II.2.

Méthodes expérimentale

II.2.1. Étude des activités antimicrobienne

Nous avons pour objectif principal l’évaluation de l’activité antibactérienne et antifongique des
extraits phénoliques de Thymelaea microphylla et Thymelaea tartonriara par deux méthodes :

 La méthode de diffusion sur milieu solide

 La méthode de diffusion en milieu liquide.

Préparation des disques

Le papier Wattman N°3 a été utilisé pour préparer des disques de 6 mm de diamètre en utilisant
un emporte-pièce en se basant sur les diamètres des disques d'antibiotiques disponibles sur le
marché.

Préparation des dilutions d’extraits des plantes

Par une balance analytique, on pèse 0.1 g de chaque extrait des deux plantes (Meoh , Acétate
d’éthyle) et on les solubilisent dans un 3 ml de DMSO . On obtient ainsi une solution mère

C0 (0,033g/ml). Ensuite, on introduit 1000 μl de la solution mère dans des tubes contenant 500
μl et 2000 μ de DMSO pour obtenir respectivement des dilutions de 0,165g/ml et 0,066g/ml.

Figure : préparation des dilutions d’extraits des plantes

 Le dimethyl sulfoxide ‘DMSO’
DMSO « Dimethyl sulfoxide » est un soufre organique de formule (CH3)2SO , ce liquide
transparent est un solvant aprotique polaire essentiel qui permet de dissoudre les composés
polaires et non polaires. Il est miscible avec de nombreux solvants organiques ainsi que l'eau
(HASSAN.,2014) .

Hassan, Ashraf. (2014). The Antibacterial Activity of Dimethyl Sulfoxide (DMSO) with and
without of Some Ligand Complexes of the Transitional Metal Ions of Ethyl Coumarin
against Bacteria Isolate from Burn and Wound Infection. 10.13140/RG.2.2.36692.40321.

Le DMSO a été choisi pour diluer les extraits naturels en raison de son absence de réaction et
d'activité sur la souche microbienne.

Figure : La structure du DMSO (réalisé par chemDraw)

Le test d’antibiogramme est utilisé pour testés la sensibilité des souches microbiennes en
comparant avec nos extraits, le choix a été selon le type des souches, le spectre d’activité et la
disponibilité.

Nom Dose

Ciprofloxacin CIP-5 5µg

Antibiotique Cefoxitin FOX-30 30 µg

Imipenem IPM-10 10 µg

Céfazoline 1g

Antifongique Fluconazole 200 mg/100ml

Tableau : les antibiotiques et antifongiques utilisés

Technique de diffusion sur gélose

La méthode de diffusion sur gélose est une approche qualitative qui permet d’évaluer la
sensibilité et la résistance des micro-organismes aux extraits des plantes.

Placement des disques

Après l’assurance d’un champ stérile (mains, surface du travail bien nettoyés et flamme stérile
pour éviter les contaminations).

 Le disque papier Wattman N°3 est disposé sur le tapis bactérien et fongique à l’aide
d’une pince stérile et puis l’ajout délicate de d’extrait (10 µl /disque) et faut laisser le
disque se sécher avant l’incubation.
 Le test est réalisé 3 fois (C0, C1/2, C1/5) pour chaque échantillon, faut séparer les
dilutions chacun dans une boite pétrie pour avoir une bonne moyenne parce que l’extrait
est volatil.
 On utilise le DMSO comme control négatif (-) et les antibiotiques (IPM-10, CIP-5 ,
FOX-30) et l’antifongique (fluconazole) comme control (+) .
 Les boites sont incubées à 37°C pendant 24 heures après le diamètre de la zone
d’inhibition est mesuré en millimètres avec le pied à coulisse.

Figure : Principe de méthode de diffusion par disque

Figure : schéma de la méthode de diffusion sur gélose en utilisant des disques
Technique de micro dilution sur milieu liquide (détermination du CMI et CMB)

La micro-dilution sur milieu liquide est utilisé pour déterminer CMI (concentration minimale
inhibitrice) ,CMB (concentration minimale bactéricide) et la concentration minimale fongicide
(CMF) à partir des extraits de plantes. La micro dilution est réalisée dans des microplaques
transparente de 96 puits en polystyrène de haute qualité.

La CMI de chaque composé est égale à la concentration du premier puits où il n'y a pas de
croissance bactérienne observée (absence du couleur rose).

Nous avons préparé une solution mère en faisant dissoudre notre extrait dans une solution de
DMSO, pour obtenir une concentration de (C0=0.033g/ml), la solution obtenue est agitée au
vortex pour avoir une bonne homogénéisation.

Figure : Schéma représentatif d’une microplaque à 96 puits

 Protocol

Première étape :

100 µl de milieu de culture ont été distribués dans tous les puits . Les rangés (A ,B,C, E,F,G )
bouillon MH pour les souches bactériennes et rangés (D et H) bouillon SAB pour la souche
fongique.

Deuxième étape :

Ajout de 100 μl de la solution mère d’extrait à une concentration de C=0.033g/ml, Dans les
puits de la première colonne, de A à D. l’extrait acétate dans A à D et l’extrait MeOH de E à H .

Par la suite, une série de dilutions successives a été réalisée de la colonne 2 à 6 à l'aide du milieu
de culture liquide comme un diluant. Pour maintenir une concentration constante de 100 μl dans
chaque puits, l'excédent de la dernière concentration (100 μl) a été éjecté.

Pour le control positif, l’ajout de 100 μl d’antibiotique céfazoline (1g) en poudre diluée dans le
solvant chlorhydrate de lidocaïne (0.04g) pour les puits de rangés (A, B ,C E ,F, G ),et
l’antifongique fluconazole ( 200mg /100ml )pour les puits de rangés D et H de ,colonne 7
diluée en série jusqu’aux puits de la colonne 12 (on jette 100 μl du dernier puits).

Troisième étape :

L’ajout de 50 μl de suspension microbienne ajustées avec une charge de 10*8 UFC/ml dans tous
les puits.

Le volume total de chaque puit est 150 μl.

Quatrième étape :

Après une incubation de 24h à 37 °C de la microplaque dans l’étuve microbienne. On ajout 40 μl

dans chaque puit le réactif iodonitrotétrazolium chloride INT de concentration 0.2 mg/ml , et on
attend 30min .

On utilise l'INT, un sel de tétrazolium, comme indicateur de croissance bactérienne il forme un

colorant formazan stable lors de la réduction par les micro-organismes , ce qui le rend adapté
pour évaluer la croissance microbienne afin de déterminer la concentration minimale inhibitrice
CMI des extraits de plantes pour les bactéries et même les champignons .(ELOFF. ,2019)
 Figure : Structure du l’iodonitrotétrazolium chloride INT (réalisé par chemDraw)

On procède à la lecture à l'oeil nu afin de déterminer la CMI , ensuite, on repiquant sur un

milieu solide des puits non colorés pour déterminer la CMB.

Eloff J. N. (2019). Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and
publishing the results. BMC complementary and alternative medicine, 19(1), 106.
[Link]

Figure : la culture sur un milieu solide pour déterminer la CMB