Validation des méthodes d’analyse

1- Introduction générale

Dans tout laboratoire de chimie de formulation (cosmétique, détergence, pharmaceutique,

environnement…), la fiabilité des résultats analytiques est essentielle.

Une méthode d'analyse constitue un ensemble d’instructions normalisées permettant d’identifier,

de quantifier ou de caractériser un analyte dans une matrice.

La validation des méthodes d’analyse vise à démontrer, avec un niveau de confiance statistique
sufÏsant, que la méthode est adaptée à l’usage prévu, selon des critères objectifs et mesurables.

2- Description d’une méthode d’analyse

Une méthode d’analyse comprend :
2.1. Objet
Définir ce que la méthode mesure : analyte, matrice, objectif (contrôle qualité,
conformité, recherche, screening).
2.2. Domaine d'application
• Type d’échantillons : formulation aqueuse, huileuse, solide, complexe…
• Gamme de concentrations mesurables.
2.3. Principe de la méthode
Exemples :
• Titrage acido-basique
• Spectrophotométrie UV-Vis
• Chromatographie (HPLC, GC, IC)
• Méthodes potentiométriques
• Analyses thermiques (DSC, TGA)
• Méthodes de séparations surfactif/micellaires
• Essais physico-chimiques (pH, viscosité, conductivité, densité…)
2.4. Appareillage
• Instruments et spécifications nécessaires
• Conditions instrumentales précises
Ex : HPLC gradient, colonne C18, longueur d’onde 254 nm, débit 1 ml/min.
2.5. Réactifs et solutions nécessaires
• Pureté, stabilité, conditions de stockage

1
 • Solutions étalons, solvants
2.6. Procédure opératoire
• Préparation des échantillons
• Préparation de la gamme d’étalonnage
• Conditions de mesure
• Contrôles qualité internes (blancs, duplicatas)
2.7. Calculs
• Formule de calcul de la concentration
• Unités
• Corrections (dilution, rendement, récupération)
2.8. Critères d’acceptation
Déterminés par le laboratoire selon :
• Objectif (contrôle qualité, quantification réglementaire)
• Normes applicables
• Contraintes analytiques (LOD, LOQ, précision, linéarité)

3- Classification des méthodes d’analyse

3.1. Selon la finalité
3.1.1. Méthodes qualitatives
Permettent de confirmer la présence/absence d’un analyte.
Ex : chromatographie TLC, spectre IR.
3.1.2. Méthodes semi-quantitatives
Donne un ordre de grandeur approximatif.
Ex : bandelettes colorimétriques, tests rapides.
3.1.3. Méthodes quantitatives
Donne un résultat chiffré avec incertitude associée.
Ex : HPLC, titrage, spectrophotométrie.

3.2. Selon la nature de la technique

• Méthodes spectroscopiques : UV-Vis, IR, NIR, FL, AAS, ICP-OES/MS
• Méthodes chromatographiques : HPLC, GC, IC, SEC

2
 • Méthodes électrochimiques : potentiométrie, conductimétrie
• Méthodes de séparation : filtration, extraction liquide-liquide, SPE
• Méthodes thermiques : DSC, TGA
• Méthodes physiques : viscosité, densité, granulométrie, rhéologie

3.3. Selon le degré d’uniformité

• Méthodes normalisées (ISO, AFNOR, ASTM)
• Méthodes pharmacopées (USP, EP)
• Méthodes internes (développées par le laboratoire)
• Méthodes validées par tiers (AOAC, EPA)

4- Performances et critères de choix d’une méthode d’analyse

Avant validation, la méthode doit répondre à des critères analytiques.
4.1. Exactitude (Accuracy)
Capacité à fournir un résultat proche de la valeur vraie.
Mesurée via :
• Tests de récupération
"Un test de récupération consiste à :
Ajouter une quantité connue (spike) d’un analyte à une matrice donnée, puis analyser l’échantillon
enrichi avec la méthode étudiée, afin de vérifier quelle fraction de l’analyte ajouté est effectivement
retrouvée. Il permet donc d’évaluer les pertes, les interférences de matrice et les biais systématiques de
la méthode."
Calcul du taux de récupération

Le pourcentage de récupération est donné par :

