UNIVERSITE DU DROIT ET DE LA SANTE LILLE 2

THESE DE DOCTORAT D’UNIVERSITE

en Sciences de la Vie et de la Santé

Recherche de déterminants génétiques

des phénotypes associés au
syndrome métabolique
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

en population

Soutenue publiquement le 28 septembre 2009 par

Vanessa LEGRY

Devant le jury composé de :

Madame le Docteur Beverley Balkau Rapporteur

Monsieur le Docteur Sander Kersten Rapporteur
Madame le Docteur Giulia Chinetti Examinateur
Monsieur le Docteur Patrick Borel Examinateur
Madame le Docteur Aline Meirhaeghe Directrice de thèse
Monsieur le Professeur Philippe Amouyel Directeur du laboratoire

Unité INSERM U744 – Institut Pasteur de Lille

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A ma grand-mère
 Je tiens d’abord à exprimer mes sincères remerciements à :

Madame le Docteur Beverley Balkau, de m’avoir fait l’honneur d’être rapporteur de cette
thèse et d’avoir pris le temps de juger ce travail.

Monsieur le Docteur Sander Kersten, d’avoir accepté d’être rapporteur de cette thèse et pour
l’intérêt que vous avez bien voulu porter à ce travail.

Madame le Docteur Giulia Chinetti, je suis très honorée que tu aies accepté d’examiner ce
travail et t’en remercie très chaleureusement.
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Monsieur le Docteur Patrick Borel, je vous remercie sincèrement d’avoir accepté de faire
partie de mon jury de thèse et vous prie de croire en mon profond respect.

Monsieur le Professeur Philippe Amouyel, vous m’avez donné la chance de travailler au sein
de votre laboratoire. Je vous suis infiniment reconnaissante des moyens que vous avez mis
en œuvre afin de mener à bien ce travail. Merci de votre confiance et de votre soutien. Que
ce travail soit le témoignage de ma sincère gratitude et de ma plus haute estime.

Madame le Docteur Aline Meirhaeghe, je te remercie très sincèrement pour les quatre
années que nous avons passées à travailler ensemble. Tes compétences scientifiques ainsi
que ton dynamisme, ta rigueur, ta disponibilité et ta gentillesse m’ont été d’une aide capitale
dans la réalisation de ce travail. Merci de m’avoir poussée à donner le meilleur de moi-même
et de m’avoir aidée à m’épanouir. Merci également de ta confiance et de ton soutien.
J’espère sincèrement que nous aurons encore la chance de collaborer dans le futur. Que
cette thèse soit le témoignage de toute ma reconnaissance et de mon plus profond respect.
 Je tiens également à remercier :

Jean Dallongeville, pour tes nombreux conseils, tes encouragements et ta bonne humeur.
Jean-Charles Lambert, pour ton enthousiasme débordant, ta disponibilité et ta sympathie.
Nicole Helbecque, pour avoir accepté de relire ce manuscrit avec tant d’attention.
Florence Richard, pour ton aide en épidémiologie et ta sympathie.
Marie Pigeyre, pour tout ce que tu m’as appris, ta disponibilité, ton amitié et la relecture de
ce manuscrit.
Dominique Cottel, Michèle Montaye, Nadine Marécaux, Nathalie Fievet, Béatrice Cousin,
Marie-Pierre Dumont, Anne Cloez et Céline Dubeau pour l’immense travail que vous réalisez
dans les enquêtes épidémiologiques et votre sympathie.
Chantal Steclebout, Marjorie Brillowski, Anne-Sophie Delbart et Valérie Codron pour votre
aide précieuse et votre disponibilité.
Xavier Hermant, pour ton aide technique mais surtout pour ta gentillesse, tes fruits et
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légumes 100% bio et nos longues discussions. Merci de m’avoir soutenue dans les moments
difficiles.

Mes remerciements s’adressent aussi à :

Anne-Marie Ayral et David Dombrowicz pour votre bonne humeur, vos nombreux conseils et
vos encouragements. Merci d’avoir été là dans les moments difficiles.
Mes compagnons de fortune Julie Dumont, Faïza Bensemain, Julien Chapuis, Geoffroy
Laumet, Emilie Dubois, Adelina Acosta, Anaïs Mounier et Sophie Lecompte pour votre
soutien et tous les bons moments partagés. Je vous souhaite à tous beaucoup de réussite.
Aux étudiants étrangers qui sont venus apporter un peu d’exotisme à Lille, Alina Besliu,
Graziana Bortone et plus particulièrement, Szilvia Bokor. Ta bonne humeur, ta gentillesse et
ton amitié ont été d’un soutien inestimable durant cette dernière année.
Aux médecins Vincent Chouraki, Kankoe Amah-Tchoutchoui, Luc Dauchet, Elise Gruson,
Emma Tilloy, Nicolas Lamblin, Anthony Foucault, Adeline Sillaire et Marie Fertin pour tout ce
que vous m’avez appris et votre sympathie.
Franck Hansmannel, Louisa Goumidi et Caroline Cieniewski pour le partage de vos
connaissances.
Sabine Szeremeta, pour tes recherches d’article et ta sympathie.
Aux étudiants qui m’ont aidée dans la réalisation de ce travail, Thomas Deroide, Nicolas
Andrieux et Marlène Huyvaert. Un grand merci pour votre aide et votre sympathie.
Merci aussi à tous les autres membres du laboratoire.
 J’en profite également pour remercier les équipes avec lesquelles j’ai collaboré :

L’unité INSERM U545 (Lille), notamment Amine Bouhlel, Rebecca Dievart, Lionel Helin et
Bruno Derudas pour votre aide technique, mais aussi Benoit Pourcet et Roxane Mansouri
pour tous vos conseils en culture cellulaire, et enfin Lucia Fuentes et Thérèse Mayi avec qui
j’ai passé des moments inoubliables durant la Spetses Summer School.
Le Département de Nutrition de l’Université d’Oslo (Norvège), en particulier Karianne Solaas,
Hilde Nebb et Borghild Arntsen pour m’avoir donné l’opportunité de découvrir la Norvège et
pour votre contribution à ce travail.

Un grand merci à tous les collaborateurs des projets CRESCENDO et HELENA pour votre
contribution à ce travail.

J’aimerais également remercier l’Institut Pasteur de Lille sans le soutien duquel je n’aurais
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pu accomplir ce travail.

Enfin, je ne pourrais conclure ces remerciements sans une pensée émue pour ma famille. Je
tiens à remercier très sincèrement :

Mes parents, pour vos encouragements, votre écoute, votre patience et tout votre amour.
Mon frère, pour ton soutien et tes soirées animées.
Colleen, pour tous les bons moments de musicalité passés ensemble.
Et pour finir, Hugues, pour ton amour, ton soutien, ta patience, tes conseils… Merci pour
toute l’énergie que tu m’as insufflée pour mener à bien ce travail.
 Liste des publications

Ce travail de thèse a donné lieu aux publications suivantes :

*Legry V, Goumidi L, Huyvaert M, Cottel D, Ferrières J, Arveiler D, Bingham A, Wagner A,

Ruidavets JB, Ducimetière P, Amouyel P, Meirhaeghe A (2009) Association study between
angiopoietin-like 6 (ANGPTL6) gene polymorphisms and Metabolic Syndrome-related
phenotypes in the French MONICA Study. Diabetes & Metabolism 35(4):287-292.

*Legry V, Cottel D, Ferrières J, Arveiler D, Andrieux N, Bingham A, Wagner A, Ruidavets JB,

Ducimetière P, Amouyel P, Meirhaeghe A (2009) Effect of an FTO polymorphism on fat
mass, obesity and type 2 diabetes in the French MONICA Study. Metabolism: clinical and
experimental 58(7):971-975.
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Goumidi L, Spengler D, Cottel D, Wagner A, Ducimetière P, Ruidavets JB, Legry V, Arveiler

D, Bingham A, Ferrières J, Amouyel P, Meirhaeghe A (2009) Study of the genetic variability
of ZAC1 (PLAGL1) in French population-based samples. Journal of Hypertension
27(2):314-321.

*Legry V, Cottel D, Ferrières J, Deroide T, Amouyel P, Meirhaeghe A (2008) Association

between liver X receptor alpha gene polymorphisms and metabolic syndrome in French
populations. International Journal of Obesity (Lond) 32(3):421-428.

*Legry V, Bokor S, Cottel D, Beghin L, Catasta G, Nagy E, Gonzalez-Gross M, Spinneker A,

Stehle P, Molnar D, Moreno L, Amouyel P, Dallongeville J, Meirhaeghe A. Associations
between common genetic polymorphisms in angiopoietin-like proteins 3 and 4 and lipid
metabolism and adiposity in European adolescents and adults. Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism Sous presse.

Bokor S, Legry V, Meirhaeghe A, Ruiz JR, Mauro B, Widhalm K, Manios Y, Amouyel P,

Moreno LA, Molnàr D, Dallongeville J on behalf of the HELENA Study group. Single
nucleotide polymorphism of CD36 locus and obesity in European adolescents. Obesity Sous
presse.
 *Solaas K#, Legry V#, Retterstol K, Holven KB, Ferrières J, Amouyel P, Rootwelt H, Berg P,
Lien S, Tonstad S, Halvorsen BL, Nenseter MS, Valtueña J, Romeo J, Widhalm K, Ruiz JR,
Birkeland KI, Thorsby P, Meirhaeghe A, Nebb HI. Liver X receptor β polymorphisms in type 2
diabetes mellitus and obesity – a three cohort study; the Norwegian HUNT 2, the French
MONICA and the European HELENA-CSS. Soumis à Human Molecular Genetics.
#
Ces auteurs ont contribué à part égale au travail.

*Publications présentées dans la thèse.

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 Liste des communications

Ce travail de thèse a donné lieu aux communications (posters) suivantes :

Legry V, Bokor S, Cottel D, Beghin L, Catasta G, Molnar D, Moreno L, Amouyel P,

Dallongeville J, Meirhaeghe A on behalf of the HELENA Study Group. Impact of
Angiopoietin-like proteins 3 and 4 genetic polymorphisms on adiposity and lipid metabolism
in European adult and adolescent samples. Obesity Facts, 2009, 2: suppl 2, p 183. 17th
European Congress on Obesity, 6-9 May 2009, Amsterdam, The Netherlands.

Legry V, Goumidi L, Huyvaert M, Cottel D, Ferrières J, Arveiler D, Bingham A, Wagner A,

Ruidavets J-B, Ducimetière P, Amouyel P, Meirhaeghe A. Impact of polymorphisms within
the angiopoietin-like 6 (ANGPTL6) gene in the French MONICA Study. Journal of Diabetes,
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

2009, 1 : suppl 1, p A270. 3rd International Congress on Prediabetes and the Metabolic
Syndrome, 1-4 April 2009, Nice, France.

Legry V, Cottel D, Ferrières J, Andrieux N, Ruidavets JB, Ducimetière P, Amouyel P,

Meirhaeghe A. Association study between FTO and obesity-related phenotypes in French
population-based samples. International Journal of Obesity, 2008, 32: suppl 2, p S208.
16th European Congress on Obesity, 14-17 May 2008, Geneva, Switzerland.

Legry V, Cottel D, Ferrières J, Deroide T, Amouyel P, Meirhaeghe A. Association between

liver X receptor alpha gene polymorphisms and metabolic syndrome in French populations.
International Journal of Obesity, 2007, 31: suppl 1, p S48. 15th European Congress on
Obesity, 22-25 April 2007, Budapest, Hungary.
 Table des matières

Table des matières

Table des matières................................................................................................................ 1

Liste des abréviations............................................................................................................ 5
Introduction ..........................................................................................................................10
Avant-propos ....................................................................................................................10
I. Définition et diagnostic du syndrome métabolique .........................................................11
I.1. Définitions ...............................................................................................................11
I.2. Historique du concept..............................................................................................11
I.3. Les critères de diagnostic du syndrome métabolique ..............................................12
I.3.a. Définition de l’OMS (1998-1999) .......................................................................13
I.3.b. Définition de l’EGIR (1999) ...............................................................................13
I.3.c. Définition du NCEP (2001) ................................................................................14
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I.3.d. Définition de l’AACE (2003) ..............................................................................14

I.3.e. Définition de l’AHA (2005).................................................................................14
I.3.f. Définition de l’IDF (2005) ...................................................................................14
II. Epidémiologie du syndrome métabolique......................................................................16
II.1. Prévalence .............................................................................................................16
II.1.a. Prévalence des phénotypes du syndrome métabolique ...................................16
II.1.b. Prévalence du syndrome métabolique en fonction de sa définition ..................17
II.1.c. Prévalence du syndrome métabolique en fonction du genre ............................18
II.1.d. Prévalence du syndrome métabolique en fonction de l’âge..............................18
II.2. Morbidité et mortalité associées au syndrome métabolique....................................19
II.2.a. Risque cardiovasculaire ...................................................................................19
II.2.b. Risque de diabète de type 2 (DT2)...................................................................20
II.2.c. Autres maladies ou conditions associées .........................................................21
II.3. Le syndrome métabolique chez les enfants et les adolescents...............................22
III. Les principaux phénotypes du syndrome métabolique et leurs voies métaboliques .....24
III.1. L’obésité abdominale.............................................................................................24
III.1.a. Définition et mesure ........................................................................................24
III.1.b. La différenciation adipocytaire.........................................................................25
III.1.c. Fonctions endocriniennes du tissu adipeux .....................................................26
III.1.d. Lipolyse du tissu adipeux ................................................................................28
III.1.e. Régulation de la balance énergétique .............................................................29
III.1.f. Conséquences de la localisation de la graisse .................................................30
III.2. L’homéostasie glucidique ......................................................................................31

1
 Table des matières

III.2.a. Mesures du désordre glucidique .....................................................................31

III.2.b. La signalisation de l’insuline............................................................................33
III.2.c. Mécanismes de l’insulinorésistance ................................................................34
III.3. Métabolisme des lipides et lipoprotéines ...............................................................35
III.3.a. Généralités sur le métabolisme des lipides .....................................................35
III.3.b. Transport inverse du cholestérol .....................................................................35
III.3.c. Altération du profil lipidique et risque cardiovasculaire ....................................37
III.4. L’hypertension artérielle.........................................................................................38
III.5. Différentes hypothèses sur l’origine du syndrome métabolique .............................39
III.5.a. Rôles de l’obésité abdominale et de l’insulinorésistance dans la genèse du
syndrome métabolique...............................................................................................40
III.5.b. Insulinorésistance ou obésité abdominale ?....................................................41
III.5.c. Hypothèses alternatives ..................................................................................42
IV. Facteurs de prédisposition...........................................................................................44
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IV.1. Facteurs environnementaux..................................................................................44

IV.2. Facteurs génétiques..............................................................................................45
IV.2.a. Les études d’épidémiologie génétique............................................................45
IV.2.b. Facteurs génétiques de l’obésité et des phénotypes associés........................47
IV.2.c. Facteurs génétiques de l’homéostasie glucidique ...........................................48
IV.2.d. Facteurs génétiques des lipides plasmatiques................................................50
IV.2.e. Facteurs génétiques de l’hypertension artérielle .............................................51
IV.2.f. Facteurs génétiques du syndrome métabolique...............................................52
V. Gènes candidats...........................................................................................................56
V.1. FTO .......................................................................................................................56
V.2. Les liver X receptors ..............................................................................................57
V.2.a. Fonctions décrites des LXRs ...........................................................................58
[Link]érences entre LXRα et LXRβ ......................................................................63
V.2.c. Etudes génétiques de LXRα ............................................................................65
V.2.d. Etudes génétiques de LXRβ ............................................................................66
V.3. Les angiopoietin-like proteins.................................................................................66
V.3.a. ANGPTL3 ........................................................................................................67
V.3.b. ANGPTL4 ........................................................................................................69
V.3.c. ANGPTL6 ........................................................................................................72
Matériels et Méthodes ..........................................................................................................75
I. Analyse de la variabilité génétique.................................................................................75
I.1. Les polymorphismes génétiques .............................................................................75
I.2. Le déséquilibre de liaison ........................................................................................76

2
 Table des matières

I.3. Notion d’haplotype...................................................................................................77

I.4. Les Tag-SNPs .........................................................................................................77
II. Génotypage ..................................................................................................................79
II.1. Restriction fragment length polymorphism..............................................................79
II.2. Technologie TaqMan..............................................................................................79
II.3. Technologie Golden Gate.......................................................................................79
III. Populations étudiées....................................................................................................80
III.1. L’étude MONICA ...................................................................................................80
III.2. L’étude MONEUR..................................................................................................81
III.2.a. Le projet EUROASPIRE..................................................................................81
III.2.b. L’étude MONEUR ...........................................................................................81
III.3. L’étude HELENA ...................................................................................................82
III.4. L’étude cas-témoins pour le DT2 nichée dans HUNT 2 .........................................83
IV. Analyses statistiques ...................................................................................................85
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IV.1. L’équilibre d’Hardy Weinberg ................................................................................85

IV.2. Analyses statistiques utilisées dans les études d’association................................85
IV.3. Facteurs de confusion et interactions ....................................................................87
Résultats ..............................................................................................................................89
Introduction.......................................................................................................................89
I. Etude du gène FTO .......................................................................................................90
I.1. Contexte de l’étude..................................................................................................90
I.2. Synthèse des résultats ............................................................................................91
I.3. Discussion...............................................................................................................91
II. Etude du gène NR1H3 codant LXRα ............................................................................93
II.1. Contexte de l’étude.................................................................................................93
II.2. Synthèse des résultats de l’article ..........................................................................94
II.3. Etudes fonctionnelles complémentaires non publiées.............................................95
II.3.a. Dans les cultures primaires de macrophages humains ....................................95
II.3.b. Etude de l’activité du promoteur de NR1H3 dans un vecteur rapporteur ..........95
II.4. Etudes d’association complémentaires non publiées..............................................97
II.4.a. Etude d’association des SNPs rs12221497 et rs11039155 dans l’étude
HELENA ....................................................................................................................97
II.4.b. Etude d’association des SNPs rs12221497 et rs11039155 dans l’étude
MONEUR...................................................................................................................97
II.5. Discussion..............................................................................................................98
III. Etude du gène NR1H2 codant LXRβ..........................................................................103
III.1. Contexte de l’étude..............................................................................................103

3
 Table des matières

III.2. Synthèse des résultats ........................................................................................104

III.3. Discussion...........................................................................................................104
IV. Etude des gènes ANGPTL3 et ANGPTL4..................................................................107
IV.1. Contexte de l’étude .............................................................................................107
IV.2. Synthèse des résultats........................................................................................108
IV.3. Discussion...........................................................................................................108
IV. Etude du gène ANGPTL6 ..........................................................................................111
IV.1. Contexte de l’étude .............................................................................................111
IV.2. Synthèse des résultats........................................................................................112
IV.3. Discussion...........................................................................................................112
Discussion générale ...........................................................................................................115
I. Difficultés des études sur le syndrome métabolique.....................................................115
II. Synthèse des travaux personnels, critiques et perspectives .......................................117
III. Les études génétiques des maladies métaboliques ...................................................120
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Conclusion......................................................................................................................123
Références.........................................................................................................................124

4
 Liste des abréviations

Liste des abréviations

β -HSD
11-β 11-β-hydroxysteroïde déshydrogénase
ABC ATP-binding cassette transporter
AACE American Association of Clinical Endocrinologists
ACC acétyl-CoA carboxylase
ACE enzyme de conversion de l'angiotensine
ADA American Diabetes Association
ADN acide désoxyribonucléique
ADNc acide désoxyribonucléique complémentaire
ADRB3 récepteur adrénergique β-3
AF activation function
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AG acides gras
AGF angiopoietin-related growth factor
AGL acides gras libres
AGRP agouti-related protein
AHA American Heart Association
AMP adénosine monophosphate
AMPc adénosine monophosphate cyclique
AMPK AMP kinase
α-MSH α-melanocyte stimulating hormone
ANCOVA analysis of covariance
ANGPTL angiopoietin-like protein
ANOVA analysis of variance
Apo apolipoprotéine
ARN acide ribonucléique
ARNm acide ribonucléique messager
ATGL lipase des TG adipeux
AVC accident vasculaire cérébral
BET bromure d’éthidium
CART cocaine and amphetamine related transcript
CEBP CAAT-enhancer binding proteins
CETP protéine de transfert d’esters de cholestérol
ChREBP carbohydrate responsive element binding protein

5
 Liste des abréviations

CNRE cAMP-negative response element

CNV copy number variation
COX-2 cyclo-oxygénase 2
CRP protéine C-réactive
CYP7A1 cytochrome P450 7 A1
DBD DNA-binding domain
ddl degré de liberté
DESIR Données Epidémiologiques sur le Syndrome d’Insulino-Résistance
DG diglycérides
DL déséquilibre de liaison
DR direct repeat
DT2 diabète de type 2
EDTA acide éthylène diamine tétra acétique
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EGIR European Group for the Study of Insulin Resistance

EL lipase endothéliale
EMSA electrophoretic mobility shift assay
ENPP1/PC-1 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 / plasma cell antigen 1
EUROASPIRE EUROpean Action on Secondary Prevention and Intervention to Reduce Event
FABP fatty acid-binding protein
FAS fatty acid synthase
FBPase fructose-1,6-biphosphatase
FDR false discovery rate
FIAF fasting-induced adipose factor
FTO fat mass and obesity-associated
G6Pase glucose-6-phosphatase
GIANT Genetic Investigation of ANthropometric Traits
GLUT4 transporteur du glucose
GWAS genome wide association study
HDL high density lipoprotein
HELENA HEalthy Lifestyle in Europe by Nutrition in Adolescence
α
HIF-1α hypoxia inducible factor 1α
HL lipase hépatique
HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
α
HNF4α hepatic nuclear factor 4 alpha
HO-1 hème oxygénase 1

6
 Liste des abréviations

HOMA-B homeostasis model assessment of β cell function

HOMA-IR homeostasis model assessment of insulin resistance
HPO hyperglycémie provoquée par voix orale
HSL lipase hormono-sensible
HUNT HelseUndersøkelsen Nord-Trøndelag
IDF International Diabetes Federation
IDL intermediate density lipoprotein
Idol inducible degrader of the LDLR
IL interleukine
IMC indice de masse corporelle
IRS insulin receptor substrate
JNK Jun N-terminal kinase
KO Knock-out
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LBD ligand-binding domain

LCAT lécithine cholestérol acyltransférase
LDL low density lipoprotein
LDLR low density lipoprotein receptor
LPL lipoprotéine lipase
LXR liver X receptor
LXRE LXR response element
MAF minor allele frequency
MAPK mitogen activated protein kinase
MC4R récepteur 4 à la mélanocortine
MCV maladie cardiovasculaire
MG monoglycérides
MGL lipase des MG
MONEUR MONICA-EUROASPIRE
MONICA Multinational mONItoring of trends and determinants of CArdiovascular diseases
NCBI National Center for Biotechnology Information
NCEP National Cholesterol Education Program
NERF new Ets-related factor
NF1 nuclear factor 1
κB
NFκ nuclear factor kappa B
NHANES National Health And Nutrition Examination Survey
NPC Niemann Pick C

7
 Liste des abréviations

NPC1L1 Niemann Pick C-1 like 1

NR1H2 nuclear receptor subfamily 1, group H, member 2
NR1H3 nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3
OMS Organisation Mondiale de la Santé
OR odds ratio
PAD pression artérielle diastolique
PAI-1 plasminogen activator inhibitor 1
PAS pression artérielle systolique
PCR polymerase chain reaction
PEPCK phosphoénolpyruvate carboxykinase
PGAR PPARγ angiopoietin-related
α
PGC1α PPARγ coactivator 1α
PI-3 phosphatidylinositol -3
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PI3K phosphatidylinositol -3 kinase

PKA protéine kinase A
PLTP protéine de transfert des phospholipides
POMC proopiomélanocortine
PPARγγ récepteur activé par les proliférateurs de péroxysomes gamma
PPRE PPAR response element
PRIME Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction
QTL quantitative trait locus
RAS ou RAAS renin-angiotensin-aldosterone system
RFLP restriction fragment length polymorphism
RR risque relatif
RTH rapport du tour de taille sur le tour de hanches
RXR récepteur de l’acide 9-cis rétinoïque
SCD stéaryl-coA désaturase
sdLDL small dense low density lipoprotein
SLC2A4 solute carrier family 2member 4
SNC système nerveux central
SNP single nucleotide polymorphism
SR scavenger receptor
SREBP sterol regulatory element-binding protein
TA tissu adipeux
TG triglycérides

8
 Liste des abréviations

α
TNFα tumor necrosis factor alpha
β
TRβ récepteur beta à l'hormone thyroïdienne
TZDs thiazolidinediones
UTR untranslating region
UV ultra violet
VEGF vascular endothelial growth factor
VLDL very low density lipoprotein
XBP X-box-binding protein
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tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Introduction
 Introduction

Avant-propos

Le concept de syndrome métabolique correspond à une association non fortuite chez

un individu d’une obésité abdominale, d’une hyperglycémie, d’une dyslipidémie et d’une
pression artérielle élevée. Ce syndrome est associé à un risque accru de diabète et de
maladies cardiovasculaires. Le syndrome métabolique est un désordre complexe, dont la
physiopathologie est encore mal connue. Aujourd’hui, on estime qu’un européen sur cinq
présente un syndrome métabolique et au vu des tendances outre-Atlantique, ce chiffre
pourrait encore augmenter. Bien que l’environnement « obésogène » dans lequel nous
vivons aujourd’hui soit à l’origine de l’augmentation de la prévalence de l’obésité et du
syndrome métabolique, il existe des différences entre les individus et l’on observe ainsi des
familles plus touchées que d’autres. Ainsi, l’origine du syndrome métabolique est
multifactorielle, résultant de l’interaction entre facteurs génétiques et environnementaux.
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L’identification des facteurs de susceptibilité génétique au syndrome métabolique et aux

phénotypes associés et la compréhension de leurs mécanismes d’action fournit des
informations précieuses pour comprendre les voies physiopathologiques impliquées dans
l’apparition de ces désordres métaboliques et potentiellement pour mieux les prévenir.

Le but de mes travaux a été d’identifier de nouveaux déterminants génétiques du

syndrome métabolique et des phénotypes associés. Pour cela, nous avons choisi plusieurs
gènes candidats impliqués dans différentes voies métaboliques dont l’altération peut
participer au développement du syndrome métabolique. Nous nous sommes ainsi intéressés
au gène FTO (fat mass and obesity-associated), identifié par les études d’association
génome entier comme déterminant génétique de l’obésité, aux gènes codant LXRα et LXRβ
(liver X receptor), récepteurs nucléaires régulant l’expression de nombreux gènes impliqués
dans le métabolisme glucido-lipidique, et aux gènes ANGPTL3, ANGPTL4 et ANGPTL6
(angiopoietin-like proteins), protéines plasmatiques impliquées dans le métabolisme
lipidique. Nous avons alors caractérisé la variabilité génétique commune de ces gènes,
recherché des associations entre les polymorphismes sélectionnés et les phénotypes
métaboliques dans différentes études de population (adultes et adolescents) et enfin, tenté
de comprendre les mécanismes moléculaires sous-tendant les associations observées en
population.

10
 Introduction

I. Définition et diagnostic du syndrome métabolique

I.1. Définitions

Le syndrome métabolique correspond à l’association, chez un individu, d’une obésité,

d’une insulinorésistance, d’une hyperglycémie, d’une dyslipidémie et d’une pression artérielle
élevée (Figure 1). Par définition, le terme syndrome (du grec sundromê qui signifie
« concours ») désigne un ensemble de signes cliniques ou de symptômes qu’un individu est
susceptible de présenter lors de certaines maladies ou dans des circonstances cliniques
d’écart à la norme pas nécessairement pathologique. De plus, le syndrome se distingue
traditionnellement de la maladie par l'absence de cause spécifique. Le métabolisme (du grec
meta qui signifie "changement, participation" et ballêin qui signifie "lancer") définit l’ensemble
des réactions biochimiques comprises dans la fonction de nutrition, grâce auxquelles un
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organisme est maintenu en vie. Les métabolismes des glucides et des lipides constituent les
principales voies du métabolisme énergétique. Leur régulation est complexe et permet le
maintien de l’homéostasie, en équilibrant la balance énergétique entre apports nutritionnels
et dépenses énergétiques.
Même si ces termes « syndrome » et « métabolique » le définissent assez bien, il
existe beaucoup de synonymes utilisés pour nommer ce concept, tels que syndrome X,
syndrome d’insulinorésistance, syndrome dysmétabolique ou encore syndrome
cardiométabolique, selon si les auteurs s’intéressent aux causes (comme
l’insulinorésistance) ou aux conséquences (maladies cardiovasculaires) de la présence d’un
tel syndrome chez un individu. L’origine de ce syndrome est encore mal connue. Différentes
hypothèses sont avancées : insulinorésistance, obésité viscérale, inflammation ou d’autres
facteurs encore inconnus. Dans tous les cas, la présence de ce syndrome chez un individu
favorise le développement de plaques d’athérome (accumulation de lipides et de cellules
dans les artères) et augmente ainsi fortement le risque cardiovasculaire.

I.2. Historique du concept

Dès 1923, Kylin observa une association entre hyperglycémie, hypertension et la

maladie de la goutte (maladie chronique liée au métabolisme de l’acide urique) [Kylin 1923].
En 1956, Vague fit le lien entre ce syndrome et l’obésité androïde (répartition de la masse
grasse au niveau de l’abdomen) et l’athérosclérose [Vague 1956]. La relation entre le
syndrome métabolique et l’hyperinsulinémie a été ensuite mise en évidence par Modan
[Modan et al. 1985], mais c’est Reaven, en 1988, qui mit l’insulinorésistance au cœur du

11
 Introduction

syndrome métabolique et qui lui donna le nom de syndrome X [Reaven 1988]. Enfin, Kaplan
désigna « deadly quartet » l’association entre obésité abdominale, intolérance au glucose,
hypertriglycéridémie et hypertension artérielle [Kaplan 1989]. Ce bref historique permet
d’illustrer l’évolution du concept de syndrome métabolique, où sont mises en avant, suivant
les époques et les auteurs, tantôt l’obésité abdominale, tantôt l’insulinorésistance.
Dans les années 1990, le concept de syndrome métabolique, en tant que
regroupement des principaux facteurs de risque cardiovasculaire, connut un intérêt croissant
notamment en santé publique. En effet, la forte mortalité causée par les maladies
cardiovasculaires (MCV) connaissait jusque là une nette diminution. Mais avec
l’augmentation mondiale de la prévalence de l’obésité et du diabète de type 2 (DT2), la
recherche de l’existence du syndrome métabolique permit alors d’identifier et de prendre en
charge précocement des individus à risque, alors qu’ils ne présentaient aucun signe
pathologique de MCV. Le syndrome métabolique est alors considéré comme une association
non fortuite de petites anomalies du métabolisme, qui ne présentent pas ou peu de risque
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individuellement, mais qui, lorsqu’elles sont combinées, augmentent fortement le risque de

MCV et de DT2.

I.3. Les critères de diagnostic du syndrome métabolique

Le syndrome métabolique regroupe 5 principaux phénotypes : une obésité

abdominale, un désordre glucidique, une hypertriglycéridémie, un taux de cholestérol
associé aux lipoprotéines de haute densité (HDL-cholestérol) anormalement faible, et une
pression artérielle élevée. L’obésité abdominale peut être estimée par différents paramètres,
tels que le tour de taille ou le rapport tour de taille sur tour de hanches (RTH). De même, le
désordre glucidique, résultant d’une mauvaise régulation de la glycémie, peut être
caractérisé par une glycémie à jeun anormalement élevée ou une mauvaise réponse de
l’organisme à une prise de glucose (intolérance au glucose). Ce désordre glucidique est
souvent lié à une résistance à l’insuline (insensibilisation des récepteurs à l’insuline dans les
tissus périphériques ne permettant plus de réguler normalement la glycémie et conduisant à
une hypersécrétion d’insuline par le pancréas) qui peut être elle-même estimée par le taux
d’insuline circulant.
Tous les groupes d’étude qui ont tenté de définir les critères de diagnostic du
syndrome métabolique se sont heurtés aux questions suivantes : quel paramètre utiliser pour
définir chaque phénotype, quelle méthode utiliser pour les mesurer, quelle valeur seuil
appliquer pour définir l’anormalité, et enfin quel poids donner à chaque phénotype dans le
développement du syndrome métabolique. Les définitions du syndrome métabolique les plus
connues sont celles de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), du European Group for

12
 Introduction

the Study of Insulin Resistance (EGIR), du National Cholesterol Education Program – Adult
Treatment Panel III (NCEP-ATPIII), de l’American Association of Clinical Endocrinologists
(AACE), de l’American Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institutut
(AHA/NHLBI) et de l’International Diabetes Federation (IDF).

I.3.a. Définition de l’OMS (1998-1999)

En 1998, l’OMS fut la première organisation à tenter de définir le syndrome
métabolique, le but n’étant guère de donner une définition arrêtée, mais plutôt d’offrir un outil
de travail pour de futures études. Convaincus que l’insulinorésistance est à l’origine du
développement du syndrome métabolique, les auteurs mirent l’accent sur la présence d’un
désordre insulinémique/glucidique dans le diagnostic du syndrome métabolique. Selon
l’OMS, ce désordre se caractérise par :
- une insulinorésistance, évaluée lors d’un clamp hyperinsulinémique
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euglycémique : captation du glucose inférieure au quartile le plus bas

- et/ou une mauvaise régulation de la glycémie, caractérisée par une
hyperglycémie modérée à jeun (6,1 - 7,0 mmol/L) ou une intolérance au glucose
(hyperglycémie provoquée par voie orale (HPO) à 2 heures entre 7,8 et 11,1
mmol/L)
- et/ou un diabète (glycémie à jeun ≥ 7,0 mmol/L ou HPO à 2 heures ≥ 11,1
mmol/L).
L’OMS définit alors un individu porteur du syndrome métabolique lorsqu’il présente un des
désordres glucidiques définis ci-dessus associé à au moins 2 des anomalies suivantes :
obésité abdominale (évaluée par l’indice de masse corporel (IMC) ou le RTH), hypertension
artérielle, dyslipidémie ou microalbuminurie (marqueur précoce du risque cardiovasculaire)
[World Health Organization 1999] (Tableau 1). Les inconvénients majeurs de cette définition
résident en l’utilisation du clamp hyperinsulinémique euglycémique et du dosage de
l’albuminurie, inapplicables aux grandes études épidémiologiques.

I.3.b. Définition de l’EGIR (1999)

Comme l’OMS, l’EGIR place l’insulinorésistance au centre du syndrome métabolique,
mais l’EGIR considère le DT2 comme une conséquence plutôt qu’un composant du
syndrome métabolique. Les individus diabétiques sont alors exclus de la définition.
L’insulinorésistance est évaluée par l’insulinémie à jeun. Le diagnostic du syndrome
métabolique correspond alors à une hyperinsulinémie plus au moins 2 des autres critères
[Balkau et al. 1999]. De plus, l’adiposité n’est pas évaluée par l’IMC ou le RTH, mais par le

13
 Introduction

tour de taille, considéré ici comme un meilleur marqueur de l’obésité abdominale

(Tableau 1).
I.3.c. Définition du NCEP (2001)
Le NCEP-ATPIII proposa en 2001 une nouvelle définition du syndrome métabolique,
essentiellement à visée clinique [2001] (Tableau 1). Contrairement aux deux précédentes,
cette définition n’inclut pas d’estimation de l’insulinorésistance, et le désordre glucidique
n’est plus un critère obligatoire. De plus, le facteur lipidique compte ici double puisque
l’hypertriglycéridémie et l’hypercholestérolémie sont des critères séparés. Le principal
avantage de cette définition est d’être basée sur des paramètres facilement mesurables, et
c’est pourquoi elle est la définition la plus utilisée dans le monde. Elle présente tout de même
un inconvénient car elle prend peu en compte le paramètre de l’insulinorésistance.

I.3.d. Définition de l’AACE (2003)

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En 2003, l’AACE fournit une nouvelle definition du syndrome métabolique plutôt

envisagé par les auteurs comme le syndrome d’insulinorésistance [Einhorn et al. 2003]. Les
seuils des concentrations de TG, HDL-cholestérol, glucose et de la pression artérielle sont
les mêmes que ceux du NCEP. Néanmoins, selon l’AACE, il n’existe pas de preuve
expérimentale suffisante pour définir un seuil d’insulinorésistance. C’est pourquoi ces
auteurs ne donnent pas de définition précise et pensent qu’il appartient au clinicien de
décider si un individu présente ou non ce syndrome. Ils considèrent que plus un individu
présente des désordres métaboliques, plus il a de risque d’être atteint du syndrome
d’insulinorésistance. Le manque de précision dans cette définition la rend inapplicable aux
études épidémiologiques.

I.3.e. Définition de l’AHA (2005)

En 2005, l’AHA/NHLBI reconnaît l’utilité et la validité des critères du NCEP mais y
apporte quelques modifications [Grundy et al. 2005] (Tableau 1). Le seuil d’hyperglycémie à
jeun a été abaissé à 5,6 mmol/L suivant les recommandations de l’ADA (American Diabetes
Association). De plus, la prise de traitements hypolipémiants ou hypotenseurs est désormais
prise en compte. Ces critères sont alors un peu plus inclusifs que ceux du NCEP de 2001.
Notons que cette définition est souvent nommée « updated NCEP » ou « NCEP modifié en
2005 » dans la littérature.

I.3.f. Définition de l’IDF (2005)

En 2005, un groupe d’experts regroupant de nombreuses spécialités touchant au
risque cardiovasculaire, sous l’égide de l’IDF, proposa une nouvelle définition du syndrome

14
 Introduction

métabolique à visée mondiale [Alberti et al. 2005]. Cette définition place l’obésité abdominale
au centre du syndrome métabolique en faisant d’un excès du tour de taille, un critère
indispensable au diagnostic. L’IDF propose également d’ajuster la valeur seuil du tour de
taille en fonction du groupe ethnique. Ainsi, pour la population européenne, ce seuil est à 94
cm pour les hommes et 80 cm pour les femmes (Tableau 1).

Au vu des débats actuels, il est fort probable que les critères de diagnostic du
syndrome métabolique évolueront encore. Ainsi de nouveaux paramètres, tels que les taux
de certains marqueurs de l’inflammation, d’adipokines ou encore d’hormones, pourraient être
pris en compte. Mais si les critères de diagnostic du syndrome métabolique font toujours
débat, il y a cependant consensus sur le fait que la détection d’un syndrome métabolique
chez une personne correspond à un risque accru de MCV.
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15
 Introduction

II. Epidémiologie du syndrome métabolique

II.1. Prévalence

Le syndrome métabolique fait partie des syndromes émergents. En effet, l’apparition

de ce syndrome est récente et semble être causée par l'évolution de notre environnement :
nous vivons aujourd’hui dans un environnement « obésogène » où l’accès à la nourriture est
devenu facile et illimité et où l’activité physique n’est plus nécessaire. Ainsi, la prévalence de
l’obésité a beaucoup augmenté au cours de ces 3 dernières décennies, et celle du syndrome
métabolique risque d’augmenter en parallèle. Même si l’estimation de sa prévalence est
rendue difficile par la diversité des définitions utilisées, de plus en plus de pays, industrialisés
ou en voie de développement, sont concernés par le syndrome métabolique (Figure 2)
[Cameron et al. 2004].
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Aux Etats-Unis, alors que 30% des adultes sont en surpoids (IMC compris entre 25 et
30 kg/m²) et 32% sont obèses (IMC ≥ 30kg/m²), le syndrome métabolique toucherait environ
un quart de la population [Ford et al. 2002] (Tableau 2). Sa prévalence varie selon l’origine
ethnique des individus, allant de 21,6% chez les Américains d’origine africaine, jusqu’à 31,9
% chez les Américains d’origine mexicaine [Ford et al. 2002]. De manière intéressante, il a
été montré que sa prévalence avait augmenté entre les 2 études NHANES (National Health
And Nutrition Examination Survey) de 1988-1994 et 1999-2000 [Ford et al. 2004]. Ainsi Ford
et al estimèrent que le syndrome métabolique touchait environ 50 millions d’Américains en
1990, et près de 64 millions en 2000. Cette augmentation peut s’expliquer à la fois par
l’augmentation de la prévalence de l’obésité ainsi que par le vieillissement de la population.
En Europe, le syndrome métabolique toucherait déjà un adulte sur quatre [Grundy 2008a].
Etant donné la complexité des études sur le syndrome métabolique due au manque
de définition consensuelle de ce syndrome, je me suis concentrée sur les données
épidémiologiques des populations d’origine caucasienne (Europe, Etats-Unis).

II.1.a. Prévalence des phénotypes du syndrome métabolique

Les cinq phénotypes caractéristiques du syndrome métabolique ont une prévalence
qui varie principalement en fonction de la région et du genre (Tableau 2). Une pression
artérielle élevée semble être l’une des composantes les plus fréquentes (environ 40%),
tandis que le désordre glucidique apparaît le moins fréquent (environ 10%). La prévalence
de l’obésité abdominale varie énormément selon le pays, passant du simple au double entre
l’Europe (étude DECODE regroupant 11 cohortes européennes [Hu et al. 2004]) et les Etats-
Unis (étude NHANES III [Ford et al. 2002]). Celle des dyslipidémies est plus homogène entre

16
 Introduction

pays mais diffère entre genre, les hommes étant presque 2 fois plus touchés que les
femmes. Ainsi, la prévalence du syndrome métabolique présente une grande variabilité en
fonction de la définition utilisée ainsi que des caractéristiques de la population étudiée, tels
que le genre, l’âge et la localisation géographique.

II.1.b. Prévalence du syndrome métabolique en fonction de sa définition

Les différences de paramètres et de seuils utilisés entre les définitions entraînent des
classifications différentes des individus. Les définitions de l’OMS et de l’EGIR, dont le pré-
requis est un désordre insulino-glucidique, sont moins inclusives (incluant moins d’individus)
que celles du NCEP, de l’AHA ou de l’IDF, et sélectionnent ainsi des individus plus
insulinorésistants. Dans la définition de l’EGIR, l’exclusion des individus diabétiques rend
cette définition encore moins inclusive. D’autre part, la définition de l’AHA est plus inclusive
que celle du NCEP du fait de l’abaissement du seuil d’hyperglycémie à 5,6 mmol/L, de la
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prise en compte des traitements et de l’inclusion des individus ayant un tour de taille égal à
102/88 cm (homme/femme). Enfin, les critères de l’IDF, dont l’obésité abdominale est le pré-
requis, seraient encore plus inclusifs que ceux du NCEP ou de l’AHA.
De nombreuses études ont comparé la prévalence du syndrome métabolique entre
les différentes définitions (Tableaux 3 et 4). Ainsi, on peut constater que la prévalence du
syndrome métabolique défini par l’EGIR est bien inférieure à celle des autres définitions (10
à 15%) (Tableau 4) [Mattsson et al. 2007; Nilsson et al. 2007; Balkau et al. 2002]. De plus, il
apparaît clairement que la prévalence du syndrome métabolique selon l’IDF est plus élevée
que les autres définitions (jusqu’à 40%), et ce dans les études américaines et européennes
(Tableaux 3 et 4) [Ford 2005; Lorenzo et al. 2007; Bataille et al. 2006; Assmann et al. 2007;
Csaszar et al. 2006; Athyros et al. 2005; Lorenzo et al. 2006]. Par ailleurs, les études
semblent se contredire sur la différence de prévalence entre les définitions de l’OMS et du
NCEP. Selon l’étude américaine NHANES 1988-1994 [Ford et al. 2003] la prévalence du
syndrome métabolique est similaire entre ces 2 définitions, tandis que dans l’étude franco-
irlandaise PRIME (Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction), la prévalence
du syndrome métabolique selon la définition de l’OMS est plus élevée que celle du NCEP
[Bataille et al. 2006]. Il semble que le genre interagisse fortement avec le type de définitions
utilisé comme le suggèrent les différences de prévalence observées entre les définitions de
l’OMS et du NCEP et entre hommes et femmes dans l’étude finlandaise [Dekker et al. 2005].
Enfin, les modifications des critères du NCEP par l’AHA suffisent à provoquer une nette
augmentation de la prévalence du syndrome métabolique selon les données des Centres
d’Examens de Santé Français, passant ainsi de 10 à 18 % chez les hommes et de 9 à 14%
chez les femmes, âgés de 20 à 74 ans [Balkau et al. 2007; Ford et al. 2004].

17
 Introduction

II.1.c. Prévalence du syndrome métabolique en fonction du genre

Comme de nombreuses voies métaboliques impliquées dans la physiopathologie du
syndrome métabolique sont soumises à des régulations hormonales, il apparaît important de
distinguer les hommes des femmes. Mais encore une fois, la différence de prévalence du
syndrome métabolique entre hommes et femmes n’apparaît pas clairement et est rendue
difficile par la diversité des définitions utilisées. Si l’on s’intéresse aux critères de l’OMS, la
prévalence du syndrome métabolique semble plus élevée chez les hommes que chez les
femmes dans plusieurs études américaines et européennes (Tableaux 3 et 4) [Ford et al.
2003; Lorenzo et al. 2007; Tillin et al. 2005; Boronat et al. 2005; Balkau et al. 2002; Hu et al.
2004]. Cette même tendance est également observée avec la définition de l’IDF [Lorenzo et
al. 2007; Assmann et al. 2007; Csaszar et al. 2006], ainsi que dans la méta-analyse réalisée
par l’EGIR en 2002 (n=17561) [Balkau et al. 2002]. Cependant, lorsque l’on regarde les
études ayant utilisé les critères du NCEP ou de l’AHA, cette tendance semble s’inverser
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[Dekker et al. 2005; Csaszar et al. 2006; Miccoli et al. 2005; Lorenzo et al. 2006; Santos et
al. 2003; Ford 2005].
La différence de prévalence du syndrome métabolique entre genre et les
contradictions observées entre définitions peuvent s’expliquer par la différence de
prévalence de chaque phénotype du syndrome métabolique entre genre. En effet, une
pression artérielle élevée, une dyslipidémie et un désordre glucidique sont plus fréquents
chez les hommes, tandis que l’obésité semble plus fréquente chez les femmes [Hu et al.
2004; Ford et al. 2002]. De plus, les différents phénotypes du syndrome métabolique
peuvent avoir un impact différent sur l’apparition du syndrome entre hommes et femmes
[Dallongeville et al. 2004]. Ainsi, une augmentation du poids et du tour de taille ainsi qu’un
taux plasmatique de HDL-cholestérol bas contribuent plus au syndrome chez les femmes
que chez les hommes. Au contraire, une pression artérielle élevée contribue plus chez les
hommes que chez les femmes à l’apparition du syndrome [Dallongeville et al. 2004].

II.1.d. Prévalence du syndrome métabolique en fonction de l’âge

Toutes les études et toutes les définitions s’accordent pour dire que la prévalence du
syndrome métabolique augmente avec l’âge, parallèlement à celle de l’obésité. Dans l’étude
NHANES III, la prévalence du syndrome métabolique ne cesse d’augmenter jusqu’à 60 ans :
de 6,7% chez les 20-29 ans jusqu’à 43,5% chez les sexagénaires [Ford et al. 2002].
Cependant, après 70 ans, cette prévalence se stabilise et tend même à diminuer,
certainement à cause du fait que les individus les plus exposés au risque de mortalité
associée à l’obésité sont plus susceptibles de mourir avant cet âge [Ford et al. 2002]. Dans
la méta-analyse de l’EGIR, la prévalence du syndrome métabolique augmente également
graduellement avec l’âge. Par exemple, si la définition de l’OMS est utilisée, la prévalence

18
 Introduction

est de 14% ou 4% (hommes ou femmes) pour les adultes de moins de 40 ans, 23% ou 13%
pour les 40-55 ans, jusque 41% ou 26% pour les plus de 55 ans [Balkau et al. 2002]. Cette
augmentation reflète l’augmentation physiologique de la pression artérielle et de la glycémie
avec l’âge. De manière intéressante, les auteurs de la méta-analyse de l’EGIR ont remarqué
que la fréquence de l’hyperinsulinémie augmentait très peu avec l’âge : chez les hommes
non diabétiques elle passe de 27% chez les moins de 40 ans à 33% chez les plus de 55 ans,
alors que la fréquence du syndrome métabolique double entre ces 2 classes d’âge [Balkau
et al. 2002], ce qui illustre l’importance des autres composantes du syndrome métabolique à
prendre en compte dans la définition.

II.2. Morbidité et mortalité associées au syndrome métabolique

II.2.a. Risque cardiovasculaire

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De nombreuses études ont montré que le syndrome métabolique est associé à un

risque accru de MCV ainsi que de décès par MCV. La méta-analyse de Gami et al, qui
regroupe 43 cohortes réparties sur les 5 continents (n=172573), permet une vue globale de
ce risque [Gami et al. 2007]. Les individus de cette étude porteurs du syndrome métabolique
ont une augmentation du risque (estimé par l’odds ratio ou OR) de MCV (OR=2,18) et de
maladie coronaire (OR=1,65) (Figure 3). Notons également que le syndrome métabolique est
associé à une augmentation du risque de mortalité globale (OR=1,60). De plus, le risque
cardio-vasculaire (fatal ou non) semble être plus marqué chez les femmes que chez les
hommes (OR=2,63 chez les femmes contre 1,98 chez les hommes). Par ailleurs, dans
l’étude américaine NHANES III (n=10357), le syndrome métabolique est associé à un risque
accru d’infarctus du myocarde (OR=2,01) et d’accident vasculaire cérébral (AVC) (OR=2,16)
[Ninomiya et al. 2004]. Dans l’étude française DESIR (Données Epidémiologiques sur le
Syndrome d’Insulino-Résistance), le syndrome métabolique (défini par le NCEP) est associé
à une augmentation du risque de MCV chez les hommes (OR=1,4) et les femmes (OR=1,7)
(n=3910) [Hillier et al. 2006].
De façon prévisible, l’estimation du risque de MCV varie en fonction des critères du
syndrome métabolique utilisés : ainsi, dans la méta-analyse de Gami, le syndrome
métabolique estimé par les critères de l’OMS est associé à un risque de MCV et de décès
plus important par rapport aux critères du NCEP (OR=2,06 contre 1,67). Le risque de MCV
(fatale ou non) associé au syndrome métabolique a été comparé entre les définitions de
l’EGIR, de l’AHA et de l’IDF dans une cohorte suédoise de 1991-1996 (n=5047, 46-68 ans)
d’individus non diabétiques [Nilsson et al. 2007]. Le risque relatif (RR) est assez faible si la
définition de l’IDF est prise en compte (RR=1,37 contre 1,95 pour l’AHA et 1,55 pour l’EGIR),
remettant en question la valeur des critères de l’IDF quant à la prédiction du risque de MCV.

19
 Introduction

L’accumulation de facteurs de risque chez un même individu confère une

augmentation du risque par rapport à la présence d’un seul facteur. C’est pourquoi le
syndrome métabolique, qui regroupe les 5 principaux facteurs de risque de MCV, est associé
à un risque plus important que chacun des composants seuls. Par exemple, dans l’étude
NHANES III, il a été montré que ce syndrome est associé à un risque d’infarctus du
myocarde ou d’AVC plus important (OR=2,05) que ne l’est l’insulinorésistance (OR=1,30), le
taux de HDL-cholestérol bas (OR=1,35), la pression artérielle élevée (OR=1,44) ou
l’hypertriglycéridémie (OR=1,66) [Ninomiya et al. 2004]. Mais la question de savoir si le
risque cardiovasculaire associé au syndrome métabolique est plus important que la simple
somme des risques associés à chaque composante fait toujours débat [Kahn et al. 2005;
Grundy 2006b].
Notons qu’il a été observé que les individus ne présentant qu’une ou deux
composantes du syndrome métabolique présentent également un risque relatif élevé de
décès par MCV (RR=1,73) par rapport aux individus ne présentant aucun facteur de risque
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[Malik et al. 2004]. De plus, le risque de décès par MCV reste élevé chez les individus
porteurs du syndrome métabolique même s’ils ne présentent pas de DT2 (RR=1,56) [Malik et
al. 2004].

II.2.b. Risque de diabète de type 2 (DT2)

La prévalence du DT2 a triplé au cours de ces 30 dernières années, atteignant 8,2%
des individus de l’étude NHANES en 2000 [Gregg et al. 2004]. Le DT2 est caractérisé par un
taux élevé de glucose dans le sang, entraînant une altération de la production d’insuline et
de son action. L’insulinorésistance est la principale caractéristique du pré-diabète, mais c’est
la déficience en sécrétion d’insuline qui est en fait la cause physiopathologique du DT2. La
plupart des patients diabétiques ont présenté une insulinorésistance et un syndrome
métabolique avant l’apparition du DT2 [Reaven 2005a]. En effet, une insulinorésistance, une
hyperinsulinémie, une dyslipidémie et une obésité précèdent l’apparition du DT2 dans 75 à
85% des cas [Meigs et al. 2007]. Dans la cohorte de Framingham (n=3323, 22-81 ans)
[Wilson et al. 2005], environ la moitié des nouveaux cas de DT2 étaient porteurs du
syndrome métabolique (selon le NCEP). On a estimé que les individus porteurs d’un
syndrome métabolique ont un risque de DT2 multiplié par 5 [Grundy 2006b; Ford et al.
2008b]. Dans l’étude française DESIR (n=3774), le syndrome métabolique (défini par le
NCEP) est associé à une augmentation du risque de DT2 chez les hommes (OR=2,4) et les
femmes (OR=3,4) [Hillier et al. 2006].
De nombreuses études ont évalué la capacité du syndrome métabolique à prédire
l’apparition du DT2. Cette capacité à prédire l’apparition d’un DT2, estimée par la sensibilité
(taux de faux négatifs) et la spécificité (taux de faux positifs), dépend des critères utilisés

20
 Introduction

pour définir le syndrome métabolique. En effet, la présence d’un désordre glucidique n’est
pas un critère obligatoire dans les définitions du NCEP, de l’AHA et de l’IDF, contrairement
aux définitions de l’OMS et de l’EGIR. Or, même si toutes les composantes du syndrome
métabolique sont associées à une augmentation du risque de DT2, l’hyperglycémie à jeun
ainsi que l’intolérance au glucose, même modérées, sont bien sûr associées à un risque de
DT2 plus important que les autres phénotypes [Bonora et al. 2004; Eckel 2007]. On peut
alors s’attendre à ce que les définitions de l’OMS et de l’EGIR aient une meilleure capacité
de prédiction du DT2. Ainsi, dans l’étude finlandaise Kuopio (1005 hommes), la définition de
l’OMS est plus sensible que celle du NCEP car elle permet de détecter 83% des cas
prévalent et 67% des cas incidents (contre 61% et 41% pour le NCEP, respectivement),
avec une bonne spécificité (0,78-0,80), mais, étant donné que l’OMS prend en compte les
individus diabétiques, sa capacité de prédiction semble alors plutôt décevante [Laaksonen et
al. 2002a]. De plus, il a été montré, dans la San Antonio Heart Study (n=1734), que si le
critère de l’intolérance au glucose n’est pas pris en compte dans la définition de l’OMS, alors
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celle du NCEP a une meilleure sensibilité (53% contre 43%), suggérant que les critères
autres que celui du désordre glucidique sont mieux définis par le NCEP que par l’OMS
[Lorenzo et al. 2003].

II.2.c. Autres maladies ou conditions associées

Le syndrome métabolique serait également associé à une augmentation du risque de
déclin cognitif (OR=1,21) [Yaffe 2007] et de démence d’origine vasculaire (RR=2,42)
[Raffaitin et al. 2009]. Le syndrome métabolique entraînerait aussi une augmentation du
risque de cancer, notamment du cancer colorectal chez les hommes (RR=1,7-3,0 selon les
études) [Cowey et al. 2006].
Il existe aussi de nombreuses maladies liées à la physiopathologie du syndrome
métabolique. C’est le cas de la stéatose hépatique non alcoolique : en effet, la masse grasse
tend à s’accumuler dans le foie chez les individus ayant un syndrome métabolique [Kotronen
et al. 2007]. Ainsi, l’incidence de la stéatose hépatique non alcoolique est multipliée par 4
chez les hommes et par 11 chez les femmes présentant un syndrome métabolique
[Hamaguchi et al. 2005]. Chez les hommes, la prévalence de l’hypogonadisme semble plus
élevée chez les porteurs du syndrome métabolique [Corona et al. 2007], et inversement,
l’hypogonadisme est un facteur de risque du syndrome [Kalyani et al. 2007]. Chez les
femmes, la prévalence du syndrome métabolique augmente après la ménopause, mais on
ne sait pas si cela est dû à l’âge ou au déficit hormonal [Carr 2003]. Le syndrome des
ovaires polykystiques, caractérisé par une anovulation, un excès d’androgènes et une
insulinorésistance, est aussi fortement lié au syndrome métabolique : en effet, un tiers des
femmes présentant ce syndrome ont aussi un syndrome métabolique [Ehrmann et al. 2006].

21
 Introduction

L’apnée du sommeil, qui est une conséquence de l’obésité, est aussi associée à
l’insulinorésistance et au syndrome métabolique : les individus souffrant d’apnée du sommeil
présentent plus souvent un syndrome métabolique par rapport aux autres individus, même si
l’on ajuste sur l’obésité [Parish et al. 2007]. Les lipodystrophies, caractérisées par une
répartition anormale de la graisse (diminution du tissu adipeux, augmentation des dépôts
ectopiques de graisse) et une insulinorésistance sévère, ont une physiopathologie liée à
celle du syndrome métabolique. Ainsi, les patients souffrant de lipodystrophie présentent les
mêmes caractéristiques que ceux présentant un syndrome métabolique [Monajemi et al.
2007]. Enfin, le syndrome métabolique semble être associé à des maladies
microvasculaires : environ 10% des individus non diabétiques présentant une hyperglycémie
modérée à jeun ou une intolérance au glucose et un syndrome métabolique sont atteints
d’une rétinopathie [Tyrberg et al. 2008; 2007c].

II.3. Le syndrome métabolique chez les enfants et les adolescents

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De récentes études soutiennent l’idée que la présence d’un syndrome métabolique

dès l’enfance serait un important facteur prédictif d’un futur DT2 et de MCV [Zimmet et al.
2007]. L’identification du syndrome métabolique chez les jeunes rencontre le même
problème que chez les adultes, à savoir la diversité des définitions utilisées. Une récente
revue révéla l’existence de 27 publications utilisant 40 critères différents [Ford et al. 2008a].
Les effets de la croissance et des changements hormonaux opérant au cours de la puberté
sur la sensibilité à l’insuline et le profil lipidique rendent l’établissement des critères encore
plus difficile. La prévalence du syndrome métabolique chez les jeunes varie ainsi en fonction
de l’âge de la population étudiée et de la définition utilisée.
Dans l’étude américaine NHANES 1986-1994 (n=2430, 12-19 ans), la prévalence du
syndrome métabolique selon la définition de Cook et al [Cook et al. 2003] est de 4,2% (6,1%
chez les garçons et 2,1% chez les filles), alors qu’elle est de 9,2% selon les critères de De
Ferranti et al dans ce même échantillon [de Ferranti et al. 2004] (Tableau 5). De même, dans
une étude allemande de 1999-2005 (n=1205, 4-16 ans), la prévalence du syndrome
métabolique double entre la définition de Cook et al (21%) et celle de De Ferranti et al (39%)
[Reinehr et al. 2007]. Cette différence est en fait due au seuil du tour de taille qui est
beaucoup plus bas dans la définition de De Ferranti et al, rendant ainsi ces critères
beaucoup trop inclusifs. Dans ce même échantillon, la prévalence du syndrome métabolique
est de 18% selon la définition de Viner et al [Viner et al. 2005], et de 29% selon celle de
Weiss et al [Weiss et al. 2004]. Cette différence semble s’expliquer par le critère de la
dyslipidémie plus restrictif dans la définition de Viner et al. Remarquons que seuls 9% des

22
 Introduction

enfants de cet échantillon sont en commun entre ces 4 définitions. Ce faible recoupement
suggère fortement qu’aucune de ces définitions n’est en réalité satisfaisante.
De nombreuses études ont évalué la prévalence du syndrome métabolique chez les
jeunes en surpoids ou obèses. Dans l’étude NHANES 1986-1994, 6,8% des jeunes en
surpoids et 28,7% (de 12,4 à 44,2% selon la définition utilisée) des jeunes obèses
présentent un syndrome métabolique [Cook et al. 2008; Cook et al. 2003]. En Europe, la
prévalence du syndrome métabolique chez les jeunes en surpoids ou obèses varie de 16,4 à
35,7% selon les critères utilisés [Bokor et al. 2008; Invitti et al. 2006; Viner et al. 2005;
Lopez-Capape et al. 2006; Druet et al. 2006]. De plus, il a été montré que les enfants ayant
un IMC ou un tour de taille élevé ont un risque accru de développer un syndrome
métabolique à l’âge adulte [Sun et al. 2008].
Il existe également une forte corrélation entre DT2 et syndrome métabolique chez les
jeunes : chez des adolescents en surpoids ayant des antécédents familiaux de DT2, la
prévalence du syndrome métabolique est comprise entre 26 et 39% selon les définitions
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[Shaibi et al. 2008]. De plus, il a été estimé que 92% des adolescents atteints d’un DT2
présentent un syndrome métabolique [Rodriguez et al. 2006; Duncan 2006]. Enfin,
l’incidence du syndrome métabolique à l’âge adulte est multipliée par 3 chez les individus
ayant présenté ce syndrome dès l’enfance [Morrison et al. 2008].
Etant donné l’augmentation de la prévalence du surpoids et de l’obésité chez les
jeunes [Ogden et al. 2002] et la corrélation entre le syndrome métabolique et l’obésité, il
n’est pas surprenant que la prévalence du syndrome métabolique ait augmenté chez les
jeunes au cours de ces dernières années. Ainsi, cette prévalence est passée de 4,2 à 6,2%
entre l’étude NHANES de 1986-1994 et celle de 1999-2000, et ce de manière similaire entre
garçons et filles [Duncan et al. 2004].

23
 Introduction

III. Les principaux phénotypes du syndrome métabolique et

leurs voies métaboliques

L’apparition d’un syndrome métabolique chez un individu est le résultat d’un long
processus mettant en jeu de nombreuses voies physiopathologiques, et commençant très tôt
dans la vie [Ozanne et al. 2004]. Ce chapitre détaille les principales composantes du
syndrome métabolique, c’est-à-dire le métabolisme du tissu adipeux, l’homéostasie
glucidique, le métabolisme des lipides et l’hypertension artérielle.

III.1. L’obésité abdominale

III.1.a. Définition et mesure

L’obésité se définit par un excès de masse grasse. Il existe deux principaux types
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d’obésité : le type gynoïde (rencontré principalement chez les femmes) où l’excès de gras se
dépose principalement autour des hanches, et le type androïde (plutôt rencontré chez les
hommes) où l’excès de gras est localisé au niveau du tronc et de l’abdomen. L’obésité
abdominale (ou centrale) est donc plutôt associée au type androïde. De plus, on distingue
deux formes de localisation de la graisse : le tissu adipeux (TA) sous-cutané et le TA
viscéral. Le TA sous-cutané se situe entre la peau et le muscle, tandis que le TA viscéral est
situé dans les cavités du corps, essentiellement dans la cavité abdominale.
L’obésité est classiquement mesurée par l’indice de masse corporel (IMC), défini par
le rapport de la masse sur la taille élevée au carré. L’obésité abdominale peut être estimée
par le rapport tour de taille sur tour de hanches (RTH), marqueur d’une obésité androïde ou
la mesure du périmètre abdominal (ou tour de taille). On peut également évaluer la quantité
de masse grasse en mesurant les plis cutanés (situés au niveau des biceps, triceps, du
mollet, les plis sous-scapulaire et supra-iliaque). En plus de ces méthodes
anthropométriques, il existe des techniques plus sensibles pour quantifier la masse grasse,
telles que la bioimpédancemétrie, la DXA (dual-energy X-ray absorptiometry), la
tomodensitométrie ou la résonance magnétique. Parmi ces techniques, seules les deux
dernières permettent de distinguer le TA abdominal viscéral du TA abdominal sous-cutané
mais elles sont trop coûteuses et complexes pour la pratique clinique ou les grandes études
épidémiologiques. Le tour de taille semble être l’une des meilleures mesures corrélées à la
graisse viscérale et aux complications métaboliques et est très souvent utilisé [Pouliot et al.
1994; Han et al. 1995]. Les résultats d’une récente méta-analyse suggèrent que le rapport
tour de taille sur la taille serait le meilleur facteur de prédiction du risque cardiovasculaire
[Lee et al. 2008].

24
 Introduction

III.1.b. La différenciation adipocytaire

Le plus grand réservoir d’énergie de l’organisme est le TA, composé d’adipocytes (les
plus nombreux) et de cellules stroma-vasculaires. Les adipocytes sont les cellules de
stockage et de relargage de l’énergie : en période d’abondance nutritionnelle, ces cellules
stockent l’énergie sous forme de triglycérides (TG) et la libèrent sous forme d’acides gras
libres (AGL) et de glycérol en période de privation [Kahn et al. 2000]. Les adipocytes peuvent
accroître leur volume jusqu’à 10 fois pour stocker l’excès de TG (de 20 à 200 µm de
diamètre) conférant ainsi au TA une capacité de croissance quasi illimitée [Fruhbeck et al.
2001; Rajala et al. 2003]. Les cellules stroma-vasculaires comprennent les pré-adipocytes et
des cellules immunitaires telles que les macrophages [Fantuzzi 2005; Kershaw et al. 2004].
Les macrophages ont tendance à s’accumuler en grande quantité en cas d’excès de dépôt
adipeux [Fantuzzi 2005]. Ces 3 types cellulaires, adipocytes, pré-adipocytes et
macrophages, peuvent subir des changements aboutissant à un processus inflammatoire et
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un dysfonctionnement métabolique.
Une dérégulation du métabolisme du TA conduit aux désordres métaboliques
observés dans le syndrome métabolique. La différenciation adipocytaire est un processus
complexe dont une mauvaise régulation peut entraîner des complications métaboliques. Les
pré-adipocytes se différencient en adipocytes qui vont se développer, se répliquer et mourir
sous le contrôle de facteurs de transcription en interaction avec des signaux cellulaires. Ces
facteurs de transcription comprennent des membres de la famille CEBP (CAAT-enhancer
binding proteins), le facteur SREBP1 (sterol regulatory element binding protein 1) et PPARγ
(récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes) [MacDougald et al. 1995; Rosen et
al. 2000]. PPARγ est considéré comme le chef d’orchestre de la différenciation adipocytaire.
Ce récepteur nucléaire est activé par les AGL ainsi que par les thiazolidinediones (TZDs),
médicaments antidiabétiques [Lehmann et al. 1995], et induit l’expression de nombreux
gènes spécifiques des adipocytes [Tontonoz et al. 1994]. Des hormones et des cytokines,
telles que l’insuline, le glucagon, les glucocorticoïdes, les rétinoïdes, la prostacycline et le
TNFα (tumor necrosis factor alpha) coordonnent une cascade de signalisation aboutissant à
des facteurs de transcription régulant l’expression de gènes impliqués dans la différenciation
et le maintien du phénotype adipocytaire. Ainsi, en réponse à l’insuline, l’expression des
gènes codant le transporteur de glucose GLUT4 (gène SLC2A4), l‘AG synthase (FAS), la
stéaryl-coA désaturase (SCD), la leptine et la fatty acid-binding protein (FABP4) est
caractéristique des adipocytes différenciés et matures. Une dérégulation du métabolisme du
TA est caractéristique des individus obèses, mais peut aussi être observée chez des
individus de poids normal. Cette dérégulation peut entraîner une insulinorésistance, une

25
 Introduction

augmentation de la lipolyse, un dysfonctionnement endothélial et la sécrétion d’adipokines

pro-inflammatoires.

Chez les mammifères, il existe un second type de TA, le tissu adipeux brun. Tandis
que le TA blanc est considéré comme le premier site de stockage de l’énergie et de
régulation de l’ensemble du métabolisme corporel, le TA brun a longtemps été considéré
comme inexistant ou métaboliquement inactif chez l’adulte [Cannon et al. 2004]. Le TA brun
est le site de la thermogenèse et joue un rôle important chez les nouveau-nés car il aide au
maintien de la température corporelle. Le TA brun se distingue du TA blanc par les
caractéristiques de ses adipocytes : ils contiennent de nombreuses petites gouttelettes
lipidiques (contrairement à une seule grande gouttelette lipidique dans les adipocytes du TA
blanc) et un grand nombre de mitochondries. De plus, le TA brun contient plus de capillaires
sanguins. De récentes études ont montré qu’il existait des dépôts de TA brun chez les
adultes, métaboliquement actifs et localisés au niveau du cou jusqu’au thorax [Virtanen et al.
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2009; Cypess et al. 2009]. Ces dépôts seraient plus fréquents chez les femmes que chez les
hommes. De manière intéressante, la quantité de TA brun serait inversement corrélée à
l’IMC, suggérant un rôle dans le métabolisme énergétique chez l’adulte [Cypess et al. 2009].

III.1.c. Fonctions endocriniennes du tissu adipeux

Les fonctions endocriniennes du TA blanc sont maintenant reconnues. En effet, les
adipocytes sécrètent de nombreuses protéines, appelées adipokines ou adipocytokines, ce
qui leur confère la capacité d’interagir entre eux, ainsi qu’avec d’autres organes, tels que le
foie, le cerveau et les muscles [Kershaw et al. 2004; Ailhaud 2006; Havel 2002; Mohamed-
Ali et al. 1998; Shimomura et al. 1996; Hotamisligil et al. 1995; Trayhurn et al. 2005]. Ces
adipokines ont non seulement des fonctions de régulation du métabolisme énergétique mais
aussi des propriétés inflammatoires.
La leptine est sûrement l’adipokine la plus connue : une mutation du gène de la
leptine ou de son récepteur entraîne une obésité massive chez la souris (ob/ob et db/db) et
l’homme. La leptine est synthétisée par le TA et le taux circulant de leptine est directement
corrélé et proportionnel à la quantité de ce TA [Maffei et al. 1995]. Son principal rôle est de
contrôler l’appétit : par sa fixation à son récepteur au niveau de l’hypothalamus, elle exerce
un rôle anorexigène (elle diminue l’appétit) [Otero et al. 2005; Otero et al. 2006], et elle
favorise la consommation d’énergie au niveau du TA (thermogenèse et lipolyse). De plus,
elle diminue la sécrétion d’insuline ainsi que la néoglucogenèse. Aujourd’hui, la leptine est
considérée comme l’un des liens fonctionnels entre homéostasie énergétique et système
immunitaire. En effet, outre ses propriétés anorexigènes, elle exerce un rôle pro-
inflammatoire, en stimulant la prolifération et l’activation des lymphocytes T, ainsi que

26
 Introduction

l’activation des monocytes, la phagocytose et la production de cytokines [Fantuzzi et al.

2000; Sanchez-Margalet et al. 2003; La Cava et al. 2004]. Au niveau des cellules
endothéliales, elle induit un stress oxydant et la production de molécules d’adhésion,
favorisant ainsi le développement de plaques athéromateuses [Fantuzzi et al. 2000;
Sanchez-Margalet et al. 2003; La Cava et al. 2004]. D’autres cytokines sécrétées par le tissu
adipeux, telles que l’interleukine 6 (IL-6), le TNF-α et le plasminogen activator inhibitor-1
(PAI-1), participent également à l’inflammation chronique du système vasculaire (locale et
systémique) [Fantuzzi 2005; Trayhurn et al. 2005; Lyon et al. 2003].
L’adiponectine est l’adipokine la plus abondamment sécrétée par les adipocytes.
Contrairement à la leptine, le taux d’adiponectine circulant diminue chez les individus obèses
[Arita et al. 1999]. Son rôle dans la sensibilité à l’insuline est bien connu : sa concentration
est inversement corrélée à celles de l’insuline et du glucose (à jeun) [Hotta et al. 2000], et
diminue chez les patients diabétiques [Arita et al. 1999]. En effet, l’adiponectine active
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l’adénosine monophosphate kinase (AMPK) d’une part, dans les muscles, induisant ainsi la
translocation du transporteur de glucose GLUT4 et la captation du glucose, et d’autre part,
dans le foie, inhibant ainsi la néoglucogenèse [Kadowaki et al. 2005]. Par ailleurs,
l’adiponectine possède également des propriétés vasoprotective, angiogénique, anti-
inflammatoire et anti-athérogénique [Ouchi et al. 2006; Gable et al. 2006]. En effet,
l’adiponectine diminue la production d’IL-6 et de TNF-α, induit la production de cytokines
anti-inflammatoires [Kumada et al. 2004; Wolf et al. 2004; Wulster-Radcliffe et al. 2004] et
inhibe la production de molécules d’adhésion dans les cellules endothéliales [Ouchi et al.
1999; Kawanami et al. 2004]. L’adiponectine exerce donc des effets opposés à ceux de la
leptine.
La résistine est une autre adipokine sécrétée par les adipocytes, mais aussi et surtout
par les macrophages [Gerstmayer et al. 2003]. Le traitement des souris par de la résistine
recombinante induit une insulinorésistance [Steppan et al. 2001]. Son expression augmente
lors d’une inflammation [Lehrke et al. 2004] et stimule la production de molécules d’adhésion
dans les cellules endothéliales [Kawanami et al. 2004].
Le TA libère aussi des cytokines, telles que IL-6 et TNFα, dont la production
augmente chez les individus obèses [Cottam et al. 2004]. IL-6 est une cytokine inflammatoire
induite par le stress, directement impliquée dans l’athérogenèse [Lyon et al. 2003]. Il a été
montré que le TA viscéral produit plus d’IL-6 que le TA sous-cutané [Fain et al. 2004; Fried
et al. 1998]. La concentration sérique d’IL-6 est un facteur prédictif du risque
cardiovasculaire [Ruan et al. 2003]. TNFα, quant à elle, est une cytokine aux nombreuses
fonctions, impliquée dans l’inflammation chronique contribuant à l’athérosclérose et à la
production d’autres cytokines pro-inflammatoires [Ruan et al. 2003; Lyon et al. 2003]. TNFα

27
 Introduction

inhibe aussi directement la signalisation de l’insuline en induisant la phosphorylation d’un

résidu sérine du récepteur à l’insuline [Hotamisligil et al. 1994]. TNFα active NFκB (nuclear
receptor kappa B), facteur de transcription induisant une inflammation dans le tissu
vasculaire, menant à une dysfonction endothéliale [Lyon et al. 2003; Park et al. 2005]. Enfin,
TNFα inhibe l’expression de l’adiponectine dans le TA viscéral, contrant ainsi ses effets
[Matsuzawa 2006].

