (TR DHA = 43.52 min)

En conclusion: le fait de ralentir l’analyse grâce à la baisse de la PGV ne permet pas

d’augmenter la résolution du C18:1 n-7, tous les temps de rétention des pics sont
déplacés en même temps.

D17
Si un pic est mal résolu (ex du C18:1 n-7), est ce que le ralentissement du temps de
l’analyse en jouant sur la température initiale du four et/ou la rampe de température
permet d’améliorer cette résolution?

Graphe n°3 Graphe n°4

C16:0 C19:0

C
C
16
16

Résolution
C18:1n-7
Résolution
(TR=21,71 min) C18:1n-7
(TR=25,84 min)
Pas de
C18:3n-6 Pas de
C18:3n-6

6°C/min 4°C/min
130°C 230°C 130°C 230°C
0,8B 0,8B

TR C16 = 16.78 min TR C16 = 20.22 min

TR C19 = 23.70 min TR C19 = 28.44 min
(TR DHA = 55.32 min) (TR DHA = 59.91 min)

En conclusion: la diminution de la température initiale du four est déjà plus efficace

en terme de résolution du pic C18:1 n-7 que la baisse de la pression du gaz vecteur
(graphe n°3 par rapport au graphe n°2). On améliore d’avantage cette résolution en
diminuant la rampe de température du four (graphe n° 4 par rapport au graphe n°3).

D18
 Graphe n°4 Graphe n°5

C16:0 C19:0

C
16

Résolution
C18:1n-7
Résolution
C18:1n-7 (TR=39,95 min)

(TR=25,84 min)

Pas de résolution
C18:3n-6 C18:3n-6

4°C/min 2°C/min
2°C/min
130°C 230°C 130°C 230°C
0,8B 0,8B

TR C16 = 20.22 min TR C16 = 28,85 min

TR C19 = 28.44 min TR C19 = 43,76 min
(TR DHA = 59.91 min) (TR DHA = 78,58 min)

En conclusion: une diminution plus importante de la rampe de température du four

permet non seulement une excellente résolution du pic C18:1 n-7 mais également la
séparation du pic C18:3 n-3 de celui du standard interne C19:0. Par contre pour
obtenir ce profil, le temps d’analyse est allongé de 18 min.

Il faut donc trouver un compromis entre la durée d’analyse et le

nombre de pics analysés avec une bonne résolution

D19
Une fois que la pression du gaz vecteur a été définie, nous pouvons modifier la
programmation de température du four afin de trouver un compromis entre la durée
d’analyse et la bonne résolution d’un maximum de pics:
Les graphiques (ex: ci-dessous) permettent alors de vérifier la plage de
température dans laquelle apparaissent les pics et ainsi de choisir les programmes
de température les plus adaptés pour une séparation optimale.

Exemple 1

110°C à 160°C en 4°C/min

160°C à 210°C à 2°C/min puis 1°C/min

jusqu’à 220°C avec 2 paliers en isotherme
de 11min à 200°C et 7min à 220°C

Exemple 2

Ralentir le début: 110°C à 146°C en 3°C/min

Accélérer la fin: 2°C/min de 146°C à 230°c et
pas de paliers en isotherme

D20
d) Choix de la température de l’injecteur et du
détecteur
La température de l’injecteur doit permettre la vaporisation immédiate de
l’échantillon. Elle est en général choisie supérieure (environ de 20°C) à la
température d’ébulition du solvant de l’échantillon.
Au moment de l’injection, la température initiale du four (début du programme) doit
aussi être supérieure à ce point.
La température du détecteur doit être supérieure de quelques 20°C degrés à la
température finale du four (risque de contamination) .

e) Facteur de réponse du FID et analyse

quantitative
Dans un détecteur FID le carbone de la fonction COOCH3 ne donne pas de signal.
Donc l’erreur sur la surface intégrée importante sur les acides gras courts (1/4 sur un
C4) devient négligeable sur un C22 (1/22).
De fait, le facteur de réponse en FID étant très voisin pour les acides gras à moyenne
chaine que nous analysons comprenant entre 16 et 22 carbones, il est inutile de
calibrer chaque acides gras séparément.