𝐶mesureˊ e − 𝐶initiale
Reˊ cupeˊ ration (%) = × 100
𝐶ajouteˊ e

où :
• 𝐶mesureˊ e : concentration mesurée après ajout
• 𝐶initiale : concentration initiale de l’échantillon
• 𝐶ajouteˊ e : concentration ajoutée (connue)

Interprétation des résultats

Récupération (%) Interprétation
≈ 100 % Excellente exactitude
95–105 % Très bonne exactitude
90–110 % Acceptable selon le domaine
< 90 % Pertes ou interférences
> 110 % Interférences positives ou biais

3
Les critères d’acceptabilité dépendent du domaine :
• Pharmaceutique : souvent 98–102 %
• Cosmétique / environnement : 90–110 %
• Traces / matrices complexes : tolérances plus larges possibles

Lien avec l’exactitude (Accuracy)

L’exactitude regroupe deux composantes :

Exactitude = Justesse (trueness) + Fideˊ liteˊ (precision)

Les tests de récupération évaluent principalement la justesse, c’est-à-dire :

l’absence de biais systématique entre la valeur mesurée et la valeur vraie.

• Matériaux de référence certifiés (CRM)

Un Matériau de Référence Certifié (CRM) est : (Définition conforme à l’ISO 17034 et au VIM)
un matériau suffisamment homogène et stable, dont une ou plusieurs propriétés sont certifiées par une
procédure valide, et accompagnées d’un certificat indiquant :
• la valeur certifiée
• l’incertitude associée
• la traçabilité (souvent au SI)
• les conditions d’utilisation
Principe d’utilisation des CRM pour l’exactitude
L’évaluation de l’exactitude par CRM consiste à :
1. Analyser le CRM avec la méthode étudiée
2. Comparer la valeur mesurée à la valeur certifiée
3. Évaluer l’écart et sa significativité en tenant compte de l’incertitude
Contrairement aux tests de récupération, aucun ajout (spike) n’est effectué.

Calcul de l’erreur (biais) avec un CRM

a) Biais absolu
Biais = 𝐶mesureˊ e − 𝐶certifieˊ e

b) Biais relatif
𝐶mesureˊ e − 𝐶certifieˊ e
Biais relatif (%) = × 100
𝐶certifieˊ e

Prise en compte de l’incertitude (test de compatibilité)

Pour une évaluation métrologique correcte, on utilise le zeta-score ou le test de compatibilité :

𝐶mesureˊ e − 𝐶certifieˊ e
𝜁=
2 + 𝑢2
√𝑢mes CRM

où :
• 𝑢mes : incertitude de la mesure
• 𝑢CRM: incertitude du CRM

4
Interprétation

∣ 𝜁 ∣| Conclusion
|≤2| Résultat compatible
|>2| Biais significatif

Critères d’acceptabilité usuels

Les critères dépendent du domaine :
Domaine Critère typique (Biais relatif (%))
Pharmaceutique ±2 %
Environnement ±10 %
Agroalimentaire ±5 à 10 %
Traces / matrices complexes élargi avec incertitude
donc utiliser le zeta-score

Remarque : Les CRM sont préférables aux tests de récupération lorsque disponibles.
Exemple
CRM : Paracétamol dans une matrice pharmaceutique
• Valeur certifiée : 50,0 ± 1,0 mg/g
• Valeur mesurée : 49,2 ± 1,2 mg/g
49,2 − 50,0
𝜁= = −0,53
√1,22 + 1,02
Résultat compatible donc la méthode est exacte

4.2. Fidélité (Precision)

Mesure de la variabilité des résultats :
• Répétabilité (intra-jour)
• Reproductibilité interne (inter-jour)
• Reproductibilité inter-opérateurs
Exprimée par l’écart-type (SD), %RSD.
Critères typiques : RSD ≤ 2 % en HPLC, ≤ 5 % en spectro.
La fidélité (Precision) d’une méthode d’analyse

1- Définition générale de la fidélité : Définition (ISO 5725 – ICH Q2(R1))

La fidélité d’une méthode d’analyse est :
Le degré de concordance entre des résultats d’essais indépendants obtenus dans des conditions spécifiées.
La fidélité ne renseigne pas sur la valeur vraie, mais uniquement sur la dispersion des résultats.

