‫الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية‬

‫وزارة التعليم العالي و البحث العلمي‬

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE 8 MAI 1945-GUELMA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
et des Sciences de la Terre et de l’Univers
Département d’Ecologie et Génie de l’Environnement
Laboratoire de Biologie, Eau et Environnement

THESE :
Présentée en vue de l’obtention du diplôme de
Doctorat 3ème cycle en Sciences Biologiques
Option : Santé, Eau et Environnement
Thème

Mise en évidence des résidus d’antibiotiques

dans les denrées alimentaires d’origine animale
« cas du lait de vache »
Présentée par :
LAYADA Samiha
Devant le jury :
Président: M. HOUHAMDI Prof Université de Guelma
Directeur de thèse: D.E. BENOUARETH Prof Université de Guelma
Examinateur: Z. BRANES Prof Université d’Annaba
Examinateur: N. GRARA M.C.A Université de Guelma

Année Universitaire 2016/2017

 Dédicace

Au terme de ce parcours, je remercie enfin celles et ceux qui me sont chers et que j’ai quelque
peu délaissé ces derniers mois pour achever cette thèse. Leurs attentions et encouragements
m’ont accompagné tout au long de ces années. Je suis redevable à mes parents Dalila et
Boubakeur, pour leur soutien moral et matériel et leur confiance indéfectible dans mes choix.

Je dédie ce travail à ceux qui m'ont donné la volonté, pour réussir dans ma vie et mes études
A

Mes très chères sœurs : "Karima" ; Mounia ; Radia ; Selouma et Amoula.

A ma belle-sœur Imene

A
Mes très chers frères: Azou, Chokri, Amine et Ayoub.
A mon beau-frère : Marwan
Aux

Fleurs de ma vie: Ibtihel, Mayar, Iyed et Saja.

A
Mes beaux-parents, beaux-frères et belles-sœurs

À Mon Mari Salah Eddine Berramdane;

Cette thèse s’ajoute à toutes les aventures que nous avons déjà partagées et il y en aura
tellement d’autres ! C’est auprès de toi que je m’épanouis pleinement. Tu donnes tellement
aux personnes qui t’entourent: tu mérites que la vie ne te réserve que de bonnes surprises.
Enfin;

A tous ceux qui m'aiment

A tous ceux que j'aime.

Samiha
 Remerciements

La thèse de doctorat représente un travail s’inscrivant dans la durée, et pour

cette raison, constitue le fil conducteur d’une tranche de vie de son auteur,
parfois au crépuscule de la candeur étudiante, et souvent à l’aube de la maturité
scientifique. De nombreuses personnes se retrouvent ainsi de manière fortuite
ou non, pour le meilleur, entre le doctorant et son doctorat. Ce sont certaines de
ces personnes que j’aimerais mettre en avant dans ces remerciements.

Je remercie chaleureusement toutes les personnes qui m’ont aidé pendant

l’élaboration de ma thèse et notamment toute ma reconnaissance et ma
gratitude s’adresse au directeur de cette thèse, le Professeur Benouareth
Djamel Eddine pour sa patience, sa disponibilité et surtout ses judicieux
conseils.

Ainsi, je tiens à remercier Mr M. Houhamdi pour avoir accepté de présider le

Jury de ma thèse. Je remercie vivement Mr Z. Branes et Mme N. Grara de bien
vouloir accepter de juger mon travail.

Mes sincères remerciements et ma gratitude vont aussi au Dr Mirjana

Andjelkovic qui m’a accepté au sein de son service des résidus et contaminants
ISP WIV Bruxelles Belgique et m’a surveillé tout au long de la réalisation de la
partie des analyses UPLC-MS/MS.

Mes remerciements vont également au Dr Wim Coucke d’avoir accepté de me

réaliser toutes les analyses statistiques.

Ce travail n’aurait pas été possible sans le soutien de l’Université de Guelma,

qui m’a permis, grâce à une aide financière pour un stage, de me consacrer
sereinement à l’élaboration de ma thèse.
Je remercie infiniment DSM food specialties et spécialement Mr Joan Vinas
(Directeur de comptes lberia et Maghreb) qui m’a fourni les kits et l’incubateur
Delvotest SP-NT, ainsi que pour son soutien moral et ses conseils
professionnels.

Ce travail n’aurait pu être mené à bien sans la disponibilité et l’accueil

chaleureux que m’ont témoigné Mme Saliha, Mr Rachid et le vétérinaire Bilel
de la ferme Mekhancha, le personnel de cette ferme et celui de la ferme école,
Khari, Jean Yve et Tim et le personnel de l’ISP Bruxelles.

Je remercie également Mr HOUHAMDI Moussa, responsable du laboratoire de

Recherche de Biologie, Eau et Environnement pour son aide et serviabilité, je

remercie infiniment Mlle ABBAS Leila pour son extrême aide.

Merci à Mr Ksori Samir Chef département de l’écologie et génie de

l’environnement et à Mme KHALLEF Messaouda, pour leur aide et conseils
précieux durant la réalisation de ce travail.

Mr Adjabi Rabeh, Directeur de la CAAR que vous soyez assuré de mon entière
reconnaissance.

Mes plus vifs remerciements s’adressent aussi à mon oncle Mr Khelaifia

Mohammed Taher (Nacer) et tout le cadre professoral et administratif de
l’Université 8 Mai 45 de Guelma.

À mes Amies ;

Azouz Hanen, Tabet Mouna, Moumen Meryem, Bergal Amira, Abda Ahlem,
Bouganoun Imene et Mairif Sameh et les autres doctorants (promotion 2011).

Pour cette chance que j’ai eu que nos chemins se croisent, que nous partagions
tant de bons moments. Je vous souhaite plein de bonheur et qu’on se revoie le
plus souvent possible !
 Liste des tableaux

Tableau 01 Présentation de la méthode des 4 boîtes utilisée pour le contrôle 19

officiel
Tableau 02 La répartition des prélèvements provenant des fermes 26

Tableau 03 Les solvants utilisés pour la préparation des solutions standards 33

intermédiaires mixtes (5LMR)

Tableau 04 Solution stock et 5LMR des Sulfamides 34

Tableau 05 Solution stock et 5LMR des Pénicillines 35

Tableau 06 Solution stock et 5LMR des Macrolides 36

Tableau 07 Solution stock et 5LMR des Tétracyclines 37

Tableau 08 Solution stock et 5LMR des Quinolones 38

Tableau 09 Solution stock et de 5LMR des Standards internes 41

Tableau 10 Résumé de comparaison entre les protocoles des quatre méthodes 45

d’extraction

Tableau 11 Concentrations des solutions des standards d’antibiotiques 48

utilisées pour obtenir la courbe de calibration. (µg/L)

Tableau 12 Les paramètres de la spectrométrie de Masse utilisés pour la 50

détection des résidus d’antibiotiques dans le lait

Tableau 13 Programme du gradient d’élution 53

Tableau 14 Exemple de la fiche de renseignement de certains prélèvements 55
provenant des vaches traitées

Tableau 15 Les résultats de Delvotest obtenus pour les deux fermes et pour 57
chaque type de lait analysé

Tableau 16 Les résultats de Delvotest obtenus pour les échantillons collectés 58

des différents points de vente

Tableau 17 Comparaison entre les résultats des différents types de lait 59

analysés par Delvotest SP-NT

Tableau 18 Statistique de confirmation avec ANOVA 63

Tableau 19 Tous les paramètres utilisés pour la comparaison entre quatre 65

méthodes (M1, M2, M3 et M4) et la sélection finale de la
méthode choisie

Tableau 20 Limites Maximales des résidus (MRL*), CCβ et le nombre des 68

échantillons analysés pour chaque antibiotique utilisé pour la
validation de la méthode choisie

Tableau 21 Comparaison des résultats obtenus par LC-MS/MS entres les 70

différents types de lait analysés

Tableau 22 Nombre des échantillons de lait positifs par antibiotique analysé. 71

Tableau 23 Corrélation statistique entre les résultats du Delvotest SP-NT et 115

LC-MS/MS
Tableau 24 Comparaison des résultats obtenus par LC-MS/MS et Delvotest 116
SP-NT donnée par la fréquence des antibiotiques surreprésentés
 Liste des figures

Figure 01 Production laitière et fromagère algérienne 05

Figure 02 Principe du test d’acidification 18
Figure 03 Présentation de la zone d’étude 24
Figure 04 Delvotest ® -sp-nt 100 ampoules 27
Figure 05 Incubateur Delvotest 28
Figure 06 Interprétation des résultats Delvotest 28
Figure 07 Evaporateur sous flux d’azote 30
Figure 08 Colonne C18 réservée pour l’analyse des multi résidus 30
d’antibiotiques
Figure 09 Système Millipore pour production de l’eau milli-Q 31
Figure 10 UPLC couplée à la spectrométrie de masse 31
Figure 11 Exemples des résultats positifs (mauve), négatifs (jaune) et 58
douteux après analyse par Delvotest SP-NT
Figure 12 Exploration graphique de rendement (recovery) par méthode, tous 62
antibiotiques confondus
Figure 13 Elaboration graphique de rendement par méthode et antibiotique 63
Figure 14 Diagramme présentant une comparaison entre les quatre méthodes 67
pour les antibiotiques qui ont des rendements plus bas

Figure 15 Chromatogrammes –a, b, c, d, e, f, g, h, i, j- des résultats 83

obtenus de l’eau, de la solution 1LMR, du blanc réactif (BR),
témoin positif (T+), négatif (T-) et des échantillons trouvés
positifs pour l’amoxicilline représentant des pénicillines

Figure 16 Chromatogrammes –a, b, c, d, e- des résultats obtenus de l’eau, 88

de la solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+),
négatif (T-) et échantillons trouvés positifs pour triméthoprime
représentant des sulfamides
Figure 17 Chromatogrammes –a, b, c, d- des résultats obtenus de l’eau, de 93
la solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+),
négatif (T-) et échantillons trouvés positifs (E) pour tilmicosin
représentant des macrolides

Figure 18 Chromatogrammes –a, b, c, d, e, f, g- des résultats obtenus de 102

l’eau, de la solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin
positif (T+), négatif (T-) et échantillons trouvés positifs (E) pour
l’oxytetracycline représentant des tétracyclines

Figure 19 Chromatogrammes –a, b, c, d- des résultats obtenus de l’eau, de 106

la solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+),
négatif (T-) et échantillons trouvés positifs (E) pour
danofloxacine représentant des quinolones

Figure 20 Chromatogrammes –a, b, c- des résultats obtenus de l’eau, de la 110

solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+),
négatif (T-) et échantillons trouvés positifs (E) pour tylvalosine
représentant des macrolides qui ne possèdent pas de LMR

Figure 21 Chromatogrammes –a, b, c- des résultats obtenus de l’eau, de la 114

solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+),
négatif (T-) et échantillons trouvés positifs (E) pour
doxcycycline, acide oxolonique et tulatrhomycine représentant
des antibiotiques interdits

Figure 22 Estimation de la concentration des tétracyclines dans des 122

échantillons de lait conservés à 4°C (a) et 21°C (b) durant deux
périodes de temps (2 et7 jours).
Figure 23 Estimation de la concentration des pénicillines dans des 123
échantillons de lait conservés à 4°C (a) et 21°C (b) durant deux
périodes de temps
Figure 24 Estimation de la concentration des macrolides dans des 124
échantillons de lait conservés à 4°C (a) et 21°C (b) durant deux
périodes de temps (2 et7 jours).
Figure 25 Estimation de la concentration des quinolones dans des 125
échantillons de lait conservés à 4°C (a) et 21°C (b) durant deux
périodes de temps (2 et7 jours).
Figure 26 Estimation de la concentration des sulfamides dans des 126
échantillons de lait conservés à 4°C (a) et 21°C (b) durant deux
périodes de temps (2 et7 jours).
 Liste des abréviations

CEE: Communauté Economique Européenne.

pH : Potentiel d’hydrogène.

ppm : Partie par million.

CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance.

DES : Dose Sans Effet.

LMR : Limite Maximale de Résidus.

AMM : L'autorisation de mise sur le marché.

var : variation.

CIP : La Collection de l'Institut Pasteur.

UI : Unité Internationale.

ELISA: l’Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay.

R.I.A: Radio-Immuno-Assay.

ppb : Partie par billion.

UPLC : Chromatographie Liquide Ultra Performance.

°C : Le degré Celsius.

Ha : Hectare.

UPLC/MS-MS : Chromatographie Liquide Ultra Performance couplée à la Spectormétrie de

Masse en tandem.

MRM : Multiple Reaction Monitoring (suivi de transition multiples).

mM : milli Molaire.

M : Molaire.

EDTA : Ethylenediamine tetracetic acid dipotassium salt dehydrate.

v/v: volume/volume.

ISP: Institut Scientifique de Santé Publique.

UHT : Ultra Haute Température.

CCβ : La capacité de détection.

S/N : signal to noise ou signal/bruit.

RRT : Le temps de rétention relatif.

ES : Electrospray.

IM : Injection intramusculaire.

MRPL : la limite minimale requise de performance.

LOD : niveau de détection.

 Sommaire
Introduction 1

Partie bibliographique

Chapitre I : Généralités sur la filière laitière en Algérie

1. Le lait et ses dérivées 4
2. Importance de la consommation du lait en Algérie 5
3. Production laitière en Algérie 6
Chapitre II : Généralités sur les résidus d’antibiotiques
1. Définition des résidus d’antibiotiques 7
2. Origine des résidus d’antibiotiques 7
2.1. Utilisation des antibiotiques à titre thérapeutique curatif ou en 7
antibio-prévention
2.2. Utilisation en méthaphylaxie 8
2.3. Utilisation des antibiotiques comme additifs alimentaires 8
3. Pharmacocinétique et résidus 8
3.1. Modélisation de la phase d’élimination: Exemple du passage dans le 9
lait
3.2. Facteurs de variation des paramètres pharmacocinétiques 9
3.2.1. L’antibiotique 9
3.2.2. Facteurs liés au mode et à la voie d’administration 10
3.2.3. Facteurs liés à l’animal 10
4. Les dangers liés à la présence des résidus d’antibiotiques dans les 12
denrées alimentaires d’origine animale
4.1. Toxicité directe des résidus d’antibiotiques 12
4.2. Risques allergiques 13
4.3. Risques cancérigènes 13
4.4. Risques liés à la modification de la flore digestive par les résidus 14
d’antibiotiques
4.5. Risques de développement et dissémination de résistance bactérienne 14
aux antibiotiques
4.6. Les problèmes liés à la transformation du lait 15
5. La réglementation autour des résidus d’antibiotiques 16
5.1. Mise en place des limites maximales des résidus LMR 17
5.2. Le délai d’attente 17
6. Les méthodes de recherches des résidus d’antibiotiques 17
6.1. Les méthodes microbiologiques 18
6.1.1. Test d’acidification 18
6.1.2. Méthode de diffusion sur gélose 19
6.1.3. Méthode des 4 boites 19
6.2. Les méthodes physico-chimiques 20
6.2.1. Méthodes enzymatiques 20
6.2.2. Méthodes immunologiques 20
6.2.3. Capteurs biologiques 21
6.2.4. Méthodes chromatographiques 21
 Partie expérimentale
Chapitre III : Matériel et méthodes

I. Cadre et période de l’étude 22

II. Échantillonnage 25
III. Matériel et Méthodes d’analyse 27
1. Analyse avec un test d’inhibition microbiologique Delvotest ® -SP-NT 27
1.1. Echantillons 27
1.2. Matériel utilisé 27
1.3. Protocole d’analyse 28
2. Analyse par Chromatographie Liquide à Ultra Performance couplée 29
avec Spectrométrie de Masse (UPLC/MS-MS)
2.1. Matériel utilisé 29
2.2. Principe de la méthode 32
2.3. Protocole d’analyse 32
2.3.1. Préparation des solutions standards d’antibiotiques 32
A. Solutions stocks (C1) 33
B. Solutions standard intermédiaires mixtes (5 LMR) 33
C. Solutions standards intermédiaires mixtes (1 LMR) 40
D. Solutions stocks des standards internes (roxythromycine, 40
norfloxacine-D5, sulfadimidine C13, déméclocycline, flucloxacilline) à
une concentration de 1mg/ml
2.3.2. Préparations des réactifs 42
2.3.3. Optimisation et validation de la méthode d’extraction 43
[Link]. Optimisation de la méthode d’extraction 43
[Link]. Validation de la méthode d’extraction 47
2.3.4. Extraction des échantillons de lait à analyser 49
2.3.5. Le dosage par UPLC/MS-MS 49
2.3.6. L’évaluation de la stabilité des antibiotiques dans le lait 53
3. L’analyse Statistique 54

Chapitre IV : Résultats et discussion

1.Résultats des questionnaires utilisés pour la collecte des données auprès 55

des fermes et points de ventes
2. Résultats de l’analyse de résidus d’antibiotiques par test d’inhibition 57
microbiologique Delvotest SP-NT
2.1. Résultats des échantillons collectés des deux Fermes A et B 57
2.2. Résultats des échantillons collectés à partir des points de vente 57
3. Résultats de l’analyse multi-résidus d’antibiotiques dans le lait par 62
UPLC-MS/MS
3.1. Résultats de l’optimisation et validation de la méthode d’extraction 62
3.1.1. Optimisation de la méthode d’extraction 62
3.1.2. Validation de la méthode d’extraction 67
3.2 Résultats de l’analyse des échantillons de lait collectés par UPLC- 70
MS/MS
4. Corrélation entre les résultats de l’UPLCMS/MS et ceux du Delvotest 115
SP-NT et présence d’antibiotiques spécifiques
5.Résultats de la stabilité des antibiotiques dans le lait pendant 120
conservation
Conclusion 129
Références bibliographiques
Annexes
Résumés
Introduction
 INTRODUCTION

Introduction
Les antibiotiques ont une place importante dans l’élevage moderne d’aujourd’hui. Leur
utilisation pour protéger la santé de l’animal et perfectionner sa production (Jank et al., 2015),
conduit à leur présence sous forme de résidus dans les denrées alimentaires spécialement le
lait. Il convient donc de s’interroger sur les risques qu’encourent les consommateurs vis-à-vis
de cette présence qui peut conduire à un développement des réactions allergiques chez
certains individus hypersensibles, à l’émergence de la résistance bactérienne, à la perturbation
dans la composition de la flore digestive, à l’augmentation du risque de la carcinogénicité
jusqu’à la toxicité aigüe pouvant causer la mort (cas du chloramphénicol) (Petrović et al.,
2008 ; Hou et al., 2014 ; Wang et al., 2006 ; Borràs et al., 2011). Peu après l’introduction des
antibiotiques dans le traitement de la mammite bovine, l’industrie laitière se heurta à des
difficultés techniques, surtout dans la fabrication des fromages affinés à pâte dure. Ces
difficultés provenaient de l’action inhibitrice des antibiotiques présents à faible concentration
sur le développement de la culture initiale (Petrović et al., 2008 ; Stead et al., 2008). Cette
présence suscite toujours de nombreuses interrogations bien que des décisions telles que les
Limites Maximales des Résidus aient conduites à la réduction de l’utilisation des antibiotiques
(Kassaify et al., 2013), notamment avec l’interdiction récente de presque tous les additifs
antibiotiques alimentaires facteurs de croissance pour rassurer la sécurité du consommateur et
pour empêcher leur présence dans les denrées alimentaires d’origine animale (Council
regulation, 2003).

Parallèlement, le lait est un aliment complet dont l’intérêt nutritionnel est incontestable chez
le jeune en croissance et chez l’adulte. Cette denrée, largement consommée, occupe une place
prépondérante dans la ration alimentaire (Boultif, 2015). Par conséquent, la présence des
résidus d’antibiotiques dans un lait destiné à une consommation directe ou une transformation
doit être contrôlée. Maintenant, il existe plusieurs techniques qui peuvent être utilisées pour
l’analyser. Les tests microbiologiques et immunologiques sont largement utilisés à cause de
leur faible cout (Ramirez et al., 2003; Beltran et al., 2015), le Delvotest SP-NT comme la
plupart des méthodes microbiologiques de détection ont été développés initialement pour la
recherche des β-lactames dans le lait de vache. Ces tests sont basés sur l’inhibition de la
souche Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis à cause de sa sensibilité à plusieurs
antibiotiques (Beltran et al., 2015). Tandis qu’une confirmation à l’aide des techniques plus
sensibles et sélectives est recommandée. Actuellement, la chromatographie liquide couplée à
la spectrométrie de masse (UPLC-MS/MS) est la méthode d’analyse la plus utilisée à cause de

1
 INTRODUCTION

sa sensibilité et sa sélectivité élevées pour la détection de plusieurs résidus d’antibiotiques

dans les denrées alimentaires (Martins et al., 2014). Plusieurs recherches sont dirigées vers
l’analyse de différentes classes de résidus d’antibiotiques dans le lait, en utilisant la LC-
MS/MS (Han et al., 2015 ; Meng et al., 2015). Cependant, l’emploi de cette dernière pour ce
type de détection dans une seul matrice est tellement exigeant de produits et donc de l’argent.
Pour cette raison, l’optimisation d’une méthode qui puissent détecter plusieurs résidus
d’antibiotiques dans différentes matrices quelques soient viande, lait ou autres est une
thématique de recherche d’actualité.

On assiste aujourd’hui à une utilisation irrationnelle et de manière totalement abusive et

anarchique des antibiotiques en pratique rurale en Algérie. Le contrôle des résidus
d’antibiotique n’étant pas réglementé. A ce jour, notre pays ne possède pas de limite
maximale de résidus dans le lait, et autres produits issus des animaux, propres aux
antibiotiques utilisés. De ce fait aucun contrôle officiel n’est fait ni au niveau des fermes, ni
sur les tanks après la collecte (Boultif, 2015). Par conséquent, quelques efforts de recherches
individuels de Tarzaali et al., (2008), Aggad et al., (2009) et Titouche et al., (2013) en
utilisant des méthodes microbiologiques moins spécifiques ont été menés sur le potentiel de la
présence des résidus d’antibiotiques dans des échantillons de lait de vache cru.

Cette étude a été menée en raison de l’absence quasi-totale des données sur ce sujet en
Algérie. L’objet principal de cette étude est :

L’évaluation des niveaux de contamination en résidus d’antibiotiques non seulement dans des
échantillons de lait collectés directement dans des fermes mais aussi de poursuivre le contrôle
dans des échantillons destinés à la consommation directe collectés à partir des différents
points de ventes.
Deux types de lait seront analysés cru et lben afin de rechercher si les résidus d’antibiotiques
persistent et peuvent être détecté dans ces échantillons après la production.

Une enquête auprès des praticiens des vétérinaires des fermes sur les antibiotiques les plus
utilisés dans le traitement des bovins et leurs délais d’attente, ainsi qu’auprès des vendeurs
privés de lait (points de vente) sur les origines de lait vendu aux consommateurs seront
effectuées afin de cibler le et/ou les antibiotiques à rechercher. La détection des résidus
d’antibiotiques dans les échantillons de lait collectés sera effectuée par l’utilisation de deux

2
 INTRODUCTION

méthodes. Nous commençons par une détection avec un test microbiologique d’inhibition
Delvotest SP-NT. Ensuite une méthode de l’UPLC-MS/MS sera utilisée. Cette dernière sera
tout d’abord optimisée et validée pour l’extraction et la purification des antibiotiques dans le
lait selon des normes internationaux. Ensuite tous les échantillons collectés incluant ceux
analysés par Delvotest SP-NT seront analysées. Les résultats obtenus par les deux méthodes
seront comparer et corréler afin d’évaluer la fiabilité de l’utilisation de Delvotest SP-NT dans
les conditions Algérienne.

Une partie bibliographique sera présentée dans deux chapitres, le premier résume des
généralités sur la filière laitière en Algérie et le second sera réservé aux généralités sur les
résidus d’antibiotiques en présentant des notions, les risques liés à leur présence dans
l’alimentation et les méthodes consacrées à leur détection.

3
Partie bibliographique
Chapitre I : Généralités sur la
filière laitière en Algérie
Chapitre I Généralités sur la filière laitière en Algérie

1. Le lait et ses dérivées

Le lait est le produit de sécrétion des glandes mammaires des mammifères comme la vache, la
chèvre et la brebis, destiné à l’alimentation du jeun animal naissant. Du point de vue
physicochimique, le lait est un produit très complexe (Amiot et al., 2002). Un liquide
biologique complexe qui contient un ensemble d’éléments nutritifs (glucides, lipides,
protéines, vitamines, minéraux) et de constituants du système immunitaire nécessaires à la
croissance rapide et à la protection du jeune mammifère durant les premières semaines ou les
premiers mois de sa vie. Il est élaboré par la femelle en lactation à partir de matériaux qu’elle
synthétise ou qu’elle prélève dans les divers pools et réserves corporels. L’étape clé est la
phase d’exportation de ces matériaux. Si la régulation des synthèses et le franchissement de la
membrane biologique ultime de la cellule sécrétrice par les différents composants conduisent
à l’assemblage d’un produit de composition et de nature bien particuliers, cette « sortie » n’est
pas très discriminante, et de nombreuses autres molécules, y compris des peptides et des
protéines de poids moléculaire relativement élevé, peuvent être exportées simultanément. De
ce fait, le lait se retrouve être le vecteur de nombre de métabolites endogènes de l’organisme
maternel (hormones stéroïdiennes, peptidiques et protéiques par exemple), mais également de
substances étrangères non nutritionnelles (xénobiotiques) introduites par l’alimentation ou
résultant de traitements thérapeutiques directs (médicaments) (Merad et Merad, 2001).

Cependant, ce produit est consommé à son état cru ou transformé dont l’Algérie présente une
tradition des produits laitiers bien établie. Le raïb fait partie de ces produits fermentés
populaires en Algérie (Belhadia et al., 2011; Zoubeidi et Gharabi, 2013), il est fabriqué à
partir du lait cru de vache ou de chèvre. La fermentation est effectuée à une façon spontanée
et le produit résultant « raib » pourrait être une source précieuse des bactéries lactiques
autochtones (Mechai et Kirane, 2008). En ce cas le raib s’agit d’un lait fermenté entier
contrairement au lben qui est à son tour le résultat de barattage du raib pendant 30 à 40 min
(figure 1). A la fin du barattage, on ajoute généralement un certain volume d'eau (environ
10% du volume du lait), chaude ou froide, suivant la température ambiante de façon à
ramener la température de l'ensemble à un niveau convenable au rassemblement des grains de
beurre (Benkerroum et Tamime, 2004 ; Ouadghiri, 2009a).

4
Chapitre I Généralités sur la filière laitière en Algérie

Figure 1: Production laitière et fromagère Algérienne (Claps et Morone, 2011).

2. Importance de la consommation du lait en Algérie

Le lait et ses dérivés représentent environ 14% des dépenses agroalimentaires par foyer. Cette
demande est tirée par la croissance démographique estimée à 1.6% par an, l’urbanisation qui
est estimée à plus de 5% par an et s’ajoutant à cela l’amélioration du pouvoir d’achat (4% à
7% par an). Une enquête menée sur les ménages algériens fait ressortir que la catégorie de
produits « lait et produits laitiers » occupe la quatrième position avec (7.5%) du total des
dépenses de ces ménages, après les céréales (24.6%), viande rouge (18.4%) et légumes et
fruits frais (13.7%) (Bouazouni, 2008). En effet, l’Algérie est le premier consommateur laitier
du Maghreb et le second pays au monde importateur de lait et de ses dérivés avec un marché
annuel estimé, en 2004, à 1,7 milliard de litres (Boultif, 2015), plus de trois milliards de litres
en 2007 (Griffoul, 2007 ; Boultif, 2015) et une consommation moyenne de l’ordre de 115L
par habitant et par an en 2010 (Ghazi et Niar, 2011).
La production locale est évaluée à un peu moins de deux milliards de litres (Boultif, 2015),
l'Algérie est donc contrainte d'importer des quantités massives de lait, dont la plus grande
partie sous forme de lait de poudre qui coûte de plus en plus cher (Griffoul, 2007). Le manque
est donc énorme; ainsi, le pays a adopté une politique d’importation des vaches laitières, mais
celles-ci ne parviennent pas à donner les résultats escomptés (Ghazi et Niar, 2011).

5
Chapitre I Généralités sur la filière laitière en Algérie

3. Production laitière en Algérie

On appelle filière un système économique qui consiste en un réseau de distribution et

d’approvisionnement utilisé par tous les producteurs d’un même produit ou type de produits,
en concurrence sur un marché de consommation (Lagrange, 1989). Elle vise à valoriser le
potentiel d’une matière première fournie par l’agriculture en les transformant en produits finis
à forte valeur ajoutée (Adrian et al., 1995 ; Cazet, 2007). Actuellement, la filière lait en
Algérie se trouve dans une phase critique, face à une production locale qui ne dépasse pas les
2.3 milliards de litres (Kabir, 2015), aggravée par un taux de collecte très faible et une
augmentation des prix de la matière première sur les marchés internationaux (Kacimi, 2013).
Par conséquent, cette production est très faiblement intégrée dans l’industrie laitière locale
(Bencharif, 2001). En Algérie, la filière s’articule autour de trois maillons principaux :

- En amont, une grande diversité d’élevages bovins,

- les organismes de collecte et de transformation à la fois étatiques et privés,
- les systèmes de mise en marché et les consommateurs.

L’émergence en amont d’un élevage laitier en mesure d’assurer les approvisionnements

nécessaires conséquents en lait, représente la principale condition pour le développement de
cette filière (Cherfaoui. 2003 ; Belhadia et al., 2009).

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Chapitre II : Généralités sur les
résidus d’antibiotiques
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

1. Définition des résidus d’antibiotiques

Le médicament est d’une importance capitale en pratique vétérinaire. Son utilisation a pour
but de sécuriser les productions et d’extérioriser au mieux les potentialités animales. De ce
fait, l’emploi des médicaments vétérinaires chez les animaux de rente occupe une place
importante dans la production laitière. Ces médicaments qui sont utilisés en vue de garantir
l’état sanitaire des animaux ou d’améliorer leurs productions se retrouvent de façon courante
dans les denrées destinées aux consommateurs sous forme de résidus lorsque le délai d’attente
n’est pas respecté (Talnan, 2013). Selon la directive Européenne (Directive 81/851/CEE,
1981), les résidus sont définis comme étant: « Tous les principes actifs ou leurs métabolites
qui subsistent dans les viandes ou autres denrées alimentaires provenant de l’animal auquel le
médicament en question a été administré». Tandis que, le règlement 2377/90/CEE modifie
légèrement cette définition en la complétant : « Les résidus sont définis comme toute
substance pharmacologiquement active, qu’il s’agisse de principes actifs, d’excipients ou de
métabolites présents dans les liquides et tissus des animaux après l’administration de
médicaments et susceptibles d’être retrouvés dans les denrées alimentaires produites par ces
animaux » (Stoltz, 2008).

2. Origine des résidus d’antibiotiques

Les antibiotiques sont utilisés de quatre façons différentes chez les animaux de production et
avec des objectifs différents.

2.1. Utilisation des antibiotiques à titre thérapeutique curatif ou en antibio-prévention

Les antibiotiques peuvent être utilisés à titre thérapeutique curatif dont l’objectif est d’obtenir
la guérison des animaux cliniquement malades et d’éviter la mortalité. Ainsi, ils peuvent être
administrés à des périodes critiques de la vie, sur des animaux soumis à une pression de
contamination régulière et bien connue. Dans ces conditions, on parle d’antibio-prévention car
le traitement permet d’éviter totalement l’expression clinique. Cette modalité d’utilisation des
antibiotiques est adaptée à une situation sanitaire donnée et doit être provisoire et ponctuelle.
L’antibio-prophylaxie est également utilisée lors d’opérations chirurgicales pour prévenir les
infections bactériennes (Stoltz, 2008).

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Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

2.2. Utilisation en métaphylaxie

Lorsqu'une infection collective et très contagieuse se déclare dans un élevage avec de grands
effectifs et évolue sur un mode aigu, avec suffisamment d'éléments concordants pour
incriminer une (des) bactérie(s), l’ensemble du groupe d’animaux est traité. Les sujets qui
sont exposés mais ne présentent pas encore de signes cliniques (sains ou en incubation) font
donc l’objet d’un traitement en même temps que ceux qui sont déjà malades. Cette pratique
est qualifiée de métaphylaxie (Maillard, 2002).

2.3. Utilisation des antibiotiques comme additifs alimentaires

Les antibiotiques sont utilisés comme facteurs de croissance afin d'améliorer la productivité
des élevages (Bories et Louisot, 1998 ; Sanders, 2005 ; Jank et al., 2015). Dans son avis du 28
mai 1999, le comité scientifique directeur de la direction générale de la commission
européenne, a déclaré que l’utilisation en tant que facteurs de croissance d’antimicrobiens
appartenant aux catégories utilisées en médecine humaine et animale, ou susceptibles de l’être
devrait être réduite le plus vite possible et à terme proscrite. Dans un deuxième avis, adopté
en mai 2001, ce comité directeur soulignait que ce processus d’élimination devait être planifié
et coordonné. Le règlement n° 1831/2003 du 22/11/2003 de la commission européenne
prévoyait la suppression définitive de l’usage des antibiotiques comme additifs en
alimentation animale à la fin de l’année 2005 et c’est en 2006 que l’usage d’antibiotiques en
tant qu’additifs en vue d’améliorer la croissance et les performances des animaux était banni
dans l’union européenne (Guillemot, 2006).

