Les Méthodes d’étude des mutations

Introduction
Les cellules subissent des milliers d'agressions endogènes (erreurs de réplication, production
de radicaux libres) ou exogènes (rayonnements UV, agents chimiques), entraînant des
modifications potentiellement graves, surtout au niveau de l'ADN. Une altération de l'ADN
peut être transmise si elle n'est pas réparée, ce qui rend nécessaire l’étude des mutations à
travers différentes méthodes.
La biologie moléculaire, notamment à travers l'extraction d'acides nucléiques, la PCR et les
techniques d'hybridation et de séquençage, permet d'étudier ces altérations à grande échelle.

I/. Extraction et purification de l'ADN et de l'ARN

I/.1 Objectif de l'extraction
L'objectif est de fournir des acides nucléiques de haute qualité, accessibles aux analyses telles
que la PCR. Les principaux points sont :
 Purification : Éliminer les contaminants susceptibles d'inhiber la réaction PCR
(nucléases, protéines, inhibiteurs de polymérase).
 Concentration optimale : Obtenir une concentration adéquate pour améliorer la
sensibilité des techniques d'analyse.
Les acides nucléiques peuvent être affectés par différents contaminants tels que :
 SDS (>0,005%), phénol (>0,02%), éthanol (>1%), héparine (>0,015 mM), urée (>20 mM),
EDTA (>0,5 mM).
I/. 2 Recueil du spécimen
Les spécimens peuvent être divers, comme :
 Sang total (sous anticoagulant) : Prélèvement sous anticoagulant, l'EDTA est souvent
préféré à l'héparine qui inhibe la Taq polymérase.
 Tissus sains : Les échantillons doivent être frais ou congelés rapidement pour éviter la
dégradation des acides nucléiques.
Conservation :
 ADN : Relativement résistant à la dégradation, peut être conservé à +4°C ou à
température ambiante pour de courtes périodes.
 ARN : Très fragile, doit être conservé à -80°C immédiatement après le prélèvement.
I/. 3 Étapes fondamentales de l'extraction
1. Lyse des échantillons : Utilisation de tampons de lyse (SDS, protéinase K, lysozyme) pour
solubiliser la membrane cellulaire et inactiver les nucléases.
2. Extraction et purification des acides nucléiques : Les protéines et les acides nucléiques
non désirés sont éliminés par des agents comme les sels chaotropes, la précipitation
avec l'éthanol ou la chromatographie.
I/. 4 Caractéristiques des principales méthodes d'extraction
 Méthode saline (Salting Out) : Utilise des sels pour précipiter les protéines et purifier
l'ADN.
 Méthode phénol/chloroforme : Le phénol dénature les protéines, tandis que le
chloroforme aide à améliorer la séparation des phases. Après mélange, l'échantillon est
centrifugé. Cela permet la formation de deux phases :
La phase aqueuse (en haut), qui contient l'ADN ou l'ARN.
La phase organique (en bas), qui contient les protéines dénaturées et les lipides.
 Chromatographie : Les acides nucléiques sont adsorbés sur de la silice, les impuretés
sont éliminées par lavage.
I.5 Critères de choix d’une stratégie de purification
Les critères incluent :
 Nature des échantillons (sang, tissus), contaminants potentiels, niveau de pureté exigé
par les analyses en aval, rendement souhaité, temps nécessaire et coût.
Le rapport A260/A280 est utilisé pour évaluer la pureté des préparations :
 ADN pur : A260/A280 = 1,8 à 2,0
 ARN pur : A260/A280 = 2,0

