Pré-industrialisation d’un procédé de consolidation de

sol par bio-calcification in situ.

Olivier Girinsky

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Olivier Girinsky. Pré-industrialisation d’un procédé de consolidation de sol par bio-calcification in
situ.. Sciences du Vivant [q-bio]. Université d’Angers, 2009. Français. �NNT : �. �tel-00557098�

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 UNIVERSITE D’ANGERS
UFR SCIENCES

« PRE-INDUSTRIALISATION D’UN PROCEDE DE

CONSOLIDATION
DE SOL PAR BIO-CALCIFICATION in situ.»

THESE DE DOCTORAT
Discipline : Science
Spécialité : Microbiologie

Présentée et soutenue publiquement par :

Olivier GIRINSKY

Le 27 mai 2009 devant le jury ci-dessous :

[Link] F., Professeur à l’Université d’Angers,

[Link] D., Professeur à l’Université de Caen,
[Link] G., Professeur à l’Université d’Angers,
Mme CASTANIER-PERTHUISOT S., Maître de Conférences à l’Université d’Angers,

M. BRUNET R., IANESCO-CHIMIE,

Mme DARSON-BALLEUR S., SOLETANCHE-BACHY,

Mme COLLINET-LATIL M.-N., DELTARES,

Directeur de thèse : Mme CASTANIER-PERTHUISOT S.

Equipe BIAF
Laboratoire de Microbiologie

1
2
 SOMMAIRE
REMERCIEMENTS 001

INTRODUCTION 003

CHAPITRE I 005
DESCRIPTION DU CONTENU DU BREVET A L’ORIGINE DE CE
TRAVAIL DE RECHERCHE.

CHAPITRE II 013
LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES.

CHAPITRE III
MATERIELS ET METHODES. 057

CHAPITRE IV
AMELIORATION DE LAPRODUCTION DE BIOMASSE. 091

CHAPITRE V
LES PREMIERS ESSAIS DE BIOCALCIFICATION EN COLONNES. 156

CHAPITRES VI
ETUDE DE LA BIOCALCIFICATION. 197

CHAPITRE VII
INFLUENCE DELA QUANTITE DE BIOMASSE SUR LE
PROFIL DE CALCIFICATION EN COLONNE. 259

CHAPITRE VIII
SUIVI CHIMIQUE DES EFFLUENTS EN SORTIE DE PROCEDE. 307

CONCLUSION GENERALE 329

LISTE BIBLIOGRAPHIE 334

LISTE DES ABREVIATIONS 350

LISTE DES FIGUERES 351

LISTE DES TABLEAUX 359

RESUME FRANÇAIS 365

RESUME ANGLAIS 366

En début de chaque chapitre, un sommaire détaillé présente son contenu.

3
Remerciements

REMERCIEMENTS
En premier lieu, j’aimerais exprimer toute ma gratitude à mon directeur de thèse, Madame S.
Castanier-Perthuisot de l’Université d’Angers, qui a su me soutenir par ses conseils, ses
encouragements, sa disponibilité et bien plus encore.

J’adresse mes sincères remerciements à Madame S. Darson Balleur, mon tuteur industriel et
Directrice du Laboratoire des Matériaux de SOLETANCHE-BACHY.
J’adresse ma reconnaissance à M S. Borel directeur du service R&D, M G. Evers et Mme A.
Esnault Fillet, qui ont successivement suivi le projet.

Je souhaite également remercier les partenaires industriels associés à cette étude, INERIS
avec M P. Pandart, HYTEC avec Mmes P. Daguet et M S. Pellet et, particulièrement, M. R.
Brunet d’IANESCO CHIMIE et Mme M.N Collinet Latil de DELTARES, qui m’a fait
l’honneur de participer au jury de soutenance.

Je remercie également très respectueusement, Monsieur les Professeurs :

F. Jorissen, Directeur de l’équipe de recherche intitulée « Etude des Bio indicateurs
Actuels et Fossiles » de l’université d’Angers,
[Link], de l’université de Caen,
G. Moguedelet, Vice-président de l’université d’Angers,
Pour leur participation au jury et leurs jugements éclairés.

Gaële Levrel dont les mains expertes au MEB ont su dénicher les plus petites signatures
bactériennes de ce monde cristallin,
Mirjam Englemeir, pour sa remarquable capacité de travail et son soutien sans faille dans les
moments difficiles,
Virginie Le Her, pour sa joie de vivre et l’optimisme qu’elle a su communiquer à toute
l’équipe,
Pascal Maïsen, pour son initiation à la construction de colonnes de sable et ses centaines de
coup de main dont il a seul le secret,
Mathieu Richard, pour ses nombreuses assistances techniques providentielles et notamment
auprès du bio réacteur,
Laurent Pivert, pour sa très grande technicité,
Aux nombreux stagiaires : Magalie Riglet, Paulo Ziolli, Ayan, Flavien Tholognat et
Guillaume Paradis,

Tous et individuellement, je les remercie sincèrement, sans eux cette recherche n’aurait pas
abouti.

Je tiens à témoigner toute mon amitié à Christophe Justino et Sven Morel pour leurs
nombreuses participations mais aussi pour les longues et passionnantes conversations qui ont
été de grands moments de soutien.

A toute l’équipe du déjeuner : Isabelle Vandehove, Martine et Philipe Vuillin, Pascal Boulade
et Aurore Crapet, dont j’ai eu le plus grand plaisir de côtoyer au long de ces dernières années,
j’adresse mes sincères salutations.

Je souhaite aussi mentionner le plaisir que j’ai eu de travailler avec Vicky Wiffing, Marien
Harkes et Léon Van-Passen de DELTARES notre partenaire des Pays-Bas.

1
Remerciements

Ma reconnaissance va également à Mme Caroline Michel et à l’équipe du service EPI du

BRGM pour m’avoir ouvert les portes de leur laboratoire.

Une très forte pensée à celui qui m’a fait entrer dans le monde de la microbiologie, Maurice
Claisse.

Enfin, sans mentionner tous ceux qui m’ont accompagné au siège, durant l’élaboration et la
rédaction de cette thèse, ces remerciements seraient incomplets, je pense à Catherine
Cividino, Marie Pierre Hochart et Emmanuel Leneuveu, Lionel Bonné, Fabrice Mathieu, Guy
Hass, Jean Pierre Hamelin, avec un grand merci, Arnaud Gossard, pour ton aide.

Pour son assistance morale et matérielle tout au long de cette thèse, je remercie de tout mon
cœur ma femme, Valérie et plus encore pour m’avoir donné le plus beau de tous les cadeaux,
notre fille Capucine.

Merci à ma mère qui m’a toujours soutenu en dépit des milliers de kilomètres qui nous
séparent.

2
Introduction

INTRODUCTION

La bio minéralisation est un processus par lequel les organismes vivants sont capables
de produire des dépôts de minéraux souvent associés à des constituants organiques. Il s’agit
d’un phénomène très ancien et très répandu auprès des organismes vivants puisque
l’ensemble des 5 phyla sont concernés. Dès l’apparition des bactéries sur la planète, certaines
d’entre elles se sont révélées capables de précipiter des dépôts minéraux tels que les silicates,
les phosphates de calcium et les carbonates de calcium. Ensuite, dans le domaine des êtres
vivants microscopiques, des algues et des champignons ont induit les mêmes productions. Le
terme de bio calcification est attribué à ces précipitations, notamment lorsqu’il s’agit de
carbonate de calcium, qui apparaissent dans le nano et le micro environnement extracellulaire
et peuvent atteindre des dimensions centimétriques.

La bio calcification survient lorsque les activités métaboliques effectuées par les
micro-organismes favorisent l’apparition de conditions propices à la synthèse, à la nucléation
et à la croissance cristalline du CaCO3. Lorsque la souche produit des ions carbonate, leur
précipitation sous forme de carbonates de calcium, peut se faire soit d’une manière active par
un efflux simultané de calcium via des pompes ATP/Ca2+, soit d’une manière passive par un
rejet conjoint dans un biotope riche en calcium de certains produits de réaction tels que le
NH4+ qui élève le pH. Les voies métaboliques mises en jeu sont nombreuses, la source de
carbone est soit minérale (autotrophie) ou organique (hétérotrophie). De plus, la
carbonatogenèse bactérienne est réalisée par une grande diversité de micro-organismes qui
colonisent eux-mêmes un grand nombre d’habitats différents.

Cette diversité a permis de choisir pour les besoins du procédé une carbonatogènese
réalisée par des bactéries hétérotrophes aérobies qui possèdent une activité uréase. Ces
bactéries ont un métabolisme très actif, ce qui favorise des taux de croissance, élevés.
Lorsqu’elles hydrolysent l’urée via l’uréase en produisant un ion carbonate et deux ions
(NH4+), alors, le processus de bio induction de la précipitation du carbonate de calcium
devient simple et rapide. C’est sur ce principe qu’est basé le développement d’un procédé de
pré industrialisation de la bio calcification.
L’obtention d’un procédé efficace, dépend du choix du micro organisme qui est
fonction essentiellement de sa capacité à produire cette enzyme en grande quantité. Or, S.
pasteurii, une bactérie mésophile, non pathogène et ubiquiste, est capable de synthétiser de
l’uréase en très grande quantité, sa concentration pouvant atteindre jusqu’à près de 1 % de
son poids sec. Ce même micro-organisme est également bien connu par sa capacité à bio
précipiter de la calcite. Ce dernier a été utilisé dans de nombreux travaux pour consolider des
systèmes poreux, par injection ou par immobilisation. Ce processus de bio précipitation
induite avec S. pasteurii a fait l’objet d’un brevet industriel destiné à la stabilisation de pente
et au renforcement du sol (WO2006/066326) Kucharski et al,.2006.

C’est dans ce dernier domaine, de consolidation de sols fins (sable – limons

sablonneux) ou liquéfiables ayant un coefficient de perméabilité faible (K = 10-5 m/s) que
réside le développement d’une application industrielle de la bio calcification, prévu dans le
programme BIOCALCIS. Cette voie industrielle innovante présente de nombreux avantages à
la fois techniques et environnementaux, par rapport aux méthodes de consolidation de sol
basées sur des techniques d’injection. En effet, pour ces types de sols (K = 10-4 à 10-5 m/s),

3
Introduction

sont utilisés des ciments ultrafins ou des résines de polymères. Dans ces deux cas de figure, la
pénétrabilité de ces sols reste réduite du fait du colmatage des pores durant l’injection et d’un
temps de prise qui modifie les propriétés de viscosité des liquides injectés. Ces inconvénients
techniques obligent à un maillage d’injection dense ce qui augmente considérablement le coût
du chantier. Par ailleurs, certaines de ces résines sont potentiellement néfastes pour
l’environnement.

Ainsi, l’utilisation de micro-organismes inducteurs du processus de biocalcification

tels que S. pasteurii en vue de consolider des sous-sols granulaires poreux et saturés
représente une avancée technologique. Les avantages d’une telle technique résident dans
l’injection sous une forme aqueuse d’une suspension bactérienne, de viscosité similaire à
celle de l’eau, sans effet de sédimentation et sans réel temps de prise. Par ailleurs, les
dimensions micrométriques favorisent la pénétration profonde de la suspension bactérienne
dans ces sols fins sans obstruer la porosité au cours de l’injection.

Il s’agit là d’un procédé industriel très novateur, basé sur l’emploi d’une
biotechnologie de pointe dans le domaine du génie civil, qui en incluant un traitement final
obligatoire des effluents, traduit les préoccupations écologiques de ce XXIième siècle.

L’objectif de la thèse, réalisée dans le cadre d’une convention CIFRE et financée par
l’ANRT dans le projet BIOCALCIS, est d’optimiser un procédé biologique de calcification
pour aboutir à un procédé industriel d’injection. Pour cela, il faut intégrer les aspects de génie
biologique et les critères d’injectabilité in situ de façon à garantir la qualité du traitement de
consolidation d’un point de vue mécanique et environnemental. Trois aspects sont étudiés
conjointement.

1. La formulation d’un milieu de culture spécifique à S. pasteurii permet de maîtriser et

d’améliorer la qualité de la biomasse. Elle concerne à la fois la production cellulaire
et la synthèse d’enzyme uréase en grande concentration, ce qui permet de garantir
l’efficacité de la bio consolidation in situ.

2. L’élaboration d’une solution calcifiante est nécessaire car deux types de sel de
calcium sont utilisables dans la bio précipitation : le chlorure de calcium et le nitrate
de calcium. Le choix entre ces deux sels est de première importance car leurs coûts en
tant que matières premières sont très différents et leurs natures influencent par
ailleurs considérablement le choix du mode et du coût de traitement des effluents. Il
est de plus nécessaire d’évaluer leurs impacts vis-à-vis de la bio calcification et de la
souche employée.

3. La mise en place d’un protocole d’injection consiste à élaborer une séquence

d’injections qui puisse prendre en compte l’ensemble des contraintes du procédé de
bio calcification in situ. Les contraintes biologiques regroupent les effets de la
température, de l’adhésion des bactéries sur les grains de sable, ou le maintien à un
niveau élevé des activités enzymatiques mais également l’impact de la nature du sel
de calcium et de sa concentration. A ces paramètres, sont associées les contraintes
technico économiques liées à l’industrialisation de ce procédé sur un chantier ; le
4. nombre de volumes de pore injectables, la durée des injections, la distance et la
vitesse d’injection.

4
Chapitre I. Le brevet

CHAPITRE I

DESCRIPTION DU CONTENU DU BREVET A L’ORIGINE DE CE

TRAVAIL DE RECHERCHE.

INTRODUCTION. 006

I. LES CONNAISSANCES AYANT PERMIS LE DEPÔT DU BREVET. 006

1. L’état des connaissances sur la bio cimentation effectuée
par S. pasteurii. 006
2. Le développement de l’activité enzymatique
chez S. pasteurii (ATCC11859). 006
3. La production d’enzyme sous contraintes industrielles. 007
4. L’influence des conditions de bio cimentation sur l’activité enzymatique. 008
5. Les premiers essais de bio cimentation. 009
6. Les premiers essais en grandes colonnes pour la validation du brevet. 009

II. L’APPORTS DU BREVET « MICROBIAL CIMENTATION » . 011

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES. 012

5
Chapitre I. Le brevet

INTRODUCTION.
Un brevet portant le N°AU(2004907195) intitulé « Microbial Biocementation » a été
déposé par l’université australienne de Murdoch avec comme auteurs Cord-Ruwisch, Al-
Thawadi, Kucharski et Whiffin, le 20-12-2004. Ses extensions internationales portent les
numéros PCT/AU2005/001927 et WO2006/066326 (Kruhaski et al., 2002). Il présente un
procédé industriel permettant l’utilisation de Sporosarcina pasteurii pour la consolidation de
substrats sableux. Le principe général est d’injecter dans le sous-sol une biomasse bactérienne
présentant une activité uréasique importante, de faciliter son adhésion sur les grains de sable,
puis de fournir l’urée et une source de calcium. La production bactérienne de calcite entre les
grains aboutit alors à un renforcement de la résistance mécanique du sol.

I. LES CONNAISSANCES AYANT PERMIS LE DEPÔT DU BREVET.

Elles sont issues de la bibliographie et des travaux de recherche effectués au cours de
la thèse de .Whiffin (2004). Celle-ci a été soutenue en 2005 et, est à la base même du brevet.

1. L’état des connaissances sur la bio cimentation effectuée par Sporosarcina

pasteurii.

S. pasteurii est une bactérie gram +, alcalinophile et uréolytique. Cette bactérie

synthétise l’uréase de manière constitutive, avec une production pouvant atteindre 1 % de son
poids sec. La présence d’ions ammonium est nécessaire pour la production d’ATP car elle
possède une ATPase/NH4+ de type membranaire. S. pasteurii fait partie des micro-organismes
capables de précipiter le carbonate de calcium sous la forme de cristaux de calcite. Cette
précipitation se réalise grâce à l’hydrolyse de l’urée, ce qui lui a valu d’être impliqué dans de
nombreuses applications telles que la bio séquestration avec une coprécipitation du strontium
ou la bio cimentation. De plus, l’uréase produite par S. pasteurii sert également sous sa forme
purifiée au renforcement d’un sol poreux (CIPS).

2. Le développement de l’activité enzymatique chez S. pasteurii (ATCC11859).

Pour la souche ATCC11859, la synthèse de l’uréase est non constitutive, cela a été
montré par la réalisation d’un grand nombre de cultures en batch. Cependant, l’activité
enzymatique (A.E.) varie entre 5 à 55 mM d’urée hydrolysée/min (300 à 3300 mg/L/min) . Le
maximum d’activité enzymatique est obtenu lorsque la culture présente une concentration
cellulaire caractérisée par une D.O. Cellulaire à une longueur d’onde de 600 nm entre 1 et 2.5
unités. De plus, les valeurs les plus faibles d’activité enzymatique obtenues sont associées à
des biomasses élevées.

L’activité enzymatique spécifique (A.E.S.) est maximale en phase pré exponentielle

c'est-à-dire autour de 8 heures de culture effectuée à pH 9 et à une température de 30° C.
L’A.E.S. peut atteindre jusqu’à 7.1 mM d’urée hydrolysée/min/D.O. Par contre l’activité
enzymatique continue à augmenter au cours de la culture pour atteindre 121 mM d’urée
hydrolysée/min. La production d’enzyme peut doubler en trois heures puis décroître assez
rapidement. Cette diminution de l’A.E.S. est attribuée à la présence d’ions NH4+, CO3 2- ou
OH-. Mais une première série d’expériences complémentaires a montré que ni les carbonates
ni l’urée ne semblent en être responsables. Une seconde approche a tenté de déterminer le
rôle du pH et des ions ammonium. Cette approche a pu montrer qu’une diminution du pH, de
9 à 7, c’est-à-dire en dessous des conditions optima ne provoquait pas de stimulation de

6
Chapitre I. Le brevet

l’activité enzymatique spécifique. De la même manière une élévation du pH de 8 à 9.25, a

conduit à une augmentation de la biomasse mais pas à un accroissement de l’A.E.S.

L’effet de l’ammonium sur les A.E.S. a également été recherché dans des productions
âgées de 24 heures. La source d’ammonium sous la forme de (NH4)2SO4 a été ajoutée à des
concentrations variant de 0 à 300 mM, en maintenant le pH constant à 9.2. Pour une
concentration en (NH4)2 SO4 entre 200 et 300 mM, les A.E.S. ont très faiblement augmenté
passant ainsi de 2 à 3.5 mM d’urée hydrolysée/min/D.O. Les essais de cultures en continu
n’ont pas donné de résultats concluants. Ceci signifie que cette technique peut être exclue du
processus de production d’enzyme.

S. pasteurii est caractérisée par une très forte variabilité des rendements de la synthèse
de l’uréase. Ces variations peuvent atteindre un facteur dix entre chaque culture. Des
tentatives de restauration de l’AES ont été réalisées à partir de 3 inocula présentant des
niveaux d’A.E.S différents (faible, élevée, banque souche). Ces inocula ont été placés dans
les mêmes conditions de culture. Seuls les inocula de fortes activités enzymatiques ont pû
donner des milieux ayant des activités moyennes. Ceci montre que l’historique des cellules a
un effet majeur sur le devenir de l’activité enzymatique lorsqu’elles sont transférées dans un
milieu neuf. De manière similaire, les repiquages successifs dans différents milieux de culture
de bactéries possédant peu ou pas d’A.E.S n’ont pas permis non plus la restauration des
activités enzymatiques spécifiques, conduisant même à une aggravation de la situation.
D’autres combinaisons telles qu’une diminution du pH (7.5) avec ajout de nutriment n’ont
pas non plus, donné satisfaction. Ainsi, une fois la diminution ou la perte de l’activité
enzymatique enclenchée, sa restauration ne semble plus possible. Seul un maintien de
l’activité enzymatique a été possible par un seul repiquage dans une solution neuve. L’auteur
suggère la présence d’éléments perturbateurs issus du métabolisme tel que l’ammonium. Mais
cela n’explique pas tout, notamment que des cultures présentant de fortes activités aient après
repiquage de si fortes diminutions de production. Cette observation est confirmée lorsque les
cultures se font en continu. Dans ce cas, les activités enzymatiques ne se sont pas maintenues,
non plus, ce qui selon l’auteur serait dû à la fois à des facteurs environnementaux, et
physiologiques.

3. La production d’enzyme sous contraintes industrielles.

L’industrialisation d’un procédé implique une augmentation des volumes de biomasse

produits. Trois paramètres sont alors déterminants pour sa réussite : le coût de la main
d’œuvre, le coût du milieu de culture et le coût du produit fini. Au fur et à mesure de
l’augmentation des volumes, les coûts du produit fini et de la main d’œuvre diminuent. Par
contre, celui du milieu de culture augmente. Ainsi, il est possible d’obtenir des A.E. (activité
enzymatique) de plus de 100 mM d’urée hydrolysée/min au bout de 96 heures mais en
fournissant dans le milieu producteur de biomasse une concentration de 100g/l d’extrait de
levure. Il est donc nécessaire d’utiliser un milieu alternatif contenant une autre source de
carbone. Pour cela, différentes sources de protéines ont été testées, dont l’une a été retenue
pour son très faible coût et sa compétence pour la production d’enzyme. Ce produit appelé
Végémite est également à base d’extrait de levure. Pour avoir une quantité de protéines
équivalente à celle présente dans 1 g d’extrait de levure (Y.E.), il faut fournir 4.5 g de
Végémite.

7
Chapitre I. Le brevet

Une autre approche consiste à optimiser le milieu alternatif par l’ajout d’additifs tels
que l’éthanol, la tryptone, l’acétate, le glucose, le citrate, le fumarate, le succinate et le
fructose. Seul l’acétate a été retenu car il permet d’obtenir des A.E.S. et des A.E. plus élevées
que celles du témoin contenant seulement de l’Y.E. Au final, un milieu de culture qui est
composé de Végémite additionnée de 150 mM d’acétate permet de produire 44 % d’A.E. (soit
entre 21 et 34 mM d’urée hydrolysée/min) de plus par rapport à la Végémite seule pour un
coût de 0.2 $/l (1.14 euro/l ). L’auteur a montré également que lorsque la concentration en
Y.E. varie de 5 à 100 g/l, l’A.E.S. n’évolue que très peu, entre 6.5 - 15.5 mM d’urée
hydrolysée/min/D.O.

Le taux d’oxygénation de la culture lors de la production d’enzyme a été étudié. Ceci

a permis de mettre en évidence qu’une faible oxygénation était plus propice à la production
d’enzyme mais en contre partie ne favorisait pas l’obtention de fortes croissances
bactériennes. Pour compenser cet état de fait, l’auteur a essayé de maintenir une faible
oxygénation plus longtemps. Il s’en est suivi une diminution de l’A.E. de près de 25 %.

4. L’influence des conditions de bio cimentation sur les rendements de l’activité

enzymatique.

L’évaluation de la précipitation de carbonate de calcium par l’uréase dans différentes

conditions de bio cimentation a été réalisée.

Les variations de l’A.E. en fonction de la température permettent le tracé d’une courbe

en forme de cloche. Selon l’auteur, entre 15 et 25° C l’activité enzymatique n’est pas affectée.
Au delà, il y a un accroissement linéaire de l’activité enzymatique de 0.05 mM d’urée
hydrolysée/min/D.O./° C, jusqu’à 60° C. Le maximum d’A.E. est obtenu à 70° C.

Le comportement de l’uréase cellulaire en fonction de différentes concentrations en

urée /Ca(NO3)2 en proportion équimolaire et sous agitation a été étudié. Un effet inhibiteur
apparaît à partir de 1.5 M [Urée/Calcium]. Les effets de chacun des composants de la solution
calcifiante ont également été testés séparément. L’impact de la concentration en urée variant
de 0.01 à 3 M, sous agitation à 25° C, montre que l’activité est maximale entre 1 à 1.5 M soit
60 à 90 g/l. Une diminution de l’A.E. de 22 % apparaît lorsque la concentration double (3 M).
L’effet de la concentration du calcium fourni sous la forme liée au nitrate (Ca(NO3)2) variant
de 0 à 3 M a été expérimentée sur l’activité enzymatique en présence d’une concentration en
urée de 3 M. Les mesures d’activité sont réalisées en deux temps pour estimer une tendance
globale. La première série de mesures a été réalisée sur une période de 30 minutes et la
seconde entre 1 et 5 heures. Cette expérience montre qu’au bout de 30 minutes une
diminution de près de 50 % de l’activité initiale pour 1 M de calcium et de 100 % pour 2 M.
Pour des concentrations de 0.75 M et de 1.5 M, entre 1 et 5 heures les diminutions sont de 20
%et de 100 % . Selon l’auteur, l’inhibition proviendrait de la nature du sel de calcium
(Ca(NO3)2). Ainsi, si ce sel est remplacé pour moitié par du chlorure de calcium (0.75 M)
alors l’inhibition semble être partiellement levée au temps T = 5 heures en condition
d’équimolarité.

L’effet des fortes concentrations en ions ammonium sur l’activité enzymatique a été
étudié. Pour cela S. pasteurii a été incubé en présence d’ammonium, avec 1.5 M d’urée, à un
pH initial de 6.6 pour atteindre 9.25 au bout d’une heure. L’inhibition constatée a été
attribuée plus à l’effet du pH qu’à l’effet de la concentration en ammonium. L’ensemble de

8
Chapitre I. Le brevet

ces données a été regroupé pour être testé dans un modèle mathématique, mais d’après
l’auteur, de nombreux éléments manquent pour que celui-ci gagne en pertinence.

5. Les premiers essais de bio cimentation.

Les premiers essais d’injection ont concerné des colonnes de 50 cm3 de sable de
granulométrie < 300 µm. Les volumes de porosité (V.P.) c'est-à-dire le volume de liquide
contenu dans l’espace entre les grains peuvent être calculés pour chaque colonne. Un volume
correspondant à un 1.5 V.P. d’un mélange de bactéries et d’urée-calcium réalisé extra
temporairement a été injecté.
Les différents essais ont montré d’une part, que les résistances à la compression
uniaxiale simple (UCS) étaient plus élevées lorsque les A.E. sont faibles (4.4 mM d’urée
hydrolysée/min) et avec deux injections successives. D’autre part, avec des taux équivalents
d’hydrolyse, l’auteur n’obtenait pas des résistances identiques. De plus, le changement de la
solution calcifiante de 100 % de Ca(NO3)2 à un mélange de 50 % CaCl2 et 50 % Ca(NO3)2
n’avait pas d’impact.

La mauvaise bio cimentation serait due selon l’auteur à une mauvaise accessibilité du
substrat aux cellules ou une consommation excessive du substrat et à une diminution du
potentiel enzymatique dans la colonne. En effet, une chute de 30 % de l’activité enzymatique
cellulaire a été estimée in situ. Cette perte est 5 fois plus importante lors de l’utilisation
d’uréase libre et cela après 4 à 6 heures de contact. Or d’une manière plus surprenante, les
colonnes maintiennent une activité enzymatique résiduelle au-delà de 24 heures. Cette
activité résiduelle peut être réactivée si une injection d’une solution nutritive est effectuée.
Selon l’auteur, la chute de l’activité ne peut être attribuée à l’utilisation d’ammonium car il
devient inhibiteur qu’à partir d’une concentration de 3 M. Elle serait plutôt due à la présence
des ions nitrates et chlorures résiduaires ou à une diminution de l’accessibilité du substrat aux
cellules qu’il attribue à une réduction de la diffusion consécutive à la formation de cristaux de
carbonate de calcium à la surface des bactéries. Ceci semble être confirmé à l’aide de
technique de coloration spécifique au microscope qui montre que les cellules englobées dans
une matrice calcaire sont non viables.

6. Les premiers essais en grandes colonnes réalisées pour la validation du brevet.

Les cultures en batch en grand volume 100 l confirment les résultats obtenus en petits
volumes. En effet, le bullage ou insufflation d’air est moins performant pour la production
d’enzyme que l’agitation. Le changement d’échelle favorise la production de biomasse, mais
la synthèse de l’enzyme est moins rapide. Ainsi, en grand volume, les valeurs d’activités
enzymatiques sont 4 fois plus faibles (6 mM d’urée hydrolysée/min) au lieu de 23 mM d’urée
hydrolysée/min.

Les premiers essais de bio cimentation ont été faits dans des tubes en PVC de 170 mm
de hauteur et de 38 mm de diamètre remplies avec un sable siliceux (Koolschijn) présentant
une granulométrie < 300 µm et une densité sèche de 1.75. Les colonnes ainsi obtenues étaient
d’abord nettoyées avec une injection d’eau correspondant à un volume et demi de porosité
dans le sens du haut vers le bas. Ces colonnes étaient ensuite injectées avec différentes
biomasses présentant des activités enzymatiques variant de 4.4 mM d’urée hydrolysée/min à
12.5 mM d’urée hydrolysée/min obtenues par culture sur un milieu Végémite - acétate. Entre

9
Chapitre I. Le brevet

les deux injections de la solution calcifiante composée de 0.75 M Ca(NO3)2 et de 0.75 M de

CaCl2, une injection d’eau d’un volume de porosité était réalisée pour chasser tous les
substrats résiduels dans les colonnes. Chaque colonne était ensuite lessivée avec une solution
d’eau de Javel (hypochlorite de sodium) puis placée au four à 60° C. Ces premières injections
ont montré une consolidation du sable pouvant s’étendre sur les 2/3 ou même les 3/4 de la
longueur des colonnes. La plus grande longueur de sable cimenté a été obtenue avec une
activité de 7.5 mM d’urée hydrolysée/min.

Cependant, toutes les colonnes présentaient une zone non consolidée au niveau du
point d’injection. Les premiers résultats semblaient indiquer que les cellules bactériennes
étaient lessivées hors de la colonne. Selon l’auteur, ce phénomène serait dû au temps de mise
en place des bactéries mais aussi à la formation d’un précipité ou floc qui engloberait les
bactéries. De plus, ces flocs produiraient également des cristaux qui colmateraient les pores.
Ces résultats permettaient à l’auteur de poser les hypothèses suivantes : soit la vitesse
d’injection était insuffisante soit les propriétés intrinsèques de ce sable étaient impliquées.

Une autre approche a été développée par l’auteur, qui a consisté à retirer l’urée de la
composition de la solution permettant la production de biomasse. Ainsi quatre colonnes ont
été injectées avec une biomasse présentant une activité enzymatique identique (8.75 mM
d’urée hydrolysée/min) mais en faisant également varier trois autres paramètres : la
composition du milieu de production de biomasse (10 g/l de Y.E. avec 100 mM d’acétate et
soit 10 g/l de NH4+, soit ajout d’enzyme purifiée issue de plante); la pression d’injection (10
Psi ou 15 Psi) et la nature du sable (Koolschijn ou un sable 100 % siliceux). Trois colonnes
sur quatre ont montré une consolidation du sable sur la totalité de la longueur. Selon l’auteur,
la distance de pénétration a été augmentée de 6 % en moyenne. La cimentation sur la totalité
de la longueur de la colonne était également due à l’augmentation de la pression d’injection.
Il semble d’après l’auteur que les principales raisons de la moins bonne cimentation obtenue
dans une colonne sur quatre serait due à un effet « matrice » et donc à la nature du sable, mais
aussi à sa capacité de fixation des bactéries. En effet, lors d’un suivi de l’adhésion des
bactéries sur différents types de sables, des comportements très différents avaient été
constatés. L’effet matrice est un phénomène non négligeable puisque près de 50 % des
bactéries s’étaient fixées sur du sable filtrant de piscine mis en colonne.

L’effet de la formation d’un floc a également été étudié sur le sable Koolschijn. Dans
ces conditions, un fort pouvoir d’ancrage de bactéries était apparu puisque 100 % n’en
ressortent pas. Ces résultats avaient été complétés par une expérience pour déterminer s’il
était possible de distribuer des bactéries en colonne de sable siliceux sur une plus grande
distance. L’auteur avait donc effectué une injection d’1.2 volume de porosité (V.p.) de
biomasse à une vitesse réelle de 2 m/H dans une colonne de 1.6 m de longueur. La
distribution de l’activité enzymatique le long de la colonne semblait homogène. L’étude de
l’influence de la nature du sable avait alors été poursuivie en utilisant des mélanges de sables
(sable Koolschijn (K) et sable Peat (tourbeux) (P)). Entre une colonne KP (90 % de K et 10 %
P) et une colonne K (K 100 %) ayant subi plusieurs injections (2 à 4), le volume des pores
avait diminué de 2 jusqu'à 14 % sans changer la perméabilité. Cependant, il avait été
également observé des réductions de près de 12 % en une seule injection lorsqu’il y a eu un
phénomène de bouchon. Les meilleures résistances à la compression simple (Rc 1.8 MPa)
avaient été obtenues avec 3 injections de solution calcifiante sur du sable non mélangé ; ceci
correspondait à une augmentation du Rc à la compression d’un facteur 8 à 9.

10
Chapitre I. Le brevet

II. L’APPORT DU BREVET « MICROBIAL CIMENTATION ».

Le brevet s’inscrit dans le domaine des techniques d’amélioration du sol. La méthode

employée tend à acquérir de fortes résistances à la compression simple (UCS) en utilisant une
bactérie capable de produire du carbonate de calcium et donc de cimenter les grains de sable
entre eux, en utilisant la capacité d’alcalinisation de l’uréase qu’elle possède. Le procédé de
ce brevet se distingue des autres applications car il ne cherche pas à réduire ni la porosité ni la
perméabilité du sol. En effet, les techniques classiques de renforcement de sol utilisent des
coulis visqueux dont l’efficacité est limitée à un faible rayon d’action autour du point
d’injection.