3. Pharmacocinétique et résidus

Le médicament se déplace pour aller agir dans l’organisme au niveau de sa cible. Il y parcourt
un chemin qui le mènera dans différents compartiments. Il pénètre dans l’organisme par la
voie d’administration, après absorption, la substance active se trouve dans le compartiment de
transport qui est le sang. Il peut aller agir au niveau d’une cible ou bien enjoindre le
compartiment de stockage (les graisses). Tout au long de sa présence dans l’organisme, il sera
régulièrement métabolisé, puis enfin il sera éliminé (Stora, 2005).

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Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

3.1. Modélisation de la phase d’élimination : Exemple du passage dans le lait

Les mécanismes de passage du sang vers le lait correspondent à la traversée de l’épithélium

de la glande mammaire qui comporte comme une membrane lipoprotéique séparant le sang
pH 7,4 du lait pH 6,6. Après administration parentérale, les substances à caractères base faible
diffusent plus facilement dans le lait que les substances acides faibles, qui ont tendance à se
localiser dans le plasma. La taille moléculaire intervient, également et les composés de poids
moléculaire inférieur à 800 - 1000 Dalton diffusent mieux que les autres. Ainsi, les substances
qui passent dans le lait en proportion importante sont celles qui ont une fixation tissulaire
prépondérante et un caractère de base faible: Tétracycline, macrolide. Les substances
lipophiles diffusent également bien dans le lait et restent fixées sur les lipides du lait (Stoltz,
2008).

3.2. Facteurs de variation des paramètres pharmacocinétiques

Il existe trois principaux types de facteurs pouvant modifier les paramètres

pharmacocinétiques d’un médicament antibiotique. On trouve, des facteurs liés au
médicament, au mode et à la voie d’administration et à l’animal.

3.2.1. L’antibiotique

A. La forme galénique de l’antibiotique (c'est-à-dire de la formule: excipients…etc)

influe fortement sur son devenir dans l’organisme.

B. La forme chimique exacte du composé intervient dans son absorption et sa

distribution : Les sels les plus couramment utilisés sont plus hydrosolubles que les
composés parentaux dont ils dérivent. La mise en suspension huileuse ralentit
l’absorption: la pénicilline sodique ou potassique mise en suspension huileuse présente
une résorption prolongée à partir du site d’injection intramusculaire pendant environ
18 heures. Sous forme de pénicilline procaïne, la même pénicilline en suspension
huileuse présente une résorption prolongée sur 24 heures au minimum (Enriquez et
Boulouis, 1990). Les esters sont en générale lipophile. C’est le cas par exemple des
esters de macrolides (Triacétyl d’oléandomycine).

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Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

C. La forme physique et les excipients jouent un rôle dans la diffusion du ou des

principes actifs. De nombreux constituants utilisés dans les spécialités
pharmaceutiques, interviennent dans la diffusion (Fiscus-mougel, 1993).

3.2.2. Facteurs liés au mode et à la voie d’administration

a. Administration intraveineuse correspond à l’introduction du médicament directement

dans la circulation sanguine. Il n’y a donc pas de phase d’absorption et la phase de
distribution commence immédiatement.
b. Administration intramusculaire et sous-cutanée se distinguent surtout par la distance à
franchir avant d’atteindre la circulation sanguine. En général, la résorption est plus rapide
après une injection intramusculaire. Cependant, la vitesse de résorption peut être augmentée
ou diminuée par la forme galénique (formulation longue action ou retard).
c. Administration orale est assez complexe car de multiples facteurs interviennent comme
les particularités du système gastro-intestinal dans les différentes espèces, la présence
d’aliments ou encore la maturité du système digestif.
d. Administration intramammaire est une voie couramment utilisée chez les vaches
laitières. L’absorption est ici fortement modulée par l’état de la glande mammaire elle-même,
notamment en cas d’infection.

3.2.3. Facteurs liés à l’animal

Les facteurs liés à l’animal correspondent essentiellement à son espèce mais également à l’âge
ou à l’état physiologique.

A. l’espèce animale

Pour un médicament donné, ses paramètres pharmacocinétiques peuvent varier en fonction de

l’espèce à laquelle il est administré. Des variations peuvent avoir lieu entre animaux d’une
même catégorie (entre bovins, ovins et caprins, qui sont tous trois des ruminants) mais surtout
entre animaux de classe différente (entre mammifères et oiseaux) (Enriquez et Boulouis,
1990).

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Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

B. l’âge de l’animal

Un animal jeune ou âgé présente des capacités de détoxication hépatique et d’élimination

moins importantes qu’un adulte. Ceci peut influer sur les cinétiques de métabolisation et
d’élimination et donc sur la qualité de résidus présents dans les tissus, résidus qui mettront
alors plus de temps à être éliminés.

C. l’état pathologique de l’animal

La variation des paramètres pharmacocinétiques d’un antibiotique peut être affectée par la
présence de différentes infections dont la plus courante est la mammite. L’acquisition d’une
infection mammaire chez les vaches laitières provoque une perturbation de fonctionnement de
la glande et par conséquent la composition du lait produit. Ces perturbations résultent de
l’infection elle-même, avec la présence de bactéries pathogènes dans le quartier infecté de la
mamelle, mais aussi bien de la réaction inflammatoire que cette infection déclenche (Le
Minor, 1982 ; Stoltz, 2008). Dans la glande mammaire, ce processus pathologique se traduit
par différentes lésions et modifications des tissus :

 Une altération et une destruction des cellules de l’épithélium sécrétoire. Ces lésions
sont dues à l’action des bactéries pathogènes et au passage de nombreux leucocytes dans le
lait à travers cet épithélium. La barrière sécrétoire que constitue cet épithélium entre le sang et
le lait, est rompue.
 Une augmentation de la perméabilité vasculaire et tissulaire associée à tous les états
inflammatoires.

Ces lésions conduisent à un passage grave dans le lait d’éléments provenant du sang ou même
le passage du sang (Le Minor, 1982). Après une injection parentérale, pour certains
antibiotiques comme la pénicilline, les résidus persistent plus longtemps dans le lait de vache
atteinte de mammites. Pour d’autres antibiotiques, il n’y a pas de différence observée dans la
cinétique d’élimination des résidus entre une vache saine et une vache atteinte de mammite.
Après administration intra-mammaire dans le trayon du quartier infecté, il peut y avoir
passage partiel de l’antibiotique dans les quartiers non traités (Burgat-Sacaze et Petit, 1983).

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Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

4. Les dangers liés à la présence des résidus d’antibiotiques dans les denrées
alimentaires d’origine animale

Une portion non négligeable des produits laitiers retrouvés sur le marché, tels les yogourts et
les fromages, sont préparés par fermentation du lait à l’aide de bactéries lactiques. Les
caractéristiques texturales et organoleptiques de ces produits sont directement liées au degrè
de croissance de ces bactéries dans le lait de départ. Occasionellement, et à cause de la
présence des antibiotiques, certains laits sont jugés impropre à la consommation et à la
transformation en produits fermentés (Barbut et Petit, 2007). Les risques pour le
consommateur et la Santé Publique liés à cette présence de résidus dans les denrées
alimentaires sont (Reig et Toldra, 2008) :

- risque de toxicité directe,

- risque allergique,
- risque cancérigène,
- risque de pathologie liée à la modification de la flore digestive,
- risque d’apparition, de sélection et de dissémination de résistances bactériennes aux
antibiotiques au sein des populations humaines et animales.

La présence de résidus d’antibiotiques dans les denrées alimentaires, et notamment le lait,

pose également un problème à l’Industrie agroalimentaire pour la fabrication de produits
fermentés. Les résidus d’antibiotiques sont alors appelés « inhibiteurs ». Ainsi, la notion
d’inhibiteur correspond à un problème technologique et la notion de résidu correspond à un
problème de santé publique (Fabre et al., 2002).

4.1. Toxicité directe des résidus d’antibiotiques

Les antibiotiques sont des médicaments antibactériens d'origine naturelle, produits à partir des
champignons ou des bactéries ou obtenus par synthèse ou semi-synthèse. Ils ont en principe
une toxicité sélective, c'est-à-dire qu'ils sont toxiques pour les bactéries mais non pour
l'organisme; ce qui malheureusement n'est pas toujours vrai. Comme pour tout médicament
actif, les antibiotiques sont susceptibles de provoquer des accidents plus ou moins importants.
Il faut cependant signaler que du fait de leur mode d'administration qui se fait souvent par
voie générale, les antibiotiques constituent une classe relativement peu toxique. Ces effets
indésirables, même s'ils sont relativement peu fréquents et rarement graves doivent dans tous

12
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

les cas faire l'objet d'une déclaration au niveau des centres de pharmacovigilance (Clive et al.,
1999).

4.2. Risques allergiques

Les antibiotiques, particulièrement les dérivés B- lactames et leurs produits de dégradation,

sont bien connus pour provoquer des réactions allergiques. Les patients ayant des antécédents
d’allergie atopique paraissent particulièrement susceptibles de développer ces réactions. Les
sulfamides, le triméthoprime, la nitrofurantoine et l’érythromycine ont aussi été associés à des
réactions d’hypersensibilité, particulièrement des rashs (Chambers et Sande, 1998). Il est
important de savoir que le potentiel allergénique de certains résidus d’antibiotiques n’est pas
nécessairement identique à celui de la molécule parentale. Par exemple, pour les pénicillines,
le déterminant majeur est le groupement benzylpenicilloyl, qui est à 95% le produit
métabolique majeur des biotransformations de la pénicilline, mais d’autres dérivés peuvent
être mis en cause tels les acides pénicilloïque, pénicillénique, pénalmaldique, pénicillényls ou
pénicillamines. Ce dernier étant classiquement considéré comme responsable du plus grand
nombre de chocs anaphylactiques (Demoly et al., 2000). Ces divers composés ne sont
immunogènes qu’après fixation covalente sur une protéine, in vivo chez l’individu. Ces
complexes immunogènes peuvent également exister dans l’organisme de l’animal et peuvent
ne pas être dosés en tant que résidus car ils correspondent à des résidus non-extractibles ou
résidus liés. En conclusion, on peut dire que le rôle sensibilisant des résidus d’antibiotiques,
c’est à- dire leur allergénicité, ne semble pas représenter un danger pour la Santé Publique.
Par contre, leur rôle déclenchant, c’est-à-dire leur immunogénicité, peut entraîner des
accidents chez des individus extrêmement sensibles (Petrovic et al., 2008 ; Stoltz, 2008 ; Hou
et al., 2014). Cependant, les cas certains d’allergie, directement liés à la présence de résidus
d’antibiotiques dans des denrées d’origine animale sont extrêmement rares (Stoltz, 2008).

4.3. Risques cancérigènes

Certains antibiotiques ont des propriétés carcinogènes connues. Les résidus de ces
antibiotiques peuvent avoir un effet carcinogène sur le long terme (Petrovic et al., 2008 ; Hou
et al., 2014), suite à une consommation régulière d’aliments contenant ces résidus. Ces
antibiotiques ou composés utilisés comme antibiotiques sont alors interdits d’utilisation chez
les animaux de production.

13
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

4.4. Risques liés à la modification de la flore digestive par les résidus d’antibiotiques

Notre tube digestif contient des bactéries dites entérobactéries avec lesquelles nous cohabitons
toute notre vie. Leur fonction principale est de nous protéger en permanence contre les
toxines, les microbes, les virus et les germes pathogènes nocifs présents dans l’environnement
mais également dans nos aliments. L’activité des antibiotiques peut provoquer la mort de
certaines bactéries ou diminuer leur aptitude à proliférer dans l’intestin. L’atteinte de certaines
populations bactériennes qui font partie de la flore normale entraine le développement
d’autres populations pouvant être pathogènes ou opportunistes (Wang et al., 2006 ; Borràs et
al., 2011). Une bactérie résistante aux antibiotiques peut être sélectionnée par un résidu
d’antibiotique, soit directement par l’élimination de la bactérie sensible correspondante, soit
indirectement par l’affaiblissement des barrières. Les bactéries non pathogènes résistantes aux
antibiotiques ne sont pas dangereuses. Cependant, la gravité des infections opportunistes est
très augmentée par les résistances. De plus, ces résistances peuvent être transmises à des
bactéries pathogènes si leur support génétique est mobilisable (plasmide, transposon) (Stoltz,
2008).

4.5. Risques de développement et dissémination de résistance bactérienne aux

antibiotiques

Le risque lié à l’apparition d’antibiorésistance reste préoccupant. En effet, l’utilisation

d’antibiotiques en médecine humaine et en médecine vétérinaire conduit immanquablement à
la sélection de bactéries résistantes (Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001 ; Wang et al., 2006 ;
Borràs et al., 2011). Le risque d’antibiorésistance consécutif à un usage massif d’antibiotiques
en élevage est donc bien réel. La dynamique de la résistance est avant tout en fonction des
antibiotiques utilisés mais elle dépend aussi d’autres facteurs parmi lesquels une
prédisposition génétique, l’échange de gènes de résistance et leur fonctionnalité chez
différentes bactéries hôtes et la pression de sélection. Le transfert de la résistance acquise au
niveau de l’agriculture vers l’homme a cependant pu être établi (Rhodes et al., 2000).

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Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

4.6. Les problèmes liés à la transformation du lait

L’industrie de transformation laitière s’est sensibilisée à la présence des résidus

d’antibiotiques dès l’utilisation de ces molécules en élevage laitier. Ainsi, dès le début des
années cinquante, des études ont montré l’importance de la sensibilité des starters industriels à
la présence de résidus inhibiteurs (Petrovic et al., 2008 ; Stead et al., 2008 ; Romnee, 2009).
La présence de résidus d’antibiotiques dans le lait présente des conséquences néfastes pour la
technologie laitière de fabrication de produits fermentés. Ces conséquences néfastes résultent
essentiellement de l’inhibition partielle ou totale des phénomènes de fermentation bactérienne
nécessaires à la fabrication de nombreux produits laitiers. Les fabrications les plus sensibles
sont celles où interviennent les ferments lactiques et les germes d’aromatisation : yaourt,
fromages à caillage acide et à caillage mixte, crème et beurres maturés. En effet, même une
faible quantité d’antibiotique suffit en général à inhiber ces ferments (Stoltz, 2008).

Au cours de la fabrication du fromage, la présence de résidus d’antibiotiques modifie

profondément l’équilibre normal de la flore microbienne présente dans le lait, souvent en
faveur des bactéries coliformes (germes de contamination fécale). Le caillage se fait
normalement, mais les ferments lactiques vrais, sensibles aux antibiotiques, sont inhibés.
L’acidification du caillé ne se produit pas et l’égouttage naturel et spontané, s’effectue mal :
le caillé reste volumineux, visqueux, mou et gorgé de lactosérum : c’est le caillé floconneux.
La flore coliforme, insensible à la pénicilline grâce à une pénicillinase, se développe dans le
caillé. Elle fermente le lactosérum résiduel en fermentation gazeuse dont les gaz s’accumulent
dans le caillé en faisant apparaître de multiples petits trous et gonfler la pâte. Le manque
d’acide lactique ne permet pas le développement des moisissures de surface qui sont
remplacées par des moisissures anormales. Enfin, la pâte se trouve rapidement envahie par
des germes de putréfaction (Giraudet, 1978). Les crèmes et les beurres subissent une perte de
goût ou d’arôme. L’arôme du beurre est dû à la présence de diacéthyle, produit du
métabolisme de Streptococcus diacetylactis, principal ferment d’arôme. D’autre part,
l’aromatisation doit se faire en milieu acide et les antibiotiques retardent ou empêchent la
phase d’acidification (Fiscus-Mougel, 1993).

15
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

Les différents ferments ne sont pas sensibles de la même manière aux différents résidus
d’antibiotiques présents dans le lait. Les laits contaminés par la pénicilline posent de sérieux
problèmes en laiterie. Dès 0,01 partie par million (ppm), la production d’arômes cesse. A 0,05
ppm, la fermentation lactique est ralentie de façon significative et de 0,1 à 0,2 ppm,
l’acidification est arrêtée (Mourot et Loussouarn, 1981 ; Heeschen et Bluthgen, 1990). Ainsi,
une très petite quantité de résidus d’antibiotiques peut perturber les techniques de
transformation du lait (Petrovic et al., 2008 ; Stead et al., 2008).

5. La réglementation autour des résidus d’antibiotiques

Avant les années 1980, les méthodes de détection des résidus dans les viandes étaient
relativement peu sensibles. Les Services Vétérinaires menaient alors, afin de protéger la Santé
Publique, une politique de zéro résidu. Si une carcasse ou une pièce de viande était contrôlée
positive aux résidus d’antibiotiques, elle était saisie et déclassée. Au début des années 1980,
les progrès techniques ont permis un bon spectaculaire dans les méthodes de détection avec
notamment le développement de la Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP). La
politique du zéro résidu n’était alors plus tenable car des quantités infimes de résidus étaient
presque systématiquement détectées. Ces quantités détectées étaient si faibles dans la grande
majorité des cas qu’il devenait important d’évaluer le danger qu’elles représentaient vraiment
pour la Santé Publique. Deux notions très importantes sont alors apparues dans la
règlementation, afin de compléter celle de résidus: La notion de Dose Sans Effet (DES) et la
notion de Limite Maximale de Résidus (LMR) (Stoltz, 2008 ; Kassaify et al., 2013).

Le Journal Officiel de l’Union Européenne du 20 Janvier 2010 publie un règlement

(Commission Regulation, 2010) qui consolide la nouvelle liste des LMR (Limites Maximales
des Résidus). Ce règlement de 72 pages comprend deux tableaux dans lesquelles les LMR des
substances pharmacologiquement actives listées par ordre alphabétique sont présentées. Le
premier tableau de 72 pages présente «Les substances autorisées» en productions animales. Le
second tableau d’une demi- page liste les substances interdites d’emploi en production
animale. Dix inscriptions au total incluant le chloramphénicol et les nitrofuranes sont
mentionnées.

16
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

5. 1. Mise en place des limites maximales des résidus LMR

La LMR correspond à la concentration maximale en résidus, résultant de l’utilisation d’un

médicament vétérinaire, sans risque sanitaire pour le consommateur et qui ne doit pas être
dépassée dans ou sur les denrées alimentaires. Dans le cas du lait, une substance doit obtenir
une LMR lait pour chaque espèce de destination, pour que son utilisation soit autorisée chez
les femelles en cours de production laitière dans ces espèces de destination. Si une substance
n’a pas de LMR lait dans une espèce, le médicament vétérinaire la contenant ne peut pas être
utilisé chez une femelle de cette espèce en lactation. La mise en évidence de ce résidu dans le
lait de cette espèce correspond à un non-respect de L'autorisation de mise sur le marché
(AMM) et de la réglementation sur les résidus (Laurentie et Sanders, 2002).

5.2. Le délai d’attente

D’une façon générale, les antibiotiques persistent longtemps dans l’organisme avant leur
excrétion complète. Pour prévenir la présence d’antibiotiques dans le lait, on impose souvent
un temps d’attente avant la commercialisation du lait. Ce délai d’attente, généralement de
plusieurs jours, varie énormément en fonction de la nature de l’antibiotique utilisé, de la dose
injectée ainsi que de la fréquence d’utilisation et de la voie d’administration. Compte tenu de
toutes ces variables, il est pratiquement impossible d’établir des délais exacts pour chaque
famille d’antibiotiques. Cela explique en partie le fait qu’on retrouve occasionnellement des
résidus d’antibiotiques dans le lait, et ce, même au-delà des délais d’attente prévus. Le
manque d’informations sur la biodistribution et l’élimination de ces substances par
l’organisme semble «être à l’origine de ce phénomène de persistance prolongée des
antibiotiques dans le lait». Le respect des délais d’attente constitue toujours un moyen de
prévention valable. Cependant, la recherche systématique des résidus d’antibiotiques dans les
échantillons de lait demeure le seul moyen de prévention qui peut assurer l’innocuité
complète des produits. Pour ce faire, il est donc impératif de disposer de méthodes de
détection fiables, sensibles et spécifiques (Le Minor, 1982).

6. Les méthodes de recherches des résidus d’antibiotiques

Dans le cadre de la surveillance de la qualité des denrées d’origine animales, plusieurs

méthodes de détection des résidus sont mises en œuvre. Certaines de ces méthodes sont dites
de dépistages qui consistent à distinguer les échantillons positifs des échantillons négatifs, et
d’autres méthodes sont dites de confirmation (Le Minor, 1982 ; Bergogne-Berizin et

17
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

Dellamonica, 1999). Selon le principe de chacune de ces méthodes, on peut les classés en
méthodes microbiologiques et en méthodes physico-chimiques.

6.1. Les méthodes microbiologiques

Les méthodes microbiologiques sont très largement utilisées en routine, sont qualitatives et
constituent la première étape des plans de contrôle, et sont basées sur l’inhibition de la
croissance bactérienne. Ces méthodes consistent à effectuer un contrôle positif «un
antibiotique auquel la souche utilisée est sensible» et un contrôle négatif «l’eau distillée stérile
ou un lait ne contenant pas d’antibiotiques» pour permettre de valider les résultats (Bergogne-
Berizin et Dellamonica, 1999).

6.1.1. Test d’acidification

Pour ce test, on utilise une culture d’une bactérie capable de dégrader le lactose en acide
lactique et un indicateur de couleur, le pourpre de bromocrésol, qui nous permet de savoir s’il
y a eu acidification du milieu. La souche la plus adaptée pour cette méthode est Bacillus
stearothermophilus var. calidolactis C953 (souche C953, CIP 5281) (Ben Mahdi et
Ouslimani, 2009). Si le lait analysé contient des antibiotiques alors les bactéries ne
dégraderont pas le lactose, la couleur du milieu reste inchangée. Par contre, l’absence
d’antibiotique, se traduit par le virage de la couleur du bleu vers le jaune, il y a donc
acidification (figure 2).

Figure 2 : Principe du test d’acidification (Singleton, 2008).

18
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

6.1.2. Méthode de diffusion sur gélose

Elle consiste à faire diffuser un antibiotique dans un milieu gélosé contenant une souche
bactérienne sensible à cet antibiotique. Pour ce faire, on dépose des volumes identiques
représentant plusieurs dilutions de la solution contenant l’antibiotique sur des rondelles de
papier buvard. Ces disques sont mis en contact d’une surface gélosée contenant 106 à 107
cellules souches indicatrices ou de spores. Pendant l’incubation, l’antibiotique diffuse dans la
gélose de façon radiaire à partir de son point d’application. Après 15 à 48 heures à la
température optimale de croissance du micro-organisme, on mesure les diamètres d’inhibition
qui apparaissent sous l’aspect de zones claires.

6.1.3. Méthode des 4 boites

La méthode des 4 boites est la méthode officielle française de détection des résidus
d’antibiotiques dans la viande. Elle a pour objet, à l'aide de microorganismes sensibles, la
mise en évidence de résidus de substances à activité antibiotique sans en déterminer leur
identité. La méthode est basée sur l’analyse de rondelles de viande selon le principe de la
méthode de diffusion sur gélose (tableau 1) (Talnan, 2013).

Tableau 1: Présentation de la méthode des 4 boîtes utilisée pour le contrôle officiel.

Boite 1 2 3 4
Souche Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bacillus subtilis Micrococcusluteus
pH 6 7.4 8 8
Observations +Triméthoprime
Molécules Bétalactames + Sulfamides Aminosides Bétalactames +
(cible) Tetracyclines Macrolides

19
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

6.2. Les méthodes physico-chimiques

Ce sont des méthodes confirmatives et/ou quantitatives, sont spécifiques à un antibiotique ou

une famille d’antibiotiques. Les méthodes physico-chimiques regroupent les méthodes
enzymatiques, immuno-enzymatiques et immunologiques qui sont dites des méthodes rapides
et les méthodes chromatographiques dites aussi méthodes analytiques.

6.2.1. Méthodes enzymatiques

Les méthodes enzymatiques sont très rapides ont pour principe l’inhibition d’une enzyme en
présence d’un résidu d’antibiotique spécifique. Cette enzyme n’est alors plus révélée par un
indicateur coloré (Bergogne-Berizin et Dellamonica, 1999). Le test le plus répandu est le
Penzyme qui permet de détecter aussi peu que 0.017 UI des β-lactames dans le lait en 20
minutes seulement. Repose sur la capacité des β-lactames d’inhiber l’enzyme DD-
carboxypeptidase responsable de la libération de la D-alanine à partir de l’[Link]-
[Link]. En absence d’antibiotiques, la D-alanine est oxydée par la D-amino-oxydase et
libère du peroxyde d’oxygène qui en présence d’un indicateur coloré, génère une coloration
rose. En présence d’antibiotiques, cette réaction colorimétrique est inhibée et le lait demeure
blanc (Le Minor, 1982).

6.2.2. Méthodes immunologiques

Sont basées sur l’interaction antigène-anticorps, qui est très spécifique pour un résidu
particulier. La technique la plus répandue est l’Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
(ELISA) et le système de détection peut être basé sur des réactifs à enzymes marquées. Il y a
différentes méthodes pour la quantification des antigènes, comme la méthode « double
anticorps » encore appelée ELISA sandwich et le test de compétition directe ELISA
(Bergogne-Berizin et Dellamonica, 1999). Les Radio-Immuno-Assay (R.I.A.) sont compétitifs
et utilisent des anticorps spécifiques pour les récepteurs des antibiotiques sont basés sur la
mesure de la radioactivité du complexe immunologique en 10 minutes, ces tests permettent la
détection des quantités de 05 à 80 partie par billion (ppb) (Le Minor, 1982). D’autres tests
utilisent la luminescence ou la fluorimétrie comme méthode de détection. Aujourd’hui, il
existe de nombreux kits ELISA de différent type utilisables pour un grand nombre de
substances et notamment de nombreux antibiotiques. Ils sont disponibles pour un résidu

20
Chapitre II Généralités sur les résidus d’antibiotiques

spécifique ou pour un groupe de composés apparentés comme par exemple le groupe des
fluoroquinolones (Bergogne-Berizin et Dellamonica, 1999).

6.2.3. Capteurs biologiques

Différents types de capteurs biologiques ont été développés ces dernières années pour le
dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans la viande, dont bien sûr les résidus
d’antibiotiques. En général, ces capteurs contiennent un anticorps comme élément de
reconnaissance qui interagit avec l’analyte. Le signal biochimique qui en résulte est mesuré
optiquement ou converti en un signal électronique qui est ensuite traité dans un équipement
approprié. Les capteurs biologiques sont capables de détecter simultanément de multiples
résidus dans un échantillon et en une seule fois ce qui les rend intéressants pour le contrôle en
laboratoire car ils permettent l’analyse d’un grand nombre d’échantillons et de résidus en un
minimum de temps et avec un minimum de consommables utilisés pour l’analyse. Ils
représentent aujourd’hui une vraie alternative aux tests ELISA (Singleton, 2008).

6.2.4. Méthodes chromatographiques

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) et la chromatographie liquide ultra

performance (UPLC) sont les méthodes chromatographiques les plus utilisées. Ces méthodes
physico-chimiques sont basées sur l’extraction et la purification des antibiotiques à partir des
tissus ou des liquides comme le lait (Bergogne-Berizin et Dellamonica, 1999). De ce fait, la
séparation de composés en solution élués s’effectue à travers une colonne chromatographique
à l’aide d’une phase mobile liquide percolée grâce à une pression élevée. Effectivement, il
existe une réelle interaction triple entre l’analyte, la phase stationnaire et la phase mobile
basée sur l’affinité physico-chimique entre les trois (Boultif, 2015).

21
Partie expérimentale
Chapitre III : Matériel et
méthodes
Chapitre III Matériel et méthodes

I- Cadre et période de l’étude

La démarche de cette étude est axée sur des enquêtes de terrain et sur des analyses réalisées au
laboratoire de microbiologie et de biochimie de la faculté des Sciences de la Nature et de la
Vie et Sciences de la Terre et de l’Univers ; Université de Guelma (Algérie). Ainsi qu’au
service des résidus et contaminants ; Institut Scientifique de Santé Publique, Bruxelles
(Belgique).

Notre étude s’est déroulée dans la wilaya de Guelma plus précisément dans le centre de la
ville de Guelma et certaines communes. La wilaya de Guelma se situe au Nord-est du pays et
constitue, du point de vue géographique, un point de rencontre, voire un carrefour entre les
pôles industriels du Nord (Annaba et Skikda) et les centres d’échanges au Sud (Oum El
Bouaghi et Tébessa). Elle occupe une position médiane entre le Nord du pays, les Hauts
plateaux et le Sud. La wilaya de Guelma s’étend sur une superficie de 3.686,84 Km2. Elle est
limitrophe aux Wilayas de: Annaba au Nord, El Taref au Nord-est, Souk Ahras à l’Est, Oum
El-Bouaghi au Sud, Constantine à l’Ouest et Skikda, au Nord-ouest.

Son territoire se caractérise par un climat subhumide au centre et au Nord et semi-aride vers le
Sud. Ce climat est doux et pluvieux en hiver et chaud en été. La température qui varie de 4°C
en hiver à 35.4°C en été, est en moyenne de 17,3°C. D’une vocation essentiellement agricole,
la Wilaya de Guelma recèle un important potentiel, à savoir:

*Surface Agricole Totale (SAT): De 264.618 Ha, soit 71,77 % de la superficie totale.

*Surface Agricole Utile (SAU): De près de 187.338ha, soit 50,81% de la superficie totale de
la wilaya et 70,80% de la SAT.

*Superficie forestière de 113.182 ha, soit un taux de 30,70% de la superficie totale de la

wilaya (ANDI, 2015).

Ce potentiel a permis le développement de nombreuses activités agropastorales tel que

l’élevage de vaches laitières dans des fermes étatiques et/ou privées ou par des éleveurs à
petite échelle. Dans le but de préserver cette activité, les éleveurs ne cessent d’utiliser des
antibiotiques, cette étude a pour objectif de détecter la présence de résidus d’antibiotiques
dans le lait collecté dans deux fermes majeurs et 16 points de vente destiné au consommateur.
Les différents sites de prélèvements sont présentés dans la figure 3.

22
Chapitre III Matériel et méthodes

 Institut de Technologie Moyenne d’Agriculture (Ferme A)

La ferme école est située à quelques mètres du siège de la wilaya de Guelma. Elle dispose un
étable avec 24 vaches laitières, dont les races sont de Prim’ holshtein et la Guelmoise.
L’hygiène est peu acceptable, l’étable est riche en débris organiques en décomposition. La
traite est mécanique; elle est réalisée deux fois par jour dans la salle de traite, grâce à quatre
chariots trayeurs. Le lait collecté lors la traite est vendu directement aux citoyens de la wilaya.

 Ferme de MEKHANCHA NAFAA (Ferme B)

La ferme pilote MEKHANCHA NAFAA est située sur le territoire de la commune Boumahra
Ahmed à l’Est du chef-lieu de la wilaya de Guelma. Elle comprend des vaches laitières de
race Prim’ holshtein pie noir. Les animaux reçoivent une ration différente selon le stade de
lactation ou de tarissement et l’état de vache (l’état de chair). En plus de la paille et du
concentré, l’alimentation des vaches laitières est occasionnellement supplémentée par des
résidus de tomate fraiche et les drèches de brasserie. L’hygiène s’effectue avec de l’eau, et
raclages des déchets. L’étable est riche en débris organiques en décomposition (concentré
moisi, matières fécales des animaux, fientes des pigeons). La traite est mécanique; elle est
réalisée deux fois par jour dans l’étable (absence de salle de traite), grâce à quatre chariots
trayeurs. A la fin, le lait collecté est vendu aux collecteurs privés qui vont le distribuer aux
usines et/ou vendeurs privés.

 Points de ventes

Seize (16) points de ventes ont été visités pour la collecte des échantillons de lait de vache cru
et de Lben destinés directement à la consommation humaine. Ces vendeurs sont localisés au
centre de la wilaya ainsi que dans ses communes, citons principalement (Boumahra Ahmed,
Belkheir, Héliopolice, Djebala et Beni mezline)

23
Chapitre III Matériel et méthodes

Figure 3: Présentation de la zone d’étude (Source électronique : Google Earth 2016). Abréviation: FA
ferme A, FB ferme B, PV points de vente.

24
Chapitre III Matériel et méthodes

II. Échantillonnage

Avant de commencer le prélèvement du lait de vache il faut d’abord s’assurer que vous êtes
en sécurité; c'est-à-dire que la vache est bien reliée par un professionnel d’étable et que vous
vous positionnez dans une manière qui vous facilite la traite et vous protège lors du
mouvement de la vache. Une procédure rigoureusement aseptique a été suivi pour le
prélèvement d’échantillon de lait afin d’éviter toute contamination par les nombreux
microorganismes présents sur le pis et les trayons de la vache, que sur les mains du préleveur.
Premièrement, la mamelle est bien nettoyée des selles et des impuretés avec de l’eau tiède
javellisée. Deuxièmement, une compresse trompée avec un antifongique à base d’ammonium
quaternaire est utilisée pour désinfecter l’extrémité du trayon en insistant sur l’extrémité de
l’orifice de canal du trayon. Troisièmement, l’extrémité de chaque trayon est essuyée avec du
coton contenant de l’éthanol à 70%. L’alcool est l’antiseptique de choix car il s’évapore
rapidement et ne laisse aucun résidu bactéricide dans l’échantillon de lait (NMC, 1990).