III.1.d. Lipolyse du tissu adipeux

Lors du jeûne, la lipolyse du TA blanc, consistant en l’hydrolyse des stocks de TG et
au relargage d’AGL et de glycérol dans le sang, permet l’apport en substrats énergétiques
aux autres organes. La libération d’AGL est également importante pour la synthèse
hépatique des VLDL (very low density lipoprotein) [Duncan et al. 2007]. Une altération de la
régulation de la lipolyse est associée à l’obésité et à l’insulinorésistance [Large et al. 1999].
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Jusque récemment, l’initiation de l’hydrolyse des TG était attribuée à la lipase

hormono-sensible (HSL) [Barroso et al. 1999]. L’HSL est une protéine cytoplasmique
hydrolysant différents substrats dont les TG et les diglycérides (DG) [Holm 2003]. En 2004,
plusieurs équipes ont identifié la desnutrine, ou lipase des TG adipeux (ATGL), et ont révélé
son rôle majeur dans l’hydrolyse des TG en DG, étape limitante de la lipolyse [Villena et al.
2004; Zimmermann et al. 2004] (Figure 4). L’ATGL est localisée à la fois dans le cytoplasme
mais aussi fixée à la gouttelette lipidique [Villena et al. 2004; Zimmermann et al. 2004]. C’est
une lipase spécifique des TG [Zimmermann et al. 2003] et son expression est induite lors du
jeûne et inhibée après l’ingestion d’un repas [Villena et al. 2004]. En fait, les deux enzymes
HSL et ATGL agissent en synergie sur la lipolyse [Zimmermann et al. 2003]. La 2ème étape
de la lipolyse, consistant en l’hydrolyse des DG en monoglycérides (MG), est catalysée par
la HSL [Giudicelli et al. 1974]. Enfin, l’hydrolyse de MG en glycérol, l’ultime étape de la
lipolyse, est catalysée par la monoglycéride lipase (MGL) [Fredrikson et al. 1986].
La gouttelette lipidique des adipocytes compte de nombreuses protéines fixées à sa
surface et intervenant dans la synthèse, le stockage et l’utilisation des lipides [Liu et al.
2004]. La périlipine est la protéine majoritaire associée aux gouttelettes lipidiques
[Greenberg et al. 1991]. Elle agit comme une barrière protectrice limitant le taux de lipolyse
de base [Brasaemle et al. 2000]. Sa phosphorylation par la protéine kinase A (PKA) entraîne
une augmentation de la lipolyse [Tansey et al. 2003; Sztalryd et al. 2003]. Sa présence
semble être nécessaire pour l’activation de la translocation de la HSL vers la gouttelette
lipidique [Sztalryd et al. 2003; Miyoshi et al. 2006] (Figure 4).
Par ailleurs, la FABP est une protéine chaperonne qui permet le transport des AG
dans le cytosol [Matarese et al. 1988] et joue un rôle non négligeable dans la lipolyse

28
 Introduction

puisqu’elle permet une efficacité maximale en aidant au relargage des AG des adipocytes,
empêchant ainsi un rétrocontrôle négatif (Figure 4) [Coe et al. 1999].
L’induction de la lipolyse lors du jeûne passe principalement par les catécholamines
[Fain et al. 1983]. L’activation du récepteur β-adrénergique à la surface de l’adipocyte
entraîne une augmentation de l’activité de la PKA (Figure 4) [Kim et al. 2005]. La PKA
catalyse la phosphorylation de la HSL, provoquant sa translocation vers la gouttelette
lipidique [Holm 2003], et la phosphorylation de la périlipine entraînant le remodelage de la
gouttelette lipidique favorisant l’accès aux enzymes de la lipolyse [Maeda et al. 2004]. En
revanche, après l’ingestion d’un repas, l’augmentation de la sécrétion d’insuline inhibe la
lipolyse (Figure 4). L’action de l’insuline sur la lipolyse passe par une inhibition de la PKA et
de la HSL et une inhibition de l’ATGL [Ragolia et al. 1998; Kershaw et al. 2006]. Notons que
chez les individus obèses, le taux de base de la lipolyse est souvent augmenté et que TNFα
et la leptine semblent contribuer à cette augmentation [Reynisdottir et al. 1995; Lonnqvist et
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al. 1995; Ryden et al. 2002].

III.1.e. Régulation de la balance énergétique

La balance entre apports énergétiques (alimentation) et dépenses énergétiques (taux
métabolique de base, activité physique, thermogenèse) est soumise à une fine régulation
faisant intervenir un réseau complexe d’interactions entre les centres de régulation de la
satiété dans le système nerveux central (SNC), en particulier dans l’hypothalamus, et les
centres de régulation du stockage et de la mobilisation des réserves d’énergies [Cone 2005;
Friedman 2000; Flier 2004; Sainsbury et al. 2002; Spiegelman et al. 2001]. La régulation de
l’appétit et du comportement alimentaire se fait par des signaux à court terme et à long
terme. Lors d’un repas, l’arrivée des aliments dans le tube digestif entraîne la sécrétion d’un
certain nombre d’hormones telles que la cholécystokinine, ou de peptides intestinaux comme
le peptide YY, qui sont transmis au SNC et conduisent à la fin du repas (effet satiétogène ou
anorexigène). A l’inverse, la ghréline, seule hormone orexigène connue, est sécrétée par
l’estomac en période de jeûne et transmise au SNC pour initier la prise alimentaire [Moran
2000; Badman et al. 2005]. Les signaux à long terme, comme la leptine, transmettent au
SNC l’état des réserves d’énergie. L’activation du récepteur à la leptine dans l’hypothalamus
inhibe la prise alimentaire et stimule les dépenses énergétiques [Friedman 2002; Porte, Jr. et
al. 2002]. De même, l’insuline a un effet inhibiteur à long terme sur la prise alimentaire. De
plus, des neuropeptides comme la mélanocortine et le neuropeptide Y, ainsi que des
neurotransmetteurs tels que la sérotonine, la dopamine et la noradrénaline, interagissent
dans l’hypothalamus pour coordonner les réponses métaboliques, physiologiques et
comportementales [Cone 2005; Porte, Jr. et al. 2002; Sainsbury et al. 2002].

29
 Introduction

La voie leptine-mélanocortine joue un rôle critique dans l’homéostasie énergétique

[Coll et al. 2004]. La leptine est sécrétée par le TA et va activer son récepteur situé à la
surface de neurones du noyau arqué (Figure 5), entraînant d’une part, la suppression de
l’expression de 2 peptides orexigènes – le neuropeptide Y et l’AGRP (agouti-related protein)
– et d’autre part, l’induction de l’expression de 2 peptides anorexigènes – le CART (cocaine
and amphetamine related transcript) et l’α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone) dérivé
de POMC (proopiomélanocortine) [Elias et al. 1999; Elmquist et al. 1999; Schwartz et al.
2000]. L’α-MSH et l’AGRP sont des ligands antagonistes pour un même récepteur, MC4R
(récepteur 4 à la mélanocortine) [Cone 1999]. L’activation de MC4R par l’α-MSH réduit la
prise alimentaire, tandis que l’inhibition de MC4R par l’AGRP fait augmenter l’appétit [Fan et
al. 1997].

III.1.f. Conséquences de la localisation de la graisse

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L’excès de masse grasse résulte en des désordres métaboliques. L’augmentation de

la taille des adipocytes entraîne généralement une élévation de la synthèse de TG, de la
lipolyse et du flux transmembranaire d’AG, et est associé à l’insulinorésistance et au
développement du DT2 [Paolisso et al. 1995; Weyer et al. 2001]. L’augmentation de la taille
du TA affecte les concentrations systémiques de cytokines et de polypeptides qu’il sécrète,
tels que la leptine, l’adiponectine, la résistine, l’angiotensine, IL-6, TNFα, la protéine C-
réactive (CRP) et le PAI-1 [Teran-Garcia et al. 2007].
De nombreuses données de la littérature soutiennent l’hypothèse qu’une masse
accrue de TA abdominal est associée à l’insulinorésistance, à l’intolérance au glucose et au
risque cardiovasculaire. Les adipocytes situés à l’intérieur de la cavité viscérale (au niveau
de l’épiploon) présentent une activité lipolytique accrue, et les AGL qu’ils libèrent rejoignent
directement le système veine-porte hépatique, altérant ainsi les fonctions hépatiques,
notamment dans la clairance de l’insuline et la production de VLDL et de glucose [Bjorntorp
1990]. Cependant, d’autres études ont montré que le TA sous-cutané contribue également
fortement aux désordres métaboliques [Kelley et al. 2000; Miles et al. 2005; Smith et al.
2001]. Ainsi, la contribution du TA viscéral au relargage d’AGL vers le foie, serait beaucoup
moins importante que ce que l’on pensait à l’origine, représentant seulement 5 à 20% de
l’ensemble des AGL transmis au système porte [Nielsen et al. 2004]. Cela veut dire que la
majorité des AGL arrivant au foie sont des dérivés de la lipolyse de la graisse sous-cutanée.
Néanmoins, les AGL libérés par les dépôts de graisse non viscéraux vont plus souvent
rejoindre les tissus périphériques, en particulier les muscles, que ceux dérivant de la graisse
viscérale. La production d’IL-6, d’IL-8, de la 11-β-hydroxystéroïde déshydrogénase (11-β-
HSD), de la résistine, de PPARγ, du VEGF (vascular endothelial growth factor) et de PAI-1

30
 Introduction

est relativement plus élevée dans le TA viscéral, tandis que la production de la protéine de
transfert d’esters de cholestérol (CETP), l’adipsine, la leptine et l’adiponectine est plus
élevée dans le TA sous-cutané [Schaffler et al. 2005]. L’expression de récepteurs
spécifiques diffère également entre les 2 types de TA : le récepteur 1 à l’angiotensine, le
récepteur adrénergique β-3 (ADRB3), le récepteur aux glucocorticoïdes et le récepteur aux
androgènes sont plus exprimés dans le TA viscéral que dans le TA sous-cutané [Fain et al.
2004]. Les TA viscéral et sous-cutané abdominal contribuent donc tous deux au
développement de désordres métaboliques mais par des mécanismes différents qui restent
à éclaircir.
Le TA représente le plus grand lieu de stockage de la graisse, mais celle-ci peut
également se déposer dans d’autres tissus. Ces dépôts ectopiques de gras jouent un grand
rôle dans l’apparition de troubles du métabolisme [Unger 1995]. A un niveau donné de stock
de lipides, niveau variant entre individus, l’adipocyte devient insulinorésistant et son activité
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lipolytique augmente, libérant ainsi des AG dans la circulation, tandis que l’incorporation
cellulaire et l’utilisation du glucose et des AG diminue. L’excédent d’AG va alors se déposer
dans le foie, le muscle squelettique, le pancréas ou encore le cœur [Krssak et al. 1999;
Seppala-Lindroos et al. 2002; Lee et al. 1994] et affecter le bon fonctionnement de ces
organes. C’est ce qu’on appelle l’effet lipotoxique. Ainsi, le contenu lipidique des cellules
musculaires et du foie est corrélé à l’insulinorésistance, et ce, indépendamment de l’obésité
[Krssak et al. 1999; Seppala-Lindroos et al. 2002].

III.2. L’homéostasie glucidique

III.2.a. Mesures du désordre glucidique

La glycémie correspond à la concentration de glucose dans le plasma sanguin. Sa
régulation est très fine et fait intervenir le système hormonal. L’insuline est une hormone
peptidique dont le rôle est de maintenir l’homéostasie glucidique et de promouvoir une
utilisation du glucose adaptée [Accili 2004]. Elle est produite par les cellules β du pancréas à
un niveau basal et une augmentation de la glycémie provoque un pic biphasique de
sécrétion d’insuline. Les incrétines, hormones gastro-intestinales, sont sécrétées en réponse
à une augmentation de la glycémie et stimulent la sécrétion de l’insuline. L’insuline favorise
l’approvisionnement du muscle squelettique et du TA en glucose et inhibe la
gluconéogenèse dans le foie. Son action est dépendante de sa concentration et est
saturable. La réponse à l’insuline représente son effet maximal, alors que la sensibilité à
l’insuline est définie par la concentration en insuline requise pour avoir la moitié de cette
réponse maximale [Muniyappa et al. 2008]. L’insulinorésistance correspond à la diminution

31
 Introduction

de la sensibilité ou de la réponse à l’insuline en terme de mise à disposition du glucose dans

les tissus périphériques et d’inhibition de la gluconéogenèse hépatique. L’insulinorésistance
joue un rôle majeur dans la physiopathologie du DT2.
Il existe différentes mesures de la sensibilité à l’insuline. L’une des mesures directes
de ce paramètre est le clamp euglycémique hyperinsulinémique [DeFronzo et al. 1979].
Après un jeûne d’une nuit, l’insuline est injectée par voie intraveineuse à un taux constant (5-
120 mU par surface corporelle par minute). Cette injection constante d’insuline entraîne un
nouveau taux d’insuline stable qui est supérieur à l’insulinémie à jeun
(« hyperinsulinémique »). Par conséquent, l’approvisionnement en glucose des muscles et
du TA augmente, tandis que la gluconéogenèse hépatique est supprimée. Dans ces
conditions, la glycémie est mesurée toutes les 5 ou 10 minutes et du glucose (dextrose 20%)
est injecté de manière à fixer la glycémie à un niveau normal (« euglycémique »). Après
quelques heures, l’équilibre entre insulinémie, glycémie et taux de glucose injecté est atteint.
Etant donné que la gluconéogenèse hépatique est supprimée, le taux de glucose injecté est
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égal au taux de glucose disponible. L’indice de sensibilité à l’insuline est alors égal au
rapport du taux de glucose injecté sur la glycémie à l’équilibre multipliée par la différence
entre insulinémie à jeun et à l’équilibre [DeFronzo et al. 1979]. L’avantage de cette méthode
est de pouvoir mesurer directement le taux de glucose disponible dans tout l’organisme pour
un niveau d’insulinémie donné. En revanche, c’est une méthode coûteuse en temps et en
argent qui requiert du personnel expérimenté. C’est pourquoi elle n’est pas appropriée pour
les études épidémiologiques, les grandes études cliniques ou pour les applications cliniques
en routine.
L’hyperglycémie provoquée par voie orale (HPO) est une méthode plus souvent
utilisée pour déterminer une intolérance au glucose ou un diabète [2007a]. Après un jeûne
d’une nuit, une dose standard de glucose (75g) est administrée à l’individu per os et la
glycémie et l’insulinémie sont mesurées à 0, 30, 60 et 120 minutes. Ce test reflète l’efficacité
de l’organisme à utiliser le glucose, ainsi que la dynamique de l’insuline dans des conditions
physiologiques, contrairement au clamp hyperinsulinémique euglycémique. Mais la tolérance
au glucose et la résistance à l’insuline sont des notions différentes : la tolérance au glucose
résulte non seulement de la sensibilité à l’insuline, mais aussi de la sécrétion d’insuline, des
effets des incrétines et d’autres facteurs. Cette méthode fournit donc de précieuses
informations sur la tolérance au glucose mais pas sur la sensibilité ou la résistance à
l’insuline.
Le dosage de la glycémie et de l’insulinémie à jeun est une méthode très souvent
utilisée. Chez les individus sains, les conditions à jeun représentent un état stable dans
lequel le glucose est maintenu à un taux normal, et l’insulinémie et la gluconéogenèse
hépatique sont constantes. La sécrétion d’insuline de base détermine un taux constant

32
 Introduction

d’insuline qui reflète la sensibilité à l’insuline. En effet, il a été montré que l’insulinémie à jeun
est un bon marqueur de l’insulinorésistance [Haffner et al. 1996]. De plus, c’est une méthode
simple et non invasive contrairement aux 2 autres méthodes. A partir de ces dosages, on
peut calculer l’indice HOMA-IR (homeostasis model assessment of insulin resistance) égal
au produit de la glycémie (en mmol/L) et de l’insulinémie (en µU/mL) divisé par 22,5
[Matthews et al. 1985]. Le dénominateur 22,5 est un facteur correspondant à une glycémie
normale (4,5 mmol/L) multiplié par une insulinémie normale (5 µU/mL). Ainsi, un individu
ayant une sensibilité à l’insuline normale a un HOMA-IR égal à 1. Il a été montré dans
diverses études que le HOMA-IR est assez bien corrélé à la sensibilité à l’insuline estimée
par clamp ou d’autres méthodes [Radziuk 2000; Wallace et al. 2004]. Cette méthode est
efficace pour évaluer l’insulinorésistance chez des individus ayant une intolérance au
glucose ou un diabète modéré. En revanche, elle est inappropriée pour les individus
présentant un dysfonctionnement du pancréas. Le HOMA-B (homeostasis model
assessment of β cell function) peut être alors utilisé pour estimer la production d’insuline des
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cellules β du pancréas [Matthews et al. 1985]. Il est également calculé à partir des
concentrations plasmatiques de glucose (mmol/L) et d’insuline (µU/mL) à jeun ((20 x
insuline)/(glucose-3,5)) et est exprimé en pourcentage. Un HOMA-B égal à 100% correspond
à un parfait fonctionnement des cellules β.

III.2.b. La signalisation de l’insuline

L’insuline exerce de nombreux rôles métaboliques. En plus de stimuler l’incorporation
du glucose au niveau des muscles, du TA et du foie, et d’inhiber la gluconéogenèse
hépatique, elle inhibe la lipolyse dans le tissu adipeux, elle régule la synthèse de protéines et
de lipides dans le foie et les muscles, ainsi que la synthèse de divers composés comme des
facteurs de coagulation, hormones sexuelles et apolipoprotéines. L’insuline coordonne
certaines réponses globales de l’organisme, telles que les ressources en lipoprotéines après
ou entre les repas, la fonction endothéliale et la croissance des tissus [Aguilar-Salinas et al.
2005]. De plus, l’insuline exerce ses effets également au sein du SNC, dans l’hypothalamus,
où elle interagit avec d’autres neurotransmetteurs et exerce ainsi un rôle anorexigène.
La première étape dans la signalisation de l’insuline est la fixation de l’insuline à son
récepteur, localisé à la surface des tissus cibles. Le récepteur à l’insuline est une grande
protéine transmembranaire hétérotétramérique (α2β2) contenant 2 sous-unités α
extracellulaires et 2 sous-unités β principalement intracellulaires [White et al. 1994]. La
fixation de l’insuline aux sous-unités α entraîne une activation de la tyrosine kinase
intrinsèque, une autophosphorylation du récepteur et la phosphorylation des substrats du

33
 Introduction

récepteur à l’insuline (IRS), notamment de IRS-1 (Figure 6) [Virkamaki et al. 1999; Hunter et
al. 1998]. Il s’ensuit l’activation de 2 voies de signalisation principales :
- la voie phosphatidylinositol-3 (PI-3) kinase – AKT/protein kinase B (PKB)
aboutissant entre autres à la translocation du transporteur de glucose GLUT4 (des
vésicules intracellulaires vers la membrane plasmatique) permettant l’entrée de
glucose dans les cellules,
- la voie Ras-mitogen activated protein kinase (MAPK) régulant l’expression de
gènes et contrôlant la croissance cellulaire et la différenciation en collaboration
avec la voie PI-3 [Avruch 1998].
Ainsi, la signalisation de l’insuline passe par une cascade de phosphorylation intégrée dans
un réseau complexe dans lequel s’entremêlent différentes voies de signalisation (Figure 6).

III.2.c. Mécanismes de l’insulinorésistance

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Les facteurs de risque classiques du DT2 sont l’inactivité physique, le surpoids et une
alimentation riche en graisses, notamment en graisses saturées [Mayer-Davis et al. 1998;
Vessby et al. 2001; Carey et al. 1996; St Onge et al. 2004]. Ces facteurs environnementaux
augmentent en effet la glycémie à long terme. Afin de maintenir l’équilibre glucidique, les
cellules β du pancréas produisent plus d’insuline. Mais cette hyperinsulinémie à long terme
entraîne une altération de la signalisation de l’insuline ainsi qu’une altération du profil
lipidique [Reaven 1988]. Lorsque l’hyperinsulinémie n’est plus suffisante pour compenser
l’insulinorésistance ou lorsque le pancréas s’épuise, alors apparaissent une intolérance au
glucose voire un DT2 [Warram et al. 1990; Lillioja et al. 1993]. Cependant, de nombreux
individus insulinorésistants arrivent à maintenir une tolérance au glucose normale ou
presque, tant que le pancréas peut compenser ce défaut d’action de l’insuline en en
produisant davantage.
Du point de vue moléculaire, la résistance à l’insuline serait le résultat de différentes
anomalies affectant les cascades de phosphorylation induites par l’activation du récepteur à
l’insuline. Ces anomalies peuvent toucher le récepteur à l’insuline lui-même, mais aussi les
voies de signalisation en aval du récepteur, comme une inactivation de l’IRS par exemple
[Taniguchi et al. 2006; Youngren 2007; Leng et al. 2004; Sesti et al. 2001; Draznin 2006;
Gual et al. 2005]. L’inactivation du récepteur à l’insuline peut être due à des modifications
post-traductionnelles comprenant une phosphorylation de résidus sériques, mais aussi à la
fixation de protéines inhibitrices telles que ENPP1/PC-1 (ectonucleotide
pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 / plasma cell antigen 1) [Goldfine et al. 2008] ou des
membres des familles de protéines SOCS et Grb [Youngren 2007].

34
 Introduction

III.3. Métabolisme des lipides et lipoprotéines

III.3.a. Généralités sur le métabolisme des lipides

Les lipides plasmatiques les plus importants d’un point de vue clinique sont le
cholestérol et les TG [Brown et al. 1986]. Le cholestérol joue de nombreux rôles : c’est un
composant des membranes cellulaires, le précurseur des hormones stéroïdiennes et de la
vitamine D, et il est nécessaire dans l’activation de molécules de signalisation neuronale
[Brown et al. 1986; Incardona et al. 2000]. Une faible partie seulement du cholestérol
circulant est issue de l’alimentation. En effet, environ 80% est issu de la synthèse endogène,
dont l’étape limitante est catalysée par l’HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A)
réductase. La majeure partie du cholestérol circulant est estérifiée, tandis que le cholestérol
libre constitue une fraction mineure. Les TG représentent une source importante d’énergie.
Ils sont fabriqués à partir d’AGL et de glycérol liés par une liaison ester. Les TG sont
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synthétisés dans les cellules de l’intestin et du foie et sont transportés dans le plasma. Après
lipolyse auprès d’une surface endothéliale, les TG délivrent des AGL aux cellules pour être
β-oxydés ou stockés.
Les TG et le cholestérol sont insolubles dans le plasma, c’est pourquoi leur transport
dans le plasma requiert un système de macromolécules sphéroïdales appelées lipoprotéines
(Tableau 6). Elles sont composées d’un noyau hydrophobe contenant des phospholipides,
des vitamines et antioxydants liposolubles et du cholestérol estérifié, et d’une enveloppe
hydrophile contenant du cholestérol libre, des phospholipides et des apolipoprotéines. Les
principales lipoprotéines charriant les TG sont les chylomicrons et les VLDL, tandis que
celles qui transportent le cholestérol sont les LDL (low density lipoprotein) et les HDL (high
density lipoprotein).
Une vue d’ensemble du métabolisme des TG et du cholestérol est présentée en
Figure 7. Brièvement, les TG et stérols absorbés par les cellules intestinales sont intégrés
dans des chylomicrons permettant leur transport jusqu’au TA et le foie [Hegele 2009]. Le foie
synthétise ou recycle les TG et le cholestérol et les incorpore dans les VLDL. Dans le sang,
les VLDL sont hydrolysés en LDL dont le rôle est de transporter les lipides vers les tissus
périphériques. Les HDL sont en revanche chargés du transport inverse du cholestérol qui
permet l’élimination du cholestérol.

III.3.b. Transport inverse du cholestérol

Les HDL naissantes sont sécrétées par le foie et l’intestin avec l’ApoA1
(apolipoprotéine A1), la principale apolipoprotéine des HDL, sous forme de particules pré-β-
HDL, riches en phospholipides et pauvres en cholestérol. Dans le sang, ces particules

35
 Introduction

s’enrichissent de lipides provenant de l’efflux cellulaire ou de l’hydrolyse de chylomicrons et

de VLDL par la LPL (lipoprotéine lipase). La première étape du transport inverse du
cholestérol consiste en l’efflux du cholestérol des cellules périphériques, en particulier des
macrophages (Figure 8). ABCA1 (ATP-binding cassette transporter A1) est un important
transporteur membranaire de cholestérol qui facilite l’efflux du cholestérol vers ces
lipoprotéines réceptrices. Le niveau de transport inverse du cholestérol est ensuite déterminé
par la coordination entre estérification du cholestérol, incorporation cellulaire sélective,
transfert des esters de cholestérol et recyclage des particules pré-β-HDL [Lewis 2006]. La
lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) joue un rôle important dans la maturation des
HDL [Jonas 2000]. La CETP facilite la redistribution et l’équilibration des lipides entre HDL et
les lipoprotéines contenant l’ApoB (chylomicrons, VLDL, IDL (intermediate density
lipoprotein) et LDL) en subtilisant les esters de cholestérol contenus dans les HDL et en y
incorporant des TG [Lewis et al. 2005]. Enfin, la PLTP transfère les phospholipides de
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surface des lipoprotéines riches en TG vers les HDL, et remodèle les HDL en fusionnant
plusieurs particules, permettant ainsi le recyclage des pré-β-HDL [Nakamura et al. 2004;
Huuskonen et al. 2001].
Le remodelage des HDL par les différentes lipases détermine leur sort métabolique.
La LPL est sécrétée par de nombreux tissus, en particulier le TA et les muscles [Merkel et al.
2002]l. En hydrolysant les particules riches en TG, la LPL contribue au transfert de
cholestérol libre, de phospholipides et d’apolipoprotéines vers les HDL, augmentant ainsi les
concentrations plasmatiques de HDL-cholestérol et d’ApoA1 [Lewis 2006]. A l’inverse, la
lipase hépatique a une activité plus grande sur les HDL que sur les VLDL ou les
chylomicrons, et convertit les HDL en particules plus petites et en pré-β-HDL [Guendouzi et
al. 1998]. Enfin, la lipase endothéliale hydrolyse plus facilement les HDL que les
autres lipoprotéines [McCoy et al. 2002] et semble jouer un rôle important dans le
métabolisme des HDL mais ses effets chez l’homme restent à déterminer [Maugeais et al.
2003; Ishida et al. 2003; Jin et al. 2003].
La clairance des HDL peut se faire de 2 manières : par une incorporation cellulaire
sélective du cholestérol (la plus fréquente) ou par une incorporation cellulaire de l’ensemble
de la lipoprotéine HDL par endocytose. Le récepteur SR-B1 (scavenger receptor B1) joue un
rôle primordial dans la captation sélective du HDL-cholestérol et permet ainsi l’entrée du
cholestérol dans les hépatocytes [Trigatti et al. 2004; Trigatti et al. 2003]. La CETP jouerait
aussi un rôle important dans l’incorporation sélective des esters de cholestérol dans le foie
[Gauthier et al. 2005]. Une fois dans le foie, le cholestérol peut être métabolisé en acides
biliaires et excrété dans les intestins où il sera éliminé par le transit.

36
 Introduction

III.3.c. Altération du profil lipidique et risque cardiovasculaire

L’excès chronique de LDL dans le sang perturbe la relaxation artérielle. En effet, une
partie des LDL non pris en charge par le récepteur aux LDL (LDLR) sont reconnus par les
récepteurs scavenger à la surface des macrophages, tels que SR-A et CD36 [Lusis 2000;
Rader et al. 2008]. Les lipides incorporés par les macrophages subissent une oxydation
générant des intermédiaires toxiques, qui induit la production de cytokines et provoque
l’attraction de cellules inflammatoires. Les macrophages de la paroi artérielle remplis de
lipides deviennent des cellules spumeuses, à l’origine du développement des plaques
athérogéniques. La rupture d’une de ces plaques entraîne des complications
cardiovasculaires, comme l’accident vasculaire cérébral [Lusis 2000; Rader et al. 2008].
L’augmentation du flux d’AGL, due à un excès de TA ou à une insulinorésistance, est
à l’origine des perturbations du profil lipidique (Figure 9). Dans le foie, les AGL stimulent la
synthèse des TG et d’ApoB100, et ainsi, l’assemblage et la sécrétion de VLDL. En cas
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d’insulinorésistance, la LPL n’est plus suffisamment stimulée par l’insuline, ce qui entraîne
une accumulation des lipoprotéines riches en TG dans la circulation [Sprangers et al. 2001;
Chen et al. 1999b]. Ainsi, la concentration plasmatique en VLDL augmente, mais aussi leur
taille puisqu’elles accumulent des TG [Despres et al. 1989; Winocour et al. 1992]. De plus,
les transferts de TG de ces lipoprotéines vers les LDL et les HDL augmentent, ainsi que le
transfert réciproque d’esters de cholestérol. Les particules LDL qui sont alors enrichies en
TG et appauvries en cholestérol estérifié sont de meilleurs substrats pour la lipase
hépatique, menant ainsi à la formation de petites LDL denses (sdLDL). Ces sdLDL sont
particulièrement athérogéniques puisqu’elles entrent dans la paroi artérielle plus aisément,
elles sont oxydées plus facilement et sont ainsi incorporées par les macrophages plus
rapidement [Grundy et al. 2005]. En outre, les particules HDL de grande taille ou HDL2, aux
propriétés athéroprotectives, diminuent [Krauss et al. 1982].
Le profil lipidique varie selon l’âge et le genre : en général, les hommes âgés
présentent un profil lipidique plus délétère que le reste de la population. Les concentrations
plasmatiques en cholestérol total et en LDL-cholestérol sont corrélées au risque
cardiovasculaire, tandis que celle du HDL-cholestérol est inversement corrélée au risque
cardiovasculaire [Grundy 2008b; Lewis et al. 2005]. Un taux faible de HDL-cholestérol est le
désordre lipidique le plus rencontré chez les patients de moins de 60 ans atteints de MCV
[Genest, Jr. et al. 1992]. Les concentrations plasmatiques en LDL-cholestérol et en ApoB
sont positivement corrélées entre elles, de même pour le HDL-cholestérol et l’ApoA1
[Sniderman 2004; Barter et al. 2006]. Cependant, chez les individus ayant un métabolisme
des lipoprotéines altéré, en particulier une augmentation des LDL petites et denses, les taux
de LDL-cholestérol et d’ApoB ne sont plus corrélés. En effet, puisqu’il existe une molécule
ApoB pour une particule LDL, l’augmentation de LDL petites et denses augmente le taux

37
 Introduction

d’ApoB, mais n’augmente pas le taux de LDL-cholestérol. Ainsi, le rapport ApoB sur LDL-
cholestérol permet une estimation de la taille des particules LDL et représente un très bon
marqueur du risque cardiovasculaire [Despres et al. 2001]. Récemment, il a été décrit que le
ratio ApoB sur ApoA1 est le meilleur facteur lipidique prédictif du risque cardiovasculaire
[McQueen et al. 2008], mais le ratio cholestérol total sur HDL-cholestérol semble être aussi
un bon marqueur [van der Steeg et al. 2007]. Enfin, la relation entre TG plasmatiques et
risque cardiovasculaire est difficile à établir étant donné qu’une augmentation du taux
plasmatique de TG est associée à une diminution du taux de HDL-cholestérol. Néanmoins,
un taux élevé de TG, de même que les hypertriglycéridémies familiales sont associés au
risque cardiovasculaire indépendamment du HDL-cholestérol [Bansal et al. 2007; Austin et
al. 2000; Nordestgaard et al. 2007].
Remarquons ici que, si une augmentation du LDL-cholestérol plasmatique est
associée au risque cardiovasculaire, le taux de LDL-cholestérol n’est pas un bon marqueur
de ce risque. En effet, en cas de résistance à l’insuline, la conversion des VLDL en IDL et
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LDL est limitée. Ainsi, même si le taux plasmatique de VLDL augmente, ce n’est pas toujours
le cas pour celui du LDL-cholestérol. De plus, les particules LDL sont davantage
transformées en sdLDL qui s’infiltrent dans la paroi artérielle et disparaissent ainsi de la
circulation. C’est pourquoi des taux normaux de LDL-cholestérol peuvent être observés chez
des individus présentant un syndrome métabolique. C’est la raison pour laquelle le taux de
LDL-cholestérol n’est pas retenu dans les définitions du syndrome métabolique.

III.4. L’hypertension artérielle

Les causes d’une augmentation de la tension artérielle sont inconnues dans 95% des
cas. Les 5% de cas d’hypertension artérielle expliqués correspondent à des patients dont la
pathologie est responsable de cette hypertension, qui est alors appelée « hypertension
artérielle secondaire ». Les 95% des cas pour qui la cause de l’hypertension est inconnue
sont décrits comme présentant une « hypertension artérielle essentielle ». L’hypertension est
un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires et rénales [Kearney et al. 2005;
Hajjar et al. 2003]. La tension artérielle est déterminée par divers facteurs tels que le volume
sanguin, le débit cardiaque, la résistance vasculaire et la compliance (adaptation du volume
sous l'influence d'une variation de pression). Ces différents éléments sont régulés par des
facteurs neuronaux, endocriniens, et paracrines (Figure 10), mais le rôle du rein dans la
régulation des fluides et de la balance des électrolytes est primordial pour le contrôle de la
tension artérielle [Cowley, Jr. 1992; Guyton et al. 1972; Guyton 1991]. De nombreux facteurs
déterminent l’efficacité du rein dans cette tâche, tels que le bon fonctionnement du système

38
 Introduction

nerveux sympathique, les taux d’hormones circulantes, des facteurs autocrines et paracrines
intra-rénaux et la filtration glomérulaire.
Les formes les plus communes d’hypertension artérielle apparaissent à la
cinquantaine et sont caractérisées par une vasoconstriction systémique et rénale. Comme
l’hypertension s’aggrave avec l’âge, les vaisseaux sanguins subissent des changements
structuraux leur permettant de supporter cette vasoconstriction, mais provoquant aussi des
complications telles que le stress oxydant [Touyz 2004]. Ce stade de l’hypertension est
souvent associé à une sensibilité accrue au sel [Campese 1994].

Le système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS) :

Le système rénine-angiotensine (RAS) ou rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS)
est un système hormonal jouant un rôle important dans la régulation de la pression artérielle
et l’équilibre des fluides. Une surexpression de la rénine et de ses produits métaboliques
chez un individu le prédispose à l’hypertension. La rénine est une protéase sécrétée par le
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rein. Elle clive l’angiotensinogène, synthétisé principalement par le foie, en angiotensine I qui
est biologiquement inactive (Figure 11) [Oparil et al. 1974; Goodfriend et al. 1996]. L’enzyme
de conversion de l’angiotensine (ACE) catalyse la conversion de l’angiotensine I en
angiotensine II, biologiquement active. L’angiotensine II exerce ses effets en activant ses
récepteurs membranaires, notamment le récepteur AT1, dont l’activation entraîne une
vasoconstriction, la libération d’aldostérone du cortex surrénal, et d’autres mécanismes
conduisant à l’augmentation de la pression artérielle [Bergsma et al. 1992]. L’aldostérone
provoque la rétention de sodium et d’eau dans les tubules rénaux. L‘angiotensine II stimule
également la sécrétion de la vasopressine qui stimule la rétention d’eau dans le rein et
exerce aussi un effet vasoconstricteur (Figure 11).
Ce système est la cible de plusieurs médicaments hypotenseurs agissant à
différentes étapes. Il existe des inhibiteurs de la rénine [Gradman et al. 2005], des inhibiteurs
de l’ACE et des antagonistes du récepteur AT1 [Finnegan et al. 2003; Zaman et al. 2002].

III.5. Différentes hypothèses sur l’origine du syndrome métabolique

La ou les causes à l’origine du développement du syndrome métabolique n’ont pas

encore été clairement identifiées et représentent ainsi une source de débats et de questions
qui remettent en cause l’existence même du syndrome métabolique. D’un côté, il y a des
auteurs, tels que les Dr Reaven, Grundy, Eckel et Zimmet, persuadés que le syndrome
métabolique est causé par l’insulinorésistance. De l’autre côté, il y a les Dr Lemieux,
Bouchard, Alberti, Hattersley et bien d’autres, qui placent l’obésité abdominale au centre de
la physiopathologie du syndrome métabolique. Au milieu, d’autres chercheurs proposent des

39
 Introduction

hypothèses alternatives, comme l’inflammation ou le déséquilibre hormonal, par exemple.

Enfin, certains, comme le Dr Gale par exemple, pensent que l’étude du syndrome
métabolique devrait être abandonnée car elle n’apporte rien de plus que les études sur le
DT2 et les MCV.

III.5.a. Rôles de l’obésité abdominale et de l’insulinorésistance dans la

genèse du syndrome métabolique.
La Figure 12 présente une vue d’ensemble des mécanismes physiopathologiques du
syndrome métabolique connus à ce jour. Elle est tirée d’une revue de Eckel et al qui placent
l’insulinorésistance au centre du syndrome métabolique [Eckel et al. 2005]. Une hypertrophie
du TA, et en particulier du TA viscéral, entraîne une libération accrue d’AGL [Kahn et al.
2000; Bjorntorp 1990]. Dans des conditions physiologiques, l’insuline inhibe la lipolyse du
TA ; mais en cas d’insulinorésistance, l’insuline n’est plus capable de supprimer
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correctement la lipolyse, ce qui entraîne une libération massive d’AGL dans le plasma [Eckel
et al. 2005]. Non seulement l’insulinorésistance augmente la libération d’AGL, mais
l’élévation d’AGL entraîne aussi une insulinorésistance [Despres 1993; Kissebah et al. 1982;
Bjorntorp 1991; Kahn et al. 2001]. Le TA contribue également à la physiopathologie du
syndrome métabolique en libérant des adipokines pro-inflammatoires comme IL-6 et TNFα.
Ces cytokines altèrent l’action de l’insuline dans le foie, les muscles et le TA [Sopasakis et
al. 2004; Hube et al. 1999].
Les AGL libérés par le TA abdominal rejoignent directement le système veine-porte
hépatique [Bjorntorp 1990]. L’élévation du flux d’AGL dans le foie altère l’action de l’insuline
et entraîne ainsi une augmentation de la production de glucose hépatique, la synthèse de
cytokines pro-inflammatoires et des changements majeurs dans le métabolisme des lipides
et lipoprotéines [Bergman et al. 2007]. Dans des conditions physiologiques, l’insuline
augmente l’expression de gènes impliqués dans la biosynthèse de TG et réduit la sécrétion
des VLDL en stimulant la dégradation de l’ApoB [Gonzalez-Baro et al. 2007; Lewis et al.
1993; Ginsberg et al. 2005]. En cas d’insulinorésistance, l’augmentation de la sécrétion des
VLDL et la réduction de l’activité de la LPL induit une altération du profil lipidique (diminution
du nombre et de la taille des HDL, augmentation des particules LDL denses de petite taille)
[Lewis et al. 1996].
Dans les muscles, l’élévation du taux plasmatique d’AGL altère le cycle glucose-AG
[Randle et al. 1963; Gibbons 2002; Schalch et al. 1965] et inhibe l’incorporation cellulaire du
glucose induite par l’insuline [Boden et al. 1994; Dresner et al. 1999; Roden et al. 1999]. Cet
effet est associé à une réduction de la compartimentation du glucose en glycogène et à une
augmentation de l’accumulation de lipides. Il est possible que cette accumulation de TG au

40
 Introduction

sein du muscle squelettique intervienne directement dans l’étiologie de l’insulinorésistance

[McGarry 2002].
Le lien entre insulinorésistance et hypertension artérielle a été établi [Ferrannini et al.
1987; Bonora et al. 2008; Laakso et al. 1989]. En effet, l’insuline a des propriétés
vasodilatatrices et des effets sur la réabsorption du sodium dans le rein [Steinberg et al.
1994; DeFronzo et al. 1975]. En cas d’insulinorésistance, l’effet vasodilatateur peut être
perdu tandis que l’effet sur la réabsorption du sodium est préservé [Tooke et al. 2000;
Kuroda et al. 1999]. Les AGL peuvent également influencer la vasoconstriction [Tripathy et
al. 2003] ainsi qu’augmenter la tension artérielle en stimulant le système nerveux
sympathique [Grekin et al. 1995]. L’insuline accroît également l’activité du système nerveux
sympathique, effet qui serait conservé en cas d’insulinorésistance [Anderson et al. 1991;
Egan 2003]. Enfin, les adipokines résistine et leptine pourraient contribuer à l’élévation de la
pression artérielle chez des patients insulinorésistants [Takata et al. 2008; Bernal-Mizrachi et
al. 2002].
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L’augmentation de la concentration de molécules inflammatoires, telles que la CRP,

TNFα, IL-6, IL-18 et la résistine, témoigne de l’état inflammatoire associé au syndrome
métabolique [Sutherland et al. 2004]. Ces cytokines contribuent au développement de
l’insulinorésistance et à l’augmentation de la lipolyse, et pourraient aussi stimuler la
production de glucose et de VLDL dans le foie [Deepa et al. 2006; Hotamisligil et al. 1995;
Glund et al. 2008; Okamura et al. 1998]. De plus, les cytokines et les AGL stimulent la
production de fibrinogène et du PAI-1, engendrant un état prothrombotique [Schneider 2005].

III.5.b. Insulinorésistance ou obésité abdominale ?

Suite à la définition du syndrome métabolique par le Dr Reaven en 1988,
l’insulinorésistance a longtemps été considérée comme le cœur de la physiopathologie du
syndrome métabolique [Reaven 1988]. L’effet pléiotropique de l’insuline et les nombreuses
complications métaboliques engendrées par la résistance à l’insuline sont des arguments
forts en faveur de cette théorie. Bien sûr, les auteurs qui défendent ce point de vue prennent
également en considération l’obésité abdominale dans la physiopathologie du syndrome
métabolique, mais seulement en tant que facteur de risque de l’insulinorésistance. Malgré
tout, la quantification de l’action de l’insuline in vivo n’est pas toujours bien corrélée ni à la
présence du syndrome métabolique en tant qu’entité, ni aux caractéristiques individuelles du
syndrome [Hanley et al. 2003; Reaven 2005b], remettant ainsi en cause le rôle central de
l’insulinorésistance dans la genèse du syndrome métabolique.
D’un autre côté, l’obésité semble jouer un rôle prépondérant dans l’apparition d’un
syndrome métabolique. En effet, l’augmentation de la prévalence de l’obésité est fort
probablement la cause de l’augmentation de la prévalence du syndrome métabolique

41
 Introduction

[Ginsberg 2000; Reaven 1988; Eckel et al. 2005; Grundy 2008a]. De plus, l’élévation du flux
d’AGL engendrée par un TA en excès est à l’origine de nombreuses complications
métaboliques, tout autant que l’insulinorésistance. Cependant, tous les individus obèses ne
présentent pas de syndrome métabolique [Karelis et al. 2004; Karelis et al. 2005; Sims
2001]. Il existe même des patients souffrant d’une obésité morbide qui n’ont pas de
syndrome métabolique, ce qui remet en question le rôle central de l’obésité dans la
physiopathologie du syndrome métabolique.
Selon les Dr Teran-Garcia & Bouchard, c’est une mauvaise régulation du
métabolisme du TA (dérégulation de la différenciation adipocytaire, apparition de dépôts
ectopiques de graisse), pouvant être observée chez des individus obèses ou de poids
normal, qui est à l’origine de la lipolyse accrue, de l’insulinorésistance, des dysfonctions
endothéliales et de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, favorisant ainsi le syndrome
métabolique [Teran-Garcia et al. 2007]. Cette hypothèse est confortée par l’observation des
désordres métaboliques liés au syndrome métabolique chez les patients lipodystrophiques
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[Barroso et al. 1999]. Ce point de vue rejoint l’hypothèse de la capacité d’expansion du TA,
selon laquelle c’est la capacité de chaque individu à agrandir son TA qui détermine
l’apparition de complications métaboliques, plutôt que la quantité absolue de masse grasse
qu’un individu possède [Virtue et al. 2008]. Lorsqu’un individu atteint le seuil de saturation de
son tissu adipeux, les dépôts ectopiques de graisse apparaissent, et en parallèle, les
désordres métaboliques, dus à la lipotoxicité.

III.5.c. Hypothèses alternatives

Le rôle de l’inflammation en tant que facteur causal est un concept émergent. En
effet, de nombreuses études ont montré le rôle d’importants marqueurs de l’inflammation
dans le syndrome métabolique. Ainsi, l’activité de la CRP, du TNFα, de IL-6 et du PAI-1
augmente avec le nombre de composantes du syndrome métabolique observées chez un
individu [Bahia et al. 2006; Van Guilder et al. 2006; Gonzalez et al. 2006; Ridker et al. 2003;
Mertens et al. 2006]. En particulier, TNFα et IL-6 ont été identifiés comme des éléments clés
de l’insulinorésistance [Hotamisligil et al. 1995; Lo et al. 2007; Ruderman et al. 2006;
Rieusset et al. 2004].
Récemment, le stress du réticulum endoplasmique a été proposé comme le lien entre
obésité, insulinorésistance et inflammation [Aguirre et al. 2000; Ozcan et al. 2004]. Le stress
du réticulum endoplasmique peut entraîner une hyper activation de la kinase c-Jun N-
terminale (JNK) [Saiki et al. 2007], engendrant la phosphorylation de la sérine de l’IRS-1 et
ainsi, une réduction de la signalisation de l’insuline [Aguirre et al. 2000]. De plus, JNK est
une kinase intracellulaire impliquée dans la signalisation cellulaire, notamment dans

42
 Introduction

l’inflammation (via TNFα) [Ozcan et al. 2004], et représente ainsi un lien intéressant entre
signalisation de l’insuline et inflammation. Enfin, des marqueurs du stress du réticulum
endoplasmique, tels que XBP-1 (X-box-binding protein-1) sont associés à l’obésité chez des
patients non diabétiques et ils diminuent en cas de perte de poids [Ozcan et al. 2004]. Le
stress du réticulum endoplasmique représente donc une nouvelle voie potentiellement
impliquée dans le syndrome métabolique.
Un concept alternatif pour expliquer le syndrome métabolique, proposé par Unger et
al, est la résistance à la leptine [Unger 2003]. En effet, une insuffisance ou une résistance à
la leptine est associée à des dépôts ectopiques de graisse résultant probablement de
l’absence d’inhibition de la SREBP1c ou de l’incapacité de la leptine à activer l’AMP kinase
dans les muscles [Unger 2003; Kakuma et al. 2000; Minokoshi et al. 2003].
Enfin, un déséquilibre hormonal pourrait être à l’origine du syndrome métabolique.
D’une part, le Dr Björntop suggéra qu’une hypercortisolémie et une insuffisance en
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hormones sexuelles stéroïdiennes sont importants dans la pathogenèse de

l’insulinorésistance [Bjorntorp 1992]. Ces défauts hormonaux combinés à une sécrétion
d’hormone de croissance insuffisante, favoriseraient l’accumulation de TG dans le TA, et
amplifieraient ainsi les manifestations du syndrome métabolique. D’autre part, les femmes
présentant le syndrome des ovaires polykystiques ont un risque augmenté de syndrome
métabolique [Coviello et al. 2006; Dunaif 2006]. L’hyperandrogénie observée chez ces
femmes est associée à une augmentation de la production de glucose, une obésité
abdominale ainsi qu’à une diminution des fonctions des cellules β du pancréas [Coviello et
al. 2006]. Ainsi, le Dr Dunaif propose le concept de syndrome XX, ou syndrome métabolique
féminin dans lequel le paramètre de l’hyperandrogénie serait pris en considération [Sam et
al. 2003]. De son côté, le Dr Phillips propose le terme de « Glucose-Insulin-Lipid-
Hypertension-Testosterone-Estrogen » (GILHT-E) syndrome [Phillips 2004] suite aux
observations suivantes : i) le ratio oestradiol/testostérone est corrélé aux taux de glucose,
d’insuline, de cholestérol et de TG chez les hommes, ii) les facteurs de risque
cardiovasculaire sont associés aux niveaux d’hormones sexuelles et iii) un taux bas de
testostérone chez les hommes est un facteur prédictif de l’accumulation de TA viscéral et du
syndrome métabolique.

43
 Introduction

IV. Facteurs de prédisposition

Même s’il est évident que de nombreux facteurs environnementaux influencent le

développement du syndrome métabolique chez un individu, sa composante génétique est
loin d’être négligeable. En effet, l’incidence du syndrome métabolique est nettement plus
élevée chez les individus ayant des antécédents familiaux [Liese et al. 1997; Chen et al.
1999a]. De plus, les principaux phénotypes du syndrome métabolique cohabitent souvent au
sein d’une même famille [Hong et al. 1998; Meigs et al. 1997]. Enfin, chacun des phénotypes
du syndrome métabolique présente une héritabilité relativement élevée [Teran-Garcia et al.
2007]. La composante génétique du syndrome métabolique ainsi que de l’obésité, du DT2,
des dyslipidémies et de l’hypertension artérielle est complexe et varie depuis des formes
monogéniques, souvent rares, aux formes polygéniques et multifactorielles, les plus
communes, dans lesquelles leur développement est le résultat d’une prédisposition
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génétique à laquelle s’est ajouté un environnement délétère.

IV.1. Facteurs environnementaux

Quelques études ont évalué l’impact des facteurs environnementaux sur la

prévalence du syndrome métabolique. Les habitudes alimentaires influencent
significativement le développement du syndrome métabolique. Ainsi, une alimentation riche
en glucides est associée à une augmentation du risque de syndrome métabolique [Park et
al. 2003]. De plus, la composition et la nature lipidique de l’alimentation favoriseraient
l’insulinorésistance. En effet, Laaksonen et al ont mis en évidence une importante interaction
entre le taux sérique en AG (biomarqueur de l’ingestion habituelle de graisses) et le
développement d’un DT2 [Laaksonen et al. 2002b]. Les hommes normo-glycémiques qui
développent une insulinorésistance présentent des taux d’AG saturés élevés et des taux
d’AG polyinsaturés diminués [Laaksonen et al. 2002b]. Enfin, il a été montré que la
substitution des AG saturés par des AG mono-insaturés dans l’alimentation (comme c’est le
cas pour le régime méditerranéen, par exemple) améliore la sensibilité à l’insuline [Vessby et
al. 2001].
Les facteurs de risque classiques des MCV, tels que la consommation de tabac ou
d’alcool et le manque d’activité physique, augmentent également le risque de syndrome
métabolique [Park et al. 2003; Dallongeville et al. 2005a; Wamala et al. 1999; Brunner et al.
1997]. De manière intéressante, il a également été mis en évidence un impact significatif du
niveau socio-économique sur la prévalence du syndrome métabolique aux Etats-Unis et en
Europe. Ainsi, il existe une corrélation inverse entre le niveau d’éducation et la catégorie

44
 Introduction

socioprofessionnelle et le syndrome métabolique [Wamala et al. 1999; Silventoinen et al.

2005; Brunner et al. 1997; Dallongeville et al. 2005a]. De même, les femmes ayant un
revenu faible ont un risque augmenté de syndrome métabolique [Dallongeville et al. 2005a;
Park et al. 2003]. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que les personnes ayant des ressources
limitées achètent les produits les moins chers, qui sont souvent les plus énergétiques, et
pratiqueraient moins de sport [Drewnowski et al. 2004; Darmon et al. 2004]. Mais ces
hypothèses n’expliquent pas la différence entre genres. Le fait que seules les femmes soient
concernées pourrait être dû à leur taux de chômage plus élevé. En effet, les femmes aux
revenus les plus modestes sont souvent sans emploi, entraînant ainsi un manque d’activité
physique et le développement du syndrome métabolique [Dallongeville et al. 2005a; Sarlio-
Lahteenkorva et al. 1999].
Pour finir, on a vu abondamment dans le chapitre II.1.d (page 18) que l’âge influence
fortement l’apparition du syndrome métabolique.
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IV.2. Facteurs génétiques

IV.2.a. Les études d’épidémiologie génétique

Les études d’épidémiologie génétique ont beaucoup évolué au cours de ces 2
dernières décennies. Les premières études génétiques des maladies communes ont
consisté en l’étude de jumeaux : la composante génétique (l’héritabilité) d’un phénotype était
estimée par comparaison de la fréquence de la pathologie entre les jumeaux monozygotes
et les jumeaux dizygotes.
Dans les années 1990, les avancées technologiques du génotypage avec l’apparition
de la PCR (polymerase chain reaction) ont fait place aux études d’association de gènes
candidats, soit dans des échantillons de cas et de témoins soit dans des études en
population. L’approche « gène candidat » est une approche a priori : on choisit un gène qui
serait impliqué dans la physiopathologie de la maladie étudiée (grâce à des modèles
animaux ou cellulaires) ou impliqués dans les formes monogéniques de la maladie. On teste
alors l’association entre des variants génétiques (ou polymorphismes), des SNPs (single
nucleotide polymorphisms) dans la plupart des cas, ou des haplotypes (combinaisons
d’allèles de plusieurs polymorphismes sur le chromosome), et le risque de maladie. Par cette
approche, il est également possible d’analyser les interactions gène x gène ou gène x
environnement. Le problème majeur de ces études réside en la faible puissance statistique
de beaucoup d’études, due à des effectifs trop petits. En effet, dans des échantillons
inférieurs à 1000 individus, le nombre de faux positifs (détection d’une association alors qu’il
n’y en a pas) et de faux négatifs (non-détection d’une association alors qu’elle existe) est
important. Plus l’effet du polymorphisme génétique ou sa fréquence sont petits, plus le

45
 Introduction

nombre d’individus requis est grand (Figure 13). La limite de cette approche est le faible taux
de concordance des résultats entre les études. Les méta-analyses représentent un bon outil
pour augmenter les effectifs et ainsi la puissance statistique, mais souffrent du biais de
publication, les résultats négatifs étant beaucoup moins publiés que les résultats positifs.
En parallèle de ces études d’associations, les études de liaison permettent une
approche sans a priori : dans une population d’individus apparentés, on examine la co-
ségrégation de régions chromosomiques avec le phénotype d’intérêt. Par clonage
positionnel, les QTLs (quantitative trait loci) impliqués dans la maladie sont identifiés. Bien
que cette stratégie s’avère efficace dans l’étude de désordres à ségrégation mendélienne ou
de rares maladies dont la composante génétique est très importante, son succès dans
l’étude des maladies communes et des traits quantitatifs continus comme l’IMC, reste limité.
De plus, elle ne permet pas, en général, de localiser avec précision le gène responsable du
phénotype.
Depuis 2005, les GWAS (genome wide association studies) ont révolutionné les
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études d’épidémiologie génétique. Cette approche consiste en l’exploration de la variabilité

du génome entier, sans a priori, chez des individus non apparentés. Deux avancées
majeures ont permis ce type d’étude. D’une part, le génotypage à haut débit a été rendu
possible grâce à la technologie des biopuces, qui permet de génotyper simultanément
jusqu’à maintenant un million de SNPs. D’autre part, le projet international HapMap
[McPherson et al. 2001] a considérablement accru nos connaissances sur les
polymorphismes génétiques et leur déséquilibre de liaison (co-ségrégation des allèles de 2
loci différents). Ainsi, ces 2 avancées ont permis la conception de biopuces à SNPs qui
captureraient 80% de l’ensemble des polymorphismes génétiques [Magi et al. 2007]. Les
GWAS ont ainsi permis d’identifier de nouveaux gènes, parfois inattendus. Ces études sont
en général construites en 2 étapes : une première étape consistant en la GWAS à
proprement parler, puis une 2ème étape de réplication, où seuls les loci les plus significatifs de
la 1ère étape sont testés dans des études à très grande échelle (souvent >10 000 individus
pour les maladies communes) afin de les valider.

Les études d’épidémiologie génétique concernant l’obésité, le DT2, les dyslipidémies

et l’hypertension artérielle pullulent, tandis que celles qui ont examiné le syndrome
métabolique se font plus rares. En effet, les controverses concernant les critères à employer
ainsi que les débats sur l’existence même du syndrome métabolique n’ont pas encouragé les
études génétiques dans ce domaine, et ont donné naissance à de nombreuses études sur
chacun des phénotypes du syndrome métabolique, considérés individuellement, plutôt que
sur le syndrome métabolique en tant qu’entité.

46
 Introduction

IV.2.b. Facteurs génétiques de l’obésité et des phénotypes associés

La composante génétique de l’obésité est relativement élevée, de 25 à 60% pour
l’IMC, selon les études. L’obésité abdominale présente aussi une héritabilité génétique
élevée, de 40 à 55% suivant les études [Teran-Garcia et al. 2007]. Les nombreuses études
d’association qui ont été réalisées ont révélé une multitude de gènes candidats. Selon la
mise à jour du Human Obesity Gene Map, d’octobre 2005, 127 gènes candidats étaient
associés aux phénotypes relatifs à l’obésité [Rankinen et al. 2006]. Cependant, ces résultats
n’ont pu être répliqués que pour 12 gènes seulement dans au moins 10 études
indépendantes. Ce sont les gènes ADIPOQ, ADRB2, ADRB3, GNB3, HTR2C, NR3C1, LEP,
LEPR, PPARG, UCP1, UCP2 et UCP3 (Tableau 7). Etant donné l’hétérogénéité du
développement de l’obésité, beaucoup d’autres variants génétiques communs doivent
contribuer à la détermination de l’IMC, chacun exerçant un effet modeste.
La première étude de liaison sur génome entier concernant le pourcentage de masse
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grasse a été publiée en 1997 [Norman et al. 1997] et depuis, le nombre d’études et de QTLs
ont augmenté exponentiellement [Li et al. 2008]. La Human Obesity Gene Map révéla
l’existence de 250 QTLs possibles répartis sur l’ensemble des chromosomes, mais seuls 15
QTLs ont pu être répliqués dans au moins 3 études et aucun d’entre eux n’a pu être réduit à
la localisation précise du gène ou du variant génétique responsable du phénotype [Rankinen
et al. 2006]. Même une méta-analyse de 37 études de liaison sur génome entier (10 000
familles) n’a pas permis l’identification d’un gène sans équivoque [Saunders et al. 2007].
L’étude de Scuteri et al est la première GWAS à grande échelle portant sur les
phénotypes relatifs à l’obésité (masse corporelle, IMC et tour de hanches) [Scuteri et al.
2007]. Les GWAS ont connu leur premier succès avec la découverte du gène FTO (fat mass
and obesity-associated) comme facteur de risque de l’obésité [Scuteri et al. 2007; Frayling et
al. 2007; Dina et al. 2007a]. L’allèle à risque de FTO est associé à une augmentation de
l’IMC de 0,40-0,66 kg/m² et du risque de surpoids (OR=1,18) et d’obésité (OR=1,32). Les
individus homozygotes pour l’allèle à risque (16% de la population) pèsent en moyenne 3 kg
de plus et ont un risque d’obésité augmenté (OR=1,70) [Scuteri et al. 2007; Frayling et al.
2007; Dina et al. 2007a]. Afin d’identifier de nouveaux polymorphismes génétiques associés
aux phénotypes relatifs à l’obésité, une méta-analyse de GWAS fut entreprise (n=16876)
[Loos et al. 2008]. Le 2ème signal après FTO a été localisé près du gène MC4R, dont les
mutations sont connues pour être responsables de formes monogéniques d’obésité sévère
dès l’enfance [Farooqi et al. 2003]. Ce signal fut confirmé chez environ 60000 adultes et
6000 enfants : ce variant génétique est associé à une augmentation de l’IMC chez les
adultes et les enfants (z-score 0,05) et à une augmentation du risque d’obésité sévère chez
les enfants (OR=1,30) [Loos et al. 2008]. Grâce au consortium GIANT (Genetic Investigation
of ANthropometric Traits), 6 nouveaux loci ont été identifiés dans une nouvelle méta-analyse

47
 Introduction

de 15 GWAS (n=32387) et confirmés dans 14 cohortes additionnelles (n>59000) [Willer et al.

2009]. Ces loci sont situés dans ou à proximité des gènes TMEM18, KCTD15, SH2B1,
MTCH2, GNPDA2 et NEGR1 (Tableau 7). Malgré la robustesse des résultats concernant les
8 gènes associés dans ces GWAS, l’impact de chaque allèle à risque est généralement
faible (0,06 à 0,33 kg/m²). Ainsi, l’ensemble de ces 8 loci expliquerait moins de 1% de la
variation totale de l’IMC [Willer et al. 2009].
Récemment, des GWAS ont porté sur différents indices de l’adiposité et sur l’obésité
abdominale. Thorleifsson et al ont ainsi identifié le gène BDNF comme déterminant
génétique de la masse corporelle et de l’IMC [Thorleifsson et al. 2009]. Les gènes TFAP2B,
MSRA, LYPLAL1 et NRXN3 sont associés à l’obésité abdominale, estimée par le tour de
taille ou le RTH (Tableau 7) [Lindgren et al. 2009; Heard-Costa et al. 2009]. Enfin, de
récentes études GWA ont porté sur l’obésité sévère (IMC ≥ 40kg/m²). L’étude de Meyre et al,
réalisée sur 1380 individus sévèrement obèses et 1416 témoins et validée chez 14186
individus, a permis l’identification, en plus des gènes FTO et MC4R, de 4 nouveaux loci
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situés dans ou à proximité des gènes NPC1, MAF, PTER et PRL (Tableau 7) [Meyre et al.
2009]. Cotsapas et al suggèrent que la plupart des loci influençant l’IMC dans la population
générale contribuent également au développement de l’obésité sévère et que les individus
sévèrement obèses cumuleraient les allèles à risque de ces différents loci [Cotsapas et al.
2009].
Ces récentes découvertes offriront une meilleure compréhension de la
physiopathologie de l’obésité dès que le rôle de ces protéines dans la régulation de la masse
grasse sera compris. Déjà, l’identification des gènes SH2B1, NEGR1, BDNF et NRXN3, en
plus de MC4R, soulignent l’importance du rôle du SNC dans le développement de l’obésité.
Bientôt, des études à plus grande échelle (le consortium GIANT vise à regrouper 100 000
individus) et l’affinage des phénotypes devraient permettre la découverte de nouveaux
variants génétiques impliqués dans la régulation de la masse grasse.

IV.2.c. Facteurs génétiques de l’homéostasie glucidique

Le DT2 et l’insulinorésistance ont une forte composante génétique (46-90% suivant
les études) [Teran-Garcia et al. 2007]. Durant ces 10 dernières années, de nombreuses
études de liaison et d’association ont été entreprises, et l’approche gène candidat a permis
l’identification sans équivoque de variants génétiques communs associés au DT2. Ces
variants sont situés dans les gènes KCNJ11 (E23K), PPARG (P12A), TCF2/HNF1B et WFS1
(Tableau 8) [Florez et al. 2004; Gloyn et al. 2003; Nielsen et al. 2003; Altshuler et al. 2000;
Gudmundsson et al. 2007; Winckler et al. 2007; Sandhu et al. 2007]. Il est important de

48
 Introduction

souligner que des mutations rares dans ces 4 gènes provoquent des formes monogéniques
de DT2 [Barroso et al. 1999; Gloyn et al. 2004; Inoue et al. 1998; Nishigori et al. 1998].
En 2006, l’affinage de la région du chromosome 10 précédemment associée au DT2
dans une étude de liaison, permit l’identification d’un nouveau variant situé dans le gène
TCF7L2 [Grant et al. 2006]. Cette découverte représente une grande avancée dans la
génétique du DT2, puisque TCF7L2 a été le premier gène identifié par une approche sans a
priori. Parmi tous les polymorphismes associés au DT2 identifiés à ce jour, ceux de TCF7L2
ont le plus grand impact sur le risque de DT2 : les 7% d’Européens homozygotes pour l’allèle
à risque ont un risque de DT2 multiplié par 2 par rapport aux individus homozygotes pour
l’allèle fréquent [Grant et al. 2006; Helgason et al. 2007].
Les GWAS ont confirmé l’association des gènes TCF7L2, PPARG et KCNJ11 avec le
risque de DT2 et ont permis l’identification de 6 nouveaux loci : FTO, CDKAL1, CDKN2A-2B,
IGF2BP2, SLC30A8 et HHEX/IDE (Tableau 8) [Saxena et al. 2007; Scott et al. 2007; 2007b;
Zeggini et al. 2007; Steinthorsdottir et al. 2007; Sladek et al. 2007; Florez et al. 2007;
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Timpson et al. 2009]. Parmi ces associations, seule celle de FTO ne résiste pas à
l’ajustement sur l’IMC, signifiant que, sauf pour FTO, ces associations avec le DT2 ne sont
pas dues à une prise de poids [Zeggini et al. 2007]. La méta-analyse du consortium
DIAGRAM (Diabetes Genetics Replication And Meta-analysis) (n=10128) a permis ensuite
d’identifier 6 nouveaux loci associés au DT2 : JAZF1, CDC123-CAMK1D, TSPAN8-LGR5,
THADA, ADAMT59 et NOTCH2 (Tableau 8). Ces 6 loci ne semblent pas être associés à
l’IMC, et ont un effet très modeste sur le risque de DT2 (OR=1,1-1,2) [Zeggini et al. 2008].
Grâce à l’augmentation des effectifs, de récentes études ont pu affiner les
phénotypes étudiés. Ainsi, un polymorphisme génétique situé à proximité du gène G6PC2
(glucose-6-phosphatase C-2) est associé à la glycémie à jeun et explique 1% de la variation
totale de la glycémie [Chen et al. 2008; Bouatia-Naji et al. 2008]. De plus, le rôle de
polymorphismes génétiques du gène GCK (glucokinase) dans la tolérance au glucose a été
confirmé [Prokopenko et al. 2009]. De même, plusieurs polymorphismes génétiques
localisés dans le gène MTNR1B sont associés à la glycémie à jeun, au HOMA-B
(homeostasis model assessment of β cell function) et au DT2 [Prokopenko et al. 2009;
Bouatia-Naji et al. 2009; Sabatti et al. 2009]. Enfin, le gène PANK1 est associé à la
concentration plasmatique d’insuline [Sabatti et al. 2009].
Les résultats des GWAS fournissent de précieuses informations pour la
compréhension des mécanismes physiopathologiques du DT2. En effet, 8 loci (TCF7L2,
KCNJ11, IGF2BP2, CDKN2A-2B, CDKAL1, SLC30A8, HHEX/IDE, MTNR1B) parmi les 18
identifiés sont associés à une altération des fonctions des cellules β du pancréas, entraînant
une mauvaise sécrétion d’insuline [Perry et al. 2008; Prokopenko et al. 2009]. En revanche,

49
 Introduction

aucun lien évident n’a pu être établi entre ces 8 loci et une insulinorésistance, suggérant que
l’insulinorésistance n’est peut-être pas la 1ère cause du développement d’un DT2.
L’ensemble de ces résultats représente un grand pas en avant non seulement dans
la compréhension des facteurs génétiques influençant le développement du DT2, mais aussi
dans la compréhension de son étiologie, et offre ainsi de nouvelles perspectives de
recherche et potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques.

IV.2.d. Facteurs génétiques des lipides plasmatiques

L’héritabilité du profil lipidique est estimée suivant les études entre 25 et 60% pour les
TG, entre 50 et 60% pour le cholestérol total, entre 30 et 80% pour le HDL-cholestérol et
entre 26 et 60% pour le LDL-cholestérol [Teran-Garcia et al. 2007]. La recherche de
déterminants génétiques contribuant à la variation des taux lipidiques plasmatiques
commença il y a plus de 25 ans. Aujourd’hui, de nombreux gènes responsables des
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dyslipidémies mendéliennes ont été identifiés [Dedoussis 2007; Rahalkar et al. 2008]. En
revanche, l’identification des facteurs génétiques des désordres lipidiques moins sévères et
plus fréquents s’est avérée fastidieuse. Une fois de plus, le faible taux de concordance des
résultats entre les différentes études d’association et de liaison a rendu cette identification
difficile. Néanmoins, de récentes méta-analyses confirment les associations entre les
polymorphismes ε de l’APOE et le taux de LDL-cholestérol [Bennet et al. 2007], et 3
polymorphismes de la CETP avec le HDL-cholestérol [Thompson et al. 2008] (Tableau 9).
De même, le cluster de gènes APOA1-C3-A4-A5 a été associé au taux plasmatique de TG
[Shoulders et al. 2004].
D’importants déterminants génétiques des taux de lipides ont été identifiés grâce à
l’étude des désordres monogéniques. Ainsi, des mutations des gènes PCSK9, APOB et
MTTP sont associés au taux plasmatique de LDL-cholestérol (Figure 14) [Tarugi et al. 2007].
De plus, des mutations dans les gènes ABCA1, APOA1, LCAT, CETP et LIPC sont
associées au taux de HDL-cholestérol [Brooks-Wilson et al. 1999; Assmann et al. 1993;
Hovingh et al. 2005]. Enfin, des mutations dans les gènes LPL, APOC2, MTTP, APOB et
SAR1B sont associées aux concentrations de TG [Fojo et al. 1992; Peterfy et al. 2007;
Young et al. 2007; Talmud 2007; Whitfield et al. 2004; Jones et al. 2003] (Tableau 9).
Le séquençage d’un grand nombre d’individus ayant des taux de lipoprotéines
extrêmes s’avère être une bonne stratégie pour identifier des mutations dans des gènes
candidats. Un excès de mutations chez les individus appartenant à une extrémité de la
distribution par rapport aux individus de l’autre extrémité peut mettre en évidence une
association génétique. Cette approche permit de confirmer l’impact de mutations des gènes
ABCA1, APOA1 et LCAT [Cohen et al. 2004] sur le HDL-cholestérol, de PCSK9 sur le LDL-
cholestérol [Cohen et al. 2005], et de LPL, APOC2 et d’APOA5 sur les TG [Wang et al.

50
 Introduction

2007a] (Tableau 9). De plus, des mutations dans le gène LIPG ont ainsi été identifiées et
sont associées au HDL-cholestérol [deLemos et al. 2002], de même que pour ANGPTL4
associé aux concentrations plasmatiques de TG [Romeo et al. 2007] (Figure 14).
Les récentes GWAS ont confirmé la plupart de ces gènes et en ont identifié de
nouveaux [Kathiresan et al. 2007; Kooner et al. 2008; Sandhu et al. 2008; Wallace et al.
2008; Willer et al. 2008; Sabatti et al. 2009]. Ainsi, l’association des gènes APOE, LDLR,
APOB, PCSK9 et HMGCR avec le LDL-cholestérol a été confirmée, et de nouveaux loci ont
pu être identifiés : SORT1, CILP2, BCAM, TOMM40, ABCG8, MAFB, HNF1A, TIMD4,
ABCG5, DNAH11 et FADS2-3 [Kathiresan et al. 2008; Kathiresan et al. 2009; Willer et al.
2008; Aulchenko et al. 2009] (Tableau 9). Concernant le HDL-cholestérol, les GWAS ont
confirmé l’impact des gènes CETP, LIPC, LPL, ABCA1, LIPG et LCAT, et ont révélé de
nouveaux loci : GALNT2, MVK-MMAB, ANGPTL4, FADS1-FADS2-FADS3, HNF4A, PLTP,
TTC39B, MADD-FOLH1 et NR1H3 [Kathiresan et al. 2008; Kathiresan et al. 2009; Willer et
al. 2008; Aulchenko et al. 2009]. Enfin, pour les TG, des gènes déjà connus, comme APOA5,
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LPL, LIPC et APOB ont été confirmés, tandis que les gènes CILP2, TRIB1, GCKR, CHREBP
(ou MLXIPL), GALNT2, AMAC1L2, FADS1-FADS2-FADS3, ANGPTL3 et PLTP sont de
nouveaux loci associés aux taux de TG [Kathiresan et al. 2008; Kathiresan et al. 2009; Willer
et al. 2008]. L’identification des gènes GCKR, CHREBP et GALNT2 font apparaître un lien
intéressant entre régulation du taux plasmatique de TG et métabolisme des glucides. Là
encore, ces récentes découvertes offrent de nouvelles perspectives thérapeutiques.

IV.2.e. Facteurs génétiques de l’hypertension artérielle

La composante génétique de l’hypertension artérielle essentielle est estimée à 50%
[Teran-Garcia et al. 2007]. Les déterminants génétiques de la pression artérielle systolique
(PAS) sont estimés à 20-70%, et ceux de la pression artérielle diastolique (PAD), à 10-50%,
selon les études. Comme pour les autres désordres métaboliques, il existe des formes
monogéniques de l’hypertension artérielle. Les gènes HSD11B2, CYP11B1, CYP11B2,
NR3C2, SCNN1B, SCNN1G, WNK1, WNK4, PPARG et MT-TI (Tableau 10) sont
responsables de ces formes mendéliennes de l’hypertension artérielle, mais ne sont pas
tous associés à l’hypertension artérielle essentielle [Binder 2007]. De nombreuses études de
liaison ont identifié des régions liées à la pression artérielle et/ou à l’hypertension artérielle.
Ces régions sont localisées sur tous les chromosomes sauf le 14 et le 22 [Binder 2007]. Les
études d’association ont beaucoup étudié les gènes appartenant au système rénine-
angiotensine. Des polymorphismes non synonymes du gène codant l’angiotensinogène
(AGT) sont associés à l’hypertension artérielle essentielle dans plusieurs populations
[Jeunemaitre et al. 1992; Caulfield et al. 1994; Gu et al. 2005]. En revanche, des résultats
contradictoires ont été publiés sur l’association entre le gène codant l’enzyme de conversion

51
 Introduction

de l’angiotensine (ACE) et l’hypertension artérielle [Binder 2007]. Les gènes du système

adrénergique, notamment ADRA2A, ADRA2C (récepteur adrénergique α2) et ADRB2
(récepteur adrénergique β2), ont également été largement étudiés mais de nombreux
résultats contradictoires ne permettent pas de conclure clairement sur leurs impacts.
Concernant le système endothélial, de nombreuses études ont analysé l’association entre
des SNPs du gène NOS3 et ont trouvé des résultats encore une fois incohérents.
Néanmoins une méta-analyse de 35 études d’association montra une association entre un
polymorphisme de NOS3 et l’hypertension artérielle [Zintzaras et al. 2006]. Le recoupement
des données des études de liaison et d’association mit en évidence une association entre le
gène MEX3C (ou RKHD2) et l’hypertension artérielle essentielle [Guzman et al. 2006], mais
aucune étude fonctionnelle de ce gène ne permet à ce jour de comprendre son impact dans
la physiopathologie de l’hypertension artérielle.
De récentes GWAS ont permis l’identification de polymorphismes associés à la
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pression artérielle et/ou à l’hypertension artérielle, localisés à proximité de 16 loci :

CYP17A1, CYP1A2, FGF5, SH2B3, MTHFR, c10orf107, ZNF652, PLCD3, ATP2B1,
CACNB2, PLEKHA7, CSK/ULK3, TBX3-TBX5, ULK4, CDH13 et STK39 (Tableau 10)
[Newton-Cheh et al. 2009; Levy et al. 2009; Org et al. 2009; Wang et al. 2009]. La
découverte de ces gènes offre de nouvelles perspectives dans les mécanismes de régulation
de la pression artérielle et de nouvelles cibles thérapeutiques.

IV.2.f. Facteurs génétiques du syndrome métabolique

L’héritabilité du syndrome métabolique selon les critères du NCEP a été estimée à
30% [Teran-Garcia et al. 2007]. Dans une étude de jumeaux (2508 paires), la concordance
entre jumeaux souffrant à la fois d’une obésité, d’un DT2 et d’une hypertension artérielle était
de 31,6% pour les jumeaux monozygotes, contre 6,3% pour les jumeaux dizygotes [Carmelli
et al. 1994].
L’identification génétique du syndrome métabolique est rendue difficile par la
complexité de ce syndrome. Cette complexité se situe à deux niveaux. D’une part, chacune
des voies métaboliques impliquées dans le développement du syndrome est complexe et
met en jeu de nombreux gènes. D’autre part, l’étiologie du syndrome reste encore inconnue
aujourd’hui. Le choix des gènes candidats repose alors sur 2 hypothèses : soit le gène a un
effet pléiotropique, et joue sur différentes voies métaboliques du syndrome métabolique, soit
il joue sur un seul phénotype pouvant suffire à lui seul au développement du syndrome.
De nombreuses études ont recherché si des gènes déjà associés à un phénotype du
syndrome métabolique pouvaient être également associés à d’autres phénotypes ou au
risque de syndrome métabolique lui-même. Parmi les gènes associés à l’obésité, le gène de
la leptine est aussi associé à l’hypertension et au DT2, indépendamment de son association

52
 Introduction

avec l’obésité [Shintani et al. 2002; Lakka et al. 2000]. Le gène ADRB3 est également
associé à l’insulinorésistance et au taux de TG [Kawamura et al. 1999; Kim-Motoyama et al.
1997; Thomas et al. 2000]. Cependant, bien que ces gènes soient associés à plusieurs
phénotypes du syndrome, ils ne semblent pas être associés au risque de syndrome
métabolique [Meirhaeghe et al. 2005b; Dunajska et al. 2008]. Le gène NR3C1, récepteur aux
glucocorticoïdes, est associé à la sensibilité à l’insuline et à l’hypertension en plus d’être
associé à l’obésité [Rosmond 2002; van Rossum et al. 2004], mais son impact sur le risque
de syndrome métabolique n’a pas encore été montré. En revanche, les gènes ADRB2
(associé au risque d’obésité et d’hypertension artérielle) et FTO (associé au risque d’obésité
et de DT2) sont associés au risque de syndrome métabolique [Dallongeville et al. 2003;
Sjogren et al. 2008] (Tableau 11). De même, PPARG, qui est un gène candidat « idéal »
puisque, en plus d’être associé à l’obésité, au DT2 et à l’hypertension artérielle, il est
responsable de lipodystrophie de forme familiale [Hegele 2001; Hegele et al. 2005], est
également associé au risque de syndrome métabolique [Meirhaeghe et al. 2005a].
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Parmi les gènes associés au DT2, les gènes TCF7L2, WFS1 et IGF2BP2 sont
également associés au risque de syndrome métabolique [Sjogren et al. 2008]. Néanmoins,
ces associations sont très modestes (OR=1,07-1,10) et ces polymorphismes ne sont
associés qu’à un seul phénotype du syndrome métabolique, le désordre glucidique. Les
associations avec le syndrome métabolique seraient donc entièrement dues à l’impact
important de ces gènes sur la glycémie.
Parmi les gènes associés aux lipoprotéines, les gènes APOA1, LIPC, LPL, GALNT2,
ANGPTL4, FADS et PLTP sont associés aux concentrations plasmatiques à la fois de HDL-
cholestérol, et de TG, ce qui leur confère une grande chance d’être associés au risque de
syndrome métabolique puisque les taux de HDL-cholestérol et de TG sont 2 composantes
individuelles du syndrome métabolique (du moins selon les critères du NCEP, de l’AHA et de
l’IDF). Ainsi, le gène LIPC est effectivement associé au risque de syndrome métabolique
[McCarthy et al. 2003] (Tableau 11). De même, le gène codant la LPL est associé au risque
de syndrome métabolique [Komurcu-Bayrak et al. 2007]. Notons que dans cette étude, le
gène codant la LPL est également associé à la glycémie. Aucune étude d’association sur le
risque de syndrome métabolique n’a été décrite pour les gènes APOA1, GALNT2,
ANGPTL4, FADS et PLTP à ce jour. Par ailleurs, le gène APOA5, connu pour être associé
aux TG, est également associé au risque de syndrome métabolique [Grallert et al. 2007;
Dallongeville et al. 2008]. Notons que dans l’étude de Grallert et al [Grallert et al. 2007], le
polymorphisme étudié est également associé au taux de HDL-cholestérol. Enfin, plusieurs
études ont rapporté une association entre APOC3 et syndrome métabolique, mais il semble
que ce ne soit pas le cas chez les individus de type Caucasien [Pollex et al. 2007].