Cette invention doit permettre d’accéder à de fortes résistances (2-5Mpa) dans un

matériau perméable en couplant les bonnes proportions d’uréase bactérienne, d’urée et d’ion
calcium dans une gamme standard d’activité enzymatique entre 0.5 et 50 mM d’urée
hydrolysée par minute. Les résistances élevées sont obtenues dans un matériel perméable
avec la formation d’au moins 33 g de calcite par litre de matériau, ceci sans provoquer
nécessairement une perturbation dans celui-ci. Les résistances recherchées sont comprises
entre 0.05 et 5 MPa. Les résistances à la compression simple augmentent rapidement pour
atteindre 60 et 90 % de la résistance finale entre 1 et 6 heures après la fin de l’application. Les
conditions standard d’application préconisées sont l’utilisation de 1.5 M d’urée à 25° C mais
pouvant monter jusqu'à 2 M, avec des concentrations en calcium équimolaires. Si l’objectif
est de produire lentement des formations bio cimentées ; alors, il est possible d’additionner
les réactifs (uréase, urée, ion calcium) un par un ou en même temps mais toujours de manière
à ce qu’elles soient en concentrations inférieures à celles permettant d’obtenir rapidement des
précipitations. Cependant, la diminution de concentrations ne correspond pas à une
diminution linéaire de la réaction, car les ions calcium ont un rôle inhibiteur sur l’activité
enzymatique d’hydrolyse de l’uréase. Leur monopolisation sous forme de carbonate de
calcium, induit une diminution de la concentration en calcium disponible ce qui accélère alors
la vitesse de la réaction enzymatique.

Le brevet précise aussi qu’il est souhaitable que le micro-organisme soit cultivable
dans des conditions non stériles et qu’il puisse supporter de très fortes concentrations de
calcium et des pH alcalins de 7.5 à 10, à 30° C. Les bactéries sont cultivées dans un milieu
contenant 0.3 M d’urée et 6 mM de chlorure de calcium pendant 24 heures à 28° C. Il permet
d’obtenir une activité enzymatique de 5.6 mM d’urée hydrolysée/min ce qui correspond à
environ 0.5 mS/min. Les bactéries sont alors injectées avec un débit variant de 15 ml/min à
1.4 l/h, puis elles sont maintenues immobilisées pendant près de 48 heures pour favoriser leur
accroche. Ensuite, suivent l’injection d’une solution calcifiante de 1.25 M de calcium et 1.7
M d’urée, et un batch de 24 heures. Ce protocole d’injection doit permettre d’accéder à des
résistances à la compression simple de 1.7 MPa.

11
Chapitre I. Le brevet

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.

L’efficacité de la bio cimentation semble étroitement dépendante de la composition du

milieu de culture, du niveau d’activité enzymatique injecté, de la nature du sable, du sel de
calcium et des mélanges, des concentrations appliquées, de la température, du temps et des
paramètres d’injection (vitesse, pression, séquence d’injection, durée de batch) (Figure n°1).

Figure n°1 : Ensemble des paramètres identifiés influençant la bio cimentation en milieux
poreux dans les conditions d’injection en colonne.

Des recherches supplémentaires sont donc nécessaires avant d’envisager une réelle
utilisation industrielle. En premier lieu, elles doivent concerner la synthèse de l’uréase chez S.
pasteurii et son optimisation. En effet, une régulation enzymatique certainement très
complexe et encore partiellement inconnue, pourrait expliquer la très grande variabilité des
résultats. Malgré cela, ce micro organisme en lui-même, a montré une forte tolérance quant
aux variations des conditions environnementales de la bio cimentation.

Des recherches d’optimisation doivent donc être menées pour l’ensemble des
paramètres d’influence pris séparément, puis simultanément afin d’obtenir des résistances à la
compression verticale suffisantes sur des sols meubles.

12
Chapitre I. Le brevet

CHAPITRE II

LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES.

I. LES CARBONATES ET LA CARBONATOGENESE BACTERIENNE. 015

1. Origines des carbonates. 016
2. La production abiotique. 017
3. Les modalités de la carbonatogenèse bactérienne. 018
3.1. La carbonatogenèse bactérienne autotrophe. 019
3.2. La carbonatogenèse bactérienne hétérotrophe. 021
3.2.1. La carbonatogenèse bactérienne hétérotrophe
dans le cycle de l’azote. 022
3.2.2. La carbonatogenèse bactérienne hétérotrophe
dans le cycle du soufre. 023
4. Les impacts de la carbonatogenèse bactérienne. 025

II. LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR S. pasteurii. 026

1. Description générale de S. pasteurii. 026
2. Physiologie et écologie de S. pasteurii. 027
2.1. L’adaptation aux conditions alcalines. 027
2.2. L’adaptation aux conditions osmotiques. 028
2.3. La tolérance aux ions sodium et ammonium. 029
2.4. L’ammonium utilisé comme une source d’énergie. 030
2.5. L’importance de l’urée chez S. pasteurii. 030

III. LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR L’UREASE

DE S. pasteurii. 031

1. Les caractéristiques générales de l’uréase chez S. pasteurii. 031

2. La structure de l’uréase chez S. pasteurii. 033
2.1. L’assemblage et l’activation de l’uréase chez S. pasteurii. 033
2.1.1. Le rôle des protéines auxiliaires. 035
2.1.2. Le rôle clé de la protéine auxiliaire UreE. 035
2.2. Le mécanisme de l’hydrolyse de l’urée au niveau du site catalytique. 035
3. L’organisation des gènes codant pour la synthèse de l’uréase chez [Link]. 035
4. La régulation de l’opéron uréase chez S. pasteurii. 036
5. L’inter régulation entre l’opéron nik et l’opéron uréase. 036
5.1. Structure de la protéine chaperonne UreE. 036
5.2. Structure et régulation des gènes Ni. 036

13
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

IV. LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR LA REGULATION

DE LA SYNTHESE DE L’UREASE. 038

1. La régulation par le pH. 039

2. La régulation par l’urée. 039
3. La régulation par le pool azoté chez les Entérobactéries. 040
4. La régulation de l’uréase chez les bactéries Gram +, le modèle de B. subtilis. 041
4.1. L’implication du pool de carbone cellulaire. 041
4.2. L’implication du cycle de la glycolyse. 042
4.3. L’implication du cycle de Krebs. 042
4.4. La régulation à l’intersection des métabolismes carbone et azote. 042
4.5. La carence azotée et la régulation de l’uréase. 043

V. LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR LA CRISTALLOGRAPHIE

DU CARBONATE DE CALCIUM. 046

1. Nucléation et croissance cristalline du carbonate de calcium

en condition abiotique. 046
1.1. Considérations générales. 046
1.2. La nucléation du carbonate de calcium. 047
1.3. La cinétique de la croissance du carbonate de calcium. 048
1.4. La formation du carbonate de calcium. 049
1.5. Les facteurs influant sur le couple nucléation cinétique
dans la formation des cristaux de carbonate de calcium. 049
2. L’influence de la matière organique sur la morphologie du
carbonate de calcium. 051
3. La capacité à précipiter le carbonate de calcium chez S. pasteurii. 053
3.1. De l’hydrolyse de l’urée à la précipitation du
carbonate de calcium. 053
3.2. L’influence de la concentration en calcium et en urée
sur la bio précipitation. 054
3.3. L’effet de la température sur la bio précipitation avec [Link]. 054
3.4. La bio précipitation avec S. pasteurii en milieu poreux. 055

14
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

I. LES CARBONATES ET LA CARBONATOGENESE BACTERIENNE.

La teneur en calcaire de l’écorce terrestre représente près de 3.63 % (Geyssant, 2001).

Dans l’environnement actuel, les roches carbonatées, qui sont formées au moins à 50 % de
carbonates, correspond à environ 20 % des roches sédimentaires. On y distingue deux
groupes, présentant des intermédiaires :
- les calcaires,
- les dolomies.

Les carbonates sont des minéraux dans lesquels l’ion CO32- est présent. Les ions
associés vont déterminer le type de carbonate. Ainsi les trois carbonates les plus représentés
sont :
- la calcite (CaCO3),
- l’aragonite (CaCO3),
- la dolomite Ca, Mg(CO3)2.
A côté de ceux-ci, d’autres carbonates existent, (Tableau n°1).

Tableau n°1 : Les différents types de carbonates.

SYSTEME CRISTALLIN NOM FORMULE

Vatérite CaCO3
Magnésite MgCO3
Giobertite
Rhomboédrique Sidérite FeCO3
Sidérose
Smithsonite ZnCO3
Rhodocrosite MnCO3
Diallogite
Strontianite SrCO3
Orthorhombique Cérusite PbCO3
Whitérite BaCO3
Monocline et hydroxylés Malachite verte Cu2(OH)3CO3
Azurite bleue Cu3(OH)2(CO3)2

Les calcaires contiennent au moins 50 % de calcite. La classification des calcaires est

très complexe, pouvant être basée sur leur composition, leur contenu ou sur leur lieu de
fabrication.
Ainsi, les proportions de calcite et de dolomite permettent de distinguer des calcaires
purs (de 100 à 95 % de calcite), des calcaires magnésiens s’ils renferment 5 et 15 % de
dolomite, des calcaires dolomitiques (entre 10 et 50 % de dolomite). Ils sont dits coquilliers,
lorsqu’ils renferment des coquilles dans un liant carbonaté micritique ou sparitique, et
récifaux quand ils sont constitués par les squelettes de coraux. Ils peuvent être dépourvus de
macro ou de micro fossiles (foraminifère, coccolithe…) et sont alors dits micritiques ou
lithographiques. D’autre part, ils peuvent être dits marins ou lacustres.

Les premiers carbonates sont apparus au Précambrien et il s’agissait de calcaires

stromatolithiques. Depuis cette époque, il y a environ 3,5 milliards d’années, la
sédimentation carbonatée n’a cessé de s’étendre à toute la planète sans restriction de biotope.

15
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

1. Origines des carbonates.

Au début du XXème siècle, l’origine des carbonates était l’objet d’une grande
controverse et beaucoup d’auteurs considéraient qu’ils résultaient d’une pure réaction
chimique basée sur une élévation de la température, sur la saturation du milieu sous l’effet de
l’évaporation, ou encore sur une baisse de la pression partielle du CO2. Ainsi dans les
calcaires coquilliers, le liant ne résultait que d’une réaction chimique, mais il piégeait des
éléments carbonatés dont l’origine était évidente. Cependant l’origine biologique des
calcaires dits improprement azoïques (ne contenant pas de fossiles) était soupçonnée (Drew,
1910 a et b, Kellerman et Smith, 1914). Le rôle de certaines bactéries telles que
Pseudomonas calcis ou Pseudomonas calci-precipitans avait même été cité (Mollish, 1924).
Nadson en 1928, soutenu ensuite par Zobell (1946) impliquait la sulfato-réduction
bactérienne dans un processus de précipitation de carbonate de calcium. Malgré cela, la
controverse va persister très longtemps.

La polémique se jouait alors entre des géologues peu familiarisés avec les concepts et
les techniques de la microbiologie et n’ayant comme principal outil que l’observation, et des
microbiologistes plus formés pour le domaine médical et surtout, insuffisamment
pluridisciplinaires pour s’entendre avec les premiers. Les travaux de chacun ont cependant
contribué à trouver l’origine des carbonates (Lalou, 1954, 1957, Trichet, 1967, Stolkowski,
1968, Adolphe et Billy, 1974). Plusieurs géologues commencèrent à chercher dans divers
environnements contemporains des bactéries carbonatogènes (Greenfield 1963, Oppenheimer
et Master, 1965, Berner, 1965, 1968, Krumbein, 1968), à les cultiver et à obtenir des
précipités de calcite (McCallum et Guhathakurta, 1970, Krumbein, 1972). Les travaux de
Krumbein (1974, 1978), de Maurin et Noel (1977), de Monty et Van Laer (1984) ont en
partie convaincu la communauté scientifique des géologues que les bactéries pouvaient
précipiter les carbonates.

Afin de prouver que des bactéries fabriquaient et précipitaient le carbonate sous

forme de carbonate de calcium et/ou de magnésium, il a fallu l’intervention de chercheurs
formés aux deux disciplines, les microbiogéologues. En laboratoire, en conditions strictes et
renouvelables, en présence et seulement en présence de bactéries, ils ont obtenu des
carbonates précipités (Krumbein, 1968, 1972, Morita, 1980, Novitsky, 1981, Castanier, 1984,
Castanier et al., 1984a et b, 1994, Castanier, 1997, Le Metayer-Levrel, 1993, 1996,
Pontoizeau et al., 1996, 1997, Castanier et al., 1999, Vali et al., 2001). Le rôle des
champignons microscopiques a aussi été établi (Verrechia et Loisy, 1997, Verrechia, 2000).
L’amélioration des microscopes électroniques à balayage a permis l’observation de
ces productions (Castanier, 1984, Castanier et al., 1984a et b, Castanier, 1997, Perthuisot et
al., 1990, Castanier et al., 1993, Le Metayer-Levrel, 1996, Knorre et Krumbein, 2000,
Castanier et al., 2000). A partir de là, la communauté scientifique dans son ensemble a admis
que les carbonates étaient produits et précipités sous l’effet des microorganismes. Les
productions bactériennes de carbonate sont répertoriées, micrite, ooïdes, stromatolithes ainsi
que les bactéries et les voies métaboliques mises en jeu.
A ce jour, non seulement les modalités de la carbonatogenèse bactérienne sont bien
connues (Castanier, 1987, Castanier et al., 1989, Le Metayer-Levrel, 1993, Le Metayer-
Levrel et al., 1997, Castanier et al., 1997, 1999), et leurs impacts quantifiés (Le Metayer-
Levrel, 1996, Castanier et al., 2000), mais des brevets d’utilisation des bactéries
carbonatogènes ont été déposés et sont en exploitation industrielle (Castanier et al., 1995,

16
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Orial et al., 1994, Le Metayer-Levrel et al., 1999). Des produits spécifiques ont été obtenus
en laboratoire tels que la magnésite (Pontoizeau et al., 1997).

Ainsi, la présence de carbonate de calcium dans l’environnement est donc issue de

deux processus, une production et une précipitation purement physico chimique dite
abiotique et une production et une précipitation biogénique. Leurs impacts respectifs sont
totalement différents et inégaux. En effet, la bio précipitation du carbonate de calcium est un
procédé ubiquiste et très ancien du monde vivant.

2. La production abiotique.

La précipitation abiotique du carbonate de calcium est sous le contrôle de quatre

paramètres : la concentration en calcium, la concentration en ions carbonates ou
hydrogénocarbonates, le pH et la disponibilité en sites de nucléations (Hammes et Verstraete,
2002). Elle se produit dans l’environnement lorsque les concentrations en ions (Ca 2+, CO3 2-
) augmentent soit par évaporation soit par abaissement de la pression partielle de CO2 et/ou
par l’élévation de la température. Le principal facteur limitant ces processus chimiques est la
disponibilité en ions carbonates et bicarbonates.

La précipitation abiotique de la calcite peut se réaliser dans les sources

hydrothermales où les eaux atteignent des températures comprises entre 140-180° C. Dans
ces écosystèmes qui n’abritent aucune bactérie même des bactéries hyperthermophiles,
lorsque la pression et les températures sont conjointement élevées, le carbonate de calcium
reste à l’état dissous (Geyssant, 2001). C’est en particulier le cas lorsque ces sources se
trouvent au fond des océans. Par contre lorsque les sources émergent en surface, la chute de
pression permet la libération du carbonate dissous sous forme gazeuse (Stumm and Morgan,
1995, Stocks-Fisher et al., 1999). La précipitation du carbonate de calcium survient alors,
selon les équations de précipitation-dissolution suivantes :
Ca 2+ + CO32- → CaCO3 Ksp = 3.35 . 10-9 (25° C) [n°1]
CaCO3 → Ca 2+ + CO32- logKs0 = - 8.48 (25° C, 104 Pa) [n°2]
La précipitation dépend de la température et du pH. Lorsque le système est clos, c’est à dire
que le système n’est pas au contact avec le CO2 atmosphérique, la teneur en carbone total
(Ct) est constante (Stumm et Morgan, 1995). La pression partielle en CO2 ne peut pas varier
et donc sa concentration est maintenue élevée. La saturation nécessaire à la production de la
calcite sera donc atteinte à une plus faible concentration d’ion calcium (White, 2003). Le
calcul de solubilité suit les équations suivantes:

CT = [CO2 (aq)] + [H2CO3] + [HCO3-] + [CO32-] [n°3]

[Ca 2+] = (Ks0/[CO32-]) = Ks0/CTα2 où α2 est une constante donnée pour un pH et un Ks0.
La précipitation de la calcite apparaît lorsque le système est sur saturé en ions calcium et
carbonate. L’indice de sursaturation (SI) est déterminé par le produit des activités de ces ions
(IAP) (Stumm et Morgan, 1995). Si IAP > Ks0 il y a sursaturation et si IAP < Ks0 il y a sous-
saturation. En condition de sous saturation la calcite ne précipite pas. La sursaturation
indiquée par SI > 0 montre une plus forte probabilité de précipitation. Cependant, la présence

17
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

de carbone organique dissous, de Mg ou de P peut limiter la précipitation du CaCO3 sous

forme de calcite car ces ions peuvent être absorbés à la surface des cristaux et en limiter la
croissance cristalline.

3. Les modalités de la carbonatogènese bactérienne.

La fabrication chimique de carbonate, en milieu stérile, c'est-à-dire dépourvu de
bactéries vivantes, existe en laboratoire, et aboutit à des carbonates amorphes, de calcium ou
d’autres ions. Elle résulte de l’alcalinisation par ajout d’une base (pH > 8.5), d’une solution
plus ou moins saturée en ions CO32- et HCO3- et renfermant des ions Ca++ par exemple. En
l’absence de bactéries, l’élévation de température et/ou l’évaporation induisent une
augmentation de la saturation jusqu’à la précipitation des ions carbonates avec des ions
calcium.
Dans le milieu naturel, il existe très peu d’environnements dépourvus de bactéries. Il
est connu depuis les années 1990 que même les milieux dits extrêmes accueillent des
bactéries que l’on appelle bactéries extrêmophiles. Ainsi, on trouve des bactéries
hyperthermophiles lorsque la température atteint 90° C, et c’est le cas dans certaines sources
hydrothermales sulfureuses (Godfroy et al., 1997). Des bactéries alcalinophiles se retrouvent
dans des biotopes dont le pH est supérieur à 9 et des bactéries xérophiles survivent lorsque la
teneur en eau se réduit. Ceci tend à dire que dans le milieu naturel, il est très rare que les
carbonates résultent de la seule activité chimique. Ainsi les carbonates « chimiques »
représentent-ils une fraction infime des carbonates recensés sur notre planète. Les autres
carbonates sont donc dits « biogéniques » (Figure n°2).

Processus chimiques
CARBONATES
rares et peu efficaces

CARBONATES ABIOTIQUES CARBONATES BIOGENIQUES

(« chimiques ») fabriqués
à partir de solutions saturées - Productions minérales des eucaryotes
sous l’effet de : animaux : coquilles, tests, squelette…

- l’évaporation, - Production sous l’effet de la photosynthèse

- la diminution de la pression en CO2 des eucaryotes végétaux
- l’augmentation de la température. (diminution de la pression en CO2)

Processus eucaryotiques sous - Productions fongiques

le contrôle des mitochondries et
des chloroplastes - Productions bactériennes
(origine bactérienne) - En autotrophie,
- En hétérotrophie,
- Précipitation active,
Processus bactériens - Précipitation passive
- Efficaces en autotrophie - dans le cycle de l’azote,
- Très efficaces en hétérotrophie - dans le cycle du soufre.

D’après CASTANIER et al., 1997

Figure n°2 : Les diverses origines des carbonates (d’après Castanier et al., 1997).

18
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Parmi les carbonates biogéniques, les productions dûes aux animaux eucaryotes sont
retrouvées sous forme de coquilles, tests, squelette … Par ailleurs la production réalisée par
les eucaryotes végétaux via la photosynthèse agit en diminuant la pression partielle en CO2 et
aboutit à l’apparition de tuf. La production fongique est incluse dans les carbonates
biogéniques. Enfin la production bactérienne est celle qui nous intéresse.
Il faut aussi remarquer que la production eucaryotique est sous le contrôle des
mitochondries et chez les végétaux des chloroplastes. Il est maintenant reconnu que ces deux
organites sont des bactéries devenues symbiotes obligatoires. Ainsi, cette production pourrait
être rapprochée de la production bactérienne et la quasi totalité des carbonates devraient alors
être considérés comme bactériens (Castanier et al., 1997, 2000).
Dans la carbonatogenèse bactérienne, on distingue :
- une production qui se fait en autotrophie,
- une production qui se fait en hétérotrophie,

o précipitation active,
o précipitation passive,

dans le cycle de l’azote,

dans le cycle du soufre.

3.1. La carbonatogènese bactérienne autotrophe.

Parmi les bactéries, la nature de la source de carbone (minérale ou organique) ainsi

que la source d’énergie définissent les types trophiques (autotrophe ou hétérotrophe,
phototrophe (énergie lumineuse) ou chimiotrophe (énergie issue de réactions d’oxydo-
réduction). Les bactéries autotrophes peuvent donc être photolithotrophes ou
chimiolithotrophes. En utilisant le CO2 comme source de carbone pour l’édification de leurs
composants organiques, elles en diminuent la pression partielle, et orientent l’équilibre des
hydrogénénocarbonates vers la précipitation, en présence d’ions calcium, de carbonate de
calcium (Figure n°3).

Le CO2 utilisé provient de l’atmosphère, et il est issu de la respiration (eucaryotique

ou procaryotique), de la fermentation réalisée par les bactéries en anaérobiose, ou de
processus chimiques divers tels que la combustion des énergies fossiles ou renouvelables.
Malgré cela on considère que l’atome de C piégé dans les carbonates d’autotrophie est
d’origine minérale (Castanier et al., 1997, 2000).

19
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

VOIES METABOLIQUES DE LA CARBONATOGENESE BACTERIENNE

EN AUTOTROPHIE.
(Prise de C à partir du CO2 dissous ou gazeux provenant
de l’atmosphère, de la respiration ou de la fermentation)

VOIES METABOLIQUES
Méthanogenèse Photosynthèse Photosynthèse
non méthylotrophe anoxygénogène oxygénogène

TYPES DE BACTERIES
Méthanogènes Bactéries
Photosynthétiques, Cyanobactéries
(Archéobactéries)
pourpres ou vertes,
sulfureuses ou non
CONDITIONS
ENVIRONNEMENTALES
Anaérobiose Anaérobiose
Lumière infra rouge Lumière visible

CO2 , H2 CO2 , H2S, S, H2 CO2

DISPARITION DU CO2
1
Ca++ + 2 HCO3- CaCO3 + CO2 + H2 0
2 PRECIPITATION
D’après CASTANIER et al., 1997

Figure n°3 : Les voies métaboliques bactériennes impliquées dans la

carbonatogenèse autotrophe (d’après Castanier et al., 1997).

Trois voies métaboliques mises en jeu par trois sortes de bactéries dans trois types
d’environnements différents aboutissent à la fabrication bactérienne autotrophe de carbonate
de calcium.

Les bactéries autotrophes ne sont pas systématiquement photosynthétiques. C’est le

cas des bactéries méthanogènes non méthylotrophes, autrement appelées bactéries
méthanogènes vraies, qui appartiennent au groupe des Archéobactéries. D’autres bactéries
sont dans la même situation et l’on peut citer les Ferrobactéries (autotrophes, non
photosynthétiques, aérobies strictes). Ces dernières ne sont pas dans le schéma de la figure
n°3 car leur activité principale est la production d’oxydes de fer en aérobiose. Elles sont
cependant très certainement impliquées dans la fabrication de la sidérite (Castanier,
communication personnelle). Les bactéries méthanogènes non méthylotrophes comme par
exemple Methanogenium thermoautotrophicum ou Methanobacterium Sp. prennent le CO2 et
le H2 présents dans leur environnement anaérobie pour fabriquer du CH4. Il peut résulter du
métabolisme d’autres bactéries anaérobies faisant des fermentations ou étant cellulolytiques
(genre Clostridium par exemple), (Fuchs et al., 1979 ; Marty, 1983 ; Belyaev et al., 1989 ;
Castanier et al., 1999).
Les bactéries photosynthétiques impliquées dans la production autotrophe de
carbonate diffèrent par leur mode de photosynthèse qui est soit oxygénogène soit
anoxygénogène. Dans le premier cas, la photosynthèse produit de l’oxygène, dans le second,
il s’agit d’une photosynthèse plus ancienne qui n’aboutit pas à l’apparition d’oxygène.
Les Cyanobactéries qui oxygènent les biotopes oligotrophes dans lesquels elles
vivent, précipitent le carbonate de calcium en prenant le CO2 dissous. Elles absorbent dans la
lumière visible, les longueurs d’onde comprises entre 680-685 nm. On les retrouve en
particulier dans la partie superficielle du stromatolithe où elles assurent sa croissance. Le
genre Synechococcus GL24 ou PCC7942 produit plus de calcite lorsqu’il se développe dans

20
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

un biotope riche en carbone inorganique dissous (DIC) et pauvre en calcium. Ceci semble
montrer le rôle direct des parois de ces micro-organismes en tant que site de nucléation
(Dittrich et al., 2004). Les cyanobactéries enrichissent les biotopes en carbone organique ce
qui permettra la carbonatogenèse bactérienne hétérotrophe.
Les bactéries photosynthétiques anoxygénogènes sont pourpres ou vertes, sulfureuses
ou non et très fréquentes dans les écosystèmes pauvres en matière organique.
D’après (Pentecost, 1996 ; Castanier et al., 1999 ; Hammes et Verstraete, 2002) la
formation de carbonate de calcium par le biais des phototrophes, est particulièrement
performante lorsque les eaux sont chargées en calcium et HCO3 et dépourvues de matière
organique.
Il existe d’autres bactéries autotrophes photosynthétiques ou non dans la diversité du
monde procaryotique mais n’ont été retenues ici que celles qui alcalinisent les biotopes.

Les carbonates bactériens « d’autotrophie », apparaissent dans des biotopes

oligotrophes. Leur faible teneur en M.O. limite le développement des bactéries hétérotrophes.
Le milieu conserve sa limpidité ce qui permet le passage des rayons lumineux favorisant les
activités des bactéries photosynthétiques. Les carbonates bactériens « d’autotrophie »,
apparaissent aussi bien dans des biotopes aérobies que dans des biotopes anaérobies, mais ils
sont toujours la réponse à une épuration bactérienne en C02.

3.2. La carbonatogènese bactérienne hétérotrophe.

La production de carbonate de calcium résulte ici de l’utilisation de la matière

organique. La précipitation peut être active ou passive.
La précipitation active est mise en jeu par des bactéries aérobies hétérotrophes,
taxonomiquement diversifiées (Castanier, 1987, Desrosiers et al., 1996, Herbaud et al., 1998,
Holland et al., 1999). Elles produisent et expulsent des ions CO3-- qui s’associent aux ions
Ca++ qui transitent dans la membrane bactérienne au niveau des pompes à calcium. Le
calcium à forte concentration dans le cytoplasme est toxique ce qui oblige les cellules
bactériennes à maintenir une concentration intracellulaire faible (0.1 – 1 µM), jusqu'à 1000
fois inférieure à celle qui peut se trouver dans leur micro environnement (Norris et al., 1996).
Pour maintenir ce gradient de concentration de calcium à l’aide de pompes Ca 2+ /ATP
dépendantes, la bactérie dépense beaucoup d’énergie car il y a sens cesse un influx d’ions
calcium via des transports passifs. Il y a alors apparition à ce niveau, sur les enveloppes
bactériennes, d’un nano environnement qui atteint la saturation ionique ce qui fait précipiter
le carbonate de calcium. Les enveloppes bactériennes jouent un rôle actif dans la
précipitation du carbonate de calcium. La précipitation active provoque la formation du
carbonate de calcium ce qui est également un moyen de défense en réduisant la toxicité du
milieu (Norris et al., 1996).

La précipitation bactérienne passive ne résulte pas de la mise en jeu des pompes

ioniques membranaires mais plutôt de l’augmentation de pH qui résulte de l’action de
certaines voies métaboliques (Castanier, 1997, Castanier et al., 1989, Le Metayer-Levrel,
1993, Le Metayer-Levrel et al., 1997, McConnaugheyan, 1997, Castanier et al., 1997, 1999,
Hammes et Verstrete, 2002). Elles se trouvent dans le cycle de l’azote (Figure n°4) et dans
le cycle du soufre (Figure n°5). La précipitation passive est plus répandue (Castanier et al.,
2000, Hammes et al.,, 2003).

21
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Dans tous les cas, ces carbonates bactériens d’hétérotrophie résulte de la diagenèse de
la matière organique et donc de l’épuration bactérienne. La M.O. résiduelle, toxique, est
immobilisée sous forme de CaCO3 qui restera inerte tant qu’une acidification ne le
solubilisera en redonnant du C02.

3.2.1. La carbonatogenèse bactérienne hétérotrophe dans le cycle de l’azote.

Trois voies métaboliques bactériennes sont impliquées et aboutissent toutes à la

production conjointe d’ions carbonate et hydrogénocarbonate, et d’ions NH4+. Le pH
augmente et la précipitation du CaCO3 en résulte. Les équations d’équilibre des ions
carbonate et hydrogénocarbonate sont déplacées vers la formation de CaCO3.
Les trois voies métaboliques ne fonctionnent pas dans les mêmes conditions.

VOIES METABOLIQUES DE LA CARBONATOGENESE BACTERIENNE

EN HETEROTROPHIE : La précipitation passive dans le cycle de l’azote.

VOIES MÉTABOLIQUES
Ammonification Réduction dissimilatrice Dégradation de l’urée
des acides du N03- ou de l’acide urique
aminés
CONDITIONS ENVIRONNEMENTALES
Aérobiose
Aérobiose Anaérobiose ou microaérophilie M.O. + Ca++ +
M.O. + Ca++ M.O. + Ca++ + NO3- urée ou acide urique

RESULTATS
Production d’ions carbonate
DE L’ACTIVITE
et bicarbonate
+ Production de NH4+ pH
BACTERIENNE

[CO3--] et [HCO3-] et [H+]

HCO3- CO3-- + H+
CO2 + H20 H2CO3 HCO3- + H+
PRECIPITATION DU CARBONATE DE CALCIUM
CO3-- + Ca++ CaCO3
D’après CASTANIER et al., 1997

Figure n°4 : Les voies métaboliques bactériennes impliquées dans la carbonatogenèse

hétérotrophe et dans le cycle de l’azote (d’après Castanier et al., 1997).

Les bactéries qui savent faire l’ammonification des acides aminés travaillent en
aérobiose et sont stimulées par des concentrations en M.O. élevées. Les bactéries qui font la
réduction dissimilatrice des nitrates exigent des conditions d’anaérobiose ou de
microaérophilie, car elles utilisent le N03- comme accepteur terminal d’électrons. Ainsi, elles
transforment le NO3- en NO2- ou en N2 ou en HH4+, selon leur appartenance taxonomique.
L’alcalinisation qui en résulte est d’autant plus importante que la voie va à son terme.
L’urée ou l’acide urique sont des produits résultant de la minéralisation azotée
effectuée par les mammifères et par les oiseaux ou les reptiles, respectivement. Ils sont
considérés comme des déchets du métabolisme, mais leur dégradation bactérienne qui se fait
en aérobiose, aboutit à la fabrication de CaCO3. Les bactéries qui sont capables de réaliser la
voie métabolique de la dégradation de l’urée ou de l’acide urique, possèdent toutes une
enzyme appelée uréase. Cette voie n’est active que depuis l’apparition des eucaryotes et plus

22
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

particulièrement des oiseaux et reptiles (acides uriques) et des mammifères pour l’urée. Les
invertébrés rejettent eux directement de l’ammoniaque.
Ces voies bactériennes produisent et font précipiter le carbonate de calcium dans les
sédiments superficiels et les eaux, riches ou pauvres en oxygène, dans les sédiments profonds
ou les eaux anoxiques à condition qu’il y ait des ions nitrate.

3.2.2. La carbonatogenèse bactérienne hétérotrophe dans le cycle du soufre.

Une seule voie métabolique est impliquée, il s’agit de la sulfato-réduction aussi

appelée la réduction dissimilatrice du sulfate, parce que celui-ci est utilisé comme accepteur
terminal d’électron. Les bactéries sulfato-réductrices sont hétérotrophes, anaérobies strictes
et taxonomiquement diversifiées. A partir de la M.O., elles produisent des ions carbonate et
hydrogénocarbonate et à partir du sulfate de H2S.

Si cette voie est impliquée, c’est le devenir de l’H2S, qui déterminera la précipitation
ou non du carbonate de calcium. En effet, l’hydrogène sulfuré est un gaz très léger acide.
Dans un premier temps le biotope subit donc une acidification.

VOIES METABOLIQUES DE LA CARBONATOGENESE BACTERIENNE

EN HETEROTROPHIE : La précipitation passive dans le cycle du soufre.

VOIE MÉTABOLIQUE CONDITIONS ENVIRONNEMENTALES

Réduction dissimilatrice du SO4-- Anaérobiose, M.O., Ca++, SO4--

RÉSULTATS DE L’ACTIVITÉ BACTÉRIENNE : production de

CO3-- HCO3- H2S

DEVENIR DU H2S

Dégazage du H2S utilisé par Non dégazage du

H2S pH d’autres bactéries H2S pH

Bactéries sulfureuses, anaérobies Bactéries sulfo-oxydantes

phototrophes, autotrophes, Autotrophes, aérobies,
H2S S° pH 2 O2 + H2S SO4-- + 2 H+
(dépôts intra ou extra cellulaires) pH

Précipitation du carbonate de calcium Pas de précipitation du carbonate

CO3-- + Ca++ CaCO3 de calcium

D’après CASTANIER et al., 1997

Figure n°5 : Les voies métaboliques bactériennes impliquées dans la carbonatogenèse

hétérotrophe et dans le cycle du soufre (d’après Castanier et al., 1997).

Si cette acidification se maintient et/ou s’intensifie il n’y aura pas la précipitation des
ions carbonate et hydrogénocarbonate produits avec les ions calcium de l’environnement.
C’est le cas lorsque le gaz ne peut s’échapper de son lieu de production et s’accumule. C’est
aussi le cas lorsque H2S est remanié par d’autres bactéries telles que les bactéries sulfo-
oxydantes. Autotrophes, aérobies strictes, elles transforment ce H2S en H2SO4 qui est un
acide très fort et l’acidité augmente. Le pH peut alors descendre jusqu’à des valeurs voisines
de 2. Bien évidemment, ce remaniement ne se fait pas dans le biotope de production d’H2S
qui est lui anaérobie, et riche en M.O. et sulfate. Il survient dans les biotopes situés au dessus
et dans lesquels transite l’hydrogène sulfuré.