Avant de commencer le prélèvement de lait à collecter, 3 à 4 jets sont éliminés pour éviter
toutes traces des désinfectants. Pour le lait de tank ; un échantillon est prélevé sur chaque
citerne de collecte à des périodes aléatoires. Tous les échantillons sont bien identifiés,
conservés dans une glacière à +4°C jusqu’à l’arrivé au laboratoire.

Durant la période de janvier 2013 à juillet 2014; un total de 194 échantillons de lait est
collecté dont 156 échantillons (tableau 2) sont rassemblés de deux fermes (A et B). Le
principe des prélèvements est la recherche des résidus d’antibiotiques dans des échantillons de
lait collectés des vaches qui ont eu un traitement aux antibiotiques le même mois de la
collecte en particulier après le délai d’attente, des vaches déclarées saines et qui n’ont reçu
aucun traitement durant le mois de prélèvement et de lait de collecte (tank). Effectivement, un
questionnaire est utilisé pour rassembler des données sur le traitement des vaches utilisé (type
d’antibiotique administré, voie de traitement, date de traitement et le délai d’attente pour
chaque antibiotique utilisé). Ce questionnaire nous dirige aux antibiotiques qui seront par la
suite analysés et nous permit de pouvoir contrôler, si le temps d’attente est vraiment respecté
au sein des fermes.

25
Chapitre III Matériel et méthodes

Tableau 2: La répartition des prélèvements provenant des fermes.

Nombre d’échantillon par type de lait

Lieu de prélèvement Lait de vaches Lait de vaches

Lait de collecte
saines traitées

Ferme A 28 8 17

Ferme B 70 18 15

Total 98 26 32

Egalement, 38 échantillons de lait (22 du lait fermenté "lben" et 16 lait de vache cru) sont
achetés auprès des 16 points de vente préalablement cités. Un autre questionnaire est utilisé
pour la collecte des données sur les origines du lait commercialisé.

Approximativement, un volume de 140 ml de chaque échantillon de lait est rassemblé dans

des flacons stériles; conservé et transporté au laboratoire à 4°C. 10 mL sont utilisés pour le
premier dépistage des résidus d’antibiotiques avec Delvotest SP-NT et 130mL sont conservés
à (-20°C) pour d’autres analyses de confirmation avec UPLC/MS-MS.

26
Chapitre III Matériel et méthodes

III. Matériel et Méthodes d’analyse

La recherche des résidus d’antibiotiques dans le lait comporte deux analyses principales.
Premièrement, une analyse avec Delvotest SP-NT et deuxièmement une analyse avec UPLC-
MS/MS.

1. Analyse avec un test d’inhibition microbiologique Delvotest ® -SP-NT

1.1. Echantillons

Un total de 154 échantillons de lait (127 des deux fermes et 27 des différents points de ventes)
fera l’objet d’une analyse par Delvotest ® -SP-NT.

1.2. Matériel utilisé

1.2.1. Description du kit Delvotest ® -SP-NT

Delvotest ® -SP-NT 100 ampoules (DSM, Pays-Bas) est un test de diffusion sur gélose et
quatre kits sont utilisés (figure 4). Trois sont fournis par la firme DSM Food Specialties
(Espagne) et le quatrième est acheté (Tunisie). Chaque kit est équipé avec 100 ampoules
coulées avec une gélose qui contient : un nombre standards de spores de Bacillus
stearothermophilus var calidolactis, des substances nutritives et l'indicateur de pH (pourpre
de bromocrésole). Ainsi 100 pipettes en plastiques jetables à 0.1mL.

Figure 4: Delvotest ® -SP-NT 100 ampoules

27
Chapitre III Matériel et méthodes

1.2.2. Incubateur Delvotest SP-NT

Est un appareil préconisé pour l’incubation de 10 ampoules à une température de 64±1 °C et

un temps de 3h préalablement réglés (figure 5).

Figure 5: Incubateur Delvotest SP-NT

1.3. Protocole d’analyse

A l’exception des échantillons de lben, 10 mL de chaque échantillon de lait cru sont chauffés
dans des tubes à vis stériles à 80°C pendant 10 min dans un autoclave pour détruire les
inhibiteurs (lysozyme et lactoferrine) naturellement présents dans le lait (Hillerton et al,
1998). Après, les ampoules nécessaires sont séparées à une façon d’éviter de détériorer les
ampoules adjacentes et la pellicule aluminium est perforée avec la pipette. 0.1mL de lait est
prélevé à l’aide d’une pipette et décanté lentement dans les ampoules Delvotest SP-NT
identifiées au préalable pour chaque échantillon à tester. Une nouvelle pipette est utilisée afin
d’éviter toute contamination entre les échantillons. Finalement, les ampoules sont incubées
dans un bain Marie ou dans l’incubateur Delvotest à 64°c ± 1°c pendant 3h. Les instructions
de la firme de production sont respectées pour le protocole et l'interprétation des résultats
(figure 6).

Figure6: Interprétation des résultats Delvotest SP-NT (DSM, 2012).

28
Chapitre III Matériel et méthodes

2. Analyse par Chromatographie Liquide Ultra Performance couplée avec

Spectrométrie de Masse (UPLC/MS-MS)

En raison de vérifier la fiabilité des résultats obtenus avec Delvotest SP-NT, une technique
rapide et spécifique est utilisée pour l’analyse de 194 échantillons.

2.1. Matériel utilisé

A. Verrerie et consommable

-matras jaugé de 5ml et 10ml

-pipettes graduées

-tube en verre de 10ml

- Tube Falcon® conique avec bouchon de 50ml

- Pipettes Pasteur

-Seringues Terumo de 2ml (VWR)

-Poire

- Portoirs

- cupules eppendorf

-Filtres membrane nylon 0.2µm (Euroscientific)

-Fioles à UPLC en verre et en plastique (GRACE)

- Eprouvettes graduées

-Flacons en verre ombré pour stocker les solutions d’antibiotiques préparées.

B. Appareillage

-Dispensettes 10ml et 50ml

- Micropipettes à volume variable 10- 100µl

- micropipettes à volume variable 100- 1000µl

- Balance de précision (Metler AK 160)

29
Chapitre III Matériel et méthodes

-Balance (Sartorius)

-Vortex (biosan)

- Centrifugeuse vitesse maximale 10000t/min (Jouan BR4)

-Centrifugeuse, type eppendorf vitesse maximale 12000 t/min (Biofuge; Heraeus)

-Incubateur (SHEL-LAB)

- Hotte aspirante

-Evaporateur sous flux d’azote de type (PIERCE) (figure7)

Figure 7: Evaporateur sous flux d’azote (26-2-2015)

- Colonne analytique UPLC: Acquity BEH C18 100×2.1 mm, 1.7µm WATERS (Millford,
MA, USA) (figure 8)

Figure 8: Colonne C18 réservée pour l’analyse des multi- résidus d’antibiotiques (30-3-2015)

30
Chapitre III Matériel et méthodes

- Système Millipore (Bedford, MA, USA) (figure 9).

Figure 9: Système Millipore pour production de l’eau milli-Q (2-4-2015)

- Chromatographie liquide Ultra Performance (WATERS Acquity) couplée au Spectromètre

de masse Xevo-TQMS avec enregistreur (PC) muni d’un logiciel Masslynx (figure 10).

Figure 10: UPLC couplée à la spectrométrie de masse en tandem (MS-MS) (26-2-2015)

C. Produits chimiques

Les réactifs utilisés sont de qualité UPLC. On note:

 Méthanol pour UPLC-MS (Biosolve; Valkenswaard, Pays bas)

 Acétonitrile pour UPLC-MS (Biosolve; Valkenswaard, Pays bas)
 Ethanol pour UPLC-MS (Biosolve; Valkenswaard, Pays bas)
 Eau Milli-Q (système Millipore, Bedford, MA, USA)

31
Chapitre III Matériel et méthodes

 Acide formique pour analyse (Darmstadt, Allemagne)

 Acide acétique pour analyse (Darmstadt, Allemagne
 Acide oxalique pour analyse (Darmstadt, Allemagne)
 Ethylenediamine tetracetic acid dipotassium salt dihydrate 99% (EDTA) (Darmstadt,
Allemagne)
 Sulfate de Sodium anhydride (Darmstadt, Allemagne)
 Solution NH4OH 2M
 Oxyde d’aluminium
 Les standards d’antibiotiques de référence, Sigma-Aldrich (Bornem, Belgique)
 Les standards internes (sulfadimidine C13, flucloxacilline, norfloxacin_D5,
roxythromycine et déméclocycline), Sigma-Aldrich (Bornem, Belgique).

2.2. Principe de la méthode

la chromatographie liquide ultra-performance (UPLC) couplée avec spectrométrie de masse

en tandem polyvalente (UPLC–MS/MS) susceptible de contrôler multiples réactions (MRM)
est devenue l'outil d'analyse de choix pour une quantification sensible simultanée et même
pour une confirmation claire d'une vaste gamme d'antibiotiques cibles et leurs métabolites
dans des matrices complexes. Les méthodes UPLC-MS/MS multi-résidu sont une façon
efficace pour contrôler une large variété de contaminants chimiques en une seule analyse,
augmentant les ressources de laboratoire et permettant une flexibilité élevée au traitement
d’échantillon (Meng et al., 2015).

La recherche des résidus d’antibiotiques à l’aide de l’UPLC-MS/MS comporte trois étapes

essentielles:

- la préparation des solutions standards d’antibiotiques et la préparation des solutions

des solvants utilisés au cours de l’analyse.
- L’extraction et purification des résidus d’antibiotiques des échantillons à analyser.
- Le dosage par UPLC-MS/MS.

2.3. Protocole d’analyse

2.3.1. Préparation des solutions standards d’antibiotiques

Toutes les solutions des standards d’antibiotiques préparées doivent être conservé à -20°C
afin d’assurer leurs stabilité.

32
Chapitre III Matériel et méthodes

A. Solutions stocks (C1)

A.1. Sulfamides, pénicillines, macrolides et tétracyclines

Dans un ballon jaugé de 10 ml, peser séparément environ 10 mg de standard et mettre au trait
avec le solvant adéquat (tableaux 4, 5, 6 et 7). Corriger la concentration en tenant compte de
la pureté du standard, selon la formule
Concentration. Exacte = (masse pesée x pureté) / volume

[Link]
Dans un ballon jaugé de 50 ml, peser séparément environ 5 mg de standard et mettre au trait
avec le solvant adéquat (tableau 8). Corriger la concentration en tenant compte de la pureté du
standard, selon la formule précédente.

B. Solutions standard intermédiaires mixtes (5 LMR)

Dans un ballon jaugé de 10 ml (V2) (tableau 3), prélever le volume exact (V1) de chacune des
solutions stocks (C1) pour obtenir une concentration finale de x µg/ml (C2) (tableaux 4, 5, 6,
7 et 8). Utiliser pour cela la formule:

C1xV1= C2xV2

C1 = concentration de la solution stock en µg/ml

V1 = volume à prélever de la solution stock en ml
C2 = concentration finale
V2 = volume final

Tableau 3: Les solvants utilisés pour la préparation des solutions standard intermédiaires mixtes
(5LMR).
Mixte antibiotiques V2 (ml) solvant
Mixte sulfamides 10 méthanol
Mixte pénicillines 10 eau
Mixte tétracyclines 10 méthanol
Mixte macrolides 10 méthanol
Mixte quinolones 10 méthanol

33
 Chapitre III Matériel et méthodes
Tableau 4: solution stock et 5LMR des sulfamides.

Date de masse Concentration Concentration dans

LMR n° de Pureté Volume Volume à
Antibiotique préparation pesée Solvant exacte C1 "Sulf mix 5 LMR" C2
(µg/L) composé (%) (mL) pipeter (µL)
d’antibiotique (mg) (mg/mL) (µg/mL)
Sulfadiazine 22/01/2015 100 1271 10,8 100 10 Méthanol 1,080 93 10
Méthanol
Sulfapyridine 22/01/2015 100 1154 10,7 100 10 1,070 93 10
Sulfamethoxy- Méthanol
22/01/2015 100 1043 10,7 100 10 1,070 93 10
pyridazine
Méthanol
Sulfadoxine 22/01/2015 100 1069 10,8 100 10 1,080 93 10
Méthanol
Sulfadimethoxine 22/01/2015 100 1264 10,0 98 10 0,980 102 10
Méthanol
Sulfadimidine 22/01/2015 100 1038 10,2 100 10 1,020 98 10
Sulfamono- Méthanol
22/01/2015 100 1037 10,0 100 10 1,000 100 10
methoxine
Méthanol
Sulfamoxole 22/01/2015 100 800 10,1 100 10 1,010 99 10
Méthanol
Sulfaquinoxaline 22/01/2015 100 1272 10,2 96 10 0,979 102 10
Sulfachloro- Méthanol
22/01/2015 100 1238 10,2 100 10 1,020 98 10
pyridazine
Méthanol
Sulfathiazole 22/01/2015 100 1274 10,1 100 10 1,010 99 10
Méthanol
Sulfaguanidine 22/01/2015 100 1278 10,1 100 10 1,010 99 10
Méthanol
Sulfamethizole 22/01/2015 100 1275 10,1 98,9 10 0,999 100 10
Méthanol
Sulfamerazine 22/01/2015 100 1279 10,0 100 10 1,000 100 10
Méthanol
Sulfamethoxazole 22/01/2015 100 1276 10,2 100 10 1,020 98 10

34
 Chapitre III Matériel et méthodes

Date de masse Concentration Concentration dans

LMR n° de Pureté Volume Volume à
Antibiotique préparation pesée Solvant exacte C1 "Sulf mix 5 LMR" C2
(µg/L) composé (%) (mL) pipeter (µL)
d’antibiotique (mg) (mg/mL) (µg/mL)
Méthanol
Sulfacetamide 22/01/2015 100 1146 10,2 100 10 1,020 98 10
Méthanol
Sulfisoxazole 22/01/2015 100 1142 10,1 100 10 1,010 99 10
Méthanol
triméthoprime 22/01/2015 100 1291 10,3 100 10 1,030 97 10

(Suite tab 4)

Tableau 5: solution stock et 5LMR des pénicillines.

Date de masse Concentration Volume à Concentration dans
LMR n° de Pureté Volume
Antibiotique préparation pesée solvant exacte C1 pipeter "Pénic mix 5 LMR"
(µg/L) composé (%) (mL)
d’antibiotique (mg) (mg/mL) (µL) C2 (µg/mL)
1239
Amoxicilline 22/01/2015 50 10,0 100 10 Eau 1,000 50 5
1287
Ampicilline 22/01/2015 50 10,5 100 10 Eau 1,050 48 5
726 Eau/Méthanol
Pénicilline G 22/01/2015 50 10,1 100 10 1,010 50 5
(V/V)
1270
Cloxacilline 22/01/2015 3000 10,5 98,5 10 Méthanol 1,034 2901 300
1294 Méthanol
Dicloxacilline 22/01/2015 300 10,2 100 10 1,020 294 30
1297 Méthanol
Nafcilline 22/01/2015 300 10,1 98,7 10 0,997 301 30
1295 Méthanol
Oxacilline 22/01/2015 300 10,1 100 10 1,010 297 30
1144
Pénicilline V 22/01/2015 25 10,9 98,9 10 Méthanol 1,078 23 2,5

35
 Chapitre III Matériel et méthodes

Tableau 6: solution stock et 5LMR des macrolides.

Concentration dans
masse Concentration Volume à "Macrol mix 5 LMR"
Date de préparation LMR n° de Pureté Volume
Antibiotique pesée Solvant exacte C1 pipeter C2 (µg/mL)
d’antibiotique (µg/L) composé (%) (mL)
(mg) (mg/mL) (µL)

acétonitrile
Erythromycine 22/01/2015 200 1288 10,3 100 10 1,030 194 20
acétonitrile
Spiramycine 22/01/2015 250 1289 10,1 100 10 1,010 248 25
acétonitrile
Tilmicosine 22/01/2015 50 1143 10,0 85,2 10 0,852 59 5
acétonitrile
Tylosine 22/01/2015 100 1213 10,2 91,8 10 0,936 107 10
acétonitrile
Josamycine 22/01/2015 200 1010 10,2 100 10 1,020 196 20
acétonitrile
Lincomycine 22/01/2015 100 1266 10,3 100 10 1,030 97 10
acétonitrile
Tulatrhomycine 22/01/2015 100 1139 10,0 97,4 10 0,974 103 10
acétonitrile
Neospiramycine 22/01/2015 250 1133 10,0 100 10 1,000 250 25
acétonitrile
Tylvalosine 22/01/2015 50 1141 10,2 68,73 10 0,701 71 5

36
 Chapitre III Matériel et méthodes

Tableau 7: solution stock et 5LMR des tétracyclines.

Date de masse Concentration Volume à Concentration dans

LMR n° de Pureté Volume
Antibiotique préparation pesée Solvant exacte C1 pipeter "Tetra mix 5 LMR"
(µg/L) composé (%) (mL)
d’antibiotique (mg) (mg/mL) (µL) C2 (µg/mL)
Méthanol
Chlortétracycline 22/01/2015 100 1267 10,3 93,1 10 0,959 104 10
Méthanol
Oxytétracycline 22/01/2015 100 1070 10,1 97 10 0,980 102 10
Méthanol
Tétracycline 22/01/2015 100 1265 10,3 97,5 10 1,004 100 10
Méthanol
Doxycycline 22/01/2015 100 1290 10,8 100 10 1,080 93 10
4-epi- Méthanol
22/01/2015 100 1041 10,0 97 10 0,970 103 10
Chlortétracycline
4-epi- Méthanol
22/01/2015 100 1023 10,1 97 10 0,980 102 10
Oxytétracycline
Méthanol
4-epi-Tétracycline 22/01/2015 100 1024 10,2 97 10 0,989 101 10

37
 Chapitre III Matériel et méthodes

Tableau 8: solution stock et 5LMR des quinolones.

Volume
Date de masse Concentration Concentration dans
LMR n° de Pureté Volume Solvant à
Antibiotique préparation pesée exacte C1 "Quinol mix 5
(µg/L) composé (%) (mL) pipeter
d’antibiotique (mg) (mg/mL) LMR" C2 (µg/mL)
(µL)
NH4OH 2M / méthanol
Fluméquine 22/01/2015 200 998 5,1 100 50 (4-96,v/v) 0,102 980 10

NH4OH 2M/ méthanol

Difloxacin 22/01/2015 300 996 5,1 100 50 (4-96,v/v) 0,102 1471 15

NH4OH 2M/ méthanol

Ciprofloxacine 22/01/2015 100 933 5,1 100 50 (4-96,v/v) 0,102 490 5

NH4OH 2M/ méthanol

Enrofloxacine 22/01/2015 100 1296 5,0 100 50 (4-96,v/v) 0,100 500 5

NH4OH 2M/ méthanol

Danofloxacine 22/01/2015 100 995 5,2 100 50 (4-96,v/v) 0,104 481 5

NH4OH 2M/ méthanol

acide
22/01/2015 100 989 5,1 100 50 (4-96,v/v) 0,102 490 5
Nalidixique
NH4OH 2M/ méthanol
acide
22/01/2015 100 911 5,4 100 50 (4-96,v/v) 0,108 463 5
Oxolinique
NH4OH 2M/ méthanol
Sarafloxacine 22/01/2015 30 932 5,1 100 50 (4-96,v/v) 0,102 147 1,5

38
 Chapitre III Matériel et méthodes

Volume
Date de masse Concentration Concentration dans
LMR n° de Pureté Volume à
Antibiotique préparation pesée Solvant exacte "Quinol mix 5
(µg/L) composé (%) (mL) pipeter
d’antibiotique (mg) (mg/mL) LMR" (µg/mL)
(µL)

NH4OH 2M/ méthanol

Marbofloxacine 22/01/2015 150 997 5,0 100 50 (4-96,v/v) 0,100 750 7,5

NH4OH 2M/ méthanol

Norfloxacine 22/01/2015 100 990 3,5 100 50 (4-96,v/v) 0,070 714 5

NH4OH 2M/ méthanol

Ofloxacine 22/01/2015 100 1149 5,5 100 50 (4-96,v/v) 0,110 455 5

(suite tab8 )

39
Chapitre III Matériel et méthodes

C. Solutions standards intermédiaires mixtes (1 LMR)

C.1. Mixte tétracyclines + macrolides

Dans un ballon jaugé de 5 ml mélanger 1 ml de chaque solution mixte 5 LMR de

tétracyclines, macrolides et mettre au trait avec du méthanol.

C.2. Mixte sulfamides + quinolones

Dans un ballon jaugé de 5 ml mélanger 1 ml de chaque solution mixte 5 LMR de sulfamides

et quinolones et mettre au trait avec du méthanol.

C.3. Mixte pénicillines

Dans ballon jaugé de 5 ml mélanger 1 ml de la solution mixte 5 LMR de pénicillines et mettre

au trait avec de l’eau.

D. Solutions stocks des Standards Internes (roxythromycine, norfloxacine-D5,

sulfadimidine C13, déméclocycline, flucloxacilline) à une concentration de 1mg/ml

Peser à +/- 10mg séparément chaque standard interne dans un ballon jaugé de 10 ml et mettre
au trait avec du méthanol, sauf pour la flucloxacilline, utiliser de l’eau (tableau 9).

[Link] Standards Internes à 5 LMR

Dans un ballon jaugé de 10 ml, prélever x µl de chaque solution stock à +/- 1 mg/ml et mettre
au trait avec du méthanol (tableau 9). Cette solution est stable 1 an au congélateur

40
 Chapitre III Matériel et méthodes

Tableau 9: solution stock et de 5LMR des standards internes.

Famille
d’antibiotique Volume Concentration
Date de masse Concentration
Stanadards LMR n° de Pureté Volume à dans "SI mix
préparation pesée exacte
Internes (µg/L) composé (%) (mL) pipeter 5 LMR"
d’antibiotique (mg) (mg/mL)
(µL) (ng/µL)

Quinolones
D5 norfloxacine 23/01/2015 100 799 5,9 100 10 0,590 169 10
Pénicillines
flucloxacilline 23/01/2015 100 855 10,2 100 10 1,020 98 10
sulfadimidine Sulfamides
23/01/2015 100 861 10 100 10 1,000 100 10
C13
Tétracyclines
déméclocycline 23/01/2015 100 1069 10,2 100 10 1,020 98 10
Macrolides
roxythromycine 23/01/2015 100 848 10 100 10 1,000 100 10

41
Chapitre III Matériel et méthodes

D.1. Mixte standards internes 1 LMR

Dans un ballon jaugé de 10 ml, prélever 2 ml de la solution mixte des standards internes
5LMR et mettre au trait avec du méthanol. Cette solution est stable 1 an au congélateur.

2.3.2. Préparations des solutions à utiliser

-Tampon acide oxalique 0.1mM, 0.1% acide formique

Dans une éprouvette graduée de 1 L, ajouter 10 ml acide oxalique 10mM et 1 ml d’acide

formique et mettre au trait avec de l’eau.

-Acide oxalique 10 mM : Dans un matras de 1 L, peser 1.26 g acide oxalique dihydraté et

mettre au trait avec de l’eau.

-Acétonitrile 0.1% acide formique : Ajouter 1ml acide formique à 1L acétonitrile.

-EDTA 0.1M : Dans un matras de 100 mL, peser 4.04 g EDTA et mettre au trait avec de
l’eau. Conserver à température ambiante.

-Méthanol/eau (1/1, v/v) : Mélanger 50ml méthanol avec 50 ml eau.

-Méthanol/acétonitrile (7/3, v/v): Mélanger 70 ml de méthanol avec 30 ml d’acétonitrile.

-Solution de déprotéinisation (éthanol : acide acétique, 96 :4 v/v) : Mélanger 96mL

d’éthanol avec 4mL d’acide acétique.

-Solution composée d’acide formique (0.1% dans l’eau) et d’acide formique (0.1% dans
l’acétonitrile) (98 :2) : Mélanger 98mL d’acide formique 0.1% dans leau avec 2 mL d’acide
formique 0.1% dans l’acétonitrile.

- Solution NH4OH 2M/CH3OH (4-96, v/v): Mélanger 4mL de la solution NH4OH avec
96mL du méthanol.

42
Chapitre III Matériel et méthodes

2.3.3. Optimisation et validation de la méthode d’extraction

[Link]. Optimisation de la méthode d’extraction

L’institut ISP de Belgique a précédemment optimisée et validée une méthode pour l'extraction
et la détection de 59 résidus d’antibiotiques dans la viande utilisant l’UPLC-MS/MS selon la
commission Européenne (Commission decision, 2002). Bien que, pour utiliser cette méthode
sur nos échantillons du lait nous devons tout d’abords l’optimiser. Alors, 36 antibiotiques qui
ont les mêmes valeurs de LMR dans le lait et la viande, ou bien des valeurs de LMR plus
basses dans le lait que la viande (Commission Regulation, 2010) parmi les 59 sont
sélectionnés. La sélection de la meilleure méthode pour l’extraction des résidus
d’antibiotiques dans le lait est basée sur la comparaison entre quatre protocoles d’extraction
modifiés (tableau 10) dont trois (M1, M2 et M3) sont basées sur la méthode initiale de viande
et M4 sur celle optimisée par Martins et al., (2014) et leurs procédures d’extraction sont
détaillées en dessous. A partir de la comparaison entre les moyennes des rendements obtenus
avec les quatre méthodes, la méthode 3 est sélectionnée comme la meilleure méthode qui sera
validée et présentée dans la partie résultats et discussion (optimisation de la méthode
d’extraction). Un échantillon du lait UHT acheté d’une supérette Belge est utilisé pour
l’analyse par UPLC-MS/MS.

Méthode 1

Dans cette méthode les mêmes paramètres que la méthode initiale de la viande sont respectés,
3 g d'échantillons (un blanc et deux contrôles) sont pesés dans des tubes Falcon® de 50 mL.
Puis, 150 µL de la solution mixte des standards internes à 1LMR (Commission Regulation,
2377/ 1990), 200 µL d’EDTA 0.1 M, 7 mL du mélange méthanol/acétonitrile et 3g de sulfate
de sodium anhydre sont ajoutés. Parallèlement, 75µL de chaque solution mixte des standards
à 1LMR (macrolides-tétracyclines), (sulfamides- quinolones) et (pénicillines), comme citées
auparavant; sont ajoutés aux échantillons de contrôles afin d’obtenir des niveaux
correspondants à 0.5 LMR. Après, les échantillons sont agités au vortex à la vitesse maximale
pendant 1 minute et centrifugés à 10000 t/min pendant 10 minutes. Un volume de 5ml de
surnageant est transvasé dans un tube de 10 mL et évaporé à sec à 40 °C sous azote. 300 µL
d’eau MilliQ sont rajoutés dans les tubes après évaporation, Agités au vortex quelques
secondes et transférés dans des cupules eppendorf de 1.5mL pour une ultracentrifugation à
12000t/min pendant 30 min. Le surnageant est filtré avec une seringue de 2 mL surmontée

43
Chapitre III Matériel et méthodes

d’un filtre de 0.2 µm dans une fiole pour injection UPLC. Les extraits contenants les
antibiotiques sont prêts pour l’analyse par UPLC-MS/MS.
Méthode 2

Dans cette méthode un volume de 10g au lieu de 3g est utilisé. 10g d’échantillons (un blanc et
deux contrôles) sont pesés et le reste de la procédure est exactement comme présenté dans la
méthode 1.

Méthode 3

Dans cette méthode les volumes des solvants et des standards utilisés sont adaptés avec le
volume du lait. 10 g d'échantillons (un blanc et deux contrôles) sont pesés dans des tubes
Falcon® de 50 mL. Ensuite, 500 µL de la solution mixte des standards internes à 1LMR, 667
µL d’EDTA 0.1 M, 23 mL du mélange méthanol/acétonitrile et 3g de sulfate de sodium
anhydre sont ajoutés. Après, 250µL de chaque solution mixte des standards à 1LMR comme
précédemment citées sont ajoutés aux échantillons de contrôles afin d’obtenir des niveaux
correspondants à 0.5 LMR. Le reste de la procédure est exactement comme expliqué dans la
méthode 1.

Méthode 4

Un volume de 0.5g d'échantillons (un blanc et deux contrôles) est pesé dans des cupules
eppendorf de 2 mL. Ensuite, 12.5 µl de la solution mixte des standards internes à 1LMR,
30µL d’EDTA 0.1 M sont ajoutés. Subséquemment, 12.5 µL de chaque solution mixte des
standards à 1LMR sont ajoutés aux échantillons de contrôles afin d’obtenir des niveaux
correspondants à 0.5 EU LMR. Le reste de la procédure est exactement comme décrit par
Martins et al., (2014). Les échantillons sont agités au vortex pendant (10s) et équilibrés à
l’abri de lumière pendant 10 min. Après, une solution de déprotéinisation (0.6ml d’éthanol:
acide acétique, 96:4 v: v) est ajoutée. Les échantillons sont agités au vortex pour quelques
secondes, congelés à (-18°c) pendant 30 min et après centrifugés à 12000 t/min pendant
30min. Finalement, 0.75mL de surnageant est transvasé dans une fiole pour injection UPLC et
dans l’ordre de compléter le volume à 1.0 mL, une solution composée d’acide formique (0.1%
dans l’eau) et d’acide formique (0.1%) dans l’acétonitrile (98 :2) est ajoutée. Un volume de 10
µL est injecté dans le système LC-MS/MS.

44
 Chapitre III Matériel et méthodes

Tableau 10: Résumé de comparaison entre les protocoles des quatre méthodes d’extraction.

étapes d’extraction Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3 Méthode 4

(Martins et al, 2014)

1) Quantité d’échantillon 3g 10g 10g 0.5g

2) Type de récipient 50mL Falcon tube 2mL Eppendorf

3) Solution mixte des standards internes, 1LMR 150µL 150µL 500µL 12.5µL
(EU2377/90)
4) EDTA, 0.1M 200µL 200µL 667µL 30µL

5) mixte methanol/acetonitrile 7mL 7mL 23mL /

6) Sodium sulfate anhydride 3g 3g 3g /

7) Solution mixtes des standards* 75µL 75µL 250µL 12.5µL

8) Agitation par vortex 1min 10s et équilibration pendant 10min à l’abri de

lumière

9) Centrifugation 10000t/min, 10min à 4°C /

10) Déprotéinisation / 0.6mL

Ethanol/acide acétique (96/4)

Suivie par une courte agitation et incubation à -

18°C pendant30min

45
 Chapitre III Matériel et méthodes

étapes d’extraction Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3 Méthode 4

11) Surnageant 5mL évaporé à sec à 40°C suivi par ajout de 300 µL /
d’eau MilliQ

12) Agitation et centrifugation quelques secondes

12000t/min pendant 30min

Tout le surnageant 0.75mL avec addition de 0.25mL

13) Surnageant
Acide Formique 0.1% dans

L’eau/ acide formique

dans l’acétonitrile (98:2)

14) Filtration filtres 0.2µm /

(suite tab 10)

* solution standard mixtes contiennent: Sulfamides (sulfapyridine, sulfamethoxypyridazine, sulfadoxine, sulfadimidine, sulfamonomethoxine, sulfaquinoxaline, sulfaquinoxaline, sulfamoxole, sulfachlorpyridazine, sulfadimethoxine,
sulfaquinoxaline, sulfathiazole, sulfaguanidine, triméthoprime, sulfamerazine, sulfamethoxazole, Sulfadiazine, sulfacetamide, sulfisoxazole), pénicillines (amoxicilline, ampicilline, pénicilline V, pénicilline G, dicloxacillin, cloxacilline, oxacilline,
nafcilline) quinolones (fluméquine, difloxacin, sarafloxacin, ciprofloxacine, enrofloxacin, danofloxacin, acide nalidixique, marbofloxacine, norfloxacine, ofloxacine, acide oxolinique), macrolides (érythromycine, spiramycine, josamycine,
clindamycine, lincomycine, neospyramycine, tilmicosine, tylosine, tylvalosine, tulatrhomycine), tétracyclines (doxycycline , oxytétracycline ,4-epi- chlorotétracycline, 4-epi-oxytétracycline, 4-epi- tétracycline, tétracycline, chlorotétracycline)

46
Chapitre III Matériel et méthodes

[Link]. Validation de la méthode d’extraction

Une validation de la méthode choisie est réalisée pour tous les antibiotiques présentés dans le
tableau 20 (partie résultats et discussion; validation de la méthode d’extraction) selon la
commission européenne (Commission Decision, 2002) en déterminant: La
spécificité/sélectivité, La capacité de détection CCβ, la linéarité et l’applicabilité. Le même
échantillon de lait (confirmé négatif aux résidus d’antibiotiques lors l’optimisation) est utilisé
comme échantillon blanc pour la validation.
Pour déterminer la spécificité de la méthode proposée, une série des extraits des échantillons
blancs de lait (n=20) avec un échantillon de lait fortifié à 0.5 LMR est analysée par UPLC-
MS/MS sur un seul jour. La spécificité est démontrée par l’absence de pics aux temps de
rétention des analytes dans des échantillons extraits à blanc. Ces derniers sont considérés
comme faux positifs lorsqu’ils répondent aux critères suivant: le rapport signal/bruit est
supérieur ou égale à 3 (S/N=3), le temps de rétention relatif (RRT) de l’échantillon de lait
blanc est équivalent à celui de l’échantillon de lait fortifié et ayant une aire supérieur à 1% de
l’aire du pic de l’échantillon du lait fortifié pour toutes les molécules d’antibiotiques
analysées. La sélectivité de la méthode est garantie par le suivi d’une transition multi-reaction
monitoring (MRM) par molécule en UPLC-MS-MS et le temps de rétention relatif.
La Capacité de détection CCβ correspond à la concentration au-delà de laquelle on peut
conclure que la substance est détectée avec une certitude de 95%. 20 blancs de lait sont
fortifiés à un seul niveau de concentration, soit à la 0.5 LMR. Ces extraits sont analysés sur un
seul jour avec une solution des standards à 1LMR. Les critères d’identifications sont:
Premièrement, le temps de rétention relatif (RRT) de l’échantillon suspect doit être dans un
range de ± 2.5% autour du RRT de la solution des standards soit:
0.75*RRT<RRT>1.025*RRT par comparaison avec le RRT du standard. Deuxièmement, le
rapport du signal/bruit (S/N) de l’ion fille doit être supérieur ou égale à 10. Troisièmement, la
concentration pour fixer la limite de détection, à savoir 0.5 LMR doit avoir au-moins 95% de
vrais positifs avec un S/N>10.
Afin d’obtenir une courbe linéaire de calibration à 5 points; une gamme de 5 solutions des
standards (tableau 11) est injectée en même temps avec les échantillons de lait extraits par les
4 différentes méthodes d’extraction (tableau 10). Ces solutions sont préparées en utilisant trois
mélanges des standards d'antibiotiques à 1LMR avec un volume spécifique pour chaque
concentration. Les mélange des (Macrolides - Tétracyclines) et (Sulfamides - Quinolones)
sont déposés dans des fioles à UPLC d'injection. Puis, un volume spécifique pour chaque

47
Chapitre III Matériel et méthodes

concentration de la solution des standards internes est ajouté et les solutions intermédiaires
obtenues sont évaporées à la sécheresse sous azote à 40°c. Les volumes spécifiques du
mélange des Pénicillines et de l'eau MilliQ sont ajoutés pour obtenir des solutions finales à
300µL avec les concentrations de 250, 500, 1000, 1500 et 2000 µg/L respectivement. La
linéarité est évaluée en vérifiant le coefficient de corrélation de tous les antibiotiques utilisés
pour la validation et qui doit être autour de 0.99. Parallèlement, l’applicabilité de la présente
méthode est évaluée en analysant les (194) échantillons de lait collectés.