53
 Introduction

Parmi les gènes associés à l’hypertension, NOS3 est également associé au DT2
[Monti et al. 2003], ainsi qu’au syndrome métabolique dans plusieurs études [Gonzalez-
Sanchez et al. 2007; Piccoli et al. 2008; Fernandez et al. 2004] (Tableau 11). En effet, NOS3
est non seulement associé à la pression artérielle, mais aussi à l’insulinorésistance, au taux
de HDL-cholestérol et au RTH[Monti et al. 2003; Gonzalez-Sanchez et al. 2007]. De même,
le gène CYP11B2 est également associé au risque de syndrome métabolique et à une
hyperglycémie [Russo et al. 2007].

D’autres gènes semblent être robustement associés à plusieurs des phénotypes du

syndrome métabolique. C’est le cas du gène HSD11B1 (hydroxysteroid 11-beta
dehydrogenase 1) associé à la tension artérielle et aux concentrations plasmatiques en LDL-
cholestérol et en ApoB [Agarwal et al. 2000; White et al. 2000; Robitaille et al. 2004;
Gambineri et al. 2006], du gène ADIPOR2 (adiponectin receptor 2) associé au DT2 et aux
taux plasmatiques de TG, VLDL-TG et VLDL-cholestérol [Damcott et al. 2005; Broedl et al.
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2006], du gène RETN (résistine) associé à l’insulinorésistance, le DT2 et l’obésité [Savage et

al. 2001; Sentinelli et al. 2002; Pizzuti et al. 2002; Ma et al. 2002], du gène PARL (presenilin
associated, rhomboid-like) localisé dans une région chromosomique liée à l’obésité et au
DT2 [Vionnet et al. 2000] et associé à l’insulinémie [Walder et al. 2005] et du gène codant
TNFα associé à l’obésité, l’insulinorésistance et à la pression artérielle [Fernandez-Real et
al. 1997; Brand et al. 2001; Dalziel et al. 2002; Sookoian et al. 2005]. Cependant, aucun de
ces gènes n’a été directement associé au risque de syndrome métabolique. En effet, les
études sur HSD11B1, ADIPOR2 et RETN sont basées sur les phénotypes (ou facteur
d’analyse) et n’ont pas analysé le syndrome métabolique en tant qu’entité. Concernant PARL
et TNFα, l’association avec le risque de syndrome métabolique a été recherchée mais n’a pu
être détectée [Powell et al. 2008; Meirhaeghe et al. 2005b].
En revanche, le gène ENPP1, associé à l’insulinorésistance et l’obésité chez les
adultes et les enfants, et à la pression artérielle chez les adultes [Santoro et al. 2009; Meyre
et al. 2005; Pizzuti et al. 1999] est également associé au risque de syndrome métabolique
[Santoro et al. 2009; Tasic et al. 2007] (Tableau 11). De même, le gène CAPN10 est associé
à l’insulinorésistance, au taux de cholestérol et à la pression artérielle, ainsi qu’au risque de
syndrome métabolique [Saez et al. 2008]. Enfin, le gène IL6, associé à l’insulinorésistance, à
l’obésité et à une dyslipidémie, est également associé au risque de syndrome métabolique
[Hamid et al. 2005; Stephens et al. 2007].

De nombreuses études de liaison ont également été entreprises afin d’identifier des
gènes associés au syndrome métabolique ou aux phénotypes apparentés [DeWan et al.
2001; Arya et al. 2002; Duggirala et al. 2001; Kissebah et al. 2000; Kraja et al. 2005; Lehman

54
 Introduction

et al. 2005; Loos et al. 2003; Edwards et al. 2008]. Trente-huit QTLs ont été ainsi identifiés et
retenus selon Teran-Garcia & Bouchard [Teran-Garcia et al. 2007] (Figure 15). On peut
remarquer la faible concordance entre les gènes identifiés par cette approche et les gènes
identifiés par les études d’association (Tableau 11), ce qui n’est pas surprenant étant donné
l’hétérogénéité des phénotypes analysés dans les études de liaison et d’association. Les
GWAS sur le syndrome métabolique pourraient permettre une grande avancée dans
l’identification des déterminants génétiques de ce syndrome.
Les 11 gènes associés au syndrome métabolique présentés dans le Tableau 11, ont
des effets très variés et interviennent dans des voies métaboliques diverses. Les gènes
ADRB2, PPARG et NOS3 codent des protéines aux effets pléiotropiques. En effet, ADRB2
code le récepteur aux catécholamines, impliquées dans la régulation de la lipolyse du TA, la
distribution des AGL, le métabolisme des lipoprotéines, l’homéostasie glucidique, le tonus
vasculaire et la pression artérielle [Insel 1996]. PPARγ contrôle la différenciation adipocytaire
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et améliore aussi la sensibilité à l’insuline en contrôlant la répartition des graisses et en

régulant l’expression d’adipokines. De plus, PPARγ est également impliqué dans la
prolifération cellulaire, l’athérosclérose et le système immunitaire [Tontonoz et al. 2008]. Le
gène NOS3 code la synthase endothéliale d’oxyde nitrique (eNOS), impliquée dans la
production d’oxyde nitrique, une molécule ubiquitaire responsable du maintien des fonctions
endothéliales. Mais l’oxyde nitrique est également impliqué dans le métabolisme du glucose
en facilitant l’utilisation de celui-ci par les muscles squelettiques [Balon et al. 1997; Higaki et
al. 2001]. Le gène CYP11B2, codant l’aldostérone synthase (composante du système
rénine-angiotensine) impliquée dans la régulation de la pression artérielle, pourrait aussi
jouer un rôle dans l’homéostasie glucidique [Ranade et al. 2001; Russo et al. 2007].
Pareillement, IL-6 semble être impliqué à la fois dans le développement de l’obésité et de
l’insulinorésistance, mais ses mécanismes d’action sont encore mal compris. Ces gènes
représentent donc de bons exemples de gènes impliqués dans le développement du
syndrome métabolique en touchant plusieurs voies métaboliques simultanément. Au
contraire, les autres gènes du Tableau 11 (excepté FTO dont les fonctions ne sont pas
encore bien connues) ne semblent pas avoir d’effets pléiotropiques. L’association des gènes
LIPC, LPL et APOA5 avec le syndrome métabolique met en évidence l’importance du
métabolisme des lipoprotéines dans la physiopathologie du syndrome. De même, les gènes
ENPP1 et CAPN10 mettent en exergue le rôle de la signalisation de l’insuline dans le
développement de désordres métaboliques. Ainsi, l’altération d’une seule voie métabolique
semble pouvoir affecter les autres voies métaboliques et ainsi conduire au développement
du syndrome métabolique.

55
 Introduction

V. Gènes candidats

Dans le but d’identifier de nouveaux facteurs de susceptibilité génétique au syndrome

métabolique et des phénotypes associés, nous nous sommes intéressés au gène FTO
(identifié par les GWAS comme déterminant génétique de l’obésité), aux gènes codant LXRα
et LXRβ (liver X receptor, récepteurs nucléaires régulant l’expression de nombreux gènes
impliqués dans le métabolisme glucido-lipidique) et ANGPTL3, ANGPTL4 et ANGPTL6
(angiopoietin-like proteins, protéines plasmatiques impliquées dans le métabolisme
lipidique).

V.1. FTO

L’identification du gène FTO (fused toe, depuis renommé fat mass and obesity-
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associated) représente une avancée majeure dans l’étude des facteurs de susceptibilité
génétique aux maladies métaboliques et a été le premier véritable succès des GWAS. A
l’origine, Fto a été identifié chez la souris comme un gène faisant partie d’un segment de
chromosome (comprenant les gènes Fto, Ftm, Fts et d’autres) dont la délétion est
responsable de la fusion des doigts (Ft, fused toe) [Peters et al. 1999]. Les souris
hétérozygotes pour cette délétion (Ft+/-) présentent, en plus de la fusion des doigts, une
hyperplasie du thymus suggérant une altération du programme apoptotique des cellules. Les
embryons de souris homozygotes Ft-/- meurent à mi-gestation et présentent de graves
malformations, notamment au niveau du cerveau, du cœur et des structures cranio-faciales,
ainsi qu’un défaut de fermeture du tube neural [Peters et al. 1999].
En 2007, deux GWAS ont identifié le gène FTO comme facteur de prédisposition au
DT2 [Scott et al. 2007; 2007b]. En effet, plusieurs SNPs situés dans le 1er intron du gène
FTO, en particulier le rs9939609, sont associés à une augmentation du risque de DT2 de 25
à 50% dans ces études. Cependant, ces associations ne résistaient pas à l’ajustement sur
l’IMC, signifiant que cette prédisposition pour le DT2 était en fait due à l’association avec
l’IMC [Frayling et al. 2007]. Par la suite, l’association des variants génétiques de FTO avec
l’IMC a été répliquée dans plusieurs GWAS [Scuteri et al. 2007; Frayling et al. 2007; Dina et
al. 2007a]. Dans ces études, l’allèle à risque de FTO est associé à une augmentation de
l’IMC de 0,40-0,66 kg/m² et du risque de surpoids (OR=1,18) et d’obésité (OR=1,32), et ce
dès l’enfance. Les individus homozygotes pour l’allèle à risque pèsent en moyenne 3 kg de
plus que les individus homozygotes pour l’allèle fréquent [Scuteri et al. 2007; Frayling et al.
2007; Dina et al. 2007a]. Étant donné la fréquence élevée de ce SNP (63% des européens

56
 Introduction

portent l’allèle à risque et 16% sont homozygotes), la part attribuable à ce SNP dans le
risque d’obésité est estimée à 20%.
Depuis, plusieurs équipes cherchent à identifier les fonctions de la protéine FTO.
Cette protéine a été identifiée comme membre de la famille des dioxygénases dépendantes
du 2-oxoglutarate [Gerken et al. 2007]. Elle catalyse ainsi la déméthylation des acides
nucléiques et permettrait la réparation d’ADN et d’ARN alkylés [Duncan et al. 2002]. En
cohérence avec ces fonctions, la protéine FTO est localisée dans le noyau des cellules
[Gerken et al. 2007]. L’expression de FTO semble être ubiquitaire, avec une expression plus
marquée dans le cerveau et le foie, mais il est aussi exprimé dans le TA, le cœur, les
cellules β du pancréas et le muscle squelettique [Scuteri et al. 2007; Frayling et al. 2007;
Dina et al. 2007a].
Les mécanismes par lesquels FTO régule la balance énergétique sont encore
méconnus. Cependant, des études fonctionnelles ont confirmé son rôle dans la
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physiopathologie de l’obésité chez la souris. D’abord, son expression dans le cerveau, en

particulier dans l’hypothalamus, est régulée par la prise alimentaire et le jeûne [Gerken et al.
2007]. De plus, les souris knock-out (KO) Fto-/-, récemment créées, présentent une réduction
du TA et de la masse maigre, attribuable à une augmentation de la dépense énergétique
[Fischer et al. 2009]. Des études complémentaires sont nécessaires pour établir le lien entre
ses fonctions de déméthylation des acides nucléiques et la régulation de la balance
énergétique.

V.2. Les liver X receptors

Les liver X receptors (LXRs) sont des facteurs de transcription activés par un ligand,
appartenant à la famille des récepteurs nucléaires. Ils ont été identifiés en 1994 par les
équipes de Apfel et al [Apfel et al. 1994] et de Song et al [Song et al. 1994]. Ils sont
composés de 4 domaines :
- un domaine AF-1 (activation function-1) en N-terminal, dont la fonction d’activation
de la transcription est indépendante du ligand,
- un domaine de liaison à l’ADN (DBD) contenant 2 doigts de zinc,
- un domaine hydrophobe de liaison au ligand (LBD) requis pour la dimérisation du
récepteur,
- une séquence AF-2 en C-terminal de transactivation dépendante du ligand qui
induit la transcription en réponse au ligand.
Deux isoformes ont été décrites : LXRα, codé par le gène NR1H3 (nuclear receptor
subfamily 1, group H, member 3), et LXRβ, codé par le gène NR1H2. Les LXRs régulent

57
 Introduction

l’expression de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme lipidique et glucidique,

l’inflammation et l’immunité.

V.2.a. Fonctions décrites des LXRs

1) Mode d’action
Les LXRs régulent la transcription de certains gènes en se fixant sous la forme d’un
hétérodimère avec le récepteur de l’acide 9-cis rétinoïque (RXR) sur une séquence
spécifique appelée LXR response element (LXRE), consistant en un DR-4 (direct repeat
séparé de 4 nucléotides) et localisée dans le promoteur du gène cible (Figure 16) [Willy et al.
1995]. A l’état basal et en l’absence de ligand, l’hétérodimère LXR/RXR réprime activement
la transcription du gène en recrutant des complexes co-répresseurs [Repa et al. 2000c;
Wagner et al. 2003]. LXR/RXR est un hétérodimère permissif car il peut être activé soit par
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un ligand de LXR soit par le ligand de RXR [Willy et al. 1995]. La fixation d’un des ligands
induit un changement conformationnel de l’hétérodimère entraînant le remplacement des co-
répresseurs par des co-activateurs (Figure 16), activant ainsi la transcription du gène cible
[Glass et al. 2000]. Par ailleurs, il a été décrit un mécanisme alternatif par lequel les LXRs
stimulent l’expression génique en se fixant à une séquence CNRE (cAMP-negative response
element) sous forme de monomères [Tamura et al. 2000; Tamura et al. 2004; Anderson et
al. 2003; Morello et al. 2005]. Dans cette voie de régulation, encore peu connue, les LXRs
serviraient d’intermédiaires transcriptionnels dans la signalisation de l’AMPc.
Les ligands naturels des LXRs sont des dérivés oxydés du cholestérol appelés
oxystérols parmi lesquels les activateurs les plus puissants sont le 22(R)-hydroxycholestérol
et le 20(S)-hydroxycholestérol (intermédiaires de la synthèse des hormones stéroïdiennes),
le 24(S)-hydroxycholestérol (l’oxystérol le plus abondant dans le plasma, produit dans le
cerveau), le 24(S),25-époxycholestérol (abondant dans le foie) et le 27-hydroxycholestérol
(intermédiaire de la synthèse des acides biliaires) [Lehmann et al. 1997; Janowski et al.
1996; Forman et al. 1997]. Ces ligands se fixent au LBD et stimulent l’activité
transcriptionnelle des LXRs à des concentrations physiologiques. La plupart des ligands
endogènes qui ont été identifiés jusqu’à maintenant, activent à la fois LXRα et LXRβ.
Cependant, le 5,6-24(S),25-diépoxycholestérol, les acides biliaires 6α-hydroxy, et l’acide
cholesténoïque sont des ligands relativement sélectifs pour LXRα [Janowski et al. 1999;
Song et al. 2000a; Song et al. 2000b]. Par ailleurs, il a été décrit que le D-glucose et la D-
glucose-6-phosphatase induisent l’activité transcriptionnelle des LXRs, avec une efficacité
comparable à celle des oxystérols [Mitro et al. 2007], mais ces observations n’ont pu être
confirmées dans une étude récente [Denechaud et al. 2008].

58
 Introduction

En plus de ces ligands endogènes, des ligands synthétiques ont été développés, dont
les plus utilisés sont le TO901317 [Schultz et al. 2000] et le GW396 [Collins et al. 2002],
activant tous deux LXRα et LXRβ. Il a été décrit un activateur synthétique spécifique de
LXRα (Compound A) [Lund et al. 2006] et une classe d’activateurs spécifiques de LXRβ, les
N-acylthiadiazolines [Molteni et al. 2007], mais ces derniers ne semblent pas être efficaces in
vivo [Baranowski 2008]. Ainsi, des activateurs spécifiques de chaque isoforme font encore
défaut, ce qui ralentit les recherches sur la détermination des fonctions spécifiques de LXRα
et LXRβ. Notons enfin qu’il existe également des antagonistes naturels des LXRs, à savoir le
géranylgéranylpyrophosphate (intermédiaire de la biosynthèse du cholestérol), les AG
insaturés et les 3-sulfates de cholestérol oxydé [Forman et al. 1997] [Ou et al. 2001;
Yoshikawa et al. 2002; Song et al. 2001].

2) LXRs et métabolisme du cholestérol

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Les LXRs jouent un rôle important dans le métabolisme du cholestérol en régulant

l’expression de nombreux gènes impliqués à différentes étapes. Tout d’abord, il a été montré
que l’activation des LXRs inhibe l’absorption du cholestérol intestinal chez la souris
[Repa et al. 2000c]. Cet effet pourrait être médié par l’activation de l’expression des gènes
codant les transporteurs ABCG5 et ABCG8 [Repa et al. 2002], mais surtout par l’inhibition de
l’expression du gène de Niemann-Pick C1 like 1 (NPC1L1), transporteur exprimé dans les
entérocytes et nécessaire à l’absorption du cholestérol du bol alimentaire [Altmann et al.
2004; Duval et al. 2006]. De plus, les LXRs inhibent la synthèse de cholestérol
hépatique. En effet, il a été décrit chez les souris KO LXRα-/-ou LXRβ -/- une augmentation de
l’expression de gènes impliqués dans la synthèse du cholestérol dans le foie, tels que
SREBP2, l’HMG-CoA synthase et réductase, la farnésyl diphosphate synthase et la
squalène synthétase [Peet et al. 1998; Alberti et al. 2001]. Les LXRs favorisent également
l’excrétion du cholestérol du foie en stimulant l’expression des transporteurs ABCG5 et
ABCG8 qui permettent l’élimination du cholestérol par les fèces (soit sous forme libre, soit
sous forme d’acides biliaires) [Yu et al. 2003; Repa et al. 2002; Yu et al. 2002]. LXRα active
l’expression de CYP7A1 (cytochrome P450 7 A1), enzyme clé de la conversion du
cholestérol en acides biliaires, mais uniquement chez la souris [Lehmann et al. 1997; Chiang
et al. 2001].
Le rôle des LXRs dans le transport inverse du cholestérol a beaucoup été étudié.
Dans les macrophages, l’activation des LXRs augmente la captation sélective du cholestérol
des HDLs, via l’induction de l’expression des gènes ApoE, LPL et de la Cavéoline-1 [Bultel et
al. 2008]. De plus, les LXRs stimulent la mobilisation du cholestérol intracellulaire en activant
l’expression des gènes Niemann Pick C (NPC1 et NPC2) permettant le transfert de

59
 Introduction

cholestérol des pools intracellulaires vers la membrane plasmatique (Figure 17) [Rigamonti
et al. 2005]. Les LXRs stimulent l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1 permettant
l’efflux du cholestérol vers les HDLs [Repa et al. 2000c; Costet et al. 2000; Fayos et al.
1994]. Ils activent également l’expression du cluster de gènes ApoE/C-I/C-IV/C-II et apoA-IV
pouvant servir d’accepteurs extracellulaires de cholestérol [Laffitte et al. 2001b; Mak et al.
2002; Liang et al. 2004a]. De plus, les LXRs participent au remodelage des particules
lipoprotéiques en induisant l’expression de la PLTP [Cao et al. 2002; Laffitte et al. 2003b], de
la CETP [Luo et al. 2000], et de la LPL [Zhang et al. 2001]. En cohérence avec ces effets
des LXRs sur le transport inverse du cholestérol, il a été observé à maintes reprises que
l’activation des LXRs par leurs agonistes synthétiques augmente la concentration
plasmatique de HDL-cholestérol chez la souris et le rat [Collins et al. 2002; Miao et al. 2004;
Beyer et al. 2004; Sato et al. 2008].
Enfin, il a récemment été décrit que l’activation des LXRs inhibe la captation des LDL
par le LDLR dans différents types cellulaires (macrophages, hépatocytes, rein, intestin)
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[Zelcer et al. 2009]. L’activation des LXRs induit l’expression du gène Idol (inducible
degrader of the LDLR, aussi appelé Mir ou Mylip) codant une ubiquitine ligase qui provoque
la dégradation du LDLR par ubiquitinylation de son domaine cytoplasmique.

3) LXRs, inflammation et athérosclérose

L’activation des LXRs par leurs ligands synthétiques empêche la production de
médiateurs de l’inflammation, tels que l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS), la cyclo-
oxygénase 2 (COX-2), et l’IL-6, dans des macrophages soumis à une infection bactérienne
ou à du lipopolysaccharide [Joseph et al. 2003]. Cet effet est en fait médié par la
suppression de la voie de signalisation de NFκB. Cet effet anti-inflammatoire ainsi que leur
rôle dans le transport inverse du cholestérol confèrent aux LXRs des propriétés anti-
athérosclérotiques. De plus, l’activation des LXRs entraîne une inhibition de la prolifération
des cellules musculaires lisses [Blaschke et al. 2004] et une réduction de la production de
métalloprotéase-9 [Castrillo et al. 2003], limitant ainsi le développement de la plaque
d’athérome et augmentant sa stabilité. Il a été ainsi observé dans plusieurs modèles
animaux d’athérosclérose que l’activation des LXRs réduit la taille des plaques d’athérome
[Joseph et al. 2002b; Terasaka et al. 2003; Levin et al. 2005].

4) LXRs et lipogenèse hépatique

L’activation des LXRs dans le foie augmente l’expression de gènes impliqués dans la
biosynthèse des AG ainsi que la concentration de TG plasmatique [Schultz et al. 2000]
[Grefhorst et al. 2002]. Cet effet a été attribué à LXRα car, contrairement aux souris KO
LXRα-/-ou les double KO LXRα-/-β -/-, les souris KO LXRβ -/- ne présentent pas d’altération de

60
 Introduction

l’expression des gènes lipogéniques [Peet et al. 1998; Schultz et al. 2000; Schuster et al.
2002; Alberti et al. 2001]. LXRα induit l’expression du maître d’orchestre de la lipogenèse,
SREBP1c [Eberle et al. 2004], facteur de transcription régulant l’expression des gènes
lipogéniques, à savoir, l’acétyl-CoA carboxylase (ACC), FAS et SCD (Figure 18) [Repa et al.
2000a; Peet et al. 1998]. L’expression de ces 3 gènes lipogéniques est activée non
seulement par SREBP1c mais aussi directement par LXRα [Chu et al. 2006; Joseph et al.
2002a; Talukdar et al. 2006]. De plus, les LXRs activent l’expression de ChREBP
(carbohydrate responsive element binding protein), facteur de transcription sensible au
glucose stimulant l’expression des gènes lipogéniques et qui favorise ainsi la conversion de
carbohydrates en lipides [Cha et al. 2007]. Par ailleurs, les LXRs augmentent la sécrétion de
VLDL hépatique certainement via l’augmentation de l’expression de la PLTP [Grefhorst et al.
2002; Cao et al. 2002] et d’ANGPTL3 [Inaba et al. 2003]. LXRα active également
l’expression de CD36 permettant l’entrée d’AG dans le foie [Zhou et al. 2008]. De manière
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intéressante, il a été décrit que l’insuline stimule l’expression de LXRα dans des hépatocytes
de rat [Eberle et al. 2004], et que LXRα pourrait être impliqué dans l’induction de l’expression
de SREBP1c par l’insuline [Chen et al. 2004]. Notons que l’activation des LXRs provoque
aussi l’accumulation de lipides dans d’autres tissus que le foie, à savoir dans les cellules
musculaires lisses [Cozzone et al. 2006] et les cellules β du pancréas [Choe et al. 2007].

5) LXRs et métabolisme du tissu adipeux

Le rôle des LXRs dans la régulation de la différenciation adipocytaire et le stockage
des TG est controversé. Il semblerait que l’activation des LXRs favorise l’accumulation de
lipides dans les adipocytes, peut-être en stimulant la captation des AG grâce à l’induction de
l’expression de CD36 et FABP [Juvet et al. 2003], ou peut-être en stimulant la synthèse d’AG
de novo [Darimont et al. 2006]. LXRα est un gène cible de PPARγ, le chef d’orchestre de la
différenciation adipocytaire [Chawla et al. 2001]. Seo et al ont montré que les LXRs, et
notamment LXRα, stimulent la différenciation adipocytaire dans les adipocytes de souris
3T3-L1 [Seo et al. 2004]. Au contraire, Hummasti et al n’ont pas détecté d’effet de l’activation
des LXRs sur la différenciation adipocytaire dans ces cellules [Hummasti et al. 2004]. Le rôle
des LXRs dans la différenciation adipocytaire reste donc à éclaircir. Notons cependant que
les souris double KO LXRα-/-β -/- présentent une réduction de la masse de TA [Laffitte et al.
2003a] et sont résistantes à l’obésité induite par un régime hyperlipidique [Kalaany et al.
2005].

61
 Introduction

6) LXRs et métabolisme du glucose

Plusieurs études témoignent de l’implication des LXRs dans l’homéostasie glucidique.
En effet, l’administration des agonistes synthétiques de LXR diminue la glycémie et
améliore la sensibilité à l’insuline dans plusieurs modèles de rongeurs diabétiques ou
insulinorésistants [Cao et al. 2003; Laffitte et al. 2003a; Commerford et al. 2007]. En fait, les
LXRs inhibent indirectement l’expression des gènes codant les enzymes clés de la
gluconéogenèse, à savoir la phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK), la glucose-6-
phosphatase (G6Pase) et la fructose-1,6-biphosphatase (FBPase) [Stulnig et al. 2002b;
Grempler et al. 2005] (Figure 19). Cet effet pourrait être médié par une inhibition de PPARγ
coactivator 1α (PGC1α), régulateur clé de la production de glucose hépatique [Laffitte et al.
2003a; Commerford et al. 2007], ou par SREBP1c, qui inhiberait l’expression de la PEPCK
[Chakravarty et al. ], ou par la voie de signalisation des glucocorticoïdes, dont l’expression
du récepteur aux glucocorticoïdes et de la 11β-HSD1 (enzyme de conversion de la cortisone
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en forme active) est réduite après addition de TO901317 [Liu et al. 2006; Stulnig et al.
2002b; Stulnig et al. 2002a]. Cependant, le rôle des LXRs dans le métabolisme du glucose
fait débat puisque, chez des animaux non diabétiques, l’activation des LXRs n’affecte pas la
glycémie [Cao et al. 2003; Laffitte et al. 2003a]. De plus, les souris KO LXRα-/- ou LXRβ -/-
présentent une sensibilité normale à l’insuline [Gerin et al. 2005]. Enfin, Grefhorst et al ont
décrit une absence d’effet du GW3965 sur la sensibilité à l’insuline et la production de
glucose chez les souris ob/ob [Grefhorst et al. 2005].
Dans les tissus périphériques, il a été montré que les LXRs activent directement
l’expression de GLUT4 dans les adipocytes et les cellules musculaires lisses, facilitant ainsi
la captation de glucose [Grefhorst et al. 2005; Laffitte et al. 2003a; Commerford et al. 2007;
Dalen et al. 2003; Kase et al. 2007; Kase et al. 2005] (Figure 19). De plus, les LXRs, et en
particulier LXRβ, pourraient stimuler la sécrétion d’insuline in vitro, en stimulant l’expression
de GLUT2, la glucokinase et la pyruvate carboxylase [Efanov et al. 2004; Zitzer et al. 2006],
mais cet effet reste controversé in vivo [Grefhorst et al. 2005; Loffler et al. 2006; Cao et al.
2003; Liu et al. 2006; Commerford et al. 2007]. Notons qu’à long terme, l’activation des LXRs
dans le pancréas conduit à une surcharge lipidique induisant un effet lipotoxique et pourrait
même contribuer aux dysfonctions pancréatiques observées dans le DT2 [Choe et al. 2007].
Le bénéfice des agonistes synthétiques des LXRs sur l’homéostasie glucidique serait donc
limité.

7) Autres fonctions des LXRs

Chez la souris, il a été montré que les LXRs, et en particulier LXRα, activent
directement l’expression du gène de la rénine dans le rein, entraînant une augmentation de

62
 Introduction

l’activité de la rénine dans le plasma, et que LXRα est requis dans le contrôle adrénergique
du RAAS [Tamura et al. 2000; Tamura et al. 2004; Morello et al. 2005]. En revanche, chez le
rat, l’activation des LXRs par le GW3965 n’a pas d’impact sur l’activité de la rénine [Leik et
al. 2007].
Les LXRs stimulent également directement l’expression du VEGF, suggérant un rôle
des LXRs dans la biologie vasculaire [Walczak et al. 2004].
Par ailleurs, plusieurs études ont montré que l’activation des LXRs dans le cerveau
augmente l’expression de ses gènes cibles classiques (ABCA1, ABCG1 et ApoE) suggérant
que les LXRs seraient essentiels pour maintenir l’homéostasie du cholestérol dans le
cerveau [Fujiyoshi et al. 2007; Liang et al. 2004b; Whitney et al. 2002]. De plus, des études
in vitro ont révélé un effet anti-amyloïdogénique des LXRs [Koldamova et al. 2003;
Koldamova et al. 2005; Brown, III et al. 2004; Sun et al. 2003]. Les LXRs pourraient donc
être impliqués dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer.
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Enfin, les LXRs seraient impliqués dans d’autres fonctions, telles que la fonction de
reproduction, la stéroïdogenèse, la prolifération et la différenciation des kératinocytes et
l’inhibition de tumeurs cancéreuses [Jamroz-Wisniewska et al. 2007].

[Link]érences entre LXRα et LXRβ

Les deux isoformes LXRα et LXRβ sont hautement apparentées : elles partagent
63% d’identité au niveau de leur ADNc et 78% d’identité au niveau de leurs domaines de
liaison à l’ADN et au ligand [Alberti et al. 2000]. Cependant, leurs fonctions ne sont pas
entièrement redondantes et ceci semble s’expliquer d’abord par la différence entre leur profil
d’expression. En effet, l’expression de LXRα est limitée au foie, tissu adipeux, rein, intestin,
rate, poumons et macrophages où elle est exprimée de façon abondante, tandis que LXRβ
semble avoir une expression ubiquitaire et plus modérée [Apfel et al. 1994; Song et al. 1994;
Auboeuf et al. 1997; Willy et al. 1995; Repa et al. 2000b]. Cette différence d’expression peut
s’expliquer en partie par l’intervention de facteurs de transcription différents. Plusieurs
études ont montré que LXRα, et non LXRβ, est un gène cible des PPARs [Tobin et al. 2000;
Chinetti et al. 2001]. En effet, les promoteurs des gènes codant LXRα chez la souris et
l’homme contiennent un élément de réponse aux PPAR (un PPRE) [Tobin et al. 2000;
Laffitte et al. 2001a]. Ainsi, l’activation de PPARα ou de PPARγ dans le foie stimule
l’expression de LXRα, et non LXRβ [Tobin et al. 2000]. Il en est de même dans les
macrophages chez l’homme et la souris [Chinetti et al. 2001]. PPARγ active aussi
l’expression de LXRα dans le tissu adipeux et le rein [Juvet et al. 2003; Hammarstedt et al.
2005; Wu et al. 2004]. De plus, l’expression de LXRα est soumise à une boucle
d’autorégulation : le promoteur du gène humain LXRα contient 3 LXRE fonctionnels pouvant

63
 Introduction

être reconnus par LXRα et LXRβ [Li et al. 2002]. Ainsi, il a été montré que l’activation des
LXRs augmente l’expression de LXRα, et non de LXRβ, dans les macrophages, les
adipocytes et les hépatocytes [Whitney et al. 2001].
De plus, LXRα et LXRβ semblent activer l’expression de gènes différents. Une
analyse transcriptomique a comparé les profils d’expression génique dans le TA entre souris
KO LXRα-/- et LXRβ -/- [Steffensen et al. 2003]. Parmi les gènes régulés par les LXRs, les
auteurs ont identifié des gènes communs régulés dans la même direction, des gènes régulés
par une isoforme mais pas par l’autre, et des gènes régulés par les 2 isoformes mais dans
des sens opposés [Steffensen et al. 2003]. Ces résultats suggèrent que les LXRs sont
impliqués dans des voies de régulation communes et dans des voies spécifiques de chaque
isoforme.
L’étude des souris KO LXRα-/-, LXRβ -/- et double KO LXRα-/-β -/- permet de distinguer
les fonctions spécifiques de chaque isoforme. Quand les souris ont une alimentation
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standard, les souris LXRα-/- présentent une légère réduction de la masse grasse autour des
gonades, avec une réduction de la taille des adipocytes [Gerin et al. 2005], ainsi qu’une
altération du profil lipidique par rapport aux souris sauvages : la concentration plasmatique
du LDL-cholestérol augmente tandis que celle du HDL-cholestérol diminue et le taux de TG
dans le foie est légèrement diminué [Schuster et al. 2002]. Ces souris présentent une
tolérance au glucose similaire à celle des souris sauvages [Schuster et al. 2002]. Par contre,
quand ces souris sont sous régime hypercholestérolémique, elles présentent une
accumulation marquée de cholestérol estérifié dans le foie, et ce, dès 8 jours de régime
[Peet et al. 1998; Alberti et al. 2001]. En fait, en l’absence de LXRα, les souris perdent leur
capacité à convertir l’excès de cholestérol en acide biliaire, réaction catalysée par l’enzyme
CYP7A1 (gène cible de LXRα, uniquement chez la souris) [Peet et al. 1998]. Ces souris
présentent également des taux plasmatiques de cholestérol total et de LDL-cholestérol
augmentés, et de HDL-cholestérol diminués, ainsi qu’une augmentation des transaminases,
marqueurs d’une stéatose hépatique [Peet et al. 1998]. Les souris KO LXRβ -/- quant à elles,
sous alimentation standard, présentent une réduction de la masse grasse entourant les
gonades et une diminution des taux plasmatiques et hépatiques des TG, comme les souris
LXRα-/-, mais également une intolérance au glucose due à une altération de la sécrétion de
l’insuline [Gerin et al. 2005; Schuster et al. 2002]. Sous régime hypercholestérolémique, ces
souris conservent leur capacité à éliminer l’excès de cholestérol par conversion en acide
biliaire et ne développent donc pas de stéatose hépatique, contrairement aux souris LXRα-/-
[Gerin et al. 2005; Alberti et al. 2001]. Par ailleurs, sous régime hyperlipidique, les souris
LXRβ -/- présentent une réduction de la masse grasse par rapport aux souris sauvages
soumises aussi à ce régime [Gerin et al. 2005]. Enfin, les souris double KO LXRα-/-β -/-

64
 Introduction

présentent, sous alimentation standard, une réduction de la masse grasse entourant les
gonades et de la taille des adipocytes, des taux de TG diminués dans le foie et le sérum
(comme LXRβ -/-), ainsi que des concentrations plasmatiques de cholestérol total et de LDL-
cholestérol augmentées et de HDL-cholestérol diminuées (comme LXRα-/-) par rapport aux
souris sauvages [Gerin et al. 2005; Juvet et al. 2003; Kalaany et al. 2005]. Ces souris sont
résistantes à l’obésité sous régime hypercholestérolémique, mais pas sous régime
hyperlipidique [Gerin et al. 2005].
En résumé, si l’on essaie d’attribuer les fonctions des LXRs à chaque isoforme, de
nombreuses études s’accordent pour affirmer que la lipogenèse hépatique est stimulée
α mais pas par LXRβ
par LXRα β [Alberti et al. 2001; Quinet et al. 2006]. Ensuite, le transport
inverse du cholestérol semble impliquer les 2 isoformes [Lund et al. 2006; Quinet et al.
2006]. Même s’il a été montré que LXRα et non LXRβ, est requise pour l’induction de
l’expression de la LPL, permettant ainsi l’incorporation du cholestérol dans le foie [Zhang et
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al. 2001], il a été aussi décrit que l’activation de LXRβ chez les souris double KO
LXRα-/-ApoE-/- induit le transport inverse du cholestérol et améliore le phénotype de ces
souris en réduisant le développement de l’athérosclérose [Bradley et al. 2007]. Concernant
le métabolisme du TA, il a été décrit que LXRβ est requis dans le processus d’augmentation
de la taille des adipocytes se produisant avec l’âge ou par gavage [Gerin et al. 2005].
Cependant, le fait que l’expression de LXRα dans les adipocytes augmente sous l’action de
PPARγ et que LXRα régule l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme des AG
(FAS, FABP, CD36) suggère un rôle non négligeable de cette isoforme dans le métabolisme
du TA [Juvet et al. 2003]. Enfin, les 2 isoformes semblent être impliquées dans
l’homéostasie glucidique à différents niveaux : LXRα mais pas LXRβ est nécessaire à
l’induction de GLUT4 dans le TA [Dalen et al. 2003], tandis que LXRβ semble requis dans le
pancréas pour assurer les fonctions des cellules β et la sécrétion d’insuline [Gerin et al.
2005].

V.2.c. Etudes génétiques de LXRα

Depuis 2006, plusieurs études ont analysé l’impact de la variabilité génétique de
LXRα (NR1H3) sur divers phénotypes. Il a été décrit que le SNP rs2279238 (Ser99Ser) est
associé à une diminution de l’IMC chez 559 femmes [Dahlman et al. 2006]. Les SNPs
rs12221497 (-115G>A par rapport à l’ATG), rs3758674 (-1830T>C) et -840C>A (non
référencé) sont associés à une augmentation des concentrations plasmatiques de
cholestérol total et des TG chez 732 hommes [Robitaille et al. 2007]. Notons que les auteurs
de cette étude ont détecté une interaction entre ces SNPs et la contenance en cholestérol de
l’alimentation des individus : la consommation de cholestérol n’est pas corrélée aux taux

65
 Introduction

plasmatiques de cholestérol total et de LDL-cholestérol, sauf chez les individus porteurs de

l’allèle -115A pour lesquels les taux de cholestérol total et de LDL-cholestérol sont plus
élevés si la consommation de cholestérol est élevée [Robitaille et al. 2007]. L’impact de la
variabilité génétique du gène LXRα sur le profil lipidique a été confirmé dans une récente
GWAS réalisée sur 4763 individus : les SNPs rs2167079 (situé 10 kpb en 5’ du gène) et
rs7120118 (intron 6) sont associés à une augmentation de la concentration plasmatique de
HDL-cholestérol [Sabatti et al. 2009]. Enfin, il a été décrit qu’un haplotype de 4 SNPs
contenant l’allèle muté du rs11039149 (-6G>A) est associé à une réduction de 22% du
risque de mortalité, notamment par maladie infectieuse (-69%), chez 563 individus âgés de
plus de 85 ans [Mooijaart et al. 2007].

V.2.d. Etudes génétiques de LXRβ

Le gène NR1H2 codant LXRβ est situé dans un locus identifié par plusieurs études
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de liaison comme étant associé au risque de maladie d’Alzheimer [Blacker et al. 2003;
Kehoe et al. 1999]. C’est pourquoi, plusieurs études d’association ont analysé l’impact de
SNPs du gène LXRβ sur le risque de maladie d’Alzheimer. Le SNP rs2695121 a ainsi été
associé au risque de maladie d’Alzheimer dans un échantillon de 1327 individus apparentés
[Adighibe et al. 2006], mais cette association n’a pas été retrouvée dans une autre étude
cas-témoins comprenant 414 cas et 447 témoins [Rodriguez-Rodriguez et al. 2008a]. En fait,
deux autres études ont montré que plusieurs SNPs de LXRβ, dont le rs2695121, sont
associés au risque de maladie d’Alzheimer seulement s’ils sont combinés à d’autres SNPs
des gènes CD14 [Rodriguez-Rodriguez et al. 2008b] ou HO-1 (hème oxygénase 1) [Infante
et al. 2008]. L’association des variants génétiques avec le risque de maladie d’Alzheimer
semble donc dépendre du fond génétique des individus. Par ailleurs, le SNPs rs2695121 a
été associé à une augmentation de l’IMC et du risque d’obésité chez 559 femmes [Dahlman
et al. 2006]. Egalement dans cette étude, le SNP rs35463555 est associé à une diminution
du taux d’insuline plasmatique et à une diminution du risque d’obésité.

V.3. Les angiopoietin-like proteins

Les angiopoiétines et les angiopoietin-like proteins (ANGPTLs) constituent un

ensemble d’une dizaine de protéines partageant des similitudes structurales : une séquence
signal à l’extrémité N-terminale, un domaine « coiled-coil » et un domaine fibrinogen-like. Les
ANGPTLs se distinguent des angiopoiétines par leur incapacité à se lier au récepteur TIE2
(récepteur à tyrosine kinase ayant des domaines homologues avec l’immunoglobuline et le
facteur de croissance épithélial), récepteur impliqué dans l’angiogenèse, la maturation des

66
 Introduction

vaisseaux sanguins et l’intégrité de l’endothélium vasculaire [Davis et al. 1996; Maisonpierre

et al. 1997]. Les ANGPTLs sont des protéines sécrétées dans le sang et agissent comme
des signaux endocriniens sur leur tissu cible. Leur récepteur est encore inconnu à ce jour, et
elles sont considérées comme des ligands orphelins. En fait, la famille des ANGPTLs a été
découverte il y a 10 ans à peine [Kim et al. 1999], c’est pourquoi leurs fonctions et modes
d’action ne sont pas encore bien connus. Aujourd’hui, 7 ANGPTLs (nommées ANGPTL1 à 7)
ont été identifiées [Hato et al. 2008]. Contrairement à ce que suggère leur nom, le lien entre
ANGPTLs et angiogenèse est loin d’être évident. En revanche, de plus en plus d’études
mettent en évidence le rôle des ANGPTLs, et en particulier d’ANGPTL-3, -4 et -6 dans la
régulation du métabolisme énergétique.

V.3.a. ANGPTL3
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1) Expression
L’expression d’ANGPTL3 semble être limitée au foie chez la souris comme chez
l’homme [Romeo et al. 2009; Conklin et al. 1999]. Son expression y est régulée par les
LXRs : l’administration du TO901317 augmente nettement la quantité d’ARNm d’ANGPTL3
dans le foie de souris et dans les cellules d’hépatome humain HepG2 [Inaba et al. 2003;
Kaplan et al. 2003]. En effet, ANGPTL3 est un gène cible des LXRs, et est directement
régulé par ceux-ci via un LXRE fonctionnel situé dans le promoteur d’ANGPTL3 en -150/-135
par rapport au site d’initiation de la transcription (TSS) [Kaplan et al. 2003]. Chez la souris,
l’administration du TO901317 (pendant 2 jours) entraîne une hypertriglycéridémie, effet qui
n’est pas observé chez des souris KO Angptl3-/-, malgré l’induction de nombreux gènes
impliqués dans la lipogenèse [Inaba et al. 2003]. C’est pourquoi, il semble que l’effet
hypertriglycéridémique des ligands des LXRs serait en fait médié par Angptl3. Par ailleurs, il
a été décrit que l’expression d’Angptl3 ainsi que son taux plasmatique sont augmentés dans
un modèle de souris diabétique, et que son expression diminue en réponse à un traitement à
la leptine ou à l’insuline, suggérant un rôle d’Angptl3 dans le diabète [Inaba et al. 2003;
Kaplan et al. 2003]. Enfin, l’expression d’Angptl3 est négativement et indirectement régulée
par le récepteur β à l’hormone thyroïdienne (TRβ), après son activation par l’hormone
thyroïdienne (T3) [Fugier et al. 2006]. Angptl3 pourrait être alors le médiateur de l’effet
hypotriglycéridémiant de TRβ.

2) Fonctions décrites
Le premier lien entre ANGPTL3 et le métabolisme lipidique fut établi en 2002 par
Koishi et al, qui localisa la mutation génétique des souris KK/San dans le gène Angptl3
[Koishi et al. 2002]. Cette lignée mutante de souris obèses KK présente des concentrations

67
 Introduction

plasmatiques en TG et AGL remarquablement faibles. De plus, la surexpression ou l’injection

intraveineuse d’Angptl3 entraîne une augmentation des taux plasmatiques de TG, d’AGL et
de cholestérol non seulement dans les souris KK/San mais aussi dans les souris sauvages
C57/BL6. Cette augmentation du taux de TG a été attribuée à une suppression de la
clairance des VLDL par une inhibition de la LPL (Figure 20) [Shimizugawa et al. 2002;
Ando et al. 2003]. Il semble que la région en position N-terminale (acides aminés 17-165)
contenant le domaine coiled-coil, région apparaissant après clivage protéolytique, soit
responsable de l’inhibition de la LPL [Ono et al. 2003].
L’augmentation du taux plasmatique d’AGL induite par Angptl3 est inattendue car une
inhibition de la LPL entraîne plutôt une diminution du taux d’AGL. En fait, Angptl3 stimule la
lipolyse du TA en se fixant directement aux adipocytes (Figure 20) [Shimamura et al. 2003].
Le mécanisme cellulaire qui sous-tend cette stimulation est encore inconnu mais met
certainement en œuvre un récepteur extracellulaire qui reste à identifier.
Il a également été montré que Angptl3 régule les concentrations plasmatiques de
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HDL-cholestérol en inhibant la lipase endothéliale grâce à un site potentiel de liaison à

l’héparine situé en N-terminal (Figure 20) [Shimamura et al. 2007]. Le taux d’ANGPTL3
plasmatique est en effet corrélé à celui du HDL-cholestérol chez l’homme [Shimamura et al.
2007], suggérant qu’ANGPTL3 pourrait avoir un effet athéroprotecteur. Cependant, il a été
décrit que des souris KO ApoE-/- ayant une mutation additionnelle sur le gène Angptl3 ne
présentent pas d’hypertriglycéridémie et d’athérosclérose, contrairement aux souris KO
ApoE-/-, suggérant un rôle délétère d’Angptl3 sur l’athérosclérose [Ando et al. 2003]. Le fait
que le taux d’ANGPTL3 soit corrélé à l’épaisseur des couches intima et media de l’artère
carotidienne chez des individus sains confirme cet effet délétère [Hatsuda et al. 2007].
Enfin, ANGPTL3 exerce des fonctions pro-angiogéniques en induisant la formation
de vaisseaux sanguins [Camenisch et al. 2002], et est capable d’accroître le pool de cellules
souches hématopoïétiques dans des cultures ex vivo (Figure 20) [Zhang et al. 2006a].

3) Etudes génétiques
La première étude génétique d’ANGPTL3 parut en 2004. Après avoir identifié chez la
souris un locus de susceptibilité à l’athérosclérose comprenant Angptl3, Korstanje et al ont
détecté une association entre 2 SNPs (rs1748199 et rs2366636) et la largeur des plaques
d’athérome chez des patients ayant eu un infarctus (n=229) [Korstanje et al. 2004]. De plus,
chez les témoins (n=369), ces SNPs étaient associés à une augmentation des taux de TG et
de VLDL. En 2008, les GWAS ont confirmé l’association de variants génétiques d’ANGPTL3
avec le taux de TG. Willer et al ont trouvé que le SNP rs1748195 est associé à une
augmentation du taux de TG chez 18243 individus [Willer et al. 2008]. Kathiresan et al ont
détecté une association entre une baisse du taux de TG et le SNP rs12130333 chez 8277

68
 Introduction

individus [Kathiresan et al. 2008] et le SNP rs10889353 chez 19834 individus [Kathiresan et
al. 2009]. Wang et al ont analysé l’impact du SNP rs12130333 sur le risque
d’hypertriglycéridémie sévère mais n’ont pas trouvé d’association significative [Wang et al.
2008]. Enfin, Romeo et al ont séquencé la région codante d’ANGPTL3 chez 3516 individus
et ont montré que les variants génétiques d’ANGPTL3 étaient plus nombreux chez les
individus appartenant au quartile le plus bas du taux plasmatique de TG, ainsi que chez les
individus appartenant au quartile le plus bas de la glycémie [Romeo et al. 2009]. Les allèles
mutés de ces variants rares associés au taux de TG semblent altérer la production ou la
sécrétion d’ANGPTL3 ou son activité inhibitrice de la LPL [Romeo et al. 2009].

V.3.b. ANGPTL4

1) Expression
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ANGPTL4 est une protéine de 50 kDa exprimée dans de nombreux tissus. Chez
l’homme, elle est exprimée majoritairement dans le foie mais aussi dans le tissu adipeux
(c’est une adipokine), le cœur, le cerveau, la thyroïde, les reins, l’intestin et le placenta [Yoon
et al. 2000; Romeo et al. 2009; Kersten et al. 2009]. L’expression d’ANGPTL4 varie en
fonction de l’état nutritionnel : en effet son expression est induite lors du jeûne – ce qui lui a
valu le nom de fasting-induced adipose factor (FIAF) [Kersten et al. 2000]. De plus,
ANGPTL4 est un gène cible des PPARs : son expression est régulée par PPARα dans le
foie, par PPARγ dans le TA – c’est pourquoi elle a aussi été nommée PPARγ angiopoietin-
related (PGAR) [Yoon et al. 2000] – et par PPARβ/δ dans le TA, le foie et les kératinocytes
[Schmuth et al. 2004; Akiyama et al. 2004]. Enfin, l’expression d’Angptl4 est fortement
induite en cas d’hypoxie, effet médié par le facteur de transcription Hif-1α (hypoxia inducible
factor 1α) [Le Jan et al. 2003; Fink et al. 2004; Ge et al. 2005].
ANGPTL4 subit un clivage protéolytique donnant naissance à une forme longue et
une forme tronquée de la protéine [Mandard et al. 2006]. Ces 2 formes peuvent être
détectées dans le plasma chez l’homme, et leur concentration présente une grande
variabilité inter-individuelle. Chez un individu donné, la concentration plasmatique
d’ANGPTL4 est assez constante et reste stable durant la journée. Cependant, elle augmente
significativement après un long jeûne, une restriction calorique sévère ou un exercice
physique d’endurance [Kersten et al. 2009].

2) Fonctions décrites
ANGPTL3 et ANGPTL4 partagent une identité de séquence, et ont ainsi des
fonctions communes. Comme Angptl3, l’injection de la protéine Angptl4 ou sa surexpression

69
 Introduction

chez la souris provoque une augmentation du taux plasmatique de TG (plus importante que
celle due à ANGPTL3) [Yoshida et al. 2002; Ge et al. 2005]. ANGPTL4 inhibe l’activité de
la LPL et réduit ainsi la clairance des VLDL (Figure 21) [Yoshida et al. 2002]. Plusieurs
modèles de souris transgéniques surexprimant Angptl4 dans le cœur ou le foie, ou de souris
KO Angptl4-/-, ont confirmé cet effet inhibiteur sur la clairance des TG plasmatiques via la
LPL [Koster et al. 2005; Yu et al. 2005]. Comme pour ANGPTL3, le domaine coiled-coil joue
un rôle dans l’inhibition de la LPL car il convertit les dimères de LPL fixés aux cellules
endothéliales en monomères circulant inactifs [Ge et al. 2004; Sukonina et al. 2006].
L’injection intraveineuse d’un anticorps neutralisant Angptl4 diminue la concentration
plasmatique de TG dans différents modèles de souris obèses ou hypertriglycéridémiques,
suggérant que Angptl4 pourrait être utilisée comme cible thérapeutique contre
l’hypertriglycéridémie [Desai et al. 2007].
Comme Angptl3, Angptl4 induit la lipolyse du TA (Figure 21) [Yoshida et al. 2002].
De plus, des souris transgéniques surexprimant modérément Angptl4 dans certains tissus
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(TA, muscle squelettique, cœur) présentent une réduction de l’adiposité (diminution de leur
poids, de la masse de TA blanc et de la taille des adipocytes) [Mandard et al. 2006]. En fait,
sa surexpression dans le TA est associée à une augmentation de la lipolyse due à l’induction
de l’expression de l’ATGL, ainsi qu’à une augmentation de l’oxydation des AG et une
diminution de la synthèse des TG, suggérant que Angptl4 favorise l’utilisation des AG et
empêche le stockage des TG.
Il a également été décrit chez ces souris une augmentation des taux plasmatiques
de cholestérol total et de HDL-cholestérol [Mandard et al. 2006]. En fait, Angptl4 se fixe aux
lipoprotéines HDL et LDL chez la souris, et aux HDL chez l’homme. Angptl4 influence aussi
le métabolisme du cholestérol au niveau du foie en inhibant la LPL et la lipase hépatique,
empêchant ainsi l’incorporation du cholestérol dans le foie et entraînant une augmentation
de la synthèse de cholestérol hépatique (Figure 21) [Lichtenstein et al. 2007].
Angptl4 exerce également un rôle dans l’absorption intestinale des TG en
interaction avec la flore intestinale (microbiote) (Figure 21). Les souris axéniques (sans
germes) sont résistantes à l’obésité induite par un régime hypercalorique [Backhed et al.
2004]. L’introduction du microbiote chez ces souris entraîne une augmentation de la masse
grasse et de l’insulinorésistance. Seulement, Backhed et al ont observé que ces effets ne
pouvaient avoir lieu qu’en l’absence d’Angptl4 [Backhed et al. 2004]. En effet, la suppression
de l’expression d’Angptl4 dans l’épithélium intestinal (par le microbiote ou par une stratégie
de ciblage de gène) induit une augmentation de l’activité de la LPL et subséquemment une
augmentation des dépôts de TG dans les adipocytes et une obésité [Backhed et al. 2004].
En accord avec ces observations, des souris axéniques KO Angptl4-/- perdent leur capacité
de résistance à l’obésité, suggérant qu’Angptl4 exerce un rôle essentiel dans la résistance à

70
 Introduction

l’obésité chez les souris axéniques [Backhed et al. 2007]. Notons que chez les souris
élevées de manière conventionnelle (avec microbiote), l’action d’Angptl4 dans l’intestin est
inhibée par la flore intestinale [Backhed et al. 2004].
Outre son rôle dans le métabolisme lipidique, ANGPTL4 serait impliqué dans la
régulation du métabolisme glucidique (Figure 21). Sa surexpression par adénovirus
entraîne une importante chute de la glycémie et améliore la tolérance au glucose chez les
souris db/db et C57/BL6 [Xu et al. 2005]. Cependant, la délétion du gène Angptl4 chez les
souris 129B6F2 ainsi que la surexpression de la protéine ANGPTL4 humaine dans le foie de
ces souris n’ont aucun effet sur la glycémie [Koster et al. 2005]. Enfin, l’administration d’un
régime hyperlipidique chez les souris FVB (connues pour être résistantes à l’obésité induite
par un régime hyperlipidique) surexprimant modérément Angptl4 dans des tissus
périphériques entraîne une intolérance au glucose [Mandard et al. 2006]. Les différents
fonds génétiques de ces souris pourraient expliquer les différences observées.
L’identification des récepteurs et des mécanismes cellulaires impliqués dans la signalisation
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d’Angptl4 devrait aider à comprendre ces effets.

Une récente analyse protéomique comparant le profil d’expression global des
protéines du foie entre souris db/db traitées ou non avec Angptl4 et souris minces, a révélé
que l’administration à long terme d’Angptl4 chez les souris diabétiques rétablit le profil global
des protéines au même niveau que les souris minces [Wang et al. 2007b]. Les auteurs
proposent un effet d’Angptl4 sur les fonctions mitochondriales, via la régulation de l’activité
des complexes II, III, et IV de la chaîne respiratoire.
Enfin, le fait qu’ANGPTL4 soit induite en cas d’hypoxie suggère un rôle dans
l’angiogenèse. Cependant, les études ayant examiné ce rôle ont présenté des résultats
contradictoires, avec tantôt un effet anti-angiogénique [Ito et al. 2003], tantôt un effet pro-
angiogénique [Le Jan et al. 2003]. Ces résultats contradictoires pourraient s’expliquer par
des effets différents de la forme longue et de la forme tronquée de la protéine. En effet, seule
la forme longue a la capacité de se fixer à la matrice extracellulaire et peut ainsi exercer un
effet anti-angiogénique [Cazes et al. 2006]. Des études fonctionnelles des deux formes
protéiques sont nécessaires afin d’éclaircir le rôle d’ANGPTL4 dans l’angiogenèse (Figure
21).

3) Etudes génétiques
Romeo et al ont réalisé la première étude génétique d’ANGPTL4 en 2007 qui
consista à séquencer des régions codantes du gène chez 3551 individus [Romeo et al.
2007]. Les auteurs ont montré qu’il existe des variants non synonymes plus fréquemment
retrouvés chez les individus appartenant au quartile du taux de TG le plus bas que chez les
individus appartenant au quartile du taux de TG le plus élevé. De plus, le polymorphisme

71
 Introduction

E40K (fréquence 0,03) est associé à une diminution du taux de TG et une augmentation du
taux de HDL-cholestérol chez 17476 individus [Romeo et al. 2007]. L’impact de ce variant
E40K sur les taux plasmatiques de TG et de HDL-cholestérol a été confirmé dans plusieurs
études indépendantes [Folsom et al. 2008; Nettleton et al. 2009; Talmud et al. 2008]. Les
allèles mutés de ces variants rares associés au taux de TG semblent altérer la production ou
la sécrétion d’ANGPTL4 ou son activité inhibitrice de la LPL [Romeo et al. 2009].
Staiger et al ont étudié l’impact de la variabilité génétique commune d’ANGPTL4 sur
les phénotypes associés au syndrome métabolique chez 629 individus à risque de DT2
[Staiger et al. 2008]. Ils ont analysé 4 SNPs (rs4076317, rs2278236, rs1044250 et
rs11672433) mais n’ont pas détecté d’association significative. Ces 4 polymorphismes ainsi
que 2 autres SNPs (rs7252574 et rs1808536) et le variant rare E40K, ont été étudiés par
Talmud et al chez 2772 hommes [Talmud et al. 2008]. Ces auteurs ont détecté des
associations entre le SNP rs1044250 (T266M) et les taux plasmatiques de TG et de HDL-
cholestérol. Cependant, ces associations ne résistent pas à l’ajustement sur le variant E40K,
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signifiant qu’elles sont biaisées par l’effet du variant E40K seul sur ces variables. Enfin, une
récente GWAS a mis en évidence une association entre le polymorphisme rs2967605
d’ANGPTL4 et la concentration plasmatique de HDL-cholestérol chez 35151 individus
[Kathiresan et al. 2009].

V.3.c. ANGPTL6

1) Expression
Chez l’homme, ANGPTL6 est exprimée abondamment dans le foie, et à un faible
niveau dans les glandes surrénales, le pancréas, la rate et l’intestin grêle [Romeo et al.
2009]. La protéine ANGPTL6 est détectable dans le sérum chez la souris et l’homme [Oike
et al. 2004]. Chez la souris, il a été détecté une forme longue, exprimée uniquement dans le
foie, et une forme tronquée, exprimée dans les autres tissus [Hato et al. 2008].

2) Fonctions décrites
Angptl6 a d’abord été nommée angiopoietin-related growth factor (AGF) par Oike et
al [Oike et al. 2003] car des souris surexprimant Angptl6 dans les kératinocytes présentent
une prolifération accrue des cellules de l’épiderme et des cellules vasculaires et une
cicatrisation rapide des plaies (Figure 22). De plus, ces souris présentent une hyper-
vascularisation de la peau. En fait, Angptl6 favorise le chimiotactisme des cellules
endothéliales vasculaires et induit la néovascularisation [Oike et al. 2004]. ANGPTL6
stimule l’adhésion, la propagation et la migration des kératinocytes, des fibroblastes et des
cellules endothéliales en se liant aux intégrines [Zhang et al. 2006b]. Dans un modèle de

72
 Introduction

souris souffrant d’ischémie du membre inférieur, l’injection intramusculaire d’un adénovirus

exprimant Angptl6 dans le membre ischémique augmente le flux sanguin et réduit la
nécessité d’amputer grâce à l’induction de l’angiogenèse et de l’artériogenèse (Figure 22)
[Urano et al. 2008]. Ces effets pourraient être médiés par l’activation de la voie NO synthase.
En 2005, Oike et al mirent en évidence le rôle d’Angptl6 dans le métabolisme
énergétique en générant des souris KO Angptl6-/- [Oike et al. 2005]. La plupart de ces souris
(80%) meurent au 13ème jour embryonnaire de graves défauts cardiovasculaires. Les souris
survivantes développent une obésité marquée, caractérisée par une augmentation de la
taille des adipocytes, des dépôts ectopiques de graisse (dans le muscle squelettique et le
foie) ainsi que des désordres métaboliques incluant une hypercholestérolémie, une
augmentation des taux plasmatiques d’AGL, une hyper-insulinémie et une intolérance au
glucose [Oike et al. 2005]. L’augmentation de l’adiposité a été attribuée à une réduction de la
dépense énergétique plus qu’à une augmentation de la prise alimentaire (Figure 22). De
plus, des souris transgéniques surexprimant Angptl6 présentent une réduction significative
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de leur masse grasse, résultant d’une dépense énergétique accrue, ainsi qu’une meilleure
sensibilité à l’insuline [Oike et al. 2005]. Ces souris résistent à l’obésité, l’insulinorésistance
et la stéatose, induites par un régime hyperlipidique. De même, l’injection intraveineuse d’un
adénovirus surexprimant Angptl6 chez des souris soumises à un régime hyperlipidique
résulte en une perte de poids et en l’amélioration de la sensibilité à l’insuline [Oike et al.
2005].
En outre, il a été montré qu’Angptl6 inhibe la production de glucose dans des
hépatocytes de rat en empêchant l’expression de la glucose-6-phosphatase (enzyme clé de
la gluconéogenèse) (Figure 22) [Kitazawa et al. 2007]. L’administration d’Angptl6 à des
souris obèses (par gavage) engendrerait une augmentation de l’activité de la kinase activée
par l’AMP et une activation de la voie de signalisation de l’insuline [Hato et al. 2008]. De
plus, l’ajout d’insuline dans des myoblastes de souris pré-traités avec Angptl6 renforcerait la
signalisation de l’insuline en augmentant la phosphorylation de l’IRS-1, l’activité de la PI3-K
et la captation du glucose (Figure 22) [Hato et al. 2008].

3) Etudes génétiques
La seule étude génétique sur ANGPTL6 est l’étude récente de Romeo et al qui
séquença les régions codantes des gènes de plusieurs ANGPTLs chez plus de 3500
individus [Romeo et al. 2009]. Contrairement à ANGPTL3 et 4, les variants génétiques
d’ANGPTL6 ne sont pas associés au taux plasmatique de TG. En revanche, les variants
génétiques d’ANGPTL6 étaient plus nombreux chez les individus appartenant au quartile le
plus bas du taux plasmatique de cholestérol total (mais pas des taux de LDL-cholestérol ni

73
 Introduction

de HDL-cholestérol). Cette étude ne montre donc pas d’impact majeur de variants

génétiques rares d’ANGPTL6 sur les phénotypes métaboliques.

En conclusion, l’ensemble des données de la littérature concernant les LXRs et

les ANGPTLs suggèrent que ces deux familles de protéines sont impliquées dans
plusieurs voies métaboliques dont l’altération peut participer au développement du
syndrome métabolique. Les gènes codant FTO, les LXRs et les ANGPTLs constituent
alors des gènes candidats intéressants pour l’étude des facteurs de susceptibilité
génétique du syndrome métabolique et des phénotypes associés.
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74
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Matériels et Méthodes
 Matériels et Méthodes

I. Analyse de la variabilité génétique

I.1. Les polymorphismes génétiques

L’apparition d’une mutation à un locus génique donné détermine un polymorphisme

génétique, c’est à dire l’existence, dans la population, d’au moins deux formes distinctes de
ce gène nommées allèles. Le polymorphisme génétique est donc un caractère héréditaire
transmis sur le mode mendélien. Par convention, on parle de polymorphisme pour une
mutation dont la fréquence en population est d’au moins 1%, et de variant dans le cas
contraire. Les polymorphismes génétiques peuvent être des mutations ponctuelles
n’affectant qu’un seul nucléotide, des délétions ou des insertions de séquences de taille très
variable, ou des variations alléliques du nombre de répétitions d'un motif unique (des triplets
nucléotidiques par exemple). Les mutations ponctuelles, également appelées SNP (single
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nucleotide polymorphism), représentent environ 90% des variations génétiques recensées

dans le génome humain. Selon les polymorphismes, le spectre des manifestations
phénotypiques associées est très large, depuis les polymorphismes non fonctionnels sans
aucune conséquence détectable jusqu’aux polymorphismes fonctionnels pouvant entraîner
une diminution de la fonction de la protéine – souvent des polymorphismes non synonymes
(changement de l’acide aminé codé) – ou de l'expression du gène – polymorphismes le plus
souvent situés dans des régions régulatrices (promoteur, untranslating region (UTR),
introns).
Il existe des bases de données qui recensent l’ensemble des SNPs identifiés à ce
jour, telles que celle du NCBI ([Link]/SNP), de CHIP bioinformatics tools
([Link] et de HapMap ([Link]). Le choix des SNPs à étudier
repose sur :
- le niveau de validation des SNPs sur le NCBI (on estime à environ 50 % le nombre
de polymorphismes décrits résultant en réalité d’erreurs de séquençage)
- la localisation sur le gène (préférentiellement dans les régions codantes ou de
régulation de l’expression du gène)
- la fréquence du SNP ; dans nos études, nous avons pris une fréquence supérieure
à 5 %, si celle-ci était connue car une fréquence <5% engendre une puissance
statistique trop faible pour pouvoir détecter un effet significatif.
Le choix des SNPs peut également être fait à partir des données de la littérature pour un
gène déjà étudié, même si ce n’est pas dans le même contexte pathologique. Enfin, il est
possible de séquencer entièrement le gène d’intérêt afin de détecter tous les variants
génétiques présents dans un échantillon.

75
 Matériels et Méthodes

I.2. Le déséquilibre de liaison

Le déséquilibre de liaison (DL) est un concept traduisant l’indépendance ou de la

non-indépendance physique de deux loci lors de leur transmission aux gamètes, au cours de
la méiose. Considérons deux loci bi-alléliques, A et B, d'allèles respectifs (A1 fréquent, A2
rare) et (B1 fréquent, B2 rare). Appelons pA1, pA2, pB1, pB2 les fréquences alléliques. La
répartition des deux allèles sur un chromosome peut être (A1,B1), (A1,B2), (A2,B1) ou
(A2,B2). Appelons pA1B1, la fréquence à laquelle on observe, dans une population, le
chromosome porteur des allèles A1 et B1, de même pour p(A1B2), p(A2B1) et p(A2B2). Si
l'on suppose que les allèles de chaque locus sont distribués au hasard, les fréquences
théoriques des chromosomes doivent être :
pA1B1 = pA1 x pB1
pA1B2 = pA1 x pB2
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pA2B1 = pA2 x pB1

pA2B2 = pA2 x pB2.
Si les fréquences observées de ces chromosomes ne diffèrent pas significativement de ces
fréquences théoriques, les loci sont dits en équilibre de liaison. Cependant, il peut exister
une différence entre les fréquences chromosomiques observées et les fréquences à
l'équilibre. On définit alors le déséquilibre de liaison D comme la différence entre les
fréquences chromosomiques observées et les fréquences théoriques à l’équilibre.
- Si D>0, les allèles rares (ou fréquents) des deux loci sont préférentiellement
associés ensemble.
- Si D<0, l’allèle rare de l’un des loci est préférentiellement associé à l’allèle fréquent
de l’autre locus.
La valeur maximale, ou minimale de D peut être calculée à partir des fréquences alléliques
des loci A et B. Ainsi, concernant la valeur maximale de D (Dmax), qui est la plus
fréquemment utilisée, désignons par A celui des deux loci pour lequel la fréquence de l'allèle
rare est la plus faible (i.e. pA2<pB2) :
- Si D>0, Dmax = pA2 (1 – pB2) = pA2 pB1
- Si D<0, Dmax = pA2 (1 – pB1) = pA2 pB2
Le DL est plus communément exprimé sous la forme de deux coefficients :
(i) le coefficient D’ de Lewontin (1964), qui est égal au rapport D/Dmax. D’ est
compris entre -1 et +1. Plus la valeur absolue de ce rapport est proche de 1, plus
le DL est fort ; la valeur absolue 1 correspond à un déséquilibre complet,
(ii) le coefficient de corrélation entre les allèles, r² , qui est égal au rapport (D)²/(pA1 x
pA2 x pB1 x pB2). La valeur 1 correspond ici à un déséquilibre parfait, signifiant

76
 Matériels et Méthodes

non seulement que D’=1, mais aussi que les fréquences alléliques des deux loci
sont strictement égales.
Dans le cas où r²=1 entre 2 SNPs, l’information recueillie à partir de l'étude d'un des deux
polymorphismes est strictement identique à celle qui serait fournie par l'étude du
polymorphisme avec lequel il est en DL parfait. Dans nos études, nous avons considéré que
le DL était parfait si r²>0,80.

Le DL diminue au cours des générations successives à cause des recombinaisons

génétiques (crossing-over), d’autant plus lentement que les deux loci sont très proches sur le
même chromosome : la force du DL exprime, sous certaines conditions, la proximité
physique des deux loci.

I.3. Notion d’haplotype

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Un haplotype est une combinaison allélique d’au moins deux polymorphismes

retrouvée sur un même chromosome. En fait, les fréquences haplotypiques ne peuvent être
mesurées, au sens strict du terme, que dans le cadre d’études familiales. Néanmoins, des
modèles statistiques de maximum de vraisemblance permettent d’estimer les fréquences
haplotypiques dans des populations d’individus non apparentés, à partir des fréquences
génotypiques mesurées [Furihata et al. 2006; Tregouet et al. 2004]. Il est alors possible
d’évaluer l’impact, non plus d’un polymorphisme mais d’une combinaison particulière de
polymorphismes sur un phénotype donné.
Lorsque ces polymorphismes présentent un DL, la transmission des séquences
nucléotidiques constitutives d’un chromosome se fait en réalité par bloc haplotypique. Au
sein d’un même bloc, la probabilité de recombinaison est très faible. En effet, ces haplotypes
sont généralement séparés par des régions de faible DL représentant des hot spots (points
chauds) de recombinaison méiotique. Chaque bloc haplotypique, de taille variable, est défini
par la combinaison de plusieurs polymorphismes, et il peut contenir un nombre variable de
gènes sur le même chromosome. Si un bloc haplotypique contient 5 SNPs et que ce bloc est
associé à un phénotype, le SNP d'intérêt est potentiellement n’importe lequel de ces 5 SNPs.

I.4. Les Tag-SNPs

L’identification des blocs haplotypiques présente un intérêt certain. Du fait de la

corrélation qui existe entre les polymorphismes d’un même bloc, une redondance allélique
est présente au sein de chaque bloc. Il est alors possible de sélectionner le (ou les) SNP(s)
le(s) plus informatif(s), appelés tag-SNP(s), c’est à dire représentant le mieux l’information

77
 Matériels et Méthodes

portée par le bloc haplotypique. Un choix judicieux des tag-SNPs permet ainsi de réduire le
nombre de polymorphismes à étudier sans pour autant perdre de l’information génétique,
réduisant ainsi les coûts de génotypage. Il a été entrepris de caractériser les blocs
haplotypiques composant le génome humain dans le but de définir au mieux l’information
génétique du génome. Des cartes de SNPs de haute résolution doivent alors être établies
par l’analyse de plusieurs milliers de SNPs. Le consortium international HapMap a pour but
de caractériser au mieux les profils de variation génétique et les blocs haplotypiques du
génome humain. Pour cela, plusieurs milliers de SNPs ont été génotypés par séquençage de
30 trios (deux parents et un enfant) d’origine européenne, de 30 trios d’origine africaine, et
de 90 individus asiatiques non apparentés. La fréquence des variations nucléotidiques ainsi
que les valeurs de DL ont ensuite été calculées dans les différentes populations. Ce travail a
également permis au consortium HapMap de déterminer qu’un échantillon de 45 individus
est suffisant pour détecter 99% des haplotypes ayant une fréquence supérieure à 5% dans
la population [2003]. Suite à l’analyse des blocs haplotypiques mis en évidence par le projet
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HapMap, on estime à 300 000 le nombre de tag-SNPs nécessaires pour couvrir les régions
génomiques présentant un fort DL (r² > 0,8), et à 500 000 le nombre de SNPs
supplémentaires pour couvrir les régions de plus faible DL [Wang et al. 2005]. Une
couverture optimale du génome entier nécessiterait donc au moins 800 000 SNPs.

78
 Matériels et Méthodes

II. Génotypage

II.1. Restriction fragment length polymorphism

La technique de génotypage par RFLP, que j’ai le plus souvent utilisée, est basée sur
la différence de taille de fragments générés après digestion par une enzyme de restriction.
La première étape consiste en l’amplification par PCR (polymerase chain reaction) de la
région d’ADN encadrant le SNP à partir de l’ADN génomique grâce à des amorces
spécifiques. Pour chaque SNP, on choisit une enzyme de restriction qui permet de
discriminer les allèles. Pour éviter les erreurs de génotypage dues à une digestion
incomplète, l’enzyme a été ajoutée en excès et, si possible, a été choisie pour couper l’allèle
fréquent du SNP ainsi qu’un autre site indépendant du SNP (Figure 23). Si le SNP ne
modifie pas de site de restriction naturellement, il est possible de forcer l’existence d’un site
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de restriction en élaborant des amorces dégénérées (Figure 23). Les produits de digestion
sont déposés sur gel d’agarose ou d’acrylamide (selon la taille des fragments) et soumis à
électrophorèse. Les fragments d’ADN sont révélés par du BET (bromure d’éthidium) et
observés sous lampe UV.

II.2. Technologie TaqMan

Certains SNPs étudiés au cours de mes travaux ont également été génotypés par
TaqMan. Cette technique consiste en l’amplification de la région chromosomique d’intérêt et
en l’hybridation simultanée de sondes spécifiques de chaque allèle. Ces sondes sont
marquées avec le fluorophore VIC® pour l’allèle 1 et avec FAM™ pour l’allèle 2. Pendant
l’amplification, le signal spécifique de chaque allèle est fluorescent uniquement si les sondes
sont hybridées à leur séquence complémentaire (Figure 24). Ainsi, le signal fluorescent
indique quel allèle est présent dans l’échantillon.

II.3. Technologie Golden Gate

Les individus de l’étude HELENA ont été génotypés par la technologie Illumina
GoldenGate par la société Integragen (Evry, France). C’est une technique à haut débit car
jusqu’à 1500 SNPs environ peuvent être génotypés simultanément. Dans cette technologie,
l’hybridation des sondes spécifiques de chaque allèle se fait avant l’amplification par PCR
(Figure 25).

