Protocole technique Caenorhabditis elegans
Préparation du milieu de croissance
Matériel :
Réactifs
MgSO4
CaCl₂
KH2PO4
K2HPO4
Cholesterol
EtOH 99,9%
NaCl
Eau distillée sterile
Peptone
Agar
Consommables
Tube à vis
Papier essuie tout
Papier aluminium
Papier film/parafilm
Boite de pétri
Micropipette (100µl et 1000µl)
Cone stérile
Gant
Appareils
Balance de précision
PSM
Réfrigérateur
pH mètre
Autoclave
Méthodologie :
Préparation des réactifs
MgSO4 (1M)
Pour 50 ml : 6 g (Pour le x7 H2O=12.34 g)
CaCl₂ (1M)
Pour 50 ml : 7.35 g (Pour le x2 H2O)
Tampon potassium phosphate (1 M)
Pour 250 ml :
- KH2PO4: 2.7 g
- K2HPO4 : 8.9 g/Pour le K2HPO4 × 3H2O : 11.66 g
- Adjust le pH à 6
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Cholesterol (5 mg/mL)-dans 99.9% EtOH
Pour 25 mL: 125 mg
Preparation du NGM (Nematode Growth Media)
Pour 500 mL:
- NaCl: 1.5 g
- Peptone: 1.25
- Agar: 8.5 g
- Eau distillé: 486 mL
- Autoclavage
Après autoclavages:
Stabilisez le milieu à 58°C à l'aide d'un bain-marie.
Ajoutez,
- 500 µL Cholesterol
- 500 µL MgSO4 (1M)
- 500 µL CaCl2 (1M)
- 12.5 mL Tampon potassium phosphate (1 M)
Ajoutez 15 ml dans chacune des boîtes de Petri (plaques de 60 mm) en évitant les
bulles d'air et laissez la gélose se solidifier.
Emballez les boîtes avec du papier parafilm ou du film plastique, et stockez-les au
réfrigérateur.
Escherichia coli OP 50 : Culture et Préparation des Boites de
Caenorhabditis elegans
Matériel :
Milieu de cultures
NGM
Bouillon LB
Consommables
Papier essuie-tout
Papier film/parafilm
Pipette stérile de 10ml ou Seringue stérile de 10ml
Anse de platine stérile
Tube Falcon 10ml (stérile )
Micropipette (100µl)
Cone stérile
Gant
Matériel biologiques
Boite de Souches pure de E. coli OP50 sur milieu LB agar
Appareils
PSM
Etuve
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Réfrigérateur
Méthode :
Prélevez 5 à 10 ml de bouillon LB dans un tube Falcon stérile.
À l'aide d'une anse de platine stérile à usage unique, prélevez 2 à 3 colonies
de E. coli OP50 (provenant d'une culture pure et récente) et inoculez-les dans
le bouillon LB.
Mettez en culture à l'étuve à 37°C pendant 18 à 24 heures (le couvercle
légèrement ouvert et le tube légèrement incliné).
Prélevez 80 µl de la suspension de E. coli OP50 et déposez-les sur les boîtes
de NGM.
Laissez sécher, puis transférez les boîtes à l'étuve pendant 8 heures à 37°C.
Transférez ensuite à l'étuve à 16°C.
Transferts pour culture de Caenorhabditis elegans
Matériel :
Milieu de cultures
NGM + E. coli OP50
Consommables
Papier essuie-tout
Papier film/parafilm
Aiguille de Prélèvement Stérile
Gant
Appareils
PSM
Etuve
Microscope
Méthode :
Observer au microscope les vers sur les boîtes et identifier leur
emplacement. Étant donné que les vers ont un cycle de vie de 3 à 4 jours et
qu'ils ne pondent des œufs qu'au stade L4, nous allons privilégier et délimiter
l'emplacement où cette tranche de population est la plus représentée. Ainsi,
nous pourrons reconstituer plus rapidement une nouvelle population de vers.