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Distinction essentielle
Notion Ce qu’elle mesure
Fidélité (Precision) Dispersion des résultats
Justesse (Trueness) Proximité de la valeur vraie
Exactitude (Accuracy) Fidélité + Justesse

Expression mathématique de la fidélité

La fidélité est exprimée par :
A- Écart-type (SD)
𝑁
∑𝑖=1( 𝑥𝑖 − 𝑥ˉ )2
𝑆=√
𝑁−1

avec :
• 𝑥𝑖 : résultat individuel
• 𝑥ˉ : moyenne
• 𝑁: nombre de mesures
B- Écart-type relatif (%RSD)
𝑆
%𝑅𝑆𝐷 = × 100
𝑥ˉ
Le %RSD est l’indicateur de référence en validation analytique.
Niveaux de fidélité en validation analytique
Selon ICH Q2(R1), la fidélité est évaluée à trois niveaux comme ci-dessous :
A- Répétabilité (Repeatability)
La répétabilité correspond à la fidélité obtenue lorsque :
• même opérateur
• même équipement
• même méthode
• même échantillon
• intervalle de temps court (intra-jour)
A-1- Objectif : Évaluer la variabilité intrinsèque minimale de la méthode.

A-2- Protocole expérimental typique

• Préparer une solution homogène
• Effectuer au moins 6 mesures consécutives
• Calculer :
o moyenne
o SD
o %RSD

A-3- Calcul
Exemple (dosage HPLC, mg/l) :
Mesure Valeur
x₁ 100,2
x₂ 99,8
x₃ 100,1
x₄ 99,9
x₅ 100,0
x₆ 100,1
𝑥ˉ = 100,02
𝑆 = 0,15
0,15
%𝑅𝑆𝐷 = × 100 = 0,15%
100,02

6
A-4- Critères usuels
Technique Critère typique
HPLC %RSD ≤ 2 %
GC %RSD ≤ 2 %
UV-Visible %RSD ≤ 5 %
Titrimétrie %RSD ≤ 2–3 %

B- Reproductibilité interne (Précision intermédiaire)

B.1 Définition
Évaluation de la fidélité lorsque certaines conditions varient, mais dans le même laboratoire :
• jours différents (inter-jour)
• analystes différents
• équipements similaires
B-2 Objectif
Vérifier la robustesse opérationnelle de la méthode en conditions réelles.

B-3 Protocole courant

• Répétabilité effectuée sur :
o ≥ 3 jours
o ou ≥ 2 analystes
• Résultats regroupés
• Calcul d’un SD global

B-4 Calcul (principe)

Si 𝑥𝑖𝑗 est la mesure i du jour j :
∑(𝑥𝑖𝑗 − 𝑥ˉ )2
𝑆inter = √
𝑁−1
𝑆inter
%𝑅𝑆𝐷inter = × 100
𝑥ˉ
B-5 Critères typiques
Méthode %RSD acceptable
HPLC ≤3%
UV ≤5%
Méthodes complexes ≤6%

C- Reproductibilité inter-opérateurs
C.1 Définition
Évaluation spécifique de l’impact de l’analyste sur les résultats :
• même méthode
• mêmes conditions
• analystes différents
C.2 Objectif
S’assurer que la méthode est :
• indépendante de l’opérateur
• correctement transférable
C.3 Approche statistique
Deux approches possibles :
a) %RSD global
Calculé sur l’ensemble des données.
b) Analyse de variance (ANOVA)
Pour séparer :
• variance opérateur
• variance méthode

7
4.3. Linéarité
Capacité à obtenir une réponse proportionnelle à la concentration dans un domaine donné.
Paramètres :
• coefficient de corrélation R² ≥ 0.999 (HPLC)
• examen des résidus
• équation de la courbe d’étalonnage
• test de Fisher F
4.3.1 La linéarité d’une méthode d’analyse
A- Définition de la linéarité
Définition (ICH Q2, ISO 8466-1) : La linéarité est :
La capacité d’une méthode analytique à fournir une réponse proportionnelle à la concentration de
l’analyte dans un domaine donné.
Mathématiquement, cela signifie que la relation entre :
• la réponse analytique (signal)
• et la concentration
peut être décrite de manière satisfaisante par une fonction linéaire.