79
 Matériels et Méthodes

III. Populations étudiées

III.1. L’étude MONICA

Les individus ont été recrutés dans le cadre de l’enquête de population MONICA
(Multinational mONItoring of trends and determinants of CArdiovascular diseases) entre
1995 et 1997 dans 3 régions de France : la Communauté Urbaine de Lille (n=1195), le
département du Bas-Rhin (Strasbourg, n=1131) et celui de la Haute-Garonne (Toulouse,
n=1182). Notre laboratoire était responsable du recrutement de l’échantillon MONICA Lille.
Ces 3 échantillons sont représentatifs de la population générale âgée de 35 à 64 ans et les
individus ont été sélectionnés par tirage au sort à partir des listes électorales de manière à
obtenir 200 individus de chaque genre par tranche d’âge de 10 ans (35-44, 45-54, 55-64
ans) [1994]. Le protocole a été approuvé par le comité d’éthique de chaque centre.
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Après consentement éclairé, les individus ont répondu à un questionnaire

concernant, entre autres, le niveau socio-économique, l’activité physique, la consommation
d’alcool et de tabac, les antécédents médicaux et familiaux, les traitements médicamenteux.
L’activité physique a été définie par un minimum de 15 minutes de marche par jour ou par le
port d’objets lourds au quotidien ou par la pratique d’un sport au moins 2 heures par
semaine. Le statut de fumeur a été défini par un minimum d’une cigarette fumée par jour. La
consommation d’alcool (vin, bière, cidre et apéritifs) a été calculée en ml d’alcool pur par
semaine.
Des mesures anthropométriques, telles que le poids et le tour de taille (au milieu de
la dernière côte et de la crête iliaque), ont été prises sur les individus en habits légers et
sans chaussures. L’IMC a été calculé selon l’équation de Quetelet (poids (kg)/taille (m)²). Les
individus ayant un IMC ≥ 30kg/m² sont considérés obèses, ceux ayant un IMC entre 25-30
kg/m² sont en surpoids. La tension artérielle a été mesurée à l’aide d’un sphygmomanomètre
standard à mercure, sur le bras droit de l’individu en position assise et après 5 minutes de
repos. La moyenne de 2 mesures consécutives a été calculée.
Une prise de sang a été réalisée sur chaque individu afin de mesurer les constantes
biologiques et d’en extraire l’ADN. Un total de 3402 échantillons d’ADN est disponible. Un
échantillon de 20mL de sang a été prélevé chez les individus après un jeûne d’au moins 10
heures dans des tubes disodium EDTA. Les concentrations plasmatiques des lipides et
lipoprotéines (TG, cholestérol total, HDL-cholestérol, LDL-cholestérol, VLDL, ApoA1 et
ApoB), du glucose et de l’insuline ont été mesurées au laboratoire de biochimie de l’hôpital
Purpan à Toulouse [Dallongeville et al. 2005b]. L’insulinorésistance a été évaluée par le
HOMA-IR [Matthews et al. 1985]. Les individus diabétiques ont été identifiés par une

80
 Matériels et Méthodes

glycémie à jeun ≥ 7,0 mmol/L ou la prise d’un traitement anti-diabétique [1997]. Les
caractéristiques des individus des 3 échantillons MONICA Lille, Toulouse et Strasbourg sont
présentées dans le Tableau 12.

III.2. L’étude MONEUR

III.2.a. Le projet EUROASPIRE

Dans le cadre du projet européen EUROASPIRE (EUROpean Action on Secondary
Prevention and Intervention to Reduce Event), notre laboratoire a participé à la constitution
de 3 séries indépendantes de cas de patients coronariens, successivement en 1994-1995,
1999-2000 et 2006-2007. Ce projet, coordonné par la Société Européenne de Cardiologie,
visait à estimer la prévalence et le niveau de prise en charge des facteurs de risque cardio-
vasculaires en prévention secondaire, chez des patients coronariens, au moins 6 mois après
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la survenue d'un épisode aigu de coronaropathie ayant nécessité une hospitalisation.

Les échantillons de population EUROASPIRE I et EUROASPIRE II, composés
respectivement de 546 individus (âgés de 25 à 75 ans) et 548 individus (âgés de 34 à 73
ans) ont été recrutés dans les unités cardiologiques de la métropole lilloise (Hôpital
Cardiologique du CH et U de Lille, Hôpital Saint Philibert de Lomme et Centre Hospitalier
Général de Roubaix). Chaque échantillon est composé de quatre groupes contrastés sur le
plan des manifestations aiguës : (1) individus ayant subi un pontage coronaire, (2) individus
ayant subi une angioplastie coronaire, (3) individus ayant présenté un infarctus du myocarde
ou (4) individus ayant présenté une ischémie myocardique aiguë (angor instable). Pour les
individus des groupes 1 et 2, la notion d'intervention en urgence est disponible ainsi que,
pour tous les individus, la notion d'antécédent d’infarctus du myocarde. Outre l'information
sur la maladie, l'IMC et des données sur la prévalence de facteurs de risques
environnementaux (consommation de tabac, consommation d'alcool, prévalence de
l'hypertension artérielle, de l'hypercholestérolémie, de diabète…) ont été mesurés ou
recueillis. Enfin, l’extraction de l’ADN a pu être réalisée pour 380 individus participant à
l'étude EUROASPIRE I, et pour 352 individus recrutés dans le cadre de l'enquête
EUROASPIRE II.

III.2.b. L’étude MONEUR

A partir des individus des études EUROASPIRE I et II, a été constitué, par tirage au
sort, un échantillon de 585 individus ayant présenté une coronaropathie aiguë (cas). Un
échantillon aléatoire composé de 585 individus indemnes de maladie coronaire et participant
à l’étude MONICA France a été constitué (témoins). Cet échantillon a été apparié sur le sexe

81
 Matériels et Méthodes

et la classe d’âge à l'échantillon de cas de coronaropathies. Parmi les 585 individus

coronariens, 350 ont eu un infarctus du myocarde récent ou ont un antécédent personnel
d’infarctus du myocarde. Le Tableau 13 résume l'essentiel des caractéristiques
phénotypiques des individus de cette étude cas-témoins reconstituée.

III.3. L’étude HELENA

L’avantage de réaliser des études d’association chez les enfants ou les adolescents
réside en le fait que les biais environnementaux sont plus restreints que chez les adultes,
notamment les biais induits par la consommation de tabac, d’alcool, la prise de médicaments
et la présence de maladies chroniques. En accord avec ceci, l’héritabilité génétique de l’IMC
et du tour de taille semble plus élevée chez les enfants (77% [Wardle et al. 2008]) que chez
les adultes (25-60% selon les études [Teran-Garcia et al. 2007]). De plus, il a été montré que
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l’effet des facteurs environnementaux était limité (15%) chez les enfants [Wardle et al. 2008].
L’impact de polymorphismes génétiques sur les phénotypes métaboliques semble alors plus
facilement détectable chez les sujets jeunes.
Les participants de cette étude ont été recrutés dans le cadre du projet HELENA
(HEalthy Lifestyle in Europe by Nutrition in Adolescence, [Link]
réalisée en 2006-2007 dans 10 centres de 9 pays européens (Athènes et Héraklion en
Grèce, Dortmund en Allemagne, Gand en Belgique, Lille, Pècs en Hongrie, Rome en Italie,
Västeras en Suède, Vienne en Autriche et Zaragoza en Espagne) [Moreno et al. 2008b]. Le
protocole fut approuvé par le comité d’éthique de chaque centre. Un consentement éclairé et
écrit fut obtenu de la part de chaque adolescent et de ses parents ou de ses représentants
légaux [Beghin et al. 2008]. La participation à cette étude était sur la base du volontariat.
L’échantillon inclut 3865 adolescents (14,8 ± 1,4 ans, de 12 à 18 ans) recrutés dans leurs
écoles, ces dernières étant sélectionnées au hasard selon une méthodologie
d’échantillonnage proportionnel prenant en compte la répartition géographique au sein de
chaque ville, le ratio écoles privées/publiques, et le nombre de classes par école [Moreno et
al. 2008a]. Dans chaque centre, des mesures anthropométriques, telles que le poids, la
taille, le tour de taille, le tour de hanches et 6 plis cutanés ont été recueillies par un médecin
expérimenté sur les individus pieds nus et en sous-vêtements. Les tours de taille et de
hanches ont été mesurés 3 fois consécutives avec un mètre non élastique (Seca 200). L’IMC
a été calculé. Un adolescent est considéré obèse si son IMC est supérieur à la valeur définie
par Cole et al [Cole et al. 2000] correspondant à un IMC ≥ 30 kg/m2 à l’âge de 18 ans. De
même, un adolescent est considéré en surpoids si son IMC correspond à un IMC compris
entre 25 et 30 kg/m2 à l’âge de 18 ans. Le pourcentage de masse grasse a été estimé à
partir des mesures des plis cutanés, selon l’équation de Slaughter et al [Slaughter et al.

82
 Matériels et Méthodes

1988]. L’activité physique a été mesurée pendant une semaine grâce à un accéléromètre
(Actigraph MTI, model GT1M, Manufacturing technology Inc., Fort Walton Beach, FL, USA)
[Hagstromer et al. 2008].
Dans le but d’étudier les constantes biologiques et de réaliser des analyses
génétiques, un tiers des classes ont été sélectionnées au hasard pour recueillir des
échantillons de sang (n=1155). Ces prélèvements ont été effectués à l’école selon un
protocole standard de recueil, après une nuit de jeûne, et ont ensuite été centralisés au
laboratoire d’analyses de l’université de Bonn ([IEL], Allemagne) pour les dosages
biochimiques [Gonzalez-Gross et al. 2008]. Les concentrations plasmatiques de TG, HDL-
cholestérol, LDL-cholestérol, de glucose et d’insuline ont été mesurées par méthode
enzymatique (Dimension RxL clinical chemistry system, Dade Behring, Schwalbach,
Allemagne). Les concentrations plasmatiques en ApoA1 et ApoB ont été mesurées par
réaction immunologique (BN II analyser, Dade Behring, Schwalbach, Allemagne). Les
échantillons sanguins destinés à l’extraction d’ADN ont été collectés dans des tubes EDTA
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K3 et envoyés au Laboratoire d’Analyse Génomique à l’Institut Pasteur de Lille. L’ADN a été

extrait des globules blancs avec le kit Puregene (QIAGEN, Courtaboeuf, France) et
conservés à -20°C. Les caractéristiques des adolesc ents de l’étude HELENA sont
présentées dans le Tableau 14.

III.4. L’étude cas-témoins pour le DT2 nichée dans HUNT 2

Grâce à une collaboration avec le Dr Karianne Solaas du Département de Nutrition

(Faculté de Médicine, Université d’Oslo, Norvège) dirigé par le Pr Hilde Nebb, nous avons eu
accès à l’étude cas-témoins pour le DT2 de l’échantillon HUNT 2. Les participants de l’étude
HUNT 2 (HelseUndersøkelsen Nord-Trøndelag, [Link]/hunt) (n=65905) ont été
recrutés entre 1995 et 1997 dans la région Nord-Trøndelag (Norvège) et constituent un
échantillon représentatif de la population norvégienne rurale [Holmen et al. 1990]. Cette
population est stable au niveau géographique et ethnique depuis plusieurs générations
(seulement 3% des individus ne sont pas d’origine caucasienne). Tous les individus de 20
ans et plus avaient été invités à participer à cette étude et le taux de participation a été de
71%. Les participants ont répondu à un questionnaire concernant, entre autres, les
traitements médicamenteux, leur hygiène de vie, la consommation d’alcool et de tabac, et
ont eu un examen clinique au cours duquel des mesures anthropométriques (poids, taille,
tours de taille et de hanches) ont été recueillies. L’IMC et le RTH ont été calculés. La tension
artérielle a été mesurée à 3 reprises sur les individus en position assise et la moyenne des 2
dernières mesures a été calculée [Midthjell et al. 1999]. Une prise de sang a été réalisée sur
chaque individu non à jeun afin de mesurer les constantes biologiques (glucose, cholestérol

83
 Matériels et Méthodes

total, HDL-cholestérol et triglycérides plasmatiques) et d’en extraire l’ADN. Ces analyses ont
été réalisées à l’hôpital de Nord-Trøndelag à l’aide d’un Hitachi 911 Autoanalyzer (Hitachi,
Mito, Japon) et des réactifs Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany). L’ADN a été
extrait par précipitation aux sels [Miller et al. 1988]. Cette étude a été approuvée par le
comité d’éthique régional norvégien de la recherche médicale, le centre norvégien des
données sociales et la direction norvégienne pour la santé et les affaires sociales.
Afin de constituer une étude cas-témoins pour le DT2, ont été sélectionnés 1040
individus (cas) parmi les 1972 individus ayant déclaré être diabétique (n=942), auxquels ont
été ajoutés 98 autres individus qui présentaient une glycémie non à jeun ≥ 11,1 mmol/L, et
2080 individus ayant une glycémie non à jeun ≤ 5,5 mmol/L (témoins), appariés sur l’âge et
le genre des cas (2 témoins par cas). Les individus ayant commencé un traitement à
l’insuline dès la première année suivant le diagnostic de leur diabète ou ayant un taux
plasmatique d’anticorps anti-GAD (décarboxylase de l’acide glutamique) ≥ 0,08 U/L ont été
considérés comme présentant un diabète de type 1 et ont été exclus de la présente étude
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

(n=171). Les caractéristiques des individus de cette étude cas-témoins nichée sont
présentées dans le Tableau 15.

84
 Matériels et Méthodes

IV. Analyses statistiques

IV.1. L’équilibre d’Hardy Weinberg

Lors des études d’association, pour chaque polymorphisme testé, il est nécessaire de
vérifier que celui-ci respecte l’équilibre d’Hardy-Weinberg dans la population étudiée. La loi
de l’équilibre d’Hardy-Weinberg stipule que, dans une très grande population dans laquelle
les mariages entre individus se font au hasard (panmixie), et qui ne connaît ni migration, ni
sélection naturelle, les fréquences alléliques et génotypiques restent stables au fil des
générations. Dans cette hypothèse, la loi d’Hardy-Weinberg permet de calculer les
fréquences alléliques à partir de la mesure des fréquences génotypiques et inversement.
Selon cette loi, si A1 et A2 sont les allèles d’un locus autosomique bi-allélique, de fréquence
respective p et q (avec q=1-p), les fréquences des trois génotypes possibles A1A1, A1A2 et
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

A2A2, sont respectivement p², 2pq et q². Une population dans laquelle la distribution
génotypique observée est statistiquement compatible avec cette distribution théorique est
dite en équilibre d’Hardy-Weinberg pour le locus considéré.
Pour vérifier qu’un polymorphisme respecte l’équilibre d’Hardy-Weinberg dans la
population témoin, on utilise un test du χ² à 1 degré de liberté (ddl) qui permet de calculer
l’écart entre les fréquences observées et les fréquences théoriques respectives des
différents génotypes. Si cet écart est significatif, la distribution du polymorphisme dans la
population n’est pas en équilibre d’Hardy-Weinberg. La raison la plus fréquente d’une
déviation de l’équilibre d’Hardy Weinberg correspond à des erreurs de génotypage. Il peut
également s’agir d’un biais de sélection de la population étudiée. En effet, la distribution d’un
polymorphisme potentiellement impliqué dans des maladies modifiant la survie d’un individu
peut ne pas respecter l’équilibre d’Hardy-Weinberg dans les populations les plus âgées.

IV.2. Analyses statistiques utilisées dans les études d’association

Les études d'association réalisées dans des échantillons de population composés

d’individus non apparentés consistent à évaluer des associations statistiques entre les
génotypes d’un SNP et un phénotype donné en comparant les fréquences des génotypes
entre un échantillon d’individus présentant le phénotype étudié (par exemple, une maladie)
et un échantillon d’individus ne présentant pas le phénotype. Ce type d’analyse se formalise,
le plus souvent, sous la forme d’un tableau croisé 2x3. Un test du χ2 permet de tester la
différence entre les effectifs génotypiques observés dans les deux groupes et ceux attendus
sous l’hypothèse d’une indépendance entre la maladie et le polymorphisme étudié. La sur-

85
 Matériels et Méthodes

représentation statistiquement significative d’un génotype particulier dans l'un des deux
groupes comparés suggère l'association de cet allèle avec la maladie. La force de
l’association est alors estimée par le calcul de l'odds ratio (OR) défini comme le rapport entre
la proportion d’individus porteurs de l’allèle mineur chez les cas et la proportion d’individus
porteurs de l’allèle mineur chez les témoins. Les calculs d’OR sont réalisés par un modèle de
régression logistique ajusté sur les facteurs de risque conventionnels de la maladie. Cet OR
illustre l’augmentation (si OR>1) ou la diminution (si OR<1) du risque de survenue de la
maladie chez les individus porteurs de l’allèle mineur par rapport aux individus non porteurs.
Les études d’association consistent également en la comparaison de la moyenne
d’un phénotype (par exemple, le dosage d'une constante biologique ou un paramètre
anthropométrique) entre les individus présentant les différents génotypes. Pour cela,
l'approche statistique la plus fréquente est celle d'une analyse de variance (ANOVA)
comparant les moyennes du phénotype étudié entre groupes de génotypes ou d’une analyse
de covariance (ANCOVA) si l’analyse est ajustée sur les facteurs de confusion.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

En général, ces tests sont considérés comme statistiquement significatifs lorsque la

valeur de p calculée est ≤ 0,05. Cette valeur correspond à un risque α, ou risque de première
espèce, de 5% qui représente la probabilité de conclure à tort à une association. Notons qu’il
existe aussi un risque β, ou risque de deuxième espèce, qui représente la probabilité
d’exclure à tort une association. Aujourd’hui, avec la multiplication des études d’association
comportant un très grand nombre de SNPs, une correction pour tests multiples est souvent
requise. En effet, le fait d’augmenter le nombre de SNPs étudiés augmente le nombre de
tests effectués et ainsi la probabilité de mettre en évidence un résultat significatif par hasard.
Concrètement, si on effectue 100 tests indépendants avec un seuil de significativité à 0,05,
statistiquement 5 tests apparaîtront comme significatifs par le seul fait du hasard (faux
positifs). Une correction pour tests multiples consiste alors à modifier (ou corriger) le seuil de
significativité pour considérer l’association comme significative. La correction pour test
multiple la plus souvent utilisée est celle de Bonferroni qui consiste à diviser le seuil de
significativité généralement admis à 0,05 par le nombre de tests effectués [Bland et al.
1995]. Bien que cette correction soit connue pour être trop stricte et souvent inadaptée aux
études de polymorphismes génétiques [Rice et al. 2008] (une correction trop stricte peut en
effet entraîner le risque de rejeter une association alors qu’elle est réelle), elle est malgré
tout souvent employée. La méthode de correction de Benjamini et Hochberg dite de FDR
(false discovery rate) [Fernando et al. 2004] est également souvent utilisée dans les études
d’association. Au lieu de contrôler le risque d’apparition de faux positifs dus au hasard
(comme dans la correction de Bonferroni), cette correction contrôle la proportion de faux
positifs à chaque seuil. Un seuil de FDR est déterminé par la distribution des valeurs de p
observées. Cette correction est alors plus sensible et moins stricte que celle de Bonferroni.

86
 Matériels et Méthodes

IV.3. Facteurs de confusion et interactions

Dans une étude d'association, la relation statistique observée entre un

polymorphisme et un phénotype peut, en réalité, être en tout ou partie, expliquée par un
facteur confondant (consommation de tabac, hypertension…). Pour être potentiellement
confondante, une variable doit être associée à l’exposition (mutation par exemple), être
associée à la maladie indépendamment de l’exposition et, donc, ne pas être un relais (étape
intermédiaire) dans le processus physiopathologique entre l’exposition et la maladie. Les
analyses stratifiées constituent une méthode permettant de contrôler la confusion, en
évaluant l’association entre le facteur d'exposition et la maladie dans les catégories ou
classes de la variable potentiellement confondante. Malheureusement, en posant rapidement
le problème de la puissance statistique, l’analyse stratifiée n’est pas une méthode pratique
pour contrôler simultanément plusieurs facteurs confondants. Une solution alternative
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

consiste à recourir à l’analyse multivariée.

L’interaction, ou modification d’effet, qui se distingue de la confusion, constitue une
information très intéressante. Certains facteurs de risque génétiques peuvent n’avoir d’effets
que dans des contextes physiologiques (âge, sexe…), environnementaux (consommation de
tabac, consommation d'alcool…) ou pathologiques (hypertension artérielle, dyslipidémies…)
qu'il est intéressant de caractériser par des recherches d'interactions statistiques. Ces
analyses d’interaction permettent, ainsi, d’identifier des sous-groupes à plus haut risque,
avec des implications potentielles en terme de santé publique.
Le terme d’interaction est souvent source d’ambiguïté, l’interaction statistique se
différenciant de l’interaction biologique, ou causale [Clayton et al. 2001]. En terme
statistique, il existe une interaction gène-environnement (ou gène-gène) lorsque l’effet de la
mutation sur la maladie dépend de l’exposition à un facteur environnemental (ou de la
présence d'une autre mutation génétique). Autrement dit, le taux d’incidence de la pathologie
en présence des deux facteurs (gène/environnement ou gène/gène) diffère du taux
d’incidence attendu résultant de leur effet individuel (Figure 26). Lorsque l’effet est supérieur
à celui attendu, on parle d’interaction positive ou synergique tandis que lorsqu’il est plus
faible on parle d’interaction négative ou antagoniste. Ce concept statistique de l’interaction a
été critiqué parce qu’il est arbitraire, modèle-dépendant, et ne tient pas compte de la notion
d’interaction biologique [Greenland 1993]. L’interaction au sens biologique suppose la
participation coordonnée de deux facteurs de risque dans un mécanisme étiologique
commun, responsable du développement de la maladie [Rothman et al. 1980]. En
épidémiologie génétique, l’interprétation de l’existence d’une interaction s'appuie, le plus
souvent, sur des considérations statistiques mais la validité du modèle doit idéalement
reposer sur des connaissances biologiques [Clayton et al. 2001]. Ceci est d’autant plus

87
 Matériels et Méthodes

complexe que le même modèle statistique traduisant un risque de maladie peut refléter
simultanément plusieurs mécanismes biologiques plus ou moins distincts. Enfin, l’une des
limites à la recherche d’interaction réside à nouveau dans la puissance statistique
nécessaire pour les détecter.
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88
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Résultats
 Résultats

Introduction

Mon travail de thèse a consisté en l’identification et la caractérisation de nouveaux

déterminants génétiques du syndrome métabolique. Comme les études génétiques sur le
syndrome métabolique sont rendues délicates du fait du manque de définition faisant
l’unanimité et la méconnaissance de son étiologie, je me suis intéressée au syndrome
métabolique en tant qu’entité, mais également aux phénotypes associés à ce syndrome pris
individuellement. Pour cela, j’ai employé une approche de type gène candidat et réalisé des
études d’association entre des polymorphismes génétiques (SNPs) de gènes ayant
possiblement un lien avec la physiopathologie du syndrome métabolique et les phénotypes
métaboliques dans des échantillons de population générale (adolescents et/ou adultes).
Pour chaque gène étudié, ma démarche a été la suivante :
- j’ai caractérisé la variabilité génétique commune des gènes et identifié les SNPs les
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

plus pertinents à étudier,

- j’ai réalisé les études d’association des SNPs sélectionnés dans des échantillons
de population,
- j’ai caractérisé in vitro la fonctionnalité des polymorphismes trouvés associés à un
phénotype métabolique, quand c’était possible.
Je me suis intéressée aux gènes codant FTO, LXRα et β, et les ANGPTL3, 4 et 6 car, au vu
des données de la littérature, ils sont tous impliqués dans au moins une voie métabolique
participant au développement du syndrome métabolique, et constituent ainsi des gènes
candidats pertinents.

89
 Résultats

I. Etude du gène FTO

I.1. Contexte de l’étude

Comme nous l’avons déjà vu dans le chapitre V.1. de l’Introduction (pages 56-57), en
2007, deux GWAS indépendantes identifièrent un nouveau gène, FTO, pour fat mass and
obesity-associated, présentant des polymorphismes très significativement associés au risque
de DT2 [Scott et al. 2007; 2007b]. En effet, l’allèle A du SNP rs9939609 (MAF 0,46) est
associé à une augmentation du risque de DT2 de 25 à 50% dans ces études. Cette
prédisposition au DT2 était en fait due à l’association de cet allèle avec une augmentation de
l’IMC (+ 0,2 à 0,4 kg/m² par allèle) [Frayling et al. 2007]. Ainsi, les individus porteurs de cet
allèle ont un risque accru de surpoids et d’obésité, et ce, dès l’enfance [Frayling et al. 2007;
Dina et al. 2007a; Scuteri et al. 2007; Do et al. 2008; Peeters et al. 2008; Grant et al. 2008;
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Lopez-Bermejo et al. 2008]. Nous avons alors analysé l’impact de ce polymorphisme dans
l’échantillon MONICA français (Lille, Toulouse et Strasbourg, n=3402) (voir les
caractéristiques des populations étudiées dans le chapitre III.1. des Matériels et Méthodes
page 80) afin de vérifier l’association de FTO et l’IMC dans cet échantillon et voir si nous
pouvions détecter d’autres associations.

90
 Available online at [Link]

Metabolism Clinical and Experimental 58 (2009) 971 – 975

[Link]

Effect of an FTO polymorphism on fat mass, obesity, and type 2

diabetes mellitus in the French MONICA Study
Vanessa Legrya , Dominique Cottela , Jean Ferrièresb , Dominique Arveilerc , Nicolas Andrieuxa ,
Annie Binghamd , Aline Wagnerc , Jean-Bernard Ruidavetsb , Pierre Ducimetièred ,
Philippe Amouyela , Aline Meirhaeghea,⁎
a
INSERM, U744, Lille; Institut Pasteur de Lille, Lille; Université de Lille 2, UMR-S744, 59019 Lille Cedex, France
b
INSERM, U558, Toulouse; Faculté de Médecine, Université Paul Sabatier, Toulouse, France
c
Laboratoire d'Epidémiologie et Santé Publique, EA 1801, Faculté de Médecine, Université Louis Pasteur, Strasbourg, France
d
INSERM, U909, Villejuif; Université Paris V, Faculté de Médecine, Villejuif, France
Received 27 September 2008; accepted 9 February 2009
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Abstract

We investigated the association between the rs9939609 (TNA) polymorphism in the FTO (fat mass– and obesity-associated) gene and
obesity- and type 2 diabetes mellitus–related phenotypes in the French Multinational MONItoring of Trends and Determinants in
CArdiovascular Disease (MONICA) Study (n = 3367). In the study, TA or AA subjects had higher body mass index (BMI) (P = .017), waist
circumference (P = .017), and hip (P = .01) circumference in an A allele dose-dependent manner. The A allele was also significantly
associated with higher plasma insulin levels (P = .05), higher insulin resistance index (homeostasis model assessment) (P = .02), and higher
systolic blood pressure (P = .003); but these associations disappeared after adjustment for BMI. In the study, 598 subjects were obese (BMI
≥30 kg/m2); and 2769 subjects were not obese (BMI b30 kg/m2). Subjects bearing the A allele of rs9939609 had a higher risk of obesity
(adjusted odds ratio [95% confidence interval] = 1.29 [1.06-1.58], P = .01) compared with TT subjects. Moreover, the homozygous AA
genotype of rs9939609 was associated with a higher risk of type 2 diabetes mellitus (odds ratio = 1.45 [1.05-1.99], P = .02, 283 subjects with
and 2601 subjects without type 2 diabetes mellitus), independently of BMI. In conclusion, the role of the A allele of the FTO rs9939609
polymorphism on the risk of obesity and type 2 diabetes mellitus was confirmed in the French MONICA Study.
© 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

1. Introduction the heritable character of these diseases has been established,

only few reliable genetic determinants have been discovered.
For several decades, obesity and type 2 diabetes mellitus The difficulties in finding these determinants can be
(T2D) have been worldwide issues because of their alarming explained by the presence of complex and abundant
increased prevalence and their associated morbidity (mainly interactions between genes and environment in the develop-
essential hypertension, dyslipidemia, cardiovascular dis- ment of obesity or T2D and also because the genetic
eases, etc) and mortality. Today, more than 1.1 billion adults determinants of these diseases are multiple and that each
worldwide are overweight; and 312 million of them are confers modest risk.
obese [1]. In addition, at least 155 million children Two genomewide association studies for T2D identified a
worldwide are overweight or obese, according to the highly significant association between the FTO rs9939609
International Obesity Task Force. The total number of polymorphism and T2D [3,4]. The risk of T2D associated
people with diabetes is projected to rise from 171 million in with the A allele of rs9939609 was increased by approxi-
2000 to 366 million in 2030 [2]. Although the evidence of mately 50% in a Finnish case-control study [3] and by
approximately 25% in the Wellcome Trust Case-Control
⁎ Corresponding author. Tel.: + 33 3 20 87 73 91; fax: +33 3 20 87 78 94. Consortium collection [4]. Interestingly, this predisposition
E-mail address: [Link]-hurez@[Link] to diabetes was in fact due to an effect on body mass index
(A. Meirhaeghe). (BMI) [5]. The A allele of rs9939609 was indeed associated
0026-0495/$ – see front matter © 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/[Link].2009.02.019
 972 V. Legry et al. / Metabolism Clinical and Experimental 58 (2009) 971–975

with higher BMI (∼0.2-0.4 kg/m2 per A allele). Adults doing sport or physical exercise for more than 2 hours a week.
homozygous for the A allele at rs9939609 were at increased In terms of smoking exposure, subjects were categorized as
risk of being overweight (odds ratio [OR] = 1.38) and obese never smokers, former smokers, and current smokers (ie,
(OR = 1.67). Similar results were obtained in children subjects reporting at least 1 cigarette per day). Total alcohol
cohorts by the age of 7 years [5,6]. Since then, several intake was expressed as the sum of milliliters of alcohol per
publications have confirmed the influence of FTO poly- week from wine, beer, cider, and spirits. Anthropometric
morphisms on fat mass in different population samples [7- measurements included body weight (rounded to the nearest
11]. Lopez-Bermejo et al [12] showed that an FTO single even decimal) and waist girth (at a level midway between the
nucleotide polymorphism (SNP) was associated with weight lower rib margin and the iliac crest, to the nearest 0.5 cm) and
and ponderal index as early as 2 weeks of age. Jacobsson were performed on subjects in light clothing without shoes.
et al [13] showed that rs9939609 predisposed to obesity in Body mass index was calculated according to the Quetelet
girls but not in boys in a sample of 450 obese and 512 equation. Subjects having a BMI greater than or equal to
nonobese Swedish children. In contrast, in Chinese Han or in 30 kg/m2 were considered as obese. Blood pressure was
African American subjects, rs9939609 was not associated measured on the right arm, with the subject in a sitting
with T2D or obesity-related phenotypes despite sufficient position and after a minimum 5-minute rest, using a standard
power in the studies [7,14]. The minor allele frequency of mercury sphygmomanometer. The mean value of 2 con-
this SNP being much lower in these ethnic population secutive blood pressure readings was taken into account. The
samples (0.20) than in white subjects (0.40), the absence of homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-
replication in these population samples could be due to an IR) index was calculated as the product of fasting plasma
evolutionary divergence or genetic drift. It remains also insulin (in microunits per milliliter) and fasting plasma
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

possible that other common variants in the FTO gene, glucose (in millimoles per liter), divided by 22.5 [18].
especially those with higher minor allele frequency, may Diabetic subjects (n = 283) were identified by fasting
contribute to the increased risk for obesity or T2D in Chinese glycemia of at least 7 mmol/L (1.26 g/L) or antidiabetic
or African Americans, similar to the TCF7L2 gene [15]. treatment [19]. Normoglycemic subjects (n = 2601) had
All the described FTO polymorphisms associated with fasting glycemia less than 6.1 mmol/L (1.10 g/L) and no
T2D or BMI are in tight linkage disequilibrium (HapMap specific treatment or diet for T2D, whereas individuals with
release 23, March 2008), including rs9939609, rs1121980, raised fasting glycemia (n = 261) had fasting glycemia
rs17817449, rs3751812, and rs1421085 (r2 N0.8). Therefore, between 6.1 and 7 mmol/L. A total of 222 subjects had type 1
we investigated the association between the FTO rs9939609 diabetes mellitus, nonfasting blood samples, or missing
polymorphism and the risk of obesity and T2D as well as values and were not used in the T2D analyses.
clinical and biochemical phenotypes in the French Multi-
national MONItoring of Trends and Determinants in 2.2. Laboratory methods
CArdiovascular Disease (MONICA) population study.
A 20-mL blood sample was drawn into a disodium EDTA
tube (after the subjects had fasted for at least 10 hours),
2. Materials and methods stored at room temperature, and centrifuged within 4 hours.
All measurements were performed at the Purpan Hospital
2.1. MONICA Study Biochemical Laboratory (Toulouse). The quality of biologi-
cal measures was assessed within the framework of the
Participants were recruited as part of the World Health
MONICA Project. Plasma total cholesterol and triglyceride
Organization–MONICA population survey conducted from
levels were measured using enzyme assays (Boehringer
1995 to 1997 in 3 different parts of France: the Lille urban
Mannheim, Mannheim, Germany). Plasma high-density
community in northern France (n = 1195), the Bas-Rhin
lipoprotein (HDL) cholesterol was measured after sodium
county in eastern France (n = 1131), and the Haute-Garonne
phosphotungstate/magnesium chloride precipitation (Boeh-
county in southern France (n = 1182). The protocol was
ringer Mannheim). Plasma low-density lipoprotein (LDL)
approved by the appropriate independent ethics committee in
cholesterol was calculated with the Friedewald equation.
each center. Subjects (aged 35-64 years) were randomly
Plasma glucose was measured using the standard glucose
selected from electoral rolls after stratification by town size,
hexokinase method (DuPont Dimension, Brussels, Bel-
sex, and age to obtain 200 participants for each sex and each
gium). Plasma insulin was measured by radioimmunoassay
10-year age group (World Health Organization–MONICA
(Medgenix Diagnostics, Brussels, Belgium).
Project protocol) [16]. DNA samples were available for 3452
subjects. After providing written informed consent, partici- 2.3. Genotyping
pants filled out a standard questionnaire; and physical
measurements were taken by a specially trained nurse. The FTO rs9939609 polymorphism was genotyped with
Details of the study have been described elsewhere [17]. a restriction fragment length polymorphism–based method.
Physical activity was defined as at least 15-minute walk a day, The 105–base pair polymerase chain reaction product was
and/or lifting or carrying heavy objects at work daily, and/or obtained using the following primers : 5′-GGT TCC TTG
 V. Legry et al. / Metabolism Clinical and Experimental 58 (2009) 971–975 973

CGA CTG CTG TGA AAT T-3′ and 5′-GCT TTT ATG .32 for the comparison between centers). The genotypic
CTC TCC CAC TC-3′. The forward primer created a forced distribution did not differ from the expected values of the
restriction site for ApoI. The T allele of rs399609 was cut by Hardy-Weinberg equilibrium either in MONICA Lille (P =
ApoI into 2 fragments of 85 and 20 base pairs, whereas the .34) or in MONICA Strasbourg (P = .99). The distribution of
A allele was not cut. Genotyping success rate was 98.4%. rs9939609 did not respect the Hardy-Weinberg equilibrium
Genotypes for rs9939609 were available for 1149, 1049, in MONICA Toulouse (P = .009), although the minor allele
and 1169 subjects in MONICA Lille, Strasbourg, and frequency of rs9939609 was similar in Toulouse as in the 2
Toulouse, respectively. other centers (0.43, 0.43, and 0.42 in MONICA Strasbourg,
Toulouse, and Lille, respectively). The mean BMI was lower
2.4. Statistical analyses in subjects from the Toulouse center compared with the
Analyses were performed with the SAS statistical soft- Strasbourg and Lille centers (25.5 ± 4.2 vs 27.0 ± 4.6 and
ware release 8 (SAS Institute, Cary, NC). The deviation from 26.6 ± 5.0 kg/m2, respectively, P b .0001), and the Hardy-
the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using the χ2 test Weinberg equilibrium was respected in the Toulouse center
(1 df). Pearson χ2 tests were used to compare genotype and when considering the group of lean subjects (P = .16).
allele distributions between groups. Heterogeneity among We evaluated the association between rs9939609 and
centers was assessed with the Breslow-Day test. We anthropometric (BMI, body weight, waist circumference),
calculated the association between FTO genotypes and risk biochemical, and clinical variables (plasma glucose, insulin,
of obesity or T2D (ORs and 95% confidence intervals) using lipids, and blood pressure) in the MONICA Study (Table 1).
unconditional logistical regression. Comparison of means The A allele of rs9939609 was significantly associated with
higher body weight (P trend = .0009), waist circumference
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

among genotype groups was tested using an additive model.

Confounding variables were age, sex, physical activity level, (P trend = .001), hip circumference (P trend = .02), waist-hip
smoking habit, alcohol consumption, and center ± BMI. ratio (P trend = .02), and BMI (P trend = .005) in an A allele
Subjects treated with cholesterol-lowering drugs, oral dose-dependent manner (eg, +∼0.3 kg/m2 per A allele for
antidiabetic drugs, insulin, or blood pressure–lowering BMI). These associations persisted for all parameters except
therapy (n = 801) were excluded when considering waist-hip ratio after adjustment for age, sex, alcohol
quantitative biological variables. consumption, smoking habit, physical activity level, and
center but became nonsignificant after further adjustment for
BMI (Table 1). The associations between rs9939609 and the
3. Results anthropometric measurements were similar whatever the
level of insulin resistance of the subjects (assessed using
The frequencies of the TT, TA, and AA genotypes of tertiles of HOMA-IR) (data not shown). The A allele was
rs9939609 were 0.33, 0.49, and 0.18 in MONICA also significantly associated with higher plasma insulin
Strasbourg; 0.31, 0.53, and 0.16 in MONICA Toulouse; levels (P trend = .05), higher insulin resistance (HOMA
and 0.33, 0.50, and 0.17 in MONICA Lille, respectively (P = index) (P trend = .03), and higher systolic blood pressure

Table 1
Association between the FTO rs9939609 SNP and anthropometric and biochemical variables in the French MONICA Study
TT TA AA Crude Adjusteda Adjusteda (including
1095 1702 570 P trend P trend BMI) P trend
Weight, kg 72.9 ± 14.4 73.8 ± 15.4 75.5 ± 14.9 .0009 .009 .71
Waist, cm 89.3 ± 13.2 90.3 ± 13.8 91.6 ± 13.5 .001 .006 .83
Hip, cm 101.1 ± 9.4 101.7 ± 9.8 102.3 ± 9.6 .02 .004 .45
Waist-hip ratio 0.88 ± 0.10 0.89 ± 0.09 0.89 ± 0.09 .02 .28 .67
BMI, kg/m2 26.1 ± 4.5 26.4 ± 4.7 26.8 ± 4.7 .005 .005 –
851 1276 439
Insulinb, μU/mL 10.49 ± 6.58 10.58 ± 9.70 11.31 ± 10.09 .05 .055 .32
Glucoseb, mmol/L 5.32 ± 0.81 5.34 ± 1.13 5.44 ± 1.06 .06 .29 .56
HOMA-IRb 2.49 ± 1.77 2.57 ± 3.00 2.74 ± 2.35 .03 .05 .30
Triglyceridesb, mmol/L 1.24 ± 0.98 1.23 ± 1.07 1.37 ± 2.11 .48 .90 .37
Cholesterol, mmol/L 5.85 ± 1.00 5.86 ± 1.08 5.82 ± 1.02 .69 .51 .49
HDL cholesterol, mmol/L 1.50 ± 0.43 1.51 ± 0.47 1.47 ± 0.44 .42 .70 .26
LDL cholesterol, mmol/L 3.82 ± 0.96 3.83 ± 1.02 3.81 ± 0.98 .93 .48 .46
SBP, mm Hg 128.3 ± 17.5 128.4 ± 16.6 131.4 ± 18.9 .007 .03 .08
DBP, mm Hg 80.8 ± 11.4 80.9 ± 10.8 82.1 ± 11.5 .08 .15 .40
Data are means ± SD. Subjects treated with cholesterol-lowering drugs, oral antidiabetic drugs, insulin, or blood pressure–lowering therapy were excluded when
considering biological variables. SBP indicates systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure.
a
P adjusted for age, sex, alcohol consumption, smoking habit, physical activity level, and center.
b
P values were calculated on log-transformed variables to obtain normal distribution.
 974 V. Legry et al. / Metabolism Clinical and Experimental 58 (2009) 971–975

(P trend = .007); but these associations disappeared after of rs9939609 was 0.42 in our sample, consistent with
adjustment for BMI. No significant association could be previous reports [3,5,6]. The A allele was associated with a
found between rs9939609 and fasting plasma glucose, total 30% higher risk of obesity. This association was homo-
cholesterol, LDL and HDL cholesterol, or triglyceride levels. genous between sexes. Moreover, the A allele of rs9939609
We next evaluated the association between rs9939609 and was significantly associated with higher BMI, in an A allele
obesity risk in the MONICA Study. There was no detectable dose-dependent manner (BMI +∼0.3 kg/m2 per A allele), in
heterogeneity among centers (P = .48). The overall genotype a magnitude similar as previously described studies (0.2-0.4
distribution of rs9939609 differed between lean, overweight, kg/m2 per A allele) [5,6,11]. It was also associated with
and obese subjects (P trend = .005) (Table 2). The crude OR higher waist and hip circumferences but not with higher
[95% confidence interval] of obesity (BMI ≥30 kg/m2) for A waist-hip ratio, suggesting that fat tended to accumulate in all
allele carriers was 1.25 [1.03-1.52] (P = .024) and was 1.29 depots in A allele carriers. Andreasen et al [11] showed that
[1.06-1.58] (P = .01) after adjustment for confounders. The physical inactivity accentuated the deleterious effect of FTO
adjusted OR of obesity was 1.46 [1.12-1.90] (P = .005) in on fat mass accumulation in Danes; but we could not
homozygous AA subjects compared with TT subjects. replicate this finding in the French MONICA Study,
Physical activity level had no influence on the association, although physical activity was self-reported in both studies.
as the adjusted ORs of being obese for A allele carriers were Other studies using direct measures of physical activity are
1.28 [0.92-1.81] or 1.30 [1.02-1.66] in subjects with or needed to evaluate this particular point.
without physical activity, respectively. There was no It has been shown that AA subjects had lower whole-body
significant interaction with sex (P = .60), and the association insulin sensitivity than T allele carriers and that a low insulin
with the risk of obesity was similar in both men and women sensitivity index enhanced the deleterious genotype effect on
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

(OR = 1.32 [0.99-1.75] and OR = 1.25 [0.95-1.66] in men BMI levels [11]. Like others [8,11,13], we detected
and women, respectively). significant associations between rs9939609 and insulin-
Finally, we evaluated the association between rs9939609 related variables (plasma insulin levels and insulin resistance
and the risk of T2D. We compared the genotype distribution index) as well as systolic blood pressure values; but these
of rs9939609 among subjects with normal fasting glycemia associations were purely the reflection of the effect of FTO
(n = 2601), raised fasting glycemia (n = 261), or T2D (n = on BMI, as they became nonsignificant after adjustment for
283) (P = .97 for the test of heterogeneity between centers) BMI. Moreover, the effect of the rs9939609 A allele on
(Table 2). The genotype distribution was not significantly anthropometric phenotypes was similar whatever the tertile
different between the 3 subject groups (P trend = .08). The of insulin resistance.
adjusted OR of T2D for A allele carriers was 1.06 [0.81- FTO is located on chromosome 16q12.2 in humans. It is
1.39] (P = .67 compared with TT subjects). Only AA expressed in many tissues such as adipose tissue, brain, liver,
homozygous subjects had a significantly higher risk of T2D skeletal, β-cells, and muscle [5,6]. Fto is expressed in
than T allele bearers (crude OR = 1.48 [1.10-1.99], P = .01 hypothalamic nuclei governing energy balance and is
and OR = 1.45 [1.05-1.99], P = .02 after adjustment for age, regulated by fasting and feeding in mice [20]. It has a role
sex, BMI, alcohol consumption, smoking habit, physical in nucleic acid demethylation [20], but more studies are
activity level, and center). needed to understand the link between nucleic acid
methylation status and fat mass regulation. In addition, it
has been shown that the A allele of rs9939609 is associated
4. Discussion with lower in vitro basal unstimulated adipocyte glycerol
release and increased in vivo lipolytic activity in women,
In our study, we confirmed the association between the suggesting that FTO may participate, at least in part, in the
FTO rs9939609 polymorphism and a higher risk of obesity regulation of body fat mass through lipolysis [21].
in the French MONICA Study. The frequency of the A allele Finally, regarding T2D, only the FTO homozygous AA
genotype was associated with a 48% higher risk of T2D in
the French MONICA Study. The association with T2D was
Table 2 seen only under a recessive model, but the relatively small
Association between the FTO rs9939609 SNP and overweight, obesity, or
T2D in the French MONICA Study
number of subjects with T2D in the sample (n = 283) might
explain this outcome. This risk was in accordance with 2
TT TA AA P trend
previous studies (OR ∼1.25 in the United Kingdom
BMI b25 (1460) 491 (0.34) 746 (0.51) 223 (0.15) .005 Wellcome Trust Case-Control Consortium collection and
25 ≤ BMI b 30 (1309) 433 (0.33) 649 (0.50) 227 (0.17)
OR ∼1.50 in Finns) [3,4]. However, unlike the data
BMI ≥30 (598) 171 (0.29) 307 (0.51) 120 (0.20)
NFG (2601) 844 (0.33) 1327 (0.51) 430 (0.16) .08 presented by Frayling et al [5] or others, the present
RFG (261) 80 (0.31) 134 (0.51) 47 (0.18) association with T2D persisted after adjustment for BMI
T2D (283) 89 (0.31) 130 (0.46) 64 (0.23) (risk still increased by 45%) or waist circumference (data not
Data are number (frequency). Crude P values are presented. NFG indicates shown), meaning that the present association with T2D was
normal fasting glycemia; RFG, raised fasting glycemia. not purely the reflection of the association with BMI in our
 V. Legry et al. / Metabolism Clinical and Experimental 58 (2009) 971–975 975

sample. One can assume that FTO polymorphisms could [6] Dina C, Meyre D, Gallina S, et al. Variation in FTO contributes to
also be associated with diabetes-related phenotypes other childhood obesity and severe adult obesity. Nat Genet 2007;39:724-6.
[7] Scuteri A, Sanna S, Chen WM, et al. Genome-wide association scan
than fat mass. Recently, Fisher and colleagues [22] showed shows genetic variants in the FTO gene are associated with obesity-
that the A allele of rs9939609 was associated with higher related traits. PLoS Genet 2007;3:e115.
plasma C-reactive protein levels in 2415 participants, [8] Do R, Bailey SD, Desbiens K, et al. Genetic variants of FTO influence
independently of BMI or waist-hip ratio. This FTO adiposity, insulin sensitivity, leptin levels, and resting metabolic rate in
polymorphism may enhance the inflammatory state of the Quebec Family Study. Diabetes 2008;57:1147-50.
[9] Peeters A, Beckers S, Verrijken A, et al. Variants in the FTO gene are
adipose tissue and may increase systemic inflammation, associated with common obesity in the Belgian population. Mol Genet
independently of the degree of adiposity. As C-reactive Metab 2008;93:481-4.
protein is an independent predictor of risk for the develop- [10] Grant SF, Li M, Bradfield JP, et al. Association analysis of the FTO
ment of T2D [23] and cardiovascular diseases, FTO gene with obesity in children of Caucasian and African ancestry
polymorphisms might contribute partly to the development reveals a common tagging SNP. PLoS ONE 2008;3:e1746.
[11] Andreasen CH, Stender-Petersen KL, Mogensen MS, et al. Low
of increased T2D and cardiovascular risk, independently physical activity accentuates the effect of the FTO rs9939609
of obesity. polymorphism on body fat accumulation. Diabetes 2008;57:95-101.
In conclusion, our study confirmed the role of the genetic [12] Lopez-Bermejo A, Petry CJ, Diaz M, et al. The association between the
variability in FTO in the modulation of the risk of obesity FTO gene and fat mass in humans develops by the postnatal age of two
weeks. J Clin Endocrinol Metab 2008;93:1501-5.
and T2D in a large French population sample.
[13] Jacobsson JA, Danielsson P, Svensson V, et al. Major gender difference
in association of FTO gene variant among severely obese children with
Acknowledgment obesity and obesity related phenotypes. Biochem Biophys Res
Commun 2008;368:476-82.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

[14] Li H, Wu Y, Loos RJ, et al. Variants in the fat mass– and obesity-
The MONICA population surveys were supported by
associated (FTO) gene are not associated with obesity in a Chinese Han
unrestricted grants from the Conseil Régional du Nord-Pas population. Diabetes 2008;57:264-8.
de Calais, ONIVINS, Parke-Davies Laboratory, the Mutuelle [15] Chang YC, Chang TJ, Jiang YD, et al. Association study of the genetic
Générale de l'Education Nationale, Groupe Fournier, the polymorphisms of the transcription factor 7–like 2 (TCF7L2) gene and
Réseau National de Santé Publique, the Direction Générale type 2 diabetes in the Chinese population. Diabetes 2007;56:2631-7.
[16] Ecological analysis of the association between mortality and major risk
de la Santé, the Institut National de la Santé Et de la
factors of cardiovascular disease. The World Health Organization
Recherche Médicale, the Institut Pasteur de Lille, the Unité MONICA Project. Int J Epidemiol 1994;23:505-16.
d'Evaluation du Centre Hospitalier et Universitaire de Lille. [17] Dallongeville J, Delcroix AG, Wagner A, et al. The APOA4 Thr347-N
V Legry is supported by the Institut Pasteur de Lille. Ser347 polymorphism is not a major risk factor of obesity. Obes Res
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developing world—a growing challenge. N Engl J Med 2007;356: [19] Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of
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estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care gene encodes a 2-oxoglutarate–dependent nucleic acid demethylase.
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[3] Scott LJ, Mohlke KL, Bonnycastle LL, et al. A genome-wide [21] Wahlen K, Sjolin E, Hoffstedt J. The common rs9939609 gene variant
association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple of the fat mass– and obesity-associated gene FTO is related to fat cell
susceptibility variants. Science 2007;316:1341-5. lipolysis. J Lipid Res 2008;49:607-11.
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tion study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared rs9939609 single nucleotide polymorphism with C-reactive protein
controls. Nature 2007;447:661-78. levels. Obesity (Silver Spring) 2009;17:330-4.
[5] Frayling TM, Timpson NJ, Weedon MN, et al. A common variant in [23] Freeman DJ, Norrie J, Caslake MJ, et al. C-reactive protein is an
the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to independent predictor of risk for the development of diabetes in the West
childhood and adult obesity. Science 2007;316:889-94. of Scotland Coronary Prevention Study. Diabetes 2002;51:1596-600.
 Résultats

I.2. Synthèse des résultats

Dans notre étude, les individus porteurs de l’allèle A du SNP rs9939609 (soit 67% de
l’échantillon) présentent une masse corporelle plus élevée, des tours de taille et de hanches
plus importants, un RTH et un IMC augmentés, de manière allèle-dose dépendante. Ces
individus ont ainsi un risque accru d’obésité par rapport aux individus TT (OR ajusté=1,29).
L’allèle A est également associé à une augmentation de la concentration plasmatique en
insuline, de l’indice d’insulinorésistance (HOMA-IR) et de la PAS, mais ces effets sont dus
entièrement à l’impact de cet allèle sur l’adiposité. Enfin, les individus homozygotes pour
l’allèle A présentent un risque augmenté de DT2, indépendamment de l’effet sur l’IMC, par
rapport aux individus TT et TA (OR ajusté=1,45).

I.3. Discussion
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Nous avons donc analysé l’impact du polymorphisme rs9939609 dans l’étude

MONICA française et avons confirmé l’association entre l’allèle A et l’augmentation de l’IMC
et d’autres variables anthropométriques (tour de taille, RTH…) et le risque d’obésité. Notons
que l’ampleur de l’effet que nous avons observé, notamment sur l’IMC (+~0,3 kg/m²) et sur le
risque d’obésité (+29%), est similaire à celui décrit dans de précédentes études (0,2-0,4
kg/m² pour l’IMC et +30-50% pour le risque d’obésité) [Frayling et al. 2007; Dina et al.
2007a]. De même, nous avons retrouvé l’association du SNP rs9939609 avec le risque de
DT2 dans notre étude (+48%), avec un effet similaire aux études précédentes (+25-50%
[Scott et al. 2007; 2007b]), mais à la différence de ces études, l’association avec le DT2 que
nous avons observée résiste à l’ajustement sur l’IMC ou le tour de taille, suggérant que cette
association ne serait pas purement et simplement le reflet de l’association avec l’adiposité.
En effet, il semble que des polymorphismes de FTO puissent âtre associés à d’autres
phénotypes liés au DT2 que l’adiposité. Une récente étude (n=2415) a décrit une association
entre le SNP rs9939609 et des taux plasmatiques de protéine C-réactive plus élevés,
indépendamment de l’IMC ou du tour de taille, suggérant que ce polymorphisme pourrait
entraîner un état inflammatoire du TA indépendamment du niveau d’adiposité [Fisher et al.
2008].
Nous avons par ailleurs évalué l’impact de ce polymorphisme sur le risque de
syndrome métabolique dans l’étude MONICA française. En considérant les définitions de
l’AHA, de l’OMS, de l’EGIR ou de l’IDF, nous n’avons pas détecté d’association significative
entre ce polymorphisme et le risque de syndrome métabolique, quelque soit le modèle
génétique testé (données non présentées dans l’article). En fait, il a été décrit que le SNP
rs9939609 est associé au risque de syndrome métabolique dans une étude de 16 143

91
 Résultats

participants, mais l’effet est trop faible (OR=1,08 [1,02-1,14], p=0,0065) pour être détectable
dans notre étude (n=3367) [Sjogren et al. 2008].
Même si le rôle de FTO dans l’homéostasie énergétique a été montré, notamment
chez la souris KO Fto-/- [Fischer et al. 2009], les mécanismes impliqués sont encore
actuellement méconnus. La protéine FTO a une localisation nucléaire et catalyse la
déméthylation des acides nucléiques [Gerken et al. 2007]. Mais le lien entre le statut de
méthylation des acides nucléiques et la régulation de la balance énergétique reste encore à
établir. Par ailleurs, les mécanismes par lesquels des polymorphismes génétiques de FTO
pourraient affecter la régulation de l’adiposité restent également à élucider. Le SNP
rs9939609 est situé dans le 1er intron du gène FTO et représente un tag-SNP pour un grand
nombre de SNPs situés dans le même intron (HapMap). De par leur localisation, ces SNPs
pourraient moduler le niveau d’expression du gène, notamment au niveau transcriptionnel.
Aujourd’hui, le SNP causal expliquant les associations avec l’adiposité n’a pas encore été
identifié. Il a été décrit que l’allèle A du SNP rs9939609 est associé à une diminution de
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

l’activité lipolytique du TA in vitro et in vivo, suggérant un rôle de FTO dans la régulation de

la lipolyse [Wahlen et al. 2008]. Cependant, dans cette étude, le SNP rs9939609 n’est pas
associé à une différence d’expression de FTO au niveau ARNm. Des études
complémentaires sont donc nécessaires pour lever le voile sur les fonctions de FTO, et sur
l’impact des polymorphismes du 1er intron sur l’expression de FTO, en particulier au niveau
protéique.
Récemment, un variant génétique rare dans le gène FTO, R316Q (MAF<0,0003), a
été décrit comme responsable d’un syndrome, à hérédité autosomale et récessive,
caractérisé par une létalité précoce (1 à 30 mois après la naissance) et de nombreuses
malformations (retard de croissance, microcéphalie, retard des fonctions psychomotrices,
défauts de fonctionnement du cerveau, dimorphisme facial et malformations cardiaques)
[Boissel et al. 2009]. Il a été montré que ce variant inhibe l’activité déméthylase de FTO in
vitro. De plus, des fibroblastes en culture, issus de ces patients, présentent une altération de
la prolifération et un phénotype sénescent. Ces résultats suggèrent que FTO est essentiel
dans le développement du système nerveux central et du système cardiovasculaire chez
l’homme.

92
 Résultats

α
II. Etude du gène NR1H3 codant LXRα

II.1. Contexte de l’étude

LXRα est un récepteur nucléaire activé par des dérivés du cholestérol. Il est codé par
le gène NR1H3 et est exprimé abondamment dans le foie, le tissu adipeux, l’intestin, la rate,
les reins, les poumons et les macrophages [Apfel et al. 1994; Auboeuf et al. 1997; Willy et al.
1995]. LXRα régule l’expression de nombreux gènes en formant un hétérodimère avec RXR
et en se fixant à une séquence spécifique, le LXRE, située dans le promoteur de ses gènes
cibles [Willy et al. 1995]. Ses fonctions sont revues en détail dans les chapitres V.2.a. et
V.2.b. de l’Introduction (pages 58-64). Brièvement, LXRα joue un rôle important dans le
métabolisme du cholestérol notamment en stimulant le transport inverse du cholestérol
[Baranowski 2008]. En particulier, LXRα induit l’expression du gène ABCA1, permettant ainsi
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

l’efflux du cholestérol des macrophages. De plus, LXRα stimule la lipogenèse hépatique.

D’autre part, l’activation de LXRα diminue la glycémie et améliore la sensibilité à l’insuline
dans plusieurs modèles animaux diabétiques [Baranowski 2008]. Enfin, LXRα est impliqué
dans le contrôle adrénergique du RAAS et pourrait jouer un rôle dans la biologie vasculaire
[Jamroz-Wisniewska et al. 2007]. LXRα est donc impliqué dans les 5 principales voies
métaboliques participant au développement du syndrome métabolique, et constitue ainsi un
excellent gène candidat.

93
 International Journal of Obesity (2008) 32, 421–428
& 2008 Nature Publishing Group All rights reserved 0307-0565/08 $30.00
[Link]/ijo

ORIGINAL ARTICLE
Association between liver X receptor a gene
polymorphisms and risk of metabolic syndrome
in French populations
V Legry1, D Cottel1, J Ferrières2, G Chinetti3, T Deroide1, B Staels3, P Amouyel1 and A Meirhaeghe1
1
INSERM, U744, Lille; Institut Pasteur de Lille, Lille; Université de Lille 2, UMR-S744, Lille, France; 2INSERM, U558,
Toulouse; Faculté de Médecine, Toulouse, France and 3Institut Pasteur de Lille, Département d’Athérosclérose, Lille;
INSERM, U545, Lille; Université de Lille 2, Faculté de Pharmacie et Faculté de Médecine, Lille, France

Context: The metabolic syndrome is a complex and multifactorial disorder often associated with type 2 diabetes mellitus and
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

cardiovascular diseases. The liver X receptor a (NR1H3) plays numerous roles in metabolic pathways involved in metabolic
syndrome.
Objective: In the search for susceptibility genes to metabolic syndrome, we hypothesized that common genetic variation in
NR1H3 gene influences metabolic syndrome susceptibility.
Design: Two large French population-based studies (n ¼ 1130 and 1160) including overall 664 individuals with and 1626
individuals without metabolic syndrome were genotyped for three polymorphisms (rs12221497, rs11039155 and rs2279239)
of NR1H3.
Results: We found that the 6A allele of rs11039155 was consistently associated with a 30% reduction in risk of metabolic
syndrome in the two independent population samples (adjusted OR (95% CI) ¼ 0.68 (0.53–0.86), P ¼ 0.001 for the combined
sample). Moreover, it was associated with an increase in plasma HDL-cholesterol concentrations (P ¼ 0.02 for the combined
sample). Neither rs12221497 nor rs11039155, both polymorphisms located in the 50 region of NR1H3, had significant influence
on NR1H3 and ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) gene expression in primary human macrophages.
Conclusions: These results suggest that NR1H3 plays an important role in the HDL-cholesterol metabolism and in the genetic
susceptibility to metabolic syndrome.
International Journal of Obesity (2008) 32, 421–428; doi:10.1038/[Link].0803705; published online 22 January 2008

Keywords: metabolic syndrome; polymorphism; NR1H3; HDL-cholesterol; association study; LXRA

Introduction due to the interaction between genetic susceptibility and

environmental factors. Moreover, the metabolic pathways
The concept of metabolic syndrome, according to the implicated in this syndrome are numerous and interact
2005 National Cholesterol Education Program (NCEP) III mutually. As an example, obesity favors dyslipidemia,
guidelines,1 corresponds to the clustering of three among insulin resistance and hypertension whereas insulin
the five following factors in individuals: abdominal resistance often leads to gain weight. In our laboratory, we
obesity, hyperglycemia, hypertriglyceridemia, hypoalphalipo- already identified several genetic susceptibility factors to
proteinemia (low HDL-cholesterol levels) and arterial hyper- metabolic syndrome2,3 but many are still to discover. The
tension. Detecting individuals with a metabolic syndrome identification of genes associated with metabolic syndrome
allows the discovery of individuals with a high risk of is important to understand better the development of this
developing cardiovascular diseases. The metabolic syndrome disorder.
is a complex and multifactorial disorder as its origin is Liver X receptor a (NR1H3, LXRA) is a nuclear receptor
expressed in liver, spleen, kidney, adipose tissue, small
intestine and macrophages4 encoded by a gene located
Correspondence: Dr A Meirhaeghe, INSERM U744, Institut Pasteur de Lille, 1 on 11p11.2. After its activation by cholesterol-derived
rue du Pr. Calmette, BP 245, Lille Cedex 59019, France.
oxysterols and heterodimerization with the retinoid X
E-mail: [Link]-hurez@[Link]
Received 5 February 2007; revised 3 June 2007; accepted 25 June 2007; receptor, NR1H3 regulates the transcription of many target
published online 22 January 2008 genes involved in cholesterol homeostasis, lipoprotein
 NR1H3 polymorphisms and metabolic syndrome
V Legry et al
422
metabolism and lipogenesis. Among them, one can cite the Table 1 Characteristics of subjects with (MetS) and without (No MetS)
genes encoding the ATP-binding cassette transporters and metabolic syndrome in Lille and Toulouse population samples
the apolipoprotein CI, CII, CIV and E, promoting the efflux Lille Toulouse
and the reverse cholesterol transport. Genes encoding PLTP
(phospholipid transfer protein)5 and CETP (cholesterol ester No MetS MetS No MetS MetS
(n ¼ 767) (n ¼ 363) (n ¼ 859) (n ¼ 301)
transfer protein)6 are also activated by NR1H3, which
explains the role for NR1H3 in lipoprotein remodeling. Age, years 5078 5478a 4979 5478a
Moreover, in liver, NR1H3 increases the expression of SREBP- Men, n (%) 371 (47) 215 (57)a 422 (48) 192 (62)a
Waist girth, cm 85.4711.3 102.6711.1a 83.2710.6 98.7711.7a
1c (sterol regulatory element binding protein 1c), FAS (fatty
BMI, kg/m2 24.873.8 30.475.1a 24.273.1 29.274.5a
acid synthase) and PLTP, leading to de novo lipogenesis. Thus, Triglycerides, 1.0770.64 2.1571.63a 1.0070.52 1.7270.99a
NR1H3 plays numerous roles in metabolic pathways in- mmol/l
volved in metabolic syndrome and, therefore, it represents HDL-cholesterol, 1.6270.46 1.2370.39a 1.5570.42 1.2270.39a
mmol/l
an excellent candidate gene for metabolic syndrome suscept-
Glucose, mmol/l 5.1270.73 6.4772.24a 5.5371.15 6.2471.47a
ibility. Little is known about the pathophysiological role of SBP, mm Hg 128718 145718a 127717 142717a
NR1H3 in humans. Although NR1H3 is not located in a DBP, mm Hg 80711 89711a 78710 85710a
susceptibility locus for the metabolic syndrome or related
Abbreviations: BMI, body mass index; DBP, diastolic blood pressure; HDL,
traits from genetic linkage analysis according to the 2005 high-density lipoprotein; SBP, systolic blood pressure. aPo0.0001 for the
Obesity Gene Map,7 one study found significant association difference between subjects with or without metabolic syndrome.
between a NR1H3 polymorphism and body mass index in
Swedish women.8 Therefore, we performed a large-scale
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

association study of NR1H3 in two large French popula- into account. Individuals with metabolic syndrome (n ¼ 363
tion-based studies (n ¼ 1130 and 1160). and 301 in Lille and Toulouse studies respectively) were
identified on the basis of the 2005 National Cholesterol
Education Program (NCEP) III guidelines.1 See Table 1 for the
Methods clinical characteristics of the subjects by center. From the
2290 individuals included in the MONICA study, 197
Subjects individuals had type 2 diabetes on the basis of a medical
Participants were recruited in the framework of the WHO- diagnosis and/or fasting glycaemia X7 mmol/l (1.26 g/l) and/
MONICA population survey conducted from 1995 to 1997 in or on the existence of a specific treatment or diet.11
different regions of France: the Urban Community of Lille in
the North (Lille, n ¼ 1195) and the Haute-Garonne county
Laboratory methods
in the South (Toulouse, n ¼ 1182). The sample included
A blood sample of 20 ml was drawn on disodium ethylene-
individuals aged 35–65 years randomly selected on electoral
diaminetetraacetic acid after the subjects had fasted for at
rolls after stratification by town size, gender and age to
least 10 h. Lipid and lipoprotein levels were all measured in
obtain 200 participants for each gender and 10-year age
the Purpan Hospital Biochemical Laboratory (Toulouse). The
group (WHO-MONICA Project protocol).9,10 The Ethical
quality of biological measures was assessed within the
Committee of each center approved the protocol. After
framework of the MONICA Project. Plasma glucose was
signing an informed consent, participants were administered
measured by a standard glucose hexokinase method (DuPont
a standard questionnaire and physical measurements were
Dimension, Brussels, Belgium). Plasma insulin was measured
made by a specially trained nurse. The level of physical
by radio-immunoassay (Medgenix Diagnostics, Brussels,
activity during leisure time was categorized as: no physical
Belgium). Plasma total cholesterol and triglyceride levels
activity, light (light physical activity almost every week),
were measured by enzymatic methods (DuPont Dimension).
intense (at least 20 min of intense physical activity more
Plasma high-density lipoprotein (HDL) cholesterol was
than once a week). Current cigarette smokers were defined
measured after sodium phosphotungstate/magnesium
as individuals reporting at least one cigarette per day. Total
chloride precipitation (Boehringer Mannheim, Mannheim,
alcohol intake was expressed as the sum of ml alcohol per
Germany). Plasma low-density lipoprotein cholesterol was
week from wine, beer, cider and spirits. The anthropometric
calculated with the Friedewald equation.
measurements included body weight (rounded to the nearest
even decimal), waist (at a level midway between lower rib
margin and iliac crest; to the nearest 0.5 cm) and were taken DNA isolation and genotyping
on individuals in light clothing without shoes. Body mass Genomic DNA was extracted from white blood cells isolated
index was calculated according to the Quetelet equation. from 20 ml of whole blood using a commercially available
Blood pressure was measured on the right arm, with the DNA isolation kit (DNA extraction kit; Stratagene, La Jolla, CA,
subject in a sitting position and after a minimum 5-min rest, USA). The typing of single nucleotide polymorphisms (SNPs)
using a standard mercury sphygmomanometer. The mean was done by the restriction fragment length polymorphism
value of two consecutive blood pressure readings was taken method (see Supplementary Information). Genotype data

International Journal of Obesity

 NR1H3 polymorphisms and metabolic syndrome
V Legry et al
423
were available for 1130 and 1160 subjects in the Lille and Statistical significance was considered when Pp0.05.
Toulouse population studies respectively. For each SNP, Reported P-values are nominal. P-values for the comparison
the PCR products had internal restriction sites (except for of the percentage of men (in Table 1) or genotypes (in
rs1449627) to avoid genotyping errors. Success rate was Table 2) between subject groups were assessed using the w2
above 98% for all SNPs. All SNPs were in the Hardy–Weinberg test. Multivariate logistic regression was used to calculate the
equilibrium in the two population studies (all P40.05). odds ratio. Comparison of differences for quantitative
Pairwise linkage disequilibrium estimates were calculated variables among genotype groups were performed using a
using GOLD.12 general linear model (proc GLM) in the combined Lille and
Toulouse sample. A dominant model was used as the number
of homozygous subjects for the minor allele was low. Power
Cell culture calculations indicated that a difference of 2 cm, 0.2, 0.06,
Human mononuclear cells were isolated from healthy blood 0.2 mmol/l, 3 and 2 mm Hg could be detected between
donors by Ficoll density gradient centrifugation. Mature genotype groups for waist circumference, triglycerides,
monocyte-derived macrophages were used after 10 days of HDL-cholesterol, glucose, systolic and diastolic blood pres-
culture in RPMI-1640 medium supplemented with 10% sure, respectively. Otherwise indicated, adjustment variables
human serum. were age, gender, smoking habit, alcohol consumption and
physical activity and further adjusted for center in the
combined sample. Haplotype analyses were based on the
RNA extraction and analysis maximum likelihood model described13 linked to the SEM
Total cellular RNA isolated from human macrophages treated algorithm14 and performed using the software developed by
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

or not for 24 h with the LXR ligand T0901317 (1 mmol/l) INSERM U525, Paris, France ([Link]
using Trizol (Invitrogen), was reverse-transcribed using In Q-PCR analysis, statistical differences between groups
random hexameric primers and multiscribe reverse tran- were analyzed by Student’s t- and ANOVA tests.
scriptase (Applied Biosystems). cDNAs were quantified by
quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) on an
MX4000 apparatus (Stratagene) using brilliant SYBR green Results
(Stratagene) and specific primers: AGGGCTGCAAGG
GATTCTTCC (forward), TCTGACAGCACACACTCCTCCC NR1H3 SNPs were extracted from the NCBI dbSNP database.
(reverse) for NR1H3, AAGGTCTTGTTCACCTCAGCCATGAC We selected 7 NR1H3 SNPs according to their minor allele
(forward), GTGAACAGCTCCAGCTCCTCCAC (reverse) for frequency (above 8%) and potential functional consequence:
ABCA1 and GCATACGGGTCCTGGCATCTTGTCC (forward), rs12221497 (115 G4A), rs11039155 (6 G4A), rs2279239
ATGGTGATCTTCTTGCTGGTCTTGC (reverse) for cyclo- (intron2 T4C), rs2279238 (exon3 C4T), rs7120118 (intron6
philin. NR1H3 and ABCA1 mRNA levels were subsequently T4C), rs1449626 (intergenic region þ 512 A4C) and
normalized to those of cyclophilin. rs1449627 (intergenic region þ 737 T4G) (according to the
NM_005693.1 sequence). To build the linkage disequilibrium
map, a hundred individuals randomly selected from the
Statistical analysis MONICA Lille population were genotyped for these seven
Statistical analyses were performed with the SAS statistical SNPs. The frequencies of the minor alleles were 13, 11, 27,
software, version 8 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). 12, 26, 14 and 23% for the SNPs rs12221497, rs11039155,

Table 2 Genotype distribution for the NR1H3 rs12221497, rs11039155 and rs2279239 SNPs in subjects with (MetS) or without (No MetS) metabolic syndrome by
MONICA population studies

Rs12221497 (115G4A) Rs11039155 (6G4A) Rs2279239 (intron2 T4C)

GG GA AA P (crude) GG GA AA P (crude) TT TC CC P (crude)

Lille
No MetS (n ¼ 767) 589 (76.8) 168 (21.9) 10 (1.3) 0.04 570 (74.3) 182 (23.7) 15 (2.0) 0.18 419 (54.6) 289 (37.7) 59 (7.7) 0.43
MetS (n ¼ 363) 257 (70.8) 96 (26.5) 10 (2.7) 288 (79.3) 69 (19.0) 6 (1.7) 184 (50.7) 151 (41.6) 28 (7.7)
Adjusted OR 1.44 [1.07–1.94] P ¼ 0.02 0.66 [0.48–0.91] P ¼ 0.01 1.12 [0.86–1.46] P ¼ 0.39

Toulouse
No MetS (n ¼ 859) 665 (77.4) 176 (20.5) 18 (2.1) 0.63 686 (79.9) 165 (19.2) 8 (0.9) 0.14 490 (57.0) 316 (36.8) 53 (6.2) 0.31
MetS (n ¼ 301) 231 (76.8) 66 (21.9) 4 (1.3) 255 (84.7) 45 (15.0) 1 (0.3) 187 (62.1) 98 (32.6) 16 (5.3)
Adjusted OR 1.15 [0.83–1.60] P ¼ 0.41 0.70 [0.48–1.00] P ¼ 0.05 0.86 [0.65–1.14] P ¼ 0.28

Abbreviations: OR, odds ratio; SNP, single nucleotide polymorphism. Data are n (%). OR: Odds Ratio using a dominant model, adjusted for age, gender, physical
activity, smoking habit and alcohol consumption. [ ]: Values within square brackets show 95% confidence interval.

International Journal of Obesity

 NR1H3 polymorphisms and metabolic syndrome
V Legry et al
424

rs12221497

rs11039155

rs2279239

rs2279238

rs7120118

rs1449626

rs1449627
D’

rs1449627 rs1449627
1 1

rs1449626 rs1449626

rs7120118 rs7120118

rs2279238 rs2279238

rs2279239 rs2279239

rs11039155 rs11039155

0.87 0.02
rs12221497 rs12221497
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

rs12221497

rs11039155

rs2279239

rs2279238

rs7120118

rs1449626

rs1449627
r²

Figure 1 Linkage disequilibrium between 7 NR1H3 polymorphisms. The D0 is displayed on the left upper corner and the r2 on the right lower corner.

rs2279239, rs2279238, rs7120118, rs1449626 and rs1449627, syndrome was 0.66 (0.48–0.91), P ¼ 0.01, for 6A allele
respectively. The linkage disequilibrium pattern across the bearers. No significant association could be detected between
SNPs was assessed using both D0 and r2 (Figure 1). We the intron2 T4C polymorphism and risk of metabolic
identified two haplotype blocks in which three SNPs were syndrome.
in complete and perfect linkage disequilibrium (D0 ¼ þ 1, In MONICA Toulouse (n ¼ 1160), the frequencies of the
0.95pr2p1) (block 1: rs11039155, rs2279238 and NR1H3 rs12221497 (115G4A), rs11039155 (6G4A) and
rs1449626; block 2: rs2279239, rs7120118 and rs1449627). rs2279239 (intron2 T4C) minor alleles were 12.3, 9.8 and
These results were in accordance with the HapMap database, 23.8%, respectively. There were 301 subjects with and 859
at least for the three SNPs described in HapMap (rs12221497, subjects without metabolic syndrome in this population
rs2279238 and rs7120118). The SNP rs12221497 was not sample. Neither the 115G4A polymorphism nor the
in complete linkage disequilibrium with the other SNPs intron2 T4C polymorphism was significantly associated with
(|D0 | ¼ 1, r2o0.5) Therefore, we typed the three SNPs risk of metabolic syndrome (Table 2). In contrast, the 6G4A
rs12221497, rs11039155 and rs2279239, in the MONICA polymorphism was significantly associated with metabolic
Lille and Toulouse studies (n ¼ 1130 and 1160 respectively, syndrome that is the adjusted OR of metabolic syndrome was
comprising overall 664 individuals with metabolic syn- 0.70 (0.48–1.00), P ¼ 0.05, for 6A allele bearers.
drome) and assessed their impact on metabolic syndrome The ORs of metabolic syndrome for individuals carrying
risk and related phenotypes. the 6A allele of the rs11039155 SNP were homogenous
In MONICA Lille (n ¼ 1130), the frequencies of the NR1H3 between the two population studies (Breslow – Day test
rs12221497 (115G4A), rs11039155 (6G4A) and P ¼ 0.83), allowing the pooling of the two samples. In the
rs2279239 (intron2 T4C) minor alleles were 13.4, 12.8 and combined Lille and Toulouse population sample (664
27.1%, respectively. We compared the genotype distribution subjects with and 1626 subjects without metabolic
of these three polymorphisms between individuals with syndrome), the OR of metabolic syndrome for individuals
(n ¼ 363) and without (n ¼ 767) metabolic syndrome. The carrying the 6A allele was 0.76 (0.60–0.95), P ¼ 0.02 (crude)
115A allele frequency was higher in subjects with and 0.68 (0.53–0.86), P ¼ 0.001, after adjustment for covari-
metabolic syndrome than in subjects without (Table 2). ables. This association between the 6G4A polymorphism
The adjusted odds ratio (OR) (95% CI) of metabolic and risk of metabolic syndrome was homogenous in men
syndrome was 1.44 (1.07–1.94), P ¼ 0.02, for 115A allele and women: the adjusted OR of metabolic syndrome for
bearers. Similarly, the adjusted OR (95% CI) of metabolic individuals bearing the 6A allele was 0.67 (0.49–0.92),

International Journal of Obesity

 NR1H3 polymorphisms and metabolic syndrome
V Legry et al
425
P ¼ 0.012, for men (398 men with and 781 men without Of these haplotypes, four occurred at frequencies 41% and
metabolic syndrome) and 0.68 (0.47–0.99), P ¼ 0.044, for accounted for 99.5% of the observed haplotypes. The
women (266 women with and 845 women without meta- frequencies for these four haplotypes are presented in
bolic syndrome). Exclusion of subjects with type 2 diabetes Table 4. The statistical analyses confirmed the importance of
(n ¼ 197) did not modify the association: the adjusted OR of rs11039155 in metabolic syndrome. Indeed, the GAC
metabolic syndrome for individuals bearing the 6A allele haplotype (corresponding to the rs2221497, rs11039155
was 0.65 (0.50–0.85), P ¼ 0.0016 in the combined Lille and and rs2279239 SNPs in this order) was significantly associated
Toulouse population sample. with a decreased risk of metabolic syndrome (adjusted
To understand the present association between the NR1H3 OR ¼ 0.73 (0.58–0.91), P ¼ 0.006) when compared to the
6G4A SNP and the risk of metabolic syndrome, we GGT reference haplotype (Table 4). No other haplotype was
evaluated the impact of this SNP on the clinical variables associated with metabolic syndrome risk.
related to metabolic syndrome (that is, waist circumference, To investigate a possible role of NR1H3 6G4A and
blood pressure, plasma glucose, triglyceride and HDL- 115G4A polymorphisms on the expression of NR1H3
cholesterol levels) (Table 3). We used combined whole Lille and ABCA1Fa target gene of NR1H3 involved in
and Toulouse samples as they are population-based studies. macrophage cholesterol efflux and HDL metabolismFQ-PCR
We detected significant associations between the 6G4A analysis was performed on primary human macrophages
polymorphism and plasma HDL-cholesterol concentrations; treated or not with the LXR ligand T0901317 (1 mmol/l).
the 6A allele being associated with higher HDL-cholesterol NR1H3 expression level was not significantly different
levels (1.4770.45 vs 1.5370.48 mmol/l in GG vs GA þ AA between genotype groups in the basal state (Figure 2a)
subjects respectively, P ¼ 0.007 or P ¼ 0.02 after adjustment and T0901317 activated NR1H3 expression similarly in
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

for age, gender, BMI, smoking habit, alcohol consumption, all genotype groups (1.5-fold) (Figure 2b). Moreover,
physical activity and center). This association was homo- ABCA1 gene expression was induced 10-fold by T0901317
genous between population studies: 1.4870.46 vs in either subjects carrying the 115GG/6GG genotypes or
1.5570.50 mmol/l (adjusted P ¼ 0.15) and 1.4570.44 vs in carriers of the 115A allele, and 12-fold in carriers of the
1.5070.44 mmol/l (adjusted P ¼ 0.06) for GG vs GA þ AA 6A allele (Figure 3) (ns).
subjects, in Lille and Toulouse studies respectively.
We also performed haplotype analyses with the
three NR1H3 SNPs. We used the combined Lille and Discussion
Toulouse sample to increase statistical power. Of the
eight potential haplotypes defined by three SNPs, six In this study, we found a consistent association between
inferred haplotypes were indeed observed in the sample. the NR1H3 6A allele of rs11039155 and a lower risk of

Table 3 Impact of the NR1H3 rs11039155 SNP on the biological variables associated with metabolic syndrome in the combined Lille and Toulouse population
studies

Rs11039155 (6G4A) (n) GG (1799) GA (461) AA (30) P (GA+AA vs GG) Adjusted P

Waist circumference (cm) 89.1713.6 89.1713.0 89.6713.1 0.98 0.22a

Triglycerides, mmol/lc 1.3471.53 1.2871.05 1.3971.31 0.25 0.16b
HDL-cholesterol, mmol/l 1.4770.45 1.5370.48 1.4570.44 0.007 0.02b
Glucose, mmol/lc 5.6471.38 5.6371.55 5.3870.79 0.60 0.93b
SBP, mm Hg 132.4718.8 132.1718.4 130.0716.9 0.59 0.20b
DBP, mm Hg 81.4711.3 80.7710.8 81.979.8 0.28 0.09b

Abbreviations: DBP: diastolic blood pressure, HDL, high-density lipoprotein; SBP: systolic blood pressure. aP-value adjusted for age, gender, alcohol consumption,
physical activity, smoking habit and center. bP-values adjusted for age, gender, BMI, alcohol consumption, physical activity, smoking habit and center. cData were
log-transformed to obtain normal distributions.