Exemple :25 ng de chaque acide gras sont injectés dans le détecteur.

Les 4 acides gras donnent une réponse identique dans le détecteur

Dans notre laboratoire, l’ors du dosage quantitatif des acides gras des phospholipides,
nous rajoutons un standard interne en début d’extraction sous forme de phospholipide
à 2 acides gras en C19.
Après extraction lipidique, hydrolyse des fractions lipidiques, Transméthylation et
chromatographie des acides gras, ces derniers sont quantifiés par rapport à la
surface du C19.
D21
4) Intérêt de la CPG en analyse qualitative et
quantitative

- Séparation d’acides gras sous forme libre:

- les acides gras volatils comportent 1 à 8 atomes de C
- les autres sont instables, ont tendance à se dimériser. On les
transforment donc en esters méthyliques plus stables. Suivi des mucoviscidoses, des
patients après mise sous régime lors d’un infarctus du myocarde.

- Dosage des stéroïdes hormonaux:

- détermination du prégnanediol urinaire: permet le contrôle de l’évolution
d’une grossesse ou l’exploration du cycle menstruel
- détermination des 11 desoxy 17 cétostéroïdes qui permet l’exploration
endocrinologique des glandes surrenales
- détermination de la testostérone urinaire chez la femme: permet le
diagnostic de certains dérèglements. Ainsi on peut déceler le virilisme et
l’hirsutisme chez la femme
- détermination des oestrogènes: lors d’un dérèglement chez la femme,
on détermine le pregnanediol et les trois oestrogènes

- Dosage des acides aminés: après transformation en composés volatils

Rq: la technique de chromatographie échangeuse d’ion est plus couramment utilisée car
la CPG ne permet pas la séparation de certains acides aminés comme par exemple
l’histidine, l’arginine et le tryptophane

- Dosage des sucres: hexoses et pentoses sous forme de dérivés méthyliques

- Glycérides: mono et diglycérides après transformation en acétates

- Oxystérols: dans l’exploration du stress oxydant et des pathologies

cardiovasculaires

D22
5) Exemple de séparation de molécules biologiques
en CPG: les acides gras
a) Généralités sur les acides gras
Définitions
Les acides gras sont des acides monocarboxyliques à chaîne linéaire et à nombre
pair d'atomes de carbone. Ils peuvent être saturés (AGS), monoinsaturés
(AGMI) ou polyinsaturés (AGPI). Ils rentrent dans la composition des mono, di et
triglycérides, du cholestérol estérifié et des phospholipides membranaires.
Deux acides gras sont dits essentiels en raison de l'impossibilité pour
l'organisme de les synthétiser. Ils doivent donc être systématiquement apportés
par voie exogène.
Les deux acides gras essentiels sont : * l'acide linoléique (C18:2n-6)
* l'acide a-linolénique (C18:3n-3)
Les acides gras polyinsaturés (AGPI), dérivés supérieurs de ces deux acides
gras, seront ainsi qualifié d'AGPI de la série (n-6) et d'AGPI de la série (n-3).
Les acides gras essentiels (AGE) donnent naissance à leurs dérivés supérieurs
grâce à des réactions enzymatiques successives sous l'action de désaturases et
d'élongases. Ce sont principalement l'acide arachidonique (C20:4n-6) et l'acide
eicosapentanoïque (C20:5n-3), précurseurs de nombreux eicosanoïdes.
Pour obtenir un statut nutritionnel et métabolique satisfaisant, deux conditions
sont nécessaire :
- les apports en AGE doivent être suffisants,
- leur transformation en dérivés supérieurs doit s'opérer correctement.

