Master 2 PCP, BPR, GD
Plan du cours
Spectrométrie de masse
1. Définition
2. Principe
3. Instrumentation
4. Interprétation des spectres
La spectrométrie de masse (SM) désigne une méthode
de caractérisation de la matière qui repose sur la
détermination des masses atomiques ou moléculaires
des espèces individuelles présentes dans l’échantillon.
Elle permet en outre l’identification et la
quantification de ces espèces.
Les instruments utilisés pour cela sont les
spectromètres de masse. Cette méthode occupe une
place privilégiée dans l’analyse chimique qualitative et
quantitative des composés organiques.
Définition
La spectrométrie de masse(MS)est une méthode de mesure des rapports masse sur charge (m/z)de
molécules individuelles et ionisées et de leurs produits de fragmentation
Plusieurs informations peuvent être disponibles à partir d’un spectre de masse :
la masse moléculaire d’un composé,
la masse des fragments de ce composé,
une mesure quantitative de ce composé…
Définition
La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire.
Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la
structure.
L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative.
Pour une molécule, trois types de masses sont définies
- Masse moléculaire moyenne :
dite aussi masse chimique, c’est la masse calculée en utilisant la masse atomique de chaque élément qui
tient compte de l’abondance relative des isotopes naturels. Exemple : masse moyenne du méthanol
CH3OH = (12,01115 + 4*(1,00794) + 15,9994) Da = 32,04231 Da.
C’est la masse calculée utilisée par un chimiste pour les calculs stœchiométriques.
- Masse nominale : c’est la masse calculée en utilisant la masse entière de l’isotope principal (le plus
abondant) de chaque élément. Exemple : la masse nominale de CH3OH = (12 + 4*1 + 16) = 32u.
- Masse mono – isotopique : appelée dans certains ouvrages ″masse isotopique″, c’est la masse
calculée en utilisant la masse exact de l’isotope principal de chaque élément. Exemple : masse mono –
isotopique du CH3OH = (12,0000 + 4*1,007825 + 15,994915) = 32,026215 u.
C’est la masse mesurée par un spectromètre de masse à haute résolution et utilisée dans les
banques de données informatisées.
(1Da = 1,673*10-27 kg = 1,007 uma).
Exemple:
Principe
Un spectromètre de masse mesure la masse de molécules isolées
Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations
suivantes :
1-Volatiliser = Séparer les molécules les unes des autres : on passe de
l’état de matière condensée à un état gazeux.
2-Ioniser = Transformer les molécules en ions, car un spectromètre
de masse fonctionne grâce à des champs électriques.
3-Mesurer les rapports m/z = La masse moléculaire est calculée à
partir du rapport masse (m)/charge (z).
Instrumentation
Les principaux éléments d’un spectromètre de masse sont :
un système d’introduction de l’échantillon
une source d’ions
un analyseur
un ensemble de détection d’ions
Instrumentation
Système d’introduction de l’échantillon = Faire entrer la substance M à
analyser dans le spectromètre de masse
Source d’ions =
Produire des ions à l’état gazeux,
Extraire les ions formés et les acheminer vers l’analyseur
Il existe de nombreuses méthodes d’ionisation adaptées à la nature de
l’échantillon et au type d’analyse à effectuer.
Analyseur = Trier les ions en fonction de leur rapport masse/charge (balayage
d’un champ magnétique ou électrique)
Détecteur = Recueillir les ions séparés par l’analyseur pour produire un
courant électrique proportionnel au nombre d’ions
Pour éviter toutes collisions avec des molécules résiduelles, «source, analyseur et
collecteur »du spectromètre de masse sont maintenues sous vide par un
système de pompage fonctionnant en permanence.
Sources d’ions
Il existe de nombreux types de sources d’ions et chacun de
ces types de sources repose sur un principe physique
différent. Le principe physique qui permet de volatiliser et
d’ioniser un type de composé est choisi par l’opérateur en
fonction des caractéristiques de la molécule à analyser.
Les étapes de volatilisation et d’ionisation se font
successivement ou simultanément selon le type de source.
Les critères de choix principaux sont :
la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser
sa labilité chimique
les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une
ionisation
la taille des molécules
les quantités de produit disponibles
le type d’introduction souhaitée (directe ou en couplage
chromatographique)
Ionisation par impact électronique (EI)
Effet du potentiel du faisceau électronique sur
l’ionisation des molécules
Ionisation chimique (CI)
La substance à analyser est injectée dans la
source avec un large excès de gaz (méthane,
ammoniac, isobutane…). Le gaz (ionisé en
premier), ionise la substance par transfert de
charge.
Ionisation chimique positive
Génère des ions positifs (acquisition d’une masse)
Exemple: Méthane :
Ionisation chimique négative
Génère des ions négatifs (perte d’une masse)
Exemple: (mélange N2O/CH4) :
Résumé:
Comparaison du résultat d’une ionisation par impact
électronique et d’une ionisation chimique de la leucine
Ionisation par electrospray (ESI)
Une solution est pulvérisée dans une chambre. Un courant de gaz sec (N2)
évapore progressivement le solvant
Un potentiel de quelques kV est appliqué à la sortie du capillaire ce qui permet
de charger les gouttelettes
Les gouttelettes chargées (de plus en plus petites) sont dirigées par un champ
électrique vers l’analyseur
L'ionisation MALDI (désorption-ionisation laser
assistée par matrice)
C’est une technique dite « douce » qui permet de
générer des ions à partir de grosses molécules fragiles,
telles que les protéines, les peptides et les polymères,
avec une fragmentation minimale.
Le processus se déroule en plusieurs étapes:
Préparation de l'échantillon : L'échantillon à analyser (analyte) est
mélangé à une substance chimique appelée « matrice ».