23
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Des essais en laboratoire, de production de carbonate de calcium par des bactéries

sulfato-réductrices cultivées en anaérobiose, en présence d’ions calcium et magnésium dans
des containers étanches ont abouti à l’obtention de magnésite (Pontoizeau et al., 1997). Dans
ces conditions, H2S ne pouvait dégazer, il s’accumulait et le pH descendait. Ainsi les ions
carbonates ou hydrogénocarbonates ne se sont pas liés avec les ions calcium mais avec les
ions magnésium donnant du MgCO3.

Lorsque H2S est évacué, par dégazage par exemple, le pH augmente par simple retrait
d’un produit acide dissous dans une solution. Ainsi la précipitation des ions carbonates et
hydrogénocarbonates peut survenir en présence d’ions calcium. Les photosynthétiques
sulfureuses vertes ou pourpres dont le rôle d’autotrophe a déjà été pris en considération
précédemment interviennent dans le cycle du soufre. Ici c’est leur action de transformation
de H2S en S° qui retire du biotope un composé acide. Le S° qui est inerte, est déposé autour
ou dans la cellule. Il est donc indisponible pendant toute la durée de la vie de la cellule. Là
aussi, les carbonates précipitent sous forme de carbonate de calcium. Mais, ceci survient dans
un environnement liquide recevant les rayonnements lumineux nécessaires à leur
photosynthèse anoxygénogène mais à faible concentration en M.O. et dépourvu d’O2. Il est
généralement situé juste au dessus d’un sédiment anoxique dont la couleur noire traduit aussi
la richesse en M.O.

Il faut noter que les carbonates de calcium issus de cet enchainement de voies se
produisent au départ dans des biotopes riches en M.O. mais surtout en sulfate et donc
principalement dans les sédiments marins et les eaux marines dont la salinité exprimées en
chlorure de sodium peut aller jusqu’à la saturation. Les bactéries sulfates réductrices (SBR)
sont ubiquistes, présentes dans tout le domaine marin anaérobie. On les retrouve aussi dans le
gypse (CaSO4, 2H2O/CaSO4) dont elles assurent la dégradation, libérant alors du calcium et
des hydrogénocarbonates tandis qu’elles réduisent le sulfate en H2S. Le gypse est alors
transformé en carbonate de calcium (Castanier 1987, Castanier et al., 1999, Peckman et al.,
1999, Wright, 1999). D’après ces auteurs, si l’H2S se complexifie avec le fer pour former de
la pyrite cela permettra une augmentation du pH et favorisera la précipitation du carbonate de
calcium.

Un autre genre bactérien peut produire du H2S. Il s’agit du genre Clostridium qui
regroupe des bactéries hétérotrophes, anaérobies strictes, sporulantes, réputées pour la
diversité de leurs voies métaboliques fermentatives sur les sucres. Elles sont aussi fortement
protéolytiques et réalisent la putréfaction avec libération de tri, di ou mono méthylamines et
d’H2S. L’origine de celui-ci n’est pas le sulfate comme c’est le cas avec les bactéries sulfato-
réductrices mais le soufre des acides aminés soufrés (méthionine et cystéine). Ainsi, cet H2S
n’a pas une origine minérale mais une origine organique. Il subit cependant les mêmes
devenirs possibles que celui issu de la sulfato-réduction et donc est susceptible d’aboutir à la
production et la précipitation de carbonate de calcium (Castanier, communication
personnelle). En milieu marin, l’H2S biologique résulte en sa grande majorité de la sulfato-
réduction à cause de la richesse en ions sulfate même si la concentration en M.O. est grande.
En effet, le nombre d’acides aminés soufrés est restreint (seulement 2) tandis que la
concentration en SO4-- dans l’eau de mer varie autour de 2,4 g/l. En milieu continental pauvre
en sulfate, les carbonates du cycle du soufre résultent alors plutôt de la dégradation des
protéines par les Clostridium.

24
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

4. Les impacts de la carbonatogènese bactérienne.

La diversité des voies métaboliques (autotrophie, hétérotrophie), la diversité des
conditions environnementales (aérobie, anaérobie, doux, salé, hypersalé, …), la diversité des
groupes bactériens mis en jeu, rendent la carbonatogenèse bactérienne très ubiquiste.

25
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

II. LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR S. pasteurii.

1. Description générale de S. pasteurii.

En terme de nomenclature, la bactérie Bacillus pasteurii est le basonyme de

Sporosarcina pasteurii depuis une ré évaluation de son positionnement taxonomique en 2001
(Yoon et al., 2001). En effet, l’étude phylogénétique réalisée sur les ADNr 16S montre un
cluster cohérent regroupant plusieurs espèces de Bacillus : Bacillus globisporus, B.
psychrophilus, B. insolitus et B. pasteurii. La description taxonomique d’après le Bergey’s
manuel, édition 2005, confirme l’intégration de B. pasteurii au genre Sporosarcina (Figure
n°6). Les deux annotations, Bacillus pasteurii et Sporosarcina pasteurii, seront utilisées
indifféremment pour désigner ce micro- organisme.

Bactéries

Phylum : Firmicutes

Classe : Bacilli

Ordre : Bacillades

Famille : Planococcaceae

Genre : Sporosarcina

Espèce : pasteurii

Figure n°6 : Position taxonomique de S. pasteurii d’après le Bergey’s manuel, 2004.

Sporosarcina pasteurii est une bactérie ubiquiste de l’environnement, Gram (+), non
pathogène, en forme de bâtonnet de longueur entre 1 à 4 µm et de diamètre entre 0.7 à 1 µm.
Cette bactérie, monotriche est mobile grâce son flagelle polaire. La respiration de ce micro
organisme est de type aérobie anaérobie facultative (Mobley et Haussinger, 1989) (Yoon et
al., 2001). Elle dispose d’un équipement enzymatique propre aux bactéries aérobies, par la
présence de l’enzyme catalase (Yoon et al., 2001). Cependant, des variabilités enzymatiques
existent au sein de cette espèce pour deux types d’enzymes : l’oxydase et la nitrate réductase.
Dans des conditions stressantes, S. pasteurii sporule pour donner des endospores sphériques
et déformantes de 1 µm de diamètre à exosporium rugueux. Sur les 11 souches de Bacillus
pasteurii cultivées à pH 8.5 sur un milieu contenant 2% d’urée, et ayant présenté de bonnes
croissances seulement une a sporulé (Bradley et Franklin, 1958). De plus, chez les Bacillus
capables de dégrader l’urée, la capacité à former une spore se perd si la culture se fait trop
longtemps sur un milieu artificiel (Bornside et Kallio, 1956).
Chimioorganotrophe, elle puise son énergie en faisant des réactions d’oxydo-
réduction sur la matière organique. S. pasteurii a été décrite très tôt comme alcalinophile
avec un pH optimum de croissance autour de 9.2 (Willey et Stokes, 1962). Selon les mêmes
auteurs et confirmé par Yoon et al. (2001) Sporosarcina pasteurii possède un métabolisme
peu conventionnel. En effet, sa croissance est améliorée en présence de fortes concentrations
en ions ammonium et en NaCl. De façon plus singulière, de nombreux sucres courants

26
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

(xylose, fructose, galactose, lactose) ne sont pas assimilés ou oxydés. Il en est de même pour
certains acides gras et acides aminés (glutamine, asparagine).
Contrairement à la glutamine, l’acide glutamique est métabolisé (Willey et Stokes,
1962). Ceci a été confirmé, trente ans plus tard par l’identification de l’enzyme NAD-
glutamate déshydrogénase (NAD-GluDH ; EC [Link]), (Jahns, 1992). D’autre part, une
enzyme de la voie catabolique de la glutamine, la glutaminase, a été identifiée chez S.
pasteurii (Klein, 2002). Or la glutamine n’avait pas été identifiée comme étant un métabolite
oxydable chez S. pasteurii par Willey et Stokes (1962). L’hypothèse la plus vraisemblable est
que la glutaminase ne soit activée qu’en présence de phosphate.

2. Physiologie et écologie de S. pasteurii.

2.1. L’adaptation aux conditions alcalines.

D’après Kuhlmann et Bremer (2002), S. pasteurii est alcalinophile et possède

l’équipement pour évoluer dans des habitats alcalins (Willey et al., 1962; Willey et al.,
1963 ; Hoddinott, 1978). Cette potentialité s’explique en partie par la présence de protéines
cytochrome C-553. Ces protéines sont présentes en grande quantité chez les alcalinophiles et
font partie de la chaine respiratoire.

La théorie chimiosmotique proposée par Mitchell et al (2006)qui permet de

déterminer le gradient électrochimique des protons (∆p) à travers la membrane est énoncée
par la formule suivante :
∆p = ∆ψ-Z ∆pH Z = 2.3 R T / F ≈ 59 mV [n° 4]
avec ∆ψ qui est le potentiel de membrane (- intérieur, + extérieur), ∆pH le gradient
transmembranaire du pH (pHin – pHex), R constante des gaz parfaits, T la température
absolue et F la constante de Faraday.

La phosphorylation oxydative ou chaine respiratoire permet la translocation des

protons à travers la membrane de la bactérie dans l’espace inter membranaire. Le couple
NADH/NAD apporte les électrons aux molécules d’oxygène et c’est grâce à ce transport
d’électrons que se produit la translocation de H+. Les protons s’accumulent à l’extérieur de la
membrane en établissant un gradient électrochimique. Parallèlement l’ATPase synthétise des
ATP par translocation des protons de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule. Il s’agit là d’un
reflux, car la membrane n’est pas imperméable aux H+ et aux OH-. Or, lorsque le pH est
basique, le maintien d’un gradient de protons devient problématique. Pour contrebalancer
cette situation consommatrice d’énergie, une protéine C553 de la famille des cytochromes est
synthétisée en grande quantité. Elle se fixe sur la partie externe de la membrane pour jouer le
rôle d’antenne à protons et transférer des électrons. Ainsi, cette lipoprotéine (Cytochrome
C553) de faible poids moléculaire (9.6kDa) composée de 92 acides aminés (Vandenberghe et
al., 1999; Goto et al., 2005 ; UniProtKB/swiss-prot entry, 2008) permet de maintenir un
gradient de protons à l’extérieur de la membrane et ceci même à un pH basique. La protéine
C-553, localisée sur la face extérieure de la membrane, possède une lipomobilité sous sa forme
oxydée. Son faible potentiel redox (47 mV) lui permet de capter facilement les électrons et de
les transférer également plus facilement à la cytochrome C oxydase. Ces propriétés
favorisent sa distribution autour de la cytochrome oxydase et la capture des protons libérés
par le cytochrome C (Vandenberghe et al., 1999; Goto et al., 2005).

27
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Cette adaptation favorise le maintien du gradient de proton (∆pH) et améliore le

gradient électronique. Ainsi, la synthèse d’ATP est accrue à pH basique et les taux de
croissance sont meilleurs (Goto et al., 2005).

2.2. L’adaptation aux conditions osmotiques.

La présence de [Link] dans de nombreux habitats de l’environnement, nécessite

des adaptations particulières (Kuhlmann et Bremer, 2002). En effet des changements
brusques du microenvironnement peuvent s’opérer, tels que des périodes de pluies (dilution
des nutriments) ou de restrictions hydriques amenant une AW (activité de l’eau) faible. Les
membranes lipidiques permettent une diffusion rapide de l’eau à l’intérieur comme à
l’extérieur de la cellule. Par contre les membranes sont semi perméables pour de nombreux
ions et molécules organiques. La bactérie doit donc s’adapter aux variations de pression
osmotique pour continuer à assimiler les éléments nutritifs.

Très récemment S. pasteurii a été décrite comme halotolérante (Kuhlmann et Bremer,

2002 ; Roberts, 2005 ; Zhao et al ., 2006). Elle est capable de synthétiser des osmolytes tels
que l’hydroxyactoine, du glutamate et l’ectoine. L’ectoine avait été d’abord détectée chez
Ectothiorhodospira une bactérie photosynthétique pourpre (Ventosa et al., 1998) puis sur de
nombreuses autres bactéries halotolérantes (Zhao et al., 2006). Chez S. pasteurii, les gènes
responsables de la synthèse de l’ectoine codent pour trois enzymes constituant les trois étapes
de la biosynthèse de cet osmolyte (Kulhmann et Bremer, 2002). Ces gènes ectA, ectB et ectC
sont organisés en opéron ectABC. La transcription de ces gènes est activée par
l’augmentation de la pression osmotique dans le micro environnent (Kulhmann et Bremer,
2002). La première étape de la biosynthèse de l’ectoïne est réalisée par l’enzyme EctB acide
diaminobutyrique aminotransférase. Elle nécessite la présence d’un L-aspartique β semi
aldéhyde et d’un donneur de groupement amine, le glutamate. Cet acide aminé est à
l’intersection de nombreuses voies métaboliques ce qui le rend indispensable. De plus sa
concentration augmente l’activation de la glutamate synthétase (GS) lors d’un stress
osmotique et de la glutamate déshydrogénase sous l’effet de l’alcalinisation du cytoplasme
(Csonka., 1989 ; Kulhmann et Bremer, 2002).

Dans le cas de [Link], la transcription du promoteur de l’opéron ectABC se

réalise dans le même sens à l’aide de la fixation du facteur σ A. Cette dernière présente de
grandes similitudes avec les séquences σ A promoteur-dépendant de chez B. subtilis
(Calderone et al., 2004). Ce facteur de transcription est normalement présent durant la phase
exponentielle de croissance, il semblerait qu’il puisse aussi intervenir dans les conditions de
stress. Ainsi, la croissance de S. pasteurii peut se maintenir dans des milieux de cultures
contenant différentes concentrations de chlorure de sodium pouvant aller jusqu'à 2 M (117
g/l) en présence d’osmolytes tels que l’ectoine ou la glycine bétaïne (Kulhmann et Bremer,
2002). L’ectoine s’accumule dans le cytoplasme en conditions d’hyperosmolarité. Son
interaction avec les macromolécules en fait un osmoprotectant qui permet à S. pasteurii
d’affronter un stress osmotique.

28
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

2.3. La tolérance aux ions sodium et ammonium.

Le pH élevé (9.2) et la présence de NaCl sont indispensables pour sa croissance

(Willey et Stokes, 1962). Cette affinité de S. pasteurii pour les ions Na+, s’explique
notamment par l’assimilation de certains acides aminés tels que la leucine (Beck et Jahns,
1996), le glutamate (Jahns, 1992) et la glutamine (Klein et al., 2002) via des transporteurs
ioniques de type Na+/acides aminés. Le transporteur Na+/glutamate est stimulé par la
présence d’ammonium. Celui de la leucine est régulé par la présence de petites chaines
d’acides aminés (BCAA). Ces dernières reflètent l’état du pool intracellulaire azoté de la
cellule.

Les ions sodium participent chez toutes les bactéries alcalino-tolérantes à de

nombreux échanges ioniques via des transporteurs simples symports et antiports aussi leur
présence dans le milieu de croissance est indispensable.
Certains auteurs (Willey et Stockes 1963 ; Morsdorf et Kaltwassen, 1989) ont
également mis en évidence la nécessité de fortes concentrations en ions ammonium (40 mM)
pour le bon fonctionnement de son métabolisme. Cependant ce micro-organisme ne semble
pas posséder pour autant de transporteurs spécifiques passifs ou actifs pour les ions NH4+.
L’accession des ions ammonium et leur intégration dans le métabolisme se réalisent à travers
la membrane par diffusion ammoniacale (NH3) (Morsdorf et Kaltwassen, 1989). Cette
particularité physiologique conduit aux observations suivantes. La première observation,
chez S. pasteurii concerne la voie enzymatique permettant l’assimilation de l’ammonium, car
elle est différente de celle d’autres micro-organismes tels que Proteus vulgaris ou
Sporosarcina ureae (Morsdorf et Kaltwasser, 1989). En effet, chez S. pasteurii les activités
de l’enzyme GS (glutamine synthase) et de l’enzyme GOGAT (glutamate synthase) ne sont
pas décelables. Seule la glutamate déshydrogénase (GDH) est présente mais avec une très
faible affinité pour l’ammonium (km = 55.2 mM). La synthèse du glutamate par la GDH
nécessite un ion ammonium qui est intégré au 2-oxoglutarate, ainsi qu’une molécule de
NADP. Cette enzyme a donc une activité NADP-GDH dépendante. La forme NAD-GDH de
l’enzyme favorise la voie de décomposition du glutamate et la libération de l’ammonium.
Ainsi, lorsque la culture de la bactérie se réalise en milieu riche en acides aminés, l’activité
de l’enzyme de NADP-GDH est faible. Par contre, elle augmente lorsque son environnement
est carencé en azote (NH4+, urée). Ceci signifie que lorsque le milieu de culture est riche,
l’ammonium n’a pas besoin d’être intégré dans les acides aminés et le ratio NADP/NAD est
élevé ce qui ne favorise pas non plus la libération de l’ammonium dans la cellule.

Morsdorf et Kaltwasser (1989) ont aussi observé l’absence de régulation de l’activité

enzymatique de l’uréase quelle que soit la disponibilité en ions ammonium dans le milieu.
Jahns (1996) a montré que la prédisposition de S. pasteurii pour des fortes concentrations en
NH4+ était la conséquence d’une adaptation physiologique particulière. En présence
d’ammonium, il y a une augmentation de la synthèse d’ATP (Jahns, 1996). Ceci est en
accord avec l’augmentation du potentiel électrochimique de la cellule (∆p) lorsqu’il y a
diminution du pH. Ces changements s’opèrent en quelques minutes après un ajout de NH4Cl
ou d’urée qui est suivi d’une alcalinisation du pH intracellulaire (de 6.1 à 7). Pour Goto et al.
(2005) le pH intracellulaire serait plus proche de 8.3 - 8.4.

29
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

2.4. L’ammonium utilisé comme une source d’énergie.

Jahns (1996) suggère la présence d’une ATPase couplée avec un efflux d’ions NH4+
et un influx par translocation de protons. Ceci expliquerait la très bonne tolérance de S.
pasteurii pour les ions NH4+. Le rôle de l’ammonium pour cette espèce alcalinophile est donc
essentiel, la déprotonation se réalise majoritairement à l’extérieur de la cellule à cause d’un
pH plus élevé selon l’équation d’équilibre :

NH3 + H+ = NH4+ (pKa = 9.2) [n°5]

Ceci permet de créer un gradient de protons (∆p) de part et d’autre de la membrane.

Ce pool de protons favorise le maintien d’un flux de protons suffisant pour la synthèse de
l’ATP. En plus de son rôle de production d’énergie, l’ammonium permet le maintien d’un
gradient de protons, ce qui facilite l’assimilation de nombreux ions et acides aminés via des
pompes H+/ acides aminés (Willey et Stockes, 1963) tel que le glutamate (Jahns, 1996) ainsi
que la synthèse d’acides aminés chez S. pasteurii.
S. pasteurii serait donc capable avec les ions ammonium de produire de l’énergie
chimique de la même façon que les bactéries halophiles en produisent avec l’ion sodium
(Krulwich, 1985).

2.5. L’importance de l’urée chez S. pasteurii.

L’urée peut être une autre source d’azote ammoniacal. L’hydrolyse de l’urée par
l’uréase libère pour une molécule d’urée, deux molécules d’ammonium et une d’ion
carbonate. Ceci induit une alcalinisation. Chez S. pasteurii, l’urée est une molécule
indispensable comme source d’azote, pour la croissance, mais également pour la synthèse
d’une partie de son énergie chimique et pour le maintien d’un micro environnement sélectif.

Il existe trois types de transport de l’urée, la diffusion simple, la diffusion facilitée qui
sont des transports passifs et la diffusion active ou transport actif nécessitant de l’énergie. Le
transport actif d’urée de type ABC transport a été décrit chez de nombreux micro-organismes
(Mobley et Hausinger, 1989 ; Berckers et al., 2004) mais n’a pas été identifié chez S.
pasteurii (Jahns et al., 1988). Il en est de même pour le transport passif de type perméase
(Mobley et Hausinger, 1989 ; Jahns, 1996). Selon ces auteurs, l’entrée de l’urée dans la
cellule chez S. pasteurii se réalise essentiellement par diffusion simple avec un coefficient de
perméabilité de 10-4 à 10-5 m/s. L’ammoniaque, une molécule non chargée, diffuse également
à travers la membrane bactérienne.

La molécule d’urée est une source cachée d’azote. Elle permet les mêmes processus
physiologiques que l’ammonium chez S. pasteurii. Ceci rend sa présence indispensable
lorsque la concentration en ammonium de son biotope diminue.

30
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

III. LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR L’UREASE DE S. pasteurii.

1. Les caractéristiques générales de l’uréase chez S. pasteurii.

Sporosarcina pasteurii, est un micro organisme ubiquiste de l’environnement (Ciurli

et al., 1996) qui appartient au groupe des bactéries uréolytiques capables d’hydrolyser l’urée
grâce à leur enzyme uréase. Cette enzyme peut représenter chez S. pasteurii près de 1% du
poids sec de la cellule (Larson et Kallio, 1954 ; Bachmeier et al., 2002).
L’uréase a été découverte en 1926 par Summer (Summer, 1926) (Larson et Kallio,
1954). Pour la première fois une enzyme était purifiée et cristallisée. Celle-ci provenait du
haricot. C’est aussi la première protéine découverte contenant du nickel (Dixon et al., 1975 ;
Fishbein et al., 1976). L’uréase est une enzyme de type urée – amidohydrolase hydrolase de
liaison C-N (EC [Link]). Elle catalyse l’hydrolyse de l’urée en ammonium et en carbamate
(R1). Celui-ci se décompose spontanément et libère une molécule d’ammonium
supplémentaire et une d’acide carbonique (R2). L’ensemble des réactions se réalisant dans la
cellule est représenté dans la Figure n°7.
Au pH physiologique (pH = 7) la réaction n° 3 (pKa = 6.37) tend vers la formation
d’ions HCO3-. La réaction n°4 s’équilibre en faveur des ions ammonium (pKa = 9 .2)
(Mobley and Hausinger, 1995 ; Hammes et al., 2003). Le pH intracellulaire augmente de 0.9
unité en présence d’urée, passant de 6.1 à 7 (Jahns, 1996). La vitesse d’hydrolyse de l’urée
par l’uréase augmente d’un facteur de 10 14 par rapport à une réaction non catalysée (Benini
et al., 1999 ; Voet et Pratt, Fundamentals of Biochemistry, 2006). L’urée (ou carbamide) est
le substrat de l’uréase. Elle a été découverte dans l’urine en 1799. C’est un composé cristallin
incolore dont la formule est brute H2N-CO-NH2 et qui a son point de fusion à 132.7° C. C’est
en 1828 que Friedrich Wöhler a mis au point le procédé de fabrication de l’urée à partir de
l’acide cyanique (HO-CN) et de l’ammoniaque (NH3) qui porte son nom : « la synthèse de
Wöhler ». Elle revêt une grande importance historique car c’était la première fois qu’un
composé organique était produit à partir d’un composé inorganique.

O O
=

uréase
H2N - C - NH2 + H2O NH3 + H2N - C - OH R1

Carbamate
urée

O
=

H2N - C - OH + H2O NH3 + H2CO3 R2

Acide carbonique

H2CO3 H+ + HCO3- R3

2 NH3 + H2O 2 NH4+ + 2 OH- R4

Figure n°7 : Les réactions de dégradation de l’urée chez S. pasteurii.

31
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Tableau n° 2 : Récapitulatif des différentes constantes (Vmax et Km) issues des activités
enzymatiques de l’uréase chez S. pasteurii.
*: activités enzymatiques spécifiques en fonction de la D.O ND : non déterminé.

Matériels Km Activité enzymatique Conditions et

Inhibitions Références
(mM) résultats

p-hydroxymercuribenzoate
Pas
(p-HMB)
40 - 1.528 µmole d’inhibition Mobley et
Acide Acétohydroxamique
130 urée/min /mg pH : 7.5 à 37° Haussenger, 1989
(AHA)
C
p- benzoquinone (p-BQ)
Uréase
22.99 0.73 mmole/min/mg
immobilisée Bachmieire et al.,
ND
2002
17.3 1.57 mmole/min/mg Uréase libre

(21 -228 mg urée /h)

soit pH variable
ND Ranganathan, 2006
(0.6 – 6 µmole [urée] variable
urée/min)
41.6 3.55 mmole/min/mg Acide Acétohydroxamique pH = 7.0

26.2 1.72 mmole/min/mg AHA pH = 7.7

Taux de Stocks-Fisher et
En présence de CaCl2 précipitation al., 1999
S. pasteurii 0.94 mmol/min [12.6-50.4] mmole CaCO3
0.75mMca2+/
h/109cellules
100 NR pH = 5.7
130 NR pH = 6.7 Larson et
ND
18.54 Kalli,1953
NR pH = 7.7
0
15 mmole /min/D.O* pH = 9.2
Wiffing, 2003
29 mmole /min/D.O* ND
18 ND
0.2 mS/min - 2.2 Whiffing et al.,
ND
mMNH4+/min 2006

1960 ± 250 U/ml

235 ±
(0.980mMurée/min/ml)
20
enzyme libre
Immobilisation sur Ca2+
1740 ± 185 U/ml pH =8 Curli et al., 1999
poly gluconate
315± (0.87mmoleurée/min/m
25 l)
enzyme fixée
En milieu de Kantzas et al.,
722.6 ND ND
culture 1992

L’urée est très répandue dans l’environnement et provient des processus du

catabolisme protéique et des purines (Mobley et Haussenger, 1989). Ce métabolite est de
charge neutre et présente peu d’interactions fortes avec l’eau, ce qui lui permet de traverser la

32
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

membrane lipidique par diffusion simple (Rebel., et al 1996) pour atteindre l’enzyme
intracellulaire (Mobley et Haussenger, 1989, Mobley et al., 1995). L’uréase présente une
activité enzymatique de type Michaëlis Menten (Mobley et al., 1995) dont certaines
constantes, Km et Vmax, sont présentées dans le Tableau n°2.

2. La structure de l’uréase chez S. pasteurii.

Il existe de nombreux êtres vivants présentant une activité uréolytique. Alors que les
uréases de champignons ou de plantes sont des protéines formées d’une seule unité de poids
moléculaire 90 kDa (Kilo Dalton), les uréases bactériennes sont des protéines complexes
formées de deux ou trois sous-unités. De nombreuses espèces de bactéries fabriquent des
uréases aussi bien dans le genre Bacillus (Bornside et Kallio, 1956) que dans d’autres genres.
A ce jour 73 espèces de bactéries sont recensées dont les plus connues sont Bacillus pasteurii
(Sporosarcina pasteurii), Helicobacter pylori qui a été découvert dans l’estomac humain en
1982 (Marshall, 1983 ; Marshall et Warren, 1984).
L’uréase de Bacillus pasteurii a été purifiée pour la première fois en 1954 (Larson et
Kallio , 1954). Sa structure moléculaire et la localisation des atomes de nickel ont été
précisées plus récemment (Christians et Kaltwasser, 1986) ainsi que le poids moléculaire de
ses sous unités (Benini et al., 1986). La structure tridimensionnelle d’une enzyme s’établit
par des techniques de cristallographie et de diffraction aux rayons X. Elle a été ainsi
déterminée avec précision pour Klebsiella aerogenes (Jabri et al., 1995) et pour Sporosarcina
pasteurii (Benini et al., 1999). L’uréase chez Sporosarcina pasteurii, est composée de 3 sous
unités α, β, γ, respectivement de poids moléculaires 11, 11.3 et 61.4 kDa. Ces sous-unités
s’associent en trimère α, β, γ donnant ainsi un hétéro polymère (αβγ)3 (Mobley et al., 1995).
Les sous unités α ont une position centrale dans l’enzyme. Les sous-unités β sont localisées
sur les parties externes du trimère. Enfin les sous-unités γ se fixent sur les deux unités (αβ)
notamment sur la partie supérieure des unités α favorisant ainsi la structure en trimère noté
(αβγ)3 (Benini et al., 1999). Ce sont les sous-unités α qui sont au contact du site catalytique
de l’uréase. Le site actif de l’uréase possède deux atomes de nickel. Le nickel est un métal
qui réagit avec l’hydrogène et le monoxyde de carbone, permettant des réactions
d’hydrogénation et de carbonylation (Hausinger, 1987).
Par rapport à d’autres cations divalents tels que le zinc (Grossoehme et al., 2007 ;
Stola et al., 2006), les ions nickel ont plus d’affinité pour le groupe NH2 de l’urée car ils sont
très électrophiles et possèdent jusqu’à quatre états d’oxydation possibles (0 à + 4). Ce métal
est capable de former six liaisons de coordination, ce qui lui donne un avantage certain dans
les processus de formation et de stabilisation des liaisons entre l’urée et l’enzyme. En effet,
l’urée est considérée comme une base faible au sens de Lewis avec ses groupes NH2.

2.1. L’assemblage et l’activation de l’uréase chez S. pasteurii.

L’uréase composée de ces trois sous unités (UreA, UreB et UreC) s’assemble en
trimère pour constituer une structure quaternaire inactive (apo - uréase). La biogenèse de
l’enzyme active se réalise grâce au concours de protéines auxiliaires (Ure D, E, F et G).
L’incorporation de deux ions nickel dans chaque sous unités α de l’uréase est un pré requis
pour l’activation de l’apo enzyme (Mulrooney et Hausinger, 2003 ; Benini et al., 1999).

33
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

2.1.1. Le rôle des protéines auxiliaires.

L’activation de la formation de l’apoenzyme nécessite l’intervention des protéines

accessoires (UreD, UreF, UreG) responsables du complexe Ure-DFG-uréase (enzyme
inactive). Chaque protéine accessoire participe à l’intégration des ions nickel à l’intérieur de
chaque trimère (UreA, UreB, UreC). En effet, l’UreF régule l’activité GTPase de la protéine
UreG. UreF possède un rôle de protéine chaperonne et facilite l’insertion du nickel dans
l’apo protéine au niveau du site actif (Zambelli et al., 2005 ; Salomone-Stagni et al., 2007).
L’hydrolyse de la molécule de GTP (guanine triphosphate) libère de l’énergie qui, permet
l’incorporation des ions nickel par UreE dans l’enzyme (Remaut et al., 2001 ; Mulrooney et
Hausinger, 2003 ; Salomone-Stagni et al., 2007). Ceci semble accéléré en présence de
dioxyde de carbone. Il s’en suit une libération des protéines accessoires Ure-DFG, du
transporteur UreE et d’une molécule de GDP (guanine diphosphate) (Mobley, 1995).
Chacune de ces protéines va recommencer un cycle d’assistance à l’activation de l’apo-
uréase en holoprotéine (Figure n°8).

MICROENVIRONNEMENT
ACIDIFIE MACROENVIRONNEMENT
PROPICE A LA PRECIPITATION
DU CARBONATE DE CALCIUM
Ca++ + 2 HCO3-- CaCO3 + 2H+

Ca++ 2 H+
2 H+ Ca++

Passive
Influx

Ca++
ATP ADP + Pi
Ca++
10^3 x Ca++
Perméase E E 2H+
Ni2+ Ni2+ Ni2+
2+ 2+ DF
G F F
G F
G
Ni Ni F F
G
ATP ATP
NixA E GTP
CO2
F
G
pH = 6.2 - 8.4 Efflux
Ca++
ADP + Pi E F
G
G
ADP + Pi
G
F
D
ATP 2+
MICROENVIRONNEMENT
n H+
GDP + Pi
Ni NH3
H+ H+ Ni
2+ 2+
Ni 2+ ALCALIN
ADP + Pi 2+ 2+ Ni
Ni Ni 30 % 70 %
n Na+
Efflux Perméase
+ --
2 NH4 + CO3 m H+
NADPH+H+
+ NGDH O H+
H
NADP m Na+
C
H2O
H2N NH2
ADP + Pi ATP

Membrane

NH4+ + H+

2- NH4+
Spéciation H2CO3 HCO3- CO3 Spéciation NH3
100 % 100 %

50 % pka = 9.25
+
NH4
+ NH3 + H
50 %

6.2 10.1 14 9.2

Figure n°8 : Schéma représentant les phases de maturation de l’uréase et son

fonctionnement dans la cellule chez S. pasteurii.

34
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

2.1.2. Le rôle clé de la protéine auxiliaire UreE.

Ainsi d’après de nombreux auteurs (Mobley et,al., 1995 ; Remaut et al., 2001 ;
Mulrooney et Hausinger, 2003 ; Won et al., 2004 ; Stola et al., 2006), l’Ure-E est une
protéine homodimérique de type métallo-chaperonne qui possède une forte affinité pour le
nickel. Cette affinité est due en grande partie à la présence de séquences d’histidines très
conservées en position C-terminale dans chacun des monomères. Deux modèles de fixation
du nickel ont été explorés pour expliquer la structure tridimensionnelle de l’UreE et de
l’identification des histidines impliquées dans la chélation (Remaut et al., 2001 ; Won et al.,
2004 ; Stola et al., 2006). Chez Sporosarcina pasteurii, l’UreE chélate deux ions nickel et
permet leur incorporation dans le complexe inactif qu’est l’apo–uréase couplée aux protéines
auxiliaires (Ure-ABC –UreDFG). La seconde conséquence de l’induction de la synthèse de
l’UreE est l’apparition d’un pool de nickel intracellulaire.

2.2. Le mécanisme de l’hydrolyse de l’urée au niveau du site catalytique.

Le site catalytique de l’uréase chez [Link], appelé aussi sphère de coordination,

est formé par les deux ions nickel, un pont hydroxyde les liant entre eux et un autre pont
formé avec le groupe carboxylate d’une lysine carbamylisée. La cavité du site actif renferme
quatre molécules d’eau (Benini et al., 1999). Cette forme particulière de la lysine permet la
liaison des deux atomes de nickel du site actif avec son groupe carboxylique (Benini et al.,
1999). L’atome de nickel est de plus lié par deux histidines, Hisα249 et Hisα275 et une
molécule d’eau. Le second atome de nickel est lui, en liaison avec deux histidines Hisα137,
Hisα139, un acide aspartique Asp α 363 et une molécule d’eau (Benini et al., 1999). Le modèle
développé par cet auteur montre le rôle fondamental des molécules d’eau dans les
mécanismes réactionnels. Elles favorisent une activité optimale du site actif à pH 8 et
diminue la barrière énergétique à 19Kcal/mol. De plus, les quatre molécules d’eau observées
(W(1), W(2), W(3) et W(4)) dans le site actif au voisinage des deux ions nickel, facilitent le
positionnement de l’urée dans la cavité catalytique. En effet, lorsque l’urée rentre dans le site
catalytique, elle remplace les molécules d’eau W(1), W(2) et W(3). La quatrième molécule
d’eau, se maintient en place pour conserver le pont hydroxyde entre les deux atomes de
nickel. Cette fonction hydroxyde joue donc un rôle essentiel dans le processus de catalyse de
l’urée.