II/. PCR classique : principe et application

La PCR classique (Polymerase Chain Reaction) est une technique de biologie moléculaire
essentielle utilisée pour amplifier de manière exponentielle une région spécifique d'ADN.
1. Principe de la PCR
La PCR permet d’amplifier une région spécifique d'un ADN donné. Cette amplification est
basée sur la capacité de l'ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d'un ADN
simple brin, servant de matrice. Le processus repose sur une série de cycles répétitifs, chacun
doublant la quantité d'ADN.
  Amplification exponentielle : Le nombre de copies d'ADN double à chaque cycle. Pour n
cycles, on obtient 2^n copies de l'ADN cible.
 Nombre de cycles : En général, on effectue environ 30 cycles pour obtenir suffisamment
de produit amplifié pour la détection et l'analyse.
2. Étapes de la PCR
La PCR se déroule en trois étapes principales qui se répètent à chaque cycle :
 Dénaturation thermique : À 95°C, les deux brins d'ADN sont séparés en brins simples en
rompant les liaisons hydrogène entre les bases complémentaires. Cette étape dure
environ 30 secondes à 1 minute.
 Hybridation des amorces (ou "annealing") : Les amorces, qui sont des séquences
courtes d'oligonucléotides, se lient à leurs séquences complémentaires sur chaque brin
d'ADN simple. Cette étape a lieu à une température plus basse, généralement entre
56°C et 64°C, pendant 30 secondes à 1 minute.
 Extension des amorces : La Taq polymérase allonge les amorces en ajoutant des
nucléotides complémentaires au brin matrice. Cette phase se déroule à 72°C, la
température optimale de la Taq polymérase, pendant 30 secondes à 2 minutes selon la
taille du fragment d'ADN.
3. Composants de la PCR
Les composants nécessaires pour une réaction PCR sont :
 ADN matrice : C'est l'ADN qui contient la séquence cible à amplifier.
 Amorces : Ce sont des oligonucléotides spécifiques à la région de l'ADN que l'on
souhaite amplifier. Chaque cycle de PCR utilise deux amorces, une pour chaque brin
complémentaire.
 Taq polymérase : Enzyme thermorésistante extraite de la bactérie Thermus aquaticus,
capable de résister à de hautes températures. Elle synthétise les nouveaux brins d'ADN
en ajoutant des nucléotides à l'extrémité 3' des amorces.
 dNTPs (désoxyribonucléotides) : Ce sont les "briques" qui seront ajoutées par la
polymérase pour construire le nouveau brin d'ADN.
 Tampon de réaction : Il maintient le pH optimal pour l'activité de la Taq polymérase.
 MgCl₂ : Le magnésium est un cofacteur essentiel pour la polymérase, car il stabilise
l'interaction entre l'enzyme et les nucléotides.
 4. Cinétique de la PCR
 Phase exponentielle : L'ADN est amplifié de manière exponentielle pendant les
premiers cycles.
 Phase de plateau : Après environ 30 cycles, la réaction atteint un plateau où
l’amplification ralentit en raison de l'épuisement des réactifs et de l'accumulation
de produits inhibiteurs.
5. Optimisation de la PCR
Plusieurs paramètres doivent être optimisés pour assurer une amplification efficace et
spécifique :
 Concentration en amorces et MgCl₂ : Un équilibre doit être trouvé pour favoriser
la spécificité sans inhiber l’activité enzymatique.
 Température d'hybridation (Tm) : Une température trop basse entraîne une
hybridation non spécifique des amorces, tandis qu'une température trop élevée
empêche leur fixation. La température idéale dépend de la composition des
amorces.
 Nombre de cycles : Trop de cycles peuvent introduire des erreurs d'amplification
ou favoriser des produits non spécifiques.
6. Applications de la PCR classique
 Diagnostic médical : Détection d'agents pathogènes, analyse des mutations
génétiques.
 Recherche génétique : Études sur les mutations, les polymorphismes et le clonage
génétique.
 Analyse médico-légale : Identification par ADN dans les enquêtes criminelles.
 Biotechnologie : Production de séquences d'ADN spécifiques pour la recherche et
le développement.
7. Avantages et limites de la PCR classique
 Avantages :
o Rapidité : Les résultats peuvent être obtenus en quelques heures.
o Sensibilité : Permet d'amplifier une région spécifique même à partir de très
petites quantités d'ADN.
o Large application : Utilisée pour une grande variété d'applications, allant de la
recherche à la médecine clinique.
  Limites :
o Risque de contamination : L'ADN exogène peut contaminer l'échantillon et
provoquer des faux positifs.
o Limite de taille : La PCR classique est moins efficace pour les séquences d’ADN
longues (au-delà de 3 kb).
o Spécificité : Des hybridations non spécifiques peuvent entraîner la production de
fragments indésirables.
8. Vérification des résultats de la PCR
Après amplification, le produit de la PCR est généralement vérifié par électrophorèse sur gel
d'agarose, qui permet de visualiser les fragments d'ADN et de confirmer leur taille par rapport
à un marqueur de poids moléculaire.