CH3
AG saturé
16
C O

20 CH
3

14 11 8 5
C O
AG insaturé
O

CH3
C O 1 CH2
20 16
CH3 O
2
C O C
14 11 8 5 O
O 6
CH2O O 5

Phospholipide
P
3
O- 1 4

2 3

D23
 Rôle biologique des AG
Qu'ils soient perfusés ou ingérés puis absorbés par l'intestin, les acides gras
essentiels suivent le même processus d'utilisation métabolique. Ils sont ainsi
transportés dans le sang sous forme de lipoprotéines pour les acides gras des
triglycérides, du cholestérol estérifié et des phospholipides, ou liés à l'albumine
pour les acides gras libres puis acheminés jusqu'au foie.
Les acides gras ne sont pas qu’une source énergétique. Ils interviennent également:
- dans la fonction et la structure des membranes cellulaires
- pour certains acides gras, en tant que précurseurs pour la synthèse de médiateurs
cellulaires (eicosanoïdes)
- au niveau de la régulation de l’expression de certains gènes (PPARs)
- au niveau du métabolisme lipidique et des maladies cardiovasculaires

Les AGS ont, à forte dose, un effet néfaste sur la santé. Leur consommation en
excès est impliquée dans la genèse des maladies cardiovasculaires.
Les AGMI de la série n-9 exercent des effets bénéfiques sur la santé. Ils régulent
le taux de cholestérol et interviennent dans la protection du système
cardiovasculaire.
Les AGPI forment deux familles importantes: celle de l’acide linoléique (n-6) et de
l’acide alpha linolénique (n-3). Ces deux familles ont des effets physiologiques
complémentaires mais différents. Les acides gras de la série n-6 diminuent le taux
de cholestérol et sont indispensable en particulier, à la structure des membranes
cellulaires. Les acides gras de la série n-3 ont un effet antiagrégant plaquettaire et
favorisent ainsi la prévention des maladies cardiovasculaires

En l’absence d’apport lipidique, l’organisme peut synthétiser la majorité des acides

gras (schéma page suivante) à l’exception de deux acides gras essentiels: l’acide
linoléique (n-6) l’acide alpha linolénique (n-3).

Rq: un apport nutritionnel correct en acides gras essentiels ne permet pas toujours
un bon équilibre en acides gras: un apport insuffisant en vitamines et oligoéléments,
le stress, la pollution, la maladie et la vieillesse empêchent le bon déroulement de la
synthèse des acides gras insaturés

D24
 Elongation

élongase
C16:0 C18:0
essentiels
DELTA-9 DESATURASE (SCD1)

C16:1n-7 C18:1n-9 C18:2n-6 C18:3n-3

DELTA-6 DESATURASE

C16:2n-7 C18:2n-9 C18:3n-6 C18:4n-3

ELONGASE

C18:2n-7 C20:2n-9 C20:3n-6 C20:4n-3

DELTA-5 DESATURASE

C18:3n-7 C20:3n-9 C20:4n-6 C20:5n-3

ELONGASE

C20:3n-7 C22:3n-9 C22:4n-6 C22:5n-3

DELTA-4 DESATURASE ? ELONGASE

C20:4n-7 C22:4n-9 C24:4n-6 C24:5n-3

DELTA-6 DESATURASE
RETROCONVERSION

C22:5n-6 C22:6n-3

D25
La nomenclature d’un acide gras s’appuie sur :
* le nombre d’atomes de carbone
* le nombre de doubles liaisons dans la chaîne aliphatique
*.la position des doubles liaisons.
Suivant la position de la double liaison, on utilisera deux expressions différentes :
en n , si la première double liaison est comptée à partir du groupement CH3
Sa position déterminera ainsi les familles n-3, n-6, n-9
en , si la double liaison est comptée à partir du groupement COOH.