Tableau 11: Concentrations des solutions des standards d’antibiotiques utilisées pour obtenir la
courbe de calibration. (µg/L)

Différents niveaux de concentrations

Etapes de préparation et
solutions utilisées 1/4 LMR 1/2LMR 1LMR 1.5LMR 2LMR

Macrolides-Tétracyclines 37.5 75 150 225 300

(µL)

Sulfamides-Quinolones 37.5 75 150 225 300

(µL)

standards internes (µL) 150 150 150 150 150

volume Intermédiaire 225 300 450 600 750

(µL)

Pénicillines (µL) 37.5 75 150 225 300

Eau MilliQ (µL) 262.5 225 150 75 0

volume Final (µL) 300 300 300 300 300

Concentration Finale 250 500 1000 1500 2000

(µg/L)

48
Chapitre III Matériel et méthodes

2.3.4. Extraction des échantillons de lait à analyser

Pour extraire les résidus d’antibiotiques de 194 échantillons de lait collectés en Algérie, nous
avons utilisé la méthode 3 optimisée et validée en cours de l’étude. Avant de commencer les
étapes de l’extraction, il faut tout d’abord s’assurer de la bonne décongélation de lait et son
homogénéisation. Chaque série à analyser doit comporter un échantillon blanc réactif (BR),
un échantillon blanc matrice (témoin négatif), un échantillon fortifié (témoin positif), une
solution des standards à 1LMR (avec les autres concentrations de calibration), de l’eau et les
échantillons du lait à analyser. Ces échantillons sont préparés comme suit :

-Standard à 1 LMR: Dans une fiole UPLC, prélever 150 µl de solution mixte à 1 MRL de
(Tétracyclines + Macrolides) et (sulfamides+ quinolones) et 150 µl de la solution mixte des
standards internes SI à 1 LMR, évaporer à sec sous azote et rajouter 150 µl de la solution
mixte de pénicillines à 1LMR et 150 µl d’eau.

-Traitement du blanc réactif (BR): Suivre la procédure d’extraction du lait par méthode 3, en
n’utilisant que les réactifs (pas de matrice).

-Traitement du blanc matrice: Préparer un échantillon négatif et lui faire suivre la procédure
d’extraction du lait par méthode 3 sans addition des solutions mixtes des standards.

-Traitement de l’échantillon fortifié (½ LMR): Préparer un échantillon négatif et ajouter 250

µl de chaque solution mixte à 1 LMR (Tétracyclines + Macrolides), (sulfamides+ quinolones)
et pénicillines et 500 µl de la solution mixte des standards internes à 1 LMR.

-Traitement de l’échantillon du lait à analyser : Préparer un échantillon et lui faire suivre la

procédure d’extraction du lait par méthode 3 sans addition des solutions mixtes des standards.

2.3.5. Le dosage par UPLC/MS-MS

L’analyse par UPLC est réalisée en utilisant un Acquity sample et solvant manager (Waters,
Milford, MA, USA). La séparation chromatographique est achevée en utilisant une colonne
Acquity pour UPLC C18 2.1×100mm 1.7µ (Waters, Millford, MA, USA) à 30°C avec une
phase mobile composée de 0.1 mM acide oxalique, 0.1% acide formique comme solution A et
acétonitrile 0.1% acide formique comme solution B à un flux constant de 0.4mL min-1. Le
programme du gradient d’élution utilisé est initialement de 98% de la solution A diminuant à
2% pendant 10.5 min (0 -10.5 min). Après, la composition est retournée aux niveaux initial A:

49
Chapitre III Matériel et méthodes

B (98 : 2) dans un temps de (10.5-12.5). Le temps de run total est de 12.5 min. Ainsi, qu’un
triple quadripôle spectromètre de masse (XEVO TQ MS) est utilisé (Waters, Millford MA, les
USA), opérant dans l'ionisation éléctrospray positive (ESI), le mode MS/MS est utilisé pour la
détection. Les données sont contrôlées et évaluées par le logiciel MassLynx (la version 4.1).
La réaction choisie contrôlant le mode (MRM) est utilisée et les paramètres suivants sont
appliqués: capillarité, 3kV; cône 15 V; extracteur, 3.00V; source température, 150°C;
température de désolvatation, 500°C, flux de gaz de cône, 80Lh-1; flux de gaz à
désolvatation, 1000Lh-1; le flux de gaz de collision, 0.16 ml/min, la résolution (LM1, HM1,
LM2, HM2 où LM est la basse masse et HM est la haute masse, 2.7, 15, 2.8, 14.8; énergie
d'ion (1 et 2), 0.3, 0.6; multiplicateur 546.52V. Les paramètres de transition de spectrométrie
de masse, de tension de cône (V), d'énergie de collision (eV) pour tous les résidus
d’antibiotiques analysés dans les échantillons de lait sont présentés dans le tableau 12.

Tableau 12: Les paramètres de la spectrométrie de Masse utilisés pour la détection des résidus
d’antibiotiques dans le lait

Analyte Transition Tension de Energie de

Cone (V) Collision (eV)

Amoxicilline 366 > 114 10 20

ampicilline 350 > 106.1 30 20

Chlorotétracycline 479.1 > 302.8 30 40

cloxacilline 436.24 > 160. 30 10

dicloxacilline 469.9 > 160.1 30 10

enrofloxacine 360.4 > 341.9 30 20

érythromycine 734.4 > 576.6 30 20

fluméquine 262.1 > 244 30 20

marbofloxacine 363.26 > 72 30 20

Nafcilline 415 > 199 30 10

neospyramycine 699.4 > 174.2 30 20

Oxytétracycline+4-epi- 461.1 > 443.1 30 10

Oxytétracycline

oxacilline 402.2 > 243.3 15 10

50
Chapitre III Matériel et méthodes

Analyte Transition Tension de Energie de

Cone (V) Collision (eV)

pénicilline G 335.1 > 176.1 30 10

spiramycine 843.6 > 174.4 30 40

sulfacetamide 215.2 > 156 30 10

sulfachloropyridazine 285 > 155.8 25 15

sulfadiazine 251 > 108 30 20

sulfadimethoxine 311.1 > 156 30 20

Sulfadimidine 279.2 > 155.9 30 20

Sulfadoxine 311.2 > 155.9 30 20

Sulfaguanidine 215.1 > 156 25 15

Sulfamerazine 265.1 > 155.9 30 20

Sulfamethizole 271.1 > 107.8 30 20

sulfamethoxazole 254.1 > 108.1 30 20

sulfamethoxypyridazine 281 > 155.7 30 15

Sulfamonomethoxine 281.2 > 155.9 30 20

Sulfamoxole 268.2 > 155.9 30 10

Sulfapyridine 250.1 > 184 30 20

Sulfaquinoxaline 301.2 > 107.7 30 20

Sulfathiazole 256.1 > 107.7 30 30

sulfisoxazole 268.1 > 156.2 30 10

Tétracycline+4-epi- 445.1 > 410.1 30 20

tétracycline

tilmicosine 869.8 > 174.1 65 45

Tylosine 916.6 > 127.2 30 40

triméthoprime 291.3 > 230.3 60 20

(Suite tab 12)

51
Chapitre III Matériel et méthodes

Les conditions et les étapes d’analyse des extraits des échantillons par UPLC-MS/MS sont

détaillées en dessous:

-Les appareils y compris le PC restent toujours sous tension

- Chargement de la liste d’échantillons et du projet

-Création d’une nouvelle liste d’échantillons à analyser

-Installation de la colonne UPLC : il faut placer la colonne C18 2.1×100mm 1.7µ spécifique
aux multi- résidus d’antibiotiques.

-Pompe binaire : Installation des bouteilles contenant les composants de la phase

mobile comme suit:

- vanne A1 : 0.1 mM acide oxalique (+ 0.1 % acide formique)

- vanne B1 : acétonitrile (+ 0.1 % acide formique)
- vanne A2 : eau/acétonitrile (90/10, v/v)
- vanne B2 : acétonitrile pur

-Allumage de MS tune: XEVO TQ MS triple quadripôle mass spectromètre est utilisé. Il faut
s’assurer que le mode d’ionisation est bien en electrospray positif (ES+)

-Purge des lignes : les solutions A1 et B1 sont utilisées pour purger les lignes de toutes
impuretés présentes dans le circuit pendant 5min.

- Conditionnement de la colonne :

Il faut s’assurer que la température de la colonne est de 30°c, fixer le débit à 0.4mL/min et les
pourcentages des solutions A1 à 98% et B1 à 2% et faites lancer le conditionnement. Il faut
attendre que la pression se stabilise (environ 10000 psi) et passer au démarrage de la
séquence.

-Démarrage d’une séquence :

Avant de démarrer une séquence il faut s’assurer que tout est en ordre pour la liste qui fait
l’objet d’une injection et les extraits des échantillons à analyser. En premier lieu il faut
injecter deux fois la solution du standard d’antibiotique pour stabiliser les temps de rétention
avant de lancer l’analyse et temps de run est de 12.5 min (tableau 13)

52
Chapitre III Matériel et méthodes

Tableau 13: programme du gradient d’élution

Temps A1% B1% Flux ml/min Curve

0 98 2 0.4
10 35 65 0.4 6
10.5 98 2 0.4 6

- Rinçage : A la fin de chaque analyse il faut mettre de l’eau pour rincer la colonne pendant
21 min.

-Collecte et traitement des données : les données sont contrôlées et évaluées par le logiciel
MassLynx (version 4.1). Les chromatogrammes sont vérifiés et une réintégration des pics
obtenus aux temps de rétention spécifiques pour toutes les molécules d’antibiotiques
recherchées pour chaque échantillon analysé est réalisée.

2.3.6. L’évaluation de la stabilité des antibiotiques dans le lait

Comme le lait utilisé pour la production du lben est abandonné à lui-même jusqu'à sa
coagulation à une température ambiante pendant 24h à 48h selon la saison, nous avons essayé
de chercher si les antibiotiques restent stables dans différentes conditions de conservation
comme la durée et la température. Par conséquent, l’échantillon du lait utilisé comme matériel
d’analyse est le même échantillon utilisé lors l’optimisation. Il est utilisé comme contrôle
négatif (n=2), ou enrichi (n =3). L'enrichissement est fait à 0.5 LMR comme prescrit pour des
matrices de viande (Commission Regulation, 1990) avec les mélanges des solutions standards
d’antibiotiques des sulfamides, des pénicillines, des quinolones, des macrolides et des
tétracyclines. Les échantillons sont extraits selon la méthode 3 et stockés à des températures
de conservation différentes (4°C, 21 °C et -20°C) et testés à un temps différent (les jours 0, 2,
7, 30,60 et 90). L'analyse est exécutée utilisant LC-MS/MS. D'abord les valeurs initiales sont
déterminées le premier jour d'extraction (le jour 0). Après cela, les échantillons stockés à 4 et
à 21°C sont analysés le deuxième jour j2 et le septième jour j7 de stockage. 6 échantillons
supplémentaires fortifiés et qui sont conservés à 21°C pendant 7 jours sont placé directement
à -20°C et analysés après 1mois, 2 mois et 3 mois de conservation. Certaines de ces
conditions de stockage ont surestimé le transport des échantillons de l'Algérie à la Belgique
aussi bien que des pratiques possibles en Algérie. Ces données ont aussi servi pour
l'évaluation de la stabilité des antibiotiques.

53
Chapitre III Matériel et méthodes

3. L’analyse Statistique

Afin de choisir la méthode d'extraction la plus appropriée; les méthodes analytiques sont
comparées sur la base des rendements suffisants pour la détection et seulement pour les
antibiotiques ayant des niveaux inférieurs de LMR dans le lait que dans la viande. Le dernier
est défini comme le rapport de LMR dans le lait sur LMR dans la viande inférieur ou égal à
0.5. De plus, l'analyse statistique des résultats de rendement obtenus avec les quatre méthodes
est exécutée appliquant le test ANOVA pondéré à deux facteurs avec répétition (n=2) utilisant
S-Plus 8.0 pour Linux (Tibco, Palo Alto, CA, les États-Unis). Le premier facteur est la
méthode utilisée et le deuxième est le type d'antibiotique. En même temps, l'interaction entre
ces deux facteurs est aussi étudiée. Comme cette dernière est significative, la comparaison
entre les quatre méthodes est faite par chaque antibiotique et corrigée pour le test d'hypothèse
simultané selon Sidak (1967).

Un modèle linéaire généralisé pour des données binomiales distribuées est convenable pour
modeler la fréquence des résultats positifs de l’UPLC-MS/MS et Delvotest SP-NT utilisant le
lien de logique. Ces résultats sont contrastés entre les différents types de lait rassemblés aux
fermes et aux points de vente. Particulièrement le type de lait est considéré comme un facteur
fixe, tandis que, la ferme et les points de vente sont des aléatoires. Aussi, la comparaison entre
les différents types de lait est évaluée et les valeurs de P sont corrigées pour le test
d'hypothèse simultané, selon Tukey. Pour des raisons de corrélation, les résultats des résidus
examinés (sans LMR et non-autorisé) utilisant UPLC-MS/MS sont considérés comme
positifs.

L'accord entre les deux tests est calculé utilisant kappa de Cohen et sa valeur de P associée.
De plus, comme le Delvotest SP-NT manque de spécificité, une liste d'antibiotiques est mise
contenant les résultats positifs de l’UPLC-MS/MS et ceux pour lesquels il y a plus de négatifs
que positifs avec Delvotest SP-NT.

54
Chapitre IV : Résultats et
discussion
Chapitre IV Résultats et discussion

1. Résultats des questionnaires utilisés pour la collecte des données auprès des fermes et

points de ventes :

 Fermes A et B
Le changement de la voie d’administration peut modifier la concentration d’antibiotique
retrouvée dans le lait et la durée de son élimination. D’une manière générale, la voie
mammaire entraîne une durée d’excrétion beaucoup plus longue que la voie intramusculaire
pour un même produit et sa concentration dans le lait est beaucoup plus importante (Brouillet,
1994 ; Fabre et al., 2006). Cependant, les voies parentérales sont également sources de
contamination du lait et ne doivent pas être négligées en raison des hautes doses
habituellement utilisées (Labie, 1981). Sur terrain, les vétérinaires ou bien les praticiens des
deux fermes possèdent des registres dans lesquelles tous traitements appliqués sur les vaches
sont enregistrés. Les antibiotiques sont administrés aux vaches malades par deux voies
principales, soit par injection intra- mammaire ou bien intramusculaire. Les familles
d’antibiotiques les plus utilisées par les vétérinaires des deux fermes sont: Les pénicillines, les
tétracyclines, les macrolides et les sulfamides dont le délai d’attente pour une livraison du lait
après traitement varie de 2 à 7 jours (tableau 14).
Tableau 14: Exemple de la fiche de renseignement de certains prélèvements provenant des vaches
traitées.

Numéros date de date de Durée Voie de Antibiotiques Nom de

de vache traitement prélèvement d'attente traitement utilisés Ferme
Oxyspein
06004 09/12/2013 16/12/2013 7jours injection IM B
(oxytétracycline)
Sulfaprim
06004 12/11/2013 20/11/2013 2jours injection IM (sulfadiazine avec B
triméthoprime)
06004 21/11/2013 02/12/2013 7jours injection IM Oxytétracycline B
14914 7 /11/2013 13/11/2013 7jours injection IM Terramycine A

Selon l’enquête effectuée par Boultif, (2015) à Constantine, les antibiotiques utilisés pour le
traitement des mammites par voie intra-mammaire sont par ordre décroissant: les tétracyclines
(55%), les bétalactamines (33%), les macrolides (9.67%) et enfin les sulfamides (3.22%).
Ainsi, pour le traitement des mammites par voie générale, presque les mêmes molécules sont
retrouvées: les bétalactamine (46.5%), les tétracyclines (26%), les macrolides (22.5%) et enfin
les sulfamides (8.69 %). Effectivement, pour le traitement des pathologies respiratoires sont:
les tétracyclines (44%), les bétalactamines (43,5 %), les macrolides (43%), les

55
Chapitre IV Résultats et discussion

céphalosporines (22%). En ce qui concerne le délai d’attente, tous les vétérinaires interrogés
indiquent que les éleveurs ne respectent presque pas les délais d’attente préconisés, au cours
des traitements antibiotiques instaurés.

 Points de ventes
La plupart des vendeurs ignorent les origines de leur lait. D'autres ont mentionné qu'il
provient des éleveurs des vaches privés, des collecteurs de lait privés, des distributeurs des
usines de lait (tel que usine SAFIA de Guelma et usine inconnue de Soukahras) et des fermes
privées ou étatiques à Guelma.

56
Chapitre IV Résultats et discussion

2. Résultats de l’analyse de résidus d’antibiotiques par test d’inhibition microbiologique

Delvotest SP-NT

2.1. Résultats des échantillons collectés des deux Fermes A et B

Parmi les 127 échantillons analysés, nous avons constaté que 34 échantillons ont été trouvés
positifs à un pourcentage de (26.77%), 59 ont été trouvés négatifs à un pourcentage de
(46.45%) et 34 ont été considérés comme douteux avec un pourcentage de (26.77%). Les
résultats des différents types de lait analysés pour les deux fermes sont détaillés dans le
tableau suivant (tableau 15).

Tableau 15: Les résultats obtenus avec Delvotest SP-NT pour chaque type de lait analysé collecté des
deux fermes.

Fermes Types de lait Positifs négatifs douteux

Lait de vaches saines 8 7 13

Ferme A Lait de vaches traitées 6 2 0

Lait de Tank 1 16 0

7 19 18
Lait de vaches saines
Ferme B 10 5 3
Lait de vaches traitées
2 10 0
Lait de Tank
Total 34 59 34

Pourcentage (%) 26.77 46.45 26.77

2.2. Résultats des échantillons collectés à partir des points de vente

L’analyse de 27 échantillons de lben et de lait de vache cru collectés à partir de plusieurs

points de vente a révélé que 5 échantillons ont été trouvés positifs à un pourcentage de
(18.51%), 21 ont été trouvés négatifs à un pourcentage de (77.77%) et qu’un seul échantillon
a été considéré comme douteux avec un pourcentage de (3.70%) (tableau 16).

57
Chapitre IV Résultats et discussion

Tableau 16: Les résultats de Delvotest SP-NT obtenus pour les échantillons collectés des différents
points de vente.

Points de vente Lait de vache cru Lait de vache fermenté (lben)

Douteux 0 1

Négatif 10 11

Positif 2 3

Total 12 15

Après que l'échantillon de lait soit déposé sur la gélose des ampoules Delvotest SP-NT, une
incubation est parcourue pendant 3h à 64°C±1°C. Durant l'incubation; le métabolisme
microbien aboutira à un changement de pH et par conséquent un changement de la couleur
violette en jaune. Donc, une ampoule jaune après l'incubation indique un échantillon négatif.
En revanche, si l'échantillon contient suffisamment hautes concentrations de substances
inhibitrices, la couleur reste pourpre indiquant un résultat positif (Stead et al., 2008). Lorsque
la couleur est intermédiaire, le résultat est considéré douteux (figure 11).

Figure 11: Exemples des résultats positifs (mauve), négatifs (jaune) et douteux après analyse par
Delvotest SP-NT

La fréquence des résultats positifs obtenus pour chaque type du lait testé par Delvotest SP-
NT, est calculée en utilisant le test statistique « un modèle généralisé pour des données
binomiales distribuées utilisant le lien de logique » ainsi qu’une comparaison entre ces
résultats est effectuée selon Tukey. (tableau 17).

58
Chapitre IV Résultats et discussion

Tableau 17: Comparaison entre les résultats des différents types de lait analysés par Delvotest SP-
NT.

Lait de Lait de Lait de vache cru

Lait de vaches vaches points de vente Lait de vache fermenté
tank saines traitées points de vente (Lben)

Delvotest 26 26 7 10 11
négatif
Delvotest 0 31 3 0 1
douteux
Delvotest 3 15 16 2 3
positif
% Delvotest
positif 10.3b 20.8b 61.5ac 16.7bc 20bc
Les groupes avec les mêmes lettres en haut ne diffèrent pas significativement au niveau de 0.05.

Parmi les 154 échantillons analysés dans cette étude, 39 ont été trouvés positifs à un
pourcentage de 25.3% du total. A partir des résultats présentés dans le tableau ci- dessus, nous
avons constaté que les niveaux les plus élevés de contamination par les résidus d’antibiotiques
sont observés dans les échantillons du lait collectés à partir des vaches traitées (61.5%), suivi
par le lait individuel des vaches saines et le lait du lben collecté auprès des points de vente.
Tandis qu’une faible contamination a été marquée dans les échantillons de lait de vache cru
(points de vente) et celui de tank. Par conséquent, une différence hautement significative a été
notée avec (P< 0.01) entre le groupe du lait de vaches traitées et ceux des vaches saines et de
collecte (tank).
Le contrôle d’un grand nombre d'échantillons du lait pour la présence de résidus
d’antibiotiques à des niveaux conformément à la législation communautaire exige le prix bas
des méthodes d’analyse. En pratique, il est principalement exécuté utilisant des méthodes de
dépistage microbiologiques, à cause de leur haute rentabilité comparée à la détection physico-
chimique. En général, ces méthodes peuvent être utilisées: sans aucune formation spéciale, ne
dépendent pas d’équipement spécialisé et ciblent un large spectre de résidus antimicrobiens
dans une analyse à la fois (Pikkemaata et al., 2009).
Les tests les plus commercialisés et largement utilisés sont les tests d'inhibition
microbiologique tels que Delvotest SP-NT, Copan Test, Charm Farm-960 Test et autres
(Ramirez et al., 2003 ; Žvirdauskienė et Šalomskienė, 2007). Dans cette étude, Delvotest SP-
NT a été utilisé pour l'évaluation de résidus d’antibiotiques dans des échantillons du lait

59
Chapitre IV Résultats et discussion

rassemblés à Guelma (Algérie). C’est un nouveau test qui a été développé sur la base du
Delvotest SP et Delvotest Milk Control Stations (MCS) mais avec une incorporation précoce
des nutriments dans l’agar. Ainsi, qu’il consiste en ampoules de gélose ou des microplaques
contenant les spores de Bacillus stearothermophillus var. calidolactis et la substance nutritive.
Lorsque le lait est déposé sur gélose et les ampoules sont incubées, les spores germent et
produisent l'acide carbonique. Ce dernier force l'indicateur pourpre de bromocresol dans
l'ampoule à changer la couleur de pourpre à jaune. En revanche, la présence d'agents
antimicrobiens inhibe la croissance de bactéries et la couleur de la gélose dans l'ampoule reste
pourpre. Ce test peut détecter une vaste gamme de substances antimicrobiennes à des niveaux
de concentration différents (Le Breton et al., 2007).
Comme la limitation principale de ceci et d'autres essais microbiens semblables, le manque de
spécificité est d'habitude assumée (Bilandzic et al., 2011). Particulièrement, pour une lecture
visuelle de Delvotest SP-NT, des couleurs pourpres et jaunes sont faciles à déterminer.
Cependant, une évaluation visuelle d'échantillons contenant des concentrations intermédiaires
d'antibiotiques est plus difficile, même pour les techniciens expérimentés ce qui rend le
jugement visuel de la réaction colorée comme dans Delvotest SP-NT subjectif (Suhren et
Luitz, 1995; Stead et al., 2008). Dans tels échantillons, le test montre souvent un nuage de
pourpre dans une couleur de jaune indiquant un résultat positif suspect. De plus, les différents
types de lait et les différents modes d'action de composés antimicrobiens peuvent mener aux
couleurs différentes dans le test, faisant l'interprétation plus difficile (Stead et al., 2008). À
son tour, ceci rend Delvotest SP-NT moins approprié pour des analyses décisives laissant la
place pour des résultats discutables. Une autre explication pourrait être que des réactions
fausses positives avec Delvotest SP-NT peuvent arriver dans des échantillons de lait des
vaches qui ont été récemment en vêlage en raison du fait que les inhibiteurs naturels et la
traite incomplète pourraient être responsables de la réaction positive (Hillerton et al., 1998).
Peu d'études ont été exécutées en Algérie sur la présence de résidus d’antibiotiques dans le
lait. Hakem et al., (2012) n’ont trouvé aucune contamination dans le lait cru collecter de deux
fermes laitières à Mitidja en utilisant Delvotest SP NT. Cependant, dans la présente étude,
autour de 10% des échantillons de lait de tank et 20% des échantillons du lait de vaches non
traitées ont été trouvés positifs. Ce dernier est plus haut que la fréquence de contamination à
Alger (9.87%) indiqué par Ben Mahdi et Ouslimani, (2009). D'autres auteurs, Zinedine et al.,
(2007) au Maroc, Tarzaali et al., (2008) à Mitidja, Aggad et al., (2009) à l'ouest de l'Algérie et
Titouche et al., (2013) à Tizi-Ouzu, ont rapporté des fréquences des échantillons du lait
positifs plus supérieures (57%, 89%, 29% et 46%, respectivement). De même, les fréquences

60
Chapitre IV Résultats et discussion

(40%) et (50%) des échantillons positifs du lait de tank dans une étude en Serbie (Petrovic et
al., 2008) et une autre au Bénin (Mensah et al., 2014b) successivement sont supérieures à la
nôtre. Aussi, nos résultats obtenus pour le lait de vache cru des points de vente sont
comparables avec ceux trouvés dans une étude en Iran (19.78%) (Aalipour et al., 2015).
Néanmoins, notre niveau de contamination du lait de vache fermenté (lben) commercialisé est
inférieur à celui atténué pour le lait du raib (50%) dans l'étude de Zinedine et al., (2007) au
Maroc.

Comme, Delvotest SP-NT et les autres méthodes microbiologiques utilisées pour le premier
dépistage de la présence de résidus d’antibiotiques ne donnent pas un résultat définitif sur
l’identité et la quantité de l’antibiotique présent (Holstage et al., 2002 ; Appicciafuoco et al.,
2015), cela rend ces méthodes moins spécifiques et exigent donc l’utilisation d’autres
méthodes beaucoup plus complexes. L’une de ces techniques qui a été choisie est l’UPLC-
MS/MS.

61
Chapitre IV Résultats et discussion

3. Résultats de l’analyse multi-résidus d’antibiotiques dans le lait par UPLC-MS/MS

3.1. Résultats de l’optimisation et validation de la méthode d’extraction

3.1.1. Optimisation de la méthode d’extraction

La principale condition pour une méthode de détection fiable est de détecter les substances
autorisées au-delà des limites LMR, et interdites à des niveaux de MRPL (la limite minimale
requise de performance) en minimisant les résultats faux négatifs. Les méthodes doivent être
spécifiques et sensibles assez pour détecter des niveaux bas, prenant en compte la complexité
d'obtenir une bonne récupération de tous les composés avec des propriétés physicochimiques
distinctes (Freitas et al., 2013). Selon la commission décision, (2002), le rendement (recovery
en anglais) est l’un des exigences générales des méthodes analytiques. C’est pour cette raison
et afin de sélectionner la meilleure méthode pour l’extraction des résidus d’antibiotiques dans
le lait; les moyennes des rendements des quatre méthodes ont été comparées et une évaluation
statistique des résultats a été utilisée. La comparaison avec ANOVA a été limitée aux
antibiotiques (11 antibiotiques) qui ont une limite dans le lait inférieure à celle dans la viande
(le rapport entre LMR est inférieur ou égale à 0.5). A partir de l’exploration graphique (figure
12), nous avons constaté que les deux méthodes M4 et M3 ont donné des rendements qui sont
supérieurs aux autres méthodes M2 et M1. Par conséquent, il est important de contrôler si ces
différences s'expriment pour tous les antibiotiques. Si c'est le cas, on peut comparer les
méthodes par antibiotiques. Sinon, on doit se limiter à une comparaison entre les méthodes
par chaque antibiotique.

Figure 12: Exploration graphique de rendement (recovery) par méthode, tous les antibiotiques

confondus.

62
Chapitre IV Résultats et discussion

Les lignes dans le graphe ci-dessous (figure 13) connectent les moyennes qui correspondent à
la même molécule d’antibiotique. Seulement si les lignes sont parallèles, il n’y a pas
d’interaction.

Figure 13: Elaboration graphique de rendement par méthode et antibiotique

A partir du graphe nous avons constaté qu’il y’a une interaction, donc la comparaison entre
les méthodes doit être faite par antibiotique. En plus, nous avons réalisé un test d’interaction
en utilisant ANOVA pour une confirmation (tableau 18). Afin de réaliser l’analyse de deux
facteurs, il y’a trois facteurs à considérer: les deux facteurs même (c’est-à-dire, antibiotique et
méthode) en plus, l’interaction entre les deux facteurs. Si l’interaction est significative (c’est-
à-dire, la valeur P est inférieur à 0.05), les valeurs P des facteurs principaux ne devraient pas
être interprété: il faut comparer les groupes d’un facteur par groupe de l’autre facteur.

Tableau 18 : Statistique de confirmation avec ANOVA

Facteur Valeur P

Méthode 0

Antibiotique 0

Interaction entre méthode et antibiotique 0

63
Chapitre IV Résultats et discussion

Comme il y a eu des interactions hautement significatives entre les deux facteurs (méthodes et
antibiotiques), les méthodes ont été comparées entres eux pour chacun des antibiotiques
sélectionnés séparément (tableau 19). Parmi les résultats de comparaison obtenus, les
différences majeures ont été observées entre deux groupes de méthodes. Particulièrement,
parmi les 11 antibiotiques comparés, les rendements de 8 (méthode 1 contre méthode 4) et 7
(méthode 2 contre méthode 3) ont présenté une différence significative (p< 0.05) (plus de
détail est présenté dans l’annexe 01). Ce résultat peut être expliqué par les différences
analytiques des méthodes. La méthode 3 a présenté des niveaux de rendement proches de
100% et plus supérieurs que ceux des autres méthodes. Dans un second lieu, les rendements
les plus bas ont été comparés entre les méthodes pour confirmer que la méthode finale puisse
détecter tous les antibiotiques sélectionnés. Nous avons noté que la méthode 3 a donné des
niveaux supérieurs des rendements pour l’érythromycine et le nafcilline par rapport aux autres
méthodes et les rendements des autres substances sont acceptables pour des raisons de
dépistage (figure 14). C’est pour cette raison la méthode 3 est choisie comme la meilleure
méthode d’extraction qui sera validée et utilisée au cours de cette étude.

64
 Chapitre IV Résultats et discussion

Tableau 19: Tous les paramètres utilisés pour la comparaison entre quatre méthodes (M1, M2, M3 et M4) et la sélection finale de la méthode choisie.