Table 4 Haplotype analyses including the NR1H3 rs2221497, rs11039155 and rs2279239 SNPs on metabolic syndrome in the combined Lille and Toulouse
population studies

Haplotype No MetS (n ¼ 1626) MetS (n ¼ 664) P (global effect) OR (95% CI) Adjusted P

GGT (%) 0.741 0.740 Reference F

AGC (%) 0.122 0.140 P ¼ 0.04 (crude) 1.20 (0.98–1.47) 0.08
GAC (%) 0.118 0.094 P ¼ 0.005 (adjusted) 0.73 (0.58–0.91) 0.006
GGC (%) 0.016 0.020 1.17 (0.76–1.81) 0.47

Abbreviation: SNP, single nucleotide polymorphism. P-values were adjusted on age, gender, physical activity, alcohol consumption, smoking habit and center. Order
of the SNPs in the haplotype analyses: rs2221497, rs11039155 and rs2279239. Only haplotypes with a frequency above 1% are represented.

International Journal of Obesity

 NR1H3 polymorphisms and metabolic syndrome
V Legry et al
426
1.6
1.4

Fold increase of NR1H3

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-115GG/-6GG -115A -6A
(n=22) (n=14) (n=19)

2.5

2.0
Fold increase of NR1H3

1.5 basal
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

T0901317
1.0

0.5

0
-115GG/-6GG -115A -6A
(n=15) (n=12) (n=14)
Figure 2 NR1H3 gene expression according to genotype groups for the 115G4A and 6G/A polymorphisms. Quantitative-PCR analysis of NR1H3 was
performed on RNA isolated from primary human macrophages treated (b) or not (a) for 24 h with T0901317 (1 mmol/l). NR1H3 mRNA levels were normalized to
cyclophilin mRNA. Expression level was set at 1 for 115GG/6GG subjects. Data with treatment were expressed relative to the levels in untreated cells set at 1.
Results are expressed as mean7s.e.m. of triplicate determinations obtained for the indicated number of macrophage preparations.

20 plasma HDL-cholesterol concentrations compared with 6GG

18
Fold increase of ABCA1

subjects.
16
14 These results are in accordance with the physiological role
12 of NR1H3. NR1H3 regulates many target genes involved in
10 Basal
lipid uptake and efflux and lipoprotein metabolism.15
8 T0901317
NR1H3 activators promote (i) the cellular transmembrane
6
4 transport of endogenous lipid substrates via the induction
2 of ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG4, ABCG816,17 in human
0 macrophages and intestine;18 (ii) the cholesterol trafficking
-115GG/-6GG -115A -6A
from the endosome/lysosome to the plasma membrane
(n=8) (n=8) (n=9)
through the activation of Niemann-Pick C (NPC) 1 and
Figure 3 Induction of ABCA1 by T0901317 according to genotype groups
for the 115G4A and 6G/A polymorphisms. Quantitative-PCR analysis of NPC2 expression in human macrophages;19 (iii) the regula-
ABCA1 was performed on RNA isolated from primary human macrophages tion of acceptors in cholesterol efflux such as ApoE, ApoCI,
treated (black bars) or not (white bars) for 24 h with T0901317 (1 mmol/l). ApoCII and ApoCIV expression in adipocytes and macro-
ABCA1 mRNA levels were normalized to cyclophilin mRNA and are expressed
phages20; and (iv) the remodeling of lipoproteins through
relative to the levels in untreated cells set at 1. Results are expressed as
mean7s.e.m. of duplicate determinations obtained for the indicated number the control of modifying enzymes such as lipoprotein lipase
of macrophage preparations. (LPL)21 and PLTP in liver and macrophages.5 To support this,
it has been shown that NR1H3 agonists raise plasma HDL-
metabolic syndrome in two independent population samples. cholesterol and triglyceride levels.22 Therefore, NR1H3 plays
Similar results were found when using the International a central role in many pathways involved in the onset of the
Diabetes Federation criteria of metabolic syndrome (data not metabolic syndrome, especially in HDL-cholesterol metabolism.
shown). Moreover, carriers of the 6A allele displayed higher It is worth noting that no significant association could

International Journal of Obesity

 NR1H3 polymorphisms and metabolic syndrome
V Legry et al
427
be detected between NR1H3 SNPs and plasma triglyceride Direction Générale de la Santé, the Institut National de la
concentrations in our study. Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), the Institut
Our results point towards the same direction than the Pasteur de Lille and the Unité d’Evaluation du Centre
study of Dahlman et al.8 They showed that the CC genotype Hospitalier et Universitaire de Lille. This study was part of
of SNP rs2279238 was associated with lower body mass index the CRESCENDO (Consortium for Research into Nuclear
in Swedish women. In our population sample, rs2279238 Receptors in Development and Aging) consortium funded by
was in perfect linkage disequilibrium with rs11039155, the the Commission’s Sixth Framework Programme (integrated
SNP we found associated with a protective role against project LSHM-CT-2005-018652). We thank Dr Rébecca
metabolic syndrome (D0 ¼ þ 1, r2 ¼ 0.95) whereas in Dahlman’s Dièvart and Lionel Helin for technical experiments.
study, it was not (D0 ¼ þ 0.34, r2 ¼ 0.11).
Both rs12221497 (115G4A) and rs11039155 SNP
(6G4A), being located in the 50 region of NR1H3, could
References
modify NR1H3 gene expression. We quantified NR1H3
mRNA levels in human primary macrophages but we did
1 Grundy SM, Cleeman JI, Daniels SR, Donato KA, Eckel RH,
not detect any significant difference in NR1H3 expression Franklin BA et al. Diagnosis and management of the metabolic
level between genotype groups. Same results were obtained syndrome. An american heart association/national heart,
for ABCA1, a target gene of NR1H3 involved in cholesterol lung, and blood institute scientific statement. Executive
summary. Cardiol Rev 2005; 13: 322–327.
efflux in human macrophages which is associated with
2 Dallongeville J, Helbecque N, Cottel D, Amouyel P, Meirhaeghe A.
HDL-cholesterol levels in association studies.23,24 These data The Gly16-Arg16 and Gln27-Glu27 polymorphisms of beta2-
suggest that these polymorphisms do not modify NR1H3 or adrenergic receptor are associated with metabolic syndrome in
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

ABCA1 gene expression, at least in macrophages. Other cell men. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88: 4862–4866.
3 Meirhaeghe A, Cottel D, Amouyel P, Dallongeville J. Association
types/tissues need to be tested. On the other hand, the
between peroxisome proliferator-activated receptor gamma
6G4A polymorphism is located six base pairs upstream haplotypes and the metabolic syndrome in French men and
from the ATG site, a position shown by Kozak to affect women. Diabetes 2005; 54: 3043–3048.
recognition of the AUG codon. The fact that the sequence 4 Willy PJ, Umesono K, Ong ES, Evans RM, Heyman RA,
Mangelsdorf DJ. LXR, a nuclear receptor that defines a distinct
flanking the AUG start codon in NR1H3 mRNA (GAAGA
retinoid response pathway. Genes Dev 1995; 9: 1033–1045.
GATGT) does not closely match the Kozak consensus 5 Laffitte BA, Joseph SB, Chen M, Castrillo A, Repa J, Wilpitz D et al.
sequence (GACACCATGG) makes it more likely that the The phospholipid transfer protein gene is a liver X receptor
polymorphism might affect translational efficiency; that is a target expressed by macrophages in atherosclerotic lesions.
Mol Cell Biol 2003; 23: 2182–2191.
mutation in position 6 is more likely to have an effect in
6 Luo Y, Tall AR. Sterol upregulation of human CETP expression in
the absence of A in position 3 and G in position þ 4.25 It vitro and in transgenic mice by an LXR element. J Clin Invest 2000;
would be therefore interesting to compare the level of 105: 513–520.
NR1H3 protein produced in various tissues for example, 7 Rankinen T, Zuberi A, Chagnon YC, Weisnagel SJ, Argyropoulos
G, Walts B et al. The human obesity gene map: the 2005 update.
liver, macrophages, adipose tissue between individuals with
Obesity (Silver Spring) 2006; 14: 529–644.
contrasted genotypes for the NR1H3 SNP rs11039155. On the 8 Dahlman I, Nilsson M, Jiao H, Hoffstedt J, Lindgren CM,
other hand, it cannot be ruled out that another variant in Humphreys K et al. Liver X receptor gene polymorphisms
linkage disequilibrium with the SNP rs11039155 may explain and adipose tissue expression levels in obesity. Pharmacogenet
Genomics 2006; 16: 881–889.
the present association.
9 Ecological analysis of the association between mortality
In conclusion, we have assessed the role of common and major risk factors of cardiovascular disease. The world
genetic variation in NR1H3 in susceptibility to metabolic health organization MONICA project. Int J Epidemiol 1994; 23:
syndrome. Among the different NR1H3 SNPs investigated, 505–516.
10 Marques-Vidal P, Ruidavets JB, Amouyel P, Ducimetiere P, Arveiler
only the rs11039155 (6G4A) polymorphism demonstrated
D, Montaye M et al. Change in cardiovascular risk factors in
consistent association with HDL-cholesterol levels and France, 1985–1997. Eur J Epidemiol 2004; 19: 25–32.
metabolic syndrome. The 6A allele was associated with an 11 Report of the expert committee on the diagnosis and classifica-
increase in HDL-cholesterol levels and a 30% reduction in tion of diabetes mellitus. Diabetes Care 1997; 20: 1183–1197.
12 Abecasis GR, Cookson WO. GOLD – graphical overview of linkage
the risk of metabolic syndrome. Other large populations of
disequilibrium. Bioinformatics 2000; 16: 182–183.
different countries are necessary to confirm this finding. 13 Tregouet DA, Escolano S, Tiret L, Mallet A, Golmard JL. A new
algorithm for haplotype-based association analysis: the
Stochastic-EM algorithm. Ann Hum Genet 2004; 68: 165–177.
14 Tregouet DA, Barbaux S, Escolano S, Tahri N, Golmard JL, Tiret L
Acknowledgements
et al. Specific haplotypes of the P-selectin gene are associated with
myocardial infarction. Hum Mol Genet 2002; 11: 2015–2023.
The Lille and Toulouse MONICA population studies were 15 Janowski BA, Willy PJ, Devi TR, Falck JR, Mangelsdorf DJ. An
supported by Grants from the Conseil Régional du Nord-Pas oxysterol signalling pathway mediated by the nuclear receptor
LXR alpha. Nature 1996; 383: 728–731.
de Calais, ONIVINS, Parke-Davis Laboratory, the Mutuelle
16 Costet P, Luo Y, Wang N, Tall AR. Sterol-dependent transactiva-
Générale de l’Education Nationale (MGEN), the Groupe tion of the ABC1 promoter by the liver X receptor/retinoid X
Fournier, the Réseau National de Santé Publique, the receptor. J Biol Chem 2000; 275: 28240–28245.

International Journal of Obesity

 NR1H3 polymorphisms and metabolic syndrome
V Legry et al
428
17 Venkateswaran A, Laffitte BA, Joseph SB, Mak PA, Wilpitz DC, 21 Zhang Y, Repa JJ, Gauthier K, Mangelsdorf DJ. Regulation of
Edwards PA et al. Control of cellular cholesterol efflux by the lipoprotein lipase by the oxysterol receptors, LXRalpha and
nuclear oxysterol receptor LXR alpha. Proc Natl Acad Sci USA LXRbeta. J Biol Chem 2001; 276: 43018–43024.
2000; 97: 12097–12102. 22 Lund EG, Peterson LB, Adams AD, Lam MH, Burton CA,
18 Repa JJ, Turley SD, Lobaccaro JA, Medina J, Li L, Lustig K Chin J et al. Different roles of liver X receptor alpha and
et al. Regulation of absorption and ABC1-mediated efflux beta in lipid metabolism: effects of an alpha-selective and a
of cholesterol by RXR heterodimers. Science 2000; 289: dual agonist in mice deficient in each subtype. Biochem Pharmacol
1524–1529. 2006; 71: 453–463.
19 Rigamonti E, Helin L, Lestavel S, Mutka AL, Lepore M, 23 Jensen MK, Pai JK, Mukamal KJ, Overvad K, Rimm EB. Common
Fontaine C et al. Liver X receptor activation controls intracellular genetic variation in the ATP-binding cassette transporter A1, plasma
cholesterol trafficking and esterification in human macrophages. lipids, and risk of coronary heart disease. Atherosclerosis 2007, in press.
Circ Res 2005; 97: 682–689. 24 Sviridov D, Nestel PJ. Genetic factors affecting HDL levels,
20 Mak PA, Laffitte BA, Desrumaux C, Joseph SB, Curtiss LK, structure, metabolism and function. Curr Opin Lipidol 2007; 18:
Mangelsdorf DJ et al. Regulated expression of the apolipoprotein 157–163.
E/C-I/C-IV/C-II gene cluster in murine and human macrophages. 25 Kozak M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator
A critical role for nuclear liver X receptors alpha and beta. codon enhance translation in mammalian cells. J Mol Biol 1987;
J Biol Chem 2002; 277: 31900–31908. 196: 947–950.

Supplementary Information accompanies the paper on International Journal of Obesity website ([Link]
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

International Journal of Obesity

 Résultats

II.2. Synthèse des résultats de l’article

Nous avons sélectionné les SNPs du gène NR1H3 selon les données du NCBI et de
HapMap disponibles en 2005. Seuls 3 SNPs étaient décrits sur HapMap (rs12221497,
rs2279238, rs7120118). Nous avons alors sélectionné 7 SNPs à partir de la base de
données du NCBI (dont les 3 SNPs décrits dans HapMap) en fonction de leur fréquence
(>8%) et de leur fonctionnalité potentielle. Après avoir génotypé une centaine d’individus pris
au hasard dans l’échantillon MONICA Lille, nous avons construit la carte de DL qui nous a
permis d’identifier 3 tag-SNPs résumant les 7 SNPs : rs12221497 (-115G>A), rs11039155
(-6G>A) et rs2279239 (intron 2 T>C). Nous avons alors réalisé des études d’association
entre ces 3 SNPs et le risque de syndrome métabolique dans les échantillons MONICA Lille
et Toulouse (voir leurs caractéristiques dans le chapitre III.1. des Matériels et Méthodes
page 80).
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

L’allèle -6A du rs11039155 (MAF 0,11) est associé à une diminution du risque de
syndrome métabolique dans les 2 échantillons MONICA Lille (OR=1,68) et Toulouse
(OR=1,70) ainsi qu’à une augmentation du taux plasmatique de HDL-cholestérol dans
l’échantillon combiné. De plus, l’allèle -115A du rs12221497 est associé à une augmentation
du risque de syndrome métabolique dans l’échantillon MONICA Lille (OR=1,44) mais cette
association n’a pas été retrouvée dans l’échantillon MONICA Toulouse.
Comme le SNP rs12221497 est situé dans l’intron 1 du gène NR1H3 (115 pb en
amont de l’ATG) et le SNP rs11039155 est situé dans le 5’UTR (6 pb en amont de l’ATG),
nous avons émis l’hypothèse qu’ils pourraient tous deux moduler l’expression du gène
NR1H3 et par conséquent l’expression des gènes cibles de LXRα. Etant donné le rôle des
macrophages dans le transport inverse du cholestérol, nous avons testé la fonctionnalité de
ces SNPs dans des cultures primaires de macrophages humains traitées ou non par le
TO901317 (agoniste synthétique des LXRs). Nous avons alors comparé le niveau
d’expression des gènes NR1H3 et ABCA1 (gène cible connu de LXRα impliqué dans l’efflux
du cholestérol) au niveau ARNm par rétro-transcription PCR quantitative en temps réel. A
l’état basal, nous n’avons pas détecté de différence significative de l’expression de NR1H3
entre les groupes de génotypes. L’activation des LXRs par le TO901317 augmente
l’expression de NR1H3 et de ABCA1 de manière similaire entre les groupes de génotypes.
Nous n’avons donc pas détecté d’impact significatif des SNPs rs12221497 et rs11039155
sur l’expression de NR1H3 et ABCA1 au niveau ARNm.

94
 Résultats

II.3. Etudes fonctionnelles complémentaires non publiées

II.3.a. Dans les cultures primaires de macrophages humains

De même que pour ABCA1, nous avons comparé l’expression de FAS (autre gène
cible connu de LXRα dans les macrophages) au niveau ARNm entre les groupes de
génotypes déterminés par le rs12221497 (-115G>A) ou le rs11039155 (-6G>A) dans les
cultures de macrophages humains traitées ou non au TO901317 (Figure 27). L’activation des
LXRs augmente, comme attendu l’expression de FAS (5-6 fois) mais aucune différence
significative entre les groupes de génotype n’a été détectée.
Le SNP rs11039155 (-6G>A) est situé dans la séquence Kozak jouant un rôle
important dans l’initiation de la traduction [Kozak 1987]. Ce SNP pourrait donc affecter
l’efficacité de la traduction et ainsi entraîner une différence au niveau de la quantité de
protéine LXRα. Nous avons alors extrait les protéines totales des cultures de macrophages
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

afin de réaliser des western blots sur les protéines LXRα et de comparer la quantité de
protéines LXRα produites entre les groupes de génotypes déterminés par le rs11039155
(-6G>A) (Figure 28). Nous avons bien retrouvé l’activation de l’expression de LXRα par le
TO901317 au niveau protéique, mais nous n’avons pas détecté de différence significative
entre les allèles du rs11039155 (-6G>A) au niveau basal ou en présence du ligand.

II.3.b. Etude de l’activité du promoteur de NR1H3 dans un vecteur

rapporteur
Nous avons réalisé des analyses in silico à l’aide du logiciel Genomatix
([Link]) afin de voir si les SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A)
modifient des sites potentiels de fixation de facteurs de transcription. D’après ces analyses,
l’allèle -115A du rs12221497 crée un site potentiel de fixation pour NERF/ELF2 (new Ets-
related factor / E74-like factor 2) (Figure 29). Le rôle de ce facteur de transcription est assez
mal connu, mais il semble être impliqué dans la régulation de l’expression des gènes
spécifiques des lymphocytes B et T [Oettgen et al. 1996], dans le développement des
vaisseaux sanguins et le remodelage vasculaire [Gaspar et al. 2002] et dans la prolifération
cellulaire et le développement des métastases [Qiu et al. 2008; Zhang et al. 2007; Cho et al.
2004]. Il existe 3 isoformes (issues du même gène) NERF1a, NERF1b et NERF2, qui sont
exprimées dans de nombreux tissus, notamment le foie, le tissu adipeux, l’intestin, le
pancréas, la rate et les macrophages. LXRα et NERFs sont donc exprimés dans des tissus
communs et nous avons émis l’hypothèse que NERF pouvait réguler l’expression de LXRα.
Afin d’évaluer l’impact des SNPs rs12221497 (-115G>A) et le rs11039155 (-6G>A)
sur l’activité transcriptionnelle du promoteur de NR1H3 à l’état basal ainsi qu’en présence

95
 Résultats

des facteurs de transcription NERFs, nous avons cloné un fragment d’ADN (nommé
LXRAprom) contenant ces 2 SNPs dans le vecteur rapporteur luciférase pGL3 basic
(Promega) (Figure 30). Par mutagenèse dirigée, nous avons obtenu les 4 formes
haplotypiques du fragment cloné : -115G/-6G (les 2 allèles fréquents), -115A/-6G, -115G/-6A
et -115A/-6A (les 2 allèles rares).
Dans un premier temps, nous avons transfecté les vecteurs pGL3 basic (vide) ou
pGL3 basic-LXRAprom G/G dans les cellules COS-7 (lignée cellulaire de rein de singe)
connue pour être facilement transfectable. Le dosage de l’activité luciférase (rapportant
l’activité de l’insert) a révélé que le fragment LXRAprom a une faible activité
transcriptionnelle (à peine le double de celle du vecteur pGL3 basic vide) (Figure 31 A).
Nous avons alors sous-cloné les 4 formes haplotypiques du fragment LXRAprom dans les
vecteurs pGL3 enhancer et promoter (Promega) (Figure 30). Le vecteur pGL3 enhancer-
LXRAprom avait encore une activité luciférase trop faible, nous conduisant à ne garder que
le pGL3 promoter pour nos expériences.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Nous avons alors transfecté les vecteurs pGL3 promoter vide, LXRAprom G/G, G/A,
A/G ou A/A dans les cellules HepG2 (lignée d’hépatome humain) car LXRα est connu pour
être exprimé de manière abondante dans le foie. Nous avons co-transfecté les vecteurs
d’expression pCI-NERF1a, NERF1b et NERF2 provenant du Dr Oettgen (Boston, USA)
[Oettgen et al. 1996]. A l’état basal (sans ajout des vecteurs d’expression des NERFs), le
vecteur pGL3 promoter-LXRAprom présente une activité transcriptionnelle au même niveau
que le vecteur pGL3 promoter vide (Figure 31 B). L’ajout des vecteurs d’expression de
NERF1a et NERF1b tend à inhiber un peu l’expression de LXRAprom (ns) tandis que
NERF2 semble l’augmenter (ns). Nous n’avons pas détecté de différence entre les 4
haplotypes, que ce soit à l’état basal ou en présence des vecteurs d’expression des NERFs.
Nous avons également transfecté les vecteurs pGL3 promoter vide, LXRAprom G/G,
G/A, A/G ou A/A dans les cellules HeLa (lignée humaine de carcinome du col de l’utérus),
type cellulaire n’exprimant pas de façon endogène les NERFs [Oettgen et al. 1996]. Là non
plus, nous n’avons pas détecté de différence entre les haplotypes au niveau basal ou en
présence des vecteurs d’expression des NERFs (Figure 31 C). On peut relever que NERF2
active l’expression de l’ensemble des vecteurs pGL3 promoter-LXRAprom (p=0,004).

En conclusion, nous n’avons pas mis en évidence d’impact des SNPs

α (ou de
rs12221497 (-115G>A) et le rs11039155 (-6G>A) sur l’expression de LXRα
certains de ses gènes cibles) dans les différents modèles utilisés.

96
 Résultats

II.4. Etudes d’association complémentaires non publiées

II.4.a. Etude d’association des SNPs rs12221497 et rs11039155 dans

l’étude HELENA
Dans l’étude MONICA, nous avons montré que les SNPs rs12221497 (-115G>A),
rs11039155 (-6G>A) et rs2279239 (intron 2 T>C) couvrent la variabilité génétique connue du
gène NR1H3. Notre étude [Legry et al. 2008] et celle de Robitaille et al [Robitaille et al. 2007]
ont montré que les SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A) sont associés à
des variations du profil lipidique plasmatique. De plus, Dahlman et al [Dahlman et al. 2006]
ont décrit que le SNP rs2279238, en DL parfait (r²=1) avec le SNP rs11039155 (-6G>A), est
associé à une diminution de l’IMC. Nous avons alors génotypé les 1155 adolescents de
l’étude HELENA composée de 1155 adolescents (voir leurs caractéristiques dans le chapitre
III.3 des Matériels et Méthodes page 82) pour les 3 SNPs rs12221497 (-115G>A),
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

rs11039155 (-6G>A) et rs2279239 (intron 2 T>C).

Nous avons comparé les moyennes des paramètres anthropométriques et lipidiques
entre groupe de génotypes. Pour le SNP rs2279239 (intron 2 T>C), tout comme dans
MONICA, aucune association significative n’a été observée. Au contraire, les SNPs
rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A) sont significativement associés au taux
plasmatique de HDL-cholestérol : les porteurs de l’allèle -115A du rs12221497 présentent un
taux plasmatique de HDL-cholestérol plus bas que les individus GG (1,39 ± 0,28 versus 1,44
± 0,27 mmol/L, p=0,016), tandis que les porteurs de l’allèle -6A du rs11039155 présentent un
taux plasmatique de HDL-cholestérol plus élevé que les individus GG (1,47 ± 0,28 versus
1,42 ± 0,27 mmol/L, p=0,006) (Tableau 16). Le fait que les deux allèles mineurs -115A et -6A
soient associées à des effets opposés est sûrement dû à leur DL négatif (D’=-1, r²=0.02). Par
ailleurs, l’allèle -115A est associé à une augmentation du taux plasmatique en ApoB (0,67 ±
0,16 chez les porteurs de l’allèle -115A versus 0,65 ± 0,16 chez les GG, p=0,042).

En conclusion, nous avons confirmé l’association du SNP rs11039155 (-6G>A)

avec le taux plasmatique de HDL-cholestérol dans l’étude HELENA. Ces résultats
suggèrent que les SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A) modulent le
profil lipidique dès l’adolescence.

II.4.b. Etude d’association des SNPs rs12221497 et rs11039155 dans

l’étude MONEUR
Puisque les SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A) sont associés au
risque de syndrome métabolique dans l’étude MONICA via leur effet sur les HDL-cholestérol

97
 Résultats

et au taux plasmatique de HDL-cholestérol dans l’étude HELENA, que le syndrome

métabolique est lui-même associé à un risque accru de MCV (OR=2,18 [Gami et al. 2007]) et
que le taux plasmatique de HDL-cholestérol est un facteur prédictif du risque de MCV, nous
avons émis l’hypothèse que ces SNPs pouvaient moduler directement le risque de MCV.
Nous avons alors génotypé les individus de l’étude cas-témoins reconstituée MONEUR,
constituée de 585 patients atteint de coronaropathie aiguë provenant des études
EUROASPIRE I et II et de 585 témoins provenant de l’étude MONICA (voir leurs
caractéristiques dans les chapitres III.2.a. et III.2.b. des Matériels et Méthodes, page 81)
pour ces 2 SNPs.
Nous avons comparé les fréquences génotypiques des ces 2 SNPs entre patients
coronariens, ainsi que le sous-groupe de patients ayant eu un infarctus du myocarde
(n=350), et les témoins (Tableau 17). Nous n’avons pas détecté de différence des
fréquences génotypiques entre cas et témoins. Nous avons calculé le risque de
coronaropathie aiguë ou d’infarctus du myocarde, mais là encore nous n’avons pas détecté
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

d’impact significatif de ces 2 SNPs.

En conclusion, nous n’avons pas mis en évidence d’association des SNPs

rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A) sur le risque de coronaropathie dans
l’étude MONEUR.

II.5. Discussion

Nous avons donc montré que la variabilité génétique du gène NR1H3 est associée au
taux plasmatique de HDL-cholestérol dans 2 études différentes : le SNP rs11039155
(-6G>A) est associé à une augmentation du taux plasmatique de HDL-cholestérol chez les
adultes de l’étude MONICA et les adolescents de l’étude HELENA, tandis que le SNP
rs12221497 (-115G>A) est associé à une diminution du taux plasmatique de HDL-cholestérol
uniquement dans l’étude HELENA. Ces derniers résultats sont relativement cohérents avec
l’étude de Robitaille et al dans laquelle l’allèle -115A est associé à une augmentation des
taux plasmatiques de TG et de cholestérol total [Robitaille et al. 2007]. Dans une récente
GWAS, les SNPs rs2167079 (situé 10 kpb en amont de NR1H3) et rs7120118 (intron 6) sont
associés à une augmentation du taux de HDL-cholestérol [Sabatti et al. 2009]. Le SNP
rs7120118 (intron 6) est en DL parfait avec le rs2279239 (intron 2 T>C) dans l’étude
MONICA (Figure 1 de l’article). Contrairement à cette étude, nous n’avons pas trouvé
d’association significative entre le rs2279239 et le taux plasmatique de HDL-cholestérol ni
dans l’étude MONICA, ni dans l’étude HELENA. Par ailleurs, dans la récente GWAS
d’Aulchenko et al, le locus MADD-FOLH1 est associé au taux plasmatique de HDL-

98
 Résultats

cholestérol [Aulchenko et al. 2009]. Les auteurs de cette étude suggèrent que l’effet de ce
locus pourrait en fait être expliqué par NR1H3, situé à 500 pb du locus associé. L’ensemble
de ces études génétiques s’accorde pour dire que le locus NR1H3 semble moduler le taux
plasmatique de cholestérol.
Ces résultats sont parfaitement concordants avec le rôle important que joue LXRα
dans le métabolisme du cholestérol, notamment dans le transport inverse du cholestérol.
D’abord, dans les tissus périphériques, les LXRs stimulent (i) la captation du cholestérol par
les macrophages en activant l’expression des gènes codant l’ApoE, la LPL et la cavéoline-1
[Bultel et al. 2008] (ii) la mobilisation du cholestérol intracellulaire en activant l’expression
des gènes NPCs [Rigamonti et al. 2005] et (iii) l’efflux du cholestérol en activant l’expression
des gènes ABCA1, ABCG1, ApoE/C-I/C-IV/C-II et ApoA-IV [Willy et al. 1995; Costet et al.
2000; Fayos et al. 1994; Laffitte et al. 2001b; Mak et al. 2002; Liang et al. 2004a]. De plus,
les LXRs participent au remodelage des lipoprotéines plasmatiques en activant l’expression
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

des gènes codant la PLTP, la CETP et la LPL [Cao et al. 2002; Laffitte et al. 2003b; Luo et
al. 2000]. En particulier, LXRα est nécessaire à l’activation de l’expression de la LPL
permettant la captation du cholestérol par le foie [Zhang et al. 2001]. Les LXRs favorisent
également l’excrétion du cholestérol du foie vers l’intestin en activant l’expression des
transporteurs ABCG5 et ABCG8 [Yu et al. 2003; Repa et al. 2002; Yu et al. 2002] et
empêchent l’absorption du cholestérol intestinal en inhibant l’expression du gène NPC1L1
[Altmann et al. 2004; Duval et al. 2006], permettant ainsi l’excrétion du cholestérol par les
fèces.
LXRα joue un rôle important dans la régulation de la lipogenèse hépatique. En effet,
LXRα induit l’expression des gènes lipogéniques SREBP1c, FAS, SCD et ChREBP [Eberle
et al. 2004; Chu et al. 2006; Joseph et al. 2002a; Talukdar et al. 2006; Cha et al. 2007]. Nous
n’avons pas trouvé d’association entre les 3 SNPs couvrant la variabilité génétique connue
de NR1H3 et le taux plasmatique de TG ni dans l’étude MONICA, ni dans l’étude HELENA.
Seule l’étude de Robitaille et al a décrit une association entre le SNP rs12221497 (-115G>A)
et le taux plasmatique de TG [Robitaille et al. 2007]. De même, LXRα semble jouer un rôle
non négligeable dans l’homéostasie glucidique puisqu’il inhibe directement l’expression des
gènes clés de la gluconéogenèse (PEPCK, G6Pase, FBPase) [Stulnig et al. 2002b;
Grempler et al. 2005] et induit l’expression de GLUT4 dans le TA, permettant la captation du
glucose [Dalen et al. 2003]. Nous n’avons pas trouvé d’association entre les 3 SNPs étudiés
et les paramètres lipidiques (glycémie, insulinémie et HOMA-IR) ni dans l’étude MONICA, ni
dans l’étude HELENA. L’étude de Dahlman et al ne décrit pas non plus d’association avec
ces paramètres glucidiques (n=2041 non diabétiques) ou le risque de DT2 (n=988 cas et 941
témoins) [Dahlman et al. 2009].

99
 Résultats

Dahlman et al ont décrit une association entre le SNP rs2279238, en DL parfait (r²=1)
avec les SNP rs11039155 (-6G>A) et une diminution de l’IMC chez 559 femmes [Dahlman et
al. 2006]. Ce résultat est cohérent avec le rôle potentiel de LXRα dans le métabolisme du
TA. En effet, LXRα est un gène cible de PPARγ et favorise l’accumulation de lipides dans les
adipocytes [Chawla et al. 2001; Darimont et al. 2006; Juvet et al. 2003]. Cependant, nous
n’avons pas trouvé d’association avec le risque d’obésité ou les paramètres
anthropométriques ni dans l’étude MONICA, ni dans l’étude HELENA. De plus, Dahlman et
al n’ont pas non plus retrouvé l’association entre le rs2279238 et l’IMC chez 1721 individus
normo-glycémiques [Dahlman et al. 2009], suggérant que l’association de ce SNP chez les
559 femmes était sans doute biaisée.
Le processus de l’athérosclérose commence très tôt dans la vie, processus selon
lequel des stries lipidiques dans l’enfance peuvent évoluer en plaques athéromateuses dès
l’adolescence et à l’âge adulte [Williams et al. 2002]. Un taux plasmatique de HDL-
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

cholestérol anormalement bas (<1,0 mmol/L) est un facteur prédictif de MCV chez les
hommes comme chez les femmes. A chaque diminution de 0,025 mmol/L (1 mg/dL), le
risque de coronaropathie augmente de 2 à 3 % [Gordon et al. 1989]. De plus, un taux
plasmatique élevé de HDL-cholestérol (≥ 1,50 mmol/L) est associé à une diminution du
risque cardiovasculaire [2002]. Comme les SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155
(-6G>A) sont associés au taux plasmatique de HDL-cholestérol dès l’adolescence et que les
LXRs ont des propriétés anti-athérosclérotiques [Joseph et al. 2002b; Terasaka et al. 2003;
Levin et al. 2005], nous avons étudié l’impact de ces SNPs sur le risque de coronaropathie
dans l’étude MONEUR. Nous n’avons pas détecté d’association entre les SNPs rs12221497
(-115G>A) ou rs11039155 (-6G>A) et le risque de coronaropathie ou d’infarctus du
myocarde dans cette étude. La récente GWAS de Willer et al n’a pas non plus décrit
d’association entre des SNPs localisés à proximité du gène NR1H3 et le risque de
coronaropathie (n=1 926 cas et 12 301 témoins) [Willer et al. 2008]. Aucune étude ne
suggère donc à ce jour, un impact de la variabilité génétique de NR1H3 sur le risque de
MCV.
Dans notre étude d’association portant sur l’étude MONICA (article), nous avons
décrit que les SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A) sont associés au risque
de syndrome métabolique dans l’échantillon MONICA Lille, ainsi que dans l’échantillon
MONICA Toulouse pour le rs11039155 (-6G>A). Ces résultats ont été obtenus en
considérant les critères de diagnostic du NCEP modifiés par l’AHA en 2005. Nous avons
également estimé le risque de syndrome métabolique selon d’autres définitions. Si l’on
considère celle de l’IDF, les résultats pour les 2 SNPs sont très semblables à ceux décrits
dans l’article. Les critères du NCEP/AHA et de l’IDF sont en effet similaires au niveau des
paramètres lipidiques (Tableau 1), auxquels sont d’ailleurs associés rs12221497 et

100
 Résultats

rs11039155. Le SNP rs11039155 (-6G>A) tend également à être associé au syndrome

métabolique selon la définition de l’OMS (OR=0,82, p=0,15 dans les échantillons Lille et
Toulouse combinés) mais pas du tout selon la définition de l’EGIR (OR=1,00, p=0,99). Or, la
définition de l’EGIR est la seule des 4 définitions à exclure les individus diabétiques. Comme
le SNP rs11039155 (-6G>A) tend aussi à être associé au risque de DT2 (OR=0,78 [0,54-
1,14] p=0,21 dans les échantillons Lille et Toulouse combinés), l’absence des individus
diabétiques dans la définition du syndrome métabolique par l’EGIR pourrait en partie
masquer l’effet de l’allèle -6A. Concernant le SNP rs12221497 (-115G>A), l’association avec
le syndrome métabolique disparaît si les définitions de l’EGIR et de l’OMS sont utilisées
(OR=1,02, p=0,94 et OR=0,94, p=0,72, dans l’échantillon MONICA Lille, respectivement).
Ces 2 définitions mettent l’accent sur le désordre glucidique en en faisant un critère
obligatoire, et accordent moins d’importance aux paramètres lipidiques, en considérant les
taux de HDL-cholestérol et de TG comme 1 seul paramètre, que les définitions du
NCEP/AHA et de l’IDF (Tableau 1). Or ce SNP n’a aucun effet sur l’homéostasie glucidique
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

et le risque de DT2 (OR=1,01, p=0,97 dans MONICA Lille). L’association du rs12221497

avec le syndrome métabolique selon le NCEP pourrait donc refléter son effet sur le
métabolisme lipidique. Ainsi, les associations des SNPs du gène NR1H3 avec le risque de
syndrome métabolique dépendent de la définition utilisée, en particulier de l’importance
accordée aux paramètres lipidiques.

Les SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A) sont situés dans la région
5’ proximale du gène et pourraient donc moduler l’expression de NR1H3. Le SNP
rs11039155 (-6G>A) est situé dans le 5’UTR, 6 pb en amont de l’ATG, dans la séquence
Kozak. Cette séquence joue un rôle important dans la traduction puisqu’elle permet
l’assemblage de la petite sous-unité ribosomique à l’ARNm [Kozak 1987]. Le fait que la
séquence entourant le codon d’initiation AUG dans le gène NR1H3 (GAAGAGATGT) soit
relativement éloigné de la séquence consensus Kozak (GACACCATGG) renforce
l’hypothèse que le SNP -6G>A pourrait altérer l’efficacité de traduction, puisque Kozak a
montré qu’une mutation en -6 a plus d’impact en l’absence d’une adénine en position -3 et
d’une guanine en position +4 [Kozak 1987]. Par ailleurs, nos analyses in silico ont suggéré
que le SNP rs12221497 (-115G>A) modifiait un site potentiel de fixation pour les facteurs de
transcription NERFs (l’allèle A créant un site potentiel). Nous avons alors employé 2
méthodes pour mettre en évidence la fonctionnalité de ces SNPs. La première a consisté à
comparer le niveau d’expression de NR1H3 et de ses gènes cibles dans des cultures
primaires de macrophages humains. Cependant, nous n’avons pas détecté d’impact
significatif des 2 SNPs ni sur l’expression de NR1H3, ABCA1 et FAS au niveau ARNm, ni sur
l’expression de LXRα au niveau protéique. Si l’on regarde d’un peu plus près la Figure 2.a

101
 Résultats

de l’article, il semblerait que les 2 SNPs soient associés à une légère diminution (-20%
environ) de l’expression à l’état basal (sans TO901317). Mais la variabilité interindividuelle
est trop grande pour que cette différence soit significative. Cela constitue l’une des limites de
cette étude. De plus, il n’est pas possible d’avoir accès aux données, telles que l’âge et le
sexe des donneurs de monocytes, qui auraient pu aider à comprendre cette variabilité entre
donneurs. Etant donné l’effet escompté de ces SNPs (20%) et la variabilité interindividuelle
observée, il faudrait plus de 150 échantillons pour avoir la puissance suffisante et mettre en
évidence un effet significatif de ces SNPs. Toutefois, il serait intéressant de comparer le
niveau d’expression de NR1H3 et de ses gènes cibles entre les allèles des SNPs
rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A) dans d’autres tissus, comme le foie ou le
tissu adipeux par exemple. Cependant, ces tissus sont plus difficiles à obtenir.
La seconde méthode a consisté à comparer l’activité transcriptionnelle du promoteur
proximal de NR1H3 entre les allèles des 2 SNPs en utilisant un vecteur rapporteur
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

luciférase. Nous avons transfecté les cellules HepG2 (car LXRα est exprimé de manière
abondante dans le foie) et les cellules HeLa (car les facteurs de transcription NERFs n’y sont
pas exprimés) avec les vecteurs rapporteurs luciférase ± les vecteurs d’expression des
NERFs. Nous n’avons pas détecté de différence entre les allèles -115G et -115A ou -6 G et
-6A à l’état basal ou lorsque les facteurs de transcription NERFs étaient surexprimés. La
limite de cette étude réside en le fait que le fragment du gène NR1H3 que nous avons cloné
(comprenant les 1284 pb en amont de l’ATG) n’a pas montré d’activité promotrice, et c’est
peut-être pour cela que nous n’avons pas vu d’impact des SNPs. Il faudrait peut-être cloner
les 4 kpb en 5’ de l’ATG afin que le fragment contienne l’ensemble du promoteur et
notamment les sites LXRE et PPRE importants pour l’activation de la transcription de NR1H3
[Laffitte et al. 2001a]. Enfin, on ne peut pas exclure que les SNPs rs12221497 (-115G>A) et
rs11039155 (-6G>A) ne soient pas les SNPs causaux. Le SNP rs11039155 (-6G>A) est un
tag SNP, en DL parfait avec les SNPs rs2279238 (Ser99Ser) et rs1449626 (en 3’
intergénique). Les associations observées en population pourraient donc aussi bien être
causées par ces 2 SNPs ou encore un autre SNP non décrit dans les bases de données.
C’est aussi le cas pour le SNP rs12221497 (SNP indépendant des autres SNPs étudiés).

En conclusion, nous avons montré que deux polymorphismes, situés dans le

promoteur proximal de NR1H3, sont associés à des variations du taux de HDL-
cholestérol chez les adolescents et les adultes et au risque de syndrome métabolique
chez les adultes. Cependant, ils ne semblent pas être associés au risque de maladie
coronaire. Enfin, la fonctionnalité de ces polymorphismes reste à élucider.

102
 Résultats

β
III. Etude du gène NR1H2 codant LXRβ

III.1. Contexte de l’étude

LXRβ est un récepteur nucléaire, activé par des dérivés du cholestérol, comme LXRα.
Il est codé par le gène NR1H2 dont l’expression est ubiquitaire, contrairement à celle de
LXRα [Repa et al. 2000b]. Comme il l’a été détaillé dans les chapitres V.2.a et V.2.b de
l’Introduction (pages 58-64), LXRβ régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans le
métabolisme du cholestérol, au même titre que LXRα, et favorise ainsi le transport inverse
du cholestérol des tissus périphériques vers le foie et son élimination par les fèces
[Baranowski 2008; Bradley et al. 2007]. LXRβ est également impliqué dans le métabolisme
du TA et semble être nécessaire à la croissance des adipocytes [Gerin et al. 2005]. A la
différence de LXRα, LXRβ ne stimule pas la lipogenèse hépatique [Alberti et al. 2001] et
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

apparaît ainsi comme une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de

l’athérosclérose [Quinet et al. 2006]. Par ailleurs, LXRβ est la seule isoforme exprimée dans
les cellules β du pancréas [Zitzer et al. 2006] et semble être requise pour la sécrétion
d’insuline [Gerin et al. 2005]. LXRβ est donc impliqué dans plusieurs voies métaboliques
participant au développement du syndrome métabolique. Etant donné que l’expression de
LXRβ est ubiquitaire, des polymorphismes génétiques du gène NR1H2 pourraient alors
affecter le métabolisme de nombreux tissus et c’est pourquoi NR1H2 représente un gène
candidat pertinent pour l’identification de facteurs de susceptibilité génétique aux maladies
métaboliques.

103
 Manuscrit en cours de préparation

Liver X receptor β polymorphisms in type 2 diabetes mellitus and obesity

–a three cohort study; the Norwegian HUNT 2, the French MONICA and
the European HELENA-CSS

Karianne Solaas1,2*, Vanessa Legry3*, Kjetil Retterstol4, Kirsten B Holven2, Jean

Ferrières5, Philippe Amouyel3, Helge Rootwelt6, Paul R Berg7, Sigbjorn Lien7, Serena
Tonstad8, Bente L Halvorsen9, Marit S Nenseter9, Jara Valtueña10, Javier Romeo11, Kurt
Widhalm12, Jonatan R. Ruiz13, Jean Dallongeville3, Kåre I Birkeland1, Per M Thorsby14,
Aline Meirhaeghe3#, Hilde I Nebb2#

1
Department of Endocrinology, Oslo University Hospital, Aker, Oslo, Norway. 2Department
of Nutrition, Faculty of Medicine, University of Oslo, Oslo, Norway. 3INSERM, U744;
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Institut Pasteur de Lille, Univ. Lille Nord de France; UDSL; Lille, France. 4The Lipid Clinic,
Oslo University Hospital, Rikshospitalet, Oslo, Norway. 5Department of Cardiology,
Toulouse University School of Medicine, Rangueil Hospital, Toulouse, France. 6Department
of Medical Biochemistry, Oslo Univsersity Hospital, Rikshospitalet, Oslo, Norway. 7Centre
for Integrative Genetics, The Norwegian University of Life Sciences, Aas, Norway.
8
Department of Preventive Medicine, Oslo University Hospital, Ulleval, Norway. 9Research
Insitute for Internal Medicine, Oslo University Hospital, Rikshospitalet, Oslo, Norway.
10
Facultad de Ciencias de la Actividad Fisica y del Deporte- INEF, Universidad Politécnica de
Madrid, Madrid, Spain. 11Immunonutrition group, Department of Metabolism and Nutrition,
Institute Frio-ICTAN, Spanish Scientific Research Council, Madrid, Spain. 12Department of
Pediatrics, Division of Clinical Nutrition and Prevention, Medical University of Vienna, 1090
Vienna, Austria. 13Unit for Preventive Nutrition, Department of Biosciences and Nutrition at
NOVUM, Karolinska Institutet, 14157 Stockholm, Sweden. 14The Hormone Laboratory, Oslo
University Hospital, Aker, Oslo, Norway.

* These authors contributed equally to this work.

-1-
 #Joint corresponding authors:
Professor Hilde I Nebb Dr Aline Meirhaeghe
Department of Nutrition INSERM U744
Faculty of Medicine Insitut Pasteur de Lille
University of Oslo 1 rue du Pr Calmette,
PObox 1046 Blindern BP 245
NO-0316 Oslo Lille F-59019
Norway France
Phone: +47 22851510 Phone: +33 3 20 87 73 91………
Fax: +47 22851341 Fax: + + 33 3 20 87 78 94………
E-mail: [Link]@[Link] E-mail: [Link]-Hurez@[Link]
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Abbreviated title: LXRβ polymorphisms in type 2 diabetes mellitus and obesity

Abbreviations:
LXR, liver X receptor; LXRE, liver X receptor response element; RXR, retinoid X receptor;
NR, nuclear receptor; SNP, single nucleotide polymorphism; HNF4, hepatic nuclear factor 4;
NF1, nuclear factor 1; T2D, type 2 diabetes mellitus; EMSA, electrophoretic mobility shift
assay; HUNT, The Nord-Trøndelag Health Study 2; GSR, genotyping success rate; TG,
triglyceride; ABCA1, ATP binding cassette transporter A1; SREBP-1c, sterol receptor
binding protein 1c; VLDL, very low density lipoprotein; HDL, high density lipoprotein; TF,
transcription factor; CVD, cardiovascular disease; GWA, genome wide association; BMI,
body mass index; OR, odds ratio; MAF, minor allele frequency.

-2-
 ABSTRACT
Background and aims
The liver X receptors α and β (LXRα and LXRβ, respectively) play important roles in the
control of lipid and carbohydrate homeostasis and inflammation in mice. LXRα and LXRβ
have similar protein structure and ligand binding, but somewhat different physiological
functions. LXRβ (nuclear receptor 1H2) is ubiquitously expressed and is the only isoform
expressed in pancreatic β-cells. It thus also has a prominent regulatory role in glucose
homeostasis. In the present study, we tested for association between five tagSNPs, capturing
all common variation in the LXRβ gene and risk of type 2 diabetes, obesity and related traits
in 5,141 adults and 1,155 adolescents from 2 population-based studies and a type 2 diabetes
case-control study.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Methods
We identified SNPs in the LXRβ gene by gene sequencing. Eleven SNPs with a minor allele
frequency above 5% could be minimized to 5 SNPs, based on the linkage disequilibrium. The
five LXRβ SNPs (rs17373080, rs2695121, rs56151148, rs2303044 and rs3219281) were
genotyped in participants from the nested case-control study for T2D (age 66 ± 14 y, n=835
cases/1986 controls) issued from the Norwegian HUNT 2 population-based study, the
MONICA Lille and Toulouse (age 35-65 y) population-based studies (n=2325) and the
European HELENA-Cross Sectional Study (age 12-18 y, n=1155). We tested for association
between each SNP and risk of diabetes or obesity using multivariate logistic regression, and
with continuous traits (BMI, waist-to-hip ratio, waist circumference, plasma glucose and
insulin levels, HOMA indexes, plasma HDL-cholesterol, LDL-cholesterol and triglyceride
levels) using multivariate linear regression. The potential functional disease associated SNPs
were analyzed in silico and in vitro.

Results
We identified an association between rs17373080 and on one hand with the risk of T2D
(OR=0.84, p=0.05) in the HUNT case-control study and on the other hand with the risk of
obesity in the MONICA population-based study (OR=1.26, p=0.05) and the risk of
overweight/obesity in the adolescent HELENA-CSS (OR=1.59, p=0.002). In silico analyses
showed that another SNP located in intron 4 (rs28514894, T>C change) – a perfect proxy for
rs17373080 – would create a binding site for the hepatic nuclear factor 4 alpha (HNF4α) and

-3-
 nuclear factor 1 (NF1A, B, C and X) transcription factors. In vitro electrophoretic mobility
shift assays (EMSA) showed that both HNF4α or NF1s could bind to the binding site, in a
similar manner whatever the allele (T or C). Cell transient transfections were also performed
to examine the impact of rs28514894 on LXRβ expression in JEG3 and HepG2 cells. Despite
a ~20% higher basal activity for the LXRβ fragment carrying the C allele compared with the T
allele, no difference in response to HNF4α or NF1s between the alleles could be detected.

Conclusion
Our results indicate that rs17373080 in the LXRβ gene is associated with T2D and obesity.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Key words:
LXR, SNP, polymorphism, type 2 diabetes, obesity, insulin resistance.

-4-
 INTRODUCTION

Liver X receptors (LXRs) are nuclear receptors involved in the control of lipid and
carbohydrate homeostasis as well as inflammation [reviewed in Bensinger SJ and Tontonoz P
2008; Baranowski M 2008; Zelcer N and Tontonoz P 2006]. LXRs consist of two isoforms,
LXRα (encoded by NR1H3) and LXRβ (encoded by NR1H2), sharing approximately 78%
amino acid identity (3). LXRα and β are encoded by separate genes, located on chromosome
11 (11p11.2) and 19 (19q13.3), respectively. High expression of LXRα is restricted to
metabolic active tissues like adipose tissue, intestine, liver, kidney and muscle, whereas
LXRβ is ubiquitously expressed (Lu TT et al. 2001). LXRβ is the only isoform expressed in
pancreatic β-cells [Zitzer H et al. 2006]. Both isoforms form obligate heterodimers with the
retinoid X receptor (RXR). The LXR-RXR heterodimers regulate gene expression by binding
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

to LXR response elements (LXREs) in the promoter regions of the target genes. Without any
ligand bound to it, the heterodimer recruits co-repressors. Upon ligand binding, a
conformation change occurs to exchange the co-repressor complex by a co-activator complex
for transcription of the target gene to take place [Hu X et al. 2003; Glass CK and Rosenfeld
MG. 2000]. The possibility of specific cofactors for transactivation of each LXR isoform have
been suggested [Mouzat K et al. 2007]. Most of the endogenous LXR ligands identified so far
activate both LXR isoforms. However, a few relatively selective LXRα ligands are described
[Janowski BA et al. 1999; Song C et al. 2000A; Song C et al. 2000B].
Despite the lack of widely available LXRβ specific ligands, the study of mice deficient
for either or both LXR isoforms has revealed important specific functions for LXRβ
[reviewed in Gabbi C et al. 2009]. LXRβ-/- mice exhibit markedly decreased glucose tolerance
due to impaired insulin secretion [Gerin I et al. 2005] and pancreatic islets isolated from
LXRβ-/- mice are characterized by significantly reduced basal and glucose-stimulated insulin
secretion [Zitzer H et al. 2006]. The stimulatory effect of LXR agonists on insulin secretion
seems to be mediated by regulation of both glucose and lipid metabolism in pancreatic β-cells
[Efanov AM et al. 2004; Zitzer H et al. 2006]. Interestingly, it has been suggested that chronic
increased activation of LXR may contribute to the dysfunction of pancreatic β-cells observed
in T2D [Choe SS et al. 2007]. LXRβ-/- mice fed a chow diet have reduced amounts of adipose
tissue, similar insulin sensitivity [Gerin I et al. 2005] and decreased hepatic and serum
triglyceride (TG) levels [Schuster GU et al. 2002, Gerin I et al. 2005] compared to wild type
(wt) mice. However, these mice are glucose intolerant due to impaired glucose-induced
insulin secretion. LXRβ-/- mice fed a high-fat diet are leaner with less gonadal fat pads

-5-
 compared to wt mice on the same diet [Gerin I et al. 2005]. In addition, it seems that the lack
of LXRβ is responsible for the lean phenotype observed in the double knock-out (KO) LXRα-
/-
β-/- mice [Gabbi C et al. 2009]. Thus, LXRβ most probably has a significant role in fat
metabolism regarding resistance in gaining weight. A diet containing 2% cholesterol seems to
affect LXRβ-/- mice similarly to wt mice [Schuster GU et al. 2002]. However, in a study
treating mice deficient in LXRα and/or LXRβ with dual or LXRα selective agonists, a
specific activation of LXRα or LXRβ was found to yield distinctive lipid outcome [Lund EG
et al. 2006]. Activation of LXRβ stimulated cholesterol efflux and increased HDL-cholesterol
without raising TG levels. In addition, in another study in which selective activation of LXRβ
was achieved by treatment of LXRα-/- mice with a dual agonist, an increased plasma HDL-
cholesterol level without significant changes in plasma TG or very low density lipoprotein
(VLDL) levels were observed [Quinet EM et al. 2006]. In a mechanistic perspective, genes
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involved in fatty acid and TG biosynthesis were not induced in liver, but in peripheral tissues,
the ABCA1 and SREBP-1c genes were induced. From these studies it seems possible that a
specific agonist of LXRβ would most probably raise plasma HDL-cholesterol levels and
stimulate cholesterol efflux from the body without causing hepatic TG accumulation, as
observed when treating wild type mice with a dual LXR agonist. Several potential strategies
for dissociating anti-atherosclerotic and anti-diabetic effects of LXR agonists from their
lipogenic effects have been proposed [Lund EG et al. 2003]. These strategies specifically
include development of LXRβ selective agonists. Thus, the above reviewed mice studies
show that LXRβ plays numerous roles in metabolic pathways involved in T2D, obesity, and
metabolic syndrome.
Regarding human studies, single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the LXRβ gene
have been so far associated with Alzheimer’s disease [Adighibe O et al. 2006; Rodríguez-
Rodríguez E et al. 2008; Infant J et al. 2008] in several studies and with obesity [Dahlman I et
al. 2006] and T2D [Dahlman I et al. 2009]. In the study associating LXRβ SNPs with obesity,
the LXRβ gene was sequenced in 24 obese and non-obese women to identify LXRβ SNPs in
which four were genotyped in the whole cohort [Dahlman I et al. 2006]. In the T2D study,
three SNPs covering 57% of the gene variability were genotyped in the cohorts [Dahlman I et
al. 2009].
In the present study, we identified SNPs in the LXRβ gene by direct sequencing from 96
individuals (males and females with and without metabolic syndrome) and designed a three
cohort study in order to test if the LXRβ SNPs are associated with T2D, obesity, or related
phenotypes. The identified disease-associated SNPs were analyzed for functionality in vitro.

-6-
 MATERIALS AND METHODS

Subjects
The HUNT 2 Study
The Nord-Trøndelag Health Study 2 (HUNT 2 Study) has been described elsewhere [Holmen
J et al. 2003; [Link] In brief, it is a large (n=65,905) population-based
health survey carried out in Norway during 1995–97. Nord-Trøndelag County (n=127,000) is
representative of rural Norway. The population has been geographically and ethnically stable
for several generations, with only 0,3% of non-Caucasian origin. All inhabitants ≥20 y were
invited and the attendance rate was 71%. Data were obtained from non-fasting blood samples,
physical tests, and from questionnaires covering e.g. medications, life style, and health-related
behaviour. Measurement of anthropometric, clinical and biochemical parameters have been
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described elsewhere [Thorsby PM et al. 2009]. From this sample, 1040 diabetic subjects were
randomly selected among 1972 individuals with self-reported diabetes (n=942) or with a non-
fasting serum glucose level >11.1 mmol/L (n=98). We also selected 2,080 age and gender-
matched non-diabetic control subjects, two for each case, with random serum glucose level
≤5.5 mmol/L. All patients who started insulin therapy within the first year of diagnosis of
diabetes or had serum level of anti-GAD ≥0.08 U/L were regarded as having a type 1 diabetes
and were excluded from the present analysis (n=171), resulting in a final number of 869 T2D
individuals who were slightly older than the controls (p=0.02) (see supplementary Table 1).
DNA extraction was performed using a salting out procedure [Miller SA et al. 1988]. The use
of data and DNA materials from the subjects in HUNT 2 for this publication was approved by
the Norwegian Regional Committee for Medical Research Ethics, Southern Region, the
Norwegian Social Data Services, and the Norwegian Directorate for Health and Social
Affairs.

The MONICA Study

Participants were recruited in the framework of the WHO-MONICA population survey
conducted from 1995 to 1997 in different regions of France: the Urban Community of Lille in
the North (Lille, n=1195) and the Haute-Garonne county in the South (Toulouse, n=1182).
The sample included individuals aged 35-65 years randomly selected on electoral rolls after
stratification by town size, gender and age to obtain 200 participants for each gender and 10-
year age group (WHO-MONICA Project protocol) [1994]. The Ethical Committee of each
centre approved the protocol. After signing an informed consent, participants were

-7-
 administered a standard questionnaire and physical measurements were made by a specially
trained nurse. Physical activity was defined as at least 15 min walk a day, and/or lifting or
carrying heavy objects at work daily, and/or doing sport or physical exercise more than 2 h a
week Current cigarette smokers were defined as individuals reporting at least one cigarette per
day. Total alcohol intake was expressed as the sum of ml alcohol per week from wine, beer,
cider and spirits. The anthropometric measurements included body weight (rounded to the
nearest even decimal), waist (at a level midway between lower rib margin and iliac crest; to
the nearest 0.5 cm) and were taken on individuals in light clothing without shoes. Body mass
index was calculated according to the Quetelet equation. Blood pressure was measured on the
right arm, with the subject in a sitting position and after a minimum 5-min rest, using a
standard mercury sphygmomanometer. The mean value of two consecutive blood pressure
readings was taken into account. The characteristics of the subjects from MONICA Lille and
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Toulouse samples have been described elsewhere [Cottel D et al. 2000].

The HELENA-CSS
Participants were recruited as part of the HELENA-CSS (Healthy Lifestyle in Europe
by Nutrition in Adolescence-Cross Sectional Study, [Link] performed
from 2006 to 2007 in 10 centres from 9 European countries (Athens and Heraklion in Greece,
Dortmund in Germany, Ghent in Belgium, Lille in France, Pècs in Hungary, Rome in Italy,
Västeras in Sweden, Vienna in Austria and Zaragoza in Spain) as previously described
[Moreno LA et al. 2008A] The protocol was approved by the appropriate ethics committee in
each centre. Written, informed consent was obtained from each subject and both of his/her
parents or legal representatives. Participation in the study was voluntary. The sample included
a total of 3865 adolescents (14.8 ± 1.4 y) recruited through their schools; the latter were
randomly selected according to a proportional cluster sampling methodology taking into
account geographical repartition within each city, private/public school ratio, and number of
classes by school [Moreno LA et al. 2008B]. In each centre, anthropometric measurements
(including weight, height, waist and hip circumferences) were taken by trained physicians
with the participants barefoot and in their underwear. Waist and hip circumferences were
measured three consecutive times and with a non-elastic tape (Seca 200) to the nearest 0.1 cm.
The body mass index (BMI) was calculated. The percentage of body fat (%BF) was estimated
from skin-fold measurements, according to Slaughter et al. [Slaughter MH et al. 1988].
In order to investigate clinical biochemistry assays and genetic analyses, one third of
the classes were randomly selected for blood collection, resulting in a total of 1155 subjects,

-8-
 whose characteristics have been described previously [Legry et al. 2009]. Blood samples were
drawn at school according to a standardised collection protocol (after a 10-hour overnight
fast), and were sent to a central laboratory (the Analytical Laboratory at the University of
Bonn [IEL], Germany) for subsequent biochemical measurements. Serum TG, HDL and
LDL-cholesterol, glucose were measured on the Dimension RxL clinical chemistry system
(Dade Behring, Schwalbach, Germany) with enzymatic methods. Blood for DNA extraction
was collected in EDTA K3 tubes. DNA was extracted from white blood cells with the
Puregene kit (QIAGEN, Courtaboeuf, France) by the Genomic analysis Laboratory at the
Institut Pasteur de Lille in Lille, France.

Gene sequencing and SNP genotyping

The LXRβ gene (all exons, exon-intron junctions, 1500 bp 5’ and 1000 bp 3’ of the gene) (see
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primer positions in supplementary Table 2) was sequenced. Primers were designed to

generate overlapping amplicons. Putative SNPs were identified and confirmed as described
[Nilsen H et al. 2008].
In the HUNT Study, the SNPs were genotyped on a MASSARRAY system using assay
design software, genotyping protocols and genotyping software as recommended by
manufacturer (Sequenom) as earlier described [Nilsen H et al. 2008]. Primers are provided on
request. The genotyping success rates (GSR) were greater than 98%. Genotypes were
available for a maximum of 835 T2D cases and 1986 controls.
In the HELENA-CSS, genotyping was performed on an Illumina system, using GoldenGate
technology. The GSRs were at least 99.7%.
In the MONICA samples, genotyping was performed by the restriction fragment length
polymorphism method. Primers and conditions are available on request. The GSRs were
greater than 98%.
All genotype distribution respected the Hardy-Weinberg equilibrium except for rs2303044 in
MONICA (p=0.017), however it respected the Hardy-Weinberg equilibrium in the subgroup
of normal-weight subjects (n=1076, p=0.14).

In silico analyses
MatInspector version 7.0 and ElDorado from Genomatix [Cartharius K et al. 2005]
(Genomatix Software GmbH, Germany) was used to identify which transcription factor
binding sites were affected by the SNPs, using the vertebrate matrix.

-9-
 Cell lines
The human JEG3 choriocarcinoma cell line, obtained from American Type Culture Collection
(ATCC, Manassas, VA) was cultured in monolayer in Minimum Essential Medium Eagle
(Sigma-Aldrich Norway AS) supplemented with 10% foetal calf serum (Integro, Dieren,
Holland), 2 mM L-glutamine, penicillin (50 units/mL) and streptomycin (50 µg/mL) at 37 °C
in 5% CO2. The human hepatoma HepG2 cell line, from ATCC (ATCC, Manassas, VA), was
cultured in Dulbecco’s Modified Essential Medium (Invitrogen, USA) with 10% foetal calf
serum (Invitrogen, USA), 2 mM L-glutamine, 1% MEM NEAA (Invitrogen, USA), penicillin
(50 units/mL), and streptomycin (50 µg/mL) at 37 °C in 5% CO2.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

As JEG3 cells do not express NF1 and HNF4α, this cell line was transfected by NF1s or
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HNF4α and nuclear extracts were prepared for EMSA. For preparation of nuclear extracts,
JEG3 cells were transfected in 10-cm dishes with 4 µg of expression vector and 8 µl of
LipofectAMINE2000 (Invitrogen) in 3.5 ml of OptiMem (Gibco, Invitrogen) for 5 hr,
followed by 24 hr incubation in 12 ml of Minimum Essential Medium Eagle (Sigma-Aldrich
Norway AS) containing serum and antibiotics. The NF1 expression vectors were a kind gift
from Dr R. Gronostajski (Buffalo, NY, USA). The HNF4α expression vector used was bought
at OriGene Technologies, Inc. (Rockville, MD, USA) (TrueClone SC123863). Nuclear
extracts were isolated using CelLytic NuCLEAR Extraction Kit (Sigma-Aldrich Norway AS)
according to the manufacturer's instructions with extra EDTA-free Complete proteinase
inhibitor cocktail (Roche Applied Science) added. The double stranded oligos used in EMSA
were (only one strand is shown): rs28514894 T allele 5'-TCC TCT GGC TCT TTG CCT
GGG GAT C-3', rs28514894 C allele 5'-TCC TCT GGC TCT TTG CCC GGG GAT C-3',
HNF4α positive control 5'-GCG CTG GGC AAA GGT CAC CTG C-3', HNF4α negative
control 5'- GCG CTG GCG AAA GGA GAC CTG C -3', NF1 positive control 5'-GCG GCT
CTT GGC CCA AAG CCA GAC CT-3', and NF1 negative control 5'-TCC TAC TTA CAC
CCT AAG TTT TAT C-3'. Bold letters in rs28514894T and rs28514894C oligonucleotides
indicate the SNP nucleotides. Bold letters in the HNF4α positive and negative
oligonucleotides represent the mutated nucleotides. In order to hinder NF1 binding, the NF1
negative control oligonucleotide was heavily mutated. The double-stranded oligonucleotides
were radiolabelled and the probes purified followed by binding reactions and separation of the
protein-DNA complexes from free probes as described [Dalen KT et al. 2003]. For supershift

- 10 -
 assays, 1 µL anti-HA antibody (Roche Diagnostics GmbH) was pre-incubated with nuclear
extracts for 45 minutes at 4°C.

Cloning and transient transfections

The pGL3-LXRβ vector was obtained by amplification of the fragment of 1922 bp containing
part of the promoter until the end of intron 4 of the LXRβ gene under its two allelic forms (T
and C) for rs28514894 with primers 5’-GGC CGC AGG CTC AGA GAA GCG-3’ (forward)
and 5’-CTG GGG TGG GTA GGT AGA GGC-3’ (reverse) and its insertion into the
luciferase reporter pGL3-basic vector. Integrity of the sequence was checked by sequencing.
Cells were transiently transfected with 500 ng of pGL3 vectors ± 250 ng of pCMV6-XL4-
HNF4α or pCH-NF1A, B, C or X with a FuGENE HD (Roche Applied Science): DNA ratio
of 5:1 for HepG2 cells and 4:1 for JEG3 cells. Luciferase activities were measured 40 hours
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after transfection with the Dual Luciferase Assay kit (Promega, Madison, WI). The firefly
luciferase activity of the pGL3 vectors was normalized on the renilla luciferase activity
obtained from the co-transfected pRL-CMV vector (Promega, Madison, WI). Results are
expressed as means ± SEM from at least 3 independent experiments performed in duplicates
in each cell line.

Statistical analyses
The linkage disequilibrium between SNPs was based on D’ and r² and evaluated using
Haploview [Barrett et al. 2005] and Thesias [Tregouet DA et al. 2007] softwares. Statistical
analyses were performed with SAS statistical software (SAS Institute Inc., Cary, NC). Odds
ratios were obtained by multivariate linear regression analyses. In order to obtain normal data
distributions, log-transformation was used for TG and insulin levels in all samples and for
glucose levels in the MONICA sample. An exponential-transformation was applied for
glucose levels in control subjects of the HUNT case-control study. Inter-group comparisons
of quantitative variables were made using a general linear model (GLM) procedure. Reported
p values are nominal and were systematically adjusted for confounding variables. In the
HUNT 2 case-control study, confounding variables were age and gender, with the addition of
BMI for biochemical variables or T2D risk. In the MONICA sample, confounding variables
were age, gender, centre, smoking habit, alcohol consumption and physical activity level for
anthropometric variables, with the addition of BMI for biochemical variables. In the
HELENA-CSS, confounding variables were age, gender and centre for anthropometric

- 11 -
 variables, with the addition of BMI for biochemical variables. Statistical significance was
considered as p≤0.05.

RESULTS

Identification of LXRβ SNPs and haplotype blocks

We sequenced the LXRβ gene in 96 individuals (86 with metabolic syndrome and 10
normolipemic control individuals) and identified 15 SNPs (table 1), of which 4 had a minor
allele frequency (MAF) below 0.05.
We genotyped the HUNT 2 case-control study for the 11 SNPs with a MAF≥0.05 (table 1)
and evaluated the linkage disequilibrium (LD) existing between the SNPs (figure 1). Two
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haplotype blocks were detected, the first one included rs17373080, rs28514894, rs41432149,
rs1405655, rs2303045 and rs4802703. Rs17373080 was chosen as a tagSNP for this block.
The second haplotype block was composed of rs1052677 and rs3219281; and rs3219281 was
chosen as a tagSNP. Rs56151148, rs2695121 and rs2303044 were independent SNPs. To
note, in the HapMap database (Rel24/phaseII Nov08, NCBI B36 assembly, dbSNP b126),
only 3 SNPs were described: rs1405655 and rs4802703 -being in strong LD and located in the
first haplotype block- and rs2248949. As we missed LD information for rs2248949, we
genotyped 96 randomly selected individuals for rs2248949 and observed that it was in
complete LD with rs2695121 (D’=+1, r²=1) (data not shown); and rs2695121 was chosen as a
tagSNP of this block. Thus, the three tagSNPs (rs17373080, rs3219281 and rs2695121) and
the 2 independent SNPs (rs56151148 and rs2303044) were selected in the following
association studies to cover the whole common genetic variability of the LXRβ gene.

Association between the LXRβ SNPs and T2D in HUNT 2

We compared the genotype distributions of the 5 SNPs between individuals with T2D
(n=835) and controls (n=1986) (Table 2). No genotype distribution differed significantly
between cases and controls. However, when considering a dominant model, rs17373080 was
associated with the risk of T2D. Indeed, subjects bearing the G allele had a lower risk of T2D
than CC subjects (adjusted OR=0.82 [0.69-0.98], p=0.03). To note, there was no significant
interaction with gender for this SNP (p=0.13).

- 12 -
 Association between the LXRβ SNPs and obesity in MONICA
Individuals from the MONICA Lille and MONICA Toulouse samples (overall n=2325) were
genotyped for the 5 SNPs (see MAFs in table 1). We combined the MONICA Lille and
Toulouse studies because (i) they are similar French population based-studies and (ii) the ORs
for obesity for individuals carrying the minor alleles of each SNP were homogenous between
the two MONICA population studies (assessed by the Breslow-Day test), allowing the
pooling of the two MONICA samples. In the combined MONICA Lille and Toulouse sample,
we compared the genotype distribution of the 5 SNPs between obese and non-obese
individuals (373 obese subjects and 1945 non-obese subjects) (table 3a). The genotype
distributions were not significantly different between subject groups. However, again for
rs17373080, when using a dominant model, the adjusted OR for obesity was 1.26 [1.00-1.59],
p=0.05 for G allele carriers compared with CC individuals. There was no significant
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interaction with gender for this SNP (p=0.65).

Association between the LXRβ SNPs and obesity/overweight in HELENA-CSS

Adolescents from the HELENA-CSS (n=1155) were genotyped for the 5 SNPs (see MAFs in
table 1). In this sample, there were 70 obese and 195 overweight adolescents. In order to have
more statistical power, we pooled these two subject categories to get 265 overweight or obese
children. We then compared the genotype distribution of the 5 LXRβ SNPs between obese or
overweight (n=265) and normal-weight (n=879) children (table 3b). Like in MONICA, the G
allele of rs17373080 was associated with a higher risk of overweight/obesity (adjusted
OR=1.59 [1.19-2.13], p=0.002) (table 3b). Moreover, individuals carrying either the T allele
of rs2303044 or the T allele of rs3219281 had also a higher risk of obesity (OR=1.84 [1.27-
2.66], p=0.001 and 1.78 [1.25-2.52], p=0.001, respectively) compared with respective
homozygous CC individuals.

Association between the LXRβ SNPs and obesity or T2D-related quantitative phenotypes
in HUNT, MONICA and HELENA-CSS
We looked for associations between the 5 LXRβ SNPs and obesity or T2D-related quantitative
phenotypes in the three cohorts, namely BMI, waist circumference, waist-to-hip ratio, plasma
glucose, TG, total cholesterol and HDL-cholesterol levels.
First, in control individuals from the HUNT 2 case-control study (table 4), the G allele of
rs17373080 was associated with lower plasma glucose levels (4.96 ± 0.43 mmol/L in G allele

- 13 -
 bearers versus 4.99 ± 0.43 mmol/L in CC subjects, p=0.03) and the T allele of rs56151148
was associated with lower plasma TG levels (1.62 ± 0.91 mmol/L in T allele bearers versus
1.69 ± 0.92 mmol/L in CC subjects, p=0.03). No significant association was detected for
rs2695121, rs2303044 or rs3219281.
Second, in the MONICA study (table 5), the GG genotype of rs17373080 was associated with
higher waist-to-hip ratio (0.893 ± 0.09 in GG subjects versus 0.884 ± 0.09 in C allele bearers,
p=0.03). The T allele of rs3219281 was associated with higher plasma TG levels (1.40 ±1.10
in T allele bearers versus 1.28 ± 0.94 mmol/L in CC subjects, p=0.01). No significant
association was detected for rs56151148, rs2695121 or rs2303044.
Last, in the HELENA-CSS (table 6), the G allele of rs17373080 was associated with higher
fasting insulin levels (10.51 ± 6.66 µU/mL in G allele bearers versus 9.82 ± 7.99 µU/mL in
CC individuals, p=0.04) and HOMA-IR (2.36 ± 1.52 in G allele bearers versus 2.07 ± 1.22 in
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CC subjects, p=0.02). The T allele of rs2695121 was associated with lower fasting insulin
levels (9.44 ± 5.12 µU/mL in T allele bearers versus 10.85 ± 6.98 µU/mL in CC subjects,
p=0.008), lower HOMA-IR (2.10 ± 1.18 in T allele bearers versus 2.45 ± 1.71 in CC subjects,
p=0.007) and lower HOMA-B cell index (136.7 ± 127.3 % in T allele bearers versus 153.1 ±
110.9 % in CC subjects, p=0.03). The T allele of rs2303044 was associated with higher BMI
(22.1 ± 4.3 in T allele carriers versus 21.2 ± 3.6 kg/m² in CC subjects, p=0.006). Finally,
rs3219281 T allele carriers had higher BMI (21.9 ± 4.2 versus 21.2 ± 3.6 kg/m², respectively,
p=0.009) and higher waist circumference (72.0 ± 9.0 versus 73.4 ± 10.7, respectively, p=0.03)
than CC subjects. No significant association could be detected for rs56151148.