Exemple : Acide linoléique, acide gras de la famille n-6

18
CH3

1
12 9 COOH

Acide linoléique: C18:2n-6 ou Acide - -9,12 octadécadiénoique

CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2 -(CH2)6-COOH
1) C18 : Nombre d’atomes de Carbone : 18
2) 2 : Deux doubles liaisons
3) n-6 : La 1ère double liaison se situe sur le 6ème carbone
par rapport au CH3 terminal

Remarque:
Dans l’ancienne nomenclature, on désignait les acides gras en utilisant le sigle à la
place de n. L'acide linoléique était nommé : C18:2 6.

D26
 b) Principe du dosage
1) Extraction des lipides dans le plasma ou les globules rouges
par un mélange méthanol et chloroforme

2) Séparation des phospholipides des autres lipides.

Chromatographie en couche mince.

Phase mobile:
1V acide acétique
20V diéthyléther
80V éther pétrole

Cuve à migration contenant une plaque de silice.

La phase mobile est apolaire et n’entraîne pas
les phospholipides polaires qui restent au
niveau du dépôt.

Découpage et grattage de la
bande correspondant aux
phospholipides

Rq: En routine, seuls les phospholipides nous intéressent .

Nous utilisons donc une phase mobile différente (1v acétone + 3v diéthyléther)
qui ne sépare pas les autres lipides (ils migrent tous au front de solvant)

3) Transméthylation (2 rôles):
- sépare les acides gras du glycérol par rupture de la liaison ester
- fixe radical méthyl sur l’acide gras ainsi obtenu afin de le rendre plus volatil
pour l’injection et plus stable en empêchant la formation de dimères par liaison hydrogène:
RCOOR’ + CH3OH RCOOCH3 + R’OH
(R= chaîne aliphatique de l’AG, R’= partie du glycérol à éliminer)

4) Extraction des acides gras méthylés puis séparation des différents acides gras
en fonction de la longueur de leur chaîne et de leur insaturation.
Chromatographie en phase gazeuse.

Rq: les résultats sont rendus par familles: n-3, n-6, n-9 en pourcentage et en pondéral
par rapport à un standard interne, phosphorylcholine en C19:0 (en 1 et 2) choisi pour:
- être absent des tissus biologiques,
- avoir les mêmes propriétés physico-chimiques que l’échantillon à doser
- sa chaîne aliphatique avec un nombre d’atomes de C intermédiaire à
celui des acides gras dosés
- son pic chromatographique devant apparaître dans une zone dénuée de pic

D27
 Acides Gras dosés au sein du Laboratoire de Biochimie

N Abrév. Nom commun Nomenclature Internationale

1 C16:0 A. Palmitique Acide Hexadécanoique
2 C16: n- Acide cis- -7-Hexadécénoique

3 C16:1n-7 A. Palmitoléique Acide cis- -9- Hexadécénoique

4 C18:0 A. Stéarique Acide Octadécanoique
5 C18:1n-9 A. Oléique Acide cis- -9-Octadécénoique
6 C18:1n-7 A. Vaccenique Acide cis- -11-Octadécénoique
7 C18:2n-6 A. Linoléique Acide cis- -9,12-Octadécadiénoique
8 C18:3n-6 A. -Linolénique Acide cis- -6,9,12-Octadécatriénoique
9 C18:3n-3 A. -Linolénique Acide cis- -9,12,15-Octadécatriénoique
10 C20:3n-9 A. Eicosatriénoique Acide cis- -5,8,11-Eicosatriénoique
11 C20:3n-6 [Link]-homo- - Acide cis- -8,11,14-Eicosatriénoique
Linolénique
12 C20:4n-6 [Link] Acide cis- -5,8,11,14-Eicosatétraénoique
13 C20:5n-3 A. Eicosapentaénoique Acide cis- -5,8,11,14,17-Eicosapentaénoique
14 C22:4n-6 A. Docosatétraénoique Acide cis- -7,10,13,16-Docosatétraénoique
15 C22:5n-6 A. Docosapentaénoique Acide cis- -4,7,10,13,16-Docosapentaénoique
16 C22:5n-3 A. Docosapentaénoique Acide cis- -7,10,13,16,19-Docosapentaénoique
17 C22:6n-3 A. Docosahexaénoique Acide cis- -4,7,10,13,16,19-Docosahexaénoique