B- Objectifs de l’étude de la linéarité

L’étude de la linéarité vise à :
• vérifier la validité du modèle linéaire
• définir le domaine de travail
• garantir la fiabilité quantitative des résultats
• permettre l’utilisation correcte de la courbe d’étalonnage
B-1 Domaine de linéarité
Définition
Le domaine de linéarité est l’intervalle de concentrations pour lequel :
• la relation signal–concentration est linéaire
• les critères statistiques sont respectés
En pratique :
• 5 à 7 niveaux de concentration minimum
• couvrant généralement 80 à 120 % de la concentration cible
o (ou plus large selon l’application)
C- Courbe d’étalonnage
c.1 Modèle mathématique
La relation linéaire est décrite par :
𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏
avec :
• 𝑥: concentration
• 𝑦: réponse analytique
• 𝑎: pente (sensibilité)
• 𝑏: ordonnée à l’origine

c.2 Calcul des paramètres (moindres carrés)

Pente
∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ )(𝑦𝑖 − 𝑦ˉ)
𝑎=
∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ )2

Ordonnée à l’origine

8
 𝑏 = 𝑦ˉ − 𝑎𝑥ˉ

c.3 Coefficient de corrélation et coefficient de détermination

c.3.1 Coefficient de corrélation (r)
∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ )(𝑦𝑖 − 𝑦ˉ)
𝑟=
√∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ )2 ∑(𝑦𝑖 − 𝑦ˉ)2

Il mesure la force du lien linéaire entre x et y.

c.3.2 Coefficient de détermination (R²)
𝑅2 = 𝑟 2
Interprétation
• 𝑅2 = fraction de la variance de y expliquée par x
• Plus 𝑅2 est proche de 1, meilleure est la linéarité
c.3.3 Critères usuels
Méthode Critère
HPLC 𝑅2 ≥ 0.999
GC 𝑅2 ≥ 0.995
UV-Visible 𝑅2 ≥ 0.990

Remarque : un bon 𝑅2 ne suffit pas à lui seul.

c-4 Analyse des résidus
c-4.1 Définition des résidus
𝑒𝑖 = 𝑦𝑖 − 𝑦̂𝑖

où :
• 𝑦𝑖 : réponse mesurée
• 𝑦̂𝑖 : réponse calculée par le modèle linéaire
c-4.2 Objectif
L’analyse des résidus permet de vérifier :
• l’absence de tendance systématique
• l’homoscédasticité (variance constante)
• la validité du modèle linéaire
c-4.3 Interprétation graphique
Un modèle linéaire est acceptable si :
• les résidus sont aléatoirement distribués autour de zéro
• aucune forme en :
o U
o S
o cône
o pente
n’est observée.
Une telle structure dans les résidus indique :
• non-linéarité
• effet de matrice
• erreur de domaine

c-5. Test de Fisher (test de significativité de la régression)

c-5.1 Objectif
Le test de Fisher permet de vérifier si :
la relation linéaire observée est statistiquement significative.
c-5.2 Hypothèses
• 𝐻0 : la pente 𝑎 = 0(pas de relation)
• 𝐻1 : la pente 𝑎 ≠ 0

9
c-5.3 Calcul des variances
Variance expliquée (régression)
2
∑(𝑦̂𝑖 − 𝑦ˉ)2
𝑆reg =
1

Variance résiduelle
2
∑(𝑦𝑖 − 𝑦̂𝑖 )2
𝑆res =
𝑁−2

c-5.4 Statistique de Fisher

2
𝑆reg
𝐹calc = 2
𝑆res
c-5.5 Décision
• Si 𝐹calc > 𝐹th (𝛼, 1, 𝑁 − 2) (déterminé à partir des tables)
donc régression significative
c-6. Validation pratique de la linéarité (démarche laboratoire)
Étapes recommandées
1. Préparer un nombre de niveaux de concentration ≥ 5
2. Mesurer chaque niveau (souvent en triplicat)
3. Tracer la courbe d’étalonnage
4. Calculer :
o équation
o 𝑅2
o résidus
o test de Fisher
5. Vérifier la conformité aux critères

4.4. Limite de détection (LOD)

Plus petite quantité détectable, sans quantification fiable.
𝜎
LOD = 3.3 ×
𝑆

A- Limite de Détection (LOD) en validation des méthodes d’analyse

A-1. Définition de la Limite de Détection (LOD)