III/. Variantes de la PCR

1. PCR de digestion (PCR-RFLP)
La PCR avec digestion enzymatique est utilisée pour détecter des mutations ponctuelles ou des
polymorphismes en utilisant des enzymes de restriction spécifiques. Le principe repose sur
l’amplification d’une région d'intérêt par PCR suivie d'une digestion du produit PCR par une
enzyme de restriction.
 Principe : Après amplification, le produit PCR est digéré avec une enzyme de restriction
qui reconnaît et coupe une séquence spécifique. En cas de mutation, la séquence cible
de l'enzyme peut être altérée, empêchant la coupure.
 Applications : Utilisée pour identifier les mutations créant ou supprimant un site de
restriction, comme dans la drépanocytose
2. PCR multiplex
La PCR multiplex permet l'amplification simultanée de plusieurs séquences cibles différentes
au sein d'un seul tube, en utilisant plusieurs couples d'amorces.
 Principe : La réaction suit le même schéma que la PCR classique (dénaturation,
hybridation, élongation), sauf qu'elle utilise plusieurs couples d'amorces pour amplifier
différentes régions de l'ADN en même temps. Chaque paire d'amorces est spécifique à
une région cible différente.
 Applications : Cette technique est souvent utilisée dans la détection de délétions dans
de grands gènes, tels que le gène DMD responsable de la myopathie de Duchenne, ou
pour identifier des agents pathogènes dans des échantillons cliniques.
  Optimisation : La PCR multiplex nécessite une optimisation soigneuse des températures
d'hybridation et des concentrations en MgCl₂, car chaque couple d'amorces doit avoir
des caractéristiques similaires pour amplifier efficacement plusieurs cibles
simultanément sans interférences.
3. PCR nichée (nested PCR)
La PCR nichée consiste à effectuer deux PCR successives avec deux couples d'amorces
différents. La première réaction PCR amplifie une région cible, puis le produit de cette
première PCR sert de matrice pour une seconde PCR avec un nouveau couple d’amorces qui
cible une région interne à la première.
 Principe : L’objectif de la PCR nichée est d’augmenter la spécificité et la sensibilité en
éliminant les produits d'amplification non spécifiques de la première PCR. La première
PCR utilise des amorces externes pour amplifier une région d'ADN, tandis que la
seconde PCR utilise des amorces internes à cette région.
 Applications : La PCR nichée est particulièrement utile dans des situations où la quantité
d'ADN cible est faible, comme dans le dépistage de virus ou de mutations rares.
4. PCR à démarrage à chaud (Hot Start PCR)
Cette technique a été développée pour améliorer la spécificité de la PCR en réduisant les
amplifications non spécifiques qui peuvent se produire lorsque les composants de la réaction
sont à température ambiante avant le début du cycle thermique.
 Principe : Dans la Hot Start PCR, certains composants de la réaction, comme la Taq
polymérase, sont soit physiquement séparés du mélange réactionnel, soit inhibés par
des anticorps ou des agents chimiques qui se désactivent à haute température. Cela
permet d’empêcher l’activité de l’enzyme à basse température, réduisant ainsi les
hybridations non spécifiques des amorces.
 Applications : Très utilisée dans les PCR diagnostiques où la sensibilité et la spécificité
sont essentielles pour éviter des faux positifs.
5. PCR touch down
La PCR touch down est conçue pour augmenter la spécificité en ajustant progressivement la
température d’hybridation au cours des premiers cycles de PCR.
 Principe : La PCR commence avec une température d’hybridation plus élevée que celle
calculée pour les amorces. Après quelques cycles, la température d’hybridation est
progressivement abaissée (par ex., d’un degré à chaque cycle) jusqu’à atteindre la
température optimale. Cela favorise l’amplification spécifique de la cible dès les
premiers cycles, tout en réduisant les hybridations non spécifiques à des températures
plus basses.
 6. PCR spécifique d'allèles (ARMS-PCR)
La PCR spécifique d’allèles permet de discriminer deux allèles d'un gène ne différant que par
un ou quelques nucléotides, notamment dans les études de mutations ponctuelles ou de
polymorphismes bi-alléliques.
 Principe : Des amorces spécifiques sont conçues pour l'allèle normal et l'allèle mutant.
Si l’amorce est complémentaire à la séquence cible, l’amplification a lieu. En cas de
mésappariement à l’extrémité 3’, l’amplification est inhibée ou absente.
 Applications : Utilisée pour identifier des mutations connues dans des pathologies
génétiques héréditaires. Par exemple, elle est utilisée pour détecter des mutations dans
le gène CFTR chez les patients atteints de mucoviscidose.
8. MLPA (La PCR semi-quantitative)
La MLPA est une variante de la PCR multiplex qui utilise des sondes dépendant d’une ligation
pour détecter des variations du nombre de copies de segments d’ADN.
 Principe : Cette méthode utilise deux sondes qui se lient à une région spécifique de
l’ADN. Une fois ces sondes liées, elles sont ligaturées, et la région ainsi obtenue est
amplifiée par PCR. Seules les sondes ligaturées sont amplifiées, ce qui permet de
quantifier la présence ou l’absence de segments d’ADN spécifiques.
 Applications : Utilisée pour détecter des délétions ou duplications dans des gènes
comme DMD (responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne) ou d’autres
anomalies génomiques.

7. RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)

La RT-PCR est utilisée pour amplifier des séquences d'ARN en les convertissant d'abord en ADN
complémentaire (ADNc) à l'aide d'une enzyme appelée transcriptase inverse.
 Principe : L'ARN cible est rétrotranscrit en ADNc, qui est ensuite amplifié par une PCR
classique. La RT-PCR est particulièrement utilisée pour étudier l'expression des gènes ou
pour détecter des virus à ARN.
 Applications : Utilisée dans la détection de virus comme le VIH ou le SARS-CoV-2, ainsi
que dans l’étude de l’expression des gènes dans des études biologiques et médicales.
IV/- La PCR quantitative en temps réel
La PCR quantitative en temps réel (qPCR), est une variante de la PCR classique qui permet non
seulement d’amplifier l’ADN, mais aussi de mesurer en temps réel la quantité d’ADN amplifiée
grâce à l’utilisation de marqueurs fluorescents.
1. Principe de la qPCR
 La qPCR repose sur la détection et la quantification d’un signal fluorescent émis lors de
l’amplification de l'ADN. À chaque cycle de PCR, la fluorescence augmente de façon
proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié.
 L’intensité de la fluorescence est mesurée cycle par cycle, permettant ainsi de suivre la
réaction en temps réel et d’obtenir des informations sur la quantité initiale d’ADN
présente dans l'échantillon.
 Cette méthode nécessite un thermocycleur équipé d’un système de détection optique
pour mesurer l’émission de fluorescence.