Identification of a potentially functional SNP (rs28514894) in perfect LD with

rs17373080
We performed in silico analyses using the MatInspector and ElDorado Genomatix
softwares to determine which transcription factor binding sites are affected by the SNPs. No
relevant TF binding site could be detected for rs17373080. However, we observed that the C
allele of rs28514894 (located in intron 4 or intron 2 after the translation initiation site), a
perfect proxy for the G allele of 17373080 (r²=0.99), would create a binding site for hepatic
nuclear factor 4 alpha (HNF4α) and nuclear factor 1 (NF1A, B, C and X). These binding sites
were not identified in the presence of the common T allele of rs28514894. Therefore, we
hypothesized that rs28514894 could possibly be a SNP modifying LXRβ transcription level
and therefore explaining the association between rs17373080 and obesity and T2D.

- 14 -
 In vitro functional studies of the rs28514894 SNP
In order to test the functionality of the theoretical HNF4α and NF1 binding sites, in vitro
electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) were conducted with JEG3 or HepG2 nuclear
extracts transfected with the HNF4α or NF1 expression vectors. We observed that either
HNF4α or NF1A, B, C or X could bind to the binding site, in a similar manner whatever the
allele (T or C) (figure 2 and data not shown). No quantitative differences in binding between
the alleles could be observed. The binding between the proteins on the C allele probe was
completely prevented by adding a 10-fold excess of unlabelled T allele probe and vice versa.
Specificity of the bindings were confirmed for NF1 with complete supershifts when adding
the anti-HA tag (figure 2). Nuclear extracts prepared from cells transfected with the empty
vectors did not bind to any probes tested.
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We went on to evaluate the impact of the rs28514894 (intron 4) SNP on LXRβ promoter
activity. We cloned a fragment of 1922 bp containing part of the promoter until the end of
intron 4 of the LXRβ gene under its two allelic forms (T and C) for rs28514894 into the
luciferase reporter pGL3-basic vector to create the pGL3-LXRβ vector. In HepG2 cells, when
comparing the luciferase activity of the pGL3-LXRβ vector with the empty pGL3-basic
vector, the LXRβ fragment was active. At the basal state, the LXRβ fragment displayed ~1.25
fold higher activity (p<0.05) when carrying the C allele than when carrying the T allele
(figure 3). Because the rs28514894 SNP is located in a putative binding site for HNF4α or
NF1s, we also co-transfected the pGL3-LXRβ vector together with an expression vector
encoding the human HNF4α or NF1A, NF1B, NF1C or NF1X cDNA. In HepG2 cells, the
presence of HNF4α increased the LXRβ activity to a level similar between the two allelic
forms of the construct (~1.6 fold for both compared with the T construct at the basal state),
suggesting that rs28514894 did not modify HNF4α ability to enhance LXRβ transcriptional
activity (figure 3A). In HepG2 cells, the presence of NF1s repressed by 60% LXRβ activity to
a level similar for the two allelic forms of the construct (compared with the T construct at the
basal state), suggesting that rs28514894 did not modify NF1s ability to repress LXRβ
transcriptional activity (figure 3A). We tested the 4 different NF1s (NF1A, NF1B, NF1C,
NF1X) and obtained similar results (data not shown).
Last, similar results were found in JEG3 cells, except we observed a repressing effect of
HNF4α instead of an activation on LXRβ (figure 3B).

- 15 -
 DISCUSSION

In this three cohort study, we identified associations between the rs17373080 SNP,
representing a large 5,7 kbp haplotype block in LXRβ, and obesity or T2D risk. Our results are
in line with two previous studies by Dahlman et al. who showed rs35463555 and rs17373080
predisposed to obesity [Dahlman I et al. 2006] and that rs17373080 was associated with a
lower risk of T2D [Dahlman I et al. 2009]. To our knowledge, no LXRβ SNPs have been
significantly associated with these disorders in genome wide association (GWA) studies for
obesity or T2D. However, due to the required very low p value threshold in GWAS (<10-8),
SNPs in the LXRβ gene might have been nominally associated with these disorders and not
actually reported. In any case, the associations with the disease were probably weak. The
associations in our present study were weaker in adults (OR=0.85 for the risk of T2D or 1.26
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for the risk of obesity for rs17273080) than in adolescents (1.59<OR<1.84 for the risk of
overweight/obesity) but were probably overestimated as the number of subjects studied is
lower than in GWAS.

The protective association between rs17273080 and T2D can be explained by the
association between rs17273080 and lower plasma glucose levels, as shown in the HUNT 2
study. This is opposite of what would be expected from the LXRβ-/- KO mice phenotype
[Gerin I et al. 2005]. As discussed by Dahlman et al. [Dahlman I et al. 2009], this may reflect
species differences. We speculate that this may also reflect differences between a complete
KO of the gene and subtle changes due to common SNPs. Also, the SNPs may induce the
recruitment of different co-factors to modify the effect of LXRβ on target genes. For example,
if the disease-associated allele -or an allele in high LD with it- creates a binding site for an
activating TF-therefore increasing LXRβ action-, the disease-association would be opposite
from the LXRβ-/- phenotype. This seems to be the case for rs28514894: the C allele, in perfect
LD with the protective G allele of rs17373080, was associated with higher LXRβ basal
promoter activity, suggesting that these alleles could be associated with higher LXRβ mRNA
levels. In addition, the fact that LXRβ is expressed in several tissues adds to the complexity of
the association. Indeed, as shown in transient transfection experiments, HNF4α activated
LXRβ in HepG2 but repressed it in JEG3 cells.

- 16 -
 It has been shown that the activation of LXRβ in pancreatic β-cells increases insulin
secretion and insulin mRNA expression via SREBP-1-regulated pathway [Zitzer H et al.
2006; Efanov AM et al. 2004]. Our data are in accordance with these results as we showed
that 2 LXRβ SNPs (rs17373080 and rs2695121) were associated with fasting insulin levels,
HOMA-IR and HOMA-B in adolescents.

Our data also confirmed the association between LXRβ and adiposity. The minor allele
of rs17373080 was associated with higher obesity risk in both adults and adolescents but it
was associated with higher BMI only in the adolescent sample. Dahlman et al. did not find
either any association between LXRβ SNPs and BMI in ~2000 normoglycemic subjects
[Dahlman I et al. 2009]. The presence of many confounding factors and compensation
mechanisms in adults may hide the impact of LXRβ on fat mass.
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The associations reported in this study would become non-significant after correction
for multiple testing (150 tests performed). However, since our data confirm results from
others, we think that to conclude negatively from a purely statistical point of view would be
too stringent. Using additional large population samples and performing meta-analyses will be
necessary to truly ascertain the association between LXRβ genetic variability and obesity and
T2D.

While we were performing this work, Dahlman et al. [Dahlman I et al. 2009] analysed
the potential functional impact of rs17373080 and performed a theoretical search for TF
binding sites using the transcription element search system (TESS). They found that a
potential NF1 binding site overlapped rs17373080. EMSAs showed that the DNA fragment
containing either the C or the G allele of rs17373080 could bind these TF and transient
transfection experiments showed that each TF could regulate LXRβ activity, whatever the
allele was. In our study, we used MatInspector and ElDorado from Genomatix and observed
that the minor C allele of rs28514894, in perfect LD with the minor G allele of rs17373080,
could create a binding site for either HNF4α or NF1. However, whereas we showed that the C
allele of rs28514894 was associated with higher LXRβ basal promoter activity, we did not
observe any differences between the T and C alleles in DNA-binding and transactivation of a
reporter gene by HNF4α or NF1 family members. However, the possibility exists that the
differences between the alleles in respect to TF binding and transcriptional activity are too

- 17 -
 small to be detected by these methods, but still makes a difference in the whole organism over
years, especially if differences between different tissues exists, as would be expected. The
complete mechanistic and physiological relevance of the statistical associations found in this
and other previous studies may be elucidated in other cell lines expressing the LXRβ gene
with the specific disease-associated SNP.

In conclusion, this three cohort study demonstrated associations between an LXRβ

haplotype block tagged by rs17373080 and T2D and obesity. Together with the earlier studies
associating LXRβ SNPs with obesity and T2D in other cohorts, the associations are
strengthened. However, understanding the mechanisms behind the LXRβ SNP-disorder link
necessitate further experiments.
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ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported with grants from Norwegian Research Council, South-Eastern
Norway Regional Health Authority and the Institut National de la Santé et de la Recherche
Médicale (INSERM). The Lille and Toulouse MONICA population studies were supported by
Grants from the Conseil Régional du Nord-Pas de Calais, ONIVINS, Parke-Davis Laboratory,
the Mutuelle Générale de l’Education Nationale (MGEN), the Groupe Fournier, the Réseau
National de Santé Publique, the Direction Générale de la Santé, the INSERM, the Institut
Pasteur de Lille and the Unité d’Evaluation du Centre Hospitalier et Universitaire de Lille.
The HUNT Study is a collaboration between the HUNT Research Centre, Faculty of
Medicine, Norwegian University of Science and Technology, Norwegian Institute of Public
Health, and Nord-Trøndelag County Council. The HELENA-CSS received funding from the
European Union’s Sixth RTD Framework Programme (Contract FOOD-CT-2005-007034),
Universidad Politécnica de Madrid (CH/018/2008), Axis-Shield Diagnostics Ltd (Oslo,
Norway), Abbot Científica S.A. (Spain) and Cognis GmbH (Germany).
This study was part of the CRESCENDO (Consortium for Research into Nuclear Receptors in
Development and Aging) consortium funded by the Commission’s Sixth Framework
Programme (integrated project LSHM-CT-2005-018652). Vanessa Legry is funded by the
Institut Pasteur de Lille.
We thank Nina Andreassen and Kristil Kindem Sundsaasen for excellent laboratory work. We
thank Dr R. Gronostajski (Buffalo, NY, USA) for providing us with the NF1 expression
vectors.

- 18 -
 DECLARATION OF INTEREST
The authors report no conflicts of interest.

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tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

- 21 -
 FIGURE LEGENDS

Figure 1. Linkage disequilibrium map of the 11 LXRβ SNPs (MAF≥0.05) genotyped in the
HUNT study. The linkage disequilibrium was analyzed using genotypes from controls of the
HUNT 2 case-control study for T2D. D’ and r² values were calculated using Haploview
software. D’ values are represented by a colour scale: from white (D’=0) to red (D’=1). r²
values are given within the diamonds.

Figure 2. EMSA experiments show no difference in TF binding between the rs28514894 SNP
alleles; exemplified with NF1C binding. EMSA of nuclear extracts (2 µg) isolated from JEG3
cells transfected with the NF1-C expression vector formed a strong specific complex with the
LXRβ oligos around the rs28514894 SNP with both SNP alleles (T or C). The competition
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experiments were performed using unlabeled oligonucleotides (indicated by *) as competitors

in 10-fold excess. The upper array indicates the supershift with anti-HA-mouse antibody
binding to the NF1-C protein-oligo complex, and the lower array indicates the NF1C protein-
oligo complexes.

Figure 3. Functional analyses of the rs28514894 SNP in luciferase reporter gene

transfections in HepG2 (A) or JEG3 (B) cells. HepG2 or JEG3 cells were transiently co-
transfected with either the empty basic-pGL3 (O) or the pGL3-LXRβ/T allele or the pGL3-
LXRβ/C allele vector with or without HNF4α or NF1s expression vector. Activity is
expressed as fold activity compared to pGL3-LXRβ/Τ vector activity and to the empty basic-
pGL3 vector. White and black bars represent activities obtained without or with HNF4α or
NF1s, respectively. Each bar represents the means ± SEM of at least 3 independent
experiments. Firefly luciferase activities were normalised to the renilla luciferase activities.
Data were compared with the Kruskal & Wallis non-parametric test. *p<0.05, ** p<0.01.

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Figure 1.

- 23 -
 tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Figure 2.

- 24 -
 Figure 3.

A.
**
* *
2
firefly/renilla/empty vector/Tbasal

1.8
1.6
**
* *
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
O T C O T C

HNF4α NF1A
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B.

** **
1.4
* * * *
firefly/renilla/empty vector/Tbasal

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
O T C O T C

HNF4α NF1A

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 Table 1. SNPs detected by sequencing in the LXR β gene

rsnumber Position on Position from Location Base change MAF in sequenced individuals MAF in HUNT-2 MAF in MAF in
chromosome 19 ATG (n=96) controls (n=1986) MONICA HELENA-CSS
(n=2325) (n=1155)
rs17373080 55,571,336 -1339 5' near gene C/G 0.37 0.35 0.31 0.32
rs56151148 55,571,364 -1311 5' near gene C/T 0.05 0.08 0.09 0.08
rs55794952 55,571,487 -1188 5' near gene G/T 0.005 (1 heterozygous subject) - - -
rs2695121 55,572,553 -122 intron 2 C/T 0.44 0.44 0.43 0.40
rs28514894 55,573,138 +464 intron 4 C/T 0.33 0.35 - -
rs41432149 55,573,984 +1309 intron 6 C/T 0.36 0.35 - -
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NA 55,574,080 +1405 exon 7 C/G -> Pro252Arg 0.005 (1 heterozygous subject) - - -

NA 55,574,374 +1700 intron 7 A/G 0.005 (1 heterozygous subject) - - -
rs1405655 55,574,431 +1757 intron 7 C/T 0.36 0.35 - -
rs2303045 55,574,730 +2056 intron 7 C/G 0.35 0.35 - -
rs4802703 55,576,697 +4023 intron 8 A/C 0.40 0.32 - -
rs2303044 55,577,013 +4339 intron 8 A/G 0.10 0.07 0.08 0.08
rs1052677 55,577,993 +5319 3' UTR C/G 0.16 0.09 - -
NA 55,578,378 +5704 3' near gene A/C 0.005 (1 heterozygous subject) - - -
rs3219281 55,578,899 +6225 3' near gene C/T 0.15 0.09 0.09 0.10

Positions based on NM_007121 sequence.

MAF: minor allele frequency.
The 5 SNPs selected for association studies are indicated in bold.
 Table 2. Genotype distribution for the 5 LXR β SNPs in individuals with T2D and controls from the HUNT 2 case control study and
ORs [95%CI] of type 2 diabetes

Controls (n=1986) T2D (n=835)

Genotype n frequency n frequency p adjusted OR [95% CI] adjusted p
rs17373080 CC 815 0,41 381 0,46
CG 934 0,47 367 0,44 0,08 0,82 [0,69-0,98] 0,03
GG 236 0,12 87 0,10
Total 1985 835

rs56151148 CC 1655 0,84 684 0,82

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CT 303 0,15 141 0,17 0,23* 1,15 [0,92-1,45] 0,22

TT 12 0,01 9 0,01
Total 1970 834

rs26955121 CC 629 0,32 262 0,31

CT 970 0,49 401 0,48 0,79 1,02 [0,85-1,23] 0,80
TT 382 0,19 170 0,20
Total 1981 833

rs2303044 CC 1726 0,87 733 0,88

CT 242 0,12 96 0,12 0,43* 0,84 [0,65-1,09] 0,20
TT 12 0,01 2 0,00
Total 1980 831

rs3219281 CC 1624 0,83 696 0,84

CT 323 0,16 128 0,15 0,27* 0,87 [0,69-1,10] 0,25
TT 21 0,01 4 0,00
Total 1968 828

* Fisher exact test

ORs and p were adjusted for age, gender and BMI. A dominant model was used to calculate the odds ratios.
 Table 3a. Genotype distribution for the 5 LXR β SNPs in obese and non obese individuals from the MONICA samples and ORs [95%CI] of obesity

Combined MONICA Lille and Toulouse

Global (n=2318) Non obese (n=1945) Obese (n=373)
Genotype n frequency n frequency n frequency p adjusted OR [95% CI] adjusted p
rs17373080 CC 1094 0,48 937 0,48 157 0,43
CG 970 0,42 804 0,42 166 0,45 0,13 1,26 [1,00-1,59] 0,05
GG 234 0,10 191 0,10 43 0,12
Total 2298 1932 366
rs56151148 CC 1909 0,83 1595 0,83 314 0,85
CT 378 0,16 325 0,17 53 0,14 0,46* 0,78 [0,57-1,08] 0,13
TT 12 0,01 11 0,01 1 0,00
Total 2299 1931 368
rs26955121 CC 744 0,32 616 0,32 128 0,35
CT 1129 0,49 947 0,49 182 0,49 0,30 0,90 [0,71-1,14] 0,39
TT 429 0,19 370 0,19 59 0,16
Total 2302 1933 369
rs2303044 CC 1966 0,85 1658 0,85 308 0,83
CT 322 0,14 262 0,14 60 0,16 0,41* 1,23 [0,91-1,67] 0,18
TT 23 0,01 20 0,01 3 0,01
Total 2311 1940 371
rs3219281 CC 1876 0,83 1571 0,83 305 0,82
CT 371 0,16 310 0,16 61 0,16 0,77* 1,03 [0,76-1,39] 0,85
TT 24 0,01 19 0,01 5 0,01
Total 2271 1900 371
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Table 3b. Genotype distribution for the 5 LXR β SNPs in overweight or obese and normal weight individuals from the HELENA-CSS and ORs [95%CI] of
overweight/obesity

HELENA
Global (n=1134) Normal weight (n=879) Overweight/Obese (n=265)
Genotype n frequency n frequency n frequency p adjusted OR [95% CI] adjusted p
rs17373080 CC 529 0,46 427 0,49 102 0,39
CG 491 0,43 366 0,42 125 0,48 0,01 1,59 [1,19-2,13] 0,002
GG 121 0,11 85 0,10 36 0,14
Total 1141 878 263

rs56151148 CC 961 0,84 728 0,83 233 0,88

CT 173 0,15 142 0,16 31 0,12 0,13* 0,72 [0,47-1,11] 0,14
TT 10 0,01 9 0,01 1 0,00
Total 1144 879 265

rs26955121 CC 407 0,36 301 0,34 106 0,40

CT 553 0,48 430 0,49 123 0,47 0,15 0,76 [0,57-1,02] 0,07
TT 183 0,16 148 0,17 35 0,13
Total 1143 879 264

rs2303044 CC 968 0,85 761 0,87 207 0,78

CT 164 0,14 111 0,13 53 0,20 0,003* 1,84 [1,27-2,66] 0,001
TT 9 0,01 5 0,01 4 0,02
Total 1141 877 264

rs3219281 CC 932 0,81 732 0,83 200 0,75

CT 197 0,17 138 0,16 59 0,22 0,01* 1,78 [1,25-2,52] 0,001
TT 15 0,01 9 0,01 6 0,02
Total 1144 879 265

* Fisher exact test

ORs and p were adjusted for age, gender and centre.
 Table 4. Associations for the 5 LXR β SNPs in control individuals from the HUNT 2 case control study

LXRb rs17373080 CC CG GG Crude Adjusted

(n) (807) (915) (231) p p G* vs CC

BMI, kg/m² 26,4 ± 3,9 26,4 ± 4,0 26,1 ± 3,7 0,49 0,55
Waist circumference, cm 87,6 ± 11,1 88,2 ± 11,2 87,5 ± 10,8 0,43 0,99
Waist/hip ratio 0,854 ± 0,077 0,862 ± 0,081 0,860 ± 0,080 0,12 0,33
Glucose, mmol/L 4,99 ± 0,43 4,96 ± 0,43 5,00 ± 0,39 0,12 0,03
Triglyceride, mmol/L 1,70 ± 0,92 1,68 ± 0,94 1,66 ± 0,88 0,72 0,28
Cholesterol, mmol/L 6,27 ± 1,24 6,27 ± 1,25 6,30 ± 1,24 0,96 0,96
HDL-cholesterol, mmol/L 1,41 ± 0,40 1,42 ± 0,42 1,44 ± 0,41 0,61 0,31

LXRb rs56151148 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (1628) (299) (12) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 26,4 ± 3,8 26,5 ± 4,3 26,0 ± 4,0 0,90 0,67
Waist circumference, cm 87,9 ± 11,1 88,0 ± 11,5 83,9 ± 8,3 0,46 0,82
Waist/hip ratio 0,858 ± 0,080 0,860 ± 0,079 0,822 ± 0,058 0,29 0,87
Glucose, mmol/L 4,97 ± 0,42 5,01 ± 0,46 4,98 ± 0,38 0,10 0,07
Triglyceride, mmol/L 1,69 ± 0,92 1,63 ± 0,92 1,52 ± 0,91 0,24 0,03
Cholesterol, mmol/L 6,28 ± 1,25 6,25 ± 1,21 6,42 ± 1,30 0,84 0,57
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HDL-cholesterol, mmol/L 1,41 ± 0,42 1,44 ± 0,40 1,48 ± 0,32 0,53 0,25

LXRb rs2695121 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (620) (951) (379) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 26,3 ± 4,0 26,4 ± 3,9 26,5 ± 3,7 0,62 0,32
Waist circumference, cm 88,0 ± 11,1 87,7 ± 11,1 88,1 ± 11,2 0,74 0,51
Waist/hip ratio 0,862 ± 0,082 0,856 ± 0,077 0,859 ± 0,081 0,25 0,75
Glucose, mmol/L 4,98 ± 0,42 4,97 ± 0,43 4,99 ± 0,43 0,85 0,92
Triglyceride, mmol/L 1,66 ± 0,94 1,68 ± 0,88 1,73 ± 0,99 0,52 0,19
Cholesterol, mmol/L 6,32 ± 1,20 6,23 ± 1,27 6,30 ± 1,24 0,36 0,18
HDL-cholesterol, mmol/L 1,43 ± 0,43 1,42 ± 0,40 1,39 ± 0,42 0,36 0,12

LXRb rs2303044 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (1702) (235) (12) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 26,4 ± 3,9 26,7 ± 4,0 25,9 ± 3,4 0,46 0,52
Waist circumference, cm 87,8 ± 11,1 88,8 ± 11,4 88,8 ± 6,0 0,42 0,53
Waist/hip ratio 0,858 ± 0,079 0,864 ± 0,084 0,878 ± 0,059 0,40 0,37
Glucose, mmol/L 4,98 ± 0,44 4,99 ± 0,36 4,88 ± 0,55 0,79 0,73
Triglyceride, mmol/L 1,68 ± 0,92 1,74 ± 0,98 1,35 ± 0,34 0,49 0,79
Cholesterol, mmol/L 6,27 ± 1,24 6,34 ± 1,23 5,93 ± 1,25 0,43 0,40
HDL-cholesterol, mmol/L 1,42 ± 0,42 1,42 ± 0,40 1,33 ± 0,36 0,79 0,64

LXRb rs3219281 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (1850) (368) (23) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 26,4 ± 3,9 26,4 ± 3,9 26,6 ± 4,0 0,97 0,78
Waist circumference, cm 87,8 ± 11,1 87,9 ± 11,3 91,7 ± 9,3 0,29 0,97
Waist/hip ratio 0,858 ± 0,079 0,860 ± 0,081 0,902 ± 0,072 0,04 0,37
Glucose, mmol/L 4,98 ± 0,43 4,97 ± 0,41 4,90 ± 0,51 0,57 0,53
Triglyceride, mmol/L 1,69 ± 0,94 1,70 ± 0,87 1,47 ± 0,49 0,56 0,63
Cholesterol, mmol/L 6,26 ± 1,24 6,37 ± 1,27 6,18 ± 1,18 0,32 0,07
HDL-cholesterol, mmol/L 1,41 ± 0,41 1,42 ± 0,44 1,33 ± 0,31 0,59 0,43
Data are means ± SD.
 Table 5. Associations for the 5 LXR β SNPs in the MONICA study

LXRb rs17373080 CC CG GG Crude Adjusted Adjusted

(n) (1093) (969) (234) p p G* vs CC p GG vs C*

BMI, kg/m² 25,9 ± 4,5 26,1 ± 4,8 26,4 ± 4,5 0,42 0,23 0,32
Waist circumference, cm 89,0 ± 13,4 88,9 ± 13,7 90,2 ± 13,2 0,38 0,40 0,12
Waist/hip ratio 0,885 ± 0,094 0,882 ± 0,090 0,893 ± 0,095 0,43 0,40 0,03
Glucose, mmol/L 5,66 ± 1,51 5,59 ± 1,28 5,64 ± 1,25 0,60 0,35 0,82
Insulin, µU/mL 11,26 ± 9,04 11,00 ± 6,95 11,39 ± 6,44 0,57 0,46 0,83
HOMA-IR index 2,95 ± 3,13 2,84 ± 2,44 2,96 ± 2,10 0,47 0,28 0,79
HOMA-B cell index, % 134,0 ± 476,0 119,0 ± 73,8 127,9 ± 118,2 0,64 0,71 0,86
Triglycerides, mmol/L 1,27 ± 0,90 1,28 ± 0,92 1,43 ± 1,34 0,28 0,40 0,14
HDL-cholesterol, mmol/L 1,47 ± 0,45 1,50 ± 0,46 1,45 ± 0,44 0,29 0,36 0,26
LDL-cholesterol, mmol/L 3,84 ± 1,01 3,79 ± 1,00 3,77 ± 0,87 0,49 0,29 0,52

LXRb rs56151148 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (1907) (378) (12) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 26,0 ± 4,7 25,9 ± 4,3 26,2 ± 4,8 0,85 0,31
Waist circumference, cm 89,1 ± 13,5 88,9 ± 13,4 87,0 ± 11,3 0,82 0,24
Waist/hip ratio 0,885 ± 0,092 0,883 ± 0,095 0,863 ± 0,102 0,68 0,21
Glucose, mmol/L 5,64 ± 1,43 5,59 ± 1,21 5,32 ± 0,78 0,62 0,72
Insulin, µU/mL 11,28 ± 8,28 10,53 ± 5,29 11,00 ± 10,15 0,33 0,09
HOMA-IR index 2,94 ± 2,89 2,69 ± 1,76 2,56 ± 2,45 0,32 0,13
HOMA-B cell index, % 129,6 ± 365,8 114,0 ± 61,8 140,3 ± 110,7 0,48 0,15
Triglycerides, mmol/L 1,30 ± 0,95 1,26 ± 1,03 1,00 ± 0,41 0,35 0,27
HDL-cholesterol, mmol/L 1,48 ± 0,45 1,47 ± 0,47 1,49 ± 0,34 0,85 0,43
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

LDL-cholesterol, mmol/L 3,81 ± 1,00 3,87 ± 0,96 3,74 ± 0,85 0,55 0,31

LXRb rs2695121 CC CT TT Crude Adjusted Adjusted

(n) (744) (1128) (428) p p T* vs CC p TT vs C*

BMI, kg/m² 26,2 ± 4,7 25,9 ± 4,8 26,0 ± 4,2 0,39 0,25 0,99
Waist circumference, cm 89,5 ± 13,6 88,6 ± 13,3 88,6 ± 13,6 0,31 0,37 0,23
Waist/hip ratio 0,885 ± 0,092 0,882 ± 0,092 0,889 ± 0,094 0,42 0,58 0,23
Glucose, mmol/L 5,61 ± 1,29 5,62 ± 1,43 5,69 ± 1,46 0,57 0,51 0,36
Insulin, µU/mL 11,29 ± 6,55 10,75 ± 6,28 11,37 ± 7,59 0,09 0,30 0,18
HOMA-IR index 2,93 ± 2,48 2,74 ± 1,96 2,98 ± 2,59 0,18 0,56 0,16
HOMA-B cell index, % 124,6 ± 93,9 114,6 ± 60,1 162,1 ± 757,2 0,09 0,20 0,30
Triglycerides, mmol/L 1,33 ± 1,11 1,27 ± 0,91 1,28 ± 0,83 0,77 0,51 0,82
HDL-cholesterol, mmol/L 1,48 ± 0,45 1,48 ± 0,46 1,48 ± 0,46 1,00 0,41 0,95
LDL-cholesterol, mmol/L 3,77 ± 0,94 3,84 ± 1,00 3,82 ± 1,04 0,37 0,11 0,91

LXRb rs2303044 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (1964) (322) (23) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 26,0 ± 4,6 26,2 ± 4,7 25,8 ± 4,8 0,74 0,35
Waist circumference, cm 89,1 ± 13,4 89,1 ± 13,7 91,8 ± 16,7 0,63 0,33
Waist/hip ratio 0,884 ± 0,092 0,884 ± 0,094 0,910 ± 0,096 0,41 0,15
Glucose, mmol/L 5,63 ± 1,42 5,59 ± 1,21 5,72 ± 1,16 0,75 0,56
Insulin, µU/mL 11,05 ± 7,88 11,69 ± 8,22 13,55 ± 10,88 0,23 0,16
HOMA-IR index 2,87 ± 2,75 3,03 ± 2,70 3,67 ± 3,42 0,35 0,34
HOMA-B cell index, % 126,6 ± 358,3 130,7 ± 121,8 123,2 ± 78,1 0,22 0,84
Triglycerides, mmol/L 1,28 ± 0,94 1,31 ± 0,99 1,92 ± 1,88 0,08 0,16
HDL-cholesterol, mmol/L 1,48 ± 0,45 1,48 ± 0,47 1,28 ± 0,40 0,11 0,32
LDL-cholesterol, mmol/L 3,81 ± 0,98 3,86 ± 1,02 3,92 ± 0,95 0,65 0,31

LXRb rs3219281 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (1875) (371) (24) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 26,0 ± 4,7 26,1 ± 4,5 26,6 ± 4,6 0,78 0,58
Waist circumference, cm 89,1 ± 13,6 89,6 ± 13,1 93,4 ± 15,0 0,26 0,26
Waist/hip ratio 0,884 ± 0,092 0,890 ± 0,093 0,906 ± 0,064 0,26 0,08
Glucose, mmol/L 5,63 ± 1,40 5,62 ± 1,26 6,17 ± 1,59 0,07 0,86
Insulin, µU/mL 11,05 ± 7,89 11,57 ± 7,95 14,10 ± 8,94 0,07 0,09
HOMA-IR index 2,87 ± 2,78 3,01 ± 2,60 4,19 ± 3,33 0,03 0,13
HOMA-B cell index, % 126,6 ± 366,1 127,1 ± 114,9 111,5 ± 62,3 0,50 0,19
Triglycerides, mmol/L 1,28 ± 0,94 1,39 ± 1,10 1,52 ± 1,11 0,03 0,01
HDL-cholesterol, mmol/L 1,48 ± 0,46 1,46 ± 0,45 1,22 ± 0,40 0,02 0,16
LDL-cholesterol, mmol/L 3,82 ± 0,99 3,83 ± 1,02 3,85 ± 1,03 0,99 0,99

Data are means ± SD.

 Table 6. Associations for the 5 LXR β SNPs in the HELENA-CSS

LXRb rs17373080 CC CG GG Crude Adjusted

(n) (532) (494) (122) p p G* vs CC

BMI, kg/m² 21,2 ± 3,5 21,4 ± 4,0 21,5 ± 3,8 0,45 0,84
Waist circumference, cm 72,2 ± 9,1 72,4 ± 9,6 72,4 ± 9,3 0,90 0,27
Waist/hip ratio 0,794 ± 0,069 0,796 ± 0,072 0,787 ± 0,060 0,45 0,95
Glucose, mmol/L 5,01 ± 0,41 5,02 ± 0,39 4,99 ± 0,40 0,58 0,21
Insulin, µU/mL 9,24 ± 4,84 10,28 ± 6,23 11,39 ± 7,82 0,03 0,04
HOMA-IR index 2,07 ± 1,22 2,31 ± 1,45 2,55 ± 1,79 0,01 0,02
HOMA-B cell index, % 136,2 ± 95,3 147,2 ± 126,6 163,5 ± 129,7 0,06 0,24
Triglycerides, mmol/L 0,78 ± 0,34 0,79 ± 0,41 0,78 ± 0,37 0,91 0,88
HDL-cholesterol, mmol/L 1,43 ± 0,26 1,43 ± 0,28 1,45 ± 0,30 0,61 0,28
LDL-cholesterol, mmol/L 2,49 ± 0,63 2,43 ± 0,63 2,44 ± 0,66 0,72 0,84

LXRb rs56151148 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (967) (174) (10) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 21,4 ± 3,8 20,9 ± 3,7 20,9 ± 1,9 0,23 0,18
Waist circumference, cm 72,3 ± 9,5 72,1 ± 8,8 71,8 ± 4,6 0,94 0,68
Waist/hip ratio 0,794 ± 0,073 0,791 ± 0,052 0,789 ± 0,042 0,84 0,73
Glucose, mmol/L 5,00 ± 0,40 5,01 ± 0,40 4,95 ± 0,37 0,90 0,52
Insulin, µU/mL 10,33 ± 7,80 10,20 ± 6,88 6,28 ± 1,86 0,07 0,63
HOMA-IR index 2,33 ± 1,94 2,27 ± 1,74 1,34 ± 0,42 0,22 0,56
HOMA-B cell index, % 144,6 ± 115,2 143,6 ± 106,8 81,5 ± 18,7 0,06 0,97
Triglycerides, mmol/L 0,78 ± 0,40 0,77 ± 0,34 0,77 ± 0,27 0,94 0,93
HDL-cholesterol, mmol/L 1,43 ± 0,28 1,42 ± 0,26 1,60 ± 0,39 0,10 0,53
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

LDL-cholesterol, mmol/L 2,44 ± 0,63 2,45 ± 0,72 2,50 ± 0,80 0,92 0,37

LXRb rs2695121 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (411) (555) (184) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 21,5 ± 4,0 21,2 ± 3,6 21,1 ± 3,5 0,31 0,13
Waist circumference, cm 72,8 ± 9,5 71,9 ± 9,4 72,1 ± 8,7 0,39 0,16
Waist/hip ratio 0,795 ± 0,065 0,793 ± 0,076 0,794 ± 0,060 0,93 0,70
Glucose, mmol/L 5,01 ± 0,42 5,00 ± 0,38 5,00 ± 0,40 0,77 0,27
Insulin, µU/mL 10,85 ± 6,98 9,48 ± 5,20 9,16 ± 4,68 0,03 0,008
HOMA-IR index 2,45 ± 1,71 2,11 ± 1,17 2,05 ± 1,12 0,01 0,002
HOMA-B cell index, % 153,1 ± 110,9 137,4 ± 113,6 142,9 ± 118,7 0,03 0,03
Triglycerides, mmol/L 0,77 ± 0,35 0,79 ± 0,42 0,78 ± 0,36 0,79 0,23
HDL-cholesterol, mmol/L 1,43 ± 0,28 1,44 ± 0,28 1,41 ± 0,26 0,60 0,66
LDL-cholesterol, mmol/L 2,46 ± 0,65 2,45 ± 0,65 2,40 ± 0,61 0,64 0,79

LXRb rs2303044 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (959) (161) (9) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 21,2 ± 3,6 22,0 ± 4,4 22,6 ± 3,1 0,01 0,006
Waist circumference, cm 72,2 ± 9,2 73,1 ± 10,6 73,4 ± 7,4 0,48 0,18
Waist/hip ratio 0,794 ± 0,065 0,794 ± 0,079 0,757 ± 0,075 0,26 0,96
Glucose, mmol/L 5,01 ± 0,40 5,02 ± 0,37 5,12 ± 0,45 0,64 0,91
Insulin, µU/mL 10,19 ± 7,46 10,52 ± 8,98 14,09 ± 5,84 0,06 0,73
HOMA-IR index 2,29 ± 1,86 2,36 ± 2,16 3,36 ± 1,50 0,04 0,84
HOMA-B cell index, % 141,4 ± 105,3 153,9 ± 154,0 191,5 ± 76,2 0,11 0,73
Triglycerides, mmol/L 0,78 ± 0,39 0,83 ± 0,39 0,86 ± 0,45 0,20 0,29
HDL-cholesterol, mmol/L 1,43 ± 0,27 1,39 ± 0,28 1,56 ± 0,30 0,05 0,53
LDL-cholesterol, mmol/L 2,44 ± 0,65 2,47 ± 0,62 2,34 ± 0,51 0,77 0,72

LXRb rs3219281 CC CT TT Crude Adjusted

(n) (937) (199) (15) p p T* vs CC

BMI, kg/m² 21,2 ± 3,6 21,8 ± 4,3 22,3 ± 3,5 0,05 0,01
Waist circumference, cm 72,0 ± 9,0 73,5 ± 11,0 72,2 ± 6,4 0,13 0,03
Waist/hip ratio 0,794 ± 0,070 0,794 ± 0,069 0,770 ± 0,048 0,42 0,82
Glucose, mmol/L 90,85 ± 7,32 91,28 ± 7,13 93,31 ± 5,83 0,32 0,18
Insulin, µU/mL 10,42 ± 10,51 10,48 ± 8,71 13,60 ± 6,93 0,05 0,87
HOMA-IR index 2,28 ± 1,86 2,37 ± 2,11 3,19 ± 1,69 0,03 0,74
HOMA-B cell index, % 141,7 ± 104,7 151,6 ± 149,3 172,5 ± 84,3 0,22 0,61
Triglycerides, mmol/L 68,66 ± 35,56 69,88 ± 31,95 67,94 ± 26,42 0,62 0,67
HDL-cholesterol, mmol/L 55,60 ± 10,58 54,02 ± 10,76 57,69 ± 10,96 0,11 0,31
LDL-cholesterol, mmol/L 94,82 ± 25,26 94,82 ± 24,29 84,56 ± 19,25 0,27 0,38

Data are means ± SD.

 Supplementary table 1. Clinical characteristics of controls and T2D cases in HUNT 2

Controls (n=1986) T2D (n=835) p

Men, n (%) 978 (49) 407 (49) ns
Age, yrs 65,6 ± 14,3 66,9 ± 13,6 0,02
BMI, kg/m² 26,4 ± 3,9 29,1 ± 5,0 <0,001
Waist circumference, cm 87,9 ± 11,2 96,2 ± 12,5 <0,001
Waist/hip ratio 0,86 ± 0,08 0,90 ± 0,08 <0,001
Glucose, mmol/L 4,98 ± 0,43 10,20 ± 4,52 <0,001
Triglyceride, mmol/L 1,68 ± 0,92 2,50 ± 1,80 <0,001
Cholesterol, mmol/L 6,27 ± 1,25 6,10 ± 1,30 <0,001
HDL-cholesterol, mmol/L 1,41 ± 0,41 1,20 ± 0,40 <0,001

Data are means ± SD or n (%).

tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009
 Supplementary table 2. LXRβ gene sequencing primers

Primer pair Forward primer 5' - 3' Reverse primer 5' - 3'
1 CGATGGGCCTGAGTAGACAT TGCAAAAATGGTTTCAATAACTTG
2 GGTCCGAGACTGAGCTTTTT AACCCATTTCCTCGCTTCTT
3 CCAATCACCAAGTTATTGAAACC GGGAGGAAATGGAAGGAGAG
4 TCCGGTGAGTTTCCAACTTC TCCAATCCACCTGCTTTTTC
5 GAGGTGGGGTCAGAATGAGA CAAAGAGCCAGAGGATGGAG
6 GAGGGGTTTAGGAAGGGAGA GTGGGCAGATGGACCATTA
7 CCCTCCACAACCTTGAGTGT CTCCAACAGGGATGAGTTGG
8 TGAGCCAAGGAGAGAAAGGA CTTGGGTGAGACCACGTTTT
9 CACGTGGCAGGTACTCAGTG CCAGATCTCCGACAGCAGA
10 GTTTCGGGCTGAGGGAGT ACCCTATGTGCCACCCTTTT
11 GGGCTTCTAGGGACCTCAGT CCTGGCTTGATCTGTTCTCC

The sequencing was performed between each primer pair.

tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009
 Résultats

III.2. Synthèse des résultats

Les polymorphismes génétiques du gène NR1H2 ont été identifiés par séquençage
en collaboration avec le laboratoire du Pr Hilde Nebb (Oslo, Norvège). Nous avons détecté
11 SNPs ayant une MAF>0,05 et avons déterminé, grâce à la carte de DL, que 5 SNPs
(rs17373080, rs56151148, rs2695121, rs2303044 et rs3219281) couvrent la totalité de la
variabilité génétique commune de LXRβ. Ces 5 SNPs ont alors été génotypés chez les
participants de l’étude cas-témoins pour le DT2 nichée dans HUNT 2, des échantillons
MONICA Lille et Toulouse et de HELENA (voir les caractéristiques des sujets pages 80-83).
Le SNP rs17373080 (C>G, MAF 0,33) – tag SNP d’un bloc haplotypique de 5,7 kpb –
est associé au risque de DT2 dans l’étude HUNT (OR=0,84), d’obésité dans l’étude
MONICA (OR=1,26) et de surpoids chez les adolescents de l’étude HELENA (OR=1,59).
Des analyses in silico ont révélé que le SNP rs28514894 (T>C), en parfait DL avec le
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

rs17373080, pouvait créer un site potentiel de fixation pour les facteurs de transcription
HNF4α (hepatic nuclear factor 4 alpha) et NF1s (nuclear factor 1 A, B, C et X). Des
expériences de retard sur gel ont montré que HNF4α et les NF1s sont capables de se fixer
sur leur élément de réponse quelque soit l’allèle. De plus, des expériences de transfection
cellulaire ont été menées afin de voir l’impact du SNP rs28514894 sur l’expression de LXRβ
dans les cellules HepG2 et JEG3. Malgré une légère différence d’expression du fragment
LXRβ comportant le SNP entre les allèles C et T, nous n’avons pas détecté de différence de
réponse aux facteurs de transcription HNF4α et NF1s.

III.3. Discussion

Dans cette étude, nous avons montré que le SNP rs17373080 du gène codant LXRβ
est associé au risque de DT2 et d’obésité. Ces résultats sont parfaitement cohérents avec
les études de Dahlman et al qui ont décrit que les SNPs rs35463555 et rs17373080
prédisposaient à l’obésité [Dahlman et al. 2006] et que le rs17373080 était associé à une
diminution du risque de DT2 [Dahlman et al. 2009]. Notons que le rs17373080 est associé
au risque d’obésité chez les adultes et les adolescents mais il est associé à l’IMC seulement
chez les adolescents. L’étude plus récente de Dahlman et al ne décrit pas non plus
d’association de ce polymorphisme avec l’IMC (étude avec ∼2000 individus). Il est possible
que la présence de nombreux facteurs de confusion et des mécanismes de compensation
chez les adultes masque l’effet des polymorphismes de LXRβ sur la masse grasse. A ce
jour, aucune GWAS n’a rapporté d’association entre un SNP de LXRβ et ces désordres
métaboliques. Toutefois, les études GWA requièrent un seuil de significativité tellement

104
 Résultats

exigent (<10-8 ) qu’on ne peut exclure que des polymorphismes de LXRβ aient été associés
de façon marginale (seuil de significativité au-delà de 10-8 mais inférieur à 0,05) mais que
ces associations n’aient pas été décrites.
L’effet protecteur de l’allèle G du rs17373080 sur le DT2 peut s’expliquer par son
association avec une glycémie plus basse dans l’étude HUNT 2. Ces associations peuvent
sembler à l’inverse de ce à quoi l’on pourrait s’attendre de l’effet de l’allèle mineur d’un SNP
au vu du phénotype des souris LXRβ -/- [Gerin et al. 2005]. Ces souris présentent en effet une
réduction de la masse grasse mais une intolérance au glucose (due à une altération de la
sécrétion d’insuline induite par le glucose). Toutefois, on peut s’attendre à des
conséquences différentes entre le KO complet d’un gène et les variations subtiles que sont
les SNPs. De plus, il se peut que l’allèle mineur d’un SNP induise en fait le recrutement de
facteurs de transcription et entraîne alors une augmentation de l’expression du gène. C’est
ce qui semble être le cas pour l’allèle C du rs28514894, en parfait DL avec l’allèle mineur G
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du rs17373080, qui est associé à une légère augmentation de l’activité du promoteur LXRβ
dans nos expériences de transfection cellulaire, suggérant que les allèles C et G des SNPs
rs28514894 et rs17373080, respectivement, soient associés avec une augmentation du
niveau d’ARNm LXRβ. L’effet protecteur de ces allèles sur le DT2 est donc cohérent avec le
phénotype des souris KO LXRβ -/- décrit par Gerin et al [Gerin et al. 2005].
Dahlman et al ont récemment décrit des études fonctionnelles pour le rs17373080
[Dahlman et al. 2009]. Ces auteurs ont réalisé les analyses in silico à l’aide du logiciel TESS
(transcription element search system) et ont trouvé un site potentiel de fixation pour les
facteurs de transcription NF1s chevauchant le SNP rs17373080. Leurs expériences de
retard sur gel et de transfection cellulaire ont montré que les NF1s pouvaient se lier et activer
l’expression du fragment contenant le rs17373080, quelque soit l’allèle. Dans notre étude,
nous avons réalisé les analyses in silico à l’aide du logiciel Genomatix [Cartharius et al.
2005], selon lequel l’allèle C du rs28514894 créerait un site potentiel de fixation pour les
facteurs de transcription HNF4α et NF1. Nos expériences ont montré que ces facteurs de
transcription pouvaient se fixer et réguler l’expression du fragment contenant le SNP
rs28514894, quelque soit l’allèle. Il se peut que la différence de réponse aux facteurs de
transcription entre les allèles soit trop petite pour être détectée par ces méthodes.
Néanmoins, même une petite différence peut avoir un impact sur l’ensemble de l’organisme
au cours du temps, en particulier s’il existe des différences d’expression entre tissus. Les
mécanismes moléculaires sous-tendant les associations observées en population restent
donc à éclaircir.

105
 Résultats

En conclusion, nous avons montré qu’un bloc haplotypique du gène codant

β , marqué par le SNP rs17373080, est associé au risque de DT2 et d’obésité.
LXRβ
Cependant, la compréhension des mécanismes moléculaires expliquant ces
associations nécessite d’autres expériences.
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106
 Résultats

IV. Etude des gènes ANGPTL3 et ANGPTL4

IV.1. Contexte de l’étude

Comme nous l’avons vu dans le chapitre V.3.a. et V.3.b. de l’Introduction (pages 67-
71), de récentes données suggèrent un rôle important pour Angptl3 et Angptl4 dans le
métabolisme énergétique, tout au moins chez la souris [Hato et al. 2008]. Ces deux
protéines appartiennent à la famille des ANGPTLs, qui sont des protéines plasmatiques
agissant comme des facteurs endocriniens sur leurs tissus cibles. ANGPTL3 et 4 sont les
membres les plus apparentés de cette famille et partagent des fonctions communes [Hato et
al. 2008]. Toutes les deux sont impliquées dans le métabolisme des lipides par leur activité
inhibitrice de lipases (LPL, EL, HL et ATGL), entraînant entre autre une augmentation de la
concentration plasmatique de TG [Shimizugawa et al. 2002; Yoshida et al. 2002; Shimamura
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et al. 2007; Mandard et al. 2006; Lichtenstein et al. 2007]. De plus, elles stimulent la lipolyse
du TA, conduisant à une augmentation du taux d’AGL dans le sang [Shimamura et al. 2003;
Yoshida et al. 2002]. Par ailleurs, Angptl4 empêche le stockage des graisses en stimulant
l’oxydation des AG et l’utilisation des stocks de TG [Mandard et al. 2006]. Angptl4 interagit
également avec la flore intestinale dans l’absorption des graisses [Backhed et al. 2004;
Backhed et al. 2007]. Enfin, Angptl4 pourrait intervenir dans le métabolisme glucidique mais
son rôle reste à éclaircir [Xu et al. 2005; Koster et al. 2005; Mandard et al. 2006]. ANGPTL3
et 4 sont exprimées principalement dans le foie, mais ANGPTL4 est aussi exprimée dans le
TA et son expression est régulée par les PPARs et induite par le jeûne [Romeo et al. 2009;
Yoon et al. 2000; Kersten et al. 2009; Kersten et al. 2000].

107
 1 Associations between common genetic polymorphisms in angiopoietin-like proteins 3

2 and 4 and lipid metabolism and adiposity in European adolescents and adults

4 Abbreviated title: ANGPTL3 and ANGPTL4 polymorphisms

6 Précis: The present study shows associations between an ANGPTL3 polymorphism and HDL-

7 cholesterol metabolism and between an ANGPTL4 polymorphism and adiposity markers.

9 Vanessa Legry1, Szilvia Bokor1, Dominique Cottel1, Laurent Beghin2,3, Giovina Catasta4, Eniko

10 Nagy5, Marcela Gonzalez-Gross6, Andre Spinneker7, Peter Stehle7, Dénes Molnár5, Luis A. Moreno8,
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11 Philippe Amouyel1, Jean Dallongeville1, Aline Meirhaeghe1

12
1
13 INSERM, U744, Lille; Institut Pasteur de Lille, Lille; Univ. Lille Nord de France, Lille; UDSL,

14 Lille, France.
2
15 EA-3925, Université Lille 2 Droit et Santé, Faculté de Médecine, Lille, France.
3
16 CIC-9301-CH&U-Inserm de Lille, IFR 114, IMPRT, CHRU de Lille, Lille, France.
4
17 National Research Institute for Food and Nutrition (INRAN), Roma, Italy.
5
18 University of Pécs, Department of Pediatrics, Pécs, Hungary.
6
19 Facultad de Ciencias de la Actividad Física y del Deporte - INEF, Universidad Politécnica de

20 Madrid, Madrid, Spain.

7
21 Institut für Ernährungs- und Lebensmittelwissenschaften – Humanernährung, Rheinische Friedrich-

22 Wilhelms Universität, Bonn, Germany.

8
23 GENUD (Growth, Exercise, Nutrition and Development) Research Group, Escuela Universitaria de

24 Ciencias de la Salud, Universidad de Zaragoza, 50009 Zaragoza, Spain.

25

26

1
 1 Corresponding author:

2 Dr Aline Meirhaeghe, INSERM U744, Institut Pasteur de Lille, 1 rue du Pr. Calmette, BP 245, F-

3 59019 LILLE cedex, France. Tel: + 33 3 20 87 73 91. Fax: +33 3 20 87 78 94.

4 [Link]-hurez@[Link]

7 DISCLOSURE STATEMENT: The authors have nothing to disclose.

9 Number of words (text): 3324

10 Number of words (abstract): 223
11 Number of tables: 4 + 1 supplementary table
12 Number of figures: 1 + 2 supplementary figures
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13

14

15 Statement of financial support:

16 The HELENA-CSS received funding from the European Union’s Sixth RTD Framework Programme

17 (Contract FOOD-CT-2005-007034), the Spanish Ministry of Education (EX-2007-1124; AGL2007-

18 29784-E/ALI; AP-2005-3827), Universidad Politécnica de Madrid (CH/018/2008), Axis-Shield

19 Diagnostics Ltd (Oslo, Norway), Abbot Científica S.A. (Spain) and Cognis GmbH (Germany).

20 The writing group takes sole responsibility for the content of this article and the European Union is not

21 liable for any use that may be made of the information contained therein.

22 The MONICA Lille population study was funded by grants from the Conseil Régional du Nord-Pas de

23 Calais, ONIVINS, Parke-Davis, the Mutuelle Générale de l'Education Nationale (MGEN), the Réseau

24 National de Santé Publique, the Direction Générale de la Santé, the Institut National de la Santé et de

25 la Recherche Médicale (INSERM), the Institut Pasteur de Lille and the Unité d'Evaluation du Centre

26 Hospitalier et Universitaire de Lille. Vanessa Legry is funded by the Institut Pasteur de Lille.

27

2
 1 Abstract

2 Context. Plasma-borne angiopoietin-like (ANGPTL) proteins act as endocrine factors on their target

3 tissues. Since ANGPTL3 and ANGPTL4 play important roles in lipid metabolism and the regulation

4 of adiposity in mice, we hypothesized that genetic variability at the ANGPTL3 and ANGPTL4 genes

5 loci might influence lipid metabolism and fat deposition in humans.

7 Objective. To examine the association between ANGPTL3 and ANGPTL4 genetic polymorphisms and

8 metabolic phenotypes in adolescent and adult samples.

10 Design and Participants. Two independent population-based studies, one composed of 1144
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11 adolescents (mean age 14.8 ± 1.4 y) from 9 European countries (the HELENA-CSS) and the other

12 composed of 1155 adults (age range 35-65 y) from Northern France (the MONICA Lille study), were

13 genotyped for one ANGPTL3 polymorphism and 4 ANGPTL4 polymorphisms.

14

15 Results. The ANGPTL3 rs11207997 polymorphism (minor allele frequency (MAF) 0.32) was

16 associated with lower plasma HDL-cholesterol and ApoA1 levels in both adolescents (p=0.0004,

17 p=0.00006, respectively) and adults (p=0.03, p=0.02, respectively). The ANGPTL4 rs4076317

18 polymorphism (MAF 0.29) was associated with a higher percentage of body fat (p=0.02) in

19 adolescents and a higher waist-to-hip ratio (in interaction with the peroxisome proliferator-activated

20 receptor γ (PPARG) Pro12Ala polymorphism) in adults (p=0.0004).

21

22 Conclusion. The present study underlines the role of ANGPTL3 in HDL-cholesterol metabolism as

23 early as in adolescence. Our data also suggest possible associations between ANGPTL4

24 polymorphisms and body fat but these findings require replication.

25

26 Key terms: ANGPTL, association study, polymorphism, gene-gene interaction, lipid metabolism,

27 adiposity.

3
 1 Introduction

2 Angiopoietin-like (ANGPTL) proteins are a family of secreted proteins that was discovered a

3 decade ago. They are characterized by the presence of 2 structural domains shared with the

4 angiopoietins (a coiled-coil domain and a fibrinogen-like domain) and, unlike angiopoietins, their

5 inability to bind the TIE2 (a tyrosine kinase with immunoglobulin and epithelial growth factor (EGF)

6 homology domains) receptor. Seven members have been identified so far and denominated as

7 ANGPTLs 1 to 7 (1). Although it is known that ANGPTLs act as endocrine factors on target tissues,

8 the corresponding receptors and signaling pathways have yet to be determined.

9 Angptl3 and Angptl4 are the most closely related members of this protein family. Both inhibit

10 lipoprotein lipase (LPL) activity and prompt a decrease in very low density lipoprotein (VLDL)-
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11 triglyceride (TG) clearance (2;3). Furthermore, Angptl3 and Angptl4 stimulate lipolysis in adipose

12 tissue and thus lead to the release of free fatty acids (FFAs) and glycerol from adipocytes (4;5).

13 Concordantly, mice lacking Angptl3 and/or Angptl4 exhibit hypotriglyceridemia, whereas

14 overexpression or intravenous injection of Angptl3 or Angptl4 increases plasma TG and FFA levels

15 (5-7). Furthermore, Angptl3 inhibits endothelial lipase (EL), which hydrolyses HDL phospholipids

16 and decreases plasma HDL levels (8) and Angptl4 reduces hepatic cholesterol uptake by inhibiting

17 LPL and hepatic lipase, leading to increase cholesterol synthesis in the liver (9). Double-knockout

18 mice die prenatally or do not survive beyond 2 months of age and present nearly undetectable TG

19 levels and low cholesterol levels – demonstrating the essential role of Angptl3/4 in the regulation of

20 circulating TG and lipoproteins (7).

21 However, Angptl3 and Angptl4 may not be redundant, as they are not always expressed in the

22 same tissues or at the same time. Whereas Angptl3 expression is restricted to the liver (regardless of

23 the nutritional status) (10), Angptl4 is expressed in adipose tissue, liver and (to a lesser extent) in

24 intestine and placenta and its transcription is strongly induced by fasting conditions (11). Indeed,

25 Angptl4 expression is regulated by peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) (12). Angptl3

26 functions seem to be restricted to lipid metabolism, whereas Angptl4 has a broader sphere of activity.

27 Angptl4 overexpression in mice caused a 50% reduction in adipose tissue weight, partly by

28 stimulating fatty acid oxidation and uncoupling in fat (5). Furthermore, Angptl4 seems to mediate the

4
 1 microbial regulation of peripheral fat storage (13). Lastly, Angptl4 appears also to play a role in

2 glucose metabolism, although this finding remains controversial (5;7;9;14).

3 In humans, the ANGPTL3 and ANGPTL4 genes are located on chromosomes 1p31.3 and

4 19p13.2, respectively. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) nearby ANGPTL3 have been

5 associated with plasma TG levels (15-17) and SNPs in ANGPTL4 have been associated with plasma

6 HDL-cholesterol levels (17) in recent genome-wide association studies (GWAS). The goal of our

7 study was to explore the impact of the common sequence variability in ANGPTL3 and ANGPTL4 on

8 some metabolic phenotypes (anthropometric parameters, plasma glucose, insulin and lipid levels) in

9 both adult and adolescent samples. After selecting all the known common SNPs of each gene, we

10 performed association studies in two independent population-based samples: (i) the Healthy Lifestyle
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11 in Europe by Nutrition in Adolescence-Cross Sectional Study (HELENA-CSS), composed of 1144

12 European adolescents and (ii) the MONICA Lille study, composed of 1155 French adults.

13

14 Materials and Methods

15 The HELENA-CSS

16 Participants were recruited as part of the HELENA-CSS ([Link]

17 performed from 2006 to 2007 in 9 European countries (Greece, Germany, Belgium, France, Hungary,

18 Italy, Sweden, Austria and Spain) as previously described (18). The protocol was approved by the

19 appropriate ethics committee in each center. Written, informed consent was obtained from each

20 subject and both of his/her parents or legal representatives. Participation in the study was voluntary.

21 The sample included a total of 3865 adolescents (mean age 14.8 ± 1.4 y) recruited through their

22 schools; the latter were randomly selected according to a proportional cluster sampling methodology

23 taking into account geographical repartition within each city, private/public school ratio, and number

24 of classes by school (19). Participants were barefoot and in underwear and anthropometric

25 measurements were taken by trained researchers. Waist and hip circumferences were measured three

26 consecutive times and with a non-elastic tape (Seca 200) to the nearest 0.1 cm. The body mass index

27 (BMI) was calculated. The percentage of body fat (%BF) was estimated from skin-fold measurements,

28 according to Slaughter et al. (20). Physical activity over a one-week period was evaluated using

5
 1 accelerometers (Actigraph MTI, model GT1M, Manufacturing technology Inc., Fort Walton Beach,

2 FL, USA) (21).

3 One third of the classes (n=1155) were randomly selected for blood collection. Blood samples

4 were drawn at school according to a standardized collection protocol (after a 10-hour overnight fast),

5 and were sent to the Analytical Laboratory at the University of Bonn [IEL] (Germany) for subsequent

6 biochemical measurements (22). Serum TG, HDL and LDL cholesterol and glucose levels were

7 measured on the Dimension RxL clinical chemistry system (Dade Behring, Schwalbach, Germany)

8 with enzymatic methods. Serum apolipoprotein A-I and apolipoprotein B concentrations were

9 measured in an immunochemical reaction with a BN II analyser (Dade Behring, Schwalbach,

10 Germany). Blood for DNA extraction was collected in EDTA K3 tubes and sent to the Genomic
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11 analysis Laboratory at the Institut Pasteur of Lille, France. DNA was extracted from white blood cells

12 with the Puregene kit (QIAGEN, Courtaboeuf, France). Genotyping was performed on an Illumina

13 system, using GoldenGate technology. The genotyping success rates were 97.2% for rs11672433,

14 98.8% for rs11207997 and above 99.6% for the other SNPs. Data on BMI were available for 1144

15 subjects.

16

17 The MONICA Lille study

18 Participants were recruited as part of the WHO-MONICA population survey performed from

19 1995 to 1997 in the Lille Urban Community in Northern France (n=1195) as previously described

20 (23). The sample included individuals aged 35-65 randomly selected from electoral rolls after

21 stratification by town size, gender and age, in order to obtain 200 participants for each gender and each

22 10-year age group (WHO-MONICA Project protocol) (24). The study protocol was approved by the

23 local ethics committee. After signing an informed consent form, participants filled out a standard

24 questionnaire and physical measurements were taken by a specially trained nurse. Physical activity

25 was defined as at least 15 min walking a day and/or daily lifting or carrying heavy objects at work

26 and/or doing sport or physical exercise for more than 2 hours a week. Current cigarette smokers were

27 defined as individuals reporting at least one cigarette per day. Total alcohol intake (in ml alcohol) was

28 calculated as the sum per week from wine, beer, cider and spirits. A 20 ml blood sample was drawn on

6
 1 disodium EDTA after a 10-hour overnight fast for 1155 subjects. Lipid and lipoprotein levels were all

2 measured at the Purpan Hospital Biochemical Laboratory (Toulouse). The genotyping was performed

3 using the restriction fragment length polymorphism (RFLP) method (see Supplementary table 1). The

4 genotyping success rate was above 98.7% for all SNPs.

6 SNP selection

7 SNPs were extracted from the NCBI dbSNP and HapMap (data release 23a/phase II, March

8 2008) databases. For ANGPTL3, the 7 validated SNPs described in the 10 kbp genomic region in the

9 NCBI database were all genotyped in the CEU panel from the HapMap Project. Only one SNP

10 (rs11207997) had a minor allele frequency (MAF) higher than 0.05. Hence, rs11207997 (MAF 0.30)
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11 was the only SNP that could be analyzed in association studies for ANGPTL3.

12 There were 6 validated ANGPTL4 SNPs with a MAF>0.02 reported in the NCBI dbSNP

13 database: rs4076317, rs2278236, rs7255436, rs1044250 (Thr266Met), rs35061979 (Arg278Gln) and

14 rs11672433 (Pro389Pro). In HapMapCEU, rs2278236 was a perfect proxy for rs7255436 (r²=1) and

15 therefore, rs2278236 was chosen a tagSNP of this block. Rs1044250, rs4076317, rs10404615 and

16 rs11672433 were independent SNPs (r²<0.8). As the linkage disequilibrium (LD) of rs35061979 with

17 the other SNPs was not known, we typed rs35061979 in a hundred subjects from the MONICA Lille

18 study but it could not be detected and was not pursued. Thus, the rs4076317, rs2278236, rs1044250

19 and rs11672433 SNPs (accounting for over 99.9% of ANGPTL4 common genetic variability) were

20 further analyzed in association studies.

21

22 Statistical analyses

23 Statistical analyses were performed with SAS statistical software, version 8 (SAS Institute

24 Inc., Cary, NC). In order to obtain a normal data distribution, log-transformation was used for TG and

25 insulin levels in both studies and also for glucose levels in the MONICA sample. In MONICA Lille,

26 inter-group comparisons of quantitative variables were made using a general linear model (GLM)

27 procedure, except for gene-gene interactions analyses for which the number of subjects was small in

28 one of the 4 groups (n=18), we first performed a rank transformation on the anthropometric variables

7
 1 as described by Conover and Iman (25) and then used a multivariate GLM procedure. In the

2 HELENA-CSS, the effects were homogenous across centers as there was no significant genotype x

3 center interactions (ns). Reported p values are nominal and were systematically adjusted for

4 confounding variables. In MONICA Lille, confounding variables were age, gender, smoking status,

5 alcohol consumption and physical activity for anthropometric variables, with the addition of BMI for

6 biochemical variables. In the HELENA-CSS, we used age, gender and center as covariates for

7 anthropometric variables, with the addition of BMI for biochemical variables. Statistical significance

8 was considered as p≤0.05.

10 Results
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11 Table 1 shows the clinical characteristics of the subjects from the HELENA-CSS and MONICA Lille.

12 We focused on the associations between the ANGPTL SNPs with anthropometric measurements and

13 plasma lipids, glucose and insulin levels significant in both studies.

14

15 Study of ANGPTL3’s genetic variability

16 The MAF for the ANGPTL3 rs11207997 SNP was 0.30 in the HELENA-CSS and 0.34 in the

17 MONICA Lille sample. The genotype distribution did not deviate from the Hardy-Weinberg

18 equilibrium in either sample (p>0.54). We detected significant associations between rs11207997 and

19 plasma HDL-cholesterol and ApoA1 levels (Table 2). Indeed, in the HELENA-CSS, T allele bearers

20 had significantly lower HDL-cholesterol and ApoA1 levels, compared with CC subjects (HDL = 1.40

21 ± 0.27 vs. 1.46 ± 0.28 mmol/L, p=0.0004; ApoA1 = 1.48 ± 0.22 vs. 1.53 ± 0.22 g/L, p=0.00006).

22 These associations were not modified by further adjustment for physical activity or for pubertal status

23 (data not shown). In the MONICA Lille study, TT subjects displayed lower HDL-cholesterol and

24 ApoA1 levels, compared with C allele bearers (HDL-cholesterol = 1.44 ± 0.43 vs. 1.51 ± 0.48

25 mmol/L, p=0.03; ApoA1 = 1.68 ± 0.30 vs. 1.74 ± 0.31 g/L, p=0.02). Given that (i) ANGPTL3 is a

26 direct target gene of the LXR nuclear receptor (26) and that (ii) we have previously shown that the

27 LXRα rs11039155 (-6 G/A) SNP was associated with plasma HDL-cholesterol levels in the MONICA

8
 1 Lille study (27), we checked whether the association between ANGPTL3 rs11207997 and HDL-

2 cholesterol could be modulated by the LXRα rs11039155 SNP. However, no significant interaction

3 between these 2 SNPs on HDL-cholesterol levels could be detected (p=0.29).

5 Study of ANGPTL4’s genetic variability

6 The MAFs for the rs4076317, rs2278236, rs1044250 and rs11672433 SNPs were respectively

7 0.29, 0.48, 0.29 and 0.14 in the HELENA-CSS and 0.28, 0.46, 0.30, and 0.16 in the MONICA Lille

8 study. Hardy-Weinberg equilibrium was observed for all 4 SNPs in the MONICA Lille study and in

9 all but one center for the HELENA-CSS. The exceptions were rs4076317 and rs2278236 in the

10 HELENA-CSS Vienna sample (p=0.011 and p=0.047, respectively), which may be due to the small
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11 number of subjects recruited (n~100).

12 We used Thesias ([Link] (28) and Haploview

13 ([Link] softwares to evaluate the LD between the 4

14 ANGPTL4 SNPs in the MONICA Lille study (Table 3). All SNPs were in weak LD with the others

15 (r²<0.50). Similar LD pattern was observed in the HELENA-CSS (data not shown).

16 We did not find any association between rs2278236, rs1044250 or rs11672433 and any of the

17 studied phenotypes in either the HELENA-CSS or the MONICA Lille sample (data not shown). In

18 contrast, we found a significant association between rs4076317 and the percentage of body fat in the

19 HELENA-CSS; GG subjects had a significantly higher percentage of body fat than C allele bearers

20 (26.2 ± 11.3 vs. 23.6 ± 9.6 %, p=0.02) (Table 4). This association was still present after (i) further

21 adjustment for physical activity or pubertal status and (ii) removal of the Vienna center, in which the

22 Hardy-Weinberg equilibrium was not respected (data not shown).

23 In the MONICA Lille study, the percentage of body fat was not available but GG subjects had

24 a higher waist-to-hip ratio than C allele bearers (0.892 ± 0.09 vs. 0.885 ± 0.10, p=0.02). Given that (i)

25 ANGPTL4 is a direct target gene of PPARs (12) and (ii) we have previously reported that the PPARG

26 Pro12Ala (rs1801282 C>G) polymorphism was associated with adiposity parameters in the MONICA

27 Lille study (29), we looked at whether this ANGPTL4 SNP interacted with the PPARG Pro12Ala

28 polymorphism regarding anthropometric measurements. In the MONICA Lille sample, we detected a

9
 1 significant gene-gene interaction (p=0.007) between ANGPTL4 rs4076317 (used in a recessive model)

2 and PPARG Pro12Ala (used in a dominant model) for the waist-to-hip ratio. Indeed, the group of

3 subjects carrying both the PPARG Ala12 allele and the ANGPTL4 rs4076317 GG genotype (n=18) had

4 a higher waist-to-hip ratio (p=0.0004) than the three other subject groups (Figure 1). In the HELENA-

5 CSS, no such gene-gene interaction could be detected; maybe because of the youth of the subjects.

7 Discussion

8 In the present work, we examined the associations between ANGPTL3 and ANGPTL4

9 common genetic variability and metabolic traits in adolescent and adult population-based studies.

10 Rs11207997 (the only frequent SNP described in the ANGPTL3 gene) was consistently associated
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11 with lower plasma HDL-cholesterol and ApoA1 levels in both adolescents and adults. Several GWAS

12 have described associations between three intergenic SNPs nearby the ANGPTL3 locus (rs1748195,

13 rs12130333 and rs10889353) and plasma TG levels (15-17). These SNPs are located at 13.6 kbp

14 upstream and 47 kbp and 121 kbp downstream from the ANGPTL3 gene, respectively, but, together

15 with rs11207997, belong to the same haplotype block (see supplementary Figure 1). Contrary to these

16 GWAS, we did not detect significant association between rs11207997 and plasma TG levels.

17 However, the effect size on TG levels described in these GWAS is too small to be detected in our

18 study. Indeed, Willer et al. reported a 7 mg/dL difference in TG levels between alleles (15) but the

19 statistical power of our study was only 29% to detect such a difference in MONICA Lille.

20 Unlike the present study, these GWAS did not report any significant associations between

21 ANGPTL3 SNPs and HDL-cholesterol levels. Nevertheless, in the GWAS of Kathiresan et al., the

22 rs10889353 SNP, in very high LD with rs11207997 (r²=0.88), was associated with lower plasma

23 HDL-cholesterol (p=0.04), LDL-cholesterol (p=0.016), total cholesterol (p=0.00024), ApoB (p=0.014)

24 and ApoC3 (p=0.004) levels in Framingham Heart Study 2nd generation participants (16). Our results

25 may be overestimated but are coherent with these findings and with the role of ANGPTL3 in HDL

26 metabolism: (i) ANGPTL3 inhibits EL (8), which is a key regulator of HDL metabolism, that

27 hydrolyses HDL phospholipids and decreases plasma HDL levels (30;31), and (ii) human plasma

28 ANGPTL3 levels are correlated with plasma HDL-cholesterol levels but not plasma TG levels (8),

10
 1 suggesting that the role of ANGPTL3 in regulation of HDL metabolism may be as important as its role

2 in regulation of TG metabolism.

3 The rs11207997 polymorphism is located within the promoter region of the ANGPTL3 gene,

4 1286 bp upstream from the transcription start site (TSS). Using Genomatix MatInspector and

5 ElDorado softwares ([Link]) {Cartharius, Frech, et al. 2005 59 /id}, we observed that a

6 binding site for NeuroD1 (neurogenic differentiation factor 1) was identified in the presence of the

7 rs11207997 C allele (matrix similarity = 1.00; core similarity = 0.98) and abolished in the presence of

8 the minor T allele. By RT-PCR, we checked whether ANGPTL3 and NeuroD1 were co-expressed in

9 brain (NeuroD1's main site of expression) or liver (ANGPTL3's main site of expression). NeuroD1

10 mRNA could be detected in brain but not in liver and vice versa for ANGPTL3 mRNA
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11 (supplementary Figure 2); ruling out the hypothesis whereby NeuroD1 could regulate ANGPTL3

12 expression. Therefore, further studies are needed to unravel the molecular mechanisms underlying the

13 genetic associations.

14 Four ANGPTL4 SNPs were analyzed in the present study. Several studies on ANGPTL4

15 genetic variability have revealed associations with lipid-related phenotypes. Romeo et al. showed that

16 the rare E40K variant (frequency: 0.03) was associated with lower TG levels and higher HDL-

17 cholesterol levels (32). This variant was also associated with lower plasma TG and LDL-cholesterol

18 levels, higher HDL-cholesterol levels, lower BMI, and lower risk of coronary heart disease in the

19 ARIC study (33). Staiger et al. did not find any associations between the four ANGPTL4 SNPs

20 investigated in the present study and metabolic traits in a low-powered study (n=629) in which 76% of

21 the subjects had a family history of diabetes (34). Talmud et al. detected associations between the

22 rs1044250 (T266M) polymorphism and lower plasma TG and higher HDL-cholesterol levels in a

23 sample of 2772 men, although this effect was entirely due to the E40K mutation (35). We analyzed the

24 rs1044250 (T266M) SNP in our population samples but did not find any association. We did not

25 assess the effect of the E40K variant since the low MAF (0.03) of this mutation meant that only 5

26 subjects would have carried the K40 allele in our sample. More recently, a GWAS has shown an

27 association between rs2967605 near ANGPTL4 and plasma HDL-cholesterol levels in ~35000

28 individuals (17). This SNP is located 30 kbp downstream from ANGPTL4 and is in weak LD (r²<0,33

11
 1 in HapMap) with the ones we studied and that are located within ANGPTL4. The association between

2 rs2967605 and HDL-cholesterol level reported in this GWAS may therefore well not be due to

3 ANGPTL4.

4 The association we detected between rs4076317 in ANGPTL4 and body fat in adolescents or

5 waist-to-hip ratio in adults has not been shown before. However, ANGPTL4 genetic variability has

6 been already associated with adiposity as Folsom et al. described an association between the

7 ANGPTL4 E40K rare variant and BMI (33). To our knowledge, no ANGPTL4 SNPs have been

8 significantly associated with adiposity parameters in GWAS. However, due to the required very low p

9 value threshold in GWAS (<10-8), SNPs in ANGPTL4 might have been nominally associated with

10 these parameters and not actually reported. In MONICA Lille, we detected a gene-gene interaction
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11 between ANGPTL4 and PPARG when considering the waist-to-hip ratio. ANGPTL4 is a direct target

12 gene of PPARγ, a major orchestrator of adipocyte differentiation (36) and the PPARG Pro12Ala

13 polymorphism is known to be associated with fat mass (37). The fact that the waist-to-hip ratio was

14 the only anthropometric parameter that came out of this gene-gene interaction suggests that the role of

15 ANGPTL4 on fat mass might vary from one fat depot to another. However, as the number of subjects

16 carrying minor alleles of PPARG and ANGPTL4 SNPs is small, these data need to be taken with

17 caution and replicated in other population samples. If this gene-gene interaction was confirmed, it

18 could also explain the fact ANGPTL4 has not been associated with obesity in GWAS. Further studies

19 are needed to validate this hypothesis.

20 The association between ANGPTL4 genetic variation and adiposity is coherent with the role of

21 the protein in fat mass regulation. First, LPL (which is inhibited by ANGPTL4) genetic variability is

22 associated with obesity (38). Second, Angptl4 plays an important role in the intestine as a mediator of

23 the microbial regulation of peripheral fat storage (13). Last but not least, Angptl4 induces adipose TG

24 lipase expression, which stimulates adipose tissue lipolysis and therefore promotes adipose tissue

25 weight loss (5). The rs4076317 polymorphism is located within the promoter region of the ANGPTL4

26 gene, 12 bp upstream from the TSS. According to Genomatix Eldorado software, there was no

27 difference between the rs4076317 C and G alleles in terms of different predicted binding sites.

12
 1 In conclusion, the observed associations between ANGPTL3 polymorphism and plasma HDL-

2 cholesterol and ApoA1 levels (as early as in adolescence) underline the role of ANGPTL3 in HDL-

3 cholesterol metabolism in humans. Our data also suggest associations between ANGPTL4 rs4076317

4 and indicators of fat mass. Although our findings warrant replication, they imply that (as in the mouse)

5 ANGPTL4 is involved in the signaling pathways in fat and other tissues which prevent fat storage and

6 stimulate fat mobilization.

9 Acknowledgements

10 Many thanks to Christel Bierschbach, Adelheid Schuch, Anke Berchtold, Petra Pickert, Anke
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11 Carstensen, for their contribution to laboratory work.