À l'aide d'une aiguille de prélèvement stérile, découpez l'emplacement
délimité de la population cible de vers (manipulation à effectuer sous PSM) et
transférez-le sur une nouvelle boîte de NGM préalablement préparée (NGM +
E. coli OP50).
Scellez la boîte avec du papier film ou du parafilm et transférez-la à 16°C.
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Préparation du Tampon M9
Matériel :
Réactifs
MgSO4
Na2HPO4
KH2PO4
NaCl
Eau distillée
Consommables
Bouteille propre
Papier essuie tout
Papier aluminium
Erlenmeyers (500ml)
Gant
Appareils
Balance de précision
PSM
Réfrigérateur
Autoclave
Méthodologie :
Préparation pour 500ml :
Peser dans une bouteille propre d'un volume de 500 ml :
- KH2PO4 → 1,5 g
- Na2HPO4 × 2 H2O → 3,76 g
- NaCl → 2,5 g
Ajouter 450 ml d'eau distillée et stériliser le mélange à l'autoclave.
Ajouter après stérilisation (à la fin de la phase de refroidissement, sous PSM), 500 µl
de MgSO4 (1 M).
Test de Toxicité aiguë sur Caenorhabditis elegans
Matériel :
Milieu de cultures
NGM+ E. coli OP50
Réactifs
Tampon M9
Substance testé
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Consommables
Papier essuie-tout
Microplaque de 96puits
Anse de platine
Micropipette (100µl)
Cône stérile
Gant
Bec Bunsen*
Allumette
Papier film ou Parafilm
Matériel biologiques
Souches SS104 ou AU37 de C. elegans
Appareils
PSM
Etuve (25°C et 16°C)
Stéréo-microscope
Méthodologie :
- Transférez 25 à 30 vers de C. elegans au stade L3 et L4 sur des plaques de
NGM+E. coli OP50 (milieu de croissance).
- Mettez les vers en ponte en les incubant pendant environ 24 heures entre 16
et 20°C.
- Après 24 heures, lorsque vous remarquez suffisamment d'œufs sur la boîte,
retirez les adultes et laissez uniquement les œufs sur la plaque, puis
incubez-les entre 16 et 20°C pendant 24 heures.
- Après 24 heures, observez les vers et transférez-les à 25°C. Compte tenu de
leurs mutations, à 25°C, le gène muté s'exprime et les empêche de se
reproduire, pendant 24 heures.
- Incubez à 25°C et vérifiez chaque jour la viabilité des vers en les touchant
avec une anse de platine et en observant leurs mouvements au
stéréomicroscope.
Test d’activités antibactériennes sur Caenorhabditis elegans
Matériel :
Milieu de cultures
NGM+ E. coli OP50
TSB
TSA
LB agar et Bouillon
Bouillon MH
Milieux sélectifs pour la souches testés( Chapman pour S. aureus etc….)
Réactifs
Eau distillé stérile
MgSO4
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CaCl₂
KH2PO4
K2HPO4
Na2HPO4
Cholesterol
EtOH 99,9%
NaCl
Peptone
Agar
Contrôle Positif (Poudre d’antibiotique)
PBS
Consommables
Papier essuie-tout
Papier aluminium
Boite de pétri 60mm et 35mm
Anse de platine
Pipette de 10 et 50ml stérile
Poire aspirante ou dispenser
Micropipette (1000µl, 100µl)
Microplaque de 96puits
Cône stérile
Gant
Bec Bunsen*
Allumette
Papier film ou Parafilm
Tube eppendorf stérile
Tube à vis
Particules de carbure de silicium de 1,0 mm
Matériel biologiques
Souches AU37 de C. elegans
Appareils
PSM à flux horizontale
Hotte à Flux verticale
Etuve (25°C et 16°C)
Stéréo-microscope
Balance de précision
Réfrigérateur
pH mètre
Autoclave
Mini centrifugeuse
Agitateur (Agitateur Tridimensionnel) *
Lecteur de plaque
Vortex
Méthodologie :
Préparation NGM (Préparation du milieu de croissance, page 1)
Préparation Tampon M9 (Préparation du milieu de croissance, page 5)
Préparation NGM+ E. coli OP50 (Préparation du milieu de croissance, page 3)
Synchronisation des Vers
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- À l'aide d'une anse de platine, transférez 20 à 25 vers de C. elegans au
stade L3-L4 sur une nouvelle boîte de NGM+E. coli OP50 et incubez
pendant 24 heures entre 17 et 20°C.