2. Phases de la qPCR
 La qPCR suit les mêmes étapes que la PCR classique (dénaturation, hybridation,
extension) mais ajoute la mesure de fluorescence.
 Les différentes phases de la cinétique de la PCR incluent :
o Phase d’initiation : où la réaction démarre.
o Phase exponentielle : où la quantité d’ADN double à chaque cycle et la
fluorescence augmente de manière exponentielle.
o Phase plateau : où la réaction ralentit en raison de l’épuisement des réactifs et
des produits d’inhibition.
3. Quantification et seuil
 Le cycle seuil (Ct) est le moment où la fluorescence détectée dépasse un seuil
préalablement défini. Le Ct est donc le nombre de cycles de PCR nécessaires pour que la
fluorescence observée dépasse le seuil de détection.
 Ct bas : Un nombre de cycles faible (valeur de Ct faible) signifie que la quantité initiale
d'ADN dans l'échantillon était élevée
4. Méthodes de détection de la qPCR
Il existe deux principaux types de détection de la fluorescence :
 Agents intercalants : comme le SYBR Green, qui se lie à l’ADN double brin. Plus il y a
d'ADN double brin, plus l'agent intercalant devient fluorescent. Cependant, cette
méthode n’est pas spécifique car elle détecte tout ADN double brin, y compris des
produits d’amplification non spécifiques.
 Sondes fluorogéniques : comme les sondes TaqMan, qui sont spécifiques d'une
séquence d'ADN. Lors de l'amplification, la sonde est dégradée par l'activité nucléase de
la Taq polymérase, libérant un fluorophore qui génère un signal .
5. Applications de la qPCR
 Étude de l’expression des gènes : en utilisant la RT-qPCR, on peut quantifier l’expression
des gènes en analysant l’ARN après sa rétrotranscription en ADNc.
 Recherche de mutations et de polymorphismes : pour détecter des mutations
génétiques dans des maladies .

V/- Les nouvelles techniques de PCR

A. La PCR quantitative : PCR – Digital
La PCR digitale est une variante de la PCR quantitative qui permet de quantifier directement
les copies d'ADN avec une précision élevée. Voici les points essentiels concernant cette
technique :
Principe de la PCR numérique
1. Concept : La PCR numérique repose sur le fractionnement de l'échantillon en milliers de
compartiments microscopiques, chacun contenant une ou plusieurs copies de l'ADN
cible. L'amplification se produit indépendamment dans chaque compartiment.
2. Système binaire : Chaque compartiment réagit indépendamment. Une amplification est
représentée par un signal positif (1), et l'absence d'amplification par un signal négatif
(0). Cette approche crée un système binaire, où les résultats de chaque compartiment
sont comptabilisés pour déterminer la quantité initiale de molécules cibles présentes
dans l'échantillon.
3. Loi de Poisson : Le calcul final s'appuie sur la loi de Poisson pour estimer la
concentration absolue d'ADN cible sans nécessiter de courbes standard, rendant cette
méthode très précise pour quantifier des mutations ou des cibles rares.
Étapes de la PCR numérique
1. Préparation du mélange : Le mélange réactionnel standard de PCR est préparé avec les
amorces, sondes, et les échantillons d'ADN.
2. Compartimentation : Le mélange est ensuite divisé en de nombreux
microcompartiments (microgouttelettes lipidiques ou micro-puits), chaque
compartiment contenant de 0 à 3 molécules d'ADN cible.
3. Amplification : La PCR est réalisée dans chaque compartiment individuel.
4. Détection : Les séquences amplifiées sont détectées soit par intercalation de l'ADN
double-brin, soit par des sondes spécifiques d'hydrolyse.
Intérêt et applications
 Détection de mutations rares : Elle est particulièrement utile pour détecter des
mutations présentes en très faible proportion, souvent inaccessibles avec d'autres
méthodes comme le séquençage Sanger ou la PCR classique.
 Quantification absolue : La PCR digitale permet une quantification sans utiliser d'échelle
standard, grâce à l'application de la loi de Poisson.