Groupe et type Concentration Moyenne Rec% ± Moyenne Rec% ± Moyenne Rec% ± Moyenne Rec% ± LMR lait LMR viande LMR
d’antibiotique fortifiée STDEV M1 STDEV M2 STDEV M3 STDEV M4 (µg/L) (µg/L) lait/LMR
(µg/L) viande
Macrolides 35,65 ± 2,72 24,50 ± 8,54 73,66 ± 8,33 79,20 ± 6,51
ab a b a
Érythromycine 2000 3,40 ± 0,98 0,67 ± 0,35 20,10 ± 3,77 0,00 ± 0,00 40 200 0,2
Neospyramycine 2500 18,78 ± 1,33 22,14 ± 1,10 70,31 ± 11,95 102,99 ± 3,17 200 200 1
Spiramycine 2500 25,96 ± 3,06 29,07 ± 1,18 53,17 ± 4,80 37,45 ± 2,02 200 200 1
Tilmicosine 500 96,42 ± 2,34 63,54 ± 39,90 171,49 ± 11,93 245,02 ± 27,02 50 50 1
a b a b
Tylosine 1000 33,69 ± 5,89 7,08 ± 0,16 53,23 ± 9,22 10,55 ± 0,35 50 100 0,50
Pénicillines 34,36 ± 2,10 30,36 ± 1,87 72,33 ± 9,17 75,42 ± 7,91
a a b c
Amoxicilline 500 57,08 ± 4,54 69,32 ± 0,38 143,26 ± 25,38 107,28 ± 35,83 4 50 0,08
a a b c
Ampicilline 500 78,19 ± 7,09 104,03 ± 7,99 204,73 ± 26,17 273,58 ± 7,65 4 50 0,08
a a a a
Cloxacillin 30000 1,43 ± 0,12 1,31 ± 0,03 3,05 ± 0,21 5,76 ± 0,49 30 300 0,1
a a ab b
Dicloxacilline 3000 9,13 ± 0,44 6,96 ± 0,09 21,14 ± 2,80 60,03 ± 5,54 30 300 0,1
a a a a
Nafcilline 3000 8,23 ± 0,20 10,69 ± 0,12 18,07 ± 0,39 10,23 ± 0,31 30 300 0,1

Oxacilline 3000 10,99a ± 0,86 11,72a ± 0,27 28,44ab ± 1,39 53,30b ± 2,03 30 300 0,1
a b a b
Pénicilline G 500 75,48 ± 1,44 8,46 ± 4,25 87,64 ± 7,85 17,76 ± 3,53 4 50 0,08
Quinolones 37,05 ± 2,20 26,58 ± 1,62 76,52 ± 1,74 83,07 ± 13,94
Enrofloxacine 500 53,28 ± 3,60 40,40 ± 1,90 110,21 ± 1,22 95,99 ± 19,05 100 100 1
a b a c
Fluméquine 1000 9,05 ± 1,45 0,00 ± 0,00 24,33 ± 0,70 52,72 ± 9,48 50 200 0,25
a a b b
Marbofloxacine 750 48,80 ± 1,55 39,32 ± 2,94 95,02 ± 3,29 100,49 ± 13,30 75 150 0,5
Sulfamides 34,80 ± 1,32 29,49 ± 2,52 94,58 ± 6,43 99,73 ± 9,82
Sulfacetamide 1000 18,54 ± 1,36 14,02 ± 1,57 35,42 ± 8,03 20,53 ± 2,80 100 100 1
Sulfachloropyridazine 1000 38,38 ± 0,48 26,78 ± 3,87 108,43 ± 0,11 132,90 ± 3,87 100 100 1
Sulfadiazine 1000 25,49 ± 2,58 24,09 ± 0,89 58,88 ± 0,63 65,94 ± 3,54 100 100 1
Sulfadimethoxine 1000 14,31 ± 1,46 7,10 ± 0,40 41,56 ± 1,33 85,52 ± 2,47 100 100 1
Sulfadimidine 1000 39,33 ± 0,21 38,29 ± 1,55 114,46 ± 7,31 123,00 ± 9,00 100 100 1

65
 Chapitre IV Résultats et discussion

Groupe et type Concentration Moyenne Rec% ± Moyenne Rec% ± Moyenne Rec% ± Moyenne Rec% ± LMR lait LMR viande LMR
d’antibiotique fortifiée STDEV M1 STDEV M2 STDEV M3 STDEV M4 (µg/L) (µg/L) lait/LMR
(µg/L) viande
Sulfadoxine 1000 30,31 ± 0,74 16,97 ± 2,60 82,33 ± 0,96 153,84 ± 1,11 100 100 1
Sulfaguanidine 1000 18,64 ± 0,12 14,25 ± 0,14 39,51 ± 7,71 26,60 ± 10,07 100 100 1
Sulfamerazine 1000 9,70 ± 1,57 7,65 ± 0,11 39,23 ± 1,08 89,31 ± 11,19 100 100 1
Sulfamethizole 1000 42,44 ± 0,80 55,31 ± 7,74 92,82 ± 1,55 84,97 ± 4,78 100 100 1
Sulfamethoxazole 1000 43,95 ± 6,02 18,70 ± 3,82 127,40 ± 4,92 161,97 ± 15,02 100 100 1
Sulfamethoxypyridazine 1000 43,94 ± 0,02 51,72 ± 1,76 140,44 ± 5,21 165,70 ± 12,54 100 100 1
Sulfamonomethoxine 1000 42,22 ± 1,56 50,56 ± 0,46 148,67 ± 9,67 174,34 ± 7,26 100 100 1
Sulfamoxole 1000 38,61 ± 1,46 19,51 ± 2,34 80,30 ± 10,71 100,31 ± 23,38 100 100 1
Sulfapyridine 1000 29,02 ± 0,68 31,62 ± 2,64 89,32 ± 6,45 101,35 ± 18,40 100 100 1
Sulfaquinoxaline 1000 13,64 ± 0,32 10,28 ± 2,07 28,72 ± 5,89 79,34 ± 14,84 100 100 1
Sulfathiazole 1000 36,39 ± 1,95 39,05 ± 0,88 88,64 ± 5,73 41,14 ± 21,28 100 100 1
Sulfisoxazole 1000 55,57 ± 0,80 29,05 ± 2,59 168,29 ± 12,57 62,20 ± 4,43 100 100 1
Triméthoprime 1000 86,00 ± 1,57 75,98 ± 9,94 217,95 ± 25,88 126,27 ± 10,81 50 50 1
Tétracyclines 25,73 ± 0,54 21,89 ± 17,13 73,50 ± 12,79 52,61 ± 7,69
Chlorotétracycline 1000 18,87 ± 0,49 21,77 ± 9,36 30,30 ± 6,29 35,67 ± 6,17 100 100 1
Oxytétracycline+ 4-Epi- 1000 32,79 ± 0,77 22,24 ± 23,07 108,49 ± 15,90 48,16 ± 2,89 100 100 1
Oxytétracycline
Tétracycline+ 4-Epi- 1000 25,53 ± 0,36 21,67 ± 18,97 81,72 ± 16,19 74,02 ± 14,00 100 100 1
Tétracycline
(suite tab 19) Une même letter signifie que les groups ne different pas significativement au niveau de 0.05.

STDEV: Standard Déviation, Rec: Rendement (Recovery).

*La concentration estimée a été basée sur la courbe de calibration obtenue avec 5 différentes concentrations des standards (250, 500, 1000, 1500 and 2000 µg/L) après
détection de l’ion de quantification dans le spèctre SM. Quatre méthodes sont utilisées (n=2) et les échantillons contrôle du lait sont fortifiés à une concentration finale de 500
µg/L.

66
Chapitre IV Résultats et discussion

120,00
Concentration d'antibiotiques (μg/L)
100,00

80,00

60,00 Moyenne des Rec% M1

Moyenne des Rec% M2
40,00
Moyenne des Rec% M3
20,00 Moyenne des Rec% M4

0,00

Figure 14: Diagramme présentant une comparaison entre les quatre méthodes pour les antibiotiques

qui ont des rendements plus bas.

3.1.2. Validation de la méthode d’extraction

La validation de la méthode d’extraction optimisée est réalisée selon la directive Européenne

(Commission Décision, 2002). La spécificité est définie par cette commission comme la
capacité d'une méthode à discerner l'analyte mesuré d'autres substances. Cette caractéristique
est essentiellement une fonction de la technique de mesure décrite, mais peut varier selon la
classe du composé ou de la matrice. Les résultats obtenus (tableau 20) présentent qu’à
l’exception de l’ampicilline, dicloxacilline, fluméquine, érythromycine, tylosine et
sulfisoxazole pour lesquels un échantillon sur 20 a été caractérisé par l’apparition de pic aux
temps de rétention des analytes résultant en 5% de faux positifs; aucun pic n'a été observé aux
mêmes temps de rétention des autres antibiotiques vétérinaires cibles, indiquant qu'il n'y avait
aucun signal faux induit par composé matriciel dans les échantillons (Han et al., 2015).
Il est cité dans la Décision (Commission Decision, 2002) que la capacité de détection (CCβ)
est la plus petite teneur en substance pouvant être détectée, identifiée et/ou quantifiée dans un
échantillon avec une probabilité d'erreur β=5%. Dans le cas des substances pour lesquelles
aucune limite autorisée n'a été fixée, la capacité de détection est la concentration la plus faible
à laquelle une méthode peut détecter des échantillons véritablement contaminés avec une
certitude statistique de 1 − β. Dans le cas des substances pour lesquelles une limite autorisée
est fixée, cela signifie que la capacité de détection est la concentration à laquelle la méthode

67
Chapitre IV Résultats et discussion

peut détecter des concentrations à la limite autorisée avec une certitude statistique de 1 − β.
Ainsi, si la Concentration cible de détection est fixée à la moitié de la limite (par exemple à
1/2 MRL); l’apparition d’un seul échantillon faux négatif ou bien l’absence totale des résultats
faux négatifs suite à l’analyse d’au moins 20 échantillons de contrôle est suffisant pour
démontrer que CCβ est moins que la LMR et inférieure ou égale à la ½ LMR (Community
reference laboratories, 2010). Les résultats obtenus (tableau 20) ont montré que dans tous les
20 échantillons fortifiés à 0.5 LMR, aucun résultat faux négatif n’a été enregistré et la
Capacité de détection CCβ a été 50% de la LMR pour toutes les molécules d’antibiotiques
analysés.

Tableau 20: limites Maximales des résidus (MRL*), CCβ et le nombre des échantillons analysés pour chaque
antibiotique utilisé pour la validation de la méthode choisie.

Détection
Famillle LMR lait CCβ CCβ échantillon
Antibiotiques
d’antibiotiques (µg/L) (µg/L) échantillon blanc
fortifié

Pénicilline Amoxicilline 4 2 20/20 20/20

Pénicilline G 4 2 20/20 20/20

Ampicilline 4 2 20/20 19/20

Cloxacilline 30 15 20/20 20/20

Dicloxacilline 30 15 20/20 19/20

Nafcilline 30 15 20/20 20/20

Oxacilline 30 15 20/20 20/20

Quinolones Enrofloxacine 100 50 20/20 20/20

Marbofloxacine 75 37.5 20/20 20/20

Fluméquine 50 25 20/20 19/20

Macrolides Erythromycine 40 20 20/20 19/20

Spiramycine 200 100 20/20 20/20

Tilmicosine 50 25 20/20 20/20

Tylosine 50 25 20/20 19/20

Neospiramycine 200 100 20/20 20/20

68
Chapitre IV Résultats et discussion

Détection
Famillle LMR lait CCβ CCβ échantillon
Antibiotiques
d’antibiotiques (µg/L) (µg/L)
échantillon blanc
fortifié

Tétracyclines Chlortétracycline 100 50 20/20 20/20

Oxytétracycline+4-epi- 100 50 20/20 20/20

Oxytétracycline
Tétracycline+4-epi- 100 50 20/20 20/20
Tétracycline
Sulfamides Sulfadiazine 100 50 20/20 20/20

Sulfapyridine 100 50 20/20 20/20

Sulfamethoxypyridazine 100 50 20/20 20/20

Sulfadoxine 100 50 20/20 20/20

Sulfadimethoxine 100 50 20/20 20/20

Sulfadimidine 100 50 20/20 20/20

Sulfamonomethoxine 100 50 20/20 20/20

Sulfamoxole 100 50 20/20 20/20

Sulfaquinoxaline 100 50 20/20 20/20

Sulfachloropyridazine 100 50 20/20 20/20

Sulfathiazole 100 50 20/20 20/20

Sulfamerazine 100 50 20/20 20/20

Sulfamethoxazole 100 50 20/20 20/20

Sulfacetamide 100 50 20/20 20/20

Sulfisoxazole 100 50 20/20 19/20

Triméthoprime 50 25 20/20 20/20

Sulfaguanidine 100 50 20/20 20/20

Sulfamethizole 100 50 20/20 20/20

* LMR (EU 37/2010) (suite tab 20)

69
Chapitre IV Résultats et discussion

Une courbe linéaire de calibration a été obtenue à partir des cinq concentrations utilisées. La
droite de régression est établie pour les surfaces du pic en fonction des concentrations des
dilutions correspondantes. Le coefficient de corrélation r2 a été ≥ 0.80 pour toutes les
substances d’antibiotiques analysées (annexe 02). L’applicabilité de cette méthode a été
satisfaisante pour l’analyse de cent quatre-vingt-quatorze (194) échantillons de lait collectés à
Guelma. Parmi lesquels, 127 échantillons ont été trouvés positifs vis-à-vis la présence de
résidus d’antibiotiques. Les résultats obtenus seront présentés dans la partie résultats de
l’analyse des échantillons.

3.2. Résultats de l’analyse des échantillons de lait collectés par UPLC-MS/MS

127 ont été trouvés positifs à un pourcentage de (65.5%) (tableau 21). À partir de l’analyse
statistique des résultats avec « un modèle généralisé pour des données binomiales distribuées
utilisant le lien de logique », nous remarquons que les fréquences les plus élevées des résultats
positifs ont été obtenues pour le lait collecté auprès des points de vente. Dont, chaque
échantillon collecté de lait cru est contaminé suivi par le lait fermenté. Ainsi, les échantillons
collectés auprès des fermes ont également présenté des pourcentages élevés de contamination
citons successivement : le lait de vaches traitées, le lait de vaches saines et le lait de tank.

Tableau 21 : Comparaison des résultats obtenus par UPLC-MS/MS entres les différents types de lait
analysés

UPLC- UPLC- % UPLC-

MS/MS MS/MS MS/MS positifs
conform non conform

Lait de collecte 16 19 54a

Lait de vaches saines 41 58 59a
Lait de vaches traitées 7 15 68a
Lait de vache cru points de vente 0 18 100a
Lait de vache fermenté (lben) points de vente 3 17 85a
Groupe avec une même lettre près du pourcentage ne diffèrent pas significativement au niveau de 0.05.

Cette méthode nous a rapporté un nombre important d’échantillons positifs et les résultats
obtenus ont révélé qu’un seul échantillon de lait puisse contenir un résidu d’antibiotique ou
plus (tableau 22). L’UPLC-MS/MS semble être une méthode très importante lorsqu’elle nous
a permis de déceler non seulement la présence de résidus d’antibiotiques à des niveaux
supérieurs ou beaucoup plus supérieurs à la LMR, mais aussi la présence des molécules

70
Chapitre IV Résultats et discussion

interdites d’utilisation chez les animaux produisant du lait destiné à la consommation humaine
selon la commission Européenne (Commission Regulation, 2010).

Tableau22 : Nombre des échantillons de lait positifs par antibiotique analysé.

Groupe et type d’antibiotique LMR* dans lait (µg/L) L COL LVS LVT LVC D LVFD
Macrolides
Erythromycine 40 0 0 1 0 0
Neospyramycine 200 0 0 0 0 0
Spiramycine 200 0 0 1 0 0
Tilmicosine 50 2 3 2 7 3
Tylosine 50 0 0 1 0 0
Josamycine ND 0 2 1 0 1
Tulathromycine Interdit 0 0 1 0 0
Tylvalosine ND 0 0 1 6 2
Pénicillines
Amoxicilline 4 6 15 6 11 13
Ampicilline 4 5 22 0 3 0
Cloxacilline 30 0 0 0 0 0
Dicloxacilline 30 0 0 0 0 0
Nafcilline 30 0 0 0 1 0
Oxacilline 30 1 1 0 5 0
Pénicilline G 4 0 2 0 1 0
Quinolones
Enrofloxacine 100 0 0 0 1 0
Fluméquine 50 0 0 0 0 0
Marbofloxacine 75 0 0 0 0 0
Danofloxacine 30 4 9 5 0 0
Acide oxolinique Interdit 0 0 0 0 1
Difloxacine Interdit 0 0 0 0 0
Sulfamides
Sulfacetamide 100 0 0 0 0 0
Sulfachloropyridazine 100 0 1 0 0 0
Sulfadiazine 100 1 15 4 0 0
Sulfadimethoxine 100 0 0 0 0 0
Sulfadimidine 100 0 0 0 0 0
Sulfadoxine 100 0 0 0 0 0
Sulfaguanidine 100 0 1 0 0 0
Sulfamerazine 100 0 0 0 0 2

71
Chapitre IV Résultats et discussion

Groupe et type d’antibiotique LMR* dans lait (µg/L) L COL LVS LVT LVC D LVFD
Sulfamethizole 100 0 0 0 0 1
Sulfamethoxazole 100 0 0 0 0 0
Sulfamethoxypyridazine 100 0 0 0 0 0
Sulfamonomethoxine 100 0 0 0 0 0
Sulfamoxole 100 0 0 0 1 2
Sulfapyridine 100 0 0 0 0 0
Sulfaquinoxaline 100 0 0 0 0 0
Sulfathiazole 100 0 2 0 0 0
Sulfisoxazole 100 0 0 0 0 0
Triméthoprime 50 3 7 5 6 2
Tétracyclines
Chlortétracycline 100 0 0 0 0 0
Oxytétracycline+ 4-Epi-Oxytétracycline 100 5 7 3 6 11
Tétracycline+ 4-Epi-Tétracycline 100 0 0 0 0 0
Doxycycline Interdit 0 0 0 2 0
(Suite tab 22) * LMR (EU 37/2010)
Abréviations : LCOL Lait de collecte (tank) ; LVS Lait de Vache Saine ; LVT Lait de vache Traitée ; LVC D
Lait de Vache Cru Distributeur (point de vente) et LVFD Lait de Vache Fermenté Distributeur (point de vente).
ND : Non définie.

Le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui
l'entraîne à travers la colonne, ce mélange doit être poussé à haute pression afin d'assurer un
débit constant dans la colonne et y éviter toute perte de charges. Si la phase stationnaire a été
bien choisie, les constituants du mélange appelés généralement les solutés, sont inégalement
retenus lors de la traversée de la colonne. De ce phénomène appelé rétention il résulte que les
constituants du mélange injectés se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leur
vitesse de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les
autres et donc séparés. Chaque soluté est alors soumis à une force de rétention, exercée par la
phase stationnaire et une force de mobilité, due à la phase mobile. Ces composés séparés vont
subir une ionisation (ESI) et une collision est induite dans le spectromètre de masse pour
obtenir une fragmentation caractéristique de l’ion sélectionné. Un détecteur placé à la sortie
couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige
sur un enregistreur un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ;
au passage de chaque soluté séparé, il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic. Dans
des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un
composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance.

72
Chapitre IV Résultats et discussion

L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de
base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté (Boultif,
2015).A partir des résultats obtenus (tableau 22) pour les échantillons des différents types du
lait analysés, nous avons constaté que les pénicillines sont les antibiotiques les plus détectés,
suivis par les sulfamides, les macrolides, les tétracyclines et les quinolones respectivement.
Les figures ci-dessous (15, 16, 17, 18, 19) regroupent des exemples des chromatogrammes de
l’eau, de la solution des standards à 1LMR, du blanc réactif, du témoin positif, témoin négatif,
et des échantillons trouvés positifs pour un seul antibiotique possédant de LMR par chaque
famille. Les mêmes chromatogrammes sont présentés pour l’antibiotique représentant des
antibiotiques qui ne possèdent pas de LMR (figure 20) et ceux des trois antibiotiques interdits
(figure 21). L’antibiotique choisi est celui présent dans un grand nombre d’échantillons. L’eau
milli-Q est utilisée au début et à la fin de chaque série d’analyse pour s’assurer de
l’élimination de toutes traces et impuretés des analyses ultérieurs qui persistent dans la
tuyauterie de l’UPLC-MS/MS et pour éviter la survenue d’artéfacts sur les chromatogrammes.
Ainsi, la solution des standards à 1LMR est injectée au début, au milieu et à la fin de chaque
analyse pour fixer les temps de rétention des antibiotiques présents et confirmer le bon
fonctionnement de l’appareil. Le chromatogramme du témoin positif identifie l’échantillon du
lait fortifié (T+) à 0.5 LMR. On observe la présence d’un pic qui permet d’identifier la
molécule recherchée au temps de rétention spécifique pour chaque antibiotique analysé. Le
temps de rétention est considéré ainsi comme le seul point d’identification caractéristique de
la molécule (Boultif, 2015). Contrairement, dans le chromatogramme d’un lait exempt
d’antibiotique (T-), Aucun pic n’est décelé au temps de rétention sur le profil
chromatographique. Pour les échantillons E, l’interprétation de leurs résultats est basée sur 5
critères (Commission decision, 2002) qui sont : Le rapport signal/bruit (S/N) de la transition
ionique est supérieur à 10, La différence chromatographique du temps de rétention relatif
(RRT) est autour 2.5% du temps de rétention relatif du même pic de l’échantillon de lait
fortifié, l’aire de l’échantillon analysé est supérieure à celle de l’échantillon fortifié et la
concentration de l’échantillon analysé est supérieure à la LMR et au niveau de détection
(LOD) autrement dit la concentration du témoin négatif. Pour les antibiotiques qui ne
possèdent pas de LMR ou bien ceux que se sont interdits, la valeur de LMR est fixée à zéro. À
l’origine, 194 échantillons de lait ont été testés pour 43 résidus d’antibiotiques différents
(tableau 22). Nous avons considéré un échantillon du lait confirmé positif si un de ces
antibiotiques est trouvé à une concentration au-dessus de la LMR ou bien à la LOD pour ceux
qui sont interdits ou qui ne possèdent pas de LMR (CMV, 2015).

73
Chapitre IV Résultats et discussion

-a-

74
Chapitre IV Résultats et discussion

-b-

75
Chapitre IV Résultats et discussion

-c-

76
Chapitre IV Résultats et discussion

-d-

77
Chapitre IV Résultats et discussion

-e-

78
Chapitre IV Résultats et discussion

-f-

79
Chapitre IV Résultats et discussion

-g-

80
Chapitre IV Résultats et discussion

-h-

81
Chapitre IV Résultats et discussion

-i-

82
Chapitre IV Résultats et discussion

-j-

Figure 15 : Chromatogrammes –a, b, c, d, e, f, g, h, i, j- des résultats obtenus de l’eau, de la solution

1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+), négatif (T-) et des échantillons trouvés positifs (E)
pour l’amoxicilline représentant des pénicillines.

Les résultats obtenus par cette étude ont confirmé que les pénicillines (figure 15) sont le
principal groupe d’antibiotiques détecté dans les échantillons de lait. Ceci reflète l’utilisation
fréquente de médicaments chimiothérapiques pour le traitement et la prévention des maladies
spécifiques dans le bétail laitier et l’utilisation des infusions intra-mammaire contenant les
béta-lactames pour le traitement des mammites (Petrovic et al., 2008 ; Rama et al., 2016).
47,42% des échantillons analysés ont été détectés positifs à cette famille d’antibiotiques. Nos
résultats sont confirmés par ceux rapportés par Ben-Mahdi et Ouslimani, (2009) à Alger et
Titouche et al., (2013) à Tizi-Ouzu ; qui ont utilisé des méthodes microbiologiques pour la
détection des résidus d’antibiotiques et déclarent que les résidus de pénicilline et/ou
tétracyclines étaient à l’origine de la contamination de 97.33 % et de 88. 75% des échantillons
de lait positifs successivement. Au Kosovo, Rama et al., (2016) ont trouvé que les béta-
lactames ont été détectés à un pourcentage de 30.18% des échantillons analysés. Au Pakistan,
Khaskheli et al., (2008) ont trouvé à l’aide d’une méthode microbiologique qualitative avec
Bacillus subtilis que 36.5% des échantillons de lait de vache cru sur marché sont contaminés
par les béta-lactames. Tandis que, Pogurschi et al., (2015) en Roumanie ont trouvé que les
béta-lactames ont été détectés seulement à un pourcentage de 18.18% sur un total de 66
échantillons analysés positifs.

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Chapitre IV Résultats et discussion

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Chapitre IV Résultats et discussion

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Chapitre IV Résultats et discussion

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Chapitre IV Résultats et discussion

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 Chapitre IV Résultats et discussion

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Figure 16 : Chromatogrammes –a, b, c, d, e- des résultats obtenus de l’eau, de la solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+), négatif (T-) et
échantillons trouvés positifs (E) pour triméthoprime représentant des sulfamides.

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Chapitre IV Résultats et discussion

Dans l’industrie laitière, les grandes quantités de lait sont contrôlées quotidiennement pour la
présence de sulfamides (figure 16) (Nebot et al., 2013). Sulfadiazine, sulfadimidine,
sulfamethoxazole, sulfadoxine et sulfadimethoxine sont les plus important et jouent un rôle
important en médecine vétérinaire comme médicaments efficaces pour les maladies
bactériennes et protozoaires et comme promoteurs de croissance (Bilandzic et al., 2011). Les
Sulfamides sont souvent abusés parce qu’ils sont peu coûteux et aisément disponibles et leur
présence à une concentration au-dessus de la valeur limite est un danger potentiel à la santé
humaine (Granja et al., 2012 ; Meng et al., 2015). Parallèlement, le Comité pour des
Médicaments Vétérinaires considère que la somme de toutes les substances appartenant à ce
groupe dans le lait bovin ne devrait pas excéder 100 mg/ kg (Bilandzic et al., 2011). Dans
cette étude, 26,80% du total des échantillons analysés sont trouvés positifs à cette famille
d’antibiotiques et nos résultats sont supérieurs à 5% et 2% rapportés par Titouche et al.,
(2013) et Nebot et al., (2013) successivement. Simultanément, Zhang et al., (2014) en Chine
ont trouvé que 20.2% des échantillons de lait UHT et 15.4% de lait pasteurisé ont été
contaminés avec des sulfamides à des niveaux inférieurs à LMR.

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Chapitre IV Résultats et discussion

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Figure 17 : Chromatogrammes –a, b, c, d- des résultats obtenus de l’eau, de la solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+), négatif (T-) et
échantillons trouvés positifs (E) pour tilmicosine représentant des macrolides.

93
Chapitre IV Résultats et discussion

Les macrolides (figure 17) constituent une classe très importante des composants

antibactériens activent contre les bactéries à Gram-positive et certaines à Gram-négative. Ce

sont largement utilisés en médecine vétérinaire pour traiter les maladies respiratoires, ou

comme additifs alimentaires pour promouvoir la croissance (Dubois et al., 2001 ; Wang et

Leung, 2007) et les macrolides les plus généralement utilisés sont érythromycine,

spiramycine, tylosine et tilmicosine (Bilandzic et al., 2011). Nos résultats 17.52% sont

supérieurs à 2,67% et 12.5% des résidus de macrolides et/ou d’aminosides qui ont été détectés

dans des prélèvements testés positifs par Ben-Mahdi et Ouslimani, (2009) et Titouche et al.,

(2013) successivement.

La présence de tétracyclines (figure 18) a été analysée comme ceux-ci sont les antibiotiques

les plus utilisés dans le traitement de maladies de glandes mammaires des vaches laitières

(Pogurschi et al., 2015). Ce sont globalement utilisés comme des antibiotiques à large spectre

contre une vaste gamme de bactéries aérobies et anaérobies Gram-positive et Gram-négative.

(Bilandzic et al., 2011). La présence de l'oxytétracycline dans la majorité des échantillons du

lait analysés est en accord avec les résultats de Martins et al., (2016), supportant la

proposition que l’oxytétracycline est probablement l’antibiotique le plus fréquemment utilisé

chez les vaches en lactation. En comparaison des résultats obtenus par cette étude avec

d’autres travaux, nous avons trouvé qu’un pourcentage de 16.49% des échantillons positifs

pour les tétracyclines est supérieur à 1.17% et 1.32% trouvés dans 339 et 605 échantillons de

lait analysés par Martins et al., (2014) ; Martins et al., (2016) en Brésil. Egalement, notre

résultat est supérieur à 0% des échantillons de lait UHT et 7.7% de lait pasteurisé qui ont été

trouvés contaminés avec des tétracyclines à des niveaux inférieurs à LMR par Zhang et al.,

(2014) en Chine. Tandis que, nos résultats sont inférieurs à 97.33%, 88.75% des pénicillines

et/ou tétracyclines trouvés par Ben-Mahdi et Ouslimani, (2009) et Titouche et al., (2013)

respectivement, à 25.71% trouvé par Pogurschi et al., (2015) en Roumanie et à 24.4%, 30% et

94
Chapitre IV Résultats et discussion

28.6% des tétracyclines détectés à des niveaux supérieurs à la LMR dans des échantillons du

lait pasteurisé, stérilisé et cru successivement en Iran (Abbasi et al., 2011).

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Chapitre IV Résultats et discussion

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Figure 18 : Chromatogrammes –a, b, c, d, e, f, g- des résultats obtenus de l’eau, de la solution 1LMR,

du blanc réactif (BR), témoin positif (T+), négatif (T-) et échantillons trouvés positifs (E) pour

l’oxytétracycline représentant des tétracyclines

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Figure 19 : Chromatogrammes –a, b, c, d- des résultats obtenus de l’eau, de la solution 1LMR, du blanc réactif (BR), témoin positif (T+), négatif (T-) et
échantillons trouvés positifs (E) pour danofloxacine représentant des quinolones.

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Chapitre IV Résultats et discussion

En médecine vétérinaire, les quinolones et les fluoroquinolones (figure 19) sont un groupe
important d’antibiotiques synthétiques largement utilisés pour traiter les maladies de bétail,
comme les infections des voies respiratoires et gastro-intestinales (Bilandzic et al., 2011 ;
Navrátilová et al., 2011). Ce sont utilisé dans des préparations intra-mammaires pour le
traitement de mammites des vaches laitières allaitantes, pour des vaches laitières pendant des
périodes sèches et aussi pour la prévention de mammite (Navrátilová et al., 2011). Bien que
les quinolones aient largement appliqués dans l’agriculture primaire, ces dernières années leur
administration aux animaux producteurs des aliments a été discutée en relation avec
l’incidence accrue de résistance au sein des micro-organismes pathogènes humains.
Effectivement, la présence de résidus quinolones dans le lait présente un risque pour la santé
publique en raison du développement d’une résistance aux médicaments de la flore intestinale
(Bilandzic et al., 2011). Ainsi, Il est prouvé que l’exposition à long terme aux basses
concentrations de ces substances peut avoir des effets négatifs sur la densité osseuse
(Navrátilová et al., 2011). Dans cette étude les quinolones ont été trouvés à un faible
pourcentage de 10.30% du total. Nos résultats sont supérieurs à 0.33% rapportés en Brésil par
Martins et al., (2016) sur un total de 605 échantillons et sont inférieurs à (28%) des
échantillons du lait trouvés positifs pour les quinolones et béta-lactames par Junza et al.,
(2014). Tandis que, nos résultats ne s’accordent pas avec ceux de Han et al., (2015) qui ont
trouvé un seul échantillon contaminé par fluméquine à un niveau inférieur à la LMR.

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Chapitre IV Résultats et discussion

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Figure 20 : Chromatogrammes –a, b, c- des résultats obtenus de l’eau, de la solution 1LMR, du blanc
réactif (BR), témoin positif (T+), négatif (T-) et échantillons trouvés positifs (E) pour tylvalosine
représentant des macrolides qui ne possèdent pas de LMR.

L’antibiotique qui ne possède pas de LMR le plus détecté dans cette étude est le tylvalosine
(figure 20). Ce dernier est utilisé dans le traitement des poulets et des dindes (CVMP, 2015) et
n’est pas actuellement approuvé pour l’utilisation dans des vaches laitières. Certains
médicaments qui ne sont pas approuvés pour l’utilisation dans le bétail laitier allaitant
peuvent être utilisés dans des conditions précises. Ces conditions incluent une relation valable
« vétérinaire – client – patient » aussi bien des mesures appropriées pour assurer qu’aucun
résidu de médicament illégal n’arrive dans aucun aliment produit par l’animal soumis au
traitement. Cependant, cette utilisation n’est pas permise pour certains médicaments et elle ne
peut pas aboutir à un résidu de médicament illégal dans la nourriture destinée à la
consommation humaine (CVM, 2015).

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Chapitre IV Résultats et discussion

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Figure 21 : Chromatogrammes –a, b, c- des résultats obtenus de l’eau, de la solution 1LMR, du blanc
réactif (BR), témoin positif (T+), négatif (T-) et échantillons trouvés positifs (E) pour doxcycycline,
acide oxolonique et tulatrhomycine représentant des antibiotiques interdits.