12

13

14 References

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23 4 Shimamura M, Matsuda M, Kobayashi S, Ando Y, Ono M, Koishi R, Furukawa H,

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 1 6 Koishi R, Ando Y, Ono M, Shimamura M, Yasumo H, Fujiwara T, Horikoshi H, Furukawa

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8 Ando Y, Koishi R, Kohama T, Sakai N, Kotani K, Komuro R, Ishida T, Hirata K,

9 Yamashita S, Furukawa H, Shimomura I 2007 Angiopoietin-like protein3 regulates plasma

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12 9 Lichtenstein L, Berbee JF, van Dijk SJ, van Dijk KW, Bensadoun A, Kema IP, Voshol PJ,

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16 10 Conklin D, Gilbertson D, Taft DW, Maurer MF, Whitmore TE, Smith DL, Walker KM,

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19 11 Kersten S, Mandard S, Tan NS, Escher P, Metzger D, Chambon P, Gonzalez FJ, Desvergne

20 B, Wahli W 2000 Characterization of the fasting-induced adipose factor FIAF, a novel

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22 12 Yoon JC, Chickering TW, Rosen ED, Dussault B, Qin Y, Soukas A, Friedman JM, Holmes

23 WE, Spiegelman BM 2000 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma target gene

24 encoding a novel angiopoietin-related protein associated with adipose differentiation. Mol Cell

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26 13 Backhed F, Ding H, Wang T, Hooper LV, Koh GY, Nagy A, Semenkovich CF, Gordon JI

27 2004 The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proc Natl Acad Sci

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14
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2 AW, Lam KS 2005 Angiopoietin-like protein 4 decreases blood glucose and improves glucose

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5 15 Willer CJ, Sanna S, Jackson AU, Scuteri A, Bonnycastle LL, Clarke R, Heath SC, Timpson

6 NJ, Najjar SS, Stringham HM, Strait J, Duren WL, Maschio A, Busonero F, Mulas A, Albai

7 G, Swift AJ, Morken MA, Narisu N, Bennett D, Parish S, Shen H, Galan P, Meneton P,

8 Hercberg S, Zelenika D, Chen WM, Li Y, Scott LJ, Scheet PA, Sundvall J, Watanabe RM,

9 Nagaraja R, Ebrahim S, Lawlor DA, Ben Shlomo Y, Davey-Smith G, Shuldiner AR, Collins

10 R, Bergman RN, Uda M, Tuomilehto J, Cao A, Collins FS, Lakatta E, Lathrop GM,
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11 Boehnke M, Schlessinger D, Mohlke KL, Abecasis GR 2008 Newly identified loci that

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13 16 Kathiresan S, Melander O, Guiducci C, Surti A, Burtt NP, Rieder MJ, Cooper GM, Roos C,

14 Voight BF, Havulinna AS, Wahlstrand B, Hedner T, Corella D, Tai ES, Ordovas JM,

15 Berglund G, Vartiainen E, Jousilahti P, Hedblad B, Taskinen MR, Newton-Cheh C, Salomaa

16 V, Peltonen L, Groop L, Altshuler DM, Orho-Melander M 2008 Six new loci associated with

17 blood low-density lipoprotein cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol or triglycerides in

18 humans. Nat Genet 40:189-197.

19 17 Kathiresan S, Willer CJ, Peloso GM, Demissie S, Musunuru K, Schadt EE, Kaplan L,

20 Bennett D, Li Y, Tanaka T, Voight BF, Bonnycastle LL, Jackson AU, Crawford G, Surti A,

21 Guiducci C, Burtt NP, Parish S, Clarke R, Zelenika D, Kubalanza KA, Morken MA, Scott

22 LJ, Stringham HM, Galan P, Swift AJ, Kuusisto J, Bergman RN, Sundvall J, Laakso M,

23 Ferrucci L, Scheet P, Sanna S, Uda M, Yang Q, Lunetta KL, Dupuis J, de Bakker PI,

24 O'Donnell CJ, Chambers JC, Kooner JS, Hercberg S, Meneton P, Lakatta EG, Scuteri A,

25 Schlessinger D, Tuomilehto J, Collins FS, Groop L, Altshuler D , Collins R, Lathrop GM,

26 Melander O, Salomaa V, Peltonen L, Orho-Melander M, Ordovas JM, Boehnke M, Abecasis

27 GR, Mohlke KL, Cupples LA 2009 Common variants at 30 loci contribute to polygenic

28 dyslipidemia. Nat Genet 41:56-65.

15
 1 18 Moreno LA, Gonzalez-Gross M, Kersting M, Molnar D, de Henauw S, Beghin L, Sjostrom

2 M, Hagstromer M, Manios Y, Gilbert CC, Ortega FB, Dallongeville J, Arcella D, Warnberg

3 J, Hallberg M, Fredriksson H, Maes L, Widhalm K, Kafatos AG, Marcos A 2008 Assessing,

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5 adolescents: the HELENA (Healthy Lifestyle in Europe by Nutrition in Adolescence) Study.

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7 19 Moreno LA, de Henauw S, Gonzalez-Gross M, Kersting M, Molnar D, Gottrand F, Barrios

8 L, Sjostrom M, Manios Y, Gilbert CC, Leclercq C, Widhalm K, Kafatos A, Marcos A 2008

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10 Sectional Study. Int J Obes (Lond) 32 Suppl 5:S4-S11.

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11 20 Slaughter MH, Lohman TG, Boileau RA, Horswill CA, Stillman RJ, Van Loan MD, Bemben

12 DA 1988 Skinfold equations for estimation of body fatness in children and youth. Hum Biol

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14 21 Hagstromer M, Bergman P, De B, I, Ortega FB, Ruiz JR, Manios Y, Rey-Lopez JP, Phillipp

15 K, von Berlepsch J, Sjostrom M 2008 Concurrent validity of a modified version of the

16 International Physical Activity Questionnaire (IPAQ-A) in European adolescents: The HELENA

17 Study. Int J Obes (Lond) 32 Suppl 5:S42-S48.

18 22 Gonzalez-Gross M, Breidenassel C, Gomez-Martinez S, Ferrari M, Beghin L, Spinneker A,

19 Diaz LE, Maiani G, Demailly A, Al Tahan J, Albers U, Warnberg J, Stoffel-Wagner B,

20 Jimenez-Pavon D, Libersa C, Pietrzik K, Marcos A , Stehle P 2008 Sampling and processing

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23 23 Dallongeville J, Meirhaeghe A, Cottel D, Fruchart JC, Amouyel P, Helbecque N 2000 Gender

24 related association between genetic variations of APOC-III gene and lipid and lipoprotein

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10 29 Meirhaeghe A, Fajas L, Helbecque N, Cottel D, Auwerx J, Deeb SS, Amouyel P 2000 Impact
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11 of the Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma2 Pro12Ala polymorphism on adiposity,

12 lipids and non-insulin-dependent diabetes mellitus. Int J Obes Relat Metab Disord 24:195-199.

13 30 Badellino KO, Rader DJ 2004 The role of endothelial lipase in high-density lipoprotein

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17 32 Romeo S, Pennacchio LA, Fu Y, Boerwinkle E, Tybjaerg-Hansen A, Hobbs HH, Cohen JC

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23 34 Staiger H, Machicao F, Werner R, Guirguis A, Weisser M, Stefan N, Fritsche A, Haring HU

24 2008 Genetic variation within the ANGPTL4 gene is not associated with metabolic traits in white

25 subjects at an increased risk for type 2 diabetes mellitus. Metabolism 57:637-643.

26 35 Talmud PJ, Smart M, Presswood E, Cooper JA, Nicaud V, Drenos F, Palmen J, Marmot

27 MG, Boekholdt SM, Wareham NJ, Khaw KT, Kumari M, Humphries SE 2008 ANGPTL4

17
 1 E40K and T266M: effects on plasma triglyceride and HDL levels, postprandial responses, and

2 CHD risk. Arterioscler Thromb Vasc Biol 28:2319-2325.

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10 Doss S, Ghazalpour A, Horvath S, Drake TA, Lusis AJ, Schadt EE 2008 Variations in DNA
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11 elucidate molecular networks that cause disease. Nature 452:429-435.

12

18
 1 Figure legends

2 Figure 1. Analysis of the gene-gene interaction between the PPARG Pro12Ala and ANGPTL4

3 rs4076317 C/G polymorphisms. Data are expressed as means adjusted for age, gender, smoking status,

4 alcohol consumption and physical activity, ± standard error of the mean. Non-parametric tests were

5 used. Subjects carrying the PPARG ProPro genotype and the ANGPTL4 rs4076317 C allele (n=832)

6 are represented in white. Subjects carrying the PPARG ProPro and the ANGPTL4 rs4076317 GG

7 genotypes (n=72) are represented in light grey. Subjects carrying the PPARG Ala12 and the ANGPTL4

8 rs4076317 C alleles (n=225) are represented in dark grey. Subjects carrying both the PPARG Ala12

9 allele and the ANGPTL4 rs4076317 GG genotype (n=18) are represented in black. The p value for the

10 PPARG x ANGPTL4 interaction was 0.007. p=0.0004 for the comparison between
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11 ProAla+AlaAla/GG and the 3 other groups.

12

13 Supplementary Figure 1. Linkage disequilibrium map of the region encompassing ANGPTL3 and the

14 SNPs associated in GWAS (15-17). D’ and r² values were calculated using Haploview software. D’

15 values are represented by a colour scale: from white (D’=0) to red (D’=1). r² values are given within

16 the diamonds. The 3 SNPs studied in GWAS (rs1748195, rs12130333 and rs10889353) are

17 surrounded by red squares, the rs11207997 SNP we studied is surrounded by a blue square.

18

19 Supplementary Figure 2. Analysis of NeuroD1 and ANGPTL3 mRNA expression in brain and liver

20 using RT-PCR. Human liver total RNA was obtained from BioChain Institute (Clinisciences,

21 Montrouge, France). Human brain total RNA was a kind gift from Dr JC Lambert, Lille, France.

22 Reverse transcription was performed initially on 1 µg of total RNA using random hexameric primers

23 and multiscribe reverse transcriptase (Applied Biosystems). cDNAs were amplified by PCR with

24 specific primers: 5’-GCTCAGGACCTACTAACAACAA-3’ (forward) and 5’-

25 TCTTCCAGGTCCTCATCTTCGT-3’ (reverse) for NeuroD1; 5’-CAGAAGGACTAGTATTCAAG-

26 3’ (forward) and 5’-GTGATCCATCTATTCGATGT-3’ (reverse) for ANGPTL3. The expected sizes

27 of the NeuroD1 and ANGPTL3 RT-PCR products were 238 bp and 269 bp, respectively. A negative

19
 1 control (NC) was performed by omitting the RNA sample. The RT-PCR products were run on a 3%

2 agarose gel.

3
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20
 1 Table 1. Characteristics of the subjects from the HELENA-CSS and MONICA Lille.

HELENA-CSS (1144) MONICA Lille (1155)

Male / female (%) 48.0 / 52.0 50.7 / 49.3

Age (years) 14.8 ± 1.4 51.3 ± 8.5
Weight (kg) 58.4 ± 13.0 74.3 ± 15.5
BMI (kg/m²) 21.3 ± 3.8 26.6 ± 5.0
Waist (cm) 72.3 ± 9.3 91.0 ± 13.9
Waist/hip ratio 0.794 ± 0.07 0.885 ± 0.096
Body fat (%) 23.8 ± 9.8 NA
Triglyceride (mmol/L) 0.79 ± 0.40 1.41 ± 1.14
HDL-cholesterol (mmol/L) 1.43 ± 0.27 1.50 ± 0.48
LDL-cholesterol (mmol/L) 2.45 ± 0.65 3.78 ± 1.03
ApoAI (g/L) 1.51 ± 0.22 1.73 ± 0.31
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ApoB (g/L) 0.65 ± 0.16 1.21 ± 0.30

Glucose (mmol/L) 5.00 ± 0.40 5.55 ± 1.54
Insulin (µIU/mL) 9.93 ± 5.88 11.93 ± 7.92
Dyslipidemia (%) NA 49.7
Hypertension (%) NA 45.1
Coronary heart disease (%) NA 2.5
Diabetes mellitus (%) NA 10.9
2

3 Data are expressed as means ± SD or %. NA: not available.

21
 1 Table 2. Association between ANGPTL3 rs11207997 and anthropometric and biochemical phenotypes.

HELENA-CSS MONICA Lille

CC CT TT p p p CC CT TT p p p
(549) (478) (104) trend CT/TT vs CC TT vs CC/CT (499) (503) (140) trend CT/TT vs CC TT vs CC/CT

BMI (kg/m²) 21.4 ± 3.7 21.4 ± 3.9 20.6 ± 3.4 0.39 0.87 0.10 26.5 ± 5.2 26.6 ± 4.9 27.1 ± 4.6 0.33 0.58 0.24
Waist / hip ratio 0.796 ± 0.06 0.794 ± 0.08 0.788 ± 0.06 0.54 0.62 0.60 0.882 ± 0.10 0.889 ± 0.09 0.887 ± 0.09 0.04 0.12 0.06
Body fat (%) 23.9 ± 9.6 24.0 ± 10.0 22.6 ± 9.4 0.80 0.54 0.62 NA
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

a
Triglyceride (mmol/L) 0.79 ± 0.39 0.79 ± 0.40 0.80 ± 0.50 0.73 0.77 0.78 1.43 ± 1.26 1.38 ± 1.14 1.19 ± 0.65 0.15 0.30 0.15
a
HDL-chol. (mmol/L) 1.46 ± 0.28 1.41 ± 0.27 1.38 ± 0.26 0.0001 0.0004 0.02 1.50 ± 0.50 1.53 ± 0.47 1.45 ± 0.43 0.03 0.48 0.03
a
LDL-chol. (mmol/L) 2.45 ± 0.63 2.45 ± 0.66 2.48 ± 0.67 0.63 0.86 0.42 3.79 ± 1.02 3.70 ± 1.03 3.77 ± 1.06 0.41 0.23 0.89
a
ApoAI (g/L) 1.53 ± 0.22 1.48 ± 0.22 1.48 ± 0.22 0.00007 0.00006 0.06 1.74 ± 0.33 1.74 ± 0.30 1.69 ± 0.31 0.06 0.78 0.02
a
ApoB (g/L) 0.65 ± 0.16 0.65 ± 0.16 0.67 ± 0.17 0.60 0.77 0.29 1.23 ± 0.29 1.21 ± 0.30 1.20 ± 0.31 0.77 0.47 0.75
b
Glucose (mmol/L) 5.02 ± 0.38 4.99 ± 0.41 5.04 ± 0.44 0.50 0.85 0.23 5.39 ± 1.20 5.35 ± 0.88 5.27 ± 0.82 0.25 0.27 0.13
b
Insulin (µIU/mL) 9.86 ± 5.75 10.07 ± 6.01 9.93 ± 6.15 0.11 0.18 0.04 12.06 ± 8.96 11.64 ± 6.98 11.76 ± 7.76 0.54 0.41 0.34
2

3 Data are expressed as means ± SD. p values are adjusted for confounding variables. In MONICA Lille, we excluded subjects treated with a lipid lowering

4 therapy or b antidiabetic drugs. NA : not available.

22
 1 Table 3. Linkage disequilibrium (D' and r²) between the 4 ANGPTL4 SNPs in the MONICA Lille

2 study.

SNP rs4076317 rs2278236 rs1044250 rs11672433

(frequency) (0.28) (0.46) (0.30) (0.16)
rs4076317 - +1.0 -1.0 -1.0
rs2278236 0.44 - -1.0 -1.0
rs1044250 0.17 0.37 - -1.0
rs11672433 0.07 0.15 0.08 -
3

4 D' values are displayed in the upper right corner and r² values in the lower left corner.

5
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

23
 1 Table 4. Association between ANGPTL4 rs4076317 and anthropometric and biochemical phenotypes.

HELENA-CSS MONICA Lille

CC CG GG p p p CC CG GG p p p
(593) (439) (112) trend CG/GG vs CC GG vs CC/CG (584) (474) (90) trend CG/GG vs CC GG vs CC/CG

BMI (kg/m²) 21.5 ± 3.7 21.1 ± 3.7 21.7 ± 4.1 0.25 0.07 0.64 26.6 ± 5.1 26.6 ± 4.8 27.3 ± 5.5 0.23 0.50 0.11
Waist / hip ratio 0.793 ± 0.07 0.793 ± 0.07 0.806 ± 0.08 0.38 0.59 0.15 0.885 ± 0.1 0.885 ± 0.09 0.892 ± 0.09 0.32 0.98 0.02
Body fat (%) 23.6 ± 9.6 23.5 ± 9.6 26.2 ± 11.3 0.29 0.83 0.02 NA
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Triglyceride (mmol/L)a 0.80 ± 0.43 0.76 ± 0.35 0.83 ± 0.43 0.97 0.87 0.52 1.44 ± 1.22 1.32 ± 1.11 1.33 ± 0.84 0.28 0.11 0.71
a
HDL-chol. (mmol/L) 1.41 ± 0.27 1.45 ± 0.27 1.42 ± 0.29 0.20 0.09 0.98 1.52 ± 0.50 1.52 ± 0.46 1.39 ± 0.44 0.19 0.96 0.08
a
LDL-chol. (mmol/L) 2.46 ± 0.65 2.43 ± 0.62 2.47 ± 0.73 0.83 0.68 0.85 3.74 ± 1.01 3.76 ± 1.01 3.78 ± 1.25 0.93 0.72 0.81
a
ApoAI (g/L) 1.49 ± 0.22 1.52 ± 0.23 1.50 ± 0.20 0.20 0.09 0.97 1.74 ± 0.31 1.74 ± 0.31 1.66 ± 0.29 0.28 0.71 0.11
a
ApoB (g/L) 0.66 ± 0.16 0.65 ± 0.15 0.65 ± 0.17 0.44 0.35 0.88 1.20 ± 0.30 1.19 ± 0.28 1.22 ± 0.35 0.68 0.86 0.38
b
Glucose (mmol/L) 5.02 ± 0.40 5.00 ± 0.40 4.98 ± 0.37 0.19 0.23 0.34 5.37 ± 1.14 5.34 ± 0.89 5.36 ± 0.91 0.91 0.87 0.74
b
Insulin (µIU/mL) 9.89 ± 5.91 9.90 ± 5.98 10.22 ± 5.37 0.88 0.84 0.99 11.91 ± 7.81 11.77 ± 8.34 11.64 ± 7.25 0.53 0.36 0.38
2

3 Data are expressed as means ± SD. p values are adjusted for confounding variables. In MONICA Lille, we excluded subjects treated with a lipid lowering

4 therapy or b antidiabetic drugs. NA : not available.

24
 Figure 1. Analysis of the gene-gene interaction between the PPARG Pro12Ala and ANGPTL4 rs4076317 C/G
polymorphisms in the MONICA Lille study.

0.0004

0.06
Waist/hip ratio
0.001
0.96

0.94

0.92
ProPro/CC+CG
0.90 ProPro/GG
0.88 ProAla+AlaAla/CC+CG
ProAla+AlaAla/GG
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

0.86

0.84

0.82
(n=832) (n=72) (n=225) (n=18)
 Supplementary table 1. Conditions of ANGPTL-3 & -4 SNPs genotyping by the restriction fragment length polymorphism method

Gene SNPs Forward primer Reverse primer Annealing MgCl2 Restriction Sizes of fragments (bp)
temperature (mM) enzyme
(°C)
ANGPTL3 rs11207997 AGCACTGTTCTAAGTGCTCTA CATGGATTAGTCTCCTCAAC 51 4.5 Hpy CH4III C= 79+20+6 ; T= 99+6
ANGPTL4 rs4076317 GAGAGCCACAGTTTGGCATC CGCTCAGCTCGGCTTCTC 58 1.5 Bgl I C= 197 ; G= 139+58
rs2278236 GATACAAGAGTGTTTCTGGTC GGTGCTGGAGAAGGTAGAA 60 2.5 Bse RI T= 190 ; C= 102+88
rs1044250 TGCCTCATGGAGTGGCCTCT TGTCCTCGCCACCCAGGT 60 2.5 Nla III C= 156+9 ; T= 94+62+9
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

rs35061979 CACGGTAGGTGTTTCTAGTGG TGGAGAAGGGTACGGAGAGG 60 2.5 Pst I G= 199+74+45 ; A= 169+74+45+30

rs11672433 CTGCAGCCATTCCAACCTCA GCAGAGCCAAGAGTCACCGT 60 2.5 Msp A1I G= 109+57+52 ; A= 166+52
 Supplementary Figure 1. Linkage disequilibrium map of the region encompassing the ANGPTL3 gene and the SNPs associated in GWAS

ANGPTL3
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009
 Supplementary Figure 2. Analysis of NeuroD1 and ANGPTL3 mRNA expression level in brain
and liver using RT-PCR.

in

r
NC
live
bra
300bp
NeuroD1
200bp

300bp
ANGPTL3
200bp
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009
 Résultats

IV.2. Synthèse des résultats

L’analyse de la variabilité génétique d’ANGPTL3 et -4 dans les bases de données

HapMap et NCBI a révélé qu’il n’existe qu’un seul polymorphisme fréquent (MAF>0,33) dans
le gène ANGPTL3 (rs11207997, situé dans le promoteur) et nous a permis de sélectionné 4
SNPs du gène ANGPTL4 : rs4076317 (promoteur), rs2278236 (intron 3), rs1044250
(T266M) et rs11672433 (P389P) couvrant la totalité de la variabilité génétique commune
d’ANGPTL4. Nous avons alors génotypé les individus des études HELENA (n=1155) et
MONICA Lille (n=1156) pour ces 5 polymorphismes et recherché des associations
statistiques entre ces SNPs et les phénotypes métaboliques (voir les caractéristiques des
populations étudiées dans les chapitres III.1. et III.3. des Matériels et Méthodes pages 80 et
82).
Le polymorphisme rs11207997 (MAF 0,32) d’ANGPTL3 est associé à une diminution
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

des taux plasmatiques de HDL-cholestérol et d’ApoA1 chez les adolescents et les

adultes. Concernant ANGPTL4, le SNP rs4076317 (MAF 0,29) est associé à une diminution
du taux plasmatique de TG chez les adultes mais pas chez les adolescents. De plus, ce
même polymorphisme est associé à une augmentation du pourcentage de masse grasse
chez les adolescents et une augmentation du RTH chez les adultes. Pour cette dernière
association, nous avons en plus détecté une interaction gène-gène entre les
polymorphismes rs4076317 de ANGPTL4 et Pro12Ala du gène PPARG chez les
adultes : c’est en fait la combinaison des allèles mineurs des 2 polymorphismes ANGPTL4 et
PPARG qui est associée à l’augmentation du RTH.

IV.3. Discussion

Nous avons donc détecté une association entre un SNP d’ANGPTL3 et les
concentrations plasmatiques d’HDL-cholestérol et d’ApoA1 dans 2 échantillons indépendants
(adultes et adolescents). De récentes GWAS ont décrit des associations entre plusieurs
SNPs situés à proximité du gène ANGPTL3 et la concentration plasmatique de TG [Willer et
al. 2008; Kathiresan et al. 2008; Kathiresan et al. 2009]. Certes ces SNPs sont éloignés du
gène ANGPTL3 (entre 13 kpb en 5’ et 122 kpb en 3’ du gène) mais ils semblent tous
appartenir au même bloc haplotypique (voir la Figure supplémentaire de l’article).
Contrairement à ces GWAS, nous n’avons pas détecté d’association entre le SNP
rs11207997 d’ANGPTL3 et le taux plasmatique de TG dans nos échantillons de population.
Ceci pourrait s’expliquer par un manque de puissance de notre étude. En effet, les effectifs
des échantillons HELENA et MONICA Lille (n=1155 et 1156, respectivement) ne permettent

108
 Résultats

pas de détecter l’effet observé sur le taux plasmatique de TG qui est reporté dans les GWAS
[Willer et al. 2008; Kathiresan et al. 2008; Kathiresan et al. 2009]. Par ailleurs, ces GWAS
n’ont pas reporté d’association significative entre les SNPs d’ANGPTL3 et le HDL-
cholestérol. Cependant, si l’on considère les associations nominales, c’est-à-dire les
associations dont le test de significativité est compris entre le seuil corrigé pour tests
multiples (5.10-8) et le seuil standard (0,05), alors le SNP rs10889353, en DL parfait avec
rs11207997 (r²=0,88), est associé à une diminution des taux plasmatiques de HDL-
cholestérol ainsi que du cholestérol total, du LDL-cholestérol, de l’ApoB, de l’ApoC3, des TG
et des VLDL dans la GWAS de Kathiresan et al [Kathiresan et al. 2008]. Les associations
entre le rs11207997 et les taux plasmatiques de HDL-cholestérol et d’ApoA1 que nous
avons observées dans MONICA Lille et HELENA sont probablement surestimées.
Néanmoins, l’ensemble des études génétiques d’ANGPTL3 s’accordent pour dire que ce
gène est situé dans un locus dont la variabilité génétique est associée à une modulation du
profil lipidique [Korstanje et al. 2004; Willer et al. 2008; Kathiresan et al. 2008; Kathiresan et
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

al. 2009; Romeo et al. 2009]. Etant donné le rôle d’ANGPTL3 dans le métabolisme des TG
(par l’inhibition de la LPL, enzyme clé dans la clairance des VLDL) et du HDL-cholestérol
(par l’inhibition de l’EL, enzyme clé dans le métabolisme du HDL) [Hato et al. 2008], les
associations observées entre ces SNPs et le profil lipidique pourraient être attribuées à
ANGPTL3. Nous avons alors envisagé de tester la fonctionnalité du SNP rs11207997.
Comme il est situé dans le promoteur d’ANGPTL3, 1286 pb en amont du site d’initiation de la
transcription, ce SNP pourrait modifier l’affinité pour un facteur de transcription qui régulerait
l’expression d’ANGPTL3. Des analyses in silico ont révélé que l’allèle mineur de ce SNP
abolit un site potentiel de fixation pour NeuroD1, facteur de transcription régulant
l’expression du gène de l’insuline et associé au diabète [Naya et al. 1995; Malecki et al.
1999]. Néanmoins, nos études d’expression ont montré que ANGPTL3 et NeuroD1 ne
semblent pas être co-exprimés dans les mêmes tissus, écartant ainsi la possibilité d’une
régulation d’ANGPTL3 par NeuroD1. Enfin, on pourrait envisager que le SNP rs11207997 ne
soit pas le SNP causal et soit en DL avec un SNP fonctionnel non identifié.
En ce qui concerne ANGPTL4, nous avons détecté une association entre le SNP
rs4076317 et le taux plasmatique de TG ainsi que l’adiposité. Notre étude est la première à
décrire une association entre ce SNP et ces traits métaboliques, bien qu’il ait déjà été
examiné dans deux précédentes études [Staiger et al. 2008; Talmud et al. 2008]. Ces
différences peuvent s’expliquer par la différence de population étudiée : l’étude de Staiger et
al comporte 629 individus dont 76% sont apparentés à des patients diabétiques [Staiger et
al. 2008] et celle de Talmud et al ne comporte que des hommes (n=2772) [Talmud et al.
2008]. L’association que nous avons observée avec le taux plasmatique de TG est en accord
avec l’étude de Romeo et al qui a montré que des variants rares d’ANGPTL4 sont associés

109
 Résultats

au taux de TG [Romeo et al. 2007]. Les associations que nous avons observées entre le
SNP rs4076317 et, d’une part, une diminution du taux plasmatique de TG, et d’autre part,
une augmentation de l’adiposité, reflètent tout à fait le caractère ambivalent d’ANGPTL4. En
fait, ANGPTL4 exerce un effet plutôt délétère dans le métabolisme des TG puisqu’en
inhibant la LPL, il inhibe la clairance des TG [Hato et al. 2008]. En revanche, ANGPTL4 joue
un rôle plutôt protecteur dans l’adiposité puisqu’il stimule la lipolyse, empêche le stockage
des graisses dans le TA, et inhibe l’absorption intestinale des graisses [Hato et al. 2008]. Par
ailleurs, ANGPTL4 est un gène cible de PPARγ, le chef d’orchestre de la différenciation
adipocytaire [Tontonoz et al. 2008]. En fait, l’association avec l’adiposité chez les adultes
semble être modulée par le polymorphisme Pro12Ala du gène PPARG, connu pour être
associé à une augmentation du TA [Tonjes et al. 2007]. Le fait que le RTH soit le seul
paramètre anthropométrique pour lequel l’interaction gène-gène est significative suggère que
le rôle d’ANGPTL4 pourrait varier suivant le type de dépôt de TA.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Récemment, une GWAS a décrit l’association d’un SNP situé à proximité du gène
ANGPTL4 avec la concentration d’HDL-cholestérol chez 40 000 individus environ
[Kathiresan et al. 2009]. Cependant, ce SNP est localisé à 30 kpb en aval d’ANGPTL4 et
présente un faible DL avec les SNPs que nous avons étudiés et qui sont, eux, localisés au
sein du gène (r²<0,33 selon HapMap), remettant alors en question l’attribution de l’effet de ce
SNP à ANGPTL4.

En conclusion, les associations que nous avons observées entre le seul

polymorphisme fréquent d’ANGPTL3 et les taux plasmatiques de HDL-cholestérol et
d’ApoA1, et ce, dès l’adolescence, soulignent le rôle d’ANGPTL3 dans le métabolisme
des HDLs chez l’homme.
Nous avons également détecté des associations entre un polymorphisme
d’ANGPTL4 et des indicateurs de la quantité et de la répartition de la masse grasse.
Bien que ces résultats requièrent confirmation, ils suggèrent que, comme chez la
souris, ANGPTL4 participerait à la régulation du stockage et de l’utilisation de
l’énergie chez l’homme.

110
 Résultats

IV. Etude du gène ANGPTL6

IV.1. Contexte de l’étude

ANGPTL6 a été récemment découverte (en 2003) et peu d’études à son sujet sont
publiées à ce jour. Comme les autres ANGPTLs, c’est une protéine plasmatique. Elle est
sécrétée principalement par le foie [Romeo et al. 2009]. En 2005, Oike et al ont décrit que
les souris KO Angptl6-/- qui survivent à la délétion du gène (seulement 20%) développent une
obésité marquée et une insulinorésistance [Oike et al. 2005]. De plus, l’injection d’Angptl6
chez la souris entraîne une perte de poids et une amélioration de la sensibilité de l’insuline,
et les souris transgéniques qui surexpriment Angptl6 sont résistantes à une obésité induite
par un régime hyperlipidique [Oike et al. 2005]. Au vu de ces données, nous avons émis
l’hypothèse que la variabilité d’ANGPTL6 pourrait influencer les phénotypes associés au
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

syndrome métabolique.

111
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Diabetes & Metabolism 35 (2009) 287–292

Original article

Association between angiopoietin-like 6 (ANGPTL6) gene polymorphisms

and metabolic syndrome-related phenotypes in the French MONICA Study
V. Legry a , L. Goumidi a , M. Huyvaert a , D. Cottel a , J. Ferrières b , D. Arveiler c , A. Bingham d ,
A. Wagner c , J.-B. Ruidavets b , P. Ducimetière d , P. Amouyel a , A. Meirhaeghe a,∗
a Inserm U744, UMR, institut Pasteur de Lille, université de Lille 2, BP 245, 1, rue du Pr-Calmette, 59019 Lille cedex, France
b Inserm U558, faculté de médecine, université Paul-Sabatier, Toulouse, France
c EA 1801, laboratoire d’épidémiologie et santé publique, faculté de médecine, université Louis-Pasteur, Strasbourg, France
d Inserm U909, université Paris-V, Villejuif, France

Received 20 November 2008; received in revised form 19 December 2008; accepted 22 December 2008
Available online 15 May 2009
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Abstract
Aim. – Although the ANGPTL6 (angiopoietin-like 6) gene product is now known to be involved in the regulation of fat mass and insulin sensitivity
in mice, its physiological functions in humans have yet to be determined.
Methods. – Subjects from the population-based French MONICA Study (n = 3402) were genotyped for single nucleotide polymorphisms (SNPs)
in ANGPTL6, and associations with anthropometric or biochemical phenotypes were looked for.
Results. – On evaluating the frequency of 17 ANGPTL6 SNPs in 100 randomly selected subjects on the basis of linkage disequilibrium mapping,
four SNPs (rs6511435, rs8112063, rs11671983 and rs15723) were found to cover more than 95% of the known ANGPTL6 genetic variability.
Subjects from the entire MONICA Study were then genotyped for these four SNPs. No significant association was detected for rs11671983 and
rs15723. In contrast, the G allele of rs8112063 was associated with lower plasma glucose levels (P = 0.009). Also, obese subjects carrying the G
allele of rs6511435 had higher plasma insulin levels than AA subjects (P = 0.0055). Moreover, the G allele of rs6511435 tended to be associated
with a 20% higher risk of the metabolic syndrome (P = 0.034). However, when false discovery rate testing (40 tests) was applied, these associations
were no longer statistically significant.
Conclusion. – These findings constitute the first study in humans of ANGPTL6 genetic variability. Although there was no evidence that
polymorphisms in ANGPTL6 might be significantly associated with the metabolic syndrome-related phenotypes, a weak association of these
polymorphisms with these parameters cannot be excluded. Further association studies are needed to arrive at any definite conclusions.
© 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Keywords: ANGPTL6 gene; Polymorphisms; Plasma glucose; Metabolic syndrome; Insulin resistance; Association study

Résumé
Étude d’association entre des polymorphismes du gène ANGPTL6 et des phénotypes du syndrome métabolique dans l’étude française MONICA.
But. – Bien que le rôle de l’ANGPTL6 (angiopoietine-like 6) dans la régulation de la masse grasse et la sensibilité à l’insuline ait été mis en
évidence chez la souris, ses fonctions physiologiques chez l’homme sont encore inconnues.
Méthodes. – Le génotypage des polymorphismes du gène ANGPTL6 a été réalisé chez les sujets de l’étude MONICA, représentative de la
population française âgée de 35 à 65 ans (n = 3402), à la recherche d’associations entre ces polymorphismes et les phénotypes anthropométriques
et biologiques.
Résultats. – Nous avons évalué la fréquence de 17 polymorphismes du gène ANGPTL6 chez 100 sujets tirés au sort de l’étude MONICA et, à partir
de la carte de déséquilibre de liaison, nous avons montré que quatre polymorphismes (rs6511435, rs8112063, rs11671983 et rs15723) couvraient
plus de 95 % de la variabilité génétique connue de ANGPTL6. Tous les individus de l’étude MONICA ont alors été génotypés pour ces quatre

Abbreviations: ANGPTL, Angiopoietin-like protein; CI, Confidence interval; HOMA-IR, Homoeostasis model assessment–insulin resistance; RFLP,
Restriction fragment length polymorphism; SNP, Single nucleotide polymorphism; WHO, World Health Organization.
∗ Corresponding author.

E-mail address: [Link]-hurez@[Link] (A. Meirhaeghe).

1262-3636/$ – see front matter © 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
doi:10.1016/[Link].2008.12.005
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288 V. Legry et al. / Diabetes & Metabolism 35 (2009) 287–292

polymorphismes. Aucune association n’a été détectée pour les polymorphismes rs11671983 et rs15723. À l’inverse, l’allèle G du polymorphisme
rs8112063 était associé à une glycémie plus basse (P = 0,009). De plus, les individus obèses porteurs de l’allèle G du polymorphisme rs6511435
présentaient une insulinémie plus élevée que les individus AA (P = 0,0055). L’allèle G du polymorphisme rs6511435 tendait également à être
associé à une augmentation du risque de 20 % de syndrome métabolique (P = 0,034). Cependant, lorsqu’on applique une correction pour tests
multiples (40 tests réalisés), ces associations n’étaient plus significatives.
Conclusion. – En conclusion, ces résultats constituent la première étude de la variabilité génétique du gène ANGPTL6 chez l’homme. Bien que
nous n’ayons pas mis en évidence d’association significative entre les polymorphismes d’ANGPTL6 et les phénotypes du syndrome métabolique,
nous ne pouvons pas exclure pour autant que des polymorphismes de ce gène puissent être faiblement associés à ces phénotypes. D’autres études
d’association sont nécessaires pour pouvoir conclure.
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Mots clés : Gène de l’ANGPTL6 ; Polymorphismes ; Glycémie ; Syndrome métabolique ; Insulinorésistance ; Études d’associations

1. Introduction 2. Materials and methods

Angiopoietin-like proteins [ANGPTLs] or ‘angiopoietin- 2.1. Subjects

related proteins’ [ARPs] are orphan ligands with a degree of
similarity to angiopoietins: they contain a coiled-coil domain Participants were recruited from the WHO–MONICA pop-
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and a fibrinogen-like domain, and have angiogenic effects ulation survey carried out from 1995 to 1997 in different
[1–10]. The ANGPTL family has seven members (ANGPTL regions of France: the Lille Urban Community in the north
1–7), which have been found in both humans and mice [11] (Lille, n = 1195); the Bas-Rhin county in the east (Strasbourg,
(except for ANGPTL5, identified only in humans [12]). The n = 1131); and the Haute-Garonne county in the south (Toulouse,
ANGPTLs are secreted proteins that serve as endocrine sig- n = 1182), as described elsewhere [15]. The study protocol was
nals in the peripheral tissues. Its most interesting member (in approved by the independent ethics committee of each respec-
terms of glucose, lipid homeostasis and insulin sensitivity) tive region. After signing an informed consent form, participants
is ANGPTL6 (also called ‘angiopoietin-related growth fac- were administered a standard questionnaire, while physical mea-
tor’ [AGF]). ANGPTL6 was first identified in 2003, and has surements were taken by a specially trained nurse. Physical
been characterized as an angiogenic factor involved in epider- activity was defined as at least 15 min/day of walking and/or
mal proliferation and wound healing [9,13]. Recently, it was the daily lifting or carrying of heavy objects at work and/or
shown that ANGPTL6 is involved in the development of obe- doing sports or physical exercise for more than 2 h/week. Cur-
sity and its related insulin resistance in mouse models [14]. rent cigarette smokers were defined as those who smoked at least
Indeed, Oike et al. have shown that mice surviving deletion one cigarette/day. Total alcohol intake (in mL) was calculated as
of the Angptl6 gene develop marked obesity, characterized by the total sum per week of wine, beer, cider and spirits. Anthropo-
an increase in fat depots and adipocyte size, hypercholestero- metric measurements were taken with the subjects wearing light
laemia, elevated plasma non-esterified fatty acid (NEFA) levels, clothing and no shoes. Body mass index (BMI) was calculated
hyperinsulinaemia and glucose intolerance. The increased fat according to the Quetelet equation, and the metabolic syndrome
mass was due to a decrease in energy expenditure rather than an was assessed using the WHO criteria [16].
increase in food intake. In addition, transgenic mice in which
Angptl6 was overexpressed displayed a significant reduction 2.2. Laboratory methods
in body weight (resulting from increased energy expenditure)
and improved insulin sensitivity [14]. These mice were also A 20 mL blood sample was drawn on disodium EDTA after
protected against high-fat diet-induced obesity and non-adipose- the subject had fasted for at least 10 h. Lipid and lipoprotein
tissue steatosis. levels were all measured at the Purpan Hospital Biochemi-
Little is known of the physiology of ANGPTL6. The mech- cal Laboratory (Toulouse), as described elsewhere [15]. The
anisms by which it stimulates energy expenditure and insulin homoeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-
sensitivity, and the nature of the tissues targeted by the pro- IR) index was calculated as the product of fasting plasma insulin
tein have yet to be established. In mice, Angptl6 is expressed (in ␮U/mL) and fasting plasma glucose (in mmol/L), divided by
predominantly in the liver, but also in haematopoietic cells 22.5 [17].
[13]. In humans, the ANGPTL6 gene is located on chromosome
19p13.2, but nothing is known of its expression and func- 2.3. Genotyping
tion. For this reason, we aimed to establish whether ANGPTL6
genetic variability could be associated with anthropometric or Single nucleotide polymorphism (SNP) typing was per-
biochemical phenotypes in humans using a sample popula- formed using the restriction fragment length polymorphism
tion (n = 3402) from the French population-based MONICA (RFLP) method (see Supplementary Data Table). The genotyp-
Study. ing success rate was greater than 96% for all SNPs. All SNPs
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V. Legry et al. / Diabetes & Metabolism 35 (2009) 287–292 289

respected the Hardy–Weinberg equilibrium (P > 0.05), except 3. Results

for rs6511435 (P = 0.002). However, the RFLP method can lead
to genotyping errors due to incomplete digestion so, to avoid this, ANGPTL6 SNPs were extracted from the Children’s Hospi-
the restriction enzyme was always added in excess. The geno- tal Informatics Program SNP ([Link]) and the NCBI
types in excess for the rs6511435 SNP corresponded to both the dbSNP databases, out of which 17 SNPs were selected, located
GG homozygote (uncut) and AA homozygote (cut) genotypes, from 1000 bp upstream of the first exon to 1000 bp downstream
ruling out the hypothesis that this was due to uncut diges- of the last exon: rs6511435; rs7260319; rs8109578; rs8101501;
tion products. Moreover, on checking 30% of the genotypes of rs10417676; rs9749206; rs10410922; rs8112063; rs11671983;
rs6511435 (n = 934) with another primer pair and another restric- rs8107814; rs2336689; rs6511432; rs6511431; rs10408727;
tion enzyme that cuts the other (G) allele (see Supplementary rs10408244; rs1044611; and rs15723. In the HapMap database
Data Table), only six discordant genotypes (0.6%) were (release 23), only the rs8109578, rs8112063, rs10408244 and
found, ruling out a problem with the genotyping technique. rs15723 SNPs were reported, and no tag SNPs were described.
Indeed, no reason for deviation from the Hardy–Weinberg To build the linkage disequilibrium map, 100 randomly
equilibrium can be identified in some cases [18]. Paired link- selected individuals from the MONICA Study were genotyped
age disequilibrium estimates were calculated using GOLD for the 17 selected SNPs. However, rs7260319, rs8101501,
software [19]. rs10417676, rs9749206, rs2336689, rs6511431, rs10408727
and rs1044611 were not detected in this sample, and the minor
2.4. Statistical analyses allele frequencies of the rs8109578, rs6511432 and rs10408244
SNPs were too low (0.05, 0.04 and 0.01, respectively) to
Statistical analyses were performed using SAS statistical yield sufficient statistical power in the analyses and so were
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software, version 8 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Inter- not pursued. The minor allele frequencies of the rs6511435,
group comparisons of quantitative variables were tested using rs10410922, rs8112063, rs11671983, rs8107814 and rs15723
a general linear model (the GLM procedure in SAS). Data SNPs were 0.25, 0.37, 0.37, 0.13, 0.10 and 0.10, respec-
for triglyceride, HOMA, glucose and insulin levels were log- tively. The linkage disequilibrium pattern across the SNPs was
transformed to obtain a normal distribution. For anthropometric assessed using both D’ and r2 (Fig. 1). Although the rs10410922,
variables, the confounding variables were age, gender, cen- rs8112063, rs11671983, rs8107814 and rs15723 SNPs were in
tre, smoking status, alcohol consumption and physical activity. linkage disequilibrium (|D’| = 1), complete allelic association
For biochemical variables, the confounding variables were (r2 = 1) was only observed for rs10410922 and rs8112063, and
age, gender, centre, BMI, smoking status, alcohol consumption for rs8107814 and rs15723. Rs6511435 was independent of the
and physical activity. Multivariate logistic-regression analyses other SNPs (maximum |D’| = 0.3 and r2 = 0.03).
were used to calculate the odds ratios (OR) for the metabolic Subjects from the MONICA population study (n = 3402)
syndrome adjusted for age, gender, centre, smoking status, alco- were then genotyped for the four SNPs — rs6511435, rs8112063
hol consumption and physical activity. Reported P values are (tagging rs10410922), rs11671983 and rs15723 (tagging
nominal. rs8107814) — that covered more than 95% of the known genetic

Fig. 1. Linkage disequilibrium across six ANGPTL6 polymorphisms. The D’ is displayed in the upper left corner and the r2 is displayed in the lower right corner.
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Table 1
Association between rs15723 and anthropometric and biochemical parameters.
rs15723 (n) TT (2751) TC (528) CC (35) P CC + TC vs TT

BMI (kg/m2 ) 26.3 ± 4.6 26.5 ± 4.7 27.8 ± 5.9 0.444

Waist/hip ratio 0.89 ± 0.09 0.89 ± 0.09 0.89 ± 0.09 0.683
Cholesterol (mmol/L) 5.89 ± 1.06 5.94 ± 1.01 5.70 ± 0.88 0.870
HDL cholesterol (mmol/L) 1.47 ± 0.44 1.49 ± 0.44 1.51 ± 0.49 0.391
LDL cholesterol (mmol/L) 3.85 ± 1.00 3.90 ± 0.94 3.65 ± 0.84 0.965
Triglycerides (mmol/L) 1.30 ± 0.97 1.25 ± 0.92 1.47 ± 1.21 0.176
Glucose (mmol/L) 5.56 ± 1.43 5.46 ± 0.90 6.10 ± 2.00 0.090
Insulin (uU/mL) 11.24 ± 9.33 11.54 ± 7.84 10.91 ± 4.21 0.552
HOMA-IR 2.90 ± 3.19 2.86 ± 2.14 3.14 ± 2.21 0.974

Data are expressed as means ± S.D.

Table 2
Association between rs11671983 and anthropometric and biochemical parameters.
rs11671983 (n) CC (2488) CG (782) GG (51) P GG + CG vs CC

BMI (kg/m2 ) 26.4 ± 4.7 26.1 ± 4.5 21A ± 4.4 0.698

Waist/hip ratio 0.88 ± 0.09 0.89 ± 0.10 0.88 ± 0.10 0.108
Cholesterol (mmol/L) 5.90 ± 1.06 5.89 ± 1.03 5.82 ± 0.97 0.695
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HDL cholesterol (mmol/Ll) 1.49 ± 0.45 1.47 ± 0.43 1.46 ± 0.47 0.328
LDL cholesterol (mmol/L) 3.86 ± 0.99 3.86 ± 0.98 3.75 ± 0.94 0.654
Triglycerides (mmol/L) 1.28 ± 0.95 1.30 ± 0.96 1.55 ± 1.56 0.215
Glucose (mmol/L) 5.53 ± 1.37 5.61 ± 1.36 5.60 ± 1.42 0.064
Insulin (uU/mL) 11.14 ± 9.00 11.81 ± 9.48 10.16 ± 4.68 0.062
HOMA-IR 2.84 ± 2.89 3.10 ± 3.52 2.63 ± 1.74 0.023

Data are expressed as means ± S.D.

variability of ANGPTL6. The minor allele frequencies of the (P = 0.023) but, as this was due to the impact of the heterozygote
ANGPTL6 rs6511435, rs8112063, rs11671983 and rs15723 subjects only, this association was considered spurious.
SNPs in the MONICA sample were 0.28, 0.43, 0.13 and 0.09, As for rs6511435 (an A > G substitution in the promoter
respectively. region), subjects carrying the G allele had higher plasma fast-
Next, the association of these four ANGPTL6 SNPs was ing insulin concentrations (P = 0.022) and were more insulin
assessed against anthropometric and biochemical phenotypes resistant (P = 0.034) than AA subjects (Table 3). We detected an
— namely, mean BMI, waist-to-hip ratio, plasma cholesterol interaction (P = 0.02) between rs6511435, plasma insulin levels
(total, HDL and LDL), triglycerides, glucose and insulin lev- and obesity, defined as a BMI less than 30 (n = 2766) or greater
els, and insulin sensitivity (estimated by the HOMA-IR). No or equal to 30 kg/m2 (n = 597). Indeed, mean insulin levels were
significant interaction between the SNPs and either gender or similar (P = 0.23) between non-obese rs6511435 G allele carri-
physical activity could be detected with these parameters. ers and AA subjects whereas obese subjects carrying the G allele
Analysis of rs15723 (a T > C substitution in the 3 untrans- had higher insulin levels than obese AA subjects (18.00 ± 10.57
lated region) showed no associations with the considered vs 16.17 ± 8.67 ␮U/mL, respectively; P = 0.0055). Given that
phenotypes (Table 1). Table 2 shows the associations for insulin resistance is a major risk factor for the occurrence of
rs11671983 (a C > G change in intron 1) with the studied param- the metabolic syndrome, logistic-regression analyses were per-
eters. HOMA-IR values tended to be higher in G allele bearers formed to evaluate the risk of the metabolic syndrome. In the

Table 3
Association between rs6511435 and anthropometric and biochemical parameters.
rs6511435 (n) AA (1735) AG (1278) GG (303) P GG + AG vs AA

BMI (kg/m2 ) 26.3 ± 4.6 26.3 ± 4.7 26.4 ± 4.6 0.782

Waist/hip ratio 0.89 ± 0.09 0.88 ± 0.10 0.88 ± 0.09 0.289
Cholesterol (mmol/L) 5.91 ± 1.04 5.89 ± 1.09 5.85 ± 0.97 0.689
HDL cholesterol (mmol/L) 1.49 ± 0.46 1.48 ± 0.43 1.45 ± 0.39 0.144
LDL cholesterol (mmol/L) 3.85 ± 0.96 3.88 ± 1.04 3.85 ± 0.92 0.419
Triglycerides (mmol/L) 1.31 ± 1.01 1.26 ± 0.92 1.27 ± 0.84 0.743
Glucose (mmol/L) 5.56 ± 1.49 5.54 ± 1.23 5.52 ± 1.18 0.721
Insulin (uU/mL) 11.02 ± 9.20 11.55 ± 9.35 11.53 ± 6.55 0.022
HOMA-IR 2.82 ± 2.98 2.97 ± 3.20 2.97 ± 2.61 0.034

Data are expressed as means ± S.D.

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Table 4
Association between rs8112063 and anthropometric and biochemical parameters.
rs8112063 (n) AA (1068) AG (1631) GG (623) P GG vs AA + AG

BMI (kg/m2 ) 26.4 ± 4.8 26.3 ± 4.6 26.4 ± 4.4 0.689

Waist/hip ratio 0.89 ± 0.10 0.89 ± 0.09 0.89 ± 0.09 0.848
Cholesterol (mmol/L) 5.90 ± 1.06 5.89 ± 1.03 5.82 ± 0.97 0.058
HDL cholesterol (mmol/L) 1.47 ± 0.43 1.48 ± 0.44 1.50 ± 0.48 0.396
LDL cholesterol (mmol/L) 3.85 ± 1.02 3.88 ± 0.99 3.83 ± 0.94 0.190
Triglycerides (mmol/L) 1.30 ± 0.97 1.31 ± 1.01 1.23 ± 0.80 0.096
Glucose (mmol/L) 5.57 ± 1.38 5.57 ± 1.44 5.45 ± 1.13 0.009
Insulin (uU/mL) 11.56 ± 9.66 11.22 ± 9.41 10.99 ± 6.80 0.414
HOMA-IR 3.01 ± 3.39 2.89 ± 3.11 2.74 ± 2.02 0.089

Data are expressed as means ± S.D.

MONICA Study, 19.0% (n = 645) of the subjects presented glucose metabolism as reported by Oike et al. in transgenic
with the metabolic syndrome. Those carrying the G allele of mice [14]. Also, it has recently been shown that Angptl6
rs6511435 tended to have a higher risk of the metabolic syn- inhibits glucose production in rat hepatocytes by prevent-
drome (adjusted OR = 1.21 [1.01–1.45]; P = 0.034) compared ing expression of glucose-6-phosphatase, a key enzyme in
with AA subjects. gluconeogenesis [22]. Furthermore, Hato et al. reported that
As regards rs8112063 (an A > G substitution in intron 1), diet-induced obese mice receiving Angptl6 showed increased
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GG subjects had lower fasting plasma glucose levels compared adenosine monophosphate-activated protein kinase activity
with A allele bearers (P = 0.009; Table 4), although the risk of (which improves insulin signaling in skeletal muscle) and that, in
the metabolic syndrome in GG subjects was not significantly C2C12 myoblasts, the addition of insulin after pretreatment with
modified (OR = 0.82 [0.65–1.04]; P = 0.106). Angptl6 increased IRS-1 (insulin receptor substrate-1) phos-
Multiple testing (40 tests) was performed in this study and, phorylation, PI3-K (phosphatidylinositol 3-kinase) activity and
when applying a correction such as the Benjamini and Hochberg glucose uptake, thereby resulting in enhanced insulin signaling
false discovery rate (FDR) [20], the best corrected P value was [11].
0.22, suggesting that none of the associations described above Although Oike et al. showed that Angptl6 is involved in
was statistically significant. fat metabolism and may counteract obesity in mice [14], we
detected no significant association between ANGPTL6 poly-
4. Discussion morphisms and body-weight-related variables in the French
MONICA sample. This was not because of a lack of power
In the present study, we explored the genetic variability of as, even when considering the most rare allele (frequency 0.09),
the ANGPTL6 gene. We assessed the frequency of 17 SNPs we would have detected a 0.7 kg/m2 difference in mean BMI in
and found that four common SNPs covered 95% of the known our study. However, an increased fat mass (as seen in obesity)
genetic variability in the gene. We studied the associations might accentuate the role of ANGPTL6 on insulin metabolism.
between these four SNPs and several anthropometric and bio- The ANGPTL6 SNPs we studied are non-coding polymor-
chemical phenotypes (including risk of the metabolic syndrome) phisms. Indeed, rs6511435 is located in the gene promoter
in the French MONICA Study sample (n = 3402). Statisti- region, 1066 bp upstream of the transcription start site. This
cally, no significant associations were detected between any ANGPTL6 SNP was totally independent of the other SNPs
of the four SNPs and the studied phenotypes. However, we tested. Rs8112063 and rs11671983 are located in the first
observed that the G allele of rs8112063 was associated with intron of ANGPTL6, which stretches out over nearly 6 kbp. As
lower plasma glucose levels. In addition, obese subjects car- rs8112063 also tagged rs10410922, the associations observed
rying the G allele of rs6511435 had higher plasma insulin for rs8112063 could be functionally explained by rs10410922,
levels than the AA subjects. The G allele of rs6511435 also also located in the first intron, 775 bp away. As the introns
tended to be associated with a 20% higher risk of the metabolic (especially the first one) are known to be regulatory regions
syndrome. We looked at the publicly available genome- that modulate gene expression, these SNPs may have an influ-
wide association datasets for quantitative glycaemic (glucose, ence on ANGPTL6 expression levels. In addition, rs15723 is
insulin, HOMA-IR) traits (Diabetes Genetics Initiative, located in the 3 untranslated region of the gene. Functional
[Link] and at the risk of type 2 analyses of these SNPs could shed light on the regulation
diabetes (DIAGRAM, [Link] of ANGPTL6 gene expression, of which nothing is currently
[21] to see whether or not ANGPTL6 SNPs had been previ- known.
ously associated with glycaemic traits and/or type 2 diabetes. In conclusion, these results constitute the first study find-
Unfortunately, no ANGPTL6 SNP had been explored in any of ings in humans of ANGPTL6 genetic variability. We found no
those studies. evidence that polymorphisms of ANGPTL6 had any significant
Nevertheless, our findings could be consistent with a phys- influence on the metabolic syndrome-related phenotypes, but a
iological role of Angptl6 in terms of insulin sensitivity and minor role of these polymorphisms on these parameters can-
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292 V. Legry et al. / Diabetes & Metabolism 35 (2009) 287–292

not be excluded either. Further association studies are needed to [6] Dhanabal M, LaRochelle WJ, Jeffers M, Herrmann J, Rastelli L, McDonald
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 Résultats

IV.2. Synthèse des résultats

Lorsque nous avons commencé ce travail en 2005, la base de données HapMap ne

comptait que 4 SNPs situés dans le gène ANGPTL6 (rs8109578, rs8112063, rs10408244 et
rs15723) et aucun tag-SNP n’était décrit. En revanche dans la base de données du NCBI, 17
SNPs étaient décrits (comprenant les 4 de HapMap). Afin de vérifier leur existence et de
calculer leur DL, nous avons génotypé l’ensemble de ces SNPs chez une centaine
d’individus pris au hasard dans l’échantillon MONICA Lille. Nous avons ainsi déterminé que
les SNPs rs6511435 (promoteur), rs8112063 (intron 1), rs11671983 (intron 1) et rs15723
(3’UTR) couvrent 95% de la variabilité génétique connue d’ANGPTL6. Nous avons alors
recherché des associations statistiques entre ces 4 SNPs et les phénotypes métaboliques
dans les échantillons MONICA Lille, Strasbourg et Toulouse.
Dans l’étude combinée des 3 populations MONICA (n=3402), le SNP rs8112063
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(MAF 0,43) est associé à une diminution de la glycémie. De plus, le polymorphisme

rs6511435 (MAF 0,28) est associé à une augmentation de l’insulinorésistance en
particulier chez les individus obèses. L’allèle G de ce polymorphisme tend également à être
associé à une augmentation du risque de syndrome métabolique (OR=1,21). Cependant,
lorsqu’on applique une correction pour tests multiples (40 tests réalisés dans cette étude),
ces associations ne sont plus statistiquement significatives.

IV.3. Discussion

Dans notre article, nous avons appliqué une correction pour tests multiples en accord
avec les nouvelles recommandations pour les études d’association. Nous avons utilisé la
méthode de correction de Benjamini et Hochberg dite de FDR [Fernando et al. 2004] en
considérant 40 tests effectués (4 SNPs, 10 phénotypes). Dans notre étude, aucune valeur p
corrigée de cette façon n’atteint le seuil de significativité. Les associations entre les
polymorphismes génétiques d’ANGPTL6 et la glycémie et l’insulinorésistance que nous
avons observées ne sont donc pas statistiquement significatives. Cependant, elles sont tout
à fait cohérentes avec les observations chez la souris et le rat (inhibition de la
gluconéogenèse et amélioration de la signalisation de l’insuline) [Kitazawa et al. 2007; Hato
et al. 2008]. De plus, Ebert et al ont décrit récemment que le taux plasmatique d’ANGPTL6
est augmenté chez des patients diabétiques par rapport à des individus non diabétiques et
qu’il est corrélé à la glycémie chez les patients et les témoins [Ebert et al. 2009]. Les auteurs
suggèrent que l’induction d’ANGPTL6 pourrait être un mécanisme compensateur chez les
patients diabétiques permettant de limiter l’hyperglycémie, ou bien, que les patients
diabétiques présentent une résistance à ANGPTL6 conduisant à une augmentation de sa

112
 Résultats

production (au même titre que la résistance à l’insuline ou à la leptine). Nous avons
recherché dans les données disponibles des GWAS concernant le DT2 (DIAGRAM,
[Link] et les phénotypes associés (glycémie, insulinémie et
HOMA-IR) (Diabetes Genetics Initiative, [Link] si des
polymorphismes génétiques d’ANGPTL6 avaient déjà été étudiés [Zeggini et al. 2008].
Malheureusement, aucun SNP d’ANGPTL6 n’a été analysé dans ces études.
Dans notre étude, l’effet d’ANGPTL6 sur l’homéostasie glucidique semble entraîner
une légère augmentation du risque de syndrome métabolique si on utilise la définition de
l’OMS. Nous avons également estimé l’impact du SNP rs6511435 sur le risque de syndrome
métabolique selon les autres définitions : les résultats sont similaires avec les critères de
l’EGIR, mais si l’on considère les définitions de l’AHA ou de l’IDF, ce SNP perd son effet
(OR=0,96, p=0,58 et OR=1,10, p=0,23). Cette différence peut s’expliquer par l’importance
donnée au désordre glucidique dans les définitions du syndrome métabolique de l’OMS et de
l’EGIR, qui en font un critère obligatoire, contrairement aux définitions du NCEP et de l’EGIR
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

(Tableau 1). La prévalence du syndrome métabolique dans l’échantillon MONICA est moins
élevée si l’on considère la définition de l’OMS par rapport à celle de l’AHA, illustrant le fait
que les critères de l’OMS sélectionnent des individus plus insulinorésistants. En effet, la
concentration plasmatique d’insuline et le HOMA-IR sont plus élevés chez les individus
présentant un syndrome métabolique défini par l’OMS par rapport à ceux définis par l’AHA
(18,32 ± 11,48 vs. 14,88 ± 8,94 µU/ml, p<0.0001 et 5,28 ± 3,47 vs. 4,24 ± 3,03, p<0.0001,
respectivement). Ainsi, l’association de ce polymorphisme avec le syndrome métabolique
défini par l’OMS ne serait en fait que le reflet de son association avec l’insulinémie et le
HOMA-IR. Son association avec le syndrome métabolique dépend alors du regard que l’on
porte sur ce syndrome.
Afin de vérifier si nous avions bien couvert l’ensemble de la variabilité génétique
connue du gène ANGPTL6, nous avons récemment regardé les données HapMap de 2009
(release 27). Par rapport à celles de 2005, un seul SNP d’ANGPTL6 supplémentaire est
décrit : le SNP rs10410922, qui est en effet en DL avec le rs8112063 selon HapMap et nos
propres données. Les 4 tag-SNPs que nous avons déterminés (rs6511435, rs8112063,
rs11671983 et rs15723) grâce à une recherche systématique dans un sous-échantillon de
population des SNPs décrits dans la base de données dbSNP du NCBI, s’avère couvrir
d’avantage de polymorphismes génétiques que ceux décrits par HapMap. Notamment, le
SNP rs6511435, potentiellement associé à l’insulinorésistance et au syndrome métabolique,
n’est pas inclus dans les données HapMap à ce jour. Ces données se révèlent donc encore
aujourd’hui incomplètes. Etant donné que les GWAS se basent essentiellement sur les
données HapMap, elles peuvent donc passer à côté de facteurs de susceptibilité génétique

113
 Résultats

aux maladies métaboliques, ce qui constitue l’une des principales limites des GWAS à ce
jour.

En conclusion, il est délicat de conclure que ANGPTL6 n’est définitivement pas

associé aux phénotypes associés à l’homéostasie glucidique. Seules d’autres études
en population portant sur un plus grand nombre d’individus permettant ainsi d’obtenir
une puissance statistique supérieure, pourront aider à confirmer ou infirmer nos
conclusions.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

114
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Discussion générale
 Discussion générale

Le syndrome métabolique est un désordre complexe impliquant de nombreux

troubles métaboliques, dont la physiopathologie est encore mal connue. La présence de ce
syndrome chez un individu augmente le risque de DT2, de MCV et de décès. Aujourd’hui, on
estime qu’un européen sur cinq présente un syndrome métabolique et au vu des tendances
outre-Atlantique, ce chiffre pourrait encore augmenter. Bien que l’environnement
« obésogène » dans lequel nous vivons aujourd’hui soit à l’origine de l’augmentation de la
prévalence de l’obésité et du syndrome métabolique, il existe des différences entre les
individus et l’on observe ainsi des familles plus touchées que d’autres. En effet, la part
attribuable à l’héritabilité génétique du syndrome métabolique a été estimée à 30% [Teran-
Garcia et al. 2007]. L’identification des facteurs de susceptibilité génétique au syndrome
métabolique et aux phénotypes associés aide à la compréhension des mécanismes
physiopathologiques impliqués dans ces désordres métaboliques.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

I. Difficultés des études sur le syndrome métabolique

Le syndrome métabolique est le sujet d’importantes polémiques depuis quelques

années [Kahn et al. 2005; Gale 2005; Gale 2008; Alberti et al. 2008]. Même si cela ne fait
aucun doute que certains facteurs de risque cardiovasculaire, notamment
l’insulinorésistance, l’obésité abdominale, l’augmentation de la pression artérielle et les
dyslipidémies ont tendance à cohabiter chez un individu, l’intérêt d’utiliser le terme de
syndrome métabolique est toujours débattu. Dans les années 1980, de nombreux efforts de
recherche se sont concentrés sur les MCV et en particulier sur leur prévention, par
l’identification des facteurs de risque. Le syndrome métabolique est alors apparu comme un
outil intéressant pour identifier les individus à risque même s’ils ne présentent pas les
facteurs de risque classiques (âge, être un homme, être fumeur, avoir des antécédents
familiaux de MCV). Or, la définition du syndrome métabolique et sa valeur prédictive du
risque cardiovasculaire sont aujourd’hui remises en cause. En effet, non seulement il existe
plusieurs définitions différentes, mais en plus, les définitions manquent de précision. Par
exemple, aucune recommandation concernant la mesure du tour de taille n’est décrite dans
les différentes définitions du syndrome métabolique, ce qui génère une variabilité entre les
examinateurs et les études. Par ailleurs, même si le syndrome métabolique est associé à
une augmentation du risque cardiovasculaire [Gami et al. 2007], il n’a pas été clairement
établi que ce risque est plus élevé que la simple somme des risques associés à chaque
composante [Kahn et al. 2005; Grundy 2006b]. De plus, plusieurs études ont montré que le
score de Framingham avait une meilleure valeur prédictive du risque cardiovasculaire que le

115
 Discussion générale

syndrome métabolique [Wilson et al. 1998; Stern et al. 2004]. L’intérêt d’utiliser le syndrome
métabolique en clinique semble donc limité.

L’existence même du syndrome métabolique a été remise en doute [Kahn et al.

2005]. Selon Kahn et al, un syndrome se définit soit par une combinaison de facteurs qui
augmente le risque de maladie, soit par une association de phénotypes tous liés à une
physiopathologie commune. En effet, le syndrome métabolique ne semble pas répondre à la
première partie de cette définition, en tout cas tel qu’il est défini actuellement. En revanche,
la seconde partie de cette définition fait débat. Ce n’est pas parce qu’aucune cause
physiopathologique unique du syndrome métabolique n’a encore été identifiée qu’elle
n’existe pas. De plus, le terme « syndrome » ne renvoie pas obligatoirement à une unique
cause physiopathologique [Grundy 2006a], contrairement à la maladie qui elle, est définie en
principe, par une cause spécifique [Gluckman 2007]. Selon Alberti et Zimmet [Alberti et al.
2008], la définition la plus simple d’un syndrome est un simple regroupement de choses.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Pour ces auteurs, la définition du syndrome métabolique est même plus robuste puisqu’elle
détermine l’association non fortuite de différents facteurs de risque cardiovasculaire et de
DT2. De plus, le syndrome métabolique, comme de nombreux autres syndromes et
maladies, est d’originie multifactorielle. L’absence ou la méconnaissance d’une cause
physiopathologique unique du syndrome métabolique ne remet donc pas en cause
l’existence du syndrome métabolique.

Le manque de définition consensuelle du syndrome métabolique rend les études

d’épidémiologie génétique particulièrement difficiles. En effet, selon la définition utilisée dans
un échantillon représentatif de la population générale, certains individus seront tantôt
considérés comme ayant un syndrome métabolique, tantôt considérés comme n’ayant pas
de syndrome métabolique. En plus des différentes définitions officielles proposées (OMS,
EGIR, NCEP, AHA, IDF), de nombreuses études emploient leur propre définition du
syndrome métabolique en fonction des données dont elles disposent. Par exemple, le tour
de taille est une mesure qui n’est pas toujours disponible dans les études épidémiologiques
et est alors souvent remplacé par l’IMC, contrairement aux recommendations de l’EGIR, du
NCEP, de l’AHA et de l’IDF. De même, dans l’étude MONICA comme dans de nombreuses
études, le clamp hyperinsulinique euglycémique n’a pas pu être réalisé et l’insulinorésistance
est alors estimée par la concentration plasmatique d’insuline, contrairement aux
recommandations de l’OMS. Comme nous l’avons vu, les études génétiques portant sur les
maladies multifactorielles souffrent d’un manque de réplication des résultats entre les
différentes populations étudiées. Les études génétiques du syndrome métabolique souffrent,
en plus de cela, du problème de sa définition s’exerçant à de multiples niveaux :

116
 Discussion générale

- l’imprécision et l’ambiguïté de certains critères,

- le nombre de définitions officielles,
- le nombre d’études utilisant leur propre définition ou une définition officielle
réarrangée.
Dans ces conditions, il est difficile de comparer les résultats et d’obtenir la réplication d’une
association entre un polymorphisme génétique et le risque de syndrome métabolique dans
différentes populations.
Il reste donc d’énormes progrès à faire dans l’étude du syndrome métabolique,
notamment au niveaux des critères de diagnostic. Déjà, ces critères pourraient être continus
(comme c’est le cas du score de Framingham), ce qui éviterait de devoir établir des limites
arbitraires qui simplifient trop la complexité du syndrome. De plus, les critères devraient se
baser sur des paramètres facilement mesurables et reproductibles, avec des
recommendations précises. Une classification plus fine des individus atteints et non-atteints
devraient permettre de meilleures études génétiques.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Tant que la définition du syndrome métabolique n’aura pas été améliorée, les
associations entre polymorphismes génétiques et le risque de syndrome métabolique seront
à prendre avec prudence. C’est pour ces raisons que j’ai étudié le syndrome métabolique en
utilisant différentes définitions, et que je me suis également intéressée aux phénotypes
associés, c’est-à-dire l’obésité, le DT2 et les dyslipidémies.

II. Synthèse des travaux personnels, critiques et perspectives

Le but de mes travaux a été d’identifier et de caractériser de nouveaux déterminants

génétiques du syndrome métabolique et de ses phénotypes associés en population. Je me
suis intéressée à la variabilité génétique commune de plusieurs gènes candidats et j’ai
réalisé des études d’association entre des polymorphismes génétiques et le risque de
syndrome métabolique, d’obésité et de DT2 ainsi que les phénotypes associés (IMC, tour de
taille, RTH, concentrations plasmatiques en TG, cholestérol, apolipoprotéines, glucose,
insuline et les indices d’insulinorésistance HOMA-IR et HOMA-B). Pour cela, j’ai utilisé
différents échantillons (soit des échantillons représentatifs de la population générale, soit des
échantillons de cas et de témoins) composés d’adultes ou d’adolescents. Pour certains
polymorphismes, j’ai également tenté de comprendre les mécanismes moléculaires sous-
tendant les associations observées en population.

117
 Discussion générale

Je me suis intéressée au gène FTO, symbole du succès des GWAS dans le domaine
de la génétique de l’obésité et qui représente une découverte capitale dans ce domaine. En
effet, le SNP rs9939609 du gène FTO a été établi comme déterminant génétique de
l’adiposité dans de nombreuses études [Scuteri et al. 2007; Frayling et al. 2007; Cotsapas et
al. 2009; Thorleifsson et al. 2009; Loos et al. 2008; Meyre et al. 2009; Heard-Costa et al.
2009]. J’ai pu confirmé l’association du polymorphisme rs9939609 avec le risque d’obésité et
de DT2 et les phénotypes associés (IMC, tour de taille, RTH) et trouvé des associations avec
le taux d’insuline plasmatique, l’HOMA-IR et la pression artérielle systolique dans
l’échantillon français MONICA. Il serait intéressant d’étudier l’impact de ce polymorphisme
chez les adolescents de l’étude HELENA qui présente l’avantage de disposer d’un grand
nombre de données concernant les habitudes alimentaires, l’environnement socio-
économique des adolescents et leur niveau d’activité physique. Les interactions entre le
polymorphisme de FTO et ces facteurs environnementaux pourraient alors être étudiées.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

J’ai également étudié la variabilité génétique commune des gènes codant LXRα et
LXRβ. Au début de ma thèse, aucune étude d’association n’était publiée sur LXRα et seule
une étude d’association entre LXRβ et la maladie d’Alzheimer était décrite [Adighibe et al.
2006]. J’ai montré que deux polymorphismes (situés dans l’intron 1 et le 5’UTR) du gène
codant LXRα étaient associés au taux plasmatique de HDL-cholestérol chez les adolescents
et les adultes, ainsi qu’au risque de syndrome métabolique chez les adultes. D’autres études
ont confirmé l’association de polymorphismes génétiques de LXRα avec le profil lipidique et
en particulier le taux plasmatique de HDL-cholestérol [Robitaille et al. 2007; Sabatti et al.
2009]. Par ailleurs, j’ai trouvé une association entre un polymorphisme du gène codant
LXRβ et le risque de DT2 et d’obésité. L’association de ce polymorphisme avec le risque de
DT2 et d’obésité vient également d’être décrite dans 2 autres études [Dahlman et al. 2009;
Dahlman et al. 2006].
J’ai réalisé des études in vitro de la fonctionnalité des polymorphismes des LXRs
associés aux traits métaboliques en population. Ces polymorphismes peuvent
potentiellement moduler la régulation de l’expression des LXRs et de leurs gènes cibles.
D’une part, j’ai mesuré le niveau d’expression de LXRα et de certains de ses gènes cibles
dans des cultures primaires de macrophages humains mais nous n’avons pas détecté de
différence significative entre les allèles des polymorphismes de LXRα. D’autre part, des
analyses in silico ont montré que les polymorphismes associés pouvaient affecter des sites
potentiels de fixation pour certains facteurs de transcription (NERFs, HNF4α et NF1s). J’ai
alors réalisé des transfections cellulaires de vecteurs rapporteurs pour comparer l’activité du
promoteur LXRα ou LXRβ entre les 2 formes alléliques et en co-transfectant ou non les

118
 Discussion générale

vecteurs d’expression de ces facteurs de transcription. Même si, dans toutes mes
expériences, les facteurs de transcription stimulent ou inhibent effectivement l’activité du
promoteur comme prédit par les analyses in silico, aucune différence entre les allèles n’a
cependant été observée. Il se peut que les polymorphismes modulent en réalité l’affinité pour
les facteurs de transcription, mais que cette différence soit trop faible pour être détectée par
les systèmes utilisés (transfections, retard sur gel). Pour l’étude de l’activité promotrice,
j’aurais pu essayer de cloner 3 copies répétées de l’élément de réponse au facteur de
transcription (sous les 2 formes alléliques) dans un vecteur rapporteur et de réaliser les co-
transfections. Cela permet parfois d’amplifier la différence existant entre les formes alléliques
mais l’inconvénient est que ce système est encore plus artificiel.

Enfin, je me suis intéressée à la variabilité génétique commune de plusieurs gènes

de la famille des ANGPTLs. Au début de mes travaux, aucune étude d’association sur les
ANGPTLs n’était publiée et le rôle de ces protéines dans le métabolisme énergétique chez la
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

souris venait d’être décrit. J’ai montré que des polymorphismes des gènes ANGPTL3 et
ANGPTL4 sont associés aux concentrations plasmatiques de HDL-cholestérol et de TG. Ces
résultats ont également été décrits dans d’autres études [Kathiresan et al. 2008; Romeo et
al. 2007]. J’ai aussi détecté une association entre un polymorphisme d’ANGPTL4 et des
mesures de l’adiposité (en intéraction avec un polymorphisme de PPARG) mais ces résultats
nécessitent d’être validés dans d’autres études. Par ailleurs, il semblerait que des
polymorphismes génétiques d’ANGPTL6 soient associés à la glycémie et à
l’insulinorésistance chez les adultes, en particulier chez les individus obèses. Il serait
intéressant d’étudier l’impact des polymorphismes génétiques d’ANGPTL6 chez les jeunes,
en particulier chez des individus obèses. En effet, la glycémie est une constante bien régulée
chez les sujets jeunes, mais certains individus obèses présentent prématurément un profil
diabétique, notamment dans leur réponse à une HPO [Weiss et al. 2006]. Il apparaît alors
pertinent d’étudier l’impact des polymorphismes génétiques d’ANGPTL6 sur la sécrétion
d’insuline et la régulation de la glycémie dans un échantillon de jeunes individus obèses pour
qui une HPO aurait été réalisée.
Je n’ai pas pu réaliser d’études fonctionnelles des polymorphismes des gènes de la
famille des ANGPTLs. Les polymorphismes associés aux phénotypes métaboliques sont
situés dans le promoteur des gènes ANGPTL3 et -4 et dans le promoteur et l’intron 1 du
gène ANGPTL6, et pourraient moduler leur niveau d’expression. Cependant, les analyses in
silico de prédiction des sites de fixation pour des facteurs de transcription n’ont pas permis
d’émettre d’hypothèse pertinente pour étudier la fonctionnalité de ces polymorphismes. Les
mécanismes moléculaires sous-tendant les associations observées en population restent
donc à élucider.

119
 Discussion générale

Au cours de ma thèse, j’ai également systématiquement effectué les analyses

haplotypiques des polymorphismes des gènes codant LXRα, LXRβ, ANGPTL4 et ANGPTL6
(données non présentées). En effet, l’analyse des haplotypes peut non seulement révéler
des associations qui sont indétectables dans les analyses des polymorphismes considérés
individuellement, mais peut aussi parfois aider à comprendre les associations observées
[Schaid 2004]. Cependant, dans nos études, les analyses haplotypiques n’ont pas apporté
d’informations supplémentaires et c’est pourquoi nous ne les avons pas présentées.