B. PCR Isotherme
L'amplification isotherme permet de surmonter les problèmes liés au processus de
refroidissement, car elle ne nécessite pas de cycles de température comme dans la PCR
conventionnelle. Ce type d'amplification présente plusieurs avantages :
1. Absence de cycles de température : Contrairement à la PCR classique, l'amplification
isotherme fonctionne à une température constante, ce qui simplifie les dispositifs
utilisés et réduit la consommation d'énergie.
2. Techniques associées : Parmi les techniques développées avec l'amplification isotherme,
on trouve :
o L'amplification par recombinase polymérase (RPA)
o L'amplification isotherme médiée par une boucle (LAMP)
3. Avantages :
o Simplification des dispositifs utilisés.
o Réduction de la consommation énergétique.
o Utilisation d'une polymérase spécifique ne nécessitant pas d'activité
exonucléasique 5’-3’.
 C. Extension d’amorce : SNAPSHOT
La méthode SNAPSHOT est une technique de génotypage utilisée pour l'identification des
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Voici les éléments principaux de cette méthode :
Principe de la technique SNAPSHOT
1. Hybridation : Une amorce unique est conçue pour s’hybrider en amont du SNP connu.
L’ADN cible est amplifié par PCR, puis purifié.
2. Mélange SNAPSHOT : Ce mélange contient :
o Taq polymérase
o Tampon PCR
o ddNTP fluorescents (didésoxyribonucléotides), qui bloquent l'extension après
incorporation d’un nucléotide unique correspondant au SNP.
3. Détection : La technique est basée sur la PCR et le séquençage de Sanger, permettant
d’incorporer un nucléotide unique à l'extrémité de l’amorce. L’analyse est réalisée par
électrophorèse capillaire suivie d'une détection par fluorescence.
4. Applications :
o Cette technique permet le génotypage multiplexé avec plusieurs amorces
spécifiques de différents SNPs, permettant de détecter plusieurs variations
génétiques simultanément.

VI/- Méthodes électrophorétiques

plusieurs techniques permettant de séparer et d'analyser les acides nucléiques ou les
protéines en fonction de leur taille et de leur charge. Voici quelques détails supplémentaires
sur les techniques principales mentionnées :
Types de gels et conditions :
 Gel d’agarose : Principalement utilisé pour séparer les grands fragments d'ADN, avec
des concentrations variant entre 0,5 % et 2 %, selon la taille des fragments à analyser.
Par exemple, un gel de 1 % d'agarose permet de séparer des fragments entre 500 et 10
000 pb.
 Gel de polyacrylamide : Utilisé pour la séparation de petits fragments d'ADN avec une
haute résolution, notamment en électrophorèse capillaire pour le séquençage de l'ADN.
Techniques spécifiques :
1. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) :
o Utilisé en conditions non dénaturantes, cette technique permet de détecter des
mutations ponctuelles en séparant les brins d'ADN simple selon leur conformation
tridimensionnelle.
o Les conformations adoptées par les brins dépendent fortement de la séquence
nucléotidique, et des variations mineures comme une mutation peuvent entraîner
des différences de migration. Cette technique permet de détecter plus de 70 %
des mutations ponctuelles.
2. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) :
o Cette technique utilise un gel avec un gradient dénaturant pour séparer les
fragments d'ADN en fonction de leur sensibilité à la dénaturation.
o Elle est particulièrement utile pour détecter des mutations, en observant des
différences de migration entre les ADN normaux et mutés, par exemple dans des
études de polymorphisme.
3. Électrophorèse capillaire :
o Utilisée principalement pour le séquençage d'ADN, cette technique permet de
séparer les fragments en fonction de leur ratio masse/charge dans un capillaire
rempli d’un tampon électrolytique. Elle offre une très haute résolution,
permettant de distinguer des différences d'une seule base.