3. L’organisation des gènes codant pour la synthèse de l’uréase chez S.

pasteurii.

Généralement les gènes codant pour l’uréase et ses protéines accessoires sont réunis
en cluster ou opéron. Celui-ci comporte des gènes de régulation, des gènes de structure
(ureABC) et des gènes accessoires (ureEFGD). Leur transcription peut être induite ou
réprimée en bloc par le gène de régulation ureR qui est présent chez à peu près toutes les
bactéries uréolytiques (Mobley et al., 1995). Chez S. pasteurii l’organisation est de même
type. L’opéron a une longueur de 11 kb (Mobley et al., 1995 ; Zambelli et al., 2005,
Mulrooney et Hausinger, 2003 ; Salomone-Stagni et al., 2007 ; Swiss prot, 2008).
Cependant, chez ce micro organisme il n’a pas été identifié ni de gène de régulation ureR ni
de plasmide. La même chose existe chez d’autres micro-organismes tels que K. aerogenes et
B. subtilis. La transcription des gènes de l’uréase s’accomplit à l’aide d’une polymérase mais
le ou les différents facteurs sigma responsables de la fixation sur les sites promoteurs n’ont
pas été encore identifiés chez S. pasteurii. La littérature n’apporte pas non plus de données
sur l’importance du turn-over de l’uréase en fonction de l’état physiologique de la bactérie.

35
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

4. La régulation de l’opéron uréase chez S. pasteurii.

Certains auteurs (Morsdorf et Kaltwasser 1989 ; Mobley et al., 1995), considèrent que
la synthèse de l’uréase est indépendante des facteurs environnementaux. Son expression est
alors dite constitutive chez S. pasteurii. Néanmoins, d’autres auteurs suggèrent au contraire
qu’elle serait inductible, notamment, lorsque les conditions environnementales sont éloignées
des conditions optimales de croissance (Chia et al., 2001) ; alors, une augmentation de
l’activité enzymatique spécifique pourrait s’opérer. C’est le cas lorsque le pH est
artificiellement maintenu autour du pH 8, c'est-à-dire une unité pH en dessous de son
optimum de croissance qui est à 9, et l’activité enzymatique spécifique augmente au cours de
la culture.
Par ailleurs, l’ajout de faibles concentrations d’urée (20 mM soit 1.2 g/l) ou 40 mM
(2.14g/l) de NH4Cl semble jouer également un rôle inducteur pour la synthèse de l’uréase.
(Morsdorf et kaltwesser, 1989 ). Ces auteurs suggérèrent néanmoins que la synthèse de
l’uréase n’est pas uniquement régulée en fonction de la disponibilité en azote dans son micro-
environnent. D’autre part, l’ajout de faibles concentrations d’ions nickel jusqu’à 100 µM
(soit 6 mg/l) améliore sensiblement l’activité enzymatique (Bachmeier et al., 2002). Ceci
semble indiquer l’existence d’une régulation plus sophistiquée.

5. L’inter régulation entre l’opéron nik et l’opéron uréase.

5.1. Structure de la protéine chaperonne UreE.

Le transport et l’incorporation de deux ions Ni2+ dans chaque sous unité UreABC par
la protéine métallo chaperonne UreE sont des étapes primordiales dans l’activation de
l’enzyme. Les recherches semblent montrer que la protéine UreE a un mécanisme de
complexation du nickel proche de celui décrit dans le cas de la sous-unités α de l’uréase. En
effet, les ions nickel sont complexés avec deux histidines permettant de réaliser 4 liaisons
O/N par acide aminé. Deux autres études de (Stola et al., 2006 ; Grossoehme et al., 2007)
confirment l’affinité de cette métalloprotéine pour les cations tels que Zn 2+, Cu 2+ et Ni 2+
mais ne tranchent pas sur la façon dont les ions nickel sont incorporés dans la protéine UreE.
L’activation de la synthèse de l’UreE se réalise en présence d’ion nickel et elle est
sous le contrôle de la protéine NikR. Celle-ci est sensible à la présence intracellulaire des
ions nickel, et assure donc un rôle indirect de régulation sur la synthèse de l’UreE
(Mulrooney et Hassinger, 2003).

5.2. Structure et régulation des gènes Ni.

La synthèse de la protéine NikR est sous le contrôle de l’opéron l’opéron nik. La

synthèse d’Ure-E nécessite donc l’activation de celui-ci (Mulrooney et al., 2003). Cet opéron
contient les gènes structuraux nikABCDE codant pour un système de transporteur
membranaire actif spécifique pour le nickel et ils sont sous le contrôle d’un gène de
régulation nikR situé en aval de nikE. Le gène nikR est lui contrôlé par deux promoteurs. Le
premier est une protéine spécifique de régulation FnR qui intervient dans l’adaptation
physiologique de la respiration lors du passage aérobie à des conditions anaérobies. Cette
protéine se lie à l’ADN en amont du gène nikR sur la séquence d’adhésion de la protéine
NikR et réprime l’expression de l’ensemble de l’opéron. Le second est situé également en
amont du gène de régulation et ne permet qu’une faible expression du produit de ce gène. La
protéine NikR a un facteur de transcription de type hélice-coude hélice. Elle possède une
séquence d’acides aminés située en position N- terminale responsable de la fixation sur

36
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

l’ADN en présence d’ion nickel. La particularité de cette protéine c’est de posséder deux
sites de chélation du nickel avec des affinités différentes position C-terminale.
Ainsi lorsque la quantité d’ion Ni est suffisante pour occuper le site de forte affinité, cela
provoque un changement de conformation qui améliore l’accrochage de cette protéine à
l’ADN au niveau de sa séquence de régulation. Ceci conduit à une très forte expression de
l’opéron nikABCDE. Par contre la fixation sur le site de plus faible affinité conduit vers une
répression. Cela arrive lorsque la concentration en ion nickel est trop élevée dans la cellule.
L’expression de l’opéron nik contrôlée positivement par la protéine NikR, présente de fortes
similitudes de fonctionnalité avec une autre métalloprotéine de régulation, Fur. Cette dernière
intervient dans la régulation et le transport du fer dans les cellules (Eitinger et Mandrand-
Berthelot, 2000).
Ainsi, les conditions environnementales semblent jouer un rôle direct sur l’activité
enzymatique uréasique de S. pasteurii. Cette activité subit néanmoins une régulation
complexe qui pourrait expliquer une synthèse de l’enzyme de type constitutive.

37
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

IV. LES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR LA REGULATION DE LA

SYNTHESE DE L’UREASE.

Les micro-organismes de l’environnement vivent une alternance de longues

périodes de disette et de courts moments d’abondance. En période d’abondance, les bactéries
identifient les sources de carbone et d’azote les plus favorables pour leur croissance. Ces
préférences nutritives sont très finement régulées. Elles sont dues à des systèmes sophistiqués
de régulation métabolique qui sont le produit d’une pression évolutive exercée dans chaque
niche écologique. Cette multitude d’habitats a permis de développer une grande diversité de
régulations métaboliques et l’apparition de nombreuses voies dont celle de l’assimilation de
l’azote. La régulation d’une enzyme clé de l’entrée de l’azote telle que l’uréase en est la
parfaite illustration.

L’uréase est une enzyme de type hydrolase E.C (3.5.15) qui est capable d’hydrolyser
l’urée pour donner de l’ammonium et de l’acide carbonique. Sa fonction de catalyse permet
d’accélérer la réaction d’hydrolyse de l’urée d’un facteur de 10 14 par rapport à une réaction
abiotique spontanée.

Dans le cycle de l’azote, l’uréase est la dernière étape de la minéralisation. Cette

enzyme est très répandue dans le monde bactérien. Elle est synthétisée à partir d’un opéron
qui regroupe les gènes de structure (ureA, ureB, ureC), les gènes accessoires (ureE, ureF,
ureG, ureH et ureI) et le gène de régulation (ureR) (Collins et al., 1993).

Certains gènes de l’opéron uréase peuvent manquer. Ainsi chez P. mirabilis la totalité
des gènes de l’opéron sont présents, mais chez S. pasteurii le gène de régulation ureR a été
perdu. Le monde microbien offre 5 modes différents et identifiés de régulation de la synthèse
de l’uréase. Ils sont représentés dans le Tableau n°3.

Tableau n°3 : Les mécanismes identifiés de la régulation de l’uréase dans le monde

microbien.
Type de régulation Mécanismes de régulation
L’expression de la transcription est régulée par l’azote chez K. pneumoniae
Système global de
(Collins et al., 1993) et chez B. subtilis par la carence en azote (Atkinson et
régulation
Fisher, 1991).
L’expression de la synthèse de l’uréase chez S. pasteurii est constitutive
Constitutive
c’est-à-dire indépendante des conditions environnementales (Morsdorf et
Kaltwasser, 1989).
La transcription de l’uréase peut être induite par l’urée sur la protéine de
Induction par l’urée
régulation Ure-R (D’Orazio et Collins, 1993 ; Mobley et al., 1995).
La synthèse de l’uréase est inductible par un abaissement ou variation du
Induction par le pH pH du milieu de culture chez H. pylorii et S. pasteurii (Chia et al., 2003» ;
Ranganathan et al., 2006).
Induction par le Cet ion est indispensable pour l’activation de la métallo- enzyme uréase
nickel (Vliet et al., 2002 ; Hausinger, 2003)

38
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

1. La régulation par le pH.

De nombreux micro-organismes comme S. salvivarus, H. pylorii ou P.

mirabilis ont une synthèse de l’uréase induite par des variations du pH extracellulaire. Les
pH acides stimulent l’expression des gènes de l’uréase en activant l’expression du gène UreI
au niveau du promoteur PureI. Ce gène permet de synthétiser une protéine transmembranaire
(UreI) pour former un canal ionique urée/H+ (Skouloubris et al., 1998 ; Guo et al., 2007). De
plus, différents niveaux de synthèse de la protéine UreI peuvent être obtenus par variations
de l’acidité du milieu mais également par la disponibilité de la source de carbone. Mais, cette
synthèse est totalement réprimée à pH neutre (Chen et al., 2003 ).

Helicobacter pylori, un micro-organisme pour qui la synthèse de l’uréase est

nécessaire à la neutralisation des sucs gastriques, possède également le gène UreI en amont
du gène UreE. Il a été montré que les deux gènes UreI et UreE sont co-transcrits dans le
même sens. Ces gènes sont finement régulés comme chez S. salvivarus car tout excès d’urée
et d’uréase produiraient une alcalinisation toxique. Selon Chen et al. (2002), l’activation de
la transcription se réalise à l’aide du facteur σ70, un facteur qui intervient en période de
croissance mais également en période de stress. Néanmoins, l’auteur suggère que l’hypothèse
de la synthèse de l’uréase induite par simple variation du pH n’est pas suffisante pour
expliquer tous les cas de figures. Il propose l’intervention d’un système de régulation plus
global. Ce point de vue a également été adopté par Cussac et al., (1992) et semble se
confirmer par l’identification du rôle clé de la glutamine synthétase (GS) chez H. pylorii
(Garner et al., 1998). Plus récemment l’induction de la transcription par le nickel de l’uréase
a été identifiée chez ce même micro-organisme via la protéine régulatrice NirkR (Vliet et al.,
2002 ; Vliet et al., 2004).
Chia et al., (2003), notent également l’effet stimulant de l’acidification du milieu sur
la synthèse de l’uréase chez S. pasteurii. En effet, une baisse du pH d’une unité pH provoque
une augmentation de près de 50 % de l’activité enzymatique spécifique. Cependant, les
mécanismes de cette régulation restent méconnus d’autant que S. pasteurii ne possède pas de
gène ureI.

Le pH joue donc un rôle important dans l’activation de la synthèse de l’uréase et plus

particulièrement dans certaines niches écologiques (Helicobacter pylori dans l’estomac).
Cette activation est possible grâce à la présence permanente d’urée qui, soit est produite au
niveau salivaire, soit diffuse à partir des muqueuses de la paroi des intestins. L’urée dégradée
permet de créer un micro environnement autour de la bactérie qui devient protecteur et
propice à sa croissance, grâce à la fabrication d’une nouvelle source d’ammonium qu’elle
délivre. Le pool d’azote jouerait alors un rôle nouveau et non négligeable dans la régulation
de l’uréase.

2. La régulation par l’urée.

La régulation de l’uréase par l’urée a été observée chez P. mirabilis. Chez ce micro-
organisme, l’augmentation de l’activité enzymatique, en présence d’urée, varie d’un facteur
de 5 à 25 par rapport aux témoins. Cette induction est spécifique à l’urée et non pas aux
analogues structuraux. Cette stimulation est conduite par un facteur de transcription positifs
de 34 Kda appelé UreR. Il appartient à la famille des facteurs positifs de transcription de type
hélice-coude-hélice tels que AraC, AppY, EnvY et le rhamnose (Nicholson et al., 1993 ;
Mobley et Haussenger, 1995).

39
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Chez les Enterobacteriaceae, l’uréase est inductible par l’urée via la

transcription du gène UreR qui synthétise la protéine régulatrice UreR. Ce facteur se fixe sur
une séquence d’ADN en amont du gène UreD pour permettre sa synthèse. Ce mécanisme de
fixation s’explique d’une part par la présence d’acides aminés tels que la leucine en position
C-terminale de la protéine (D'Orazio et al., 1993 ; Poore et al., 2001) et celles de molécules
d’urée. En effet, l’urée favorise l’activation de la transcription sur les séquences de
promoteur UrepR et UrepD (D'Orazio et al., 1995) ; elle empêche la fixation des protéines
répressives (H-NS) dans la région inter génique des gènes UreD et UreR. Cette région
renferme une séquence répétitive d’adénine appelée poly (A) track qui en absence d’urée,
favorise la formation d’une structure secondaire d’ADN à l’aide des protéines H-NS et donc
la répression de la transcription de l’uréase.

3. La régulation de l’uréase par le pool azoté chez les Entérobactéries.

L’ammonium chez les bactéries est la source préférée d’azote, elle est facilement
intégrée dans le métabolisme et permet de soutenir une croissance rapide. Les gènes non
actifs dans cette assimilation, comme la glutamine synthétase, seront réprimés (Merrick et
al., 1995). La régulation de l’uréase peut être contrôlée par le pool azoté de la cellule. Il
existe deux systèmes de régulations connus. Le premier concerne la régulation chez les
Enterobactériaceae, le second est représenté par B. subtilis pour les bactéries Gram (+).

Ce premier système de régulation dû au pool azoté Ntr (Nitrogen regulatory system) a

été identifié lorsque des bactéries appartenant aux genres Klebsiella, Escherichia, Salmonella
ont été placées dans des milieux riches en substrats carbonés, mais en présence d’une source
d’azote facilement assimilable tel que l’ion NH4+. Dans ces conditions, elles n’ont pas
synthétisé d’uréase. Cependant, lorsque les milieux deviennent carencés en azote avec encore
de faibles concentrations en acides aminés tels que la proline, l’arginine ou l’histidine, la
synthèse de l’uréase se trouve activée (Mobley et Haussenger, 1995). Ceci suggère aux
auteurs l’existence d’une voie plus complexe de régulation pour la synthèse de l’uréase. En
effet, l’assimilation des composants azotés peut-être divisée en deux voies métaboliques. La
première consiste en une assimilation de l’azote extracellulaire. Elle passe par l’expression
des enzymes telles que la GS (glutamine synthétase), la glutamate dehydrogénase (GDH) et
d’autres enzymes responsables du catabolisme de l’azote. La seconde voie d’assimilation est
intracellulaire et se fait à partir des molécules organiques. Ces deux voies dépendent de
l’organisme étudié, de la nature et de la quantité d’azote présente dans la cellule.

Ce système de régulation dû à l’azote repose sur 4 enzymes. Il permet, en fonction du

besoin de la cellule, d’assimiler l’azote extracellulaire et intracellulaire. La première enzyme
est l’uridyl transférase (UTase/UR) qui est codée par le gène glnD. Cette enzyme permet de
phosphoryler une protéine PII codée par un gène glnB en PII-UMP. Ces deux molécules sont
les principales responsables de la perception de l’azote intracellulaire par l’intermédiaire du
ratio glutamine - 2 cétoglutarate.
Lorsque l’azote n’est pas en concentration limitante, l’enzyme (UTase /UR) va
déuridyser la protéine PII pour permettre l’adénylation par l’ATPase de la glutamine
synthétase (GS) en GS-AMP codée par le gène glnA. Cette enzyme se trouve alors inactivée.
Ainsi l’enzyme UTase/UR et PII agissent comme des identifiants de l’azote intracellulaire.
Le gène glnA de la GS appartient à l’opéron glnAmtrBC qui code pour NtrC et NrtB. Ces
deux protéines interviennent directement dans le système de régulation de l’azote. Lorsque le
pool azoté diminue, le déuridalysation de PII cesse, ce qui permet à cette dernière d’activer
une enzyme NtrB (NR2) codé par le gène GlnL. La diminution de l’azote intracellulaire passe

40
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

par la diminution du donneur d’azote, c'est-à-dire la glutamine. Ceci provoque la

phosphorylation de NtrC et l’induction de la transcription de nombreux gènes tels que
l’opéron uréase.

Les promoteurs azote-dépendant responsables de la synthèse de l’uréase se situent en

amont du codon start du gène UreD. Cette zone a été identifiée comme susceptible de se lier
aux facteurs σ A et σ 70. D’autres protéines telles que NAC, interviennent dans la régulation
de l’uréase. Elle fait partie de la famille des Lys R, régulateurs positifs de type hélice coude
hélice, exprimés par un promoteur à l’aide du facteur sigma 54. Cette protéine est sous le
contrôle du système Ntr et s’associe avec le facteur sigma (σ70) pour favoriser son accroche
sur les promoteurs sigma (σ70) dépendants des gènes du système Ntr. Ainsi le facteur NAC
est capable de s’associer sur une séquence légèrement en amont du gène UreD chez K.
pneumoniae, P. aeruginosa (Merrick et al., 1995) ce qui permet des niveaux plus élevés de
synthèse d’uréase.

4. La régulation de l’uréase chez les bactéries Gram (+), le modèle de B.

subtilis.

Le modèle trouvé chez B. subtilis présente un grand intérêt, car cette bactérie est
taxonomiquement très voisine de S. pasteurii.

4.1. L’implication du pool de carbone cellulaire.

L’activité de la cellule est gérée par les voies métaboliques de la glycolyse, du cycle
des pentoses phosphates, du cycle de Krebs et du cycle 2-oxoglutarate-glutamate-glutamine.
Ces trois cycles du métabolisme sont contrôlés par des protéines régulatrices. En effet, en
fonction de la composition du milieu de culture et de l’état physiologique de la cellule, trois
protéines vont intervenir : CcpA, CodY et TnrA. Ces protéines de régulation globale sont
capables de contrôler l’expression de nombreux gènes et opérons à partir de signaux
spécifiques intracellulaires et environnementaux. Par exemple, la protéine CcpA active de
manière directe ou indirecte de nombreux gènes du métabolisme carboné notamment dans la
glycolyse. Un contrôle plus global est accompli par la protéine CodY. Elle présente une
action directe sur de nombreux gènes du métabolisme carboné et azoté, mais également sur
les gènes responsables du transport, de la sporulation et de l’acquisition de la compétence. La
protéine CodY est très fréquente chez les bactéries gram (+) à faible GC % (Sonenshein ,
2007), et c’est le cas pour S. pasteurii qui a un GC % de 39 (Yoon et al., 2001). La protéine
CodY intervient de manière très active en se liant à l’ADN, cette fixation est facilitée
lorsqu’il y a présence de GTP et/ou de petites chaines d’acides aminés (BCAA). Quant à la
protéine TnrA, son action est indirecte auprès des gènes responsables du métabolisme azoté
notamment sur l’activation de la transcription de l’uréase en condition de stress azoté. Chez
[Link], la synthèse de l’uréase est intégrée dans la régulation du métabolisme azoté et
carbonaté. Son fonctionnement est étroitement contrôlé par le besoin global énergétique
(GTP) et nutritif (BCAA) de la cellule (Fisher et al., 1999 ; Sonenshein, 2007).

41
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

4.2. L’implication du cycle de la glycolyse.

Lorsque la cellule est en excès de glucose, S. subtilis va le dégrader

préférentiellement jusqu’au pyruvate et à l’acétyl-CoA. Le flux de carbone est ensuite dirigé
vers la synthèse de produits tels que l’acétate, le lactate et l’acétoïne. Ces métabolites sont
rejetés en dehors de la cellule dans le micro environnement. Les enzymes responsables de la
fabrication de ces produits de fermentation sont stimulées par l’action de CcpA et CodY dans
un premier temps. En effet, plus le pool d’énergie chimique intracellulaire GTP est
important, moins il est nécessaire de produire de l’énergie chimique. De la même manière,
les BCAAs permettent à la protéine régulatrice Cody d’évaluer l’état du pool intracellulaire
en acides aminés. L’ensemble de ces informations conduisent à l’activation des voies de
fermentation. Une fois le glucose disparu dans le milieu, les enzymes (lactate
déshydrogénase, l’acétate kinase et acétoïnase) vont être deréprimées pour permettre aux
métabolites de réintégrer la cellule pour poursuivre le cycle complet d’oxydation. Cette levée
d’inhibition est activée par ces mêmes protéines de régulation et leurs interactions avec GTP,
BCAA et FBP.

4.3. L’implication du cycle de Krebs.

Le cycle de Krebs possède également son propre système de contrôle, activé et régulé
par les mêmes protéines régulatrices (CcpA, CcpC et CodY). Ainsi, la production d’acides
tricarboxyliques (TCA) produit par le cycle de Krebs est réprimée en phase de croissance
lorsque le milieu de culture est riche en substrats carbonés. Ce sont en effet, des cascades de
réactions complexes qui s’opèrent, lorsqu’il y a accumulation de GTP, d’isoleucine ou bien
de valine dans la cellule.
La concentration de ces acides aminés (Valine, isoleucine) diminue lorsque la bactérie
se trouve dans un environnement nutritionnel plus pauvre, par exemple en fin de phase
exponentielle et au début de la phase stationnaire. A ce moment, l’AbrB, une autre protéine
spécifique de régulation entre en action. Elle réprime l’expression de nombreux gènes et par
contre stimule l’action de TnrA. Ceci permet l’activation de gènes ayant un rôle dans le
métabolisme azoté (Sonenshein, 2007). C’est notamment le cas pour les gènes de l’opéron
UreABC (Fisher et al., 1999).

4.4. La régulation à l’intersection des métabolismes carbone et azote.

La protéine de régulation globale, TnrA, agit sur de nombreuses enzymes au niveau

du carrefour métabolique carbone - azote. Cette intersection métabolique est représentée par
trois enzymes :
1. la glutamate synthétase (GOGAT) qui permet la formation de glutamate à partir
2-cétoglutarate et de l’ammonium,
2. la glutamine synthétase (GS) qui autorise la synthèse d’un autre acide aminé, la
glutamine, elle-même, synthétisée à partir du glutamate et de l’ammonium,
3. la glutamate déshydrogénase (GDH) qui produit du glutamate à partir du 2-
cétoglutarate et du NH4+.

Sont là représentées les principales voies biochimiques de l’assimilation de l’azote

sous sa forme réduite dans la cellule. Le glutamate et la glutamine sont des acides aminés

42
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

clés, car ils sont donneurs de groupements amines dans les réactions de transamination.
Quant au 2-cétoglutarate, c’est un produit intermédiaire du cycle de Krebs qui est aussi à
l’intersection du métabolisme carbone – azote. Ce métabolite sert de squelette carboné à de
nombreux autres acides aminés. Il permet de renseigner la cellule sur le niveau de son pool
azoté.
L’entrée de l’ammonium chez S. pasteurii se réalise par une diffusion sous sa forme
ammoniacale. Il intègre le métabolisme obligatoirement via la glutamate déshydrogénase
(GDH), en effet, les enzymes GOGAT et GS n’ont pas été détectées chez S. pasteurii
(Morsdorf et al., 1989). Chez B. subtilis, la protéine régulatrice TnrA réprime l’activité
enzymatique de GOGAT et GS. Cette inhibition de la synthèse s’opère en particulier lorsque
les cellules tentent de croître sur un substrat azoté difficilement métabolisable. En contre
partie, la TnrA active d’autres gènes tels que la nitrate réductase avec nasBC , NasDEF et les
gènes ureABC (Fisher et al., 1999 ; Sonenshein, 2007). Cette stratégie permet à la souche de
garder l’accès à une source d’azote. Cette régulation positive est stoppée lorsque la teneur en
glutamine intracellulaire est suffisante, car la glutamine est l’acide aminé par excellence
donneur de groupes amines. L’état de son pool renseigne la protéine CodY sur le besoin de la
cellule en source azoté. Elle inhibe la GOGAT et la GS lorsque les conditions de culture sont
riches. Cette répression pourrait expliquer l’absence de GS et de GOGAT chez S. pasteurii
(Morsdorf et Kaltwasser,1989).

Lorsqu’il y a appauvrissement de la source de carbone notamment du glucose,

l’enzyme (GDH) régulée par une protéine régulatrice spécifique, RocR, permet de convertir
le glutamate en 2-oxoglutarate ce qui autorise alors la synthèse de nombreux acides aminés.
Or, le gène rocG (GDH) qui est situé en amont de l’opéron rocABC, est impliqué dans le
métabolisme de l’ornithine et de la proline. Il est, par ailleurs, co-régulé par l’opéron rocABC
en une action commune de RocR et de l’ornithine. Deux promoteurs permettent la régulation
de ces opérons. Le premier qui est en amont du gène roc A et en aval de roc G, nécessite la
présence de la protéine RocR et de l’ornithine pour assurer une forte transcription et une
inhibition de la glutamate synthétase (GS). Par contre lorsque l’ornithine est absente, le
second promoteur qui est en amont du gène rocG, permet d’assurer la transcription du gène
Roc G, mais elle est faible et de type constitutif.

La seconde régulation de l’entrée de l’azote dans la cellule intervient dans des

conditions de milieu riche avec présence de glucose. La source carbonée permet la synthèse
du pool de FBP. Ce métabolite prévient la protéine régulatrice CcpA qu’il y a un stock
suffisant de molécules carbonées. Cette dernière va alors inhiber l’action de RocR en
réprimant l’expression du gène RocR. L’inhibition de cette enzyme empêche la formation du
2-oxoglutarate et d’autres acides aminés, car ils sont des sources alternatives de carbone et
d’azote (Sonenshein, 2007).

4.5. La carence azotée et la régulation de l’uréase.

Lorsque les conditions de culture sont toujours satisfaisantes, la protéine régulatrice

CodY est également associée à la régulation globale de l’azote dans la cellule. Elle a été
identifiée comme ayant une action de répression sur l’expression des gènes du métabolisme
azoté (BACC, histidine, arginine), sur les transporteurs d’acides aminés, peptides, sucres et
sur le gène ureABC (Sonenshein, 2007). Cette protéine gère aussi l’excès de glucose en
activant les voies métaboliques de décongestion c'est-à-dire, les voies de la fermentation et
de la synthèse de la guanine. La répression elle, concerne l’assimilation des acides aminés ou

43
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

plus exactement une sélection des acides aminés nécessaires au cours de la croissance. En
effet, lorsque les milieux de culture sont riches, la cellule par l’intermédiaire de CodY va
effectuer un choix d’assimilation des acides animés. Ainsi durant la phase de croissance
exponentielle l’arginine, la glycine et la proline sont privilégiées. La phase stationnaire
favorise elle, l’assimilation de l’isoleucine, de la thréonine et de la valine (Fisher et al.,
1999).

En synthèse, la clé de la régulation entre les différentes voies métaboliques repose

sur la notion de pools de métabolites ou d’énergie (GTP). Ils indiquent l’état physiologique
de la cellule. Le pool des acides aminés peut être représenté par des petites chaines d’acides
aminés appelé BCAAs. Elles sont codées par 4 gènes IlvA, IlvD, IlvBHI et LeuABCD et
régulées de la manière suivante :
1. CodY inhibe IlvA,
2. CodY et CcpA travaillent ensemble pour réprimer ou activer les gènes
responsables
des enzymes clés lors d’un excès de carbone,
3. CodY et CcpA travaillent de manière antagoniste quant à la biosynthèse de
BCAAs,
4. TnrA est inhibée dans le cas d’un excès de carbone et active en cas de
carence d’azote.

La synthèse de BCAA nécessite quatre acides aminés, l’aspartate, la thréonine la

valine et l’isoleucine. Cette voie de bio synthèse est au carrefour d’autres voies telles que les
acides α céto isovalériques qui sont les précurseurs des acides gras, les acides pantothéniques
et les coenzymes. Ce pool de BCAA est à son maximum lorsque les milieux de culture sont
riches. Dans ces conditions d’abondance, CodY inhibe la synthèse de BCAAs au niveau du
gène IlvB, les pools BCAAs, GTP et ATP renforcent l’action de CodY pour favoriser le flux
de carbone vers le métabolisme de fermentation. Par contre, lorsque la qualité du milieu
diminue, avec une carence en source d’azote, la synthèse des protéines ne peut plus se
réaliser convenablement. En effet, au cours de la transcription, l’apparition d’un ARNt sans
acide aminé, bloque le site A du ribosome. Ce processus enclenche la fixation d’une protéine
sur le ribosome et provoque la synthèse de pppGpp puis de ppGpp pour finalement bloquer la
transcription de nombreux gènes. De manière concomitante, le pool énergétique (GTP)
diminue. L’ensemble de ces processus favorise d’autres voies métaboliques, notamment
l’induction de la synthèse de l’uréase au niveau du gène UreABC à l’aide de la protéine de
régulation globale TnrA. Ces mécanismes se déroulent lorsque les conditions deviennent
défavorables pour la croissance.

En milieu carencé en azote, la synthèse de GlnR est inhibée et sa répression se fait

donc moins forte sur TnrA. Ceci lui permet de se fixer de nouveau sur les séquences
spécifiques de régulation TnrA/GlnR qui contrôlent les voies alternatives d’assimilation de
l’azote, comme le catabolisme des purines. Ce chemin va indirectement stimuler la synthèse
de l’uréase (Cruz-Ramos, 1997 ; Fisher et al., 1999). De plus, en condition de stress azoté,
PucR, une protéine de régulation spécifique de la voie catabolique des purines rentre en
action (Brandenburg et al., 2002). Elle permet la stimulation de la synthèse de l’uréase car,
les différentes étapes du catabolisme des purines permettent la dégradation de l’alanine vers
l’urée en passant par l’allantoïne. La dégradation de l’urée nécessite l’activation du gène
UreABC au niveau du promoteur P3 de ce gène par la protéine régulatrice PucR. Elle permet
à la cellule de se procurer une source d’azote sous forme d’ammonium. (Schultz, 2001 ;
Beier, 2002). Le promoteur P3 possède deux séquences TnrA/GlnR box

44
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

(5’TGTNAN7TNACA-3’) sur lesquelles peuvent se fixer TnrA et la protéine GlnR ; entre

ces deux séquences, PucR améliore l’accroche du facteur sigma (Guo et al., 2007). Ainsi
donc, l’expression de la synthèse de l’uréase est améliorée lors d’une carence en azote, par
un effet de coopération entre les protéines pucR et TnrA (Brandenburg et al., 2002). Par
contre, en excès d’azote, l’interaction directe entre TnrA et GlnR empêche toute ouverture
vers des voies alternatives d’assimilation de l’azote notamment par le biais de l’uréase
(Schultz et al., 2001 ; Beier et al., 2002).

Cette régulation positive de l’opéron UreABC via le promoteur P3 est donc

grandement améliorée durant la fin de phase exponentielle et au début de la phase
stationnaire lorsque la source d’azote vient à manquer et l’action de GlnR limitée.

45
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

[Link] RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES SUR LA CRISTALLOGRAPHIE

DU CARBONATE DE CALCIUM.

1. La nucléation et la croissance cristalline du carbonate de calcium en

condition abiotique.

1.1. Considérations générales.

La précipitation du carbonate de calcium est sous le contrôle de 4 grands facteurs

physico chimiques : (i) la concentration en ions Ca 2+ dans l’environnement, (ii) la quantité
de carbone inorganique dissous (DIC), (iii) le pH élevé et (iv) la disponibilité des sites de
nucléation et leur nature. En effet, la croissance par exemple, d’un cristal de carbonate de
calcium, est conditionnée d’une part, par le transport des ions (Ca 2+ et C03 2-) vers sa
surface et d’autre part, par les réactions qu’ils peuvent avoir avec elle (adsorption, échanges
d’ions, convection) (Sigg et al., 2006). Ces mécanismes sont les principaux facteurs
limitants de la croissance cristalline. Au niveau du transport ionique, il s’établit un
équilibre d’interface entre le liquide qui apporte les ions et la surface du cristal.
La vitesse de croissance est donc directement liée à l’état d’agitation des liquides
environnant le cristal. Habituellement dans l’environnement, la vitesse de croissance
cristalline est limitée essentiellement par la vitesse des réactions de surface car elle est
extrêmement faible. C’est donc, au niveau du réseau cristallin que se déterminent les
vitesses de fixation ou de dissolution des cristaux. Ces réactions peuvent être quantifiées
par la mesure de la sursaturation du milieu ( ) qui obéit à la loi suivante :
( ) = ((Ca2+)t (CO32-)t)/Kso [n°6]

( ) = ((Ca2+)t (HCO3-2)t(H2CO3-1)t /Kso K1 K2-1[n°7]

où Kso est le produit de solubilité de CaCO3, K1 et K2 les constantes d’acidité de H2CO3 et

() les activités effectives au temps t [M] (Stumm and Morgan, 1996 ; Sigg et al., 2006).