Excepté pour le gène FTO, la variabilité génétique des gènes que j’ai étudiés a été
analysée en totalité. Pour cela, je me suis basée sur les données disponibles du NCBI et de
HapMap, et quand cela fut possible, nous avons également séquencé le gène (c’est le cas
pour LXRβ). En effet, le séquençage reste le meilleur moyen pour identifier tous les
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

polymorphismes d’un gène. La banque de données dbSNP du NCBI est très dense mais
comprend malheureusement de nombreux SNPs qui ne sont pas validés et qui ne sont que
des erreurs de séquençage. En effet, je me suis basée entièrement sur cette base de
données pour l’étude du gène ANGPTL6 – parce qu'à l'époque la base de données HapMap
n'était pas encore disponible – et 9 SNPs seulement sur les 17 qui étaient décrits ont pu être
détectés dans un échantillon de 100 individus. La banque de données HapMap est très riche
et présente notamment l’avantage d’inclure des informations sur le DL entre les
polymorphismes mais elle n’inclue pas tous les polymorphismes. En effet, si l’on recherche
les polymorphismes du gène codant LXRβ dans la dernière base de HapMap (release 27,
février 2009), aucune information n’est disponible pour les SNPs rs56151148 (associé au
taux plasmatique de TG dans l’étude HUNT) et rs2303044 (associé à l’IMC dans l’étude
HELENA). De même pour le gène ANGPTL6, aucune donnée n’est disponible pour le SNP
rs6511435 (potentiellement associé à l’insulinorésistance). La base de données HapMap est
donc un outil précieux pour les études génétiques mais reste encore insuffisante aujourd’hui
pour réaliser des études approfondies.

III. Les études génétiques des maladies métaboliques

Les études d’épidémiologie génétique ont émergé il y a 20 ans avec l’apparition de la

PCR. Elles ont d’abord connu un certain succès grâce à l’identification de nombreux gènes
comme facteurs de susceptibilité aux diverses maladies communes étudiées. Grâce au
séquençage entier du génome humain, ces études ont été de plus en plus approfondies,

120
 Discussion générale

évoluant depuis les études d’un seul polymorphisme pour un gène jusqu’à l’établissement
des cartes de déséquilibre de liaison permettant de capturer toute l’information génétique
d’un gène tout en réduisant le nombre de polymorphismes à génotyper. Cependant, la
multiplication des associations non répliquées et même de résultats contradictoires remit en
question la validité de ces études. Les exigences de publication ont alors évolué, nécessitant
des effectifs toujours plus grands (pour éviter les faux positifs), la réplication des résultats
dans des échantillons indépendants et des études fonctionnelles des polymorphismes
associés.

Les GWAS sont une véritable révolution pour les études génétiques et ont ravivé
l’optimisme des années 90. Durant ces 2 dernières années, elles ont permis de grandes
avancées dans la compréhension des bases génétiques de diverses maladies. Leur
approche sans a priori offre la possibilité de découvrir de nouveaux gènes et par
conséquent, de nouvelles voies physiopathologiques et de nouvelles cibles thérapeutiques.
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009

Elles présentent néanmoins des limites. Comme pour les études génétiques classiques
(approche gène candidat et études de liaison), des résultats contradictoires peuvent encore
apparaître. Cela a été le cas pour le gène INSIG2 décrit associé à l’IMC dans 5 échantillons
indépendants par Herbert et al en 2007 [Herbert et al. 2006] et qui n’a pu être répliqué dans
3 autres études comprenant 20000 individus [Loos et al. 2007; Dina et al. 2007b; Rosskopf
et al. 2007]. Il n’est d’ailleurs toujours pas possible aujourd’hui de conclure quant à l’impact
de ce gène sur l’IMC au vu du nombre de données incohérentes [Lyon et al. 2007; Fox et al.
2007]. Une autre limite des GWAS réside en le fait que, même si un très grand nombre de
SNPs sont étudiés (500000), toute la variabilité génétique du génome humain n’est pas
capturée dans ces études.
L’avenir des GWAS consistera déjà à augmenter les effectifs des échantillons étudiés
afin d’identifier de nouveaux déterminants génétiques. En effet, les phénotypes métaboliques
sont le résultat d’intéractions complexes entre facteurs génétiques et environnementaux, et
l’on s’attend à ce que les déterminants génétiques soient nombreux, exerçant chacun un
faible impact sur les voies métaboliques. Il est donc nécessaire d’augmenter la puissance
statistique afin de révéler les déterminants génétiques pour le moment dissimulés parmi les
résultats négatifs. Les études GWA haplotypiques devraient également aider à identifier de
nouveaux déterminants génétiques [Tregouet et al. 2009]. Les GWAS devront aussi
s’intéresser aux autres types de polymorphismes (CNV, délétion-insertion) et tenir compte de
l’existence possible d’intéractions (gène-gène et gène-environnement). Enfin, des études
complémentaires seront nécessaires pour affiner le signal, en particulier dans les cas où le
locus associé au phénotype métabolique n’a pu être attribué à un gène, comme par exemple
les loci CDC123-CAMK1D et TSPAN8-LGR5 associés au risque de DT2 [Zeggini et al.

121
 Discussion générale

2008]. Les méthodes d’imputation de polymorphismes basée sur la structure haplotypique et

de séquençage d’individus pour les régions d’intérêt devraient permettre d’identifier les
polymorphismes (et les gènes) causaux. Dans ce cadre, les études d’association classiques
pourront tenir un rôle non négligeable dans l’identification des polymophismes causaux, à
condition qu’elles soient réalisées sur des échantillons de grande taille et bien phénotypés.
Enfin, des études moléculaires et physiologiques seront nécessaires pour explorer
les mécanismes responsables des associations observées et les voies métaboliques
impliquées. Des études d’expression genome-wide à grande échelle ont commencé à voir le
jour [Dixon et al. 2007; Stranger et al. 2007; Goring et al. 2007] et d’autres devraient bientôt
émerger, permettant ainsi l’identification de polymorphismes influençant le niveau
d’expression des gènes. De plus, de nouvelles données sur le génome générées par le
projet ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) entre autres, offriront de précieuses
informations sur la fonctionnalité des polymorphismes génétiques [Birney et al. 2007].
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Aucune GWAS sur le syndrome métabolique n’a été publiée à ce jour. Les
polémiques au sujet de l’existence du syndrome métabolique et de sa définition ainsi que le
nombre de paramètres à prendre en compte sont probablement à l’origine de ce léger retard.
Pourtant ces études devraient apporter de précieuses informations sur les bases génétiques
du syndrome métabolique. En effet, les approches classiques des études de liaison et de
gènes candidats ont montré leurs limites, notamment, au vu du nombre de voies
métaboliques impliquées, le nombre de gènes candidats apparaît alors démesuré. Les
GWAS devraient permettre d’identifier les déterminants génétiques du syndrome
métabolique, mais aussi d’aider à comprendre ses mécanismes physiopathologique s. Il sera
notamment intéressant de comparer les résultats obtenus entre différentes définitions du
syndrome métabolique car l’indentification d’un déterminant génétique commun à toutes les
définitions pourrait révéler une voie physiologique commune aux différents désordres
métaboliques.

122
 Discussion générale

Conclusion

En conclusion, j’ai recherché de nouveaux déterminants génétiques du

syndrome métabolique et des phénotypes associés en population. J’ai identifié deux
gènes, LXRα et ANGPTL3, associés au profil lipidique, notamment au taux
plasmatique de HDL-cholestérol. J’ai confirmé que des polymorphismes des gènes
FTO et LXRβ sont des déterminants génétiques de l’obésité, du DT2 et des
phénotypes associés. Deux gènes, LXRα et ANGPTL6, sont associés au risque de
syndrome métabolique, mais ces associations sont dépendantes de la définition du
syndrome métabolique utilisée. Une amélioration de la définition du syndrome
métabolique est nécessaire pour conclure quant à l’impact réel de ces deux gènes sur
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le risque de syndrome métabolique. En outre, les mécanismes moléculaires sous-

tendant les associations observées en population restent à élucider.

La révolution des GWAS est en marche et devrait permettre d’identifier encore

de nouveaux déterminants génétiques des phénotypes métaboliques et d’ouvrir des
portes sur de nouvelles voies métaboliques. Elles permettront peut-être de mieux
comprendre la physiopathologie du syndrome métabolique.

L’intérêt pour la pratique clinique de ces nouvelles connaissances sur la

génétique des maladies métaboliques reste malgré tout encore limité. Cependant, ces
études devraient permettre dans le futur une meilleure prévention du syndrome
métabolique et par conséquent du DT2 et des maladies cardiovasculaires, grâce à une
prise en charge précoce, personnalisée et ainsi, mieux adaptée.

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 Figure 1 : Composantes du syndrome métabolique et morbidité associée (adapté de Doria et
al. 2008).
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Les principaux phénotypes du syndrome métabolique sont l’obésité abdominale, la dyslipidémie,

l’insulinorésistance et l’hypertension (PA : pression artérielle). La présence de ces phénotypes chez un individu
augmente le risque de maladies cardiovasculaires et de diabète de type 2.
 Figure 2 : Prévalence du syndrome métabolique dans différents pays selon les critères
du NCEP (adapté de Cameron et al. 2004).
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 Figure 3 : Risque relatif et IC 95% de MCV et mortalité associé au syndrome métabolique
(adapté de Gami et al. 2007).
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Les losanges représentent le pool des risques relatifs (RR) et l’intervalle de confiance (CI) à 95% des différentes
études ayant analysé les conséquences (outcome) : maladie cardiovasculaire (CV event), maladie coronarienne
(CHD event), et décès suite à ces maladies (death). Certaines études ont analysé plusieurs conséquences.
 Figure 4 : Principaux acteurs de la lipolyse du tissu adipeux.
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L’activation du récepteur β-adrénergique par la noradrénaline entraîne une conversion de l’ATP (adénosine
triphosphate) en AMPc (adénosine monophosphate cyclique) par l’adénylyl cyclase. L’APMc active la protéine
kinase A (PKA) qui va alors phosphoryler la périlipine et la lipase hormono-sensible (HSL), permettant la
translocation de la HSL vers la gouttelette lipidique. La lipase des triglycérides (TG) adipeux (ATGL) hydrolyse
les TG en diglycérides (DG), eux-mêmes hydrolysés en monoglycérides (MG) par la HSL. La monoglycéride
lipase (MGL) hydrolyse finalement les MG en glycérol. Chaque étape d’hydrolyse s’accompagne par une
libération d’acides gras (FA) qui sont pris en charge par la fatty acid-binding protein (FABP) qui permet leur
exportation. L’insuline inhibe la lipolyse, notamment en inhibant la PKA : l’activation des substrats du récepteur
à l’insuline (IRS) active la phophatidyl-inositol 3 phosphate kinase (PI3-K) qui va activer à son tour la protéine
kinase B (PKB/Akt) entraînant une inhibition de la PKA.
 Figure 5 : La voie leptine-mélanocortine.
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La leptine est sécrétée par le tissu adipeux (TA) et se fixe à son récepteur (LEPR) situé à la surface de 2 types de
neurones de l’hypothalamus : un type produit le neuropeptide Y (NPY) et l’Agouti-related protein (AGRP) aux
propriétés orexigènes et inhibant le récepteur 4 à la mélanocortine (MC4R) (inhibition symbolisée par une flèche
rouge), l’autre type de neurones produit les peptides anorexigènes CART (cocaine and amphetamine related
transcript) et POMC (proopiomélanocortine). Ce dernier, métabolisé en α-MSH (α-melanocyte stimulating
hormone) active MC4R conduisant à une diminution de l’appétit.
 Figure 6 : Voie de signalisation de l’insuline (d’après Taniguchi et al. 2006).
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Le réseau de signalisation de l’insuline s’articule autour de nœuds critiques (node) en aval du récepteur de
l’insuline (IR) (flèches noires) et du récepteur de l’insulin growth factor-1 (IGF1R) (flèches bleues). Les voies
de signalisation activées par les cytokines comme TNFα, IL-6 et la leptine, interfèrent dans la signalisation de
l’insuline (flèches oranges et rouges). Trois nœuds sont importants dans la signalisation de l’insuline : le nœud
des substrats de l’IR (IRS) 1-4 (Node 1), celui de la phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3K) et de ses nombreuses
sous-unités régulatrices et catalytiques (Node 2), et celui des isoformes AKT/protéine kinase B (PKB) (Node 3).
Les produits en aval ou effecteurs intermédiaires ou modulateurs incluent l’atypique protéine kinase C (aPKC),
le substrat Akt de 160 kDa (AS160), la Cas-Br-M ecotropic retroviral transforming sequence homologue (Cbl),
la protéine associée à la Cbl (CAP), la cell-division cycle 42 (CDC42), les kinases régulées par signal
extracellulaire (ERK1 et ERK2), la forkhead box O1 (FOXO1), la kinase de la glycogène synthase (GSK3), la
Janus kinase (JAK), la c-Jun-N-terminal kinase (JNK), la cible de rapamycine de mammifère (mTOR), la kinase
S6 de protéine ribosomale p90 (p90RSK), les kinases dépendantes du phosphoinositide (PDK1 et 2),
l’homologue des phosphatase et tensine (PTEN), la protéine tyrosine phosphatase-1B (PTP1B), Ras, Rac, la
protéine Src homologue-2 (Shc), le suppresseur de la signalisation de cytokines (SOCS), le transducteur de
signal et activateur de la transcription (STAT), et l’homologue de RasARHQ (TC10).
 Figure 7 : Vue d’ensemble du métabolisme des TG et du cholestérol (d’après Hegele 2009).
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Dans le métabolisme des triglycérides (TG), les graisses alimentaires sont hydrolysées en acides gras (FA) et
entrent dans les entérocytes grâce à un transporteur (FA transporter). Les TG y sont alors reconstitués et
empaquetés avec du cholestérol (C) et l’apolipoprotéine B48 dans les chylomicrons (CM) grâce à la protéine de
transfert de TG microsomale (MTTP). Les CMs sont sécrétés via le système lymphatique, entrent dans la veine
cave et circulent dans le sang. Les CMs contiennent les apolipoprotéines ApoA5 (A5), ApoC2 (C2) et ApoC3
(C3). Lorsqu’ils rencontrent la lipoprotéine lipase (LPL), des acides gras libres sont relargués et entrent en partie
dans des cellules périphériques. Dans les adipocytes, des enzymes incluant l’acyltransférase acyl
CoA:diacylglycerol (DGAT) re-synthétisent des TG, qui sont à leur tour hydrolysés par la lipase de TG
adipocytaire (ATGL) et la lipase hormono-sensible (HSL). Les restes de CM (CMR) sont pris en charge par le
récepteur hépatique au LDL (LDLR) ou par la LDLR-related protein-1 (LRP1). Dans les hépatocytes, les TG
sont empaquetés avec du cholestérol et l’ApoB100 dans les VLDL (very low-density lipoprotein). Les TG
contenus dans les VLDL sont hydrolysés par la LPL en IDL, eux mêmes hydrolysés par la lipase hépatique
(HL) en LDL.
Dans le métabolisme du cholestérol, les stérols de la lumière intestinale sont captés par les entérocytes grâce au
transporteur Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1), tandis que les transporteurs à ATP-binding cassette G5 et G8
(ABCG5/G8) en relarguent. Dans les entérocytes, le cholestérol est empaqueté avec les TG dans les CMs. Dans
les hépatocytes, le cholestérol est recyclé ou synthétisé de novo par la 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
réductase (HMGCR). Les LDL transportent le cholestérol du foie à la périphérie. Les LDL sont captés par les
cellules périphériques et le foie par le LDLR, assisté d’une protéine adaptatrice (AP). La proprotéine convertase
subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) court-circuite le recyclage du LDLR entraînant sa dégradation (X). Les
lipoprotéines HDL permettent le transport inverse du cholestérol en interagissant avec les transporteurs ABCA1
et G1. La lécithine-cholestérol acyltransférase (LCAT) estérifie le cholestérol permettant son incorporation dans
les HDL. Les HDL sont remodelés par la protéine de transfert des ester de cholestérol (CETP) et la lipase
endothéliale (LIPG) et entrent dans les hépatocytes grâce au scavenger receptor class B type I (SRB1).
 Figure 8 : Schéma représentant le transport inverse du cholestérol.
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La première étape du transport inverse du cholestérol consiste en l’efflux du cholestérol des cellules
périphériques (macrophages). Le transporteur ABCA1 (ATP-binding cassette A1) facilite l’efflux du cholestérol
vers les HDL pré-matûres grâce à la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) et la protéine de transfert de
phospholipides (PLTP). La protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) et la LPL facilitent
l’incorporation du cholestérol dans les cellules hépatiques. Dans le foie, le cholestérol est métabolisé en acides
biliaires et excrété dans les intestins où il sera éliminé par le transit.
 Figure 9 : Remodelages des lipoprotéines associés au syndrome métabolique (adapté de
Aguilera et al. 2008).
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L’augmentation du flux d’acides gras libres (FFA) stimule la synthèse des triglycérides (TG) et d’ApoB dans le
foie, et ainsi, l’assemblage et la sécrétion de VLDL. En cas d’insulinorésistance, la clairance des VLDL diminue,
entraînant une augmentation du taux de VLDL et de leur taille, ainsi que les échanges de TG vers les LDL et les
HDL contre du cholestérol estérifié (CE). Les LDL sont alors hydrolysées par la lipase hépatique (HL),
aboutissant à la formation de petites LDL denses (sdLDL). Les HDL sont hydrolysées par la lipase hépatique,
entraînant une diminution de la concentration en HDL de grande taille (HDL2).
 Figure 10 : Mécanismes de la régulation de la pression artérielle (adapté de Cowley, Jr.
2006).
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La pression artérielle est le produit du débit cardiaque par la résistance périphérique totale. Le débit cardiaque est
déterminé par des relations complexes entre le volume sanguin, la compliance et la résistance des vaisseaux. La
résistance périphérique totale est déterminée par la structure et les fonctions des vaisseaux. Les facteurs
neuroendocriniens ont un impact important sur les fonctions vasculaires et rénales. Il existe une autorégulation
(lignes en pointillé) grâce à des détecteurs de la pression artérielle qui envoient des signaux régulant les
fonctions neuroendocriniennes, rénales et vasculaires.
 Figure 11 : Le système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS).
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Quand le volume sanguin diminue, les reins sécrètent la rénine qui clive l’angiotensinogène en angiotensine I,
qui sera à son tour clivée en angiotensine II par l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE). L’angiotensine
II exerce un effet vasoconstricteur et provoque une augmentation de la pression sanguine en stimulant le système
nerveux sympathique et la sécrétion d’aldostérone et de vasopressine (ou anti-diuretic drug, ADH), et ainsi la
réabsorption de sels et la rétention d’eau.
 Figure 12 : Pathophysiologie du syndrome métabolique et de l’insulinorésistance (adapté de
Eckel et al. 2005).
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Des AGL (FFA) sont libérés en abondance du tissu adipeux (TA) hypertrophié. Dans le foie, les AGL
augmentent la production de glucose et de TG et la sécrétion de VLDL, entraînant une diminution du taux de
HDL-cholestérol et une augmentation des LDL denses et de petite taille (sdLDL). Les AGL réduisent la
sensibilité à l’insuline dans les muscles et inhibent ainsi l’incorporation cellulaire du glucose. Les perturbations
associées à ce processus sont une réduction de la compartimentation du glycogène et une augmentation intra-
musculaire de lipides (intramuscular droplet). L’augmentation de la glycémie et des AGL circulants accroît la
sécrétion d’insuline dans le pancréas. L’hyperinsulinémie ainsi engendrée peut stimuler la réabsorption du
sodium dans les reins, et augmenter l’activité du système nerveux sympathique, et ainsi contribuer à l’HTA. Les
AGL pourraient aussi contribuer à l’HTA de cette manière. De plus, la sécrétion de cytokines comme TNFα et
IL-6 par le TA aggravent la résistance à l’insuline et la lipolyse. IL-6 et d’autres cytokines augmentent aussi dans
la circulation et pourraient accroître la production de glucose et de VLDL dans le foie et aggraver
l’insulinorésistance dans les muscles. Les cytokines et les AGL induisent la production de fibrinogène et de PAI-
1 dans le foie, en complément de la surproduction de PAI-1 dans le TA, aboutissant ainsi à un état
prothrombotique. Enfin, une diminution de la production de cytokines anti-inflammatoires comme l’adiponectine
est également observée chez les individus ayant un syndrome métabolique ou une insulinorésistance.
 Figure 13 : Relation entre taille de l’échantillon et effet escompté (z-score et OR) (adapté de
Li et al. 2008).
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La figure représente la relation entre la taille de l’échantillon et la taille de la déviation par allèle (z-score) en (a),
et le risque associé à chaque allèle (OR) en (b), selon une puissance de 80% et un seuil significatif à 1%, en
fonction de différentes fréquences alléliques représentées par un gradient de gris (0,05 ; 0,1 ; 0,15 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4
et 0,5). Le petit cercle correspond à une fréquence allélique de 40%, une déviation de 0,10, et un OR de 1,32,
comparable au SNP rs9939609 du gène FTO associé au BMI et au risque d’obésité [Frayling et al. 2007].
 Figure 14 : Facteurs génétiques associés au taux plasmatique de lipides (adapté de Hegele
2009).
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ANGPTL4

Le graphe représente la distribution des lipides dans la population : le taux plasmatique (x) en fonction de la
fréquence (y). En-dessous du graphe sont représentés les gènes déterminant le taux de lipoprotéine pour chaque
segment de la distribution. Les gènes non surlignés ont été identifiés par des approches de génétique classique,
les gènes identifiés par séquençage sont surlignés en orange, et ceux surlignés en bleu, par les GWAS. ho :
homozygote, he : hétérozygote.
 Figure 15 : Localisation de gènes et de régions chromosomiques associés au syndrome
métabolique (adapté de Teran-Garcia et al. 2007).
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Les rectangles situés à droite de chaque chromosome représentent les QTLs liés au syndrome métabolique (selon
Teran-Garcia & Bouchard [Teran-Garcia et al. 2007]). Les gènes qui semblent être associés de manière
cohérente au syndrome métabolique sont représentés en rouge.
 Figure 16 : Mécanismes de régulation transcriptionnelle des LXRs (adapté de Baranowski
2008).
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A l’état basal et en l’absence de ligand, les liver X receptors (LXR) et le retinoid X receptor (RXR) forment un
hétérodimère reconnaissant spécifiquement le LXR-response element (LXRE) situé dans le promoteur du gène
cible. LXR/RXR réprime alors activement la transcription du gène en recrutant des co-répresseurs, tels que le co-
répresseur de récepteur nucléaire (NcoR) et le facteur SMRT (silencing mediator of retinoic acid and thyroid
hormone receptors). La fixation d’un ligand induit un changement conformationnel de l’hétérodimère, entraînant
le remplacement des co-répresseurs par des co-activateurs comme le co-activateur du récepteur stéroïdien (SRC-
1), Grip1 (un co-activateur de la famille p160) ou le PPARγ co-activateur-1α (PGC1α) activant ainsi la
transcription du gène cible.
 Figure 17 : LXRs et transport inverse du cholestérol.
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Dans les macrophages, l’activation des LXRs augmente la captation sélective du cholestérol des HDLs, via
l’induction de l’expression des gènes de l’apolipoprotéine E (ApoE), de la lipoprotéine lipase (LPL) et de la
Cavéoline-1. Les LXRs stimulent l’expression des gènes Niemann Pick C (NPC1 et NPC2), favorisant la
mobilisation du cholestérol intracellulaire, et l’expression du transporteur ATP-binding cassette (ABC)-A1
permettant l’efflux du cholestérol vers les HDLs ou les apolipoprotéines E et C. Ils activent également
l’expression des gènes codant la protéine de transfert des lipoprotéines (PLTP) et la protéine de transfert d’esters
de cholestérol (CETP) facilitant ainsi le remodelage des particules lipoprotéiques et leur entrée dans le foie. Ils
induisent l’expression des gènes codant les transporteurs ABCG5 et ABCG8 dans le foie, permettant l’excrétion
du cholestérol vers la bile, et dans l’intestin, ce qui, en complément de l’inhibition de l’expression du gène
Niemann Pick C1 like 1 (NPC1L1), inhibe l’absorption intestinale de cholestérol et favorise ainsi son
élimination par les selles.
 Figure 18 : LXRα et lipogenèse hépatique (d’après Baranowski 2008).
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LXRα induit l’expression de la sterol response element binding protein (SREBP1c) et de la carbohydrate
response element binding protein (ChREBP). L’expression des gènes lipogéniques codant l’acétyl-CoA
carboxylase (ACC), l’enzyme de synthèse des AG (FAS) et la stéaroyl-CoA désaturase (SCD) est activée par
LXRα, SREBP1c et ChREBP. Ces 3 enzymes synthétisent les acides gras (fatty acids) qui seront assemblés en
triglycérides (TAG), sécrétés dans les particules VLDL. LXRα favorise aussi cette sécrétion par l’activation de
l’expression des gènes codant la protéine de transfert des lipoprotéines (PLTP) et l’angiopoietin-like protein 3
(ANGPTL3). LXRα active aussi l’expression du gène FAT/CD36 permettant la captation des acides gras libres
(FFA) du plasma vers le foie.
 Figure 19 : LXRs et métabolisme du glucose (d’après Baranowski 2008).
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Les LXRs inhibent la gluconéogenèse hépatique en inhibant l’expression des gènes codant les enzymes
phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK), la glucose-6-phosphatase (G6Pase) et la fructose-1,6-
biphosphatase (FBPase). Cet effet pourrait être médié par l’inhibition de la voie de signalisation des
glucorticoïdes. Les LXRs pourraient aussi augmenter l’utilisation du glucose en périphérie en augmentant
l’expression du transporteur GLUT4 dans les muscles et les adipocytes. Enfin, les LXRs stimuleraient la
sécrétion d’insuline dans la pancréas.
 Figure 20 : Fonctions d’ANGPTL3.
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ANGPTL3 induit l’angiogenèse et la croissance des cellules hématopoïétiques. Elle stimule la lipolyse du tissu
adipeux entraînant ainsi une libération d’acides gras libres (AGL) et de glycérol. Elle exerce un effet délétère sur
le métabolisme des lipides en inhibant la lipoprotéine lipase (LPL) qui hydrolyse, d’une part, les chylomicrons
(CM) en chylomicrons remnants (CMR), et d’autre part, les VLDL en IDL, conduisant ainsi à une augmentation
des taux plasmatiques de VLDL, triglycérides (TG), cholestérol et AGL. ANGPTL3 inhibe la lipase endothéliale
(EL) impliquée dans le remodelage des lipoprotéines HDL (CE : cholestéryl ester, PL : phospholipides, A-I :
ApoA1) et est ainsi corrélée au taux plasmatique de HDL-cholestérol.
 Figure 21 : Fonctions d’ANGPTL4.
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ANGPTL4 exerce un effet délétère sur le métabolisme des lipides en inhibant la lipoprotéine lipase (LPL) qui
hydrolyse, d’une part, les chylomicrons (CM) en chylomicrons remnants (CMR), et d’autre part, les VLDL en
IDL, conduisant ainsi à une augmentation des taux plasmatiques de VLDL, triglycérides (TG), cholestérol et
AGL. ANGPTL4 inhibe aussi la lipase hépatique (HL) qui, avec la LPL, permet la capture de cholestérol (C) par
le foie, entraînant ainsi une augmentation de la synthèse de cholestérol. Au contraire, ANGPTL4 exerce un effet
bénéfique sur l’adiposité puisqu’elle stimule la lipase du tissu adipeux (ATGL), l’oxydation des AGL et inhibe la
synthèse des TG, favorisant ainsi l’utilisation de l’énergie. ANGPTL4 inhibe également l’absorption intestinale
des lipides en inhibant la LPL de l’intestin. Son rôle dans l’angiogenèse et l’homéostasie glucidique reste à
éclaircir.
 Figure 22 : Fonctions d’ANGPTL6.
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ANGPTL6 exerce des effets pro-angiogéniques en induisant la néovascularisation et l’artériogenèse. Elle

favorise la régénération de la peau en stimulant la croissance des kératinocytes et des fibroblastes. Son rôle dans
l’homéostasie glucidique est également bénéfique puisqu’elle inhibe la production de la glucose-6-phosphatase,
empêchant ainsi la gluconéogenèse, et elle améliore la signalisation de l’insuline (via IRS-1, PI3-K et FoxO1).
Elle augmenterait également les dépenses énergétiques.
 Figure 23 : Exemple de génotypage par RFLP.

Création d’un site de restriction par amorce dégénérée :

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 Figure 24 : Génotypage par TaqMan (adapté de TaqMan® SNP Genotyping Assays
Protocol).

Chaque sonde contient un fluorophore – VIC (V) ou FAM (F) – à son extrémité 5’, un minor groove binder
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(MGB) permettant d’augmenter la température de dénaturation pour des sondes courtes et ainsi de discriminer
plus facilement les allèles, et un quencher non fluorescent (NFQ) en 3’.
Pendant l’amplification, chaque sonde s’hybride spécifiquement à la séquence située entre les amorces. Quand la
sonde est intacte, la proximité du quencher au fluorophore empêche sa fluorescence. L’ADN polymérase
AmpliTaq Gold® clive uniquement les sondes qui sont hybridées. Ce clivage sépare alors le fluorophore du
quencher et permet ainsi sa fluorescence.
 Figure 25 : Génotypage par GoldenGate (adapté de Illumina® GoldenGate® Assay
Protocol).
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L’échantillon d’ADN est activé par liaison de particules paramagnétiques (1). Trois sondes sont ajoutées pour le
génotypage d’un SNP (2): une sonde spécifique de l’allèle 1 (ASO1), une sonde spécifique de l’allèle 2 (ASO2),
et une sonde non spécifique des allèles, mais spécifique du locus d’intérêt (LSO). Ces 3 sondes contiennent une
séquence spécifique du locus étudié et un site universel de PCR (P). De plus, la LSO contient une séquence
d’adressage ciblant un type de bille particulier. Après hybridation de ces sondes/amorces et élimination des
oligonucléotides non hybridés (3), suit une étape d’élongation des sondes/amorces (3). Ce produit sert alors de
patron pour la PCR (4). Les amorces P1 et P2 sont marquées par les fluorophores Cy3 et Cy5. Les brins marqués
sont deshybridés (5) puis sont hybridés à une bille grâce à la séquence d’adressage (6). Les fluorophores sont
alors révélés et témoignent de la présence de l’allèle qu’ils marquent.
 Figure 26 : Exemple d’interaction gène-environnement (d’après Talmud 2004).

A B

Fumeurs Fumeurs
Trait

Trait
Non fumeurs Non fumeurs

AA Aa + aa AA Aa + aa
Génotypes Génotypes
C D
Fumeurs Non fumeurs
Trait

Trait
Non fumeurs Fumeurs

AA Aa + aa AA Aa + aa
Génotypes Génotypes
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A) Effet significatif de la consommation de tabac sur le trait quantitatif mesuré, mais pas d'effet du génotype.
B) Effet significatif du génotype sur le trait quantitatif mesuré mais pas de la consommation de tabac.
C) Effets significatifs de la consommation de tabac et du génotype sur le trait quantitatif mesuré mais pas
d’interaction : l’effet du tabac n’est pas différent entre les deux groupes de génotypes.
D) Effets significatifs antagonistes de la consommation de tabac et du génotype sur le trait quantitatif mesuré :
interaction négative, ou qualitative.
 Figure 27: Induction de l’expression du gène FAS (fatty acid synthase) par le TO901317
selon les groupes de génotype pour les SNPs -115G>A (rs12221497) et -6G>A
(rs11039155) de NR1H3.

Les ARN, extraits de cultures primaires de macrophages humains traitées (en noir) ou non (en gris) par le
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TO901317 (1 µmol/L) pendant 24 heures, ont été rétro-transcrits grâce aux amorces spécifiques
AACGCCTACCAGGCCATCCA (sens) et CCATTCCCCGCTGTGTCGAA (antisens). La quantité d’ARNm de
FAS a été mesurée par PCR quantitative en temps réel et normalisée par rapport à celle de la cyclophiline et est
exprimée relativement à celle des cellules non traitées. Les résultats sont exprimés sous forme moyenne ± écart
moyen des duplicats des différents échantillons dont le nombre est indiqué entre parenthèses.
 Figure 28 : Quantification des protéines LXRα dans les cultures primaires de macrophages
humains par western blot.

Les protéines totales des cultures primaires de macrophages humains, traitées (en bleu foncé) ou non (en bleu
clair) par le TO901317 (1 µmol/L) pendant 24 heures, ont été extraites dans un tampon RIPA. Les protéines
LXRα ont été marquées par un anticorps monoclonal de souris anti-hLXRα (AB41902, Abcam). Afin de
normaliser la quantité de protéines LXRα, nous avons marqué les protéines actine β grâce à un anticorps
monoclonal de souris anti-actine β (A5441, Sigma). Les résultats sont exprimés sous forme moyenne ± écart-
type de la densité des bandes relativement à celle des échantillons -6GG non traités. Le nombre d’échantillons
est indiqué entre parenthèses. T+ : protéines extraites de cellules COS7 transfectées par un vecteur d’expression
de LXRα. T- : protéines extraites de cellules COS7 non transfectées.
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 Figure 29 : Rs12221497 (-115G>A) et site NERF.
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 Figure 30 : Clonage du fragment LXRAprom dans les vecteurs pGL3 basic, enhancer et
promoter, et obtention des 4 formes haplotypiques.
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 Figure 31 : Résultats de l’activité transcriptionnelle du fragment LXRAprom.

A. Transfection des vecteurs pGL3 basic vide et LXRAprom G/G dans les cellules COS-7.

Les cellules COS-7 ont été cultivées dans un milieu DMEM avec
10% de sérum de veau fœtal, 2mM de L-glutamine, 50 U/ml de
pénicilline et 50 µg/ml de streptomycine, à 37°C dans une
atmosphère humide avec 5% de CO2. Elles ont été transfectées
de façon transitoire avec 600 ng de vecteurs pGL3 avec un ratio
Fugene (Roche): ADN de 3:1. L’activité luciférase a été dosée 40
heures après la transfection grâce au kit Dual luciferase assay
(Promega). L’activité firefly luciférase des vecteurs a été
normalisée sur l’activité renilla luciférase obtenue par co-
transfection de 20 ng de pRL-CMV (Promega). Les résultats sont
exprimés sous forme moyenne ± écart-type.

B. Transfection des vecteurs pGL3 promoter vide et les 4 formes haplotypiques de

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LXRAprom dans les cellules HepG2.

Les cellules HepG2 ont été cultivées dans

un milieu DMEM avec 10% de sérum de
veau fœtal, 2mM de L-glutamine, 1%
d’acides aminés non essentiels, 50 U/ml
de pénicilline et 50 µg/ml de
streptomycine, à 37°C dans une
atmosphère humide avec 5% de CO2.
Elles ont été transfectées de façon
transitoire avec 600 ng de vecteurs pGL3
± 300 ng de pCI-NERF, avec un ratio
Fugene-HD (Roche): ADN de 3:1.
L’activité luciférase a été dosée comme
précédemment décrit. Les résultats sont
exprimés sous forme moyenne ± écart-
moyen des triplicats de 3 expériences
indépendantes.

C. Transfection des vecteurs pGL3 promoter vide et les 4 formes haplotypiques de

LXRAprom dans les cellules HeLa. Les cellules HeLa ont été cultivées dans
un milieu EMEM avec 10% de sérum de
veau fœtal, 50 U/ml de pénicilline et 50
µg/ml de streptomycine, à 37°C dans une
atmosphère humide avec 5% de CO2.
Elles ont été transfectées de façon
transitoire avec 500 ng de vecteurs pGL3
± 300 ng de pCI-NERF, avec un ratio
Fugene-HD (Roche): ADN de 3:1.
L’activité luciférase a été dosée comme
précédemment décrit. Les résultats sont
exprimés sous forme moyenne ± écart-
moyen des triplicats de 3 expériences
indépendantes. *p<0,10 par rapport à
chaque haplotype à l’état basal (test de
Student).
 Tableau 1 : Critères de diagnostic du syndrome métabolique selon les définitions de l’OMS, de l’EGIR, du NCEP, de l’AHA et de l’IDF.

OMS EGIR NCEP AHA IDF

[World Health Organization 1999] [Balkau et al. 1999] [2001] [Grundy et al. 2005] [Alberti et al. 2005]

IMC > 30kg/m² ou RTH Tour de taille Tour de taille Tour de taille Tour de taille (Europe)
Adiposité
> 0,90/0,85 (H/F) ≥ 94/80 cm (H/F) > 102/88 cm (H/F) ≥ 102/88 cm (H/F) ≥ 94/80 cm (H/F)
Glycémie à jeun
Glycémie à jeun
≥ 5,6 mmol/L Glycémie à jeun
≥ 6,1 mmol/L Glycémie à jeun Glycémie à jeun
Hyperglycémie ou traitement ≥ 5,6 mmol/L
ou HPO ≥ 7,8 mmol/L ≥ 6,1 mais < 7,0 mmol/L ≥ 6,1 mmol/L
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hypoglycémiant ou diabète de type 2

ou diabète de type 2
ou diabète de type 2

Captation du glucose
Insulino- Insulinémie à jeun
< quartile le plus bas en clamp - - -
résistance ≥ 75e percentile
hyperinsulinique euglycémique

TG ≥ 1,7 mmol/L TG ≥ 1,7 mmol/L

TG ≥ 1,7 mmol/L
TG ≥ 2,0 mmol/L ou traitement hypolipémiant ou traitement hypolipémiant
TG ≥ 1,7 mmol/L
ou HDL-C
Dyslipidémie ou HDL-C
< 1,0 mmol/L HDL-C HDL-C
< 0,9/1,0 mmol/L (H/F) HDL-C
ou traitement hypolipémiant < 1,04/1,29 mmol/L (H/F) < 1,03/1,29 mmol/L (H/F)
< 1,04/1,29 mmol/L (H/F)
ou traitement hypolipémiant ou traitement hypolipémiant

PAS ≥ 130 PAS ≥ 130 PAS ≥ 130

Pression
PA ≥ 140/90 mm Hg et/ou PAD ≥ 85 mm Hg PA ≥ 130/85 mm Hg ou PAD ≥ 85 mm Hg ou PAD ≥ 85 mm Hg
artérielle élevée
ou traitement hypotenseur ou traitement hypotenseur ou traitement hypotenseur

Autre Microalbuminurie - - - -
Hyperglycémie ou
Principe de la Hyperinsulinémie plus ≥ 2 Obésité abdominale plus ≥ 2
insulinorésistance plus ≥ 2 des ≥ 3 parmi les 5 critères ≥ 3 parmi les 5 critères
définition des autres critères des autres critères
autres critères
IMC : indice de masse corporelle ; RTH : rapport taille sur hanche.
TG : triglycérides ; HDL-C : high-density lipoprotein cholesterol.
HPO : hyperglycémie provoquée par voie orale.
PAS : pression artérielle systolique ; PAD : pression artérielle diastolique.
H : chez l’homme ; F : chez la femme.
Microalbuminurie : excrétion urinaire d’albumine ≥ 20 µg/min ou rapport albumine/créatinine ≥ 30 mg/g.
 Tableau 2 : Exemples de prévalence (%) des principaux phénotypes du syndrome
métabolique.
NHANES III DECODE DESIR
[Ford et al. 2002] [Hu et al. 2004] [Balkau et al. 2003]
Etats-Unis d’Amérique Europe France

Particularités de la Age 50-59 ans

Age ≥ 20 ans Age 30-64 ans
population étudiée (8 études européennes)

H : 3,5 à 42,6 H : 14,4

Désordre glycémique 12,6
F : 4,9 à 32,2 F : 4,7

H : 8,5 à 27,7 H : 7,9

Obésité (abdominale) 38,6
F : 14,2 à 36,8 F : 13,3

Faible taux de H : 14,2

37,1
HDL-cholestérol H : 36,2 à 46,6 F : 14,9
F : 13,7 à 37,8 H : 25,6
Hypertriglycéridémie 30,0
F : 13,2

Pression artérielle H : 20,4 à 71,5 H : 68,6

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34,0
élevée F : 21,3 à 65,9 F : 44,6
H : hommes.
F : femmes.
 Tableau 3 : Exemples de prévalence du syndrome métabolique aux Etats-Unis.

Prévalence du syndrome métabolique (%)

Age
Etude Critères Hommes Femmes Total
(n)

NHANES III
≥ 20
1988-1994 NCEP / OMS 24,2 / 27,9 23,5 / 22,6 23,9 / 25,1
(8608)
[Ford et al. 2003]

NHANES 1999-2002 ≥ 20
NCEP* / IDF 33,7 / 38,9 35,4 / 38,1 34,5 / 39,0
[Ford 2005] (3601)

San Antonio Heart

25-64
Study AHA / IDF / OMS 24,0 / 28,4 / 18,8 16,8 / 24,7 / 12,1 -
(2559)
[Lorenzo et al. 2007]
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Liste non exhaustive des études.

*Critères du NCEP mais avec le seuil d’hyperglycémie abaissé à 5,6 mmol/L.
 Tableau 4 : Exemples de prévalence du syndrome métabolique en Europe.

Prévalence du syndrome métabolique (%)

Age
Pays et référence Critères Hommes Femmes Total
(n)
Suède 46-68
(5047) AHA / IDF / EGIR - - 20,6 / 21,9 / 18,8
[Nilsson et al. 2007]
Pays-Bas 50-75
(1364) NCEP / OMS 19,0 / 26,0 32,0 / 26,0 -
[Dekker et al. 2005]
Angleterre 40-69
(2346) NCEP / OMS 18,4 / 18,8 14,4 / 9,1 -
[Tillin et al. 2005]
France 35-64
[Dallongeville et al. (3359) NCEP 23,0 16,9 -
2005a]
France 50-59
(10592) NCEP / IDF / OMS 29,7 / 38,9 / 35,5 - -
[Bataille et al. 2006]
Allemagne
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(7131) AHA / IDF 23,5 / 31,6 17,6 / 22,6 -

[Assmann et al. 2007]
Hongrie 30-60
(13383) AHA / IDF 6,7 / 14,9 9,8 / 8,6 -
[Csaszar et al. 2006]
Grèce Adultes
(9669) AHA / IDF - - 24,5 / 43,4
[Athyros et al. 2005]
Italie 45-65
(1877) NCEP 24,1 23,1 -
[Bo et al. 2005]
Espagne 35-64
(2540) AHA / IDF 22,3 / 27,7 30,7 / 33,6 -
[Lorenzo et al. 2006]
20-40 (2834) 14 / 10 4/3
Méta-analyse EGIR 40-55 (7323) OMS / EGIR 23 / 9 13 / 7 -
[Balkau et al. 2002] ≥ 55 (7404) 41 / 22 26 / 17
Méta-analyse DECODE 30-89
(11512) OMS 15,7 14,2 -
[Hu et al. 2004]
Liste non exhaustive des études.
 Tableau 5 : Exemples de définitions du syndrome métabolique chez les jeunes.

Viner et al Weiss et al Cook et al De Ferranti et al

[Viner et al. 2005] [Weiss et al. 2004] [Cook et al. 2003] [de Ferranti et al. 2004]

IMC IMC Tour de taille Tour de taille

Adiposité ≥ 95ème percentile selon ≥ 97ème percentile ≥ 90ème percentile ≥ 75ème percentile selon
l’âge et le genre selon l’âge et le genre selon l’âge et le genre l’âge et le genre

Glycémie à jeun
≥ 6,1 mmol/L
ou HPO ≥ 7,8 mmol/L Glycémie à jeun
Hyperglycémie Glycémie à jeun Glycémie à jeun
≥ 6,1 mmol/L
Hyperinsulinémie ou insulinémie à jeun ≥ 6,1 mmol/L ≥ 6,1 mmol/L
≥ 15 mU/L pré-pubère
≥ 30 mU/L pubère
≥ 20 mU/L post-pubère
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TG ≥ 1,75 mmol/L TG ≥ 1,2 mmol/L TG ≥ 1,2 mmol/L TG ≥ 1,1 mmol/L

ou
Dyslipidémie HDL-C < 0,9 mmol/L
ou cholestérol total HDL-C
≥ 95ème percentile HDL-C < 1,1 mmol/L HDL-C < 1,1 mmol/L < 1,2 mmol/L (G),
< 1,3 mmol/L (F)

Pression
PA ≥ 95ème percentile PA ≥ 95ème percentile PA ≥ 90ème percentile PA ≥ 90ème percentile
artérielle élevée

Principe de la
≥ 3 parmi les 4 critères ≥ 3 parmi les 5 critères ≥ 3 parmi les 5 critères ≥ 3 parmi les 5 critères
définition

IMC : indice de masse corporelle.

TG : triglycérides.
HDL-C : high-density lipoprotein cholesterol.
HPO : hyperglycémie provoquée par voie orale.
PA : pression artérielle.
G : garçons.
F : filles.
 Tableau 6 : Composition des lipoprotéines.
Chylomicrons VLDL LDL HDL

Principales A1, A4, A5, B48, C1, B100, E, C1, C2, C3 B100, E A1, A2, (E)
apolipoprotéines C2, C3, E
TG, % 80-95 45-65 4-8 2-7

Phospholipides, % 3-6 15-20 18-24 26-32

Cholestérol libre, % 1-3 4-8 6-8 3-5

Cholestérol estérifié, % 2-4 16-22 45-50 15-20

Protéines, % 1-2 6-10 18-22 45-55

TG : triglycérides
VLDL : lipoprotéine de très basse densité
LDL : lipoprotéine de basse densité
HDL : lipoprotéine de haute densité
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 Tableau 7 : Gènes associés à l’obésité ou aux phénotypes associés.
Gène Nom Chromosome Fonction

Gènes identifiés par approche gène candidat

ADIPOQ Adiponectine 3 Adipokine, impliquée dans la sensibilité à l’insuline ; propriétés
anti-inflammatoires
ADRB2 Récepteur β-2 adrénergique 5 Récepteur aux catécholamines impliqué dans la régulation de la
lipolyse du TA, du métabolisme des lipoprotéines, l’homéostasie
glucidique et le tonus vasculaire
ADRB3 Récepteur β-3 adrénergique 8 Lipolyse et thermogenèse au niveau du TA
GNB3 Guanine nucleotide-binding 12 Transduction du signal
protein β-3
HTR2C 5α-hydroxytryptamine récepteur X Mobilisation du calcium intracellulaire et activation de la
2-C protéine kinase C
NR3C1 Nuclear receptor subfamily 3, 5 Récepteur nucléaire activé par les glucocorticoïdes, impliqué
(GR) group C, member 1 dans le développement, le métabolisme glucidique et le système
(glucocorticoid receptor) immunitaire
LEP Leptine 7 Hormone anorexigène
LEPR Récepteur de la leptine 1 Signalisation de la leptine
PPARG Récepteur γ activé par les 3 Principal régulateur transcriptionnel de la différenciation
proliférateurs de peroxysomes adipocytaire
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UCP1 Uncoupling protein 1 4

UCP2 Uncoupling protein 2 11 Transporteurs mitochondriaux impliqués dans la régulation de
l’homéostasie énergétique
UCP3 Uncoupling protein 3 11

Gènes identifiés par les GWAS

FTO Fat mass and obesity-associated 16 Régulerait la balance énergétique dans l’hypothalamus
MC4R Récepteur de type 4 à la 18 Inhibition de la prise alimentaire
mélanocortine
SH2B1 SH2B adaptator protein 1 16 Signalisation de la leptine dans le SNC
MTCH2 Mitochondrial carrier homolog 2 11 Transporteur mitochondrial impliqué dans l’apoptose
NEGR1 Neuronal growth regulator 1 1 Croissance neuronale
KCTD15 Potassium channel tetramerization 19 Fonction inconnue
domain-containing protein 15
TMEM18 Transmembrane protein 18 2 Fonction inconnue
GNPDA2 Glucosamine-6-phosphate 4 Fonction inconnue
désaminase 2
NPC1 Niemann-Pick C1 18 Trafic intracellulaire du cholestérol
MAF c-MAF-inducing protein 16 Développement et différenciation cellulaire dans le système
immunitaire, le pancréas et le TA
PTER Phosphotriesterase-related 10 Exprimé dans le rein, fonction inconnue
PRL Prolactine 6 Hormone impliquée dans la reproduction, le système
immunitaire, le métabolisme énergétique et le cancer (sein,
prostate)
BDNF Brain-derived neurotrophic factor 11 Croissance et survie neuronale
TFAP2B Transcription factor activating 6 Facteur de transcription exprimé dans le TA, favorisant
enhancer binding protein 2 beta l’accumulation de lipides et la sensibilité à l’insuline
MSRA Méthionine sulfoxide réductase A 8 Réparation de l’oxydation des protéines
LYPLAL1 Lysophospholipase-like 1 1 TG lipase
NRXN3 Neurexine 3 14 Molécule d’adhésion exprimée dans le SNC jouant un rôle dans
l’addiction
SNC : système nerveux central
TA : tissu adipeux
TG : triglycérides
 Tableau 8 : Gènes associés à l’homéostasie glucidique.

Gène Nom Chromosome Fonction

Gènes identifiés par approche gène candidat

KCNJ11 Potassium channel inwardly- 11 Régulation de la sécrétion de l’insuline induite par le glucose
rectifying J-11
PPARG Récepteur γ activé par les 3 Principal régulateur transcriptionnel de la différenciation
proliférateurs de peroxysomes adipocytaire
TCF2/HNF1B Transcription factor 2 / 17 Facteur de transcription régulant de nombreux gènes dans le
hepatocyte nuclear factor 1-B foie et le pancréas
WFS1 Wolfram syndrome 1 4 Protéine transmembranaire du réticulum endoplasmique

Gènes identifiés par étude de liaison

TCF7L2 Transcription factor 7-like 2 10 Facteur de transcription impliqué dans la voie de signalisation
WNT, la prolifération cellulaire, l’embryogenèse, la
régulation de la myogenèse et de l’adipogenèse

Gènes identifiés par les GWAS

FTO Fat mass and obesity-associated 16 Régulerait la balance énergétique dans l’hypothalamus
CDKAL1 CDK5 regulatory subunit- 6
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associated protein 1-like 1 Régulateurs de kinases dépendantes de la cycline, exprimées

CDKN2A-2B CDK inhibiteur 2-A 9 dans les cellules β du pancréas
IGF2BP2 Insuline-like growth factor 2 3 Développement du pancréas
mRNA-binding protein 2
HHEX/IDE Haematopoietically expressed 10 Développement du pancréas
homeobox / insulin-degrading
enzyme
SLC30A8 Solute carrier family 30 A-8 8 Transporteur de zinc
JAZF1 Juxtaposed with another zinc 7 Répresseur transcriptionnel de NR2C2
finger gene 1
CDC123 Cell division cycle 123 homolog 10 Régulation du cycle cellulaire
Calcium/calmodulin-dependent Régulation des fonctions des granulocytes via la transduction
CAMK1D
protein kinase 1D du signal de chémokines
TSPAN8 Tétraspanine 8 12 Glycoprotéine membranaire exprimée dans certaines formes
Leucine-rich repeat-containing G de cancer
LGR5
protein-coupled receptor 5 Marqueur des cellules souches intestinales
THADA Thyroid adenoma associated 2 Apoptose
ADAMTS9 A disintegrin and metalloprotease 3 Métalloprotéase clivant certains protéoglycanes, exprimée
with thrombospondin 9 dans le pancréas et le muscle squelettique
NOTCH2 Notch homolog 2 1 Récepteur membranaire impliqué dans l’organogenèse
pancréatique
G6PC2 Glucose-6-phosphatase C-2 2 Hydrolyse du glucose-6-phosphate
GCK Glucokinase 7 Phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate
MTNR1B Melatonin receptor 1-B 11 Signalisation de la mélatonine, impliquée dans le rythme
circadien
PANK1 Pantothénate kinase 1 10 Enzyme clé de la biosynthèse du coenzyme A
SNC : système nerveux central
CDK : cyclin-dependent kinase
NR2C2: nuclear receptor subfamily 2, group C, member 2
 Tableau 9 : Gènes associés au lipides plasmatiques.
Gène Nom Chromosome Fonction

Gènes associés au LDL-cholestérol

APOE Apolipoprotéine E 19 Apolipoprotéine des chylomicrons
APOB Apolipoprotéine B 2 Principale apolipoprotéine des chylomicrons et LDL
PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin 1 Métabolisme du cholestérol
type 9
MTTP Microsomal triglyceride transfer 4 Rôle central dans l’assemblage des lipoprotéines
protein
HMGCR 3-hydroxy-3-methylglutaryl- 5 Enzyme catalysant la synthèse du cholestérol
Coenzyme A réductase
SORT1 Sortiline 1 1 Protéine transmembranaire du réseau trans-Golgi
CILP2 Cartilage intermediate layer protein 2 19 Fonction inconnue
BCAM Basal cell adhesion molecule 19 Immunoglobuline, rôle potentiel dans le cancer de la peau
TOMM40 Translocase of outer mitochondrial 19 Permet l’entrée de protéines dans la mitochondrie
membrane 40
ABCG8 ATP-binding cassette, sub-family G-8 2 Excrétion de cholestérol et de stérols dans la bile
MAFB v-maf musculoaponeurotic 20 Rôle dans la régulation de l’hématopoïèse
fibrosarcoma oncogene homolog B
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HNF1A Hepatic nuclear factor 1-α 12 Facteur de transcription régulant l’expression de nombreux
gènes spécifiques du foie
TIMD4 T-cell immunoglobulin and mucin 5 Récepteur à phosphatidylsérine à la surface des
domain containing 4 macrophages facilitant la phagocytose des cellules
apoptotiques
ABCG5 ATP-binding cassette, sub-family G-5 2 Excrétion de stérols dans la bile, limite l’absorption
intestinale
DNAH11 Dynein, axonemal, heavy chain 11 7 ATPase impliquée dans le mouvement des cils
respiratoires
FADS2-3 Fatty acid desaturase 11 Catalyse la désaturation des AG

Gènes associés au HDL-cholestérol

CETP Cholesteryl ester transfer protein 16 Transfert d’esters de cholestérol entre lipoprotéines
ABCA1 ATP-binding cassette, sub-family A-1 9 Efflux du cholestérol intracellulaire
APOA1 Apolipoprotéine A-1 11 Principale protéine des HDL
LCAT Lecithin-cholesterol acyltransferase 16 Enzyme d’estérification du cholestérol extracellulaire
nécessaire pour le transport du cholestérol
LIPC Lipase hépatique 15 Hydrolyse les triglycérides et facilite l’incorporation
cellulaire des lipoprotéines
LIPG Lipase endothéliale 18 Phospholipase impliquée dans le métabolisme des
lipoprotéines
LPL Lipoprotéine lipase 8 Hydrolyse les triglycérides et facilite l’incorporation
cellulaire des lipoprotéines
GALNT2 Galactosamine:polypeptide N- 1 O-glycosylation et transfert de N-acétylgalactosamine sur
acétylgalactosaminyl-transférase 2 les résidus sérine ou thréonine des protéines
MVK6 Mevalonate kinase 6 12 Synthèse des isoprénoïdes et stérols
Methylmalonic aciduria cobalamin Conversion de la vitamine B12 en adénosylcobalamine
MMAB
deficiency B
ANGPTL4 Angiopoietin-like protein 4 19 Inhibition de la LPL, lipolyse du TA, homéostasie du
glucose
FADS1-2-3 Fatty acid desaturase 11 Catalyse la désaturation des AG
HNF4A Hepatocyte nuclear factor 4-α 20 Facteur de transcription contrôlant l’expression de
nombreux gènes hépatiques
PLTP Phospholipid transfer protein 20 Transferts de phospholipides des lipoprotéines riches en
TG vers les HDL
TTC39B Tetratricopeptide repeat domain 39B 9 Fonction inconnue
MADD MAP-kinase activating death domain 11 Transduction du signal apoptotique
FOLH1 Folate hydrolase Glutamate carboxypeptidase, hydrolyse du folate
NR1H3 Nuclear receptor subfamily 1, group 11 Gène codant LXRα (liver X receptor), récepteur nucléaire
H, member 3 impliqué dans le métabolisme gluco-lipidique
 Gène Nom Chromosome Fonction

Gènes associés aux TG

APOA1/C3/A Apolipoprotéines A1/C3/A4/A5 11 Apolipoprotéines
4/A5
LPL Lipoprotéine lipase 8 Hydrolyse les triglycérides et facilite l’incorporation
cellulaire des lipoprotéines
APOC2 Apolipoprotéine C-2 19 Apolipoprotéine des VLDL
MTTP Microsomal triglyceride transfer 4 Rôle central dans l’assemblage des lipoprotéines
protein
ANGPTL4 Angiopoietin-like protein 4 19 Inhibition de la LPL, lipolyse du TA, homéostasie du
glucose
LIPC Lipase hépatique 15 Hydrolyse les triglycérides et facilite l’incorporation
cellulaire des lipoprotéines
APOB Apolipoprotéine B 2 Principale apolipoprotéine des chylomicrons et LDL
CILP2 Cartilage intermediate layer protein 2 19 Fonction inconnue
TRIB1 Tribbles homolog 1 8 Fonction inconnue
GCKR Glucokinase regulator 2 Inhibe la glucokinase dans le foie et le pancréas
MLXIPL MLX interacting protein-like 7 Facteur de transcription activant, de façon glucose-
(CHREBP) (carbohydrate response element- dépendante, l’expression de gènes impliqués dans la
binding protein) synthèse des TG
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GALNT2 Galactosamine:polypeptide N- 1 O-glycosylation et transfert de N-acétylgalactosamine sur

acétylgalactosaminyl-transférase 2 les résidus sérine ou thréonine des protéines
AMAC1L2 Acyl-malonyl condensing enzyme 1- 8 Fonction inconnue
like 2
FADS1-2-3 Fatty acid desaturase 11 Catalyse la désaturation des AG
ANGPTL3 Angiopoietin-like protein 3 1 Inhibition de lipases, lipolyse du TA
PLTP Phospholipid transfer protein 20 Transferts de phospholipides des lipoprotéines riches en
TG vers les HDL
TG : triglycérides
 Tableau 10 : Gènes associés à l’hypertension artérielle.

Gène Nom Chromosome Fonction

Gènes associés aux formes monogéniques

HSD11B2 Hydroxystéroïde (11-beta) 16 Enzyme de conversion de la cortisone en cortisol
deshydrogénase 2
CYP11B1 Cytochrome P450 11-B-1 8 Métabolisme du cortisol dans le cortex adrénergique
(stéroïde 11β hydroxylase)
CYP11B2 Cytochrome P450 11-B-2 8 Synthèse de l’aldostérone, composante du système rénine-
(aldostérone synthase) angiotensine
NR3C2 Nuclear receptor subfamily 3, group 4 Récepteur aux minéralocorticoïdes et à l’aldostérone
C, member 2
SCNN1B Sodium channel, nonvoltage-gated 1 16
β Pompe à sodium contrôlant le transport de fluides et
SCNN1G Sodium channel, nonvoltage-gated 1 16 d’électrolytes à travers l’épithélium
γ
WNK1 Lysine deficient protein kinase 1 12 Sérine-thréonine kinase impliquée dans la signalisation
cellulaire. WNK4 serait impliqué dans la régulation de la
WNK4 Lysine deficient protein kinase 4 17
pression artérielle et de la balance potassique
PPARG Récepteur γ activé par les 3 Principal régulateur transcriptionnel de la différenciation
proliférateurs de peroxysomes adipocytaire
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MT-TI Mitochondrially encoded tRNA mitochondrie Fonction inconnue

isoleucine
Gènes associés à l’hypertension artérielle essentielle
AGT Angiotensinogène 1 Régulation de la pression artérielle
NOS3 Nitric oxide synthase 3 7 Synthèse d’oxyde nitrique, important régulateur de la
(endothéliale) vasodilatation et impliqué dans le métabolisme glucidique
MEX3C Mex-3 homolog C 18 Fonction inconnue
(RKHD2)
CYP17A1 Cytochrome P450 1-A-1 10 Métabolisme des glucocorticoïdes et des hormones
(stéroïde 17-α-hydroxylase) stéroïdiennes
CYP1A2 Cytochrome P450 1-A-2 15 Métabolisme de médicaments (phénacytine)
FGF5 Fibroblast growth factor 5 4 Développement embryonnaire, croissance cellulaire,
morphogenèse, réparation de tissus, croissance et invasion
tumorale
SH2B3 SH2B adaptor protein 3 12 Signalisation cellulaire impliquée dans l’activation des
lymphocytes T
MTHFR Méthylenetétrahydrofolate réductase 1 Méthylation de l’homocystéine en méthionine.
c10orf107 Chromosome 10 open reading 10 Fonction inconnue
frame 107
ZNF652 Zinc finger protein 652 17 Fonction inconnue
PLCD3 Phospholipase C, delta 3 17 Signalisation cellulaire, via la production de diacylglycérol
et d’inositol trisphosphate
ATP2B1 ATPase, Ca++ transporting, 12 Rôle dans l’homéostasie du calcium intracellulaire
plasma membrane 1
CACNB2 Calcium channel, voltage- 10 Transport du calcium
dependent, beta 2 subunit
PLEKHA7 Pleckstrin homology domain 11 Fonction inconnue
containing, family A member 7
CSK c-src tyrosine kinase
15 Kinases
ULK3 Unc-51-like kinase 3
TBX3/TBX5 T-box 3/T-box 5 12 Facteurs de transcription impliqués dans le développement
embryonnaire
ULK4 Unc-51-like kinase 3 3 Kinase
CDH13 Cadherin 13, H-cadherin 16 Protéine d’adhésion favorisant les interactions
intercellulaires dans le cœur
STK39 Sérine thréonine kinase 39 2 Réponse au stress cellulaire
 Tableau 11 : Gènes associés au syndrome métabolique.

Gène Nom Chromosome Fonction

ADRB2 Récepteur β-2 adrénergique 5 Récepteur aux catécholamines impliqué dans la régulation
de la lipolyse du TA, du métabolisme des lipoprotéines,
l’homéostasie glucidique et le tonus vasculaire
FTO Fat mass and obesity associated 16 Régulerait la balance énergétique dans l’hypothalamus

PPARG Récepteur γ activé par les 3 Principal régulateur transcriptionnel de la différenciation

proliférateurs de peroxysomes adipocytaire
LIPC Lipase hépatique 15 Hydrolyse les triglycérides et facilite l’incorporation
cellulaire des lipoprotéines
LPL Lipoprotéine lipase 8 Hydrolyse les triglycérides et facilite l’incorporation
cellulaire des lipoprotéines
APOA5 Apolipoprotéine A5 11 Composante des HDL, déterminant important du taux
plasmatique de TG
NOS3 Nitric oxide synthase 3 7 Synthèse d’oxyde nitrique, important régulateur de la
(endothéliale) vasodilatation et impliqué dans le métabolisme glucidique
CYP11B2 Cytochrome P450 11-B-2 8 Synthèse de l’aldostérone, composante du système rénine-
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(aldostérone synthase) angiotensine

ENPP1 Ectonucléotide 6 Enzyme clivant une grande variété de substrats, inhibe
pyrophosphatase/phospho- l’activité du récepteur à l’insuline
diestérase 1
CAPN10 Calpaine 10 2 Rôle dans la sécrétion et l’action de l’insuline
IL6 Interleukine 6 7 Cytokine pro-inflammatoire
 Tableau 12 : Principales caractéristiques des individus des échantillons MONICA Lille,
Strasbourg et Toulouse.

Lille Strasbourg Toulouse

(n=1195) (n=1131) (n=1182)
Age, ans 51,3 ± 8,5 51,2 ±8,7 50,2 ± 8,6
Hommes, % 50,3 49,8 51,9
Poids, kg 74,3 ± 15,5 76,2 ± 14,9 71,0 ± 14,1
IMC, kg/m² 26,6 ± 5,0 27,0 ± 4,7 25,5 ± 4,2
Tour de taille, cm 91,0 ± 13,9 92,6 ± 13,8 87,3 ± 12,9
RTH 0,885 ± 0,096 0,889 ± 0,098 0,883 ± 0,089
TG, mmol/L 1,41 ± 1,14 1,29 ± 0,97 1,18 ± 0,74
Cholestérol total, mmol/L 5,90 ± 1,08 6,02 ± 1,04 5,78 ± 1,01
HDL-cholestérol, mmol/L 1,50 ± 0,48 1,48 ± 0,42 1,46 ± 0,44
LDL-cholestérol, mmol/L 3,78 ± 1,03 3,95 ± 0,98 3,84 ± 0,96
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ApoA1, g/L 1,73 ± 0,31 1,73 ± 0,28 1,65 ± 0,26

ApoB, g/L 1,21 ± 0,30 1,23 ± 0,30 1,20 ± 0,27
Glucose, mmol/L 5,55 ± 1,54 5,38 ± 1,30 5,72 ± 1,28
Insuline, µU/mL 11,93 ± 7,92 11,64 ± 10,95 10,42 ± 8,05
HOMA-IR 3,05 ± 2,57 2,90 ± 3,53 2,74 ± 2,90
PAS, mm Hg 133,7 ± 19,4 133,4 ± 20,92 131,1 ± 17,9
PAD, mm Hg 83,1 ± 11,6 85,1 ± 12,6 79,5 ± 10,5
Obèses (IMC ≥ 30), % 20,0 21,9 12,1
Surpoids (25 ≤ IMC < 30), % 36,6 41,9 38,3
DT2, % 10,9 9,2 10,0
Syndrome métabolique (OMS), % 20,6 21,3 16,5
Syndrome métabolique (EGIR), % 15,3 16,5 10,2
Syndrome métabolique (NCEP), % 22,3 19,3 14,7
Syndrome métabolique (AHA), % 32,2 31,3 26,1
Syndrome métabolique (IDF), % 35,2 35,3 31,0
Moyennes ± écart-type ou %.
RTH : rapport taille sur hanches.
PAS : pression artérielle systolique.
PAD : pression artérielle diastolique.
DT2: diabète de type 2.
 Tableau 13 : Principales caractéristiques des individus de l'étude MONEUR.

Sujets Cas
Témoins p* p*
coronariens d'infarctus
(n=585) (n=585) (n=350)

Hommes, % 81,4 81,5 ns 84,9 ns

Age, ans 55,2 ± 8,1 55,6 ± 8,2 ns 55,5 ± 8,1 ns

IMC, kg/m2 27,1 ± 4,8 28,7 ± 5,0 <0,0001 28,7 ± 4,9 <0,0001

Fumeurs et ex-fumeurs, % 63,8 78,1 <0,0001 80,6 <0,0001

Hypercholestérolémie, % 31,8 69,6 <0,0001 73,7 <0,0001

Hypertension, % 55,9 63,4 0,009 58,3 ns

DT2, % 7,0 21,5 <0,0001 22,6 <0,0001

Moyennes ± écart-type ou %.
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IMC : indice de masse corporelle.

Hypercholestérolémie (concentration plasmatique de cholestérol total ≥ 6,2 mmol/L).
Hypertension (PAS≥140 mm Hg ou PAD≥90 mm Hg).
DT2: diabète de type 2.
*par rapport aux témoins.
 Tableau 14 : Principales caractéristiques des individus de l'étude transversale HELENA
(n=1155).

Age, ans 14,8 ± 1,4

Garçons, % 47,8
Poids, kg 58,4 ± 13,0
IMC, kg/m² 21,3 ± 3,8
Tour de taille, cm 72,3 ± 9,3
RTH 0,794 ± 0,070
Masse grasse, % 23,8 ± 9,8
TG, mmol/L 0,79 ± 0,40
Cholestérol total, mmol/L 4,16 ± 0,71
HDL-cholestérol, mmol/L 1,43 ± 0,28
LDL-cholestérol, mmol/L 2,45 ± 0,65
ApoA1, g/L 1,50 ± 0,22
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ApoB, g/L 0,65 ± 0,16

Glycémie, mmol/L 5,00 ± 0,40
Insuline, µU/mL 9,92 ± 5,87
PAS, mm Hg 118,2 ± 13,8
PAD, mm Hg 67,3 ± 9,8
Obèses, % 6,1
Surpoids, % 17,0
Moyennes ± écart-type ou %.
IMC : indice de masse corporelle.
RTH : rapport taille sur hanches.
TG : triglycérides.
PAS : pression artérielle systolique.
PAD : pression artérielle diastolique.
 Tableau 15 : Principales caractéristiques des individus de l'étude cas-témoins pour le DT2
nichée dans l’échantillon HUNT 2.

Témoins Cas DT2

p
(n) (1986) (835)

Hommes, n (%) 978 (49,2) 407 (48,7) ns

Age, ans 65,6 ± 14,3 66,9 ± 13,6 0,02
IMC, kg/m² 26,4 ± 3,9 29,1 ± 5,0 <0,001
Tour de taille, cm 87,9 ± 11,2 96,2 ± 12,5 <0,001
RTH 0,86 ± 0,08 0,90 ± 0,08 <0,001
Glucose*, mmol/L 4,98 ± 0,43 10,20 ± 4,52 <0,001
TG*, mmol/L 1,68 ± 0,92 2,50 ± 1,80 <0,001
Cholestérol total*, mmol/L 6,27 ± 1,25 6,10 ± 1,30 <0,001
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HDL-cholestérol*, mmol/L 1,41 ± 0,41 1,20 ± 0,40 <0,001

PAS, mm Hg 144,8 ± 24,2 152,8 ± 25,5 <0,001
PAD, mm Hg 82,3 ± 12,7 83,8 ± 13,7 <0,001
Moyennes ± écart-type ou %.
IMC : indice de masse corporelle.
RTH : rapport tour de taille sur tour de hanches.
TG : triglycérides.
PAS : pression artérielle systolique.
PAD : pression artérielle diastolique.
*non à jeun.
 Tableau 16 : Etude d’association des SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A)
dans l’étude HELENA.

rs12221497 (-115G>A) GG GA AA p
p
(n) (879) (252) (20) GA+AA vs. GG

IMC, kg/m² 21,3 ± 3,8 21,2 ± 3,8 20,6 ± 3,0 0,28 0,75
Masse grasse, % 24,0 ± 9,8 23,0 ± 9,6 22,3 ± 7,8 0,84 0,97
Triglycérides, mmol/L 68,3 ± 35,3 70,6 ± 33,2 80,1 ± 43,6 0,39 0,35
Cholestérol, mmol/L 4,15 ± 0,71 4,19 ± 0,71 4,10 ± 0,77 0,81 0,52
HDL-cholestérol, mmol/L 1,44 ± 0,27 1,41 ± 0,28 1,28 ± 0,27 0,006 0,02
ApoA1, g/L 1,51 ± 0,22 1,49 ± 0,23 1,44 ± 0,28 0,20 0,19
LDL-cholestérol, mmol/L 0,77 ± 0,37 0,80 ± 0,38 0,91 ± 0,50 0,15 0,06
ApoB, g/L 0,65 ± 0,16 0,67 ± 0,16 0,69 ± 0,16 0,07 0,04
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rs11039155 (-6G>A) GG GA AA p
p
(n) (847) (264) (29) GA+AA vs. GG

IMC, kg/m² 21,3 ± 3,7 21,4 ± 3,9 20,7 ± 3,5 0,40 0,65
Masse grasse, % 24,0 ± 9,7 23,4 ± 9,9 21,2 ± 10,2 0,44 0,54
Triglycérides, mmol/L 0,77 ± 0,37 0,80 ± 0,38 0,91 ± 0,50 0,31 0,16
Cholestérol, mmol/L 4,14 ± 0,71 4,20 ± 0,73 4,27 ± 0,57 0,49 0,34
HDL-cholestérol, mmol/L 1,42 ± 0,27 1,46 ± 0,28 1,56 ± 0,29 0,005 0,006
ApoA1, g/L 1,50 ± 0,22 1,52 ± 0,23 1,55 ± 0,23 0,18 0,09
LDL-cholestérol, mmol/L 2,45 ± 0,62 2,42 ± 0,66 2,40 ± 0,57 0,99 0,87
ApoB, g/L 0,66 ± 0,15 0,65 ± 0,17 0,66 ± 0,14 0,71 0,67
Les valeurs p sont ajustées sur l’âge, le genre et le centre (+IMC pour les variables biologiques).
 Tableau 17 : Etude d’association des SNPs rs12221497 (-115G>A) et rs11039155 (-6G>A)
avec le risque de coronaropathie aiguë dans l’étude MONEUR.

rs12221497 (-115G>A) GG GA AA
p brut OR ajusté IC [95%] p ajusté
(n) (887) (251) (27)

Témoins 441 (76,0) 130 (22,4) 9 (1,6)

Coronaropathie 446 (76,2) 121 (20,7) 18 (3,1) 0,19 0,98 [0,74-1,29] 0,86
Infarctus du myocarde 265 (75,7) 77 (22,0) 8 (2,3) 0,72 0,95 [0,69-1,31] 0,76

rs11039155 (-6G>A) GG GA AA
p brut OR ajusté IC [95%] p ajusté
(897) (241) (21)
(n)

Témoins 437 (76,0) 125 (21,7) 13 (2,3)

Coronaropathie 460 (78,7) 116 (19,9) 8 (1,4) 0,36 0,87 [0,66-1,15] 0,33
Infarctus du myocarde 276 (78,9) 68 (19,4) 6 (1,7) 0,58 0,86 [0,62-1,19] 0,37
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n (%)
Les OR et valeurs p sont ajustés sur l’âge, le genre et l’IMC.
Les OR ont été calculés selon un modèle dominant (AA+GA versus GG).
tel-00426888, version 1 - 28 Oct 2009
 Résumé
Le concept de syndrome métabolique correspond à une association non fortuite chez
un individu d’une obésité abdominale, d’une insulinorésistance, d’une hyperglycémie, d’une
dyslipidémie et d’une pression artérielle élevée. Ce syndrome est associé à un risque accru
de diabète et de maladies cardiovasculaires. Le syndrome métabolique est un désordre
complexe et multifactoriel dont l’origine est due à l’interaction entre facteurs génétiques et
environnementaux. Dans le but d’identifier de nouveaux déterminants génétiques du
syndrome métabolique et des phénotypes associés, je me suis intéressée à la variabilité
génétique commune de plusieurs gènes candidats impliqués dans différentes voies
métaboliques. J’ai réalisé des études d’association entre des polymorphismes génétiques de
ces gènes et les phénotypes métaboliques dans différentes études de population (MONICA,
HELENA et HUNT 2).

D’abord, j’ai pu confirmer l’impact du polymorphisme rs9939609 du gène FTO (fat

mass and obesity-associated) sur le risque d’obésité, de diabète de type 2 et les phénotypes
associés (IMC, tour de taille, rapport tour de taille sur tour de hanche) et trouvé des
associations avec le taux d’insuline plasmatique, l’insulinorésistance et la pression artérielle
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systolique dans l’échantillon français MONICA (Legry et al, Metabolism, 2009).

Par ailleurs, je me suis intéressée aux gènes codant les récepteurs nucléaires LXRs
(liver X receptor) et j’ai montré que deux polymorphismes (situés dans l’intron 1 et le 5’UTR)
du gène codant LXRα étaient associés au taux plasmatique de HDL-cholestérol chez les
adolescents et les adultes, ainsi qu’au risque de syndrome métabolique chez les adultes
(Legry et al, Int J Obes (Lond), 2008). De plus, j’ai trouvé une association entre un
polymorphisme du gène codant LXRβ et le risque de diabète de type 2 et d’obésité. J’ai
réalisé des études in vitro de la fonctionnalité des polymorphismes des LXRs, pouvant
potentiellement moduler la régulation de l’expression des LXRs et de leurs gènes cibles. Je
n’ai pas détecté de différence significative entre les allèles des polymorphismes de LXRα du
niveau d’expression de LXRα et de certains de ses gènes cibles dans des cultures primaires
de macrophages humains. J’ai également réalisé des transfections cellulaires et des
expériences de retard sur gel pour voir si les polymorphismes de LXRα et de LXRβ
modulaient l’affinité de fixation de facteurs de transcription mais je n’ai pas détecté de
différence entre les allèles.

Enfin, j’ai étudié la variabilité génétique commune de trois gènes de la famille de

protéines plasmatiques ANGPTLs (angiopoietin-like proteins). J’ai montré qu’un
polymorphisme du gène ANGPTL3 est associé à une diminution des taux de HDL-
cholestérol et d’ApoA1 et qu’un polymorphisme du gène ANGPTL4 est associé à une
augmentation de l’adiposité, chez les adultes et les adolescents (Legry et al, J Clin
Endocrinol Metab, sous presse). En outre, deux polymorphismes du gène ANGPTL6
semblent être associés à la glycémie et l’insulinorésistance chez les adultes, mais ces
résultats sont à confirmer (Legry et al, Diabetes Metab, 2009).

En conclusion, ces résultats suggèrent un impact non négligeable de la variabilité

génétique des gènes codant FTO, les LXRs et les ANGPTLs dans la détermination du profil
glucido-lipidique et de la masse grasse ainsi que le risque d’obésité, de diabète de type 2 ou
de syndrome métabolique chez l’Homme.