VII/- DHPLC
La DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) est une méthode de pré-
analyse utilisée pour détecter les mutations génétiques, notamment les insertions, délétions
et substitutions. Le principe repose sur la détection des hétéroduplexes et homoduplexes qui
se forment après la dénaturation et la renaturation d'ADN provenant de différents allèles. Les
hétéroduplexes, résultant de la présence d'une mutation, sont moins stables thermiquement
que les homoduplexes et sont donc séparés plus tôt lors de l'élution dans la chromatographie.
Cette technique est souvent utilisée dans le screening pour détecter des mutations inconnues
et dans le scoring pour identifier des mutations connues. Le système WAVE® est l'un des
dispositifs utilisés pour la DHPLC, permettant de séparer et de visualiser les produits amplifiés
en fonction de leur stabilité thermique.
En résumé, la DHPLC est une méthode puissante pour identifier des variations génétiques
subtiles avant de procéder à des analyses plus poussées comme le séquençage d'ADN.
VIII/- Méthodes d’hybridation
A. Southern Blot
Le Southern blot est une méthode utilisée pour détecter la présence d'une séquence
spécifique d'ADN dans un échantillon.
Principe : Le Southern blot repose sur la séparation de fragments d'ADN par électrophorèse
sur gel d'agarose, suivie de leur transfert sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose.
Ensuite, une sonde spécifique, complémentaire de la séquence d'ADN d'intérêt, est appliquée
pour détecter les fragments par hybridation.
1. Procédure :
o L'ADN est d'abord coupé en fragments à l'aide d'enzymes de restriction.
o Les fragments sont ensuite séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel.
o Après séparation, les fragments d'ADN sont dénaturés en simple brin pour
permettre l'hybridation avec la sonde.
o Les fragments sont ensuite transférés sur une membrane.
o Une sonde marquée (radioactive ou non) est utilisée pour hybrider la séquence
cible.
o La détection se fait par autoradiographie ou par un signal chimique ou
fluorescent.
2. Applications : Le Southern blot est principalement utilisé pour :
o La détection de mutations génétiques spécifiques.
o L'analyse des fragments d'ADN pour vérifier la présence ou l'absence de certaines
séquences.
o L'étude des réarrangements d'ADN, comme les délétions ou les insertions.
 B. Dot Blot
La méthode Dot Blot est une technique d'analyse d'acides nucléiques similaire au Southern
blot, mais plus simple.
1. Principe :
o L'ADN ou l'ARN à analyser est déposé en petits points sur une membrane de
nylon ou de nitrocellulose.
o Les sondes spécifiques sont utilisées pour détecter une séquence cible. La sonde
est marquée (radioactive ou non) et hybridée aux points d'acides nucléiques.
o Après hybridation, la détection se fait par autoradiographie ou par signal
fluorescent.
2. Application combinée avec la PCR :
o Après l'amplification PCR, les produits sont dénaturés en simple brin, puis
déposés sur une membrane pour être hybridés avec deux sondes, l'une normale
et l'autre mutée.
o Cette méthode permet de différencier entre les allèles mutés et normaux en
utilisant des conditions de température, salinité et pH appropriées pour
l'hybridation.
C. Puce à ADN (ADN microarray)
La puce à ADN est une technologie permettant l'analyse simultanée de milliers de gènes ou
séquences d'ADN.
1. Principe de la puce à ADN :
o La puce à ADN repose sur l'hybridation de séquences d'ADN ou d'ARN sur une
surface solide. Chaque puce contient des sondes spécifiques déposées à des
positions distinctes sur la surface.
o Lorsque des séquences cibles marquées provenant d'un échantillon biologique
sont introduites sur la puce, elles s'hybrident aux sondes correspondantes.
o Les résultats sont visualisés par fluorescence ou autres techniques de détection.
2. Applications :
o Utilisée pour l'analyse de l'expression des gènes, la détection de mutations, ou
encore la comparaison de profils d'expression génétique dans différents types
cellulaires ou conditions.
o Une application fréquente est l'étude des profils génétiques dans les cancers.
IX/- Séquençage
Le séquençage est une méthode clé pour analyser l'ADN et identifier l'ordre des nucléotides
au sein d'une séquence.
Principes du Séquençage :
Le séquençage de Sanger : Le séquençage de Sanger est une méthode utilisée pour lire
la séquence d'ADN en déterminant l'ordre des bases (A, T, C, G). Son principe repose sur
l’utilisation de molécules spécifiques (ddNTPs) qui, lorsqu’elles sont incorporées dans la
chaîne d’ADN en cours de synthèse, provoquent son arrêt. Cela génère des fragments de
différentes longueurs, chacun se terminant par une base marquée.
Ces fragments sont ensuite séparés par taille via électrophorèse. Un capteur détecte la
dernière base de chaque fragment, permettant de reconstruire la séquence complète de
l’ADN.
Points clés :
 Précis et fiable, surtout pour des séquences courtes (500 à 1000 bases).
 Applications : utilisé pour confirmer des mutations et analyser de petits fragments
d’ADN.
 Moins adapté aux grands projets de séquençage, comme le séquençage complet du
génome, en raison de son coût et de son temps de traitement plus élevés.

