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Introduction
Le diagnostic bactérien permet de mettre de façon directe ou indirecte la
présence d’une pathologie. La coloration est utilisée en bactériologie pour mettre en évidence
certains germes, ainsi pour lier la théorie à la pratique notre professeur de microbiologie nous
a demandé de faire un travail pratique portant sur :
la coloration de Koester
la coloration de Stamp
technique de Castoneda
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I. Coloration de Koester (Prescott et al.,2010)
Intérêt de la coloration de Koester est pour identifier et rechercher les bactéries du genre
brucella.
Matériels
lames étalées
colorants (mercurochrome 2%, vert de méthyle à 2%)
Mode opératoire
Réalisons un frottis du prélèvement pathologique ( ne pas fixer)
Recouvrir la lame d’une solution filtrée de mercurochrome à 2% pendant 3à5 minutes
Laver à l’eau distillée
Colorer pendant 5 minutes avec une solution de vert de méthyle à 2%
Laver à l’eau distillée et laisser sécher
Examiner à l’objectifx100brucella, les bactériesapparaissent en violet clair sur fond
presque incolore. Il est nécessaire de dispose d’un bon microscope et d’un observateur
averti.
II. Coloration de Stamp (François et Marie, 2004)
Objectifs
Mettre en évidence le caractèreacido-résistante (fuchsine), elle dérive de ziehlNielsen. C’est
une méthode de coloration utilisée chez l’échantillon animal pour diagnostiquer la brucellose.
Echantillon
Echantillon vaginal d’animal
le lait
Matériels
Lame étalée,
colorants
Réactifs
Solution alcoolique saturée de fuchsine :
Fuchsine basique : 0,3 g
Ethanol à 950 :10 ml
Solution aqueuse de phénol :
Observation du genre Brucella au microscope après
coloration de stamp
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Phénol(cristaux) :5 g
L’eau distillée : 90 ml
Faire fondre à 950C (bain marie) puis ajouterl’eau
Solution de travail
Mélangerles deux solutions (fuchsine et phénol)
Solution e décoloration
Acide sulfurique à 25%
Solution de contre coloration
Bleu de méthylène hydrosoluble : 1 g
Alcool 950 : 10 ml
Phénol : 1 ml
Eau distillée quantité suffisante pour faire 100 ml
Technique
Couvrir le frottis de fuchsine phéniquée
Chauffer très doucement jusqu’à l’émission de vapeur
Le colorant doit agir 10 minutes sans ébullition ni dessèchement
Rincer la lame à l’eau distillée stérile
Couvrir le frottis d’alcool 5minutes
Couvrir le frottis d’acide sulfurique à 25% 3 minutes
Rincer la lame à l’eau distillée
Couvrir le frottis avec la solution de bleu de méthylène 2 minutes
Rincer la lame à l’eau stérile et laissersécher à l’air
Coloration
Le frottis est coloré par une solution alcoolique saturée de fuchsine basique phéniquée
pendant 10 minutes. Apres décoloration (3 minutes) avec un mélange acide – alcool (acide
sulfurique à 25% dans l’alcool à 900), la lame est rincée à l’eau distillée stérile puis contre
colorée 3 minutes par une solution aqueuse de bleu de méthylène à 3%. Les frottis sont
ensuite rincés à l’eau distillée puis séchés à l’étuve. L’observation est effectuée à l’objectif
100 à l’immersion avec l’huile minérale. Les mycobactéries colorées par la fuchsine
phéniquée apparaissent rouge vif sur fond bleu de la préparation.
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III. Technique de Castaneda (Prescott et al, 1935)
Objectif de la méthode
Est une modalité de recherche de brucella fondée par un bactériologiste mexicain
qui consiste à ensemencer le milieu bi phasique(liquide et solide) ou à utiliser le milieu de
Becton Dickinson
Temps d’expérimentation
Les résultats se présententaprès 3 jours environ car brucella pousse lentement
Diagnostique
On observe la morphologie des cultures bactériennes s’il s’agit de coccobacille
gram négatif de 0,5 à 0,7 Um de longueur sur 0,6 à 1,5 Um de diamètre, immobile, non
encapsulé. On observe le caractère culture, on observe l’aspect de colonies (R,S).
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CONCLUSION
Au terme de notre travail qui portait sur la coloration de Koester, la coloration
de Stamp et la technique de Castoneda, il est ressort que toutes les colorations en
bactériologie suivent un même principe qui peut se définir en quatre étapes : la première qui
est la coloration (colorant qui donnera en résultat positif à la fin), ensuite mordançage ou
intensification de la coloration, puis décoloration (c’est le caractère que l’on cherche à mettre
en évidence) et en fin contre coloration qui permet d’observer les germes décolorés
précédemment (donc c’est un colorant qui donne le résultat négatif).
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REfErence
Français Denis, Marie CécilePlay , 2004. Bactériologie médicale, techniques usuelles, 3e
Edition entièrementrépondue. Elsevier Masson, 470 - 472 pp.
Prescott, Harley, Klein, 1935. Microbiology,1e Edition de McGraw Hill Higgher education,
267- 269 pp.
Prescott, Harley, Klein, 2010. Microbiology, 3e Edition de McGraw Hill Higgher education,
322-324 pp.