La vitesse de croissance cristalline dépend de la surface disponible et de la

concentration des ions concernés. Ainsi, la croissance se fait en couche mononucléaire
lorsque la sursaturation est faible. Par contre, elle est polynucléaire lorsque la sursaturation
est élevée ; c’est-à-dire, qu’il y a apparition de nouveaux sites de nucléation avant même
que la croissance cristalline précédente ne recouvre totalement la surface du cristal.

1.2. La nucléation du carbonate de calcium.

Les sites de nucléation sont des surfaces qui favorisent les liaisons potentielles entre
les ions calcium et les ions carbonates. Ces surfaces peuvent être des arêtes ou des défauts
du cristal en croissance ou bien de la matière organique. La première étape de la
cristallisation du carbonate de calcium est la formation d’un nucléus ou germe. Le nucléus
est un ensemble de quelques atomes de calcium et de carbonate plus ou moins organisés en
un réseau cristallin. Dans le cas du carbonate de calcium, il peut se constituer à pression
atmosphérique et à des températures compatibles avec la vie. La surface peut être
homogène ou hétérogène selon les conditions dans lesquelles se forment les nucléus.

46
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Lorsque ceux-ci s’assemblent sur une surface étrangère (de composition différente), elle est
dite hétérogène. Ce phénomène est très courant dans l’environnement et peut–être initié à
partir d’une substance organique (Mitchell et Ferris , 2006 ). Par contre, une nucléation
homogène se produit lorsque la solution est homogène, sans particules, en condition de
fortes sursaturations ( = 10). Ceci est possible lorsque des cristaux de calcite deviennent
eux même de nouveaux sites de nucléation. La nucléation homogène nécessite la formation
d’un germe qui se construit de façon aléatoire en fonction du mouvement brownien et de
l’énergie d’interface. Le volume du germe est défini par la formule suivante :
∆Gv = 4/3 πr3 x ∆Gv/Vm, [n°8]

où Vm est le volume molaire, soit ∆Gv = 4 πr2γ avec γ la tension inter faciale.
Il y a compétition entre ∆Gs et ∆Gv ce qui donne la formule ∆Gn = ∆Gs - ∆Gv. Le
passage par un maximum quand la dérivée de ∆Gn/r s’annule donne alors le rayon critique
rc = 2 γvm/∆Gv. Ce point correspond à un niveau d’énergie d’activation de la nucléation
homogène noté ∆Gc. Ainsi, la formation d’un germe est stable quand r > rc.

Les interfaces favorisent les échanges de coordination entre les ions calcium et les
ions carbonates pour former un noyau stable (Sigg et al., 2000). La structure des surfaces
cristallines sert de catalyseur et facilite l’agencement des ions et ceci d’autant plus efficace
lorsque les ions sont similaires aux cristaux formés. Les ions du cristal sont donc absorbés
spécifiquement. Ceci est dû au fait que l’énergie libre nécessaire à la nucléation d’un cristal
est contrôlée thermodynamiquement par l’énergie libre de la solution et celle de l’interface
correspondant à la phase solide. Cette dernière est plus faible lorsqu’il s’agit du même
cristal formé.

1.3. La cinétique de la croissance du carbonate de calcium.

La vitesse de précipitation ou vitesse de croissance peut être exprimée par

l’équation suivante :
R= d[CaCO3] = d[Ca 2+ ] [n°9]
dt dt

Ceci signifie que la réaction est d’une part proportionnelle à la surface du noyau de calcite,
c'est-à-dire au nombre de sites actifs de croissance, autrement dit, à la surface du cristal en
croissance et d’autre part à la concentration des espèces (H2CO3, HCO3-, CO32-, Ca2+)
participant à la formation de la calcite.
k1
Ca 2+ + HCO-3 CaCO3 (s) + H+ R1
k’1

k2

Ca 2+ + CO2-3 CaCO3 (s) R2

k’2

k3
2+
Ca + 2HCO-3 CaCO3 (s) + H2CO3 R3
k’3

47
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

La vitesse totale déduite est donc : R tot = R1 + R2 +R3 avec :

R1 = k1 [Ca2+ ] [HCO-3]-k’1[H+], [n°10]
R2 = k2 [Ca2+ ] [HCO-3]-k’2 , [n°11]
R3 = k3 [Ca2+ ] [HCO-3]2 -k’3[H2 CO3]. [n°12]

Les valeurs ki s’expriment en cm2 de surface de calcite par cm3 de solution. Si la

croissance est suffisamment éloignée de l’équilibre, la réaction inverse peut être négligée.
La réaction devient :
Rtot = k1 [Ca2+] [HCO-3] + k2 [Ca2+] [CO3-] + k3 [Ca2+] [HCO3-] [n°13]
Or, l’équation R3 n’est significative que lorsqu’il y a sursaturation dans une eau à
pH faible. Elle peut être négligée dans le procédé de bio minéralisation et l’équation de la
vitesse totale devient :
Rtot = k1 [Ca2+] [HCO-3] + k2 [Ca2+] [CO3 2-] [n°14]

Ces constantes sont dépendantes de la température (Ferris, 2003) ainsi la constante

de précipitation de la calcite est de 0.17 µmole/l/jour à 10° C et passe à 0.16 µmole/l/jour à
20° C.

1.4. La formation du carbonate de calcium.

Il existe six formes différentes de carbonate de calcium, le carbonate de calcium

amorphe (CCA), les carbonates de calcium hydratés comme le carbonate de calcium
hexahydraté et monohydraté (vatérite) et les formes anhydres de carbonate de calcium que
sont l’aragonite et la calcite.
Le carbonate de calcium (CaCO3) est un cristal polymorphe et ses trois principales
formes (aragonite, calcite et vatérite) ont des symétries différentes. Ces cristaux ont donc
des compositions chimiques identiques mais des structures cristallines différentes. Ainsi, la
calcite qui possède une structure de type rhomboédrique thermodynamiquement entre 0 et
90° C à la pression atmosphérique, est plus stable que les autres types de cristaux comme
l’aragonite (orthorhombique) et la vatérite (hexagonale). Les arrangements moléculaires
des cristaux régissent leurs propriétés physico-chimiques, telles que la réfringence, la
dureté et la solubilité. Ainsi, la vatérite est un cristal de carbonate de calcium métastable.
Elle subit des réarrangements pour se stabiliser en calcite sans passer par la formation
d’aragonite, cette dernière étant elle aussi une forme instable bien que dans une moindre
mesure. Ainsi, les cristaux de carbonates de calcium les plus abondants sur la planète sont
de type calcite et aragonite, ceci étant dépendant de leur solubilité. En effet la formation
des carbonates de calcium et leur maintien dépendent du coefficient de solubilité. Il ne peut
être déterminé que sur les cristaux les plus stables, la calcite et l’aragonite. Leur solubilité
est déterminée par Ks0(A) (mole par unité de surface) d’après la formule suivante :

Ln Ks0(A) = Ln Ks0(A=0) + ((2γA)/(3RT)), [n°15]

avec Ln Ks0(A) la solubilité à l’équilibre avec une surface molaire de A = 0, γ l’énergie

d’interface solide/liquide (0.096 joules.m-2), R la constante des gaz parfaits et T la
température en Kelvin (Mitchell et Ferris, 2006). Ceci signifie que la vitesse de la
précipitation de CaCO3 est une fonction du diamètre du cristal. Ainsi les cristaux de plus

48
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

petites tailles auront une énergie libre de surface plus élevée que les gros cristaux ce qui les
rend donc moins stables et donc plus solubles.

La précipitation du carbonate de calcium provoque dés son début, la formation

concomitante de deux phases, l’une amorphe et l’autre solide. La structure amorphe
(hydroxyde de calcium, CCA) s’organise progressivement en structures cristallines telles
que la vatérite, l’aragonite et la calcite de plus en plus stables et de moins en moins
solubles (Clifford et Chen, 1995 ; Kabasci et al., 1996 ;Abdel et al., 2002, Nehrke et al.,
2006). Cette transformation, à 20-25° C sous une pression d’une atmosphère peut prendre
de 6 à 10 heures. Il est courant en fonction des conditions de précipitation d’obtenir de
cristaux de vatérite ayant des morphologies agrégatives, par exemple framboïdes, avant de
devenir de la calcite rhomboédrique. L’aragonite est moins courante que la calcite,
puisqu’elle possède un produit de solubilité plus faible. (Gutjahr et al., 1996 ; Nehrke et al.,
2006).

1.5. Les facteurs influant sur le couple nucléation-cinétique dans la

formation de cristaux de carbonate de calcium.

Le couple « nucléation-cinétique » est le moteur de la formation des cristaux et de

leur morphologie. Ainsi, les conditions environnementales qui contrôlent l’un ou l’autre de
ces paramètres favorisent-elles l’apparition des cristaux ainsi qu’une multitude de
morphologies. Ainsi, plus l’indice de sursaturation (S ou ) sera élevé, plus nombreux
seront les sites de nucléation et plus grande sera la vitesse de croissance cristalline. En effet
la croissance cristalline est liée au nombre de sites actifs à la surface des cristaux en
croissance. Le ratio entre le taux de nucléation et la vitesse de croissance permet de déduire
la taille et le nombre de cristaux (Clifford et Chen, 1995 ).

Les forts indices de sursaturation permettront la formation de cristaux plus

nombreux et de plus petites tailles. Cette relation entre la nucléation et la croissance
cristalline a été étudiée dans le cadre de la synthèse des nano particules de calcite, les
cristaux de petites tailles, en inhibant la croissance cristalline (Aizenberg et al., 2000 ; Lin
et al., 2002).

D’après Abdel-Aal et al. (2003), les conditions de sursaturation sont déterminantes

pour la nucléation et la croissance, l’adhésion et la morphologie. En effet, lorsque la
nucléation apparaît en solution sursaturée, les auteurs décrivent trois séquences
d’évènements. La première séquence rassemble deux événements, la formation d’un
nucleus de carbonate de calcium amorphe (CCA) et quasi simultanément sa transformation
en vatérite et en calcite. C’est durant cette phase que l’adhésion sur le nucléus initial, de
nouveaux cristaux, se réalise sans que l’indice de sursaturation ne baisse significativement.
Ces cristaux amorphes sont au début de petites dimensions, inférieures ou égales à 1 µm
pour atteindre 10 µm. A la fin de la première séquence, ils se transforment en vatérite (62
%) et en calcite (38 %) en quelques dizaines de minutes. La seconde séquence est marquée
par une chute de l’indice de sursaturation et par une augmentation de la masse des cristaux
de calcite. Il y a en effet un réarrangement cristallin de la vatérite en calcite. Cette
transformation peut prendre quelques minutes à quelques heures (6 heures). La fin de cette
phase est marquée par une deuxième chute de l’indice de saturation.

La troisième séquence commence lorsque la vatérite a complètement disparu. Les

cristaux sphériques disparaissent au profit des cubiques. Il n’y a plus de formation de

49
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

cristaux d’aragonite. En effet, son taux de croissance augmente moins rapidement que celui
de la calcite. Il peut y avoir dans les conditions de sursaturation où S-1 = 0 un phénomène
de dissolution de l’aragonite pendant que la calcite continue à croître (Gutjahr et al., 1996).
De plus, d’après Domingo et al. (2004), la pression atmosphérique (1 bar ou 104Pa), qui
peut être considérée comme une faible pression, et les températures ambiantes (T = 25° C),
à partir d’une solution d’hydroxyde de calcium avec un ratio (CO32- / Ca 2+ ≈ 1), favorisent
d’une part, les cristaux de calcite et d’autre part, amènent à l’apparition de cristaux plus
volumineux que ceux obtenus à des températures et à des pressions élevées.

D’après Abdel-Aal et al., (2002), l’impact de la dynamique des fluides est

importante sur les processus de nucléation et de croissance cristalline. Ainsi en milieu
agité, il y a en général une diminution de la nucléation et de l’efficacité de la croissance.
Ces phénomènes sont accentués lorsque les concentrations en calcium augmentent. Par
contre, certaines zones dans un environnement dynamique sont propices à la calcification,
car elles sont soumises à de plus faibles agitations, ce qui favorise l’adhésion et la
croissance cristalline. En effet, le maximum de calcification a été obtenu lorsque le flux est
perpendiculaire à la surface de l’obstacle au niveau des angles du support. Cette tendance a
été également observée avec du sable au cours d’une injection en flux continu. En effet,
selon Stedtfield (2003) ; Stoner et al. (2005) la calcite précipite plus favorablement derrière
les obstacles en raison de moindres turbulences et d’une plus grande disponibilité en ions.
L’accessibilité et la disponibilité des ions en milieu poreux est le facteur limitant de la
croissance cristalline. L’espace poreux détermine donc non seulement leur volume mais
aussi leur nombre.

La nucléation et la croissance peuvent être inhibées par la présence d’ions

interférents (Mg2+, Sr2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+ et NH4+) (Sohnel et al., 1990 ; Gutjahr et al.,
1996 ; Lebron et Suarez, 1996 ; Zhang et Dawe, 2000 ; Ferri et al., 2003). Une étude de
Parsiegla et Dawe (2000) montre l’action inhibitrice des ions Cu2+, sur la nucléation et la
croissance cristalline dans les conditions de sursaturation. Elle ne correspond pas à une
simple fonction de la quantité totale de cuivre ou d’ion cuivre dissous, mais plutôt à la
formation de complexes bi ou tri nucléaires de cuivre qui peut apparaître en condition de
sursaturation avec des pH entre 8 et 9. Il se forme, ainsi, des complexes d’hydroxydes de
cuivre ou de carbonate. Ces derniers sont les véritables responsables de l’inhibition de la
croissance cristalline du carbonate de calcium. La précipitation passe d’une croissance
cristalline en forme de couche, pour devenir en présence de cuivre une croissance dominée
par des réactions de nucléations.

Les phénomènes d’inhibition apparaissent également en présence de molécules

organiques et des parois cellulaires. Leur première action est de chélater les ions calcium et
donc de réduire la concentration en ions Ca2+ et de ce fait leur disponibilité pour la croissance
cristalline. Ce phénomène est capital lorsque les concentrations en sels de calciums sont
faibles (Ehrlich et al., 1999 ; Friis et al ., 2003).

L’introduction d’ions ammonium dans le milieu favorise localement des zones

super saturées et à pH élevé. Ces paramètres conduisent à la formation de nucléus
favorables à la croissance de cristaux de type vatérite en une organisation en agrégats. Ces
conditions inhibent la transformation de vatérite en calcite. En effet, l’effet du pH est
directement responsable de la spéciation et des formes chimiques des carbonates. A ce pH
élevé (10) et en sursaturation, c’est la formation de la vatérite qui est favorisée car ce sont

50
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

les ions CO32- qui sont majoritaires. Par contre, lorsque le pH diminue pour atteindre 8, la
nucléation favorise les ions HCO3- qui permettent des réarrangements pour former
préférentiellement une structure cristalline rhomboédrique.

Les effets de la température sont liés de manière positive sur les processus de
nucléation et de cinétique cristalline en accord avec le diagramme pression-température. En
effet la cinétique de précipitation du carbonate de calcium est proportionnelle à
l’augmentation de la température. Ceci a été vérifié sur une gamme de température entre 10
et 50° C en présence de solution contenant entre 2.5 g et 90 g /l de calcium (Nemati et al.,
2005 ; Mitchell et Ferris, 2006 ).

2. L’influence de la matière organique sur la morphologie du carbonate de

calcium.

De très nombreuses études montrent l’influence de la présence de matière organique

lors de la croissance cristalline du carbonate de calcium en conditions abiotiques, et en
particulier sur la morphologie des cristaux. D’après Ferris (2006), c’est non seulement la
matière organique de très petite taille sous forme dissoute (<10 KDa) qui est impliquée,
mais aussi dans une moindre mesure, la matière organique particulaire comme la surface
d’une bactérie. En effet, les macromolécules, à faible concentration (0.1 à 0.5 % du poids
du biominéral) influencent grandement la croissance cristalline (Xie et al., 2005). Au-delà,
il peut y avoir empoisonnement du mécanisme catalytique de cristallisation. Ces
macromolécules diminuent le taux de précipitation car elles se complexent avec des cations
en réduisant ainsi leurs concentrations (Kitano et Hood, 1965 ; Meldrum et Hyde, 2001 ;
Bosak et al., 2004 ; Bosak et Newman, 2005). La présence de matière organique peut selon
Ferris (2003) réduire d’un facteur deux la vitesse de précipitation.

Ainsi, des cristaux aux morphologies complexes, comme des rhomboèdres avec des
« effets de marche » ont été obtenus et observés en présence de CaCl2, d’urée et d’uréase
purifiée (Sondi et Matijevic, 2001). Il s’agit là d’une production biologique. L’influence de
la surface protéique de l’uréase purifiée de S. pasteurii et de Canavalia ensiformis, a été
étudiée de manière plus approfondie. La différence entre ces deux enzymes provient de leur
structure primaire qui ne présente pas la même teneur en acide aspartique et en acide
glutamique. La structure tertiaire ne sera donc pas la même. Ainsi, l’uréase purifiée de S.
pasteurii favorise la précipitation de la vatérite alors que la calcite est dominante avec
l’enzyme de Canavalia ensiformis. L’uréase de S. pasteurii qui présente une structure tri
dimensionnelle plus complexe permet des interactions plus grandes avec ces deux acides
aminés largement présents à la surface de cette enzyme.

D’autres observations ont montré que l’acide aspartique et l’acide glutamique

contrôlent directement la formation des cristaux de vatérite. Les ions calcium interagissent
fortement avec les groupements carboxyliques de ces acides aminés pour former des
complexes multiples. Ceux-ci pilotent la formation de cristaux polymorphes (Samata et
Venus, 1998 ; Tong et al., 2004). D’autres acides aminés semblent être également
impliqués dans le contrôle de nucléation et de croissance cristalline. D’après Xie et al.
(2005), un mélange d’acide aminé (Cystéine, tyrosine, acide aspartique et lysine) avec un
rapport Ca++/Mg++ variant de 1 à 4, conduit à la formation d’un maillage qui guide la
précipitation du CaCO3 en vatérite, aragonite et calcite. Les auteurs ont obtenu une
sphérisation des particules de carbonate de calcium en fonction de la nature des acides

51
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

aminés. Ainsi, la cystéine semble avoir peu d’impact sur la structure et donne des
carbonates de calcium sous forme de cristaux de calcite. La tyrosine quant à elle, œuvre
vers une légère sphérisation des cristaux. Ce phénomène est accentué en présence d’acide
aspartique et surtout de lysine.

La bio minéralisation est contrôlée et stabilisée par la présence d’acides aminés.

Leur proportion est variable selon qu’il s’agit de calcite ou de vatérite. La cystéine n’est
pas incorporée systématiquement dans la calcite. Quant à la tyrosine, elle est incorporée
aussi bien dans les cristaux de vatérite et de calcite. L’acide aspartique est lui présent dans
80 % des cas dans la vatérite et lysine dans 95% .

Une multitude de morphologies différentes en calcite et en aragonite ont également

pu être obtenues en présence d’additifs tels que les ions magnésium, l’acide malique ou
citrique. Des formes de cristaux aussi diverses que des rhomboèdres, des doubles fagots,
des écailles triangulaires et des phénomènes d’agrégation ont été observées. Cette matière
organique favorise les bonnes liaisons électrostatiques et permet une complémentarité
structurale et stéréochimique. En effet, les acides aminés proposent des sites de nucléations
au calcium et abaissent les énergies d’activation (Xie et al., 2004).C’est le résultat d’une
alternance de mécanismes d’absorption sur certaines surfaces du cristal provoquant des
inhibitions de la croissance et nucléation. Ces mécanismes extrêmement spécifiques
favorisent l’élongation de certaines faces dans une direction donnée (Meldrum et Hyde,
2001). L’élongation des cristaux peut être contrôlée par la structure secondaire des
protéines, telles que les hélices α. Elles vont se fixer préférentiellement sur une des
surfaces des cristaux et permettent une croissance unidirectionnelle du cristal en lui
donnant une forme « d’accordéon ».

En 2000, Aizenberg a montré qu’il est possible de contrôler la précipitation du

carbonate de calcium en créant des microenvironnements à l’aide d’empreintes produisant
des régions favorables ou défavorables à la nucléation et, cela à l’aide de deux types de
macromolécules. Le premier type possède à son extrémité des groupes carboxyliques et
donc une forte charge négative, propice à la nucléation. Le second groupe de
macromolécules est lui porteur de fonction méthyle. Ce contrôle simultané du micro
environnement et de la nanostructure des sites de nucléation permet de manipuler des
gradients de concentration proches de l’interface. Ces phénomènes sont rendus possibles
par la présence de matière organique durant les processus de nucléation et de croissance
cristalline (Addadi et al., 2003).

L’occurrence élevée de cristaux de vatérite est surprenante car la vatérite est stable
seulement aux températures inférieures à 10° C sous une atmosphère (Albright et al.,
1971). La formation et la stabilisation de la vatérite sont indissociables de la présence
biologique. En effet, la production de vatérite est favorisée notamment en présence de
polymères de polysaccharides telle la chitine. Celle ci possède une polarité qui permet des
interactions avec les ions calcium. La cinétique de précipitation dans le cas de la chitine est
d’ordre 2. Ceci suggère un processus contrôlé par des mécanismes de diffusion.
D’autres polymères de sucres tel que l’acide alginique possèdent la propriété de
diminuer fortement l’action des ions Mg 2+ au profit des ions Ca 2+. Ce polymère joue ainsi,
un rôle actif comme trame de la cristallisation de la calcite. Il oriente la croissance
cristalline et donc la morphologie des cristaux. Selon Wei et al. (2007) l’utilisation
séquentielle d’additifs organiques permettrait de mieux contrôler la nucléation et la
croissance.

52
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Ces expériences conduisent à établir un schéma général des différents facteurs

contrôlant la cristallisation polymorphique des cristaux de carbonate de calcium (Kitamura
et Hara., 2007).

3. La capacité à précipiter le carbonate de calcium chez Sporosarcina pasteurii.

3.1. De l’hydrolyse de l’urée à la précipitation du carbonate de

calcium.

L’urée en présence de [Link] pénètre la cellule par diffusion pour y être

hydrolysée. Les ions NH4+ s’accumulent et se dirigent vers la voie assimilative ou bien
sont expulsés à l’aide de transporteurs transmembranaires actifs par l’ATPase H+/NH4+
hors de la cellule (Jahns, 1996). La diffusion de l’ammonium hors de la cellule se réalise
sous la forme de molécules d’ammoniaque. Elles s’accumulent dans le micro
environnement pour former une enveloppe alcalisante autour de la bactérie (pKaNH4+ /NH3 =
9.2) (Jahns, 1996, Stocks-Fisher et al., 1999).

Les ions bicarbonates et carbonates produits lors de l’hydrolyse de l’urée sont

expulsés de la bactérie à l’aide de transporteurs ou bien diffusent sous la forme de CO2
dissous (Mobley et Hausinger, 1989 ; Ferris, 2003). Les ions ammonium et carbonate
constituent les ions majoritaires du microenvironnement de S. pasteurii, leur accumulation
conduit à une sursaturation localisée. La précipitation du carbonate calcium est alors
fortement favorisée par les nombreux sites de nucléation présents sur la membrane
bactérienne.
D’après Bang et al (2001) le processus peut-être décrit de la manière suivante :

Ca 2+ + cellule cellule-Ca 2+ (R1)

[n°16]

si la source de calcium est CaCl2, alors :

Cl- + HCO3- + NH3 NH4Cl + CO3 2- (R2)

[n°17]

en présence de cellule bactérienne :

Cellule- Ca2+ + CO3 2- Cellule-CaCO3 (R3)

[n°18]

La réaction en réalité libère un proton :

Ca2+ + HCO3- CaCO3+ H+ (R4)

[n°19]

Les protons libérés dans la réaction n°4 vont avoir trois répercussions. La première est une
diminution du pH dans le microenvironnement. Ceci est dû au fait, qu’au fur et à mesure
que la précipitation du CaCO3 se produit, les ions carbonates sont retirés du système et des

53
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

réactions de ré-équilibrage favorisent la réaction n°5 dans le sens de la formation des

carbonates.

HCO3- CO32- +H+ (R5)

[n°20]

La chute du pH encourage le ré-équilibrage du couple NH4+/NH3 dans le sens de la

formation d’ammonium.
NH3 + H+ NH4+ (R6)
[n°]21

La baisse du pH vers un pH de 8 conduit à renforcer le gradient de protons de la cellule et

donc la synthèse d’ATP. S. pasteurii présente un optimum d’affinité pour l’uréase à pH 8-
8.5. Cette propriété enzymatique chez ce micro-organisme confirme sa capacité à induire la
précipitation du carbonate (Stocks-Fisher et al., 1999). Ainsi, en présence de S. pasteurii, la
vitesse de croissance cristalline est augmentée et la solubilité des cristaux de carbonate de
calcium est plus faible (Mitchell et Ferris, 2006).

3.2. L’ion ammonium Influence de la concentration en calcium et

urée
sur la bio précipitation.

Des études (Nemati et Voordouw, 2003 ; Ferris, 2003, Fujita et al., 2004 ; Nemati et
al., 2005) ont montré qu’avec des solutions calcifiantes constituées d’un mélange CaCl2-
urée, à 20° C ne permettaient pas d’obtenir 100% d’hydrolyse de l’urée, contrairement aux
solutions sans calcium. Un effet inhibiteur du calcium ou du carbonate de calcium semble
réduire le taux de d’hydrolyse. Ce taux d’hydrolyse est moins affaibli, lorsque les cellules
ou l’enzyme pure de S. pasteurii sont dans un flux ou dans une solution agitée.

3.3. L’effet de la température sur la bio précipitation avec S.

pasteurii.

L’hydrolyse de l’urée et le taux de précipitation suivent une relation positive avec la

température, notamment entre 10 et 20° C. Ainsi le niveau de sursaturation critique est
obtenu plus rapidement à 20° C. Par contre, il ne semble pas y avoir de différence quand la
bio précipitation se fait entre 20 et 30° C (Ferris et al., 2003). L’effet de l’augmentation de
la température peut être compensé par un accroissement de la concentration en enzyme. En
effet, des résultats équivalents à la perte de perméabilité ont pu être obtenus avec 0.03 g/l à
30° C et 0.1 g/l à 20° C (Némati et Voordouw, 2003).

3.4. La bio précipitation avec S. pasteurii en milieu poreux.

Il existe naturellement du sable consolidé par de la calcite (Saxena et Lastrico,

1978). L’efficacité de cette précipitation de calcite est largement contrôlée par les
caractéristiques environnementales. Il peut y avoir deux mécanismes, en premier, les

54
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

conditions sursaturantes avec du carbonate de calcium, en second lieu, les échanges

ioniques d’interface grains de silice-eau (Ismail et al., 1999). A cela s’ajoute un grand
nombre de facteurs qui peuvent accélérer ou inhiber la précipitation, tels que la chimie du
système poreux (teneur en ion calcium et carbonate), la texture du sol, sa composition, sa
stabilité, sa perméabilité et la présence de bactéries (Molenaar et Venmans, 1993 ; Hall et
al., 2004 ; Mozley et Davis, 2005).

La bio précipitation de carbonate de calcium dépend également du diamètre du pore

et de celui des bactéries (Madigan et Martinko, 2003). En effet, le diamètre usuel des
bactéries est entre 0.3 et 3 µm ce qui d’après Mitchell et Santamarina (2005) rend possible
l’injection en milieu poreux. Les auteurs soulignent aussi que les micro-organismes sont les
lieux de nucléation et de croissance cristalline. Il peut y avoir une augmentation de volume
d’un facteur de 20. Ce phénomène pourrait être amplifié si le micro-organisme est capable
de s’agréger, comme Mixococcus xanthus et contrairement à S. pasteurii. Ceci pourrait
produire des obstructions de la porosité et réduirait également le ratio surface/volume,
important pour l’assimilation de l’urée (DeJong et al., 2006).

La bio précipitation de carbonate de calcium à partir de l’uréase de S. pasteurii

purifiée a été utilisée par Nemati et Voordouw (2003) pour réduire la porosité. La
perméabilité a pu être réduite jusqu’à 98 % avec 0.03 g/l d’uréase, dans une colonne de
sable après deux injections de volume de pore de solution calcifiante. Une étude
complémentaire qui compare l’utilisation de l’enzyme pure avec celle d’une bactérie
proche de P. vulgaris, montre une perte de perméabilité de 65 et 62 %, respectivement. Par
contre, il semble que la quantité du carbonate de calcium précipité soit moins élevée que
celle produite par de l’enzyme libre. Cela est dû très probablement aux effets inhibiteurs
des fortes concentrations des solutions d’urée/calcium (36 et 90 g/l) (Nemati et al., 2005).
Selon Nemati et Voordouw (2003) à partir d’une certaine concentration d’urée-calcium, il
n’y a plus de proportionnalité entre le carbonate de calcium précipité et la diminution de la
perméabilité. En effet, les cellules bactériennes en présence, par exemple de 0.25 M d’urée
et de 0.34 M de CaCl2, nécessitent une phase d’adaptation allant jusqu'à une centaine
d’heures avant d’hydrolyser l’urée et d’atteindre un taux d’hydrolyse final autour de 70 %
et un taux de précipitation de 53 % ( Nemati et al., 2005). Cet effet plateau avait été
également observé avec S. pasteurii par Bang et al., (2001) lorsque la bio précipitation
utilise moins de 106 cellules/ml. Au dessus de ce nombre, la quantité de carbonate de
calcium biologiquement précipité semble être directement liée à la concentration en
cellules. Ces résultats sont en accord avec le fait que le calcium ne s’accumule pas dans les
cellules (Silver et al., 1975) et que les surfaces des bactéries sont autant de sites de
nucléation (Ferris et al., 1986, 1987). En effet, Socks-Fisher et al. (1999) ont mesuré le
taux d’hydrolyse (k-1) et le taux de précipitation du carbonate de calcium (µ -1) en fonction
de la concentration en calcium (de 12.6 à 50.4 mM) pour 106 cellules/ml. Les résultats ont
montré que (µ -1) et (k-1) n’évoluaient quasiment pas en fonction de la concentration de
calcium, avec 0.11 h-1 pour la production d’ammonium et 0.75 h-1 pour la production de
CaCO3. Ces deux paramètres semblent évoluer indépendamment l’un de l’autre. Par contre,
lorsque c’est le nombre de cellules de S. pasteurii qui augmente de 106 à 109cellules/ml,
alors, le taux d’hydrolyse spécifique diminue, passant de 100 mMNH4+/h/106 cellules/ml à
approximativement à 50 mMNH4+/h/109 cellules/ml. Cela provoque la chute du taux
spécifique de précipitation du CaCO3 et est dû au fait que les cellules sont des sites de
nucléation et de croissance cristalline potentiels. Ces phénomènes vont réduire la diffusion
de l’urée à travers la membrane et par conséquent son taux spécifique d’hydrolyse. Un
autre phénomène qui diminue également le taux d’hydrolyse des bactéries ou de l’enzyme a

55
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

pu être mis en évidence chez S. pasteurii. Il s’agit de l’immobilisation de l’enzyme ou de la

bactérie sur un support qui entraine une réduction des surfaces de contact et donc des
échanges avec son environnement. Par conséquent, le taux d’hydrolyse diminue (Bang et
Ramakrishnan, 2001, Nemati et Voordouw, 2003, Nemati et al., 2005).

L’utilisation de S. pasteurii pour consolider, via la précipitation du carbonate de

calcium, des fractures a été employée par Bang et al., (2001) . Ils ont mis en évidence qu’il
n’y avait pas de différence de résistance à la compression entre les deux lots bio précipités
pendant 7 jours ou 28 jours. Ceci tend à confirmer que le carbonate de calcium bio
précipité par S. pasteurii n’évolue pas dans sa cristallisation. Ceci suggère la présence de
cristaux de calcite qui est confirmée par les analyses de cristallographie. Par ailleurs, les
observations au MEB montrent des cristaux de calcite qui croissent autour des micro-
organismes ou les encroutent (Fisher et al., 1999 ; Bang et al., 2001).

56
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

CHAPITRE III
MATERIELS ET METHODES.

I. LE CONTEXTE. 057
1. Le choix du sable. 060
2. Les caractéristiques du procédé de bio calcification. 061
2.1. Les caractéristiques des sables liquéfiables. 061
2.2. Les caractéristiques des sables sélectionnés. 061
2.3. Les caractéristiques d’injectabilité des sables fins à très fins. 062

II. LA DESCRIPTION DU DISPOSITIF D’INJECTION POUR LES

COLONNES. 066

1. La présentation du dispositif général. 066

2. Le protocole expérimental. 067
3. Le remplissage des colonnes. 067
3.1. La méthode de compactage par pluviation et vibration. 067
3.2. La méthode de compactage par pluviation et tapotement. 068
4. La préparation de la colonne. 065
5. La préparation de la biomasse et ses conditions de culture. 070
5.1. Les souches bactériennes et leurs milieux de culture. 070
5.2. La mesure des activités enzymatiques. 071
6. La méthode de stimulation de l’adhérence. 072
7. La suspension de biomasse et son injection. 073
8. La préparation de la solution calcifiante. 073

III. LES CONDITIONS D’INJECTION. 075

1. Le protocole d’injection de la suspension de biomasse. 075

2. Le suivi de la fixation bactérienne en cours d’injection. 075
3. Le protocole d’injection de la solution calcifiante. 077

IV. LA COLLECTE DES RESULTATS. 078

1. Le démoulage des colonnes. 078

2. La mesure de la résistance maximale à la compression simple . 078
3. La détermination de la teneur en carbonate de calcium des colonnes. 079
4. Les observations des échantillons au microscope électronique
à balayage (MEB). 081
5. Les analyses chimiques des effluents du procédé. 082

V. L’ORGANIGRAMME DE LA MISE EN PLACE DU PROCESSUS

D’INJECTION EN COLONNE. 084

VI. LE PROTOCOLE D’INJECTION. 086

VII. LE DESCRIPTIF GENERAL DES INJECTIONS REALISEES EN

COLONNES. 87

57
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

I. LE CONTEXTE.

L’injection de sol, peut se définir comme étant le procédé qui contrôle l’injection d’un
produit temporairement en phase liquide (coulis), dans le sol ou dans les fissures de roche,
pour en changer les caractéristiques géotechniques. Les injections de sol nécessitent la mise
en place d’un produit pompable, en ajustant leurs caractéristiques rhéologiques.
Deux principes d’injection existent ; avec déplacement de terrain et sans déplacement de
terrain. Dans ce dernier cas, deux applications sont possibles, le comblement et la pénétration
du sol. Dans le cas de l’injection par pénétration, elle peut se réaliser, soit au niveau des
fissures des roches soit par imprégnation dans un sol poreux. Dans le cas du procédé de bio
calcification, ce sont les injections de sol par imprégnation qui sont recherchées, car le plus
couramment utilisées. Elles sont réalisées, sous pression contrôlée, dans un terrain plus ou
moins perméable et plus ou moins compact, avec un coulis qui se substitue à l’eau
interstitielle de la zone à traiter. En effet, ce produit durant sa phase liquide pénètre le sol via
le réseau poral sans perturber la structure du sol. Cette technique est initialement utilisée pour
réduire la perméabilité et permettre un meilleur contrôle de l’écoulement des eaux
souterraines (étanchéité), et pour l’amélioration de la consolidation.