- Brûlez les vers adultes et incubez pendant 48 heures entre 16 et 20°C.
- Transférer les boites à 25°C pendant 24h pour rendre stérile les vers adultes
de C. elegans AU37
Infection des vers
- Réalisez une suspension bactérienne pendant 18 heures en émulsionnant 1
ou 2 colonies dans du bouillon de TSA pour les Gram positifs ou LB pour les
Gram négatifs, puis incubez à 37°C.
- Diluez la suspension bactérienne pour obtenir une densité optique (OD) de
0,3 (environ 10^8 UFC/ml) et ajoutez 80 µl de celle-ci sur des boîtes de TSA
(préalablement préparées et coulées dans des boîtes de 35 mm), puis
laissez sécher.
- Transférez 25 vers adultes stériles sur chaque boîte et incubez à 25°C
pendant 6 heures.
Traitement des vers et évaluation de l’activité antimicrobienne
- Lavez deux fois les vers en les transférant dans des tubes Eppendorf
préalablement remplis avec 1 ml de tampon M9 et en les centrifugeant à
1500g pendant 1 minute.
- Après le deuxième lavage, ajoutez 200 µl/extrait ou substance testée par
Eppendorf et incubez pendant 18 heures.
- Lavez les vers deux fois dans 1 ml de M9 et resuspendez-les dans 200 µl de
M9 et 200 mg de particules de silicone dans chaque tube.
- Vortexez pendant 1 à 5 minutes pour écraser le corps des vers.
- À partir de chaque suspension, prélevez 10 µl et réalisez une dilution sérielle
de 10^-1 à 10^-7 dans une microplaque à 96 puits : pour cela,
- Remplissez 7 puits avec 90 µl de bouillon MH ou PBS.
- Ajoutez 10 µl de la suspension bactérienne dans le premier puits, puis
réalisez une dilution sérielle au 1:10 dans chaque puits jusqu'à 10^-7.
- Ensemencez chaque dilution sur un milieu de culture sélectif et incubez à
37°C.
- Procédez au dénombrement.
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Culture des cellules HepG2
Matériel :
Milieu de cultures
DMEM 4,5 G/L Glucose
FBS 10%
Consommables
Boite de culture cellulaire
Trypsine 0,125%
Pipettes
Bécher
Antibiotiques
Flacons T75
Gants
Appareils
PSM
Etuve
Microscope
Méthode :
- Placer immédiatement les cellules congelées dans un incubateur de stockage
d'azote liquide.
- Décongeler rapidement l'ampoule dans un bain-marie à 37o C.
- Transférer les cellules décongelées dans un flacon T75 avec 40 ml de milieu de
croissance chaud.
- Laisser les cellules se rétablir pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37oC,
5% CO2 dans un incubateur humidifié.
- Verser le milieu le lendemain, le remplacer par du milieu frais et le remettre dans
l'incubateur.
Maintenance des cellules HepG2
Matériel :
Milieu de cultures
DMEM 4,5 G/L Glucose
FBS 10%
Consommables
Boite de culture cellulaire
Trypsine 0,125%
Pipettes
Bécher
Antibiotiques
Flacons T75
Gants
Appareils
PSM
Etuve
Microscope
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Méthode :
- Propager les cellules jusqu'à ce que la densité atteigne 70-80% de confluence.
- Décanter le milieu.
- Laver les cellules avec du PBS 1X chaud.
- Ajouter 8 ml d'Accutase et remettre en incubateur pendant 10 à 15 minutes.
- Retirer immédiatement les cellules et les culotter à 500 xg pendant 5 minutes
- Laver les cellules 2 fois avec du PBS 1X.
- Remettre doucement en suspension le culot cellulaire dans un milieu chaud.
- Effectuer un fractionnement des cellules de 1:4 à 1:6 si nécessaire.
- Enregistrer chaque sous-culture comme un passage.
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