Définition normative (ICH Q2(R1), ISO 11843) : La limite de détection (LOD) est :
La plus petite quantité d’un analyte pouvant être détectée par une méthode analytique, sans
exigence de quantification précise.
À la LOD :
• l’analyte est détectable
• mais non quantifiable avec fiabilité acceptable

10
A-2. Intérêt de la LOD en chimie de formulation
La LOD est cruciale pour :
• détecter des impuretés
• vérifier l’absence de résidus (solvants, conservateurs)
• contrôler des actifs faiblement dosés
• assurer la conformité réglementaire
Exemple typique :
• conservateur à l’état de traces
• allergène parfumant
• principe actif dans une formulation diluée
A-3. Principe statistique de la LOD
La LOD repose sur la distinction du signal de l’analyte par rapport au bruit de fond.
Mathématiquement le signal mesuré doit être significativement supérieur au bruit
L’hypothèse statistique est comme suit :
Signal analyte > bruit + 𝑘 × 𝜎bruit

où :
• 𝜎= écart-type du bruit
• 𝑘= facteur statistique (≈ 3)
A-3.1 Expression mathématique de la LOD (méthode par étalonnage)
a- Formule ICH (la plus utilisée)
𝜎
LOD = 3.3 ×
𝑆

avec :
• 𝜎: écart-type de la réponse (bruit, blanc ou résidus)
• 𝑆: pente de la droite d’étalonnage (sensibilité)
Origine du facteur 3,3
• Correspond à un risque α ≈ 0,1 %
• Assure une détection statistiquement significative
• Issu de l’approximation de la loi normale / Student

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a-1. Détermination expérimentale de σ
Trois approches reconnues :
a-1.1 Écart-type du blanc
• Mesure du signal du blanc (n ≥ 10)
• Calcul de :
𝜎 = 𝑆𝐷blanc

a-1.2 Écart-type des résidus de régression (recommandée) Approche plus robuste

∑(𝑦𝑖 − 𝑦̂𝑖 )2
𝜎=√
𝑁−2

a-1.3 Écart-type à faible concentration

• Réplicats proches de la LOD attendue
• Approche expérimentale directe
a-2. Calcul de la pente S
La pente est issue de la droite d’étalonnage :
𝑦 = 𝑆𝑥 + 𝑏
∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ)(𝑦𝑖 − 𝑦ˉ)
𝑆=
∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ)2

Plus S est grande, meilleure est la sensibilité donc LOD plus faible.

B- Limite de Quantification (LOQ) en validation des méthodes d’analyse

B-1 Définition (ICH Q2(R1))
La Limite de Quantification (LOQ) est la plus faible quantité d’un analyte dans un
échantillon pouvant être déterminée quantitativement avec une exactitude et une fidélité acceptable,
dans des conditions expérimentales spécifiées.
𝜎
LOQ = 10 ×
𝑆
Contrairement à la LOD, la LOQ ne se limite pas à détecter, elle permet de mesurer de manière
fiable.

12
B-2 Signification analytique de la LOQ
La LOQ correspond à une concentration pour laquelle :
✓ le signal est clairement distinguable du bruit
✓ l’incertitude relative est maîtrisée
✓ la répétabilité est acceptable
✓ l’erreur systématique reste faible
Donc en pratique un résultat en dessous de la LOQ est un résultat non fiable quantitativement
B-3 Méthodes de détermination de la LOQ
ICH reconnaît plusieurs approches.
B-3.1 Méthode statistique (la plus utilisée)

10 𝜎
LOQ =
𝑆

où :
• 𝜎= écart type du bruit ou des résidus
• 𝑆= pente de la droite de calibration
Justification : le facteur 10 donne une précision et une exactitude acceptables et basé sur le
rapport signal/bruit
C- Test de Fisher (test de significativité de la régression)
c.1 Objectif
Le test de Fisher permet de vérifier si la relation linéaire observée est statistiquement
significative.
c.2 Hypothèses
• 𝐻0 : la pente 𝑎 = 0(pas de relation)
• 𝐻1 : la pente 𝑎 ≠ 0
c.3 Calcul des variances
Variance expliquée (régression) :
- Somme des carrés expliquée par le modèle