Pour évaluer la faisabilité de la technique d’injection par imprégnation dans un sol, un

certain nombre de critères doivent être connus, tels que la perméabilité in situ, le contexte
géologique et géotechnique. Mais des considérations environnementales sont également
nécessaires et peuvent influencer sur le maillage des injections. Ainsi, en fonction de la
gamme des coefficients de perméabilité rencontrée dans le sol, le choix du coulis est adapté.
La gamme des coefficients de perméabilité rencontrés pour ce type d’injection peut varier
entre 10-6 < K < 5 . 10-3 m/s. Ainsi, lorsque K > 5 . 10-3 m/s, les injections sont réalisées avec
des coulis de ciment pur ou avec de la bentonite en suspension. Ce sont des coulis dits «
granulaires » adaptés dans le cas des alluvions. Lorsque le coefficient de perméabilité est
compris entre 5 . 10-3 et 10-5 m/s ce sont des suspensions de micro ciments (d < 16 µm) qui
sont employées. Enfin, la perméabilité de 5 . 10-4 à 10-6 m/s nécessite des coulis dits
« chimiques » tels que des silicates de sodium, des composés phénoliques ou des gels
acryliques. Ces coulis sont plus fluides et plus pénétrants, ces résines peuvent être associées
avec des retardateurs de prise.
La première action des injections dans le sol est la modification de la perméabilité.
C’est donc un paramètre important qui reflète la qualité du réseau poral, c'est-à-dire le niveau
d’inter connectivité et les volumes de pores. En effet, l’efficacité des injections dépend des
caractéristiques des suspensions d’une part et d’autre part de celle du sol, notamment leur
action filtrante sur les suspensions injectées. Cette action filtrante dépend de la taille des
grains et de la taille des zones inter granulaires. Ainsi, une formule empirique d’injectabilité
repose sur le ratio de deux diamètres de particules d15/d85. Par ailleurs, la stabilité chimique
des suspensions injectées, les gradients hydrauliques in situ, sont des paramètres à prendre en
compte, car les injections se réalisent à faible pression (0.4 à 4 MPa) et à faible débit. Cette
pression est liée à la résistance du sol (103 à 2.103 Pa par mètre de pénétration dans le sol),
aux surcharges et à la rhéologie du coulis. Ainsi, en fonction de ces caractéristiques, il est
possible de déterminer un ratio volume (volume de coulis / volume de sol à traiter) par passe
d’injection en fonction de la géométrie de traitement, c’est-à-dire, en fonction de l’espace qui
existe entre chaque point d’injection et la profondeur des injections. Les paramètres
d’injection à proprement parler sont la pression, le volume et le débit. Ils sont ajustés de
façon à éviter toute déformation du sol ou claquage et ceci est d’autant plus important, qu’il
s’agit d’un sol peu compacté. Ces claquages induisent des écoulements préférentiels qui
limiteront l’action de consolidation du sol.

58
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Dans le cas d’un procédé de consolidation du sol par bio calcification, le choix de la
technique d’injection doit prendre en compte les profondeurs d’injection, la stabilité du sol, la
possibilité de revenir sur les forages pour de nouvelles injections et un forage stable sur toute
la durée de chantier. Pour cela, la technique de mise en place de la suspension la plus
adéquate est l’injection par tube à manchette (TaM). Les forages sont réalisés au moyen
d’une foreuse rotative avec de la boue ou de l’eau comme fluide de forage. Lorsque le forage
est achevé, un tube lisse en PVC est mis en place. Il est associé dans sa partie inférieure à un
tube à manchette. Ainsi chaque forage est équipé d’un tube lisse sur les premiers mètres puis
entre 2 et 10 m, le tube à manchettes prend le relais. Ce tube est perforé sur les hauteurs de
terrain à traiter à intervalle régulier tous les 0.3 à 0.5 m. Un coulis de gaine est alors mis en
place de façon à maintenir scellé le tube d’injection. Le scellement peut durer entre 3 et 7
jours. Ce coulis sera ensuite « claqué » au début d’injection de chaque passe et à chaque
manchette pour laisser le passage au coulis d’injection vers le terrain. C’est au niveau de ces
perforations que s’écoule le coulis dans le sol grâce à la présence d’une valve en caoutchouc
qui obstrue le tuyau dans sa partie inférieure et de clapets anti retour pour empêcher le coulis
injecté dans le terrain de refouler dans le forage en fin d’injection.
Pour la consolidation d’une zone d’intérêt, une phase préliminaire d’étude de terrain
est nécessaire et indispensable. L’implémentation des forages se réalise de manière linéaire
ou en quinconce avec un maillage de l’ordre de 0.8 à 2 m sur 2 ou 5 lignes, mais
habituellement entre 1.2 et 1.5 m. L’imprégnation se réalise progressivement par une
multitude de forages équipés de tubes à manchette. Les volumes mis en jeu représentent en
général près de 25 % du volume de sol à traiter. Par ailleurs chaque point d’injection peut être
revisité. Cette méthode permet d’améliorer l’homogénéité du sol. Elle peut être combinée
avec d’autres techniques d’amélioration du sol, telles que la vibro compaction.

Cependant, les principales limites techniques de l’imprégnation dépendent d’une

évaluation précise de la dimension de pore moyen et de la granulométrie du sol en premier
lieu. Dans ce cas, le colmatage peut se produire rapidement et induire des écoulements
préférentiels au niveau du point d’injection. La direction des fluides est déterminée par les
différents niveaux de perméabilité. Par ailleurs, l’hétérogénéité et l’anisotropie affectent la
pénétration et la dissipation du coulis créant des bulbes au niveau des ponts d’injection. A
cela s’ajoute la viscosité du coulis et la densité dépendante du fluide. Pour limiter ces effets,
les vitesses de pompage sont faibles permettant un déplacement du fluide le plus stable qui
soit. Pour limiter ces effets, des combinaisons de coulis sont possibles. Le couplage
d’injection d’imprégnation utilisant différente coulisse est également possible. En effet, en
présence d’écoulements préférentiels trop importants ou la présence de volume de pore trop
large, alors des injections de ciment bentonite peuvent être effectuées pour réduire les
volumes de pores. Ceci permet de réduire sensiblement les coûts. La combinaison de coulis
de différentes natures est une voie de développement de la bio calcification. Pour cela, de
nombreux paramètres doivent être pris en compte pour assurer la meilleure compactibilité
avec un procédé biologique. Outre les possibilités d’accès au site, les informations
nécessaires pour un procédé d’imprégnation de type biologique sont entre autres :
la structure du sol et sa texture,
sa granulométrie,
sa perméabilité ainsi que sa distribution et sa variabilité dans la zone à traiter,
l’analyse chimique de l’eau de la nappe, son sens d’écoulement,
la durée du traitement et son impact sur le court et long terme,
les caractéristiques de la biomasse et ses possibilités de conservation….

59
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

L’utilisation d’un coulis de nature biologique, en comparaison avec les coulis

habituellement employés pour les injections dans les sous-sols granulaires tels que l’argile-
ciment ou le gel de silicates, permet principalement de diminuer le nombre de points
d’injection sur chantier, en raison de la prise en masse moins rapide du produit utilisé. Par
ailleurs, le temps de prise d’un coulis biologique est nul. Le Tableau n°4 permet de comparer
les paramètres principaux d’un coulis classique par rapport à ceux d’un coulis bactérien.

Tableau n°4 : Comparaison des principaux paramètres des coulis classiques et bactériens.
(cP = mPas : millipascal par seconde).

Les principaux paramètres des coulis classiques et bactériens

Coulis classiques Coulis bactériens
Temps de prise court = 1,5 heure sans objet
Viscosité Forte = 10 à 20 cP faible = 2 à 4 cP

Le principe du procédé étudié est donc de consolider un sous-sol granulaire saturé en

eau, en y injectant une suspension bactérienne suivie d’une solution calcifiante. La formation
de ponts de carbonate de calcium entre les grains de sable par bio calcification réduira alors le
risque de liquéfaction ou perte de résistance du sol . La représentativité du sable utilisé pour la
préparation des colonnes, l’injectabilité du coulis bactérien et la reproductibilité des essais sont
les facteurs à prendre en compte.

1. Le choix du sable.

Le procédé biologique de bio calcification est destiné à la consolidation des sols

granulaires, poreux et saturés, c'est-à-dire potentiellement liquéfiables. La liquéfaction est le
résultat de trois grands phénomènes concomitants, la pulvérulence du sol, la présence d’une
nappe d’eau et la sollicitation physique. Ces sols sont classés dans la catégorie C selon la
norme (NF P 06-013), ce qui correspond à des sols de faibles résistances mécaniques. Dans
cette même catégorie se trouvent les sols granulaires lâches (sable), les argiles molles et les
vases. Le potentiel liquéfiable de ces sols est évalué en comparant la sollicitation sismique et la
résistance à la liquéfaction. En effet, un sol sableux saturé peut se trouver dans différents états
de compacité, un état dense ou un lâche. Lorsqu’une onde de cisaillement (S) se propage et
agit latéralement sur les roches, c’est-à-dire selon un angle droit par rapport à sa direction de
propagation, la pression interstitielle augmente jusqu’à compenser les chargements extérieurs,
les contraintes inter granulaires s’annulent et le milieu devient liquide. Il s’en suit une
diminution de la résistance au cisaillement. En effet, ces fortes vibrations sismisques peuvent
susciter le réarrangement des grains et ainsi provoquer des tassements de sol.
Afin de tester les différents paramètres pouvant influencer l’efficacité de la bio
calcification, il est nécessaire de posséder un modèle de colonne le plus représentatif possible
des conditions environnementales du sous-sol dans lequel seront réalisées les applications
industrielles. Il est aussi essentiel d’avoir une bonne reproductibilité dans la préparation des
colonnes. Pour cela, deux conditions varient dans la préparation des colonnes, la nature du
sable siliceux utilisé et le mode de compactage.

60
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

2. Les caractéristiques du procédé de bio calcification.

Le procédé de consolidation des sols repose en premier lieu sur l’injection d’une
solution de biomasse et d’une solution de calcium et d’urée dans un environnement poreux et
saturé. Ces liquides injectés sont de type newtonien, la viscosité de ces solutions est
indépendante de la vitesse d’écoulement. Ils sont donc injectables.

2.1. Les caractéristiques des sables liquéfiables.

Les sols liquéfiables sont caractérisés par un fuseau granulométrique précis. Celui-ci est
représenté par deux courbes en S. Elles déterminent les limites inférieure et supérieure d’une
fenêtre granulométrique dans laquelle la liquéfaction est possible. Ces sols sont de nature
sableuse ou ont des caractéristiques particulières (Tableau n°5).

Tableau n°5 : Les caractéristiques principales d’un sol sableux considéré susceptible de
liquéfaction selon la norme NF 06-031.

Caractéristiques des sols sableux liquéfiables

Sol saturé Oui
Granulométrie uniforme Cu = d60/d10 < 15
Diamètres des grains à 50% 50 < d50 < 1500 µm
Etat de la contrainte à l’état final du projet σ v < 200 kPa

Les grains des sols sableux considérés comme exempts du risque de liquéfaction
possèdent des diamètres à 10 % tel que d10 > 2 mm (norme NF 06-031).

2.2. Les caractéristiques des sables sélectionnés.

Quatre types de sables ont été sélectionnés pour leur potentiel à la liquéfaction dont
trois sont de même origine (le sable de Fontainebleau) et un quatrième en provenance des
Pays-Bas appelé sable Itterbeck. Leurs granulométries ont été déterminées à l’aide d’un
granulomètre laser Horiba. La minéralogie et les caractéristiques granulométriques sont
présentées dans le Tableau n° 6 et figures n°6 bis.

Tableau n° 6 : Les caractéristiques granulométriques des quatre sables.

Sable de Sable de Sable de

Sable
Paramètres Fontainebleau Fontainebleau fontainebleau
Itterbeck
NE 34 brut correcteur
d10 (mm) 0.15 0.15 0.09 0.11
d60 (mm) 0.21 0.28 0.19 0.19
Cu=d60/d10 <2 1.4 1.87 2.11 1.73
d50 (mm) 0.200 0.250 0.165 0.175
Densité réelle
2.65 2.65 2.65 2.65
(pycnomètre)*
Densité apparente
1.5 1.5 1.5 1.6
sable sec (Prolabo)*
Minéralogie* quartz quartz quartz quartz
Forme* arrondie arrondie arrondie anguleux
Dureté*(Mohs) 7 7 7 7
* Sifraco Fiche technique

61
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

100.00

90.00
Sable SF Correcteur
80.00 SF NE34
passants cumulés (%)

SF brut
70.00
SABLE ITTERBECK
60.00

50.00

40.00

30.00

20.00

10.00

0.00
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10
ouverture des mailles (mm)

Figures n°9 : Les granulométriques des quatre sables.

Les trois sables de Fontainebleau sont composés de silice (SiO2) à plus de 99 %. Le

sable NE 34 (sable normalisé, Sifraco, Nemours) et le sable correcteur (sable BR, Sifraco,
Bourron –Marlotte) ont été lavés afin de supprimer les particules minérales et organiques
solubles puis séchés et écrêtés. Tout les deux peuvent être rangés dans la catégorie des sables
propres, contrairement au sable brut qui lui n’a subi aucun traitement par l’exploitant tout
comme le sable Itterbeck. Ce dernier de composition chimique équivalente à celui du sable de
Fontainebleau, possède une courbe granulométrique proche du sable correcteur. Ces quatre
sables sélectionnés sont classés selon l’échelle texturale dans les sables fins à très fins d’après
le Handbook of soil science.

2.3. Les caractéristiques d’injectabilité des sables fins à très fins.

Pour que le choix du sable soit définitif, un autre paramètre doit être pris en compte,
celui de sa capacité à supporter l’injection des solutions. Elle dépend de deux éléments, la
viscosité de la solution à injecter et le niveau de compactage du milieu poreux. Dans le cas de
la bio calcification, la viscosité des solutions utilisées est équivalente à celle de l’eau (2 - 4 cP).
Ce paramètre ne sera pas limitant pour la pénétrabilité du coulis bactérien et c’est donc le
niveau de compactage du sable qui sera déterminant. Pour se placer dans des conditions
facilement reproductibles, c’est le compactage maximal du sol (≈ 1.74 g/cm3) qui a été choisi..
La pénétrabilité de la solution de biomasse va donc dépendre du diamètre des pores. Dans le
cas des sables siliceux purs, ce diamètre pourra être estimé à partir du coefficient de
perméabilité (K) exprimé en m/s car il fournit une valeur in situ de la vitesse à laquelle un
fluide pénètre les pores. Il peut être déterminé à partir de la formule de Hazen modifiée :

K = α*(d10 )2 [n°23]

avec le α, déterminé par la relation = e3 / 1 + e, et e étant l’indice des vides (e= Vv/Vs = (Vt-
Vs)/Vs). K peut être relié à la porosité n par la formule : e = n/(1 - n), alors la formule de
Hazen modifiée devient :

62
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

K= ((e3)/(1+e))*(d10)2. [n°24]

Les différentes perméabilités calculées pour les quatre sables sélectionnés et avec les
indices de densité du sable de Fontainebleau emax = 0.94 et emin = 0.54 (Thèse de
Benahmed ,2001) sont réunies dans le Tableau n°7.

Tableau n°7 : Les perméabilités calculées pour l’état lâche et l’état dense pour les
quatre sables sélectionnés.

Perméabilités des sables sélectionnés

Sable de Sable de Sable de
Paramètres Fontainebleau Fontainebleau Fontainebleau Sable Itterbeck
NE 34 brut correcteur
K (m/s)
2.25 10-4 2.25 10-4 8.1 10-5 1.21 10-4
état lâche
K (m/s)
4.67 10-6 4.67 10-6 1.68 1006 2.56 10-6
état dense

A partir de la perméabilité, il est possible de déduire le diamètre de pores pour évaluer

l’injectabilité d’un coulis bactérien. Il existe plusieurs formules de calcul plus ou moins
proches des conditions chantiers. Dans les conditions de chantier (Bouchelaghem, 1994), il faut
prendre en compte la formule de Johnson (1958) adaptée au sable fin c'est-à-dire aux
perméabilités inférieures à 10-5 m/s et la formule de Cambefort (1967) :

(d15sol /d85 coulis) >I ; I = 25 [n°25]

Le d15sol correspond au diamètre des particules du sol au point sur la courbe granulométrique
où le pourcentage des passants est de 15 %. Le d85 coulis est le diamètre des particules de coulis
au point sur la courbe granulométrique où le pourcentage des passants est de 85 %. Dans notre
cas, il s’agit d’un coulis bactérien de S. pasteurii dont les cellules ont des longueurs variant de
1 à 4 µm. Cette approximation tient compte de l’hétérogénéité d’une population bactérienne.
En effet, les cellules en division sont généralement deux fois plus longues ; quant à leur
diamètre, il est approximativement de 1µm. Le d 85 coulis est alors assimilé à la longueur
maximale de la bactérie soit 4 µm. Le second critère est donné par la formule de Cambefort
(1967) :
d 50 coulis < C*√K [n°26]

avec d50 coulis le diamètre des particules ou celui des bactéries, C une constante et K la
perméabilité.

Les résultats sont interprétés à l’aide du diagramme montrant les variations du diamètre d50 coulis
en fonction de K (Figure n°9). La limite de perméabilité est donnée par une courbe de pente
égale à 1/2 (Cambefort, 1967). Par une lecture graphique, une première estimation peut-être
réalisée de la limite de perméabilité des coulis sur la perméabilité des terrains. Elle donne un
diamètre des « grains » injectables compris entre 20 et 30 µm.

63
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Figure n°9 bis : Les limites de pénétrabilité des coulis basées sur la perméabilité
des terrains (Cambefort, 1967).

L’injectabilité d’une solution bactérien de S. pasteurii semble possible dans des

colonnes à compactage dense (densité d = 1.74).
Une façon plus proche des conditions de laboratoire (Deleport, 2003), consiste à évaluer le
diamètre de pore dans le cas d’un écoulement unidirectionnel à basse vitesse par un faisceau de
capillaires parallèles. Celui-ci est calculé avec la formule :

K= (Ø d²)/32 [n°27]

avec, Ø la porosité (rapport du volume des pores au volume total), d le diamètre des canaux et
K la perméabilité en (m/s). Cette formule permet d’estimer le diamètre des pores moyens dans
un modèle de colonne de sable compacté.
Le diamètre des pores peut être également estimé à partir de la formule de Schiereck, 2004
selon la formule :
D 15sol < 4 d 85pore [n°28]

. Enfin, dans le cas d’injection de solution colloïdale dont les grains sont inférieurs à 50 µm, la
pénétrabilité d’une solution suit la formule suivante :

d15sol > 15 d 85 du coulis « bactérien » [n°29]

avec d15 = 0.16 mm et d85 = 0.004 mm alors 15D85 = 0.060 mm.

Ainsi, un coulis de bactéries de 4 µm de longueur, est injectable dans tous les sables
sélectionnés. Le Tableau n°8 réunit les données concernant l’injectabilité des sables et les
estimations de diamètre de pores pour les colonnes de sable compacté, fabriquées.

64
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Tableau n°8 : Récapitulatif des estimations des diamètres de pore moyen pour la
détermination de l’injectabilité du coulis bactérien pour les quatre sables sélectionnés.

Sable de Sable de Sable de

Paramètres Fontainebleau Fontainebleau Fontainebleau Sable Itterbeck
NE 34 brut correcteur
d15 sol (mm) 0.160 0.160 0.112 0.115
d coulis bactérien
0.004 0.004 0.004 0.004
(mm)
D15so l > 15 d 85 coulis 0.06 0.06 0.06 0.06
d15/d85 = I>25 40 80 56 57.5
Diamètre d85 pore (µm) ≈ 40 ≈ 40 ≈ 30 ≈ 37
√K (modifié cal) 2.16 10-3 2.16 10-3 1.30 10-3 1.59 10-3
K (m/s) modifié cal
4.67 10-6 4.67 10-6 1.68 10-6 2.56 10-6
pour état dense
Diamètre moyen d’un
≈ 20 ≈ 20 ≈ 11 ≈ 15
pore d (µm)

Cependant, il est difficile d’estimer le diamètre de pore, car il est impossible dans nos
conditions de connaître la structure du sol, c'est-à-dire le mode d’assemblage ou d’arrangement
(cubique ou hexagonal compact) des particules minérales et les liaisons éventuelles avec
d’autres éléments (interface sable et support de la colonne). Or, d’après une étude de Musy
Soutter (1991), le système poral en fonction du diamètre des pores a été établi pour du sable
fin. Il en ressort que 40 % des pores auraient un diamètre inférieur à 4 µm. D’après ces
données, le sable pourrait avoir une action de filtration mécanique importante sur la biomasse.
En effet les particules ou les cellules bactériennes comprises entre 1 µm et 4 µm sont sujettes
aux forces mécaniques et hydrodynamiques de l’injection mais aussi aux interactions physico
chimiques et électrostatiques du support siliceux. La pénétrabilité du coulis bactérien pourrait
être limitée.

65
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

II. DESCRIPTION DU DISPOSITIF D’INJECTION POUR LES COLONNES.

Le premier objectif de la construction de colonnes est d’avoir un protocole simple de

montage, démontage et nettoyage, afin d’obtenir des colonnes reproductibles et de minimiser le
temps de préparation.

1. La présentation du dispositif général.

Pour évaluer les différents paramètres susceptibles d’influencer la bio calcification,

pour un même diamètre (6.3 cm), trois hauteurs de colonnes ont été étudiées, 20, 40 et 60 cm.

Schéma d’une colonne de sable

Entrée Vis Papillon Figure n°10 : Schéma d’ensemble

Joints toriques d’une colonne (d’après Paradis,
2007)
Filtre nylon
Tige filetée

Sable filtre

Sable de
20 cm 19 cm Fontainebleau

Rondelle plastique

Filtre nylon

Silicone

Sortie

6,3 cm

La colonne standard, est équipée d’une embase inférieure et supérieure en PVC où

l’entrée et la sortie des fluides sont centralisées. Le corps de la colonne est constitué d’un tube
également en PVC de 3 mm d’épaisseur qui est emboité à la verticale sur les embases. Le
système ainsi monté est relié à une pompe péristaltique Masterflex L/S Digital. Elle est
composée d’une tête de pompe Masterflex L/S de modèle Easy Load 7518-00. L’ensemble est
relié par des tuyaux flexibles Masterflex L/S de type Tygon R3603 de taille 13.

66
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

2. Le protocole expérimental.

La procédure expérimentale pour la réalisation d’un essai d’injection complet comporte

quatre phases (Tableau n° 9).

Tableau n°9 : Le protocole expérimental.

Protocole de montage de colonne
Pluviation et vibration
Phase n°1 Méthode de compactage
Pluviation et tapotement
Montage des raccords et Préparation des
solutions
Phase n°2 Préparation et injection
Injection de la biomasse
et des solutions calcifiantes
Démoulage et compression Extraction des échantillons
Phase n°3
simple Ecrasement des échantillons
Démontage
Phase n°4 Démontage et nettoyage
Nettoyage

Les montages de colonnes sont réalisés en immersion. Ce choix a été déterminé afin de
simplifier les méthodes de compactage et d’éviter la présence de bulles d’air. En effet, la
présence de gaz dans le réseau de pore produirait des courants préférentiels.

3. Le remplissage des colonnes.

3.1. La méthode de compactage par pluviation et vibration.

Au début de chaque essai, les différentes pièces telles que les embases, le corps de la
colonne et les connexions sont montées séparément. Les joints toriques sont montés sur les
embases supérieure et inférieure de la colonne. Ils permettent d’assurer l’étanchéité du tube en
PVC avec les embases. Pour assurer une imperméabilité totale, ces joints ainsi que les fonds
des embases sont badigeonnés de vaseline blanche. Elle est étalée en une fine couche circulaire
également sur la paroi interne du tube de PVC et sur toute la longueur. L’emploi de la vaseline
dans le tube de PVC permet de réduire les effets de bords lors des injections et de faciliter le
démoulage des colonnes en fin de procédure.

Lorsque le tube de PVC est emboité dans l’embase inférieure, une couche de silicone
est appliquée sur le pourtour de la jonction tube/embase, afin de mieux consolider cet
ensemble. Une fois le gel de silicone séché, deux tiges filetées sont vissées sur l’embase
inférieure. Ensuite, sont déposés au fond de la colonne deux filtres circulaires à base d’une
toile de nylon de 0.5 mm de diamètre de pore et légèrement inférieur au diamètre de la colonne
(Ø 60 mm). Une fois les filtres déposés, une rondelle de plastique imperméable est centré sur
les filtres. La sortie de l’embase inférieure est ensuite obstruée pour que la colonne puisse être
remplie par un volume précis d’eau.

Une première couche de 0.5 cm de sable filtre (30 g) est déposée par pluviation de
manière homogène au fond de la colonne. Cette couche permet l’homogénéisation de
l’écoulement au sein de l’échantillon et empêche les grains de sable de venir colmater l’orifice
de sortie situé dans l’embase inférieure. La colonne est installée dans un seau pour être ensuite
déposée sur un tamiseur. Au dessus de la colonne est placée une éprouvette dans laquelle est

67
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

versé une masse connue de sable de Fontainebleau sec. Ce sable est versé sous forme de pluie à
un débit approximativement de 5 g/min au sommet de la colonne à une hauteur constante de 5
cm. La colonne est soumise lors de la pluviation du sable aux vibrations du tamiseur. Ce
dispositif de pluviation dans une colonne saturée facilite la mise en place de matériaux
granulaires en des structures homogènes sans singularité de densité. L’état de compacité de la
colonne est assuré par le débit de la pluviation sous eau et la vibration du tamiseur. L’opération
est arrêtée lorsque le niveau du sable se trouve à 0.5 cm de haut du tube en PVC. La masse de
sable introduite est mesurée de manière très précise. Puis 30 g de sable filtre permettent de
compléter le haut du tube en PVC. Cette couche est arasée pour homogénéiser sa surface et
permettre de déposer un filtre nylon qui stabilisera cette couche lors de l’injection. Enfin,
l’embase supérieure est emboitée sur le tube en PVC et sur les tiges filetées. Les vis papillons
sont vissés simultanément sur les tiges filetées. Une couche de silicone est appliquée sur le
pourtour de la jonction tube/embase pour assurer là aussi un maximum d’étanchéité. Les
différentes connexions de flexibles sont réalisées une fois que le volume d’eau éjectée de la
colonne a été mesuré. La Figure n°11 présente une vue du dispositif de préparation de
colonne.

Cône de remplissage
avec robinet intégré

Seau de réception

Eau éjectée de la
colonne

Appareil à plateau
vibrant

Figure n°11 : Schéma du protocole de pluviation et vibration en immersion

3.2. La méthode de compactage par pluviation et tapotement.

Cette méthode de compactage est différente de la précédente par les points suivants. Le
remplissage de la colonne de sable se réalise également sous immersion mais petit à petit (semi
– continu). En effet, après la mise en place du sable filtre, du sable de Fontainebleau est versé
manuellement à l’aide d’un entonnoir, de façon circulaire, sur une épaisseur de 1 à 2 cm. La
colonne est ensuite vibrée par trois séries de 8 chocs latéraux appliqués contre la paroi avec un
maillet. Ces trois séquences de chocs doivent être uniformément réparties sur le pourtour du
cylindre, tous les 120° et avec la même intensité. Une fois le tassement assuré et l’égalisation
de la surface supérieure du sable, une quantité d’eau identique est ajoutée avec un versement

68
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

de sable identique à la précédente. La colonne est ainsi totalement remplie en plusieurs cycles
de compactage.

4. La préparation de la colonne.

Le protocole de mise en place des flexibles a pour objectif principal de maintenir un

continum d’eau entre la colonne et les raccords. La colonne a été remplie sous eau et doit être
maintenue totalement saturée lors de la mise en place des flexibles à l’entrée et à la sortie. Pour
cela, l’entrée de la colonne située sur l’embase supérieure est remplie d’eau jusqu'à
débordement. L’entrée est ensuite obturée à l’aide d’un morceau de paraffine. Parallèlement
deux flexibles Masterflex L/S de type Tygon R3603, taille 13, pour l’entrée de la colonne et de
diamètre 1 mm pour la sortie sont remplis d’eau. Le flexible de sortie est emboité en premier et
son extrémité est maintenue en position haute, légèrement au dessus du niveau d’entrée de la
colonne. Une fois cette opération réalisée, le flexible d’entrée dont une extrémité est placée
dans un récipient d’eau au même niveau que la colonne afin d’éviter que le tuyau ne se vide de
son contenu, est connecté. Lorsque cette opération est réalisée, il y a un continum d’eau entre
les raccords et la colonne. Ceci doit être néanmoins vérifié. Pour cela il suffit de relever
légèrement le flexible de sortie par rapport au niveau d’entrée de la colonne pour observer une
sortie d’eau et ainsi s’assurer qu’il n’y a aucune bulle d’air à l’intérieur de la colonne. Cette
dernière opération doit être renouvelée plusieurs fois pour s’assurer de l’injectabilité de la
colonne.
L’ensemble des données est collecté dans un tableau synthétique de préparation de
colonne (Tableau n°10).

Tableau n°10 : Exemple de fiche de synthèse des données techniques d’une colonne.

Caractéristiques techniques du
Exemple de colonne
montage de la colonne
Type de sable Fontainebleau NE 34 (SFB NE 34)
Granulométrie (µm) 1 125-250.
Hauteur de la colonne (cm) 20
Diamètre de la colonne (cm) 6.3
Masse de sable filtre (g) 60
2
Masse totale de sable (g) 1086
Volume total de colonne (cm3)3 655
3
Volume d'eau récupéré (cm ) 400
3
Volume de porosité pratique (cm ) 255
3
Densité apparente (g/cm ) 1.66
Masse de sable fin (SFB) (g) 1036
Volume théorique de sable (SFB) (cm3) 592
Densité sèche sable fin (SFB) 1.75
1 = Bande passante des grains pour le sable fin (Fontainebleau ou Itterbeck)
2 = Masse de sable filtre + masse de sable fin (Fontainebleau ou Itterbeck)
3 = Volume de sable filtre + volume de sable fin (Fontainebleau ou
Itterbeck)

Les deux types de densité permettent de se rendre compte des différences de

compaction entre les colonnes et de les comparer. En premier lieu, la densité apparente prend

69
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

en compte la masse sèche de sable filtre et de sable fin (Fontainebleau ou Itterbeck) sur le
volume total de la colonne. Le second calcul de densité correspond à celui du sable fin
uniquement. Pour cela, c’est la masse sèche de sable fin qui est également divisée par le
volume de la colonne. Ainsi, pour ce calcul, la hauteur de colonne est réduite de 1 cm (2*0.5
cm). Elle correspond à 60 g (30*2)de sable filtre soit 30 cm3.

5. La préparation de biomasse et ses conditions de culture.

5.1. Les souches bactériennes et leurs milieux de culture.

Deux souches de S. pasteurii achetées auprès de fournisseurs de l’Institut Pasteur, et ont

été utilisées. Il s’agit de S. pasteurii CIP 66.21 et de S. pasteurii DSMZ 33. Toutes les deux ont
servi pour les suivis de croissance, les optimisations de l’activité enzymatique et les essais en
colonne. La culture du micro organisme et la production d’uréase sont deux étapes liées dont
dépend fortement la réussite des essais de bio précipitation en colonne.
Le conditionnement des souches, la méthode de réviviscence, le mode de conservation
ainsi que les conditions de production de biomasse (type de précultures par exemple) sont
autant d’étapes déterminantes (Tableau n°11).De celles-ci dépendent non seulement le
rendement de la production d’uréase mais aussi le passage à une production industrielle.

Tableau n°11 : Les modes de conservation et de culture des précultures pour S. pasteurii.
Mode de Mode de
Souches Conditionnement Préculture
reviviscence conservation
Une culture liquide
Milieu gélosé Une culture
de 24 h entre 20 et
S. pasteurii sélectif liquide SBF, de
Lyophilisée 25° C
CIP 66.21 (Agar 20 g/l + Y.E. 24 h entre
(20 g/l Y.E.,
20 g/l et urée 20 g/l) 20 et 25° C
20 g/l urée)
Une culture liquide
Milieu gélosé Une culture
de
S. pasteurii sélectif liquide SBF, de
Liquide 24 h entre 20 et 25° C
DMSZ 33 (Agar20 g/l + Y.E. 24 h entre
(20 g/l Y.E.,
20 g/l) 20 et 25° C
20 g/l urée)
Y.E. : Extrait de levure, SBF : Soletanche Bachy France.

Les précultures et les cultures sont réalisées en Erlenmeyers, elles sont incubées à
température ambiante, sous hotte stérile à flux laminaire, placées sur un plateau d’agitation. Le
milieu de culture liquide, semi synthétique et à base d’extrait de levure, est complexe et a
évolué tout au long de cette étude (Tableau n°12).

70
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Tableau n°12 : Les milieux de culture utilisés pour la production de biomasse et d’enzyme.