L’ordre de sortie des acides gras est fonction:

- du nombre de C (C16 à C22), les chaines les plus courtes étant les plus volatils
- du nombre de doubles liaisons (mais C24: 0 est élué avant C22: 6n-3)
- de la place des doubles liaisons (ex pour C18: le 1 n-9 est élué avant le 1 n-7 et
le 3 n-6 est élué avant le 3 n-3)

Il y a des pics difficiles à séparer:

- C18:3 n-6 et C19:0 (d’où l’intérêt de jouer sur la T°initiale, la rampe de montée en
T°C et la T°C finale
- C20: 2 n-6 et C20: 3 n-9 (=> changement de la colonne de 30 m à 50 m)
- C22: 6 n-3 et C24:1 n-9 (pas en routine mais dans le suivi de régime enrichi en huile
d’olive sur rats)

Rq: les temps de rétention des pics sont contrôlés avec des surcharges de standards
d’acides gras méthyl-esters

D28
Ordre de sortie des composés dans notre système

B A

D29
Identification des pics
chromatogramme d’un mélange de standards

Si l’analyse est trop rapide, le C18:3n-6 n’est pas

séparé du C19:0 (SI)

La séparation n’a pu être effective qu’en remplaçant la

colonne de 30m par 50m
C21:0 situé entre C20:3n-6 et C20:4n-6
(moins d’atomes de carbonne mais plus de doubles liaisons)

C22:6n-3 (DHA) et C24:1n-9

difficiles à séparer (mais pas de 24:1n-9
dans les profils biologiques de routine)

D30
 c) Interprétation des résultats
Les dosages des phospholipides plasmatiques et globulaires permettent d'apprécier le
statut en AGPI.

1) Dosage des acides gras plasmatiques:

reflet direct des apports.

2) Dosage des acides gras globulaires:

reflet de l’état des membranes.

INTERET DU DOSAGE:
1) en routine: bilan nutritionnel en liaison avec les proteines, les oligoélements
et les vitamines(cf marguerite) (nutrition parentérale, endocrino-diabétologie,
mucoviscidose, médecine de ville)
2) En recherche: régime huile soja / olive (rats)
3) Dosage dans huiles, lait, beurre, solutions d’AG

VARIATIONS PHYSIOLOGIQUES:

a) Carence d'apport en acides gras essentiels

Le métabolisme est dévié sur la série n-9.
Diminution de l'acide linoléique, arachidonique, a-linolénique, docosahexaénoique.
Augmentation de l'acide eicosatriénoique.
b) Apport excessif en acides gras essentiels
Diminution des activités désaturasiques par excès de substrat.
Diminution de l'acide arachidonique et docosahexaénoique.
c) Insuffisance hépathocellulaire
Inhibition des activités désaturasiques.
Diminution de l'acide arachidonique et docosahexaénoique.

Vitamines
Vitamines liposolubles
hydrosolubles Vit A Vit E
Vit C, Vit B
Molécules essentielles Ac aminés
et micronutriments
Homocystéine
Oligo
éléments
Cu, Zn, Se
Acides gras des
phospholipides

D31
 Différents
chromatogrammes

D32
Profil d’acides gras des phospholipides d’un plasma normal

D33
Profil d’un plasma carencé en acides gras

Augmentation du pic 20:3 n-9 et diminution du pic 22:6 n-3

D34
Profil d’acides gras des phospholipides globulaires normal

D35
Profil d’acides gras des phospholipides globulaires carencé
en acides gras n-3

D36