2
∑(𝑦̂𝑖 − 𝑦ˉ)2
𝑆reg =
1

- Variance résiduelle

13
 2
∑(𝑦𝑖 − 𝑦̂𝑖 )2
𝑆res =
𝑁−2

c.4 Statistique de Fisher

𝑆2
𝐹calc = 𝑆reg
2
res

Décomposition des sommes de carrés

En régression linéaire, la variabilité totale se décompose ainsi :

SCT = SCR + SCE

où :
a- Somme des carrés totale
𝑁

SCT = ∑( 𝑦𝑖 − 𝑦ˉ)2
𝑖=1

b- Somme des carrés expliquée par le modèle

𝑁

SCR = ∑( 𝑦̂𝑖 − 𝑦ˉ)2

𝑖=1

c- Somme des carrés des résidus

𝑁

SCE = ∑( 𝑦𝑖 − 𝑦̂𝑖 )2
𝑖=1

Aussi d’après la définition du coefficient de détermination 𝑅 2

On a :

SCR
𝑅2 =
SCT

Donc :

SCR = 𝑅 2 SCT et SCE = (1 − 𝑅 2 ) SCT

14
D’après l’analyse de la variance (ANOVA) le test de Fisher compare la variance expliquée par le
modèle à la variance résiduelle

Variance expliqueˊ e
𝐹=
Variance reˊ siduelle

De plus les degrés de liberté, pour chaque variabilité, se présentent comme suit :

Terme ddl

SCR (régression) 1
SCE (résidus) 𝑁−2

SCT 𝑁−1

On peut alors exprimer les variances comme ci-dessous :

A- Variance expliquée

2
SCR
𝑠reg =
1

B- Variance résiduelle

2
SCE
𝑠res =
𝑁−2

Ceci permet d’écrire l’expression complète du F de Fisher

SCR/1
𝐹=
SCE/(𝑁 − 2)

En remplaçant SCR et SCE :

𝑅 2 SCT
𝐹=
(1 − 𝑅 2 ) SCT/(𝑁 − 2)

Et par simplification (la somme SCT se simplifie) :

𝑅2
𝐹= (𝑁 − 2)
1 − 𝑅2

La prise de décision est :

• Si 𝐹calculé > 𝐹théorique (𝛼, 1, 𝑁 − 2) la régression est significative

15
D- Exemple générale :
D.1 Contexte formulation
Dosage d’un conservateur (phénoxyéthanol) dans une émulsion cosmétique par HPLC-UV.
Objectif : détecter la présence du conservateur à l’état de traces (< 0,05 %)
Données expérimentales

Concentration (mg/l) Signal (UA)

1 120

2 245

5 610

10 1220

20 2450
Droite obtenue :

Signal (UA)
3000

2500

2000

1500

1000

500

0
0 5 10 15 20 25

D.2 Calcul de la pente (S)

Données expérimentales

i Concentration 𝑥𝑖 (mg/l) Signal 𝑦𝑖 (UA)

1 1 120

2 2 245

3 5 610

4 10 1220

5 20 2450

16
Nombre de points :
𝑵=𝟓

D.2.1. Calcul des moyennes

Moyenne des concentrations
1 + 2 + 5 + 10 + 20 38
𝑥ˉ = = = 7,6
5 5

Moyenne des signaux

120 + 245 + 610 + 1220 + 2450 4645
𝑦ˉ = = = 929
5 5

D.2.2. Tableau de calcul (méthode des moindres carrés)

i 𝑥𝑖 𝑦𝑖 𝑥𝑖 − 𝑥ˉ 𝑦𝑖 − 𝑦ˉ (𝑥𝑖 − 𝑥ˉ)(𝑦𝑖 − 𝑦ˉ) (𝑥𝑖 −𝑥ˉ)2

1 1 120 −6,6 −809 5339,4 43,56

2 2 245 −5,6 −684 3830,4 31,36

3 5 610 −2,6 −319 829,4 6,76

4 10 1220 2,4 291 698,4 5,76

5 20 2450 12,4 1521 18860,4 153,76

Sommes nécessaires
∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ)(𝑦𝑖 − 𝑦ˉ) = 29558
∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ)2 = 241,2
D.2.3. Calcul de la pente (S)

∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ)(𝑦𝑖 − 𝑦ˉ)

𝑆=
∑(𝑥𝑖 − 𝑥ˉ)2
29558
𝑆=
241,2
𝑆 = 122,6 UA\l\mg−1

D.2.4. Calcul de l’ordonnée à l’origine (b)

𝑏 = 𝑦ˉ − 𝑆𝑥ˉ
𝑏 = 929 − (122,6 × 7,6)

17
 𝑏 = 929 − 931,8 = −2,8

Ordonnée très proche de zéro donc absence de biais instrumental significatif.