Condition de
Composition par litre Désignation Utilisation
culture
Y.E. = 10 g
urée = 2.4 g
NaCl = 3 g SBF
NiCl2 = 128 mg
pH = 8.5
Y.E. = 6 g
Chicorée=1.5 g
urée = 2.4 g
SBF Chic
NaCl = 3 g Agitation
Production de
NiCl2 = 128 mg (120 rpm)
biomasse et
pH = 8.5 20 - 22° C
d’enzymes
Y.E. = 6 g 24h
Chicorée = 1.5 g
urée = 2.4 g
NaCl = 3 g
SBF Chic
MgCl2 = 0.1 g
Vit
NiCl2 = 128 mg
Cocktail de
vitamines
pH = 8.5

Le dispositif expérimental prévoit une phase de culture bactérienne de 24 heures à

température ambiante soit entre 20 et 22° C, pour obtenir en fin de phase exponentielle un
maximum d’activité enzymatique de type uréase. De plus, en fin de phase exponentielle, le
milieu de culture ne possède quasiment plus d’éléments nutritifs. Cette désignation n’est plus
justifiée par conséquent, on parlera donc d’une solution ou préférentiellement d’une suspension
de biomasse. Chacune d’entre elles est caractérisée avant d’être injectée en colonne, par son
activité enzymatique de l’uréase (A.E.), la mesure de sa densité optique à 600 nm (D.O.).
L’activité enzymatique spécifique (A.E.S. = A.E./D.O.) peut alors être calculée. Les
suspensions de biomasse sont refroidies puis stockées à 4° C pendant 24 à 72 heures. Elles sont
réchauffées sur la table d’agitation avant d’être injectées. Des mesures de l’activité
enzymatique et des observations au microscope optique sont réalisées avant son injection dans
les colonnes.

5.2. La mesure des activités enzymatiques.

La qualité des suspensions de biomasse est évaluée à l’aide deux paramètres : la mesure
de la densité optique (D.O.) et la mesure de l’activité enzymatique uréasique (A.E.). La mesure
de la D.O. cellulaire se réalise sur une prise d’essai de 300 µl de suspension bactérienne qui est
diluée dans 2.7 ml d’eau distillée directement dans une cuvette pour spectrophotomètre. La
mesure d’absorbance à 600 nm s’accomplit grâce à un spectrophotomètre Biomate 3, de chez
Thermo Electron corporation. La mesure de l’activité enzymatique (A.E.) s’effectue sur 3 ml
de la suspension bactérienne diluée dans 27 ml d’une solution d’urée à 1,1 M soit 66 g/l. La
mesure de l’activité, réalisée dans les conditions de Michaelis-Menten, s’opère par mesure de
la conductivité grâce au multi paramètre Multi 340i (marque WTW), et d’une double sonde de
conductivité et de température TetraCon 325 de chez WTW et cela dans les conditions
dynamiques, à 20 °C. Une mesure de la conductivité du mélange est effectuée toutes les

71
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

minutes pendant une durée de 6 min. Le coefficient directeur de la pente de la courbe de

conductivité en fonction du temps, permet de calculer l’activité enzymatique de la suspension
testée dans ces conditions standard. L’activité enzymatique est donnée en µS/cm/min. Il s’agit
là de l’activité enzymatique totale (A.E.T.). Au cours de cette recherche, il a été mis en
évidence que l’enzyme ayant tendance à sortir de la cellule, une mesure de l’activité est donc
faite sur une fraction filtrée sur des filtres de 0.2 µm de porosité qui retiennent les cellules.
L’activité alors mesurée correspond à l’activité enzymatique extracellulaire ou libre (A.E.L).
Elle est peu intéressante pour le procédé car l’enzyme libre ne s’adsorbe que très peu sur les
grains de sable et dans tous les cas, moins bien que les bactéries. L’activité enzymatique
spécifique (A.E.S) est déduite grâce au rapport A.E./D.O., son unité est donc le
µS/cm/min/D.O.

6. La méthode de stimulation de l’adhérence.

D’après des tests réalisés sur galeries API 20 E et 50 CH, un ose, l’inuline, qui est
contenue en grande quantité dans la chicorée, est facilement métabolisable par S. pasteurii
(CIP 66.21) et stimule à faible concentration sa croissance. L’inuline est un mélange de
polymères de 2 à 70 unités de fructose avec un glucose en position terminale. C’est d’ailleurs
le seul sucre que cette souche utilise comme seule source de carbone et d’énergie. Il joue pour
la bactérie un rôle très important dans la stimulation de sa fabrication d’adhésines et/ou des
polymères de sa capsule. Ainsi, la souche présentera de plus grandes capacités de fixation à la
surface des grains de sable. Ce produit a donc été ajouté une première fois dans le milieu de
production de biomasse à raison de 1.5 g/l, mais aussi une deuxième fois dans une étape
supplémentaire qui se réalise durant le réchauffement de la solution de biomasse et/ou avant
son injection. Cet ose en excès, est alors assimilé et favorise les voies de synthèse des exo
polysaccharides (EPS) qui seront exportés à la surface des cellules. Ce processus dépend de
l’état physiologique des cellules, et peut prendre à ce moment là entre 1 à 3 heures.
Ensuite, lorsque la solution de biomasse est prête à être injectée, 10 mM de sels de
calcium sont ajoutés (Tableau n°13). Les cations multivalents interagissent spécifiquement
avec les fonctions carboxyliques des EPS. Ils conduisent alors à une consolidation du maillage
polysaccharidique et à une diminution des forces électrostatiques de répulsion entre les grains
de silice et les bactéries, les deux étant naturellement chargés négativement. Cette étape ne
modifie ni la viscosité, ni le volume de la suspension de biomasse à injecter, ni l’activité
enzymatique. Les produits ajoutés ne présentent pas de toxicité pour les micro-organismes
et/ou pour l’environnement.

Tableau n°13 : Les caractéristiques de la solution améliorant la fixation.

Composition Concentration Utilisation

Chicorée 4 à 2 g/l de chicorée 1 à 3 heures à 20° C sous agitation.
Juste avant l’injection dans la
Nitrate de calcium 2.36 g/l
solution à 20° C sous agitation

72
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

7. La suspension de biomasse et son injection.

La suspension de biomasse à injecter est placée au même niveau que la colonne sur un
agitateur magnétique. Elle est reliée à l’entrée de la colonne (embase supérieure) par un
flexible ajusté au niveau de la tête de pompe. Cette suspension biologique a été définie
également par des paramètres propres au procédé d’injection. En effet, le volume de pore
(V.p), le nombre de séquences d’injection et la durée de batch (pause) sont des éléments définis
lors de la préparation de l’expérience et du montage de la colonne.
L’ensemble de ces caractéristiques établies pour chaque colonne injectée a évolué au
cours de cette recherche. Elles sont regroupées dans une fiche synthétique (Tableau n°14).

Tableau n°14 : Exemple de fiche regroupant les caractéristiques techniques de la

suspension bactérienne avant injection.

Exemple de suivi de
Fiche des caractéristiques d’une solution de biomasse
colonne
Souche bactérienne CIP 66.21
Milieu de culture SBF
Age de la culture 24 h
Densité optique - 600 nm 1.82
Activité enzymatique (µS/cm/min) 968
Activité enzymatique surnageant ND
Activité enzymatique spécifique (µS/cm/min/D.O.) 532
Nombre d'injections de V.p (Volume de pore) 1
Volume injecté (cm3) 250
Conductivité (mS/cm) ND
Débit-Vitesse d'écoulement (cm3/h - cm/h) 250 ml/h – 20 cm/h
Temps d’injection de 1 volume de pore (heure) 1
Temps de batch (heure) 3
Matière organique ajoutée (fixation) Chicorée 4 g/l
Sel de calcium ajouté (fixation) Ca(NO3)2 10 mM
ND : non déterminé.

8. La préparation de la solution calcifiante.

La solution calcifiante est un mélange équimolaire d’un sel de calcium et d’une source de
carbonate sous forme d’urée. Le calcium se présente sous forme de sel de calcium, avec deux
sources prépondérantes, le chlorure de calcium (CaCl2) et le nitrate de calcium Ca(NO3)2. Dans
cette recherche, les deux sources de calcium ont été testées, mais en utilisant des produits d’une
qualité proche de la réalité du chantier industriel, c'est-à-dire impurs. Ce choix nécessite donc
une étape supplémentaire lors de la préparation de la solution calcifiante lorsqu’il s’agit du
chlorure de calcium. En effet, une filtration sur filtre à café est nécessaire avant de le mélanger

73
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

à l’urée. Cette opération élimine de nombreuses particules micrométriques qui pourraient

colmater la colonne de sable fin. Les volumes et les concentrations sont déterminés lors de la
préparation de l’expérience d’injection et du montage des colonnes (Tableau n°15).

Tableau n°15: Exemple de fiche technique regroupant les caractéristiques de

la solution calcifiante.

Exemple de suivi de
Fiche des caractéristiques d’une solution calcifiante
colonne
Nature du sel de calcium Ca(NO3)2
Concentration en calcium (mol/l) 0.3
Concentration en urée (mol/l) 0.3
Volume injecté (cm3) 2600.
Conductivité (mS/cm) 44
Nombre d'injection de volume de pore (V.p) 1
Temps d’injection d’un volume de pore (heure) 7.2 heures
3
Débit -Vitesse d'écoulement (cm /h - cm/h) 6 ml/min - 14.5 cm/h
Temps de batch (heure) entre chaque volume de pore 72

Pour améliorer les possibilités de nucléation et/ou de croissance cristalline, une faible
quantité de matière organique a été additionnée dans certaines solutions calcifiantes quel que
soit le sel de calcium utilisé (Tableau n°16).

Tableau n°16 : Exemple de fiche précisant la composition des solutions calcifiantes

améliorées.

Caractéristiques d’une solution calcifiante améliorée Exemple de suivi de colonne

Nature du sel de calcium CaCl2 ou Ca(NO3)2
Concentration en calcium (mol/l) 0.3
Concentration en urée (mol/l) 0.3
Nature et quantité de la matière organique (g/l) Chicorée : 0.25

74
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

III. LES CONDITIONS D’INJECTION.

Les injections en colonne suivent un protocole d’injection qui est défini par des
paramètres de chantier. En effet, ce sont les paramètres technico-économiques qui définissent
le nombre de volume de pore, les vitesses réelles d’injection, la durée d’un chantier modèle et
la température présente en sub-surface. L’ensemble de ces paramètres de chantier définissent
une fenêtre de faisabilité (Tableau n°17).

Tableau n°17 : Synthèse des conditions chantiers définissant le protocole d’injection en

colonne.

Conditions chantiers du procédé de bio calcification

Nombre total de volume de pore pouvant être appliqué 1à6
Vitesses réelles d’injection pouvant être appliquées 0.2 à 0.6 m/h
Température en sub-surface 12° à 20°C
Durée du chantier 7 jours
Sens de l’injection Unidirectionnel
Séquence d’injection Biomasse – Sol calcifiante

1. Le protocole d’injection de la suspension de biomasse.

Les suspensions de biomasse sont placées à la même hauteur que les embases
supérieures des colonnes à injecter pour faciliter la calibration du débit et de son maintien au
cours de l’injection. La calibration se réalise avec des tuyaux flexibles identiques à ceux qui
serviront pour les injections des solutions calcifiantes.

Elle s’effectue à l’aide d’une éprouvette graduée et d’un chronomètre dans le cas de la
pompe péristaltique Matsterflex L/S Digital et avec le logiciel d’exploitation Matsterflex dans
le cas d’une pompe péristaltique Matsterflex L/S Computerized. Les injections peuvent être
réalisées à l’aide de l’une ou l’autre. Les raccords flexibles MasterlfexL/S Tygon de taille 13
reliant les suspensions bactériennes à l’entrée des colonnes passent par des têtes de pompe
Masterflex L/S easy load de modèle 7518-00. En effet, une certaine hauteur de charge est à
respecter, car une différence trop importante entre le niveau de la suspension de biomasse à
l’entrée de la colonne et en fin d’injection risque de réduire le débit. La première phase de la
procédure d’injection consiste en la mise en place de la suspension bactérienne. Ce protocole
d’injection est identique pour des colonnes simples (20 cm), double (40 cm) ou triple (60 cm),
seuls les volumes injectés varient.

2. Le suivi de la fixation bactérienne en cours d’injection.

Le rendement du procédé repose sur l’efficacité du dépôt de la biomasse dans une

matrice poreuse et siliceuse. Ce dépôt est assimilé à une estimation du taux de fixation. Ces
informations sont nécessaires pour mieux appréhender la relation entre la distribution de la
biomasse et les zones de calcification. Il est nécessaire d’estimer le taux de fixation bactérienne
en fonction du point d’injection et par rapport au nombre de volume de pore injecté.

75
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

MESURE EN CONTINU

Entrée de la biomasse

[Link]

Débit
Débit Figure n°12 : Dispositif
expérimental permettant de
T°C
3
T°°C suivre l’injection et le dépôt
Colonne
thermostatée [Link] de biomasse.
Logiciel (20°C)
d'acquisition
VisionLite
rate V1.0

Sortie

Le suivi de la fixation bactérienne est fait par la mesure de la D.O. sur les liquides de
sortie de la colonne. Pour cela, un spectrophotomètre (Biomate 3, Themo electron) qui est
placé en sortie de colonne, par l’intermédiaire d’une cuve à circulation en quartz (Suprasil,
Hellma), mesure la densité optique ou absorbance (A) à 600 nm (D.O.600) soit toutes les 30
secondes soit toutes les 2 minutes selon le modèle de colonne injectée (Figure n°12). Les
volumes non utiles, que représentent les tubes reliant les colonnes, sont minimisés en utilisant
les plus petits diamètres possibles, généralement de 1 mm.
Avant chaque suivi de biomasse, une ligne de base (blanc) est réalisée à partir d’une
suspension bactérienne filtrée sur une membrane de cellulose à 0.2 µm, c'est-à-dire ne
renfermant plus que le milieu de culture. Une estimation de la D.O. fixée peut être déduite de
la quantité de D.O cellulaire qui sort de la colonne après l’injection du 1er volume de pore de
solution calcifiante. La représentation théorique (Figure n°13) permet une visualisation directe
de la fixation.
D.O
[Link]
ensortie
sortie par
par rapport
rapport àà la
laD.O.
D.O. en
en entrée du 11erer
entrée du
V.P
[Link]
porede
desolution
solution calcifiante.
calcifiante.

100
100
90
90 D.O fixée
D.O fixéedans
danslalacolonne
colonne
en %
V.p)V.p)

80
80
(1er(1er

70
70
Figure n°13 : Représentation
entrant

60 théorique de la fixation bactérienne

entrant

60
50
à l’intérieur de la colonne.
sortie/D.O

50
ensortie/D.O

40
40

30
[Link]
D.O.

20 D.O. sortie
sortie colonne
colonne n°
n°11
10

0
0,0
0.0 0,5
0.5 1,0
1.0 1,5
1.5 2,0
2.0 2,5
2.5 3,0
3.0 3,5
3.5
Nombre
Nombrede
devolume depore
volume de pore(V.p)
(V.p)

Dans cette représentation, la colonne semble fixer environ 17 % de la biomasse

injectée. Ces informations sont à complémenter avec d’autres paramètres car, les courbes de

76
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

sortie de D.O. et donc la fixation des bactéries, vont dépendre à la fois de la taille et de la
nature des grains de sable, et du degré d’homogénéité, c’est-à-dire du compactage des
colonnes. Ceci est particulièrement visible dans l’exemple ci-après qui concerne des colonnes
montées en série (Figure n°14).

Figure n°14 : Représentation du

lessivage de la biomasse des
colonnes n°1 et n°2, montées en
série, par l’injection de la
solution calcifiante.

3. Protocole d’injection de la solution calcifiante.

Les solutions calcifiantes sont fabriquées extra temporairement de façon à limiter toute
éventuelle hydrolyse précoce de l’urée. Les injections sont réalisées de la même manière que
celle de la suspension de biomasse.

77
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

IV. LA COLLECTE DES RESULTATS.

1. Le démoulage des échantillons.

Après les injections, les colonnes doivent être démontées pour évaluer le rendement de
la bio calcification. La difficulté de cette opération est d’extraire la colonne de son enveloppe
en PVC sans la détruire ni la fissurer afin de ne pas fausser les résultats des essais de
compression. Les embases inférieures et supérieures sont toutes deux déboitées du tube en
PVC. Les trois premiers centimètres et demi de chaque extrémité du tube PVC sont sciés pour
être éliminés. Seuls les 12 cm du corps central de la colonne (cas des colonnes de 20 cm) sont
conservés et découpés de façon longitudinale afin d’extraire l’échantillon (Figure n°15).

Figure n°15 : Schéma d’une colonne dont est

20 cm 19 cm 12 cm
extrait l’échantillon destiné à la compression
verticale simple.

6,3 cm

Les échantillons ainsi extraits possèdent un élancement de 2, c’est à dire un rapport

longueur/diamètre = 2. Ce rapport est nécessaire pour éviter le frettage lors des essais de
compression uniaxiale non confinée selon la norme NF P 94-077..Pour permettre une bonne
représentativité et reproductibilité des résultats, les échantillons sont tous compressés
immédiatement après l’arrêt de l’expérience. Toutes les pièces du dispositif, sauf le tube en
PVC qui a été scié, sont ensuite nettoyées à l’aide d’une solution d’acide HCl 11 N pour une
réutilisation.

2. La mesure de la résistance maximale à la compression uniaxiale simple.

Une fois démontées, les colonnes de sable calcifiées sont préparées pour être soumises
à l’écrasement en compression non confinée. Cet essai de compression simple est réalisé à
l’aide d’une presse hydraulique Instron de modèle 4467 pilotée par ordinateur avec acquisition
automatique des données grâce au Logiciel série IX v 8.15. Avant d’être écrasées, les surfaces
des extrémités des échantillons sont lissées à l’aide d’un papier de verre pour rendre parallèle
les surfaces d’appui lors de l’écrasement. L’éprouvette humide recueillie de 12 cm est placée
orthogonalement entre les deux plateaux. Seul le plateau supérieur est mobile et avance à une
vitesse constante de déformation longitudinale de 2 mm/min, à température constante de 20° C.
La mesurer la force axiale appliquée (F) à l’éprouvette se réalise en temps réel. Les essais de
compression sont menés jusqu'à la rupture de l'échantillon. La résistance à la compression (Rc)
obtenue est un indicateur de la résistance mécanique. L’allure de la courbe de type (contrainte

78
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

– déformation) montre l’évolution de la force de compression (F). Cette courbe peut expliquer
le type de mécanisme et surtout le comportement du matériau. Le calcul de la contrainte
maximale de résistance (Rc) à la compression simple, de l’échantillon est donné en KPa ou
MPa. Il résulte de la loi de Hooke : σ = E/ε avec σ la contrainte normale en Pa proportionnelle
à l’allongement relatif ε sans unité et par la constante du module de Young E en Pa. La
contrainte de σ compression est égale à la force F divisée par la surface S en m² pour une
matériau élastique..
Les valeurs relatives à la résistance maximale à la compression simple pour chaque
colonne ont été rassemblées dans des fiches d’essai de compression de colonnes (Tableau
n°18). Un exemple de courbe σ = f(ε) = f (∆h /h0) de résistance à la compression en fonction de
la déformation est donné (Figure n°16).

Tableau n°18 : Exemple de fiche présentant les caractéristiques des essais compressions.

Fiche des caractéristiques des compressions de colonnes

Type d’essai Paramètres suivis Exemple de colonne

Contrainte maximale (MPa) 1.1176

Essais de compression
simple
Taille de l'échantillon (cm) 12 (Elancement de 2)
Aspect de la courbe ,Pic

Rcmax
Rupture fragile Effondrement
des liaisons
Phase élastique cimentées
Figure n°16 : La force axiale appliquée à
E l’éprouvette en fonction de la déformation
F = f (∆h).
Défauts de .
Endommagement et
parallélisme
rupture progressive

3. La détermination de la teneur en carbonate de calcium des colonnes.

La détermination de la teneur en carbonate de calcium est réalisée à partir d’un

calcimètre de Bernard. Le principe du calcimètre consiste à mesurer le dégagement du dioxyde
de carbone issu d’une attaque acide (HCl 11N) sur des échantillons de sables calcifiés. Le sable
employé dans ces essais est siliceux et donc tout le CO2 dégagé correspond au carbonate
précipité. Le volume ainsi dégagé par l’attaque acide est comparé à une courbe étalon, ceci
pour déterminer la teneur en carbonate de calcium de l’échantillon. Ces mesures sont réalisées
à température ambiante.

79
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Les morceaux de l’éprouvette testée issus de l’écrasement sont regroupés puis broyés
dans un mortier de façon à obtenir un mélange homogène. La bonne représentativité de
l’échantillon à doser est réalisée en suivant une méthode de prélèvement et d’homogénéisation
standardisée, courante en chimie. Cette méthode consiste, à partir de l’échantillon écrasé, à le
broyer pour ensuite le diviser en quatre parts égales puis de réduire de manière dichotomique
l’échantillon en éliminant deux parts. Les deux parts restantes sont à nouveau mélangées pour
être de nouveau divisées en quatre parts égales. Ce processus s’arrête à la fin lorsque le
diamètre de la colonne correspond à la dimension du sable mélangé. Cet échantillon est ainsi
représentatif de la partie écrasée de la colonne. La teneur en carbonate de calcium est une
donnée essentielle pour comparer l’efficacité du traitement pour chaque colonne. Elle est
donnée g de CaCO3 par cm3 de volume d’échantillon selon la formule suivante :

CaCO3 ( g/cm3) = [(VCO2 /a)) /(M éch(VCO2 /a))]*d,

avec a le coefficient directeur de la courbe étalon et d la densité de la colonne dont est issu
l’échantillon écrasé.
La mesure de la teneur en carbonate de calcium a également été confiée à un laboratoire
accrédité COFRAC sur ce dosage spécifique. Les mesures ont été réalisées selon la norme en
vigueur (NF ISO 10693 X 31-105) et les résultats sont donnés en g de CaCO3 par kg
d’échantillon. La formule permettant de passer de g de CaCO3/ kg d’échantillon au g de
CaCO3/ cm3 est :

CaCO3 (g/cm3) = [(X CaCO3g/g) / ((1-(X CaCO3g/g))*1/d)]

L’ensemble des valeurs des teneurs en carbonate de calcium est rassemblé pour chaque
colonne dans une fiche synthétique (Tableau n°19).

Tableau n°19 : Exemple de fiche établie pour les dosages de CaCO3.

Fiche des caractéristiques des teneurs en carbonate de calcium
Type de test Paramètres suivis Exemple de colonne
Teneur en CaCO3 (mg/g) de sol 0.080
Calcimètre de Bernard
Teneur en CaCO3 (g/cm3) de sol 0.045
Contrôle inter-colonne CaCO3 (g/cm3)/Silice (g/cm3) 0.79

4. Les observations des échantillons au Microscope à balayage (MEB).

Après les mesures de la résistance à la compression simple, les fragments de colonne

sont séchés à basse température puis envoyés pour observation ultra microscopique. La
calcification des colonnes a été observée au Microscope Electronique à Balayage (M.E.B.)
Géol à effet de champs 6400F, dans le Service de microtitration et de microscopie électronique
de l’Université de Nantes. Les prélèvements et les observations ont été réalisées par Mesdames
Castanier-Perthuisot et Levrel du Laboratoire de Microbiogéologie de l’Université d’Angers
qui est rattaché à l’équipe de M. le Professeur Jorissen, appelée « Bio Indicateurs Actuels et
Fossiles » : B.I.A.F. Systématiquement, les prélèvements d’échantillon ont été faits en
périphérie de colonne et dans la zone centrale. Dans la mesure du possible, trois niveaux dans
les colonnes (haut, mi-hauteur et bas) ont été observés. Ces données permettent de mieux

81
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

appréhender les performances des traitements ainsi que d’appréhender l’existence de zones
d’écoulement préférentiel.
Le prélèvement est collé sur plot en cuivre, soit avec de la colle d’argent soit sur un
scotch double face noir. La technique du point critique, pourtant classique pour l’observation
des bactéries ou des cellules eucaryotes, n’est pas appliquée car elle n’est pas adaptée à ce type
d’échantillon composé d’un mélange de bactéries, de sable et de carbonate de calcium. Les
plots sont mis sous vide et leur surface est métallisée avec un mélange or/palladium. La couche
déposée n’excède jamais une épaisseur de 150 Angströms, ce qui permet une conservation
maximale du microrelief et donc une meilleure observation aux forts grossissements. Elle reste
cependant suffisamment conductrice pour les électrons.
Dans certains cas, des analyses atomiques des minéraux sont réalisées sur le
Microscope Electronique Jéol 5800 qui est couplé à une sonde atomique. Les diagrammes
obtenus indiquent la composition en atomes et en aucun cas, n’identifient avec certitude la
nature cristalline du minéral. De plus, le pinceau du faisceau d’analyse, très perforant, ne
permet pas de limiter l’analyse à une épaisseur inférieure à 1 µm. L’interprétation des profils
d’analyse doit donc être faite avec précaution car, il sera souvent difficile n’analyser que les
nano-grains sans atteindre leur support.

5. Les analyses chimiques des effluents du procédé.

Le protocole opératoire de prélèvement, d’analyse et de conditionnement a été encadré

par IANESCO-CHIMIE. En effet, les effluents, issus de la bio calcification sont
particulièrement instables, à cause de la présence simultanée de bactéries, d’enzymes libres, de
résidus organiques et minéraux du milieu de production de biomasse, et des réactifs contenus
dans le milieu calcifiant (urée, nitrate ou chlorure de calcium). Les paramètres chimiques suivis
sont, le carbone organique total (COT), le NH4+, le NO3-, le Ca 2+, l’azote total Kjeldhal
(NTK), le phosphore, le magnésium, les chlorures, le nickel et le titre alcalimétrique complet
(TAC) dans le cas des colonnes représentatives du procédé (Tableau n°20), et également, le
pH, la conductivité, l’oxygène dissous et la température.

Tableau n°20 : Les analyses physico-chimiques pratiquées sur les effluents.

Analyse Spécificité Unité Normes

Carbone organique
COT mg/l NF EN 1484 (oxydation chimique)
Total
Calcium NF EN ISO 7980 (Flamme) après filtration sur
Ca mg/l
dissous 0.45µm
Chlorures Cl mg/l NF EN ISO 10304-2
Conductivité à 25° C µS/cm NF EN 27888
Carbone organique
DCO mg02/l NF T 90-101
dissous
pH Unité pH NF T 90-008
P Phosphore total mg/l NF EN 6878(article 8) méthode automatique
Ortho
P04 mg/l NF EN ISO 6878 (article 4)
phosphates
Matières en
MES NF EN 872 (filtre en fibre de verre Sartorius)
suspension
NF EN ISO 7980 (flamme) après minéralisation.
Mg total Magnésium total mg/l
acide

82
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

NF EN ISO 7980 (flamme) après filtration sur

Mg dissous Magnésium dissous mg/l
0.45µm
N-NO2 Azote nitreux mg/l NF EN ISO 13395 (flux)
N-NH4 Azote ammoniacal mg/l NF T 90-015-1 (distillation +titrimétrie soude)
N-NO3 Azote nitrique mg/l NF EN ISO 13395 (flux)
NTK Azote Kjeldhal mg/l NF EN 25663
Ni Nickel total mg/l FD T 90 112 (Flamme) après minéralisation
SO4 Sulfates mg/l NF EN ISO 10304-2
Température °C
Titre alcalimétrique
TAC °F NF EN ISO 9963-1 (potentiomètrie)
complet
TA Titre alcalimétrique °F NF EN ISO 9963-1 (potentiomètrie)
TH Dureté totale °F NF EN ISO 7980 (flamme) après filtration

Lors de la dernière injection à l’eau, les effluents sont récupérés dans des flacons en
verre de 250 ml placés dans un bac réfrigérant à 4° C, pour stopper l’activité bactérienne. Les
flacons sont en verre car cette matière possède des propriétés thermo-conductibles élevées, ce
qui accélère le refroidissement. Les effluents récupérés sont ensuite transvasés dans des flacons
normalisés. Certaines analyses chimiques nécessitent l’ajout d’acide pour stabiliser ces liquides
métastables. Ainsi l’acide phosphorique est utilisé pour l’analyse du COT et l’acide
nitrique pour l’analyse du calcium et magnésium. Quant à l’acide sulfurique, il est nécessaire
pour les analyses de NTK, NH4+ et phosphore.
Les effluents ont été ensuite envoyés à IANESCO-Chimie qui après une description
portant sur la couleur (incolore/jaune/marron), l’odeur (sans odeur/odeur de milieu de
culture/ammoniac) et la présence de précipité (nul/faible/important), pratique les analyses.

Des données complémentaires telles que la conductivité, la température (° C), NH4+,

pH et l’oxygène ont été également collectées au laboratoire de Montereau (Tableau n°21).

Tableau n°21 : Liste des paramètres complémentaires mesurés au Laboratoire de Montereau.

Analyses Unités Références

pH unité pH
T° C mg/l
Multi paramètres 340I
Conductivité mS/cm
Teneur en Oxygène mg/l
Densité optique (D.O. 600 nm) A (Absorbance) Spectrophomètre Biomate 3
NH4+ (D.O.) 575 nm mg/l Réactif de Nessler
Etat Frais Microscope Zeiler
Comptage de cellules Bactéries/ml Cellule de Malassez

Le dosage de l’ammonium est accompli à l’aide du réactif de Nessler. Une prise

d’essai de 10 µl est mélangée dans une cuve de spectrophotomètre au réactif de Nessler puis
placée à l’abri de la lumière pendant 5 minutes exactement. Une mesure de densité optique
(D.O.) à 425 nm est alors effectuée. Les résultats sont portés sur une courbe étalon réalisée à
partir d’une gamme de concentrations variant de 0 à 1.6 g/l de chlorure d’ammonium.
Des analyses de microbiologie sont également réalisées telles que le suivi de la D.O.
cellulaire à 600 nm, l’activité enzymatique totale (A.E.T) et l’activité enzymatique du
surnageant ([Link] ou A.E.L.). Les observations à l’état frais permettent d’évaluer l’état
physiologique, la taille, la forme, la mobilité et éventuellement le degré de contamination de la
suspension.

83
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

V. L’ORGANIGRAMME DE LA MISE EN PLACE DU PROCESSUS D’INJECTION

EN COLONNE.

Cet organigramme permet de situer toutes les étapes de la procédure d’injection en

colonne de sable élaborée au laboratoire (Figure n°17).

84
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Montage de colonne et Suspension de Extraction, compression et analyses

calibration de la pompe biomasse

Montage de l'embase Culture sur boite Découpe

inférieure et du corps en PVC Mesure de transversale et
l'activité longitudinale de la
Sub-culture liquide enzymatique et colonne :
Compactage du sable en de la D.O.600 échantillon
immersion cellulaire d'élancement 2
Culture liquide : production
de biomasse
Essais de circulation
d'eau Compression
Stockage 4° C de la uniaxiale simple
Calibration de la pompe suspension de biomasse

Ajout des additifs de fixation Echantillon écrasé

Programmation du dans la suspension de biomasse pour l’analyse de la OBJECTIF :
programmateur horaire teneur en CaCO3
pour les cycles d'injections Injection de la suspension
de biomasse bio calcification
homogène en
colonne
Envoi des effluents dans les
Injection de la solution conditionnés au conditions
calcifiante laboratoire d'analyse chantier.

Ajout de l’additif pour Conditionnement des

l'amélioration de la solution effluents dans les
calcifiante flacons acidifiés

Solubilisation de l'urée
et des sels de calcium Réception en sortie de
colonne des effluents
dans des flacons à 4° C
Mesure de la masse de sel
de calcium et d'urée
Préparation des Mesure de la D.O.600
flacons, ajout de l'acide cellulaire, conductivité, pH,
température, oxygène
Solution de calcification
Analyses physico-chimiques

Figure n°17 : L’organigramme représentant les différentes étapes des tests.

85
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

VI. LE PROTOCOLE D’INJECTION.

Le procédé comporte fondamentalement deux phases. La première consiste en la mise

en place de la biomasse dans le système siliceux, la seconde apporte les sels de calcium et l’urée.
Ces deux phases peuvent être injectées en continu, c’est-à-dire qu’il n’y a pas d’arrêt entre la
mise en place de la suspension de biomasse et celle de la solution calcifiante. Cependant, elles
peuvent être aussi injectées en mode semi continu. Dans ce cas, il y a un temps appelé temps de
batch qui sépare ces deux phases. Le batch se matérialise par une immobilisation des fluides
pendant une durée définie à l’avance. La phase biologique est représentée par l’injection d’un
volume de pore. Quant à la phase calcifiante, elle peut comporter entre 3 et 5 volumes de pores.
Chacun de ces volumes de pores est séparé par un batch dans le mode d’injection semi continu.
Les vitesses réelles d’injection sont toutes constantes et fixées à 0.2 m/h dans le mode semi
continu. En mode continu, deux vitesses d’injection ont été testées, des vitesses de chantier et des
vitesses faibles (< 5 cm/h) (Tableau n°22).

Tableau n°22 : Les paramètres impliqués dans l’élaboration d’un protocole d’injection.

Conditions d’injection sur colonnes de 20, 40 ou 60 cm

Mode d’injection continu semi continu

Nombre de volumes de pores de
1 1 2
suspension de biomasse injectée

Vitesse réelle d’injection de la biomasse 5 cm/h 20 cm/h 20 cm/h

Réalisation de batch non oui

Nombre de volumes de pores de solution
5 3à5
calcifiante injectée
Vitesse réelle d’injection de la solution
5 cm/h 20 cm/h 20 cm/h
calcifiante
Réalisation de batch non oui

L’objectif principal de cette sélection de paramètres est l’établissement d’un protocole

d’injection capable de cibler les critères optimisant la bio calcification pour le processus
biologique ainsi que ceux du chantier.