La commission Européenne (Commission Regulation, 2010) interdit l’utilisation du

tulatrhomycine, l’acide oxolinique et doxycycline (figure 21) chez les animaux producteurs

du lait et ces antibiotiques sont trouvés à des niveaux élevés dans les échantillons de laits

analysés. Selon, Amer et al., (2012) un long délai d’attente (> 19 jours) est exigé pour le lait

destiné à la consommation humaine quand le tulathromycine est administré accidentellement

aux chèvres laitières allaitantes. Nos résultats s’accordent avec les résultats rapportés par

CVM, (2015) qui ont trouvés 2 échantillons positifs pour le tulathromycine sur un total de 953

échantillons de lait cru analysés. Tandis que, notre résultat pour le doxycycline est supérieur à

0 échantillon trouvé positif par cette étude.

En général, 65.5% de tous les échantillons de lait analysés dans cette étude par UPLC-MS/MS

ont été contaminés par les résidus d’antibiotiques à des niveaux qui dépassent la MRL. Nos

résultats sont beaucoup plus supérieurs à ceux de 15% (Li et al., 2012), 16.66% (Meng et al.,

2015) en Chine, 28% (García et al., 2016) en Espagne et 25.4% (Abbasi et al., 2011) en Iran.

Des niveaux plus bas de contamination ont été enregistrés : 1.76% ,0.33% par (Martins et al.,

114
Chapitre IV Résultats et discussion

2014) et (Jank et al., 2017) en Brésil successivement et (<1%) en Croatie par (Bilandzic et al.,

2011). Ainsi, nos résultats sont similaires aux proportions de 70 % rapportés au Kossovo par

Sulejmani et al., (2012) et de 58 et 100 % au Bénin (Mensah et al., 2014b). Pereira et al.,

(2014) ont indiqué que 47.17% des échantillons analysés ont été détectés à des concentrations

de détection tandis que Han et al., (2015) ont trouvé que 12% des échantillons ont été détectés

à des niveaux inférieurs à la MRL.

4. Corrélation entre les résultats de l’UPLCMS/MS et ceux du Delvotest SP-NT et

présence d’antibiotiques spécifiques

Seulement 131 échantillons de lait ont été utilisés pour une comparaison entre les résultats
obtenus avec Delvotest SP-NT et l’UPLC-MS/MS (tableau 23). L’utilisation de Kappa de
Cohen (test statistique) pour la comparaison entre le nombre total des résultats a révélé qu’il
n’y’a pas d’agrément entre ces deux méthodes.

Tableau 23: Corrélation statistique entre les résultats du Delvotest SP-NT et UPLC-MS/MS
Delvotest Delvotest Delvotest
négatif positif douteux

UPLC-MS/MS négatif 18 13 15

UPLC-MS/MS positif 52 20 13

kappa de Cohen (−0.1042, valeur de P : 0.1578) calculées.

En outre, parmi les 131 échantillons de lait seulement 18 échantillons ont été trouvés négatifs
par les deux méthodes. En utilisant Delvotest SP-NT, 15 échantillons ont été considérés
comme douteux et 13 échantillons ont été trouvés positifs. Ces résultats ont été confirmés par
la suite avec l’UPLC-MS/MS comme négatifs. Ainsi qu’à partir des résultats illustrés dans les
tableaux 23 et 24, nous avons trouvé que l’UPLC-MS/MS a pu détecter plusieurs
antibiotiques dans les 52 échantillons trouvés négatifs auparavant avec le Delvotest SP-NT
dont les β-lactames sont les résidus les plus abondants suivi par les macrolides. Tandis que,
les sulfamides, les quinolones et les tétracyclines ont été présents consécutivement à des
fréquences modiques. Finalement, 20 échantillons de lait ont été confirmés positifs par les
deux méthodes et en plus la positivité de 13 échantillons trouvés douteux par Delvotest SP-

115
Chapitre IV Résultats et discussion

NT a été révélé e par l’UPLC-MS/MS. Ces résultats de comparaison indiquent que la

méthode de l’UPLC-MS/MS est plus sensible que le Delvotest SP-NT.

Tableau 24 : Comparaison des résultats obtenus par LC-MS/MS et Delvotest SP-NT donnée par la
fréquence des antibiotiques surreprésentés
Antibiotique %Fréquence des résultats
LC-MS/MS positif & LC-MS/MS positif & LC-MS/MS positif &
Delvotest négatif Delvotest positif Delvotest douteux

ampicilline 26.9 10 38.5

oxacilline 9.6 / /
tylvalosine 11.5 5 /
tilmicosine 13.5 10 /
amoxicilline 42.3 40 /
érythromycine 1.9 / /
tilosyne 1.9 / /
sulfathiazole 1.9 / /
sulfamerazine 1.9 / /
sulfamethizole 1.9 / /
enrofloxacine 1.9 / /
spiramicine 1.9 / /
nafcilline 1.9 / /
josamycine 1.9 / 7.7
tulathromycine 1.9 / /
doxycycline 1.9 /

Les analyses comparatives ont indiqué plusieurs contradictions entre les méthodes, un certain
nombre de résultats faux négatifs utilisant Delvotest SP-NT a été identifié et la sensibilité de
Delvotest SP-NT pour les différents groupes d'antibiotiques aussi bien que le type de lait a été
évalué.
Selon les résultats obtenus avec Delvotest SP-NT, les échantillons les plus contaminés sont
ceux collectés des vaches traitées, alors que, l’UPLC-MS/MS a révélé que les échantillons
rassemblés auprès des points de vente ont été les plus contaminés. Ce faisant, les éleveurs
pratiquent la métaphylaxie plus que la prophylaxie dans la gestion des pathologies. Ils
appliquent des traitements antibiotiques à titre préventif pour les vaches allaitantes saines et
curatif pour celles malades (Mensah et al., 2014b). Le délai d’attente correspond à la durée
consécutive à la dernière administration du traitement pendant laquelle les denrées produites
par l’animal traité ne peuvent pas être commercialisées. C’est pour cela, les antibiotiques
présents dans le lait des vaches traitées pourraient résulter d'une collection de lait durant un
temps réduit après l'administration d'antibiotiques. Ainsi, il peut refléter le non-respect du

116
Chapitre IV Résultats et discussion

délai d’attente prescrit à cause de l’utilisation d’une dose élevée, la défaillance d'observer le
délai d’attente, la mauvaise utilisation de médicaments ou la mauvaise hygiène (Zinedine et
al., 2007; Petrović et al., 2008; Mensah et al., 2014b; Boultif, 2015). L'établissement d'un
délai temps d’attente dépend de différents critères : le type d'antibiotique utilisé, la quantité
d'antibiotique donné et la voie de traitement ainsi l'âge, le statut de santé, la phase de lactation
et les caractéristiques individuelles d'animaux laitiers (Nikolić et al., 2011). Les études qui ont
été faites pour la fixation du délai d’attente sont pour la plupart menées pour des races
représentatives des grandes productions des pays développés et ne tiennent pas compte des
particularités des espèces animales africaines qui peuvent différer au niveau de leur
patrimoine génétique mais également en matière de régulation de leur physiologie, adaptée
aux conditions climatiques locales (consommation en eau, volume de distribution et clairance
rénale). Ces différences influent sur la cinétique des résidus et pourraient nécessiter d’adapter
les temps d’attente requis lorsque les médicaments sont administrés à des races locales
(Mensah et al., 2014a).

Egalement, Les échantillons de lait collectés aux niveaux des points de ventes ont été fournis
par des collecteurs privés qui rassemblent leurs lait dans des citernes isothermes à partir des
fermes (privées ou étatiques) et des éleveurs producteurs de lait de vaches à petite échelle.
Ces derniers sont largement dispersés aux territoires Algériens ruraux et sont localisés très
loin des zones urbaines et loin de tous contrôle par les autorités compétentes. En réalité, la
détection précise des niveaux bas de résidus de médicament antimicrobiens dans le lait, est
non seulement très importante pour les laboratoires de contrôle gouvernementaux et
l'industrie laitière, mais aussi pour les fermiers pour leur permettre d'assurer que le lait
contaminé provenant des vaches individuelles n'est pas mélangé avec celui du tank (Stead et
al., 2008) et empêcher le transfert d'antibiotiques dans la chaîne alimentaire. Le décret N°14-
366 exécutif Algérien du 15 décembre 2014 qui règle les conditions et les modalités
applicables quant aux polluants tolérés dans des produits alimentaires, ne mentionne pas
d'informations suffisantes sur le plan de contrôle et le dosage de résidus d’antibiotiques
(Décret exécutif, 2014). En fait, l'autocontrôle dans les industries laitières est généralement
réalisé suivant la législation Européenne. Au contraire, l'assurance de la qualité est plutôt
basse ou non strictement suivie dans beaucoup de pays africains comme en Algérie (Mensah
et al., 2014b). D'où, l’inexistence de cadre législatif réglementaire en la matière en Algérie
peut être liée aux pourcentages élevés de résidus d’antibiotiques interdits ou réglementés
dans les produits alimentaires d'origine animale.

117
Chapitre IV Résultats et discussion

Dans cette étude les échantillons de lben ont été fortement contaminés. Le lait fermenté 'lben'
est préparé en laissant le lait de vache se fermente naturellement à température ambiante
pendant 24h de temps. Cette fermentation est effectuée principalement par les bactéries
lactiques présentes (Zamfir et al., 2006 ; Ouadghiri et al., 2009b) et après il doit être soumis
au barattage et l'enlèvement de beurre. La Littérature suggère que la présence d'antibiotiques
dans le lait puisse affecter les processus de fermentation dans l’industrie alimentaire (Hsieh et
al., 2011). Par conséquent, la fermentation durant la production du lben peut être affectée par
l'inhibition de la croissance des cultures initiales si les résidus d’antibiotiques sont présents
(Nikolic et al., 2011) et il ne peut pas donc contenir de sous-produits de certaines substances
antimicrobiennes naturellement présentes dans ce type de fermentation (Zinedine et al., 2007).
C'est pour cette raison, la performance de Delovtest SP-NT a été mise en doute. Tandis
qu'aucune limitation spécifique n’est mentionnée ni par le fabricant, ni vérifiée dans quelques
études (Hennart et Faragher, 2012) pour analyser les résidus d’antibiotiques dans le lait
fermenté et le devenir d'antibiotiques dans un lait comme lben n'est pas entièrement évalué. A
l’exception d’une étude réalisée par Zinedine et al., (2007) sur le lait raib au Maroc, il y a un
grand manque de données scientifiques sur la recherche des résidus d’antibiotiques dans le
lait fermenté (lben). La durée de vie de 'lben' est environ 3 jours à 4 °C. Cependant, il a été
rapporté que parfois il est gardé à température ambiante dans des régions où il y’a l’électricité
est limitée. Dans ces conditions le lait de lben atteint des niveaux élevés d'acidité après 2-3
jours (Benkerroum et Tamime, 2004). Les résultats de la stabilité des antibiotiques de notre
étude ont montrés que dans ces conditions la concentration d’antibiotique semble augmenter.
C'était indépendant des conditions de température (4°C et 21°C). Plus d'études seraient
nécessaires pour révéler si ces antibiotiques seraient facilement bio-disponibles et augmentent
l'exposition aux consommateurs.
Delvotest SP-NT présente une sensibilité variable aux différents groupes d'antibiotiques.
Selon le fabricant et plusieurs rapports (Althaus et al., 2003, Stead et al., 2008, Sierra et al.,
2009a ; DSM, 2012 et Beltran et al., 2015), La sensibilité de Delvotest SP NT aux ß-lactames,
comme le principal groupe de médicaments vétérinaires utilisés en thérapie des vaches est
haute à part le cloxacilline. Celui-ci peut être détecté au niveau plus haut que LMR (Petrovic
et al., 2008). La sensibilité du Delvotest SP-NT aux macrolides est limitée au tylosine, alors
que l’érythromycine et spiramycine sont détectés à des niveaux plus haut que LMR (DSM,
2012). Althaus et al., (2003); Stead et al., (2008); Sieera et al., (2009b) et Beltran et al.,
(2015) ont aussi confirmé que la détection de l’érythromycine était à des niveaux plus haut
que LMR tandis qu’il n'y a aucune donnée liée à la sensibilité de Delvotest SP-NT pour les

118
Chapitre IV Résultats et discussion

autres macrolides (tilmicosine, tulathromycine, tylvalosine et josamycine). En outre, la

sensibilité de Delvotest SP-NT aux sulfamides est limitée seulement à sulfathiazole (DSM,
2012). Les niveaux de détection de l’enrofloxacine et doxcycycline de ce test ont été décrits
par Sieera et al., (2009 b). Ce dernier rapporte quand l'échantillon de lait contient des résidus
au-dessous de la limite de détection (LOD), les spores germent et multiplient, ainsi, leur
activité métabolique change la couleur de l'indicateur. Althaus et al., (2003), Sierra et al.,
(2009b), Le Breton et al., (2007) et Comunian et al., (2010) ont remarqué que Delvotest SP-
NT a démontré une capacité inférieure de détecter d’autres tétracyclines. Ainsi,
Appicciafuoco et al., (2015) ont signalé que les méthodes de routine utilisées actuellement
pour l’analyse du lait, ne peuvent pas détecter les résidus de quinolones. Pour un test de
dépistage, l’absence de résultats faux négatifs est plus important que l’absence de résultats
faux positifs parce que les échantillons positifs seront confirmés (Petrović et al., 2008, Ferrini
et al., 2015).

Les deux méthodes ont été en accord pour quelques échantillons de lait trouvés positifs. Les
antibiotiques les plus fréquemment détectés ont été les ß-lactames. Principalement,
l'amoxicilline (le résidu le plus abondant dans le lait étudié) et ampicilline ont été trouvés
dans la moitié des échantillons à un pourcentage qui est toujours moins que 97 % et 88 % de
pénicillines et/ou tétracyclines comme rapportés par Ben-Mahdi et Ouslimani, (2009) et
Titouche et al., (2013), respectivement où des méthodes microbiologiques standards ont été
utilisées. Le prix bas de ß-lactames en Algérie les rend facilement disponibles et donc facilite
leur utilisation par des éleveurs des vaches privés sans surveillance de vétérinaires dans les
endroits isolés. De plus, la présence des macrolides à des fréquences basses de tilmicosine et
tylvalosine comme - résidu sans MRL - pourrait être liée –à leur utilisation sporadique. Alors
que, les aminoglycosides n'ont pas été analysés par la méthode UPLC-MS/MS en raison de
leur LMR relativement élevée en comparaison avec celle de la viande. Principalement, la
sensibilité de Delvotest SP-NT pour dihydro-streptomycine et streptomycine est plus haute
que LMR et plus bas que LMR pour néomycine. Ce dernier, pourrait présenter dans les 20
échantillons qui ont été trouvés positifs avec les deux méthodes. Les niveaux supérieurs de
contamination des échantillons de lait par les résidus d’antibiotiques sont expliqués
essentiellement par l’utilisation massive et incontrôlée des préparations pharmaceutiques
intra-mammaires pour le traitement et la prévention de mammite bovine, tandis que les délais
d’attente après traitement n'ont pas été correctement respectés. Une autre raison pourrait être
liée à cette contamination est l’addition volontaire des inhibiteurs de croissance bactériens

119
Chapitre IV Résultats et discussion

(des antibiotiques, antiseptiques) pour arrêter la croissance microbienne et stabiliser la qualité

microbienne de lait (Zinedine et al., 2007). Une autre argumentation est supportée par l'étude
de Reybroeck, (2010) où il a été stipulé que la raison principale de la présence de résidus
d’antibiotiques dans le lait était la traite accidentelle des vaches traitées qui ont passé
inaperçues à 66 % des cas et la non - la conformité de délais de retrait à 41 % des cas.

En conclusion, l’UPLC-MS/MS est une méthode nettement plus sélective et plus sensible que
les méthodes microbiologiques car elle permet d’identifier les molécules séparément et donc
d’éviter les problèmes d’interférences possibles entre les substances (Boatto et al., 1998).
Malgré le coût très élevé de ces instruments, le gain de temps réalisé permet de les rentabiliser
lorsque le nombre d’échantillons testés est grand (Bergogne-Berizin et Dellamonica, 1999).

5. Résultats de la stabilité des antibiotiques dans le lait pendant conservation

Le but de cette expérience était de déterminer l'effet de températures différentes et de temps

de conservation sur la concentration des antibiotiques dans le lait en employant l'UPLC-
MS/MS. Selon les résultats obtenus (figures 22, 23, 24, 25 et 26), aucune dégradation n’a été
marquée pour les antibiotiques présents dans les échantillons du lait blanc fortifiés pendant les
deux premiers jours de conservation à des températures différentes (4°C et 21°C). Tandis
qu’une augmentation significative de la concentration de ces antibiotiques a été observée
après conservation pendant 7 jours à 4 °C et à 21 °C. Pour la plupart des antibiotiques, cette
différence était significative indépendamment de la température à laquelle le lait a été stocké
alors que pour certains antibiotiques était non significative (p > 0.05). Ceci était pour
neospyramycine, sulfamethoxypyridazine, sulfaquinoxaline, oxytétracycline (OTC) et
tétracycline (TC) à 4 °C; pour pénicilline G, triméthoprime à 21°C et pour: tylosine,
dicloxacilline, sulfapyridine, sulfisoxazole dans les deux températures. Les résultats n’ont
aussi montrés aucune différence significative entre les concentrations d’antibiotiques présents
dans les échantillons de lait conservés 2 jours dans les deux températures. Cependant, après
l’analyse des échantillons conservés pendant 7 jours une différence significative entre certains
antibiotiques a été observée. À 21°C après 7 jours il était possible de mesurer
significativement plus d'antibiotiques, neospyramycine, spyramicine, cloxacilline,
dicloxacilline, pénicilline G, sulfacetamide, sulfadoxine, sulfamethoxazole, sulfamoxole. Une
évaluation de l’effet des deux températures 4°C et à 21°C sur la concentration des
antibiotiques présents analysés en même jours d’analyse a été réalisée. A partir de ses

120
Chapitre IV Résultats et discussion

résultats tous ces antibiotiques à titre d’exemple l’oxytétracycline, tétracycline, ampicilline,

sulfadoxine et sulfadimidine ont été détectés au deuxième jour de conservation à 4°C mieux
qu’à 21°C alors qu’une augmentation de concentration a été remarquée pour les macrolides à
21°C mieux qu’à 4°C. Parallèlement, Les résultats du septième jour de conservation ont
montrés qu’aucune différence n’a été enregistrée entre les concentrations à 4°C et à 21°C pour
les quinolones et les macrolides bien que les sulfamides ont été plus détectés à 4°C qu’à 21°C.
Ainsi une analyse des échantillons conservés à -20°C après 1mois (j30), 2mois (j60) et 3mois
(j90) a été effectuée et une comparaison entre ses résultats a révélé qu’une dégradation
remarquable a été enregistrée après 3mois de conservation pour sulfaguanidine,
sulfamérazine, sulfamethoxypyridazine, sulfapyridine, sulfathiazole, tétracycline et
marbofloxacine alors que les pénicillines ont été plus stables et ont présentés des valeurs
élevées après 3mois de conservation (ces résultats sont consignés dans l’annexe 03).

121
Chapitre IV Résultats et discussion

-a-

-b-
Figure 22: Estimation de la concentration des tétracyclines dans des échantillons de lait conservés à
4°C (a) et 21°C (b) durant deux périodes de temps (2 et7 jours).

Average Rec% : (Moyenne des Rendement), D : jour

122
Chapitre IV Résultats et discussion

-a-

-b-
Figure 23: Estimation de la concentration des pénicillines dans des échantillons de lait conservés à
4°C (a) et 21°C (b) durant deux périodes de temps (2 et7 jours).

123
Chapitre IV Résultats et discussion

-a-

-b-
Figure 24: Estimation de la concentration des macrolides dans des échantillons de lait conservés à
4°C (a) et 21°C (b) durant deux périodes de temps (2 et7 jours).

124
Chapitre IV Résultats et discussion

-a-

-b-

Figure 25: Estimation de la concentration des quinolones dans des échantillons de lait conservés à
4°C (a) et 21°C (b) durant deux périodes de temps (2 et7 jours).

125
Chapitre IV Résultats et discussion

-a-

-b-
Figure 26: Estimation de la concentration des sulfamides dans des échantillons de lait conservés à 4°C
(a) et 21°C (b) durant deux périodes de temps (2 et7 jours).

126
Chapitre IV Résultats et discussion

Dans la littérature, La stabilité de cinq antibiotiques majeurs des ß-lactames (l'amoxicilline,

ampicilline, cloxacilline, oxacilline et la pénicilline G) dans le lait fortifié et dans des extraits
de lait préparés pour l'analyse LC-MS/MS a été étudiée au changement de températures à
froid (4, -20 et -76 °C). Le stockage d'échantillons de lait à 4 °C a abouti aux pertes
mesurables de tous les ß-lactames après 6 jours (> 50 % dans la plupart des cas). La
dégradation lente de pénicilline G, cloxacilline et oxacilline a été observée dans le lait stocké
à-20 °C, mais aucune perte n'a été enregistrée à -76 °C plus de 4 semaines (Riediker et al.,
2004). Roca et al., (2011) ont signalé que l'augmentation de la température de 60°C à 100°C
a diminué la demi-vie d'amoxicilline (372 à 50 min), ampicilline (741 à 26 min), cloxacilline
(367 à 46 min) et la pénicilline G (382 à 43 min). Les traitements thermiques à hautes
températures et longues durés (par exemple, 120°C pendant 20min) ont mené à la dégradation
supplémentaire des antibiotiques ß-lactames avec des pourcentages près de 100 % pour
cefoperazone et cefuroxime. En revanche, quand le lait a été soumis aux traitements
thermiques à basses températures et des temps courts (par exemple, 72°C pour 15 s), la
dégradation de ß-lactames dans le lait n'a pas excédé 1% pour les 10 antibiotiques testés.
Alors que, Grunwald et Petz, (2003) ont indiqué que les facteurs principaux menant à la
diminution de résidus des pénicillines sont la température pendant le traitement thermique (90
°C, 15 minute) du lait avant que les cultures de yaourt ont été ajoutées, l'attachement des
pénicillines aux protéines de lait, le temps et la température de fermentation et l'influence des
cultures initiales. Tandis que, Rizwan et al., (2014) ont trouvé que 5% des échantillons du lait
bouillés collectés à Pakistan sont contaminés avec pénicilline.

Les résultats de Roca et al., (2010) ont montré que les quinolones sont très résistants aux
différents traitements thermiques avec les pertes maximales de concentration de 12.71% pour
ciprofloxacine et 12.01% pour norfloxacine à 120 °C et 20 min. Ces résultats sont supportés
par ceux de Fisher et al., (2010) qui ont trouvé que tous les antibiotiques (quinolones)
exposent la stabilité haute thermique; chaque composé a une base thermodynamique
différente pour la stabilité. Par conséquent, la haute stabilité de quinolones représente un
risque significatif à la santé humaine parce que les résidus de ces antibiotiques peuvent rester
dans le lait après le traitement thermique et, donc, peuvent atteindre l'industrie laitière et les
consommateurs (Roca et al., 2010). Les résultats obtenus par Abbasi et al., (2011) ont révélé
que 24.4%, 30 % et 28.6 % des échantillons du lait pasteurisés, et stérilisés, avaient
respectivement des résidus tétracyclines supérieurs aux niveaux maximaux recommandés
(100ng/g). Ainsi que, Rizwan et al., (2014) ont trouvé que 5% des échantillons du lait bouillés

127
Chapitre IV Résultats et discussion

sont contaminés avec oxytétracycline et cela indique que les tétracyclines persistent dans le
lait même après Pasteurisation. Roca et al., (2013) ont examiné la cinétique de la dégradation
de huit sulfamides dans le lait écrémé chauffé à 60, 70, 80, 90 et 100°C avec LC-MS/MS.
l'Application d'équations cinétiques aux différents traitements thermiques utilisés dans le
traitement de laiterie indique que les sulfamides sont très stables pendant la pasteurisation
(63°C; 30 min et 72°C; 15 s) aussi bien que l’UHT stérilisation (140 °C; 4 s). Au contraire,
les calculs exécutés avec le modèle cinétique ont évalué des pertes dans des concentrations
entre 6.5 % (sulfadimethoxine) et 85.1 % (sulfamethazine) pour la stérilisation à 120 °C
pendant 20 min. Tandis que, pour les macrolides aucune information n’a été trouvée sur leur
stabilité dans le lait.

128
Conclusion
 Conclusion

Conclusion

L’utilisation des médicaments vétérinaires constitue le premier réflexe des éleveurs. Si le but
de leur utilisation est de sécuriser les productions et de mieux extérioriser les potentialités
animales, il existe cependant de nombreux problèmes liés à cette pratique. L’emploi non
contrôlé et abusif des antibiotiques chez les vaches laitières conduit à leurs présence sous
forme de résidu dans le lait. Or, ces résidus constituent une préoccupation majeure tant pour
les consommateurs et les services officiels sur le plan sanitaire que pour les industriels sur les
plans technologique, commercial et médiatique. Pour l'industrie laitière, dont l'objectif est de
disposer d'une matière première conforme aux exigences réglementaires et apte à subir une
transformation, il est nécessaire de dépister les résidus d'antibiotiques dans le lait à chaque
collecte. Les éleveurs restent le maillon principal pour la qualité des denrées alimentaires
d’origine animale ainsi que les vétérinaires qui ont une place centrale dans la maîtrise de
l’utilisation des antibiotiques en santé animale. Ils interviennent notamment au stade de la
conception, du développement, de l’autorisation de mise sur le marché du médicament
vétérinaire antibiotique, mais aussi et surtout dans sa distribution, son administration ainsi que
dans le contrôle des bonnes pratiques de son utilisation. Egalement, Les autorités prennent
une grande part de responsabilité lors d’absence d’une législation rigoureuse et stricte relative
à l’utilisation des médicaments vétérinaires et qui reste sommaire faute de ressources
financières et humaines.

Vue les risques que cause la présence des résidus d’antibiotiques dans les denrées alimentaires
d’origine animale et le manque d’un contrôle officiel, l’objectif de cette étude était d’évaluer
les niveaux de contamination dans la région de Guelma d’une denrée alimentaire largement
utilisée qui est le lait sous deux formes cru et lben par deux méthodes Delvotest SP-NT et
UPLC-MS/MS. D’après les résultats obtenus, il s’avère que 65.5 % des échantillons de lait
local étaient contaminés par des résidus d’antibiotiques autorisés à des niveaux supérieurs à la
LMR, des résidus qui ne possèdent pas de MRL, ou même des résidus qui sont interdits
d’utilisation chez les animaux producteurs du lait.

La corrélation entre les résultats obtenus par les deux méthodes a révélé que le test
d’inhibition microbiologique Delvotest SP-NT ne pourrait être fiable dans des conditions
comme celles en Algérie pour une détection précise des résidus d’antibiotiques dans le lait.
Tandis que, l’UPLC-MS/MS a présenté une détection alternative avec une possibilité d’une

129
 Conclusion

investigation profonde de chaque type d’antibiotique en appliquant une extraction spécifique

afin d’augmenter la sensibilité de la méthode et diminuer la limite de détection (LOD).

Subséquemment, une méthode analytique de LC-MS/MS polyvalente est prête d’être utilisée
dans un Plan National de Control des Résidus en Algérie pour surveiller et déterminer la
présence des multi-résidus d’antibiotiques dans le lait et autres matrices des denrées
alimentaires après optimisation.

Les résultats de cette recherche ont révélé non seulement la présence de résidus
d’antibiotiques dans le lait cru, mais aussi et pour la première fois la présence de résidus
d’antibiotiques dans le lait transformé, en l’occurrence le lben.

Perspectives

Le statut actuel de la qualité du lait de la wilaya de Guelma vis-à-vis de la contamination par

les résidus d’antibiotiques explique l’absence totale d’un contrôle alimentaire. Cette situation
est préoccupante et certaines mesures doivent être réalisées:

La mise en place d’un plan national de contrôle rigoureux pour la recherche des résidus
d’antibiotiques dans les denrées alimentaires d’origine animale au sein des fermes, des usines
et des points de ventes afin de rassurer la sécurité du consommateur. Une pénalisation sur un
lait contaminé peut freiner l’utilisation anarchique de ces médicaments.

Le renforcement des laboratoires de recherche de matériels d’analyse plus développés tels que
l’UPLC-MS/MS facilite l’analyse d’un grand nombre d’échantillons en même temps.

Ce travail pourra être poursuivi par l’élargissement de la recherche à d’autres molécules

d’antibiotiques.

L’étude de la stabilité des résidus d’antibiotiques dans le lait dans différentes conditions et
une compréhension de l’effet de leur présence sur l’émergence de la résistance bactérienne
semble être deux thématiques de recherche très importantes à prendre en considération par les
futurs chercheurs.

130
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Annexes
 Annexes

Annexe 01

Tableau 01 : Comparaison entre les quatre méthodes d’extraction M1 (3mlv), M2 (10mlv),

M3 (10mlvm) et M4 (0.5 ml art) par antibiotique.

Antibiotique Comparaison Différence Valeur P

amoxicilline 0,5ml art-10mlv 0.3198 0.0073

amoxicilline 0,5ml art-10ml vm -0.3971 0.0042

amoxicilline 0,5ml art-3mlv 0.444 0.0001

amoxicilline 10mlv-10ml vm -0.7169 0.0001

amoxicilline 10mlv-3mlv 0.1242 0.953

amoxicilline 10ml vm-3mlv 0.8411 0.0001

Ampicilline 0,5ml art-10mlv 1.6976 0.0001

Ampicilline 0,5ml art-10ml vm 0.7042 0.0001

Ampicilline 0,5ml art-3mlv 1.956 0.0001

Ampicilline 10mlv-10ml vm -0.9934 0.0001

Ampicilline 10mlv-3mlv 0.2585 0.1034

Ampicilline 10ml vm-3mlv 1.2519 0.0001

cloxacilline 0,5ml art-10mlv 0.0443 0.9999

cloxacilline 0,5ml art-10ml vm 0.027 0.9999

cloxacilline 0,5ml art-3mlv 0.0431 0.9999

cloxacilline 10mlv-10ml vm -0.0174 0.9999

cloxacilline 10mlv-3mlv -0.0012 0.9999

 Annexes

Antibiotique Comparaison Différence Valeur P

cloxacilline 10ml vm-3mlv 0.0161 0.9999

dicloxacilline 0,5ml art-10mlv 0.5281 0.0026

dicloxacilline 0,5ml art-10ml vm 0.3882 0.1981

dicloxacilline 0,5ml art-3mlv 0.5065 0.0058

dicloxacilline 10mlv-10ml vm -0.1399 0.9643

dicloxacilline 10mlv-3mlv -0.0216 0.9999

dicloxacilline 10ml vm-3mlv 0.1183 0.9987

érythromycine 0,5ml art-10mlv -0.0059 0.9999

érythromycine 0,5ml art-10ml vm -0.1974 0.0244

érythromycine 0,5ml art-3mlv -0.0327 0.9984

érythromycine 10mlv-10ml vm -0.1915 0.0397

érythromycine 10mlv-3mlv -0.0268 0.9999

érythromycine 10ml vm-3mlv 0.1648 0.2407

Fluméquine 0,5ml art-10mlv 0.5187 0.0001

Fluméquine 0,5ml art-10ml vm 0.2756 0.0228

Fluméquine 0,5ml art-3mlv 0.4294 0.0001

Fluméquine 10mlv-10ml vm -0.2432 0.0001

Fluméquine 10mlv-3mlv -0.0894 0.0455

Fluméquine 10ml vm-3mlv 0.1538 0.1212

marbofloxacine 0,5ml art-10mlv 0.604 0.0001

 Annexes

Antibiotique Comparaison Différence Valeur P

marbofloxacine 0,5ml art-10ml vm 0.0464 0.9999

marbofloxacine 0,5ml art-3mlv 0.5083 0.0001

marbofloxacine 10mlv-10ml vm -0.5575 0.0001

marbofloxacine 10mlv-3mlv -0.0956 0.9996

marbofloxacine 10ml vm-3mlv 0.4619 0.0002

nafcilline 0,5ml art-10mlv -0.0046 0.9999

nafcilline 0,5ml art-10ml vm -0.0784 0.9999

nafcilline 0,5ml art-3mlv 0.02 0.9999

nafcilline 10mlv-10ml vm -0.0738 0.9999

nafcilline 10mlv-3mlv 0.0246 0.9999

nafcilline 10ml vm-3mlv 0.0983 0.9999

oxacilline 0,5ml art-10mlv 0.4154 0.0429

oxacilline 0,5ml art-10ml vm 0.2486 0.9428

oxacilline 0,5ml art-3mlv 0.423 0.0333

oxacilline 10mlv-10ml vm -0.1668 0.9664

oxacilline 10mlv-3mlv 0.0076 0.9999

oxacilline 10ml vm-3mlv 0.1744 0.9357

pénicilline G 0,5ml art-10mlv 0.0999 0.0742

pénicilline G 0,5ml art-10ml vm -0.6988 0.0001

pénicilline G 0,5ml art-3mlv -0.5805 0.0001

 Annexes

Antibiotique Comparaison Différence Valeur P

pénicilline G 10mlv-10ml vm -0.7987 0.0001

pénicilline G 10mlv-3mlv -0.6804 0.0001

pénicilline G 10ml vm-3mlv 0.1183 0.9966

tylosine 0,5ml art-10mlv 0.0346 0.9999

tylosine 0,5ml art-10ml vm -0.4189 0.0001

tylosine 0,5ml art-3mlv -0.2263 0.0087

tylosine 10mlv-10ml vm -0.4535 0.0001

tylosine 10mlv-3mlv -0.2609 0.0006

tylosine 10ml vm-3mlv 0.1926 0.5369

 Annexes

Annexe 02

Tableau 01 : Les coefficients de corrélation obtenus pour tous les antibiotiques analysés

Groupe et type d’antibiotique Coefficients de corrélation

Macrolides
Erythromycine 0,97
Neospyramycine 0,96
Spiramycine 0,91
Tilmicosine 0,80
Tylosine 0,99
Josamycine 0,90
Tulathromycine 0,96
Tylvalosine 0,93
Pénicillines
Amoxicilline 0,96
Ampicilline 0,95
Cloxacilline 0,92
Dicloxacilline 0,94
Nafcilline 0,91
Oxacilline 0,95
pénicilline G 0,95
Quinolones
Enrofloxacine 0,89
Fluméquine 0,89
Marbofloxacine 0,86
Danofloxacine 0,65
Acide oxolinique 0,76
Difloxacine 0,94
 Annexes

Groupe et type d’antibiotique Coefficients de corrélation

Sulfamides
Sulfacetamide 0,95
Sulfachloropyridazine 0,94
Sulfadiazine 0,80
Sulfadimethoxine 0,93
Sulfadimidine 0,92
Sulfadoxine 0,93
Sulfaguanidine 0,95
Sulfamerazine 0,94
Sulfamethizole 0,88
Sulfamethoxazole 0,94
Sulfamethoxypyridazine 0,94
Sulfamonomethoxine 0,95
Sulfamoxole 0,92
Sulfapyridine 0,94
Sulfaquinoxaline 0,94
Sulfathiazole 0,92
Sulfisoxazole 0,91
Triméthoprime 0,88
Tétracyclines
Chlortétracycline 0,94
Oxytétracycline+ 4-Epi-Oxytétracycline 0,97
Tétracycline+ 4-Epi-Tétracycline 0,94
Doxycycline 0,93
Annexes

Annexe 03

-a-
Annexes

-b-
Annexes

-c-
Annexes

-d-
 Annexes

-e-
Figure 1 : Estimation de la concentration de toutes les familles d’antibiotiques testées –a, b, c,
d, e- dans des échantillons de lait conservés à 4°C et 21°C en même jour d’analyse J2 et à J7.
Average Rec% : moyenne des rendements. D : jour.
Annexes

-a-
 Annexes

-b-

Figure 02: Estimation de la concentration de toutes les familles d’antibiotiques testées –a et b- dans des échantillons de lait conservés à
21°C et à -20°C durant des périodes de temps différentes (7, 30, 60 et 90jours).
Annexes
Résumé
 Résumé

Résumé
Compte tenu du manque des données sur le statut des denrées alimentaires d’origine animale
et précisément le lait commercialisées à Guelma vis-à-vis la présence des résidus
d’antibiotiques, notre étude vise à chercher leur présence dans le lait de vache cru et lben.