D.2.5. Équation finale de la droite d’étalonnage

𝑦 = 122,6 𝑥 − 2,8

D.2.6. Interprétation analytique (HPLC-UV)

• La réponse est hautement proportionnelle à la concentration
• La pente élevée indique une bonne sensibilité
• La droite est adaptée pour :
o étude de linéarité
o calcul de LOD / LOQ
o quantification en formulation
D.3. Lien direct avec LOD / LOQ
Si l’écart-type des résidus est noté 𝜎:
𝜎 𝜎
LOD = 3,3 ; LOQ = 10
122,6 122,6

D.3.1. Calcul des résidus

Valeurs calculées :
𝑦̂𝑖 = 122,6𝑥𝑖 − 2,8

𝑥𝑖 (mg/l) 𝑦𝑖 (UA) 𝑦̂𝑖 (UA) Résidu 𝑒𝑖 = 𝑦𝑖 − 𝑦̂𝑖

1 120 119,8 +0,2

2 245 242,4 +2,6

5 610 610,2 −0,2

10 1220 1223,2 −3,2

20 2450 2449,2 +0,8

18
D.3.2. Calcul de l’écart-type des résidus σ
Formule :

∑𝑒𝑖2
𝜎= √
𝑁−2

Calcul numérique

Résidu 𝑒𝑖2

0,2 0,04

2,6 6,76

−0,2 0,04
−3,2 10,24

0,8 0,64

∑𝑒𝑖2 = 17,72
17,72
𝜎=√ = √5,91
3
𝜎 = 2,43 UA

D.3.3. Calcul de la LOD et de la LOQ (ICH Q2)

Formules :
𝜎 𝜎
LOD = 3,3 ; LOQ = 10
𝑆 𝑆

Application numérique :
𝑆 = 122,6

LOD
2,43
LOD = 3,3 × = 0,065 mg/l
122,6

19
LOQ
2,43
LOQ = 10 × = 0,198 mg/l
122,6

Interprétation formulation
Paramètre Valeur

LOD 0,065 mg/l

LOQ 0,20 mg/l

Ainsi, toute concentration :

• < 0,065 mg·l⁻¹ : non détectable
• ≥ 0,065 mg·l⁻¹ et < 0,20 mg·l⁻¹ : détectable mais non quantifiable
• ≥ 0,20 mg·l⁻¹ (LOQ) : quantifiable avec une exactitude et une précision acceptables
Conclusion :
• La méthode est adaptée pour le contrôle de traces du conservateur. Méthode hautement
sensible

D.4 Calcul du coefficient de détermination R²

Formule :
∑(𝑦̂𝑖 − 𝑦ˉ)2
2
𝑅 =
∑(𝑦𝑖 − 𝑦ˉ)2

Résultat numérique :
À partir des données :

𝑅 2 = 0,9999
Interprétation :
• 99,99 % de la variance du signal est expliquée par la concentration
• Ceci et conforme aux exigences ICH (≥ 0,999 pour HPLC)

D.5 Test de linéarité – Test de Fisher

D.5.1 Hypothèses
• 𝐻0 : pas de relation linéaire (a = 0)
• 𝐻1 : relation linéaire significative

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D.5.2 Calcul de F
𝑅2
𝐹= × (𝑁 − 2)
1 − 𝑅2
0,9999
𝐹= ×3
0,0001
𝐹calc ≈ 29997

D.5.3 Valeur critique

𝐹th (1,3, 𝛼 = 0,05) ≈ 10,1

D.5.4 Décision
𝐹calc ≫ 𝐹th

Donc la régression et hautement significative et linéarité est statistiquement démontrée

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