Co-cristallisation : Le mélange analyte-matrice est déposé sur une cible
et le solvant est évaporé, ce qui forme une couche de cristaux solides
sur la surface. La matrice doit absorber l'énergie du laser à la longueur
d'onde utilisée.
Irradiation laser : Un faisceau laser pulsé est dirigé vers les cristaux. La
matrice absorbe l'énergie du laser, ce qui augmente sa température de
plusieurs dizaines de °C et la fait se sublimer rapidement, et entraîne
les molécules d'analyte dans la vapeur de matière qui se forme.
Ionisation : Pendant le processus de désorption, les molécules d'analyte
sont ionisées, le plus souvent par transfert de proton entre la matrice et
l'analyte. Cela génère des ions moléculaires, principalement des ions
chargés positivement [M+H] ou négativement [M-H] selon la nature
des molécule du réseau.
Choix de la méthode d’ionisation selon la molécule à analyser
Choix de la méthode d’ionisation selon la le but visé par l’analyse:
Les méthodes d’ionisations sont classées en deux types selon leur impact
sur la fragmentation:
Les «ionisations dures» : génèrent souvent des ions moléculaires, à
nombre impair d’électrons, qui se fragmentent beaucoup et parfois
même totalement avant d’avoir eu le temps de sortir de la source.
Les «ionisations douces »: génèrent des ions moléculaires à nombre
pair d’électrons, qui sont relativement stables et qui ont des durées de
vie suffisantes pour traverser l’analyseur, arriver jusqu’au détecteur, et
donc être mesurés.
ESI: Méthode douce
EI: Méthode dure
CI: Méthode assez douce
L’analyseur
Les ions formés dans la source d’ions sont dirigés
(par un système d’extraction et de focalisation)
vers l’analyseur par des champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts
(Q, IT, FT-ICR) ou de plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B).
La vitesse de déplacement des ions dans l’analyseur dépend de l’intensité
du champ d’extraction
Il existe différents types d’analyseurs. Ils sont tous basés sur des principes
physiques différents, mais tous les analyseurs mesurent des valeurs
m/z.
B :Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus
ancien)
Q :Déflexion par un champ quadrupolaire
IT :Confinement dans un piège à ion (IonTrap)
TOF :Mesure d’un temps de vol (TimeOfFlight)
FT-ICR :Résonnance Cyclotronique d’Ions à Transformée de Fourrier
Principe de fonctionnement d’un analyseur B:
I-
Principe de fonctionnement d’un analyseur magnétique B:
II-
II-
Principe de fonctionnement d’un analyseur magnétique B:
L’échantillon est injecté par seringue, ou est issu d’une sortie de chromatographes (GC, HPLC…
Le jet gazeux passe dans la chambre d’ionisation
Un système permet de canaliser le flux moléculaire en un jet qui est dirigé vers un
ensemble d’électrodes
Les ions, selon leurs rapports m/z, arrivent à des temps différents sur le détecteur
Analyseur Par Temps de Vol (T.O.F.)
MALDI - TOF
Un analyseur par temps de vol (TOF) mesure la masse
des ions en mesurant le temps qu'ils mettent à
parcourir une distance donnée dans un tube sous vide
(de 0.5–2 m), après avoir été accélérés par un champ
électrique.
Le temps de vol dépend du rapport m/z des molécules
Principe:
Détecteur
Dernier élément du spectromètre de masse, le détecteur
fournit des signaux électriques qui sont enregistrés sous
la forme de spectres de masse par le logiciel d’acquisition
de l’ordinateur qui pilote l’appareil.
Il existe différents détecteurs :
Cylindre de Faraday
Multiplicateur d’électrons secondaires
Multiplicateur magnétique
Channeltron
Galette de microcanaux
Interprétation des spectres de masse
I- Identification des pics spécifiques correspondant au bruit
de fond
Spectre composé de pics caractéristiques du fond :
Pics des gaz ionisants (O2 m/z = 32, N2 m/z = 28, Ar m/z = 40…)
Pics des composés libérés par la phase stationnaire d’une colonne
GC (dérivés silylésm/z = 207, 281…)
Pics des impuretés du solvant pour la LC-MS
Pics de la matrice (en FAB et MALDI)
Interprétation des spectres de masse
II- Recherche du pic le plus intense
Pic de base (100 %): formation du fragment le plus probable
donc le plus facile à former lors de l’ionisation de la molécule
Identification de ce pic très importante
Interprétation des spectres de masse
III- Identification du pic moléculaire
Le pic moléculaire ou pic apparenté est généralement le plus lourd ou
presque le plus lourd si le spectre présente des satellites isotopiques.
Il peut être de faible intensité(voir absent) si la molécule est fragile
Intensité très faible si la molécule a de nombreuses ramifications
Intensité forte si la molécule à de nombreuses insaturations
Avec des techniques d’ionisation tels que FAB, MALDI, API… peuvent
apparaître de pics correspondant à des dimères (2M) ou trimères (3M)
Le pic à rechercher diffère selon la technique d’ionisation
Interprétation des spectres de masse
III- Utilisation des massifs isotopiques
Les isotopes naturels génèrent des pics de masse proche à
M+1 ou M+2 d’abondance caractéristique de la composition
des fragments principaux.
On porte à 100 % l’abondance d’un pic de masse M et on
normalise les pics de masse M+1 et M+2.
Dans le cas du pic moléculaire, on peut obtenir de cette façon
la formule brute de la molécule recherchée.
Exemple :
Interprétation des spectres de masse
III- Utilisation des massifs isotopiques
On fait un calcul approché du nombre de C, H, O et N
en utilisant des modèles mathématiques