Séquençage haut débit : Utilisé pour analyser simultanément plusieurs fragments

d'ADN. Les plateformes comme Illumina, Ion Torrent, 454 GS FLX, et SOLID permettent
l'analyse rapide de larges quantités d'ADN. Ces technologies utilisent souvent la PCR en phase
solide ou en émulsion pour amplifier l'ADN avant le séquençage .
Types de PCR utilisés pour le séquençage :
 LATE-PCR : Cette méthode produit une grande quantité d'un brin d'ADN, facilitant ainsi
le séquençage en permettant une lecture plus précise .Contrairement à la PCR classique,
la LATE-PCR produit une quantité beaucoup plus importante d’un seul brin d’ADN par
rapport au second.
 TAIL-PCR : Utilisée pour amplifier des séquences inconnues adjacentes à des séquences
connues, ce qui est essentiel pour découvrir de nouvelles mutations ou segments .
Applications du Séquençage :
Le séquençage permet d'analyser :
 Les mutations génétiques : Identifier des variations dans des gènes spécifiques, souvent
crucial pour diagnostiquer des maladies génétiques.
 Les réarrangements génomiques : Étudier des modifications comme des délétions ou
des insertions, souvent observées dans les cancers .
Ces techniques de séquençage sont essentielles pour la recherche clinique, notamment pour
le diagnostic des maladies génétiques et l'analyse des mutations somatiques dans le cancer.

X/- Stratégie d’étude des mutations

1. Pourquoi détecter les mutations ?
 Fins diagnostiques : valider un diagnostic pour des individus symptomatiques,
notamment en cas de maladies génétiques ou de cancers.
 Étudier la relation structure/fonction d'un gène pour déterminer s'il est responsable
d'une pathologie.
2. Méthodes de détection des macromutations
 Cytogénétique classique et moléculaire : pour détecter des délétions, insertions,
duplications, inversions et translocations, souvent de grande taille (centaines à milliers
de pb).
 Techniques comme le Southern blot, la PCR fluorescente, la RT-PCR et le MLPA
(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification).
3. Détection des mutations ponctuelles
 Méthodes telles que :
o PCR directe ou PCR-restriction : efficace pour détecter une seule mutation.
o OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) et ASO (Allele Specific Oligonucleotide
Hybridization) : pour détecter un groupe de mutations.
o Séquençage et techniques comme DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis) et SSCA (Single Strand Conformation Analysis) pour une
détection plus large.
4. Techniques de criblage des mutations (screening)
 SSCP, DGGE, DHPLC, HRM (High Resolution Melting), Puces (Micro-array) : ces
méthodes permettent de détecter des mutations ou polymorphismes sans les
caractériser précisément. Elles sont utiles pour des analyses à grande échelle, mais
peuvent manquer de précision sur des fragments d’ADN plus grands.
5. Diagnostic indirect
 Utilisé lorsque les autres méthodes échouent. Il repose sur l’utilisation de marqueurs
génétiques voisins du gène étudié (extragénique ou intragénique).
6. Cas particulier : Les amplifications de triplets
 Certaines maladies, comme la maladie de Huntington ou le syndrome de l'X fragile,
sont dues à des amplifications répétées de triplets (ex. CAG, CTG, CGG). Le diagnostic
repose sur des techniques comme le Southern blot et l’analyse génotypique par PCR.
Conclusion
Les méthodes modernes d’étude des mutations, en particulier les techniques de PCR,
d’hybridation et de séquençage, ont révolutionné la biologie moléculaire. Elles permettent
d’analyser rapidement et précisément des altérations génétiques, ouvrant ainsi des possibilités
importantes pour le diagnostic des maladies, la thérapie ciblée, et la recherche en génétique.