4-Mode opératoire :
A -Préparation de milieu de culture « Gélose nutritive »
1- Définition
La gélose nutritive est un milieu de culture solide très utilise en microbiologie
pour faire pousser des micro-organismes, surtout des bactéries non exigeantes. C’est un
milieu non sélectif permet la croissance de nombreuses bactéries, non différentiel ne
distingue pas les bactéries entre elles leur pH généralement autour de 7 (neutre).
2- Composition
Elle contient généralement :
Extrait de viande : source de vitamines et de nutriments ……………. 3g
Peptone : apporte des acides aminés (azote) ……………………………… 5g
Chlorure de sodium (Nacl) : maintient l’équilibre osmotique……… 5g
Agar-agar : substance gélifiante (donne la texture solide) ………….. 15g
Eau distillée………………………………… 1000 ml
B– Préparation des échantillons de sol ferreux
1 -Prélèvement du sol
Prélever a 5-10 cm de profondeur (éviter la surface
contaminée)
Prendre un échantillon a l’aide d’une spatule ou d’une pelle
stérile
Mettre dans un bécher stérile
Etiqueter (type de sol ferreux)
2 - Séchage et homogénéisation
Retirer les cailloux, racines débris
Broyer légèrement pour obtenir une texture homogène
3- Préparation de la suspension mère
Peser 1 g de sol ferreux bien broyé avec
Ajouter dans 9mL d’eau distillée stérile
Agiter fortement avec le vortex ou agitation manuelle
C_ Dilution décimale ou au dixième : 1/10 ou 10-1
1- Définition
La dilution décimale est méthode utilisée pour diminuer
progressivement la concentration d’une solution en la diluant par un
facteur da 10 à chaque étape.
2- Matériel
Un tube de diluant de 9 ml (eau distillée, en général, sauf
indication contraire : eau physiologique, eau peptone, typotone-
sel, …)
Une pipette stérile de 1 ml (ou pipette automatique p1000 avec
cônes stériles ).
Un vortex.
3- Préparation de dilution.
Homogénéiser la suspension microbienne à prélever (agitation
par mouvements circulaires pendant 10 secondes environ ou à
l’aide d’un vortex).
Ouvrir et flamber l’ouverture du tube.
Prélever 1 ml de suspension à l’aide de la pipette plastique (ou
pipette automatique). Ne pas introduire la pipette dans la
suspension de plus de 1 cm.
Flamber et refermer le tube. Il est conseillé de replacer le
portoir à une place montrant. Qu’il ait déjà été prélevé (en
retirait par exemple)
Ouvrir le tube de 9 ml de diluant, flamber l’ouverture, y
introduire le volume prélevé (sur la paroi sans toucher le
liquide). Eviter tout contact entre la pipette contenant
l’inoculum et le diluant stérile.
Flamber et refermer le tube, jeter la pipette souillée dans l’eau
de Javel.
D -Technique d’ensemencement
1 -Définition
C’est L’action de transférer des bactéries, levures ou autres micro-organismes sur ou dans un
milieu nutritif adapté (solide ou liquide).
2- matériel.
Une pipette stérile de 1 ML : Il ne faut qu’une seule pipette de 1ml pour ensemencer toutes
les boites si elles ensemencées de la dilution la plus grande a la dilution la plus petite (du
plus diluée au plus concentrée).
3-Méthode.
Ensemencement en surface :
Le dénombrement en surface s’effectue sur 0,1 ml de dilution.
Homogénéiser la dilution à prélever (la plus grande).
Prélever un volume précis au dixième de millilitre à l’aide pipette stérile de 1 ml
et déposer 0,1 ml de la dilution au centre de la surface de la gélose.
Etaler à l’aide d’un étaloir en verre le volume sur toute la gélose.
E- incubation
Placer les boites de pétri en incubation dans une étuve à 37°C. La durée d’incubation
est généralement de 24 à 48 heures.