Dans cette étude, deux méthodes ont été utilisées Delvotest SP-NT et UPLC-MS/MS. les
résultats obtenus avec Delvotest SP-NT sont vérifiés et validés par la méthode de
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS/MS). D’après les
résultats de cette dernière, 65.46% des échantillons ont été positifs contenant des résidus
d’antibiotiques au-delà de la LMR, des résidus qui n’ont pas de LMR ou des résidus interdits.
La comparaison entre les résultats obtenus par les deux méthodes a révélé que le Delvotest
SP-NT est peu fiable à cause du nombre des résultats faux négatifs. Ces résultats ont exprimé
le statut actuel de la qualité du lait distribué pour une consommation directe et/ou pour une
transformation. Cette situation peut être confirmée par un contrôle au niveau national avec des
analyses plus profondes sur la présence des résidus d’antibiotiques dans les denrées
alimentaires d’origine animale.

Mots clés: résidus d’antibiotiques, Delvotest SP-NT, UPLC-MS/MS, faux positifs, faux
négatifs, lait fermenté (lben).
 Résumé

Abstract

Taking into consideration the lack of data on the statute of foodstuff originated from animals
especially milk commercialized in Guelma against antibiotic residues presence, our study
aims to search their presence in cow’s milk raw and lben.

In this work, two methods were used Delvotest SP-NT and UPLC-MS/MS. Results obtained
using Delvotest SP-NT are verified and validated by a liquid chromatography coupled to mass
spectrometry (UPLC-MS/MS). Among the latter findings, 65.46% of non-conform samples
contained authorized residues at levels higher than the MRL, residues without set MRL, or
non-authorized residues. The comparison between both methods results showed that Delvotest
SP-NT is less trustworthy due to number of false negative results. These results showed the
current statute on the quality of milk distributed to a direct consumption and/or for
transformation. This assumption could be confirmed by a nationwide study with more in-
depth analyses of antibiotic's presence in food chain originated from animals.

Keywords: antibiotic residues, Delvotest SP-NT, UPLC-MS/MS, false positive, false

negative, fermented milk (lben).
 ‫‪Résumé‬‬

‫ملخص‬
‫تهدف هذه الدراسة إلى البحث عن بقايا المضادات الحيوية في حليب البقرة الطازج واللبن الخاص بمدينة قالمة‪ ،‬وهذا‬
‫نظرا لنقص المعلومات حول هذا الموضوع بصفة عامة في المواد الغذائية ذات مصدر حيواني‪.‬‬

‫و لتحقيق ذلك‪ ،‬تم استعمال وسيلتي تحليل مختلفتين هما‪ Delvotest SP-NT:‬و ‪ UPLC-MS/MS‬التي قمنا من‬
‫خاللها بالتأكد من النتائج المتحصل عليها بالطريقة األولى األقل تخصصا‪ .‬لقد أظهرت نتائجها‪ ،‬بأن ‪ % 65.46‬من عينات‬
‫الحليب المحللة كانت موجبة الحتوائها على بقايا المضادات الحيوية التي لديها قيمة قصوى )‪ (LMR‬والتي لم تحدد لها أي‬
‫قيمة حتى الوقت الحالي‪ .‬كما أنه تم إيجاد عدد قليل من العينات التي تحتوي على بعض المضادات الحيوية الممنوع‬
‫استخدامها في الحيوانات المنتجة للحليب‪ .‬في حين‪ ،‬بينت المقارنة بين النتائج المتحصل عليها بالطريقتين السالف ذكرهما؛‬
‫أنه ال يمكن الوثوق بالتحليل‪ ،Delvotest SP-NT‬وهذا تبعا لعدد نتائجه السلبية الخاطئة‪.‬‬

‫نستطيع أن نستخلص من النسبة المرتفعة للعينات الموجبة‪ ،‬الوضعية الراهنة لنوعية الحليب الذي يتم توزيعه ليستهلك‬
‫مباشرة أو يستعمل في انتاج مشتقاته و يمكن أن نتأكد من هذا بإجراء رقابة على المستوى الوطني؛ وذلك باعتماد تحاليل‬
‫أكثر عمقا حول تواجد بقايا المضادات الحيوية في المواد الغذائية ذات مصدر حيواني‪.‬‬

‫كلمات المفتاح‪ :‬بقايا المضادات الحيوية‪، UPLC-MS/MS، Delvotest SP-NT ،‬نتيجة موجبة خاطئة ‪،‬نتيجة سالبة‬
‫خاطئة‪ ،‬حليب متخمر (لبن)‪.‬‬
Layada et al. International Journal of Food Contamination (2016) 3:19
DOI 10.1186/s40550-016-0042-6
International Journal
of Food Contamination

DATA ARTICLE Open Access

Assessment of antibiotic residues in

commercial and farm milk collected in the
region of Guelma (Algeria)
Samiha Layada1*, Djemel-Eddine Benouareth1*, Wim Coucke2* and Mirjana Andjelkovic2*

Abstract
Background: In an attempt to enhance the quality and quantity of food production (especially milk) and in order
to prevent, or treat,animal diseases, the use of antibiotics in Algeria follows an increasing trend. The increased use
evidently contributes to the emergence of increased contamination levels of antibiotic residues.
Results: In this work, two methods were used to detect presence of antibiotic residues in raw and fermented cow’s
milk collected in Guelma’s farms (in Algeria). The screening comprised different points of sale in Guelma province.
In a first step a widely used prescreening method based on microbial inhibition assay; Delvotest SP-NT; was used to
analyze 131 milk samples. In a second step a liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) was
used. The latter was first optimized for extraction of 36 veterinary drugs of penicillins, quinolones, macrolides,
tetracyclines, sulfonamides, and trimethoprim from the collected milk. After simple extraction and dilution, the 194
samples, including those previously tested by the Delvotest SP-NT, were analyzed by LC-MS/MS. Results obtained
by both methods were compared. Among the LC-MS/MS findings, 65.46 % of non-conform samples contained
authorized residues at levels higher than the MRL, residues without set MRL, or non-authorized residues.
Conclusion: The comparison of both methods showed that Delvotest SP-NT is less trustworthy due to number of
false negative results. This was further confirmed by LC-MS/MS pointing out the traces of antibiotics in numerous
samples. In 65.46 % of milk samples residues of antibiotics were found suggesting a lack of public health controls
as well as an evidence of the negligent use of antibiotics in the livestock industry, which both form a risk to public
health. This indication should be confirmed by a nationwide study with in-depth analyses of antibiotic’s presence in
food chain originated from animals. The study offered an LC-MS/MS based analytical method ready to be used in
Algerian National Residues Control Plan as a versatile analytical tool to monitor and determine the occurrence of
antibiotic multi-residues in milk.
Keywords: Antibiotic residues, Delvotest SP-NT, LC-MS/MS, False positive, False negative, Fermented milk (lben)

Background in food products especially milk implicates certain dam-

Antibiotics are widely used in livestock production for ages in the public health like: the development of allergic
many purposes, such as: animal disease treatment reactions in some hypersensitive individuals, increased
(therapeutic application), animal disease prevention risk of carcinogenicity (Petrović et al. 2008; Hou et al.
(prophylactic application), and feed efficiency (as growing 2014), the growth of resistant bacterial strains, and imbal-
promoters) (Jank et al. 2015). Their presence as residues ances in intestinal microflora (Wang et al. 2006; Borràs et
al. 2011). Low concentrations of antimicrobial drug resi-
dues create problems in the production of milk products
* Correspondence: [Link]@[Link]; Benouareth_dje@[Link];
[Link]@[Link]; [Link]@[Link]
by inhibiting the starter cultures (Petrović et al. 2008;
1
Research Laboratory of Biology, Water and Environment, Biology Stead et al. 2008). Moreover, the risk of contamination
Department, Faculty of Natural and Life Sciences, Earth and Universe with antibiotic residues of farms milk is higher if inappro-
Sciences, University 8 Mai 1945-Guelma, BP 401, Guelma 24000, Algeria
2
Scientific Institute of Public Health, Juliette Wytsman Street 14, 1050
priate practices are applied. For these reasons, control
Brussels, Belgium measures must be implemented to prevent drug residues
© The Author(s). 2016 Open Access This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0
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reproduction in any medium, provided you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to
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from entering into the food chain. In this regard, and to They indicated that among all tested milk samples 89, 29,
ensure the safety of the consumer, worldwide regulatory and 47 % were found to contain residues, respectively.
authorities have set Maximum Residue Limits (MRLs) for This appears significantly high prevalence of positive sam-
several veterinary drugs (Kassaify et al. 2013). Since 2006, ples in comparison to results from any European Union
these substances are forbidden by the European Union country where a regular system for antibiotic residues
(EU) to be used either in sub-therapeutic doses for control in milk is many decades-old. On contrary in
prophylaxis or as growth promoters in veterinary medi- Algeria similar milk control appears to be immature. Con-
cine (Council Regulation No 1831/2003). Consequently, sequently, there are no data available on occurrence of
the presence of antibiotic residues in products that are tar- antibiotic residues in milk produced in Guelma province
geted for food consumption has to be controlled. Simi- located in North East of Algeria. Moreover, in any of the
larly, various analytical methods have been described to published reports contamination of fermented milk was
analyze milk; especially microbiological and immune as- not considered. The fermented milk - called lben- and
says which are widely used because of their low cost and cow’s milk are important components of Algerian’s diet
short time of analysis (Ramirez et al. 2003; Beltran et al. (Belhadia et al. 2011; Zoubeidi and Gharabi 2013). Lben is
2015). However, most current microbial screening tests traditional cultured milk widely consumed in North Africa
have been initially developed to detect β-lactams in cow’s and in Middle Eastern countries. It is produced by spon-
milk. They are based on the inhibition of Geobacillus taneous souring of cow’s milk followed by churning in
stearothermophilus var. calidolactis which is highly sensi- order to separate lben from butter. Whereas only one re-
tive to these substances (Beltran et al. 2015). Delvotest port about a similar milk type (raibi milk) is available
SP-NT is considered as one of the most commonly (Zinedine et al. 2007), no other data on the specific prod-
used microbial inhibition tests (Stead et al. 2008). How- ucts are available or known.
ever, the limited sensitivity and selectivity of the method In this work, the analyses of two types of milk (raw
demand further confirmation of the results obtained using and lben) collected in Guelma province (in the north of
more sensitive technique (Ferrini et al. 2015). Algeria) is presented. The samples were collected dir-
Instrumental techniques such as liquid chromatog- ectly from the farms, and further in the value chain from
raphy (LC) coupled to UV- VIS spectroscopy or mass dairy markets. Two methods were used to detect the
spectrometry (MS), are widely used in food control for presence of antibiotic residues in those samples. The
either screening or confirmation of positive findings of first one was Delvotest SP-NT, which is most commonly
less specific test within the following studies: Hermo et used test for this purposes in Algeria. The second one
al. (2008), Li et al. (2012), Boix et al. (2014), Hou et al. was an optimized LC-MS/MS multi-residues screening
(2014), Martins et al. (2014), and Cepurnieks et al. method. The results obtained by both tests were com-
(2015). Furthermore, LC-MS/MS is nowadays the most pared and correlated to evaluate the feasibility of the use
frequently used analytical tool for detecting a large num- of Delvotest SP-NT as a prescreening test in Algerian
ber of multiclass veterinary drug residues in food and setting. The optimization and validation of multi-residue
decreasing the rate of false negative and false positive re- LC-MS/MS screening method was performed following
sults with high selectivity and sensitivity (Martins et al. the international norms.
2014). Many papers have tackled the analysis of different
classes of veterinary antibiotics in milk using LC-MS/ Methods
MS (Bogialli et al. 2008; Hermo et al. 2008; Han et al. Samples and accompanying data
2015, and Meng et al. 2015). But recent research themes A total of 194 cow’s milk samples were collected.
have enlarged their interests to the development of mul- Among them, 156 samples were collected from two
ticlass veterinary drug residues methods which facilitate farms (A and B), whereas 38 (including fermented and
the discrimination of antibiotics in milk and other matri- raw cow’s milk) were purchased from 16 various points
ces; such as, the study of Martins et al. (2014), which of sale in Guelma province during the period of January
has established two screening methods that can analyze 2013 to July 2014. Of 156 farm samples 53 were col-
24 antibacterial and one metabolite residue in milk and lected from farm A located in the centrum of Guelma
liver using LC-MS/MS. province. The samples were gathered as such: 8 samples
Very few studies in Algeria have been conducted on were taken from individual cows which have been
the potential presence of antibiotic residues in raw cow’s treated less than a month prior to the collection, 28
milk samples and that was by using less specific micro- from individual untreated cows, and 17 samples were
biological methods. Of the few researches that are avail- collected from bulk tank milk at the farm. Similarly, 103
able, studies made by Tarzaali et al. (2008), Aggad et al. milk samples were collected from farm B located more
(2009), and Titouche et al. (2013) have described high than 7 Km far from Guelma center-. Their collection
levels of milk contamination by using Delvotest SP-NT. and number were as follows: milk from individual cows
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treated less than a month prior to the collection were standards sulfadimidine C13, flucloxacilline, norfloxacin_
18, milk from individual untreated cows were 70, and D5, roxythromycine, and demeclocycline, were from
bulk tank milk were 15. In addition to sampling for the Sigma-Aldrich (Bornem, Belgium). Besides, stock stan-
assessment of antibiotic residues, questionnaires were dards solutions of sulphonamides, penicillins, macrolides,
made to collect data on the cow’s treatment like: the and tetracyclines were prepared by dissolving 10 mg of
kind of antibiotic administered to the cow, the day of each substance into 10 mL of methanol, except for peni-
treatment, and the withdrawal time of each antibiotic cillins which were dissolved in 10 mL of Milli-Q water
used. The latter may vary from 2 to 7 days depending on (Millipore corp., Bedford, MA, USA). For the quinolones,
the administered antibiotics (penicillins, tetracyclines, 5 mg of each substance were dissolved into 10 mL of
macrolides and sulfonamides) and this either intermam- methanol. In addition, mixed intermediate standard solu-
mary or intramuscular. tions at 5MRL (Commission Regulation 2377/1990) were
Out of 38 milk samples purchased at various points of prepared from diluting stock standard solutions to obtain
sale in Guelma province, 22 were fermented milk “lben” a specific final concentration for each substance then con-
and 16 were raw cow’s milk. Seven points of sale were served them at −20 °C. Actually, solvents acetonitrile and
situated in the province’s capital whereas the others were methanol used for mobile phase and extraction were of
situated in separate regions surrounding the state. For UPLC-MS grade. They were purchased from Biosolve
this part of the value chain a short questionnaire was (Valkenswaard, the Netherlands). Yet, Formic acid, oxalic
used in order to collect more specific information about acid 10 mM, Ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)
the milk origin. Those data specified milk as collected 100 mM, and sodium sulfate anhydride were purchased
either from a farmer, private collection, milk factories, or from Merck (Darmstadt, Germany). The analytical liquid
from farms in Guelma municipalities and Souk Ahras chromatography column (Waters, Millford, MA, USA)
state. Due to missing data, other collections were indi- C18 2.1 × 100 mm, 1.7 μm was used.
cated as unknown origin.
Approximately a volume of 140 mL of each milk sam- Microbial inhibitor test (Delvotest SP-NT)
ple was collected and conserved in sterile flask and Delvotest SP-NT, which is a non-specific microbial in-
transported to the laboratory at 4 °C. Ten millilitre were hibitor test, was used to detect the presence of antibi-
used to be analyzed by a microbial test Delvotest SP-NT otics in milk samples. In short this is an agar diffusion
for the prescreening of antibiotics in milk samples. The test that contains a standardized number of Bacillus
remaining 130 mL were frozen and kept at −20 °C prior stearothermophilus spores, selected nutrients, and pH
to further analysis by LC/MS-MS. Two blank milk sam- indicator bromocresol purple. Four kits of Delvotest SP-
ples were assigned in the collection after a negative test NT (DSM, Netherlands) were used whereas three were
for antibiotics by Delvotest SP-NT and one purchased provided by DSM Food Specialties located in Spain, and
from Belgian supermarket for LC-MS/MS analysis. the fourth was purchased. After adding milk sample dir-
ectly to the agar bed (ampoules), an incubation step was
Chemicals conducted for 3 h at 64 °C. During incubation, microbial
The following reference standards were from Sigma- metabolism resulted in a change in pH, and hence in a
Aldrich (Bornem, Belgium). The sulfonamides (sulfapyri- change of color from purple to yellow. By contrast, if the
dine, sulfamethoxypyridazine, sulfadoxine, sulfadimidine, sample contained sufficiently high concentrations of in-
sulfamonomethoxine, sulfaquinoxaline, sulfamoxole, sul- hibitory substances, the color would remain purple (Stead
fachloropyridazine, sulfadimethoxine, sulfathiazole, sulfa- et al. 2008). Except fermented milk, 10 mL of each raw
guanidine, sulfamerazine, sulfamethoxazole, sulfadiazine, milk sample was heated at 80 °C for 10 min to destroy
sulfacetamide, sulfisoxazole, sulfamethizole), trimetho- natural inhibitors lysozyme and lactoferrin (Hillerton et al.
prim, penicillins (amoxicillin, ampicillin, penicillin V, 1999). In parallel, 0.1 mL was decanted into Delvotest SP-
penicillin G, dicloxacillin, cloxacillin, oxacillin, nafcillin), NT ampoules using a specific pipette for each sample. The
quinolones (flumequine, difloxacin, sarafloxacin, cipro- ampoules were incubated in water bath at 64 °C ± 2 °C
floxacin, enrofloxacin, danofloxacin, nalidixic acid, marbo- within 3 h. Test and data interpretation were performed
floxacin, norfloxacin, ofloxacin, oxolinic acid), macrolides according to the manufacturer’s instructions.
(erythromycin, spiramycin, josamycin, clindamycin, linco-
mycin, neospyramycin, tilmicosin, tylosin, tylvalosin, Extraction optimization
tulatrhomycin), and tetracyclines (doxycycline, oxytetra- The extraction procedure was based on an existent
cycline, 4-epi- chlortetracycline, 4-epi-oxytetracycline, 4- method for screening of antibiotics in meat. This
epi- tetracycline, tetracycline, chlortetracycline) were with method was previously developed and validated in ac-
a purity of 95 to 100 %. These standards were used to pre- cordance with the European commission (Commission
pare stock standards solutions. Similarly, the internal Decision 2002). In this study, only 36 antibiotics were
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selected to be followed in milk samples during method anhydride were added. The spiked samples were fortified
optimization instead of 59 ones targeted in the initial with 250 μL of each mixed standard solutions at 1MRL as
method. The selected antibiotics had either the same above in order to obtain levels corresponding to 0.5 MRL.
level of MRL both in milk and meat, or lower MRL in Samples were vortexed for 1 min, and centrifuged at
milk than in meat as prescribed in European commis- 10,000 rpm for 10 min at 4 °C. Subsequently, 5 mL of the
sion (Commission Regulation 37/2010). With required supernatant was decanted into 10 mL tubes and evapo-
scrutiny, the selection of the appropriate method for the rated to dryness at 40 °C. Three-hundred microlitre of
extraction of antibiotics residues in milk was based on Milli-Q water was added into tubes after evaporation,
the comparison between four modified extraction proto- vortexed for a few seconds and transferred to eppendorfs
cols as briefly presented in Table 1. All protocols were tubes to be centrifuged at 12,000 rpm for 30 min. Super-
tested on a set of a blank milk sample and two control natant was filtered through a 0.2 μm filter directly to
samples spiked with mixture of antibiotic standards. Out injection vial prior to LC-MS/MS analysis.
of the comparative overview of the average recoveries
obtained by four extraction protocols (Table 2), method LC-MS/MS analysis
3 was selected as the optimal. Further details are ex- UPLC analysis was performed using an Acquity sample
plained in the section of Optimization of the LC-MS/ and solvent manager (Waters, Milford, MA, USA). Chro-
MS screening method results. The following list includes matographic separation was achieved using an Acquity
the steps of the extraction procedure. Ten grams of one UPLC column C18 2.1 × 100 mm 1.7 μ (Waters, Millford,
blank and two control milk samples were weighed in MA, USA) at 30 °C with the mobile phase composed by
50 mL falcon. To these 500 μL of mixed internal standard 0.1 mM oxalic acid, 0.1 % formic acid (solution A) and
solution at 1MRL, 667 μL of EDTA 0.1 M, 23 mL of the acetonitrile 0.1 % formic acid (solution B) at a constant
mixture (methanol/acetonitrile) and 3 g of sodium sulfate flow of 0.4 mL min-1. The gradient elution program used

Table 1 Comparative overview of four extraction methods parameters

Extraction steps Method 1 Method 2 Method 3 Method 4
(Martins et al. (2014))
1) Sample amount 3g 10g 10g 0.5g
2) Type of container 50mL Falcon tube 2mL Eppendorf tube
3) Mixed internal standard solution, 150μL 150μL 500μL 12.5μL
1MRL (EU2377/90)
4) EDTA, 0.1M 200μL 200μL 667μL 30μL
5) Mixture methanol/acetonitrile 7mL 7mL 23mL /
6) Sodium sulfate anhydride 3g 3g 3g /
7) Mixed standard solution* 75μL 75μL 250μL 12.5μL
8) Vortexing 1min 10sec and equilibration for 10min from light
9) Centrifugation 10000rpm, 10min at 4°C
10) Deprotonization 0.6mL
Ethanol/acetic acid (96/4)
Followed by short vortexing and 30min
at -18°C incubation
11) Supernatant 5mL evaporated to dryness at 40°C /
followed by addition of 300 μL
of water MilliQ
12) Vortex and centrifugation Few seconds
12000rpm during 30min
13) Supernatant All supernatant 0.75mL with addition of 0.25mL
Formic acid 0.1% in water/ formic acid
in acetonitrile (98:2)
14) Filtration 0.2μm filter /
*mixed standard solution contained: Sulfonamides (sulfapyridine, sulfamethoxypyridazine, sulfadoxine, sulfadimidine, sulfamonomethoxine, sulfaquinoxaline,
sulfaquinoxaline, sulfamoxole, sulfachlorpyridazine, sulfadimethoxine, sulfaquinoxaline, sulfathiazole, sulfaguanidine, trimethoprim, sulfamerazine,
sulfamethoxazole, Sulfadiazine, sulfacetamide, sulfisoxazole), penicillins (amoxicillin, ampicillin, penicillin V, penicillin G, dicloxacillin, cloxacillin, oxacillin, nafcillin)
quinolones (flumequine, difloxacin, sarafloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin, nalidixic acid, marbofloxacin, norfloxacin, ofloxacin , oxolinic acid),
macrolides (erythromycin, spiramycin, josamycin, clindamycin, lincomycin, neospyramycin, tilmicosin, tylosin, tylvalosin, tulatrhomycin), tetracyclines (doxycycline ,
oxytetracycline ,4-epi- chlortetracycline, 4-epi-oxytetracycline, 4-epi- tetracycline, tetracycline, chlortetracycline)
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Table 2 All parameters used for the comparison between four methods (M1, M2, M3 and M4) and the final selection of the test suitable method
Group and type of antibiotic Spiked Concentration Average Rec% ± Average Rec% ± Average Rec% ± Average Rec% ± MRL in milk MRL in meat MRL milk/MRL
(μg/L) STDEV M1 STDEV M2 STDEV M3 STDEV M4 (μg/L) (μg/L) meat
Macrolides 35.65 ± 2.72 24.50 ± 8.54 73.66 ± 8.33 79.20 ± 6.51
ab a b
Erythromycin 2000 3.40 ± 0.98 0.67 ± 0.35 20.10 ± 3.77 0.00a ± 0.00 40 200 0.2
Neospyramycin 2500 18.78 ± 1.33 22.14 ± 1.10 70.31 ± 11.95 102.99 ± 3.17 200 200 1
Spiramycin 2500 25.96 ± 3.06 29.07 ± 1.18 53.17 ± 4.80 37.45 ± 2.02 200 200 1
Tilmicosin 500 96.42 ± 2.34 63.54 ± 39.90 171.49 ± 11.93 245.02 ± 27.02 50 50 1
a b a b
Tylosin 1000 33.69 ± 5.89 7.08 ± 0.16 53.23 ± 9.22 10.55 ± 0.35 50 100 0.50
Penicillins 34.36 ± 2.10 30.36 ± 1.87 72.33 ± 9.17 75.42 ± 7.91
Amoxicillin 500 57.08a ± 4.54 69.32a ± 0.38 143.26b ± 25.38 107.28c ± 35.83 4 50 0.08
a a b
Ampicillin 500 78.19 ± 7.09 104.03 ± 7.99 204.73 ± 26.17 273.58c ± 7.65 4 50 0.08
a a a a
Cloxacillin 30,000 1.43 ± 0.12 1.31 ± 0.03 3.05 ± 0.21 5.76 ± 0.49 30 300 0.1
Dicloxacillin 3000 9.13a ± 0.44 6.96a ± 0.09 21.14ab ± 2.80 60.03b ± 5.54 30 300 0.1
a a a a
Nafcillin 3000 8.23 ± 0.20 10.69 ± 0.12 18.07 ± 0.39 10.23 ± 0.31 30 300 0.1
Oxacillin 3000 10.99a ± 0.86 11.72a ± 0.27 28.44ab ± 1.39 53.30b ± 2.03 30 300 0.1
a b a b
Penicillin G 500 75.48 ± 1.44 8.46 ± 4.25 87.64 ± 7.85 17.76 ± 3.53 4 50 0.08
Quinolones 37.05 ± 2.20 26.58 ± 1.62 76.52 ± 1.74 83.07 ± 13.94
Enrofloxacin 500 53.28 ± 3.60 40.40 ± 1.90 110.21 ± 1.22 95.99 ± 19.05 100 100 1
Flumequine 1000 9.05a ± 1.45 0.00b ± 0.00 24.33a ± 0.70 52.72c ± 9.48 50 200 0.25
a a b b
Marbofloxacin 750 48.80 ± 1.55 39.32 ± 2.94 95.02 ± 3.29 100.49 ± 13.30 75 150 0.5
Sulfonamides 34.80 ± 1.32 29.49 ± 2.52 94.58 ± 6.43 99.73 ± 9.82
Sulfacetamide 1000 18.54 ± 1.36 14.02 ± 1.57 35.42 ± 8.03 20.53 ± 2.80 100 100 1
Sulfachloropyridazine 1000 38.38 ± 0.48 26.78 ± 3.87 108.43 ± 0.11 132.90 ± 3.87 100 100 1
Sulfadiazine 1000 25.49 ± 2.58 24.09 ± 0.89 58.88 ± 0.63 65.94 ± 3.54 100 100 1
Sulfadimethoxine 1000 14.31 ± 1.46 7.10 ± 0.40 41.56 ± 1.33 85.52 ± 2.47 100 100 1
Sulfadimidine 1000 39.33 ± 0.21 38.29 ± 1.55 114.46 ± 7.31 123.00 ± 9.00 100 100 1
Sulfadoxine 1000 30.31 ± 0.74 16.97 ± 2.60 82.33 ± 0.96 153.84 ± 1.11 100 100 1
Sulfaguanidine 1000 18.64 ± 0.12 14.25 ± 0.14 39.51 ± 7.71 26.60 ± 10.07 100 100 1
Sulfamerazine 1000 9.70 ± 1.57 7.65 ± 0.11 39.23 ± 1.08 89.31 ± 11.19 100 100 1
Sulfamethizole 1000 42.44 ± 0.80 55.31 ± 7.74 92.82 ± 1.55 84.97 ± 4.78 100 100 1
Sulfamethoxazole 1000 43.95 ± 6.02 18.70 ± 3.82 127.40 ± 4.92 161.97 ± 15.02 100 100 1

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Sulfamethoxypyridazine 1000 43.94 ± 0.02 51.72 ± 1.76 140.44 ± 5.21 165.70 ± 12.54 100 100 1
Sulfamonomethoxine 1000 42.22 ± 1.56 50.56 ± 0.46 148.67 ± 9.67 174.34 ± 7.26 100 100 1
Sulfamoxole 1000 38.61 ± 1.46 19.51 ± 2.34 80.30 ± 10.71 100.31 ± 23.38 100 100 1
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Table 2 All parameters used for the comparison between four methods (M1, M2, M3 and M4) and the final selection of the test suitable method (Continued)
Sulfapyridine 1000 29.02 ± 0.68 31.62 ± 2.64 89.32 ± 6.45 101.35 ± 18.40 100 100 1
Sulfaquinoxaline 1000 13.64 ± 0.32 10.28 ± 2.07 28.72 ± 5.89 79.34 ± 14.84 100 100 1
Sulfathiazole 1000 36.39 ± 1.95 39.05 ± 0.88 88.64 ± 5.73 41.14 ± 21.28 100 100 1
Sulfisoxazole 1000 55.57 ± 0.80 29.05 ± 2.59 168.29 ± 12.57 62.20 ± 4.43 100 100 1
Trimethoprim 1000 86.00 ± 1.57 75.98 ± 9.94 217.95 ± 25.88 126.27 ± 10.81 50 50 1
Tetracyclines 25.73 ± 0.54 21.89 ± 17.13 73.50 ± 12.79 52.61 ± 7.69
Chlortetracycline 1000 18.87 ± 0.49 21.77 ± 9.36 30.30 ± 6.29 35.67 ± 6.17 100 100 1
Oxytetracycline+ 4-Epi- 1000 32.79 ± 0.77 22.24 ± 23.07 108.49 ± 15.90 48.16 ± 2.89 100 100 1
Oxytetracycline
Tetracycline+ 4-Epi-Tetracycline 1000 25.53 ± 0.36 21.67 ± 18.97 81.72 ± 16.19 74.02 ± 14.00 100 100 1
Means with the same letter do not differ significantly at the level of 0.05
STDEV Standard Deviation, Rec Recovery
*the estimated concentration was based on the calibration curve produced with the five different standard concentrations (250, 500, 1000, 1500 and 2000 μg/L) after screening the quantifier ion in the MS spectra.
Four methods used (n = 2) in milk samples spiked each antibiotic of 500 μg/L as a final concentration