86
 Chapitre III. Matériels et Méthodes.

VII. LE DESCRIPTIF GENERAL DES INJECTIONS REALISEES EN COLONNES.

L’industrialisation du procédé de bio calcification a nécessité l’élaboration d’un protocole

d’injection, c'est-à-dire l’établissement d’une séquence d’injection dans les conditions des
chantiers, capable d’aboutir à une bio calcification homogène. Pour cela, trois paramètres
interdépendants ont été pris en compte :
1. la biomasse,
2. la solution calcifiante,
3. le mode d’injection.
L’impact du paramètre biomasse a été étudié sur deux niveaux, i. l’estimation du taux de
fixation en fonction du type de sable et ii. le maintien de l’activité enzymatique au cours du
temps. L’impact de la solution calcifiante sur le processus de bio calcification est étudié sur trois
niveaux, i. l’effet de la nature du sel de calcium, ii. l’effet de la concentration et iii. l’effet de
l’équimolarité avec l’urée. Enfin, l’impact du mode d’injection, continu ou semi continu, a été
étudié ainsi que la vitesse d’injection, et la durée d’un temps de batch propice à la bio
calcification. Les interactions de ces trois paramètres ont permis de définir, le protocole
d’injection.

Pour étudier l’ensemble de ces paramètres, 189 colonnes ont été injectées et les conditions
générales testées pour chacun des paramètres sont présentées ci-après (Tableau n°23).

Tableau n°23 : Les caractéristiques générales des colonnes injectées.

Température ambiante (20° C)

Injection en continu Injection en semi continu
Sable Itterbeck Sable Fontainebleau Sable Itterbeck Sable Fontainebleau
Compactage : Compactage : Compactage : Compactage :
pluviation et tassement pluviation et tassement pluviation et tassement pluviation et vibration
Longueur 0.2 m Longueur 0.2 m Longueur 0.2 - 0.6 m Longueur 0.2 - 0.6 m
Vitesse d’injection Vitesse d’injection Vitesse d’injection Vitesse d’injection
0.05 - 0.2 m/h 0.05 - 0.2 m/h 0.05 - 0.2 m/h 0.05 - 0.2 m/h
Nombre de volume pore Nombre de volume pore de Nombre de volume pore Nombre de volume pore de
de biomasse 1 biomasse >10 de biomasse 1 biomasse 1 et 2
[U/Ca(N03)2] et [U/Ca(N03)2] et [U/Ca(N03)2] et [U/Ca(N03)2] et
[U/CaCl2] [U/CaCl2] [U/CaCl2] [U/CaCl2]
= 0.5 - 0.83 M = 0.5 - 0.83 M = 0.5 - 0.83 M = 0.5 - 0.83 M
Volume pore de solution Volume pore de solution Volume pore de Volume pore de solution
calcifiante calcifiante solution calcifiante calcifiante
V.p = 5 et >10 V.p = 5 et >10 V.p = 3 - 5 V.p = 3 - 5

Les tableaux suivants (Tableaux n°24, 25 et 26) présentent les différentes variables
testées pour la détermination du comportement de la biomasse sur le rendement de la bio
calcification.

87
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Tableau n°24 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer

l’effet de la quantité de biomasse.

IMPACT DE. QUANTITE DE BIOMASSE

PARAMETRES CONSTANTS PARAMETRES VARIABLES
Nombre de
Type de Solution Vitesse Nombre de V.p de
Méthode de Mode V.p de
sable calcifiante réelle solution calcifiante
compactage d’injection biomasse
utilisé [U/Ca 2+] d’injection injecté
injecté
Pluviation et En semi
SFB 0.5 M 0.2 m/h 1 - 2 V.p 3 – 5 V.p
vibration continu
SFB : Sable de Fontainebleau. V.p. : Volume de porosité.

Tableau n°25 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer

l’impact du taux de fixation de la biomasse.

IMPACT DU TAUX DE FIXATION DE LA BIOMASSE

PARAMETRES CONSTANTS PARAMETRES VARIABLES
Nombre
Solution
Méthode de Vitesse réelle de V.p de Mode Type de sable Hauteur de
calcifiante
compactage d’injection biomasse d’injection utilisé colonne
[U/Ca 2+]
injecté
En semi-
Pluviation et
0.2 m/h 1 V.p 0.5 M continu et SFB/Itterbeck 0.2 - 0.6 m
vibration
continu
SFB : Sable de Fontainebleau. V.p. : Volume de porosité.

Tableau n°26 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer

le maintien de l’activité enzymatique de la biomasse.

IMPACT DU MAINTIEN DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE

PARAMETRES CONSTANTS PARAMETRES VARIABLES
Nombre
Type de
Méthode de Vitesse réelle de V.p de Mode d’ Hauteur Temps de
sable T° C
compactage d’injection biomasse injection de colonne batch
utilisé
injecté
semi-
Pluviation et
0.2 m/h 1 V.p continu et SFB 0.2 m 12 - 20° C 24 – 48 h
tapotement
continu
SFB : Sable de Fontainebleau. V.p. : Volume de porosité.

Les tableaux suivants (Tableaux n° 27 et 28) précisent les conditions expérimentales

appliquées aux colonnes pour la détermination de l’impact de la solution calcifiante sur le
processus de bio calcification à température ambiante, tandis que le Tableau n°29 montre celles
pour l’étude de l’impact du mode de compactage.

88
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Tableau n°27 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer

la nature du sel de calcium.

IMPACT DE LA NATURE DU SEL DE CALCIUM

PARAMETRES
PARAMETRES CONSTANTS
VARIABLES
Type de Solution Nombre de Vitesse
Méthode de Mode
sable calcifiante Volume de réelle Sels de calcium utilisés
compactage d’injection
utilisé [U/Ca 2+] pore injecté d’injection
pluviation semi
SFB 0.5 M 5 V.p. 0.2 m/h Ca(NO3)2 et CaCl2
et vibration continu

Tableau n°28 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer

le rapport urée/Ca.

IMPACT D’UNE SOLUTION UREE/Ca NON EQUIMOLECULAIRE

PARAMETRES CONSTANTS PARAMETRES VARIABLES
Nombre de
Type de Vitesse Concentration de la solution
Méthode de Mode V.p
sable réelle calcifiante
compactage d’injection biomasse
utilisé d’injection [U/Ca 2+]
injecté
pluviation semi
SFB 0.2 m/h 5 V.p 0.5 - 0.75 M
et vibration continu

Tableau n°29 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer

l’effet du mode de compactage.

IMPACT DU MODE DECOMPACTAGE

PARAMETRES CONSTANTS PARAMETRES VARIABLES
Nombre de
Solution Vitesse
Mode V.p de solution Type de sable Méthode de
calcifiante réelle
d’injection calcifiante utilisé compactage
[U/Ca 2+] d’injection
Injecté
pluviation et
En semi Sable de SFB et tapotement,
0.5 M 0.2 m/h 3 V.p
continu Itterbeck/correcteur pluviation et
vibration

Les Tableaux n° 30, 31, 32 et 33 présentent les conditions expérimentales, respectivement,

pour l’étude des effluents, la détermination du mode d’injection, l’effet de la température sur le
processus de bio calcification et la formation des cristaux de calcite.

89
Chapitre III. Matériels et Méthodes.

Tableau n°30 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer

la nature chimique des effluents.
NATURE CHIMIQUE DES EFFLUENTS
PARAMETRES CONSTANTS PARAMETRES VARIABLES
Concentration de
Vitesse Nombre de V.p
Type de sable Méthode de Mode la solution
réelle solution calcifiante
utilisé compactage d’injection calcifiante
d’injection injecté
[U/Ca 2+]
Pluviation et
SFB semi continu 0.2 m/h 3 - 5 V.p 0.5 - 0.83 M
vibration

Tableau n°31 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer

l’impact des modalités d’injection.

IMPACT DES MODALITES D’INJECTION

PARAMETRES
PARAMETRES VARIABLES
CONSTANTS
Nombre de
Concentration de la
Type de sable Méthode de Mode Vitesse réelle V.p solution
solution calcifiante
utilisé compactage d’injection d’injection calcifiante
[U/Ca 2+]
injecté
Pluviation et
semi continu
SFB vibration / 0.05 - 0.2 m/h 5 – 10 V.p 0.5 - 0.75 M
et continu
Tapotement

Tableau n°32 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer l’effet de la température.

IMPACT DE LA TEMPERATURE
PARAMETRES
PARAMETRES CONSTANTS
VARIABLES
Nombre de V.p
Concentration de la
Méthode de Mode Vitesse réelle solution Type de sable
T° C solution calcifiante
compactage d’injection 2+ d’injection calcifiante utilisé
[U/Ca ]
injecté
Pluviation
12° C semi continu 0.5 M 0.2 m/h 5 V.p SFB/Itterbeck
et vibration

Tableau n°33 : Caractéristiques des colonnes injectées pour étudier la

formation des cristaux de calcite.

ETUDE DE LA FORMATION DES CRISTAUX DE CALCITE

PARAMETRES CONSTANTS PARAMETRES VARIABLES
Concentration
Vitesse
Type de Méthode de de la solution Mode Nombre de V.p solution
réelle
sable utilisé compactage calcifiante d’injection calcifiante injecté
d’injection
[U/Ca 2+]
Pluviation
SFB 0.5 M semi continu 0.2 m/h 1 à 5 V.p
et vibration

90
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

CHAPITRE IV
AMELIORATION DE LA PRODUCTION DE BIOMASSE
ET DE LA SYNTHESE DE L’UREASE.

I. RECHERCHE DES PRINCIPAUX FACTEURS REGULANT

L’ACTIVITE ENZYMATIQUE DE L’UREASE CHEZ S. pasteurii. 092

1. Définitions des besoins. 092

2. Les premiers essais de culture. 092
3. L’importance des ions sodium. 095
4. L’impact de l’ajout d’une source de phosphate. 096
5. L’impact de la nature de la source d’azote. 099
6. L’amélioration des conditions de culture. 104
7. Bilan des premiers essais de milieu de culture. 114

II. DEVELOPPEMENT VERS L’INDUSTRIALISATION. 115

1. Optimisation de la composition du milieu de culture pour une

production de masse. 115
1.1. Recherche d’un substitut à l’extrait de levure. 116
1.2. Augmentation des volumes de production. 120
2. Description du suivi d’une production de biomasse riche en uréase. 125
2.1. Suivi et interaction des paramètres pH, O2 et D.O. cellulaire. 126
2.2. Interactions des paramètres biologiques et physico-chimiques. 128
2.3. Bilan des interactions sur la synthèse de l’uréase. 129
3. Suivi d’une production de biomasse et de son stockage en vue d’un
approvisionnement sur un chantier. 129
4. Synthèse des résultats pour la production de biomasse et le maintien
de l’activité enzymatique. 131

III. PROPOSITION D’UN MODELE DE REGULATION DE L’ACTIVITE

ENZYMATIQUE DE TYPE UREASE CHEZ S. pasteurii. 147

1. Détermination d’un modèle de régulation de l’uréase. 147

2. Le modèle de régulation de l’uréase chez B. subtilis appliqué à S. pasteurii. 150
3. Proposition d’un système de régulation de l’uréase chez S. pasteurii. 153
4. Prise en compte de la régulation de l’uréase pour une
production industrielle. 158

91
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

I. RECHERCHE DES PRINCIPAUX FACTEURS REGULANT L’ACTIVITE

ENZYMATIQUE DE L’UREASE CHEZ S. pasteurii.

1. Définition des besoins.

La bio calcification repose chez S. pasteurii sur l’induction biologique de la

précipitation du carbonate de calcium via une enzyme intra cytoplasmique, l’uréase. Cette
enzyme hydrolyse l’urée pour libérer deux molécules d’ammonium et une molécule de
carbonate. Cette réaction produit une alcalinisation du milieu et favorise la précipitation du
carbonate de calcium. Les effectifs bactériens sont aussi un critère influant sur la rentabilité
du procédé. Il faut donc cumuler la maîtrise de la croissance des bactéries et celle de la
synthèse de l’enzyme. De plus, la composition d’un milieu de culture doit répondre aux
contraintes biologiques industrielles du procédé. Il faut donc pouvoir contrôler la production
d’enzyme, la stabilisation de cette dernière, tout en minimisant les coûts de production.

2. Les premiers essais de culture.

L’état des connaissances au début des essais de bio calcification préconisait des
milieux de culture composés d’une source d’ammonium associée à une source nutritive riche
et complexe. Deux milieux de culture ont été proposés, un pour l’emploi en laboratoire et
l’autre pour une utilisation plus industrielle. Généralement, les milieux utilisés en laboratoire
ont des compositions plus complexes et sont fabriqués avec des produits purifiés. C’est le cas
du milieu Columbia recommandé pour S. pasteurii par les banques de souches. Un second
milieu, plus simple était composé de 20 g/l d’extrait de levure (Y.E) additionné de 10 g/l d’un
sel d’ammonium (SO4NH4)2. Or, ce sel d’ammonium composé d’ions sulfates augmente la
possibilité biologique de formation de sous produits à base de soufre soit par la souche
effectuant la bio calcification soit par les bactéries en place dans le sol. Dans ce cas, le
traitement des effluents sur chantier devient plus complexe. Ce sel d’ammonium a été
remplacé par Whiffin (2004) par 10 g/l de chlorure d’ammonium, plus simple à traiter et
moins onéreux. Il a été associé à une source nutritive alternative complexe (la Marmite) à la
concentration de 10 g/l. La Marmite est un produit à base d’extrait de levure, destiné à la
consommation humaine. Son coût est près de 3 fois plus faible que celui de l’extrait de levure
utilisé en laboratoire. Cependant, les premiers essais de culture contenant cette source
nutritive alternative ne donnèrent pas satisfaction. En effet, la très forte variation de la
production d’uréase entre les différents essais a conduit à son abandon. En conséquence, il est
apparu souhaitable de retourner à l’utilisation d’une source complexe d’Y.E pur, qui a
permis d’obtenir une production d’enzyme presque constante. L’extrait de levure de
laboratoire est issu d’un hydrolysat de levure, très complet, ne nécessitant pas l’ajout
d’additifs pour assurer la quasi totalité des besoins du micro organisme (Tableau n°34). En
effet, il est composé à 50 % de carbone, 15 % d’azote, 1 % de phosphore, et renferme des sels
minéraux variés et de nombreuses vitamines.

92
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Tableau n°34 : Composition chimique de l’extrait de levure BD (Difco).

Composition en acides
Source % Libre Total
aminés (%)
Carbone 45% Histidine H 0.6 1.3
Cystine C 0.2 détruit
Azote Total (TN) 10.9 Phénylalanine F 2 2.6
Azote Amino (AN) 6 Serine S 2.6 1.6
(AN/TN) 0.55 Tryptophane W 0.5 détruit
Cendre 11.2 Valine V 2.2 3.5
NaCl 0.1 Leucine L 3 4.1
Analyse élémentaire µg/g Méthionine M 0.6 0.8
Calcium 130 Proline P 0.8 2
Magnésium 750 Thréonine T 1.1 1.6
Potassium 3195 Tyrosine Y 0.8 1.2
Sodium 1490 Arginine R 1.4 2.6
Chlorure (%) 0.38 Glycine G 1 3
Sulfate (%) 0.09 Isoleucine I 1.8 3
Phosphate (%) 3.27 Lysine K 1.9 4 .6
Facteurs de croissance mg/l Acide glutamique E 6.6 9.4
Biotine 2 . 10-3 Alanine A 4.4 5.6
Acide Folique 2 . 10-3 Acide Aspartique D 1.6 5.3
Inositol 2
Niacine 0.4
Riboflavine (B2) 0.2
Thiamine 0.4

La maîtrise du coût d’une biomasse injectable commence par les matières premières,
c’est le poste le plus coûteuxr. Les autres, travail humain et conditions de culture
(température, aération), se traduiront par des coûts énergétiques. S’intégreront ensuite les frais
d’achat de matériels et leur amortissement. La matière première entrant principalement dans
la composition du milieu de culture est l’Y.E. de qualité « laboratoire » dont le prix est de 100
Euro/kg. Dans le cas d’une source alternative de nutriments comme la Marmite le coût
diminue à 30 Euro/kg. Malgré cela, dans le cadre de ces premiers essais de culture, le choix
s’est porté sur l’extrait de levure de laboratoire comme source de nutriment. Cela a permis de
s’affranchir au mieux de la variabilité de la production d’enzyme, car leurs mécanismes de
régulation complexes et mal connus. Par la suite, la source de nutriment a été adaptée aux
besoins de S. pasteurii.

Dans une première étape d’optimisation, cette source nutritive a été complétée par des
produits destinés à stimuler la synthèse d’uréase. L’urée est le substrat naturel de l’enzyme et
sa présence dans le milieu de production de biomasse stimule la synthèse de l’uréase (Jahns,
1996). D’autre part, en ce qui concerne la souche CIP 66-21, il a été mis en évidence que sa
présence dans la composition du milieu était indispensable. La particularité de S. pasteurii est
la double fonction de l’azote NH4+ résultant de la dégradation de l’urée. L’ammonium sert à la
fois de source d’azote mais aussi de source d’énergie. La cellule bactérienne possède une ATP
synthétase/NH4+. Il s’agit d’un transport actif secondaire qui s’active en présence
d’ammonium dans l’environnement. La dissociation de l’ammonium conduit à la libération
d’un proton, créant ainsi un gradient électrochimique de par et d’autre de la membrane
plasmique. C’est un mécanisme de couplage chimio-osmotique. Dans un milieu très riche en
azote organique apporté par les acides aminés de l’extrait de levure, la souche au début de la

93
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

croissance prend sa source d’azote préférentiellement dans l’azote organique. En fin de

croissance la concentration en nutriments chutant, elle se tournera vers l’ammonium. Au
cours des différents essais, il s’est avéré que l’uréase est une enzyme de type inductible et non
constitutive. Sa synthèse n’est pas constante dans la cellule mais induite par la présence de
son substrat, l’urée. La gamme de concentration dans laquelle l’urée est inductible, est
comprise entre 20 et 40 mM soit 2.4 g/l.
Par ailleurs, l’ajout de nickel sous la forme de NiCl2 entre 10 et 100 µM (Bachmeier et
al, 2002) a été identifié également comme stimulant la synthèse de l’uréase. En effet, ce
cation est un élément clé qui s’intègre dans la structure tridimensionnelle de l’enzyme
puisqu’il est localisé au niveau du site actif et sert de catalyseur au processus réactionnel
d’hydrolyse de l’urée. Le nickel, élément peu concentré dans les eaux des réseaux urbains
(unité qualité =20µg/L), peut donc être un facteur limitant; il doit donc être ajouté à la
composition chimique du milieu. Pour déterminer quels sont les niveaux de concentration les
plus efficaces, un plan d’expérience d’essais de culture a été établi, avec pour chaque élément
deux niveaux de concentrations testées (Tableau n°35). Les essais de croissance de S.
pasteurii sur ces différents milieux de culture, ont été faits en duplicata. Le potentiel de
précipitation du carbonate de calcium des biomasses obtenues, a été recherché dans des tests
en tri réplicat, en utilisant trois solutions calcifiantes équimolaires (urée/calcium) et présentant
trois concentrations différentes (0.1, 0.2 et 0.3 M).

Tableau n°35 : Les deux niveaux testés pour les trois éléments entrant
dans la composition du milieu de culture.

FACTEURS UNITE NIVEAU -1 NIVEAU +1

Y.E g/l 10 20
UREE g/l 1.2 2.4
NiCl2 mg/l 0.58 5.8

Ces essais ont permis d’établir la composition d’un premier milieu de culture intitulé
« Milieu pré SBF » renfermant 10 g/l d’extrait de levure, 2,4 g/l d’urée et 0.58 mg/l de NiCl2,
hydraté avec de l’eau déminéralisée. Sur ce milieu, le taux de croissance µ de S. pasteurii
souche CIP 66-21 est de 0.44 h-1, le temps de génération de 2 h 34 avec une estimation du
taux moyen de précipitation de CaCO3 de 35 %.

Une étude spécifique a été faite pour mettre en évidence l’impact du pH de départ du
milieu de culture sur la croissance et surtout sur la synthèse de l’enzyme et le potentiel
calcifiant de la biomasse. L’institut Pasteur, fournisseur de la souche préconise un pH compris
entre 8 et 9 pour obtenir la croissance optimale. Pour tester le pH initial entre 8 et 9 le même
protocole expérimental a été mis en jeu. Les résultats ont montré que le pH de départ du
milieu de culture à condition qu’il reste compris entre 8 et 9, ne semble pas intervenir dans un
sens ni dans l’autre sur les performances de croissance, ni sur les performances de la
précipitation. En conséquence un ajustement du pH à 8.5 a été adopté.
La composition du milieu de culture a servi de point de départ aux travaux
d’optimisation, en vue d’établir un milieu industriel (Figure n°18).

94
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Recherche d’une fenêtre optimale de culture pour l’obtention d’activité

enzymatique de type uréase stable et élevée

Deux voies

Composition du Conditions de
Figure n°18 : Les différents
milieu de culture culture points abordés pour le
développement d’une fenêtre
Différents niveaux optimale pour l’obtention
d’aération
d’activité enzymatique spécifique.
PO4 NaCl NH4Cl

Effet volume Effet Effet 02

agitation

3. L’importance des ions sodium.

Les milieux de culture destinés aux bactéries de l’environnement renferment une petite
quantité de chlorure de sodium destinée à créer un équilibre osmotique équivalent à celui
qu’elles rencontrent dans leur biotope. S. pasteurii a été décrit comme un micro organisme
halotolérant. Sa physiologie est donc adaptée à la présence du chlorure de sodium. En effet,
de nombreux acides aminés tels que la valine, la leucine et l’isoleucine, caractérisés par la
présence d’une chaine aliphatique (BCAA) sont pris en charge par le système de transporteurs
secondaire sodium dépendant. Ces acides aminés sont de première importance puisqu’ils
peuvent représenter près du tiers des acides aminés constituant les protéines. La présence de
l’ion sodium, participe à la formation d’un gradient électrochimique de proton, par
translocation, via une ATPase/Na+. Un mécanisme d’entrée analogue a été identifié pour la
glutamine (Jahns, 1994 ; Beck et Jahns, 1996). Ce gradient facilite également l’entrée active
d’autres ions tels que l’ion potassium via une pompe antiport ATPase Na/K+. Non seulement
la physiologie de S. pasteurii est adaptée à la présence du chlorure de sodium, mais ce produit
lui est strictement nécessaire. En facilitant le transport de différents solutés présents dans le
milieu de culture, le chlorure de sodium devrait améliorer la croissance de la souche mais
aussi la synthèse de l’enzyme. Pour cela, 3 essais en duplicata de milieux de culture ont été
testés avec trois concentrations différentes de chlorure de sodium (0, 3 et 9 g/l). La croissance
a été menée à 20° C pendant 24 heures (Tableau n°36).

Tableau n°36 : Influence de l’ajout de NaCl sur la croissance de S. pasteurii CIP 66-21.
(CV : coefficient de variation)

0 g/l 3 g/l 9 g/l

0.083 ± 0.002 avec 0.086 ± 0.001 avec 0.092 ± 0.0004 avec
Taux de croissance (µ en h-1)
CV = 2.8 % CV = 1 % CV = 1 %
∆ D.O. Echantillon -témoin 0 0.289 0.328
∆ D.O./NaCl (g/l) 0 0.083 0.036

Comme le montrent les taux de croissance, l’ajout de NaCl est bénéfique pour la
souche. Il permet dans ces conditions de culture un gain de 10 %, soit l’équivalent au bout de
24 heures de 0.328 D.O. cellulaire par rapport au témoin. Ceci correspond à 0.036 unité de
DO par gramme de NaCl, dans le cas d’une culture en ayant reçu 9 g/l. Par contre, le bénéfice
est de 0.083 unité D.O. par gramme de NaCl pour une concentration 3 fois plus faible. En

95
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

conséquent, 3 g/l de NaCl permettent une augmentation du taux de croissance de 4 % par

rapport au témoin soit une diminution d’une heure du temps de génération.
Les performances des milieux à 9 g/l sont moindres au regard de la quantité de sel
ajouté, ceci malgré des temps de génération très similaires entre les deux concentrations
testées. Lorsque les ions chlorure et les ions sodium sont maintenus dans la cellule à un
niveau physiologique, la bactérie profite de ce bénéfice. Par contre, lorsque la concentration
devient plus élevée, la bactérie met en place des pompes ATP/Na+ de transport actif et de
transport antiport couplé avec H+, afin de maintenir une concentration intracellulaire
physiologique et stable. Cette activation des pompes établit un gradient de concentration du
sodium entre les compartiments intra et extracellulaire. Cette réponse devient coûteuse en
énergie chimique, notamment, lorsqu’il y a induction de la synthèse d’osmolytes tels que
l’ectoine et le glutamate (Kuhlmann et Brener, 2002). C’est autant d’énergie chimique qui
n’est plus destinée au métabolisme soutenant la croissance malgré une meilleure assimilation.
Par conséquent, à partir d’une certaine concentration en NaCl, le bénéfice de cet ajout se
réduit. Ce phénomène suggère d’opter pour une concentration de 3 g/l.

Par ailleurs, tout ajout d’éléments dans la composition du milieu entraine un coût
supplémentaire, non seulement à l’achat mais aussi au niveau du traitement des effluents. En
effet, l’élaboration d’un milieu de culture doit être prise dans sa globalité et il faut considérer
le cycle entier de vie d’un produit, notamment en ce qui concerne les chlorures. Ces derniers
sont difficilement revalorisables car lorsqu’ils sont concentrés et donc toxiques. Ainsi, les
effluents dus à la suspension de biomasse produite sur le « milieu pré-SBF » (qui ne contient
pas de NaCl ajouté), collectés en sortie de colonne, renferment en moyenne moins de 1g/l de
NaCl. L’ajout de 3 g/l de chlorure de sodium influera donc fortement sur la composition des
effluents et sur leur traitement (possibilité de corrosion des métaux, …). Cependant, la
fraction d’ions chlorure reste ici, négligeable, face aux quantités trouvées dans les rejets dûs à
la solution calcifiante qui contient du chlorure de calcium et dont le cation est piégé au fond
par les ions carbonates produits par la bactérie.

Enfin, pour intégrer, totalement l’ajout de 3 g/l de NaCl dans la composition du milieu
de culture, ces contrôles sur la croissance ont été complétés par un suivi de l’activité
enzymatique. Un gain de 15 % au bout de 6 heures de culture a été obtenu confortant l’intérêt
de l’ajout de 3 g/l de NaCl. La composition de ce nouveau milieu de culture, noté « Milieu
SBF » est la suivante : 10 g/l d’extrait de levure, 2,4 g/l d’urée et 0.58 mg/l de NiCl2, 3 g/l de
NaCl, hydraté avec de l’eau déminéralisée, pH ajusté à 8.5 avant autoclavage.

4. L’impact de l’ajout d’une source de phosphate.

Il est couramment admis que les besoins nutritifs des micro-organismes en macro
nutriments durant la phase de croissance répondent à un équilibre entre les atomes de C, N et
P de telle façon que leurs proportions respectives obéissent au rapport 100/10/1. Si la
concentration en phosphate devenait limitante dans le milieu de culture, la production de
biomasse et d’enzyme en seraient affectée. Or, au cours de différents essais d’injection en
colonne, les résultats des analyses chimiques des effluents ont montré des valeurs
contradictoires quant à leur teneur en phosphore totale, suggérant peut-être une carence en
phosphate dans la composition du milieu de culture SBF. En effet, les teneurs en phosphore
oscillent d’un facteur 17, entre 6 mg/l et 106 mg/l. L’ensemble des résultats sera étudié dans
le chapitre intitulé « Etude chimique des effluents ». Il faut cependant souligner que les

96
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

effluents ne sont qu’incomplètement représentatifs des éventuelles carences du milieu de

production de biomasse. Ce qui est injecté au fond est une suspension de biomasse en fin de
croissance exponentielle. Le milieu initial est en partie épuisé en C, N et P au profit des
cellules produites. De plus, les effluents de sortie collectés après l’injection du premier V.p de
solution calcifiante, sont appauvris en bactéries puisque celles-ci sont sensées se fixer sur les
grains de sable. Ces effluents sont donc appauvris en C, N et P et selon une proportion qui
dépend du taux de fixation des bactéries. Par ailleurs, les 10 g/l d’extrait de levure que
renferme le Milieu SBF apportent 45 % de C, 10.9 % de N et 3.25 % de phosphate (Tableau
n°34). La teneur en P calculé est de 1.07 %. Le rapport C/N/P de ce produit est donc de
100/24.2/2.37. Ainsi l’extrait de levure du milieu de culture obéit au rapport 100/10/1 et ne
crée pas une carence en phosphore. Cependant, ceci peut être vérifié.

L’étude des taux de P des effluents étant insuffisante, une série d’expériences a été
mise en jeu pour s’assurer que le phosphate n’est pas en concentration limitante dans le milieu
de production. Ces essais de culture ont été réalisés en duplicata, avec un ajout de 0.2 g/l
d’orthophosphate de sodium. Deux productions réalisées dans un milieu sans apport
d’orthophosphate constituent les témoins. Les cultures ont été faites à 28° C et pilotées durant
168 heures. Les courbes de D.O.. cellulaire sont superposables qu’il y ait eu ajout ou non
d’orthophosphate (Figure n°19). Les suspensions bactériennes produites avec ajout
d’orthophosphate présentent des activités enzymatiques qui suivent un profil similaire à celui
des suspensions témoins (Figure n°20). La production maximale moyenne d’enzyme pour les
deux duplicatas est constatée durant la fin de la phase exponentielle et la phasede
ralentissement.

6.0

5.0

4.0 Figure n°19 : Comparaison des courbes

D.O. cellulaire

3.0 de croissance avec (■) et sans

2.0 orthophosphate(♦).
1.0

0.0
0 50 100 150 200
Tem ps (h)

350
Témon (m)
300
Ortho (m)
250
Figure n°20 : Comparaison des activités
enzymatiques obtenues en absence (♦) et
A.E (µS/min)

200
en présence(■) d’orthophosphate dans le
150
milieu de culture.
100

50

0
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0
Tem ps (h)

Dans les deux croissances, il n’y a quasiment pas de phase de latence et les durées des
phases sont identiques. La phase d’accélération (1 - 4 h) est suivie d’une phase exponentielle

97
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

durant 3 heures (4 - 7 h) puis d’une longue phase de ralentissement (9 - 32 h) qui s’achève par
l’entrée dans la phase stationnaire (Tableau n°37). Malgré des profils très semblables, les
milieux ayant reçu un ajout d’ortho phosphate ont produit un peu moins de biomasse.

Tableau n°37 : Les paramètres en absence et en présence d’orthophosphate.

Sans ajout Avec ajout

Paramètres
d’orthophosphate d’orthophosphate
Phase de latence (h) (0 - 1) ≈ 1 (0 - 1) ≈ 1
Phase d’accélération (h) (1 - 4) ≈ 3 (1 - 4) ≈ 3
Phase exponentielle (h) (4 – 7) ≈ 3 (4 - 7) ≈ 3
Phase décélération (h) (7 - 32) ≈ 25 (7 - 32) ≈ 25
Phase stationnaire (h) 32 h => 149 h 32 h => 149 h
Taux de croissance µ (h-1) 0.329 0.293
Temps de génération (h) 2.11 2.33
D.O cellulaire max 4.9 ± 0.16 5.1 ± 0.06
Corrélation A.E /D.O 0.8 0.8
Coefficient de détermination R2 0.61 0.67
A.E maximale (µS/cm/min) 272 ± 12 292 ± 22
Production (Phase exponentielle) 5 6.2
d’A.E par (Phase de
6 5.7
heure ralentissement))

Ainsi, ces expériences confirment que le Milieu SBF ne présente pas de carence en
phosphore.

La production d’uréase, qu’il y ait ou non un ajout d’orthophosphate, se fait surtout en

fin de phase exponentielle, pendant la phase de ralentissement. Quand la souche rentre en
phase stationnaire la production s’arrête. Ceci signifie que la synthèse semble être dissociée
de la croissance. Une hypothèse peut être proposée pour expliquer ce phénomène. Il se
pourrait qu’une faible transcription de l’enzyme lorsque les conditions environnementales
sont propices puis une levée d’inhibition lorsque le milieu s’appauvrit. Cette régulation peut
se réaliser au niveau du promoteur de l’opéron ureABC par le jeu du facteur de transcription
qui induit ou inhibe la transcription de l’opéron. La régulation des gènes dans le monde
microbien ne peut se réaliser par une régulation post-transcriptionnelle, car les ARNm sont
monocistroniques. Un autre niveau de régulation peut exister, directement à l’échelle de
l’enzyme, tel qu’il existe avec les enzymes allostériques. Or, l’uréase étant une enzyme de
type « micheline » cela exclut également ce type de régulation. Ici, la régulation de l’opéron
uréase résulterait d’une combinaison de facteurs environnementaux et physiologiques,
conduisant à une régulation plus complexe.

L’ajout d’orthophosphate ne produit aucun effet notable sur la production d’enzyme

soit parce que ces ions PO43- étaient déjà en concentration suffisante, soit parce qu’ils
n’interviennent pas dans le processus de synthèse de l’enzyme. Cependant, les ions
phosphates sont utiles pour la synthèse des acides nucléiques et des phospholipides, pour les
échanges ioniques et les cascades de régulation du métabolisme.

Les fortes variations de la teneur en phosphore des effluents de biomasse issus des
colonnes, pourraient avoir une autre explication. Les teneurs faibles en phosphore total (6
mg/l) sont probablement être dûes au contact entre la suspension de biomasse et la solution
calcifiante. Les ions phosphates restant dans la suspension de biomasse, pourraient précipiter

98
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

sous forme de phosphate de calcium qui resterait piégé dans la colonne. Ceci appauvrirait les
effluents. Cette explication est cependant, en désaccord avec toutes les observations
ultramicroscopiques faites sur les cristaux obtenus et les analyses atomiques pratiquées dessus
qui n’ont jamais mis en évidence de phosphate de calcium (Castanier et Levrel,
communication personnelle).

5. L’impact de la nature de la source d’azote.

Le milieu de production de biomasse (Milieu SBF), sans compter l’urée ajoutée pour
induire la synthèse de l’uréase, possède une teneur en azote suffisante pour assurer la
croissance de S. pasteurii. Le milieu Columbia qui est préconisé par les banques de souches,
est composé de 17 g/l de poly peptone, 3 g/l de peptone pancréatique de cœur, 1 g/l d’amidon
de maïs, 3 g/l d’extrait de levure, 5 g/l de NaCl, ce qui fait de lui