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was initially 98 % of A decreasing to 2 % within 10.5 min Table 3 Mass spectrometry parameters used for the screening
(0–10.5 min). After that, the composition was set back to of antibiotic residues in milk
the initial levels A: B (98:2) (10.5–12.5 min). The total run Analyte Transition Cone Collision
time was 12.5 min. XEVO TQ MS triple quadrupole mass voltage (V) energy eV
spectrometer (Waters, Millford MA, USA), operating in Amoxicillin 366 > 114 10 20
positive Electrospray ionization (ESI) MS/MS mode was Ampicillin 350 > 106.1 30 20
used for detection. Data was controlled and evaluated by Chlortetracycline 479.1 > 302.8 30 40
MassLynx software (version 4.1). The selected reaction Cloxacillin 436.24 > 160.0 30 10
monitoring (MRM) mode was used and the following tune
Dicloxacillin 469.9 > 160.1 30 10
parameters were applied: capillary, 3 kV; cone 15 V; ex-
tractor, 3.00 V; source temperature, 150 °C; desolvation Enrofloxacin 360.4 > 341.9 30 20
temperature, 500 °C, cone gas flow, 80Lh−1; desolvation Erythromycin 734.4 > 576.6 30 20
gas flow, 1000Lh−1; collision gas flow, 0.16 mL min−1, Flumequine 262.1 > 244 30 20
resolution (LM1, HM1, LM2, HM2 where LM is low mass Marbofloxacin 363.26 > 72 30 20
and HM is high mass), 2.7, 15, 2.8, 14.8; ion energy (1 and Nafcillin 415 > 199 30 10
2), 0.3, 0.6; multiplier 546.52 V. Cone voltage (V), collision
Neospiramycin 699.4 > 174.2 30 20
energy (eV) and transition mass parameters for all anti-
biotic residues analyzed in milk samples are presented in Oxytetracycline + 4- 461.1 > 443.1 30 10
epi-Oxytetracycline
Table 3.
Oxacillin 402.2 > 243.3 15 10

Validation of the LC-MS/MS screening method Penicillin G 335.1 > 176.1 30 10

Validation of the selected method was performed on all Spiramycin 843.6 > 174.4 30 40
antibiotic substances cited in Table 4 and performed Sulfacetamide 215.2 > 156 30 10
following the international norm (Commission Decision Sulfachloropyridazine 285 > 155.8 25 15
2002) through determining: specificity/selectivity, de-
Sulfadiazine 251 > 108 30 20
tection capability CCβ, linearity, and applicability. Milk
Sulfadimethoxine 311.1 > 156 30 20
samples bought from a Belgian supermarket were ana-
lyzed, and after confirming the absence of antibiotics Sulfadimidine 279.2 > 155.9 30 20
were used as blank samples in the validation studies. Sulfadoxine 311.2 > 155.9 30 20
To determine the specificity of the proposed method, Sulfaguanidine 215.1 > 156 25 15
a set of extract of blank milk samples (n = 20) were Sulfamerazine 265.1 > 155.9 30 20
injected into the chromatographic system on the same
Sulfamethizole 271.1 > 107.8 30 20
day. The process included also an analysis of the spiked
sulfamethoxazole 254.1 > 108.1 30 20
samples on three levels. This permits the specificity to
be evaluated through the average and standard devi- sulfamethoxypyridazine 281 > 155.7 30 15
ation of the noise amplitude (S/N), expressing relative Sulfamonomethoxine 281.2 > 155.9 30 20
to the internal standard signal amplitude. When a ratio Sulfamoxole 268.2 > 155.9 30 10
of signal to noise (S/N) of blank sample is higher than Sulfapyridine 250.1 > 184 30 20
3, its relative retention time (RRT) is equivalent to RRT
Sulfaquinoxaline 301.2 > 107.7 30 20
of the spiked milk sample and its response area is
Sulfathiazole 256.1 > 107.7 30 30
higher than 1 % of that of the spiked milk sample, then,
the result is deemed false positive. Moreover, the select- Sulfisoxazole 268.1 > 156.2 30 10
ivity was guaranteed by following up the multi-reaction Tetracycline + 4-epi-tetracycline 445.1 > 410.1 30 20
monitoring (MRM) transitions per substance on LC- Tilmicosin 869.8 > 174.1 65 45
MS/MS and the relative retention time. The detection Tylosin 916.6 > 127.2 30 40
capability (CCβ) which is the smallest content of the
Trimethoprim 291.3 > 230.3 60 20
substance that may be detected, identified and/or quan-
tified in a sample with an error probability of β = 5 %.
Probability of false non-compliance ≤5 % was tested had to be equal or higher than 10. In order to get a lin-
with 20 milk samples. The latter, had been spiked at 0.5 ear calibration curve at 5 points, standard solutions
MRL and analyzed according to two criteria. Firstly, series of 0.25, 0.5, 1, 1.5 and 2 MRL were injected with
relative retention time (RRT) of the suspect sample had the series of the samples extracted with 4 different
to be in a range of ±2.5 % around the RRT of the stand- methods (Table 1). In particular, these solutions were
ard solution. Secondly, S/N ratio of the daughter ion prepared using three mixtures of antibiotic standards at
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Table 4 Maximum residues limits (MRL*), CCβ and number of samples analyzed for each antibiotic used for the validation of the
selected method
Family of Antibiotics MRL in milk (μg/L) CCβ (μg/L) Detection
antibiotics
CCβ spiked CCβ Blank samples
Penicillins Amoxicillin 4 2 20/20 20/20
Penicillin G 4 2 20/20 20/20
Ampicillin 4 2 20/20 19/20
Cloxacillin 30 15 20/20 20/20
Dicloxacillin 30 15 20/20 19/20
Nafcillin 30 15 20/20 20/20
Oxacillin 30 15 20/20 20/20
Quinolones Enrofloxacin 100 50 20/20 20/20
Marbofloxacin 75 37.5 20/20 20/20
Flumequine 50 25 20/20 19/20
Macrolides Erythromycin 40 20 20/20 19/20
Spiramycin 200 100 20/20 20/20
Tilmicosin 50 25 20/20 20/20
Tylosin 50 25 20/20 19/20
Neospiramycin 200 100 20/20 20/20
Tetracyclines Chlortetracycline 100 50 20/20 20/20
Oxytetracycline+ 4-epi-oxytetracycline 100 50 20/20 20/20
Tetracycline+ 4-epi-Tetracycline 100 50 20/20 20/20
Sulfonamides Sulfadiazine 100 50 20/20 20/20
Sulfapyridine 100 50 20/20 20/20
Sulfamethoxypyridazine 100 50 20/20 20/20
Sulfadoxine 100 50 20/20 20/20
Sulfadimethoxine 100 50 20/20 20/20
Sulfadimidine 100 50 20/20 20/20
Sulfamonomethoxine 100 50 20/20 20/20
Sulfamoxole 100 50 20/20 20/20
Sulfaquinoxaline 100 50 20/20 20/20
Sulfachloropyridazine 100 50 20/20 20/20
Sulfathiazole 100 50 20/20 20/20
Sulfamerazine 100 50 20/20 20/20
Sulfamethoxazole 100 50 20/20 20/20
Sulfacetamide 100 50 20/20 20/20
Sulfisoxazole 100 50 20/20 19/20
Trimethoprim 50 25 20/20 20/20
Sulfaguanidine 100 50 20/20 20/20
Sulfamethizole 100 50 20/20 20/20
*MRL (EU 37/2010)

1MRL: mix 1 (macrolides – tetracyclines), mix 2 (sul- solutions at 300 μL with final concentrations of 250,
fonamides - quinolones), and mix 3 (penicillins). After 500, 1000, 1500, and 2000 μg/L, respectively. In order
adding specific volume of each internal standard to the to evaluate applicability of the present multi-residue
mix, the intermediate solutions were evaporated to dry- method, the collected milk samples (194) were analyzed.
ness at 40 °C. The specific volumes of penicillins and Additionally, the interpretation of results was based
Milli-Q water were added in order to obtain final on five criteria (Commission Decision 2002) which
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were: a S/N ratio of the ionic transitions greater than MS and Delvotest SP-NT results using the logit link.
ten, the difference of the chromatographic retention These results were contrasted between different types of
time was within 2.5 % range of the retention time of milk collected at the farms and points of sale. In particu-
the same peak in standard solution, area of the sam- lar, milk type was considered as a fixed factor, whereas,
ple was higher than area of blank, area of sample was farm and points of sale were random ones. Also, the
higher than area of spiked sample, and concentration comparison between the different milk types was evalu-
of the sample analyzed was higher than MRL and ated and P-values were corrected for simultaneous hy-
LOD. pothesis testing, according to Tukey. For correlation
purposes, results of the examined residues (without
MRL, and non-authorized) using LC-MS/MS were con-
Stability of antibiotics in milk
sidered as positive.
Taking in consideration that lben is produced within 1
The agreement between the two tests was calculated
day of fermentation at temperature room; the stability of
using Cohen’s kappa and its associated P-value. In
antibiotic residues was evaluated. Consequently, milk
addition, since the Delvotest SP-NT appeared to lack
purchased in a Belgian supermarket was used either as a
specificity, a list of antibiotics was set up containing the
negative control (n = 2), or enriched (n = 3) as a test ma-
positive LC-MS/MS results and those for which there
terial. The enrichment was done at 0.5 MRL as pre-
were more negative than positive Delvotest SP-NT.
scribed for meat matrices (Commission Regulation
2377/1990) with mixtures of antibiotic standards of sul-
fonamides, penicillins, quinolones, macrolides, and tetra-
Results
Optimization of the LC-MS/MS screening method
cyclines. The samples were stored at different storage
The main requirement for a reliable screening method is
temperature (4 and 21 °C) and tested at various time pe-
to detect authorized substances above the regulatory
riods (day 0, 2 and 7). The analysis was performed using
limits MRL and unauthorized at a level of MRPL; which
LC-MS/MS after extraction (method 3). First and for
is the minimum required performance limit, minimizing
most, the initial values were determined on the day of
false negative results (Freitas et al. 2013). Before the final
extraction (day 0). After that, samples stored at 4 and
method validation, four methods were compared and
21 °C were analyzed at day 2 and day 7 of storage. Some
the results presented in Table 2 were statistically evalu-
of these abused storage conditions also mimicked or
ated to select the appropriate one. Comparison using
overestimated the transport of the samples from Algeria
ANOVA was limited to antibiotics (11 antibiotics) with
to Belgium as well as possible practices in Algeria. These
lower MRL in milk than in meat (MRL ratio equal or
data also served for antibiotic stability evaluation.
lower than 0.5). Since highly significant interactions were
observed between methods and antibiotics, methods were
Statistical analysis compared with each other for each of those selected anti-
In order to select the most suitable method extraction; biotics separately. Among the comparative results, the
the analytical methods were compared on the basis of main differences were marked between two method
the recoveries sufficient for the screening purposes, and groups. Particularly, out of 11 compared antibiotics, the
only for the antibiotics having lower MRL in milk than recoveries of eight (method 1 as opposed to method 4)
in meat. The latter was defined as the ratio of MRL in and seven (method 2 as opposed to method 3) were sig-
milk to MRL in meat by being lower or equal to 0.5. In nificantly different (p < 0.05). This result may be explained
addition, Sstatistical analysis of the recovery results ob- by the analytical differences of the methods. Method 3
tained with the four methods was performed using two- presented recoveries that were higher than other methods
factor weighted ANOVA test with replication (n = 2) and closer to 100 %. In a second step the lowest recoveries
using S-Plus 8.0 for Linux (Tibco, Palo Alto, CA, US). were compared among the methods to ensure that final
The first factor was the method used and the second method may detect all selected antibiotics. It was observed
was the type of antibiotic. At the same time, the inter- that only for erythromycin and nafcilin higher recoveries
action between these two factors was also studied. Since were obtained when applying method 3. Taking this in ac-
the latter was significant, the comparison between the count and the fact that other compounds were acceptable
four methods was done per each antibiotic and cor- for screening purposes by method 3, it was decided to use
rected for simultaneous hypothesis testing according to this method further in the study.
Sidak (1967). Similar was done for comparison of stor- The optimized extraction method was validated for
age effect on antibiotics. Statistical significance was macrolides, penicillins, quinolones, sulfonamides, and
tested at significance level of 0.05 and 0.01. tetracyclines. Except, ampicillin, dicloxacillin, flume-
A generalized linear model for binomially distributed quine, erythromycin, tylosin, and sulfisoxazole which
data was fit to model the frequency of positive LC-MS/ were characterized with some interference peaked within
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retention time range resulting in 5 % of false positive, (68 %), followed by milk samples collected from un-
the rest of the specificity compounds analyzed in 20 treated cows (58 %), and lastly bulk tank milk (54 %).
blank milk samples were negative. The detection cap-
ability levels were 50 % of MRL for all compounds in ac-
Correlation between LCMS/MS and Delvotest SP-NT
cordance to the guidelines for the validation of
results and occurrence of specific antibiotics
screening methods for residues of veterinary medicines
Only 131 milk samples were used for the comparative
(Table 4) (Community Reference Laboratories 2010). A
assessment of results obtained by Delvotest SP-NT and
linear calibration curve was obtained according to con-
LC-MS/MS. Specifically, the comparison of the total
centrations used. The correlation coefficient was ≥0.80
numbers of results using Cohen’s Kappa illustrated that
for all analyzed substances. One hundred ninety- four
there was no evidence of agreement between results ob-
(194) milk samples were analyzed using this screening
tained by LC-MS/MS and Delvotest SP-NT (Table 6). Fur-
method. Within these, one hundred twenty-seven (127)
thermore, from 131 milk samples only 18 samples were
were found non-conform. More details are presented in
negative by both LC-MS/MS and Delvotest SP-NT
LC-MS/MS results section.
methods. In this study, 15 samples showed doubtful re-
sults and 13 samples presented positive results with Del-
Delvotest votest SP-NT. Both groups of samples (doubtful and
Out of 154 samples analyzed in this study 39 were posi- positive results) were later confirmed negative by LC-MS/
tive forming 25.3 % of the total samples. According to MS. Furthermore, results presented in Tables 6 and 7 also
the results presented in Table 5, the highest frequencies show that in 52 samples initially found negative by Delvot-
of positive results by Delvotest SP-NT prescreening were est SP-NT mutltiply antibiotics were detected by LC-MS/
obtained for treated cow’s milk (61.5 %), followed by un- MS. The most abundant residues (β-lactams) were
treated cow’s milk (20.8 %), and market fermented cow’s followed by macrolides. Sulfonamides, quinolones, and
milk (20 %). Yet, market raw cow’s milk (16.7 %) and tetracyclines consecutively were present at similar low fre-
bulk tank milk (10.3 %) were tested less positive than quencies. Finally, 20 milk samples were confirmed positive
treated cow’s milk. Correspondingly, a high percentage by both methods and additionally 13 samples initially
of positive results in the sample category of treated cow’s found questionable by Delvotest SP-NT were confirmed
milk were significantly different from untreated cow’s positive by LC-MS/MS. This all implies that LC-MS/MS
milk and bulk tank milk (p ≤ 0.01). method was more sensitive than Delvotest SP-NT.

LC-MS/MS results Stability of antibiotics in milk during storage

The comparison between different types of milk col- The noticeable increase in measurable antibiotics was ob-
lected from distinct sources did not reveal any signifi- served after storage. The followed antibiotics were spiked
cant differences. As presented in Table 5, 127 out of 194 to blank milk samples which were stored during short
samples analyzed were found positive (65.5 %). The (2 or 7 days) period. After 2 days there was no
highest frequencies of positive results with LC-MS/MS change of antibiotics independently of the storage
analysis were obtained for milk collected from the mar- conditions, but a significant increase in measurable
ket where each sample of collected raw milk was con- antibiotics was noticed after 7 days both at 4° and
taminated (100 % samples positive) and followed by 21 °C. These differences are shown in Fig. 1. For most of the
fermented milk (85 % samples positive). High percentage antibiotics this difference was significant independently of
of positive results was similarly found in samples col- the temperature at which milk was stored whereas for cer-
lected from the farms. Hereby, the milk collected from tain antibiotics it was insignificant (p > 0.05). This was for
treated cows contained the most antibiotic residues neospyramycine, sulfamethoxypyridazine, sulfaquinoxaline,
Table 5 Comparison of the results for different milk types obtained by Delvotest and LC-MS/MS
Delvotest Delvotest %Delvotest LC-MS/MS LC-MS/MS % LC-MS/MS
negative positive positive conform non-conform positive
Bulk tank milk 26 3 10.3a 16 19 54a
Individual untreated cow’s milk 57 15 20.8a 41 58 59a
b
Individual treated cow’s milk 10 16 61.5 7 15 68a
Market raw cow’s milk 10 2 16.7ab 0 18 100a
ab
Market fermented cow’s milk 12 3 20 3 17 85a
Groups with the same letter behind the percentage of % Delvotest positive are not significantly different from each other at level of 0.05
Groups with the same letter behind the percentage of % LC-MS/MS positive are not significantly different from each other at level of 0.05
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Table 6 Statistical agreement between results obtained by two cost-effectiveness compared to physical–chemical detec-
techniques Delvotest SP-NT and LC-MS/MS tion. In general, these assays can be operated: without
Delvotest Delvotest Delvotest special training, do not depend upon specialized equip-
negative positive doubtful ment, and target a broad spectrum of antimicrobial resi-
LC-MS/MS conform 18 13 15 dues within one test (Pikkemaata et al. 2009). The most
LC-MS/MS non-conform 52 20 13 widely used tests which are commercially available are
Total number of results for each results category was compared and Cohen’s microbial inhibitor tests with spores of Bacillus stear-
kappa (−0.1042, P value: 0.1578) was calculated othermophilus var. calidolactis –Delvotest SP, Copan
Test, Charm Farm-960 Test, and others (Žvirdauskienė
OTC+epi-OTC2 and TC+epiTC1 at 4 °C; for penicilline and Šalomskienė. 2007). Within this study, Delvotest SP-
G, trimetoprime at 21 °C and for: tylosine, dicloxacilline, NT was the selected one to be used for the assessment
sulfapyridine, sulfisoxazole at both temperatures. The re- of antibiotic residues in milk samples collected in
sults also shown lack of significant difference in antiobitic Guelma (Algeria). As the main limitation of this and
concentration in milk kept 2 days on either temperatures. other similar microbial assays non-specificity is usually
However, the significant difference among some antibi- assumed (Bilandzic et al. 2011). For a visual reading of
otics was noticed after analyzing samples kept 7 days. At in particular Delvotest SP-NT, clear yellow and clear
21 °C after 7 days it was possible to measure significantly purple colors are easy to determine. However, visual
more antiobitics, in particular neospyramycine, spyrami- assessment of samples containing intermediate concen-
cine, cloxacilline, dicloxacilline, penicilline G, sulfaceta- trations of antimicrobials is more difficult, even for ex-
mide, sulfadoxine, sulfamethoxazole, sulfamoxole. perienced technicians which render the visual judgment
of the colored reaction as in Delvotest SP-NT subjective
Discussion (Suhren and Luitz. 1995; Stead et al. 2008). In such sam-
Monitoring large numbers of milk samples for the pres- ples, the test medium often shows a cloud of purple in a
ence of residues in excess of the levels laid down under yellow background indicating a suspect positive result.
community legislation requires low cost screening In addition, different types of milk and the different
methods. In practice, it is primarily performed using modes of action of antimicrobial compounds can lead to
microbiological screening methods, because of their high different colors in the test, making the interpretation
more difficult (Stead et al. 2008). In turn, this makes
Table 7 Comparison of the results obtained by LC-MS/MS and Delvotest SP-NT less suitable for decisive analyses leav-
Delvotest SP-NT given as frequency (%) of the measurement
ing spaces for disputable results (false positives, eg). An-
appearances
other explanation could be that false positive Delvotest
Antibiotic (Frequency of results, %)
SP-NT reactions may occur in samples from freshly
LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS calved cows due to the fact that natural inhibitors and
positive & positive & positive &
Delvotest Delvotest Delvotest incomplete milking could be responsible for positive re-
negative positive doubtful action (Hillerton et al. 1999).
Ampicillin 26.9 10 38.5 To confirm the results obtained by those screening tests
Oxacillin 9.6 / / more specific, fast and sensitive techniques could be used.
Tylvalosin 11.5 5 /
One such a method is LC-MS/MS technique which was
employed in this study to verify the results of the Delvotest
Tilmicosin 13.5 10 /
SP-NT. The comparative analyses pointed out several dis-
Amoxicillin 42.3 40 / crepancies between the methods, a number of false nega-
Erythromycin 1.9 / / tive results using Delvotest SP-NT were identified and the
Tilosyn 1.9 / / sensitivity of Delvotest SP-NT for different groups of anti-
Sulfathiazole 1.9 / / biotics as well as milk type was evaluated.
Sulfamerazine 1.9 / /
Whereas according to Delvotest SP-NT the most con-
taminated samples were those obtained from treated
Sulfamethizole 1.9 / /
cows, LC-MS/MS revealed that the samples collected
Enrofloxacin 1.9 / / from the markets were mostly contaminated. Antibiotics
Spiramicin 1.9 / / in milk of treated cows could arise from a collection of
Nafcillin 1.9 / / milk shortly after administration of antibiotics. Subse-
Josamycin 1.9 / 7.7 quently, it may also reflect a certain disrespect of a pre-
Tulathromycin 1.9 / /
scribed antibiotic withdrawal time due to overdose usage,
failure to observe withdrawal time, drug misuse or the bad
Doxycyclin 1.9 /
hygiene (Zinedine et al. 2007; Petrović et al. 2008; Mensah
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Fig. 1 Estimation of the antibiotic concentration in samples stored at two temperatures (4° and 21 °C) and during two periods (2 and 7 days). *The results
present the estimated concentration of antibiotics measured in samples stored at 4 °C (a) and at 21 °C (b). The results are average of three measurements
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et al. 2014b; Boultif. 2015). Establishment of a withdrawal the performance of Delovtest SP-NT was questioned.
time depends on different criteria (type of used antibiotic, Whereas no specific limitations for analyzing antibiotic
quantity of given antibiotic, the way of applications, and residues in fermented milk are neither mentioned by the
as well age, health status, lactation stage and individual manufacturer nor verified in some studies (Hennart and
features of dairy animals) (Nikolić et al. 2011). Certain Faragher 2012), the fate of antibiotics in milk type as lben
studies indicated that some African breeds may differ in is not fully evaluated. Except a study on raibi milk from
terms of their genetic heritage making them more suited Morocco (Zinedine et al. 2007), there is a lack of scientific
to local climatic conditions (water consumption, volume data on fate of antibiotic residues in fermented milk
of distribution, and renal clearance) but non directly com- (lben). This milk type is sour milk and may be a product
parable to antibiotics withdrawal time as determined for of mostly lactic acid bacteria fermentation (Ouadghiri et
breeds representative of a large-scale production in devel- al. 2009) and therefore may contain some byproducts, cer-
oped countries (Mensah et al. 2014a). Therefore, certain tain natural antimicrobial substances of that fermentation
adaptation to local conditions could be envisaged. type. In turn, results obtained may represent the reaction
Milk samples collected form the markets were pro- of the test to those antibiotics already present in raw milk
vided by different private milk collectors that brought (Zinedine et al. 2007).
milk in isotherm tanks collected from private and/or The shelf life of ‘lben’ is about 3 days at 4 °C. How-
governmental farms, and from small-scale cow’s milk ever, it was reported that sometimes “lben” may be kept
producers. The latter are widely dispersed in rural Alger- at room temperature in the countryside with limited
ian territories and located very far from urban areas and electricity supply. In this conditions ‘lben’ reaches
far away from any control by competent authorities. Ac- high acidity levels after 2–3 days (Benkerroum and
tually, the accurate detection of low levels of antimicro- Tamime 2004). The results from our study have
bial drug residues in milk, as it was done in the study, is shown that in these conditions the antibiotic concen-
not only of great importance for governmental control tration appears to increase. This was independent of
laboratories and the dairy industry, but also for farmers the temperature conditions (both 4° and 21 °C). More
to enable them to ensure that contaminated milk from studies would be necessary to reveal whether these
individual cows is not consigned to the bulk tank (Stead antibiotics would be easier bioavailable increasing the
et al. 2008) and prevent the further transfer of antibi- exposure to the consumers.
otics in the food chain. Recently, few studies in Algeria were performed on the
Algerian executive decree N°14-366 of December 15th, presence of antibiotic residues in milk. Using Delvotest SP
2014 that regulates the conditions and the applicable NT, Hakem et al. (2012) had found no contamination of
modalities regarding contaminants tolerated in food- raw milk collected from two Dairies Mitidja’s Farms. How-
stuffs, does not mention sufficient information on the ever, in the present study, around 10 % of bulk tank milk
control plan and the dosage of the residues of antibiotics samples and 20 % of samples of untreated cow’s milk were
(Décret exécutif 2014). In fact, auto-control in dairy in- positive. The latter was higher than the contamination
dustries is commonly done following the European legis- prevalence in Algiers (9. 87 %) indicated by Ben-Mahdi
lation. In contrast, quality assurance is rather low or not and Ouslimani (2009). Other authors, Zinedine et al.
strictly followed in many African countries like in (2007) in Morocco Tarzaali et al. (2008) in Mitidja, Aggad
Algeria. Hence, the lack of statutory legal framework in et al. (2009) in the west of Algeria, Titouche et al. (2013)
Algeria may be a contributor to a high presence of the in Tizi-Ouzu, reported higher frequency of antibiotics
forbidden or regulated antibiotics residues in animal- positive milk samples (57, 89, 29, and 46 %, respectively).
derived foodstuffs (Mensah et al. 2014b). Similarly, frequency of positive farm bulk tank milk (40 %)
In this study lben samples were highly contaminated. was found to be higher in a study from Serbia (Petrović et
The fermented milk ‘lben’ is prepared by letting raw cow’s al. 2008). Also results obtained for market raw cow’s milk
milk to be naturally fermented within 24 h at room in the present study were comparable to those found in a
temperature. Fermentation of milk mainly involves lactic study from Iran (19.78 %) (Aalipour et al. 2015). Neverthe-
acid bacteria (LAB), but micrococci, coryneforms, yeasts less, contamination of marketed fermented cow’s milk was
and moulds can also occur (Zamfir et al. 2006). After that, lower than results attained for raibi milk (50 %) in the
it must be subjected to churning and removing of butter. study of Zinedine et al. (2007). In general, 65.5 % of all an-
Literature suggests that the presence of antibiotics in milk alyzed samples using LC-MS/MS contained antibiotic res-
may affect fermentation processes in food production in- idues at levels exceeding MRL. This positive frequency is
dustries (Hsieh et al. 2011). Therefore, the fermentation much higher than 15 % (Li et al. 2012), 16.66 % (Meng et
during lben production may be affected if residues of al. 2015) in China, 1.76 % (Martins et al. 2014) in Brazil,
antibiotics are present by possibly inhibiting the growth and 28 % (García et al. 2016) in Spain. Pereira et al. (2014)
of the starter cultures (Nikolić et al. 2011). For this reason, indicated that 47.17 % of analyzed samples were at
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detectable concentration whereas Han et al. (2015) found mastitis, while the withdrawal times after treatment were
12 % at levels lower than MRL. Delvotest SP-NT has vary- probably not correctly respected. Similarly, the voluntary
ing sensitivity to different antibiotics groups. According to addition of bacterial growth inhibitors (antibiotics, anti-
the manufacturer and several reports (Althaus et al. 2003; septics) in order to stop microbial growth and stabilize
Stead et al. 2008; Sierra et al. 2009a; DSM 2012, and Bel- the microbial quality of milk (Zinedine et al. 2007) may
tran et al. 2015), the sensitivity of Delvotest SP NT to β- also be considered as a possible cause. Another argu-
lactams, as a main group of veterinary drugs used in ther- mentation is supported by the study of Reybroeck (2010)
apy of cows in many countries is high except for cloxacil- where it was stipulated that the main reason for anti-
lin. This one may be detected at levels higher than the biotic residues in milk was the accidental milking of
MRL (Petrović et al. 2008). Delvotest SP-NT sensitivity to treated cows that went unnoticed in 66 % of the cases
macrolides is limited to tylosin but erythromycin and spir- and the non -compliance of withdrawal time deadlines
amycin are detected at levels higher than MRL (DSM in 41 % of the cases.
2012). Althaus et al. (2003); Stead et al. (2008); Sierra et al.
(2009b) and Beltran et al. (2015) also confirmed that the Conclusion
detection of erythromycin was at levels higher than MRL To conclude, the study findings preliminary revealed
whereas, there are no data linked to Delvotest SP-NT sen- that the presence of antibiotics in raw and fermented
sitivity for the other macrolides (tilmicosin, tulathromycin, cow’s milk collected in Guelma region and intended for
tylvalosin and josamycin). Furthermore, Delvotest SP-NT either direct consumption and/or fermentation was high.
sensitivity to sulfonamides is limited only to sulfathiazole The results highlighted 65.5 % of non-conform samples
(DSM 2012). Enrofloxacin and doxycycline detection contained authorized residues at levels higher than the
levels of this test were described by Sierra et al. (2009b). MRL, residues without set MRL, or non- authorized res-
The latter argued that when the milk sample contained idues. The occurrence of antibiotic starting from farm’s
residues below the detection limit (LOD), the spores ger- milk and ending in milk purchased from markets in
minated and grew, thus, their metabolic activity made the Guelma province indicated the necessity of further con-
indicator change the color. Althaus et al. (2003), Sierra et trol of milk. Providing that there is a lack of data in this
al. (2009b), Le Breton et al. (2007), and Comunian et domain, the control and assessment might be considered
al. (2010) noticed that Delvotest SP-NT demonstrated on a national level. Additionally, to obtain results an ex-
a lower ability to detect some other tetracyclines. traction method with LC-MS/MS detection was vali-
Both methods were in accordance for some milk sam- dated following regulatory criteria and demonstrated
ples that were found positive. The most frequently de- satisfactory results for all parameters. The comparison of
tected antibiotics were β-lactams. Mainly, amoxicillin results of both methods showed that Delvotest SP-NT
(the most abundant residue in the studied milk) and could not be accurately trusted under these circum-
ampicillin were found in half of the samples; which was stances. However, LC-MS/MS represented a better screen-
still less than penicillin (97 %) and/or tetracycline (88 %) ing alternative with a possibility to further investigate each
as reported by Ben-Mahdi and Ouslimani (2009), and group of compounds applying the specific extraction to
Titouche et al. (2013), respectively where standard increase the sensitivity of the method and decrease the
microbiological methods were used. The low cost of β- LOD. The present LC-MS/MS method could be used in
lactams in Algeria makes them easily available. The lat- Algerian National Residue Control Plan as a versatile ana-
ter facilitated the use of penicillin by private farmers lytical tool to monitor and determine the occurrence of
without veterinarian supervision in isolated places. antibiotic multi-residues in milk and other food matrices
Moreover, the presence of macrolides with low frequen- after optimization.
cies of tilmicosin and tylvalosin as -a residue without
Acknowledgements
MRL - could be explained by their sporadic use. Amino-
The authors are thankful to those farmers who kindly provided milk samples
glycosides were not analyzed by LC-MS/MS method due and cows treatment data. The authors are very grateful for the financial support
to their relatively high MRL in comparison to meat. of the Algerian Ministry of the Superior Education and Scientific Research and
University of Guelma for the training. A great acknowledgement goes to the
Fundamentally, Delvotest SP-NT manufacturer reported
technical support for LC-MS/MS analysis given by Khariklia Tsilikas, Jean-Yves
that the sensitivity of Delvotest SP-NT for dihydrostrep- Michelet, and Tim Reyns from Scientific Institute of Public Health ([Link])
tomycin and streptomycin is higher than MRL and lower Brussels, Belgium. Special acknowledgments goes to Radhia Layada for the
considerable work on refining the language of the manuscript. As well as,
than MRL for neomycin. Neomycin, in its turn, could be
appreciations are delivered to Mr. Joens Vinas (Spain) and DSM food specialties
present within the 20 positive results of both methods. (Netherlands) for providing Delvotest SP-NT Kits.
The high levels of contamination of milk samples by
antibiotic residues can mainly be explained by massive Authors’ contributions
SL and DEB conceived the study. SL performed the collection of the
and uncontrolled intermammary pharmaceutical prepa- samples, al practical work, the interpretation of the results, and drafted the
rations used for the treatment and prevention of bovine manuscript with supervision of MA. MA designed the stability study and the
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LC-MS/MS analytical method approach. WC performed the statistical analysis Council Regulation No 1831/2003 of the European parliament and of the council
of all the results. All authors took parts in drafting the manuscript. All authors of 22 September 2003 on additives for use in animal nutrition. Off. J. Eur.
read and approved the final manuscript. Union L268: 29–43
Décret exécutif n° 14–366 du 22 Safar 1436 correspondant au (15 décembre
2014) de la République Algérienne fixant les conditions et les modalités
Competing interests applicables en matière de contaminants tolérés dans les denrées
The authors declare that they have no competing interests. alimentaires. J.O.R.A 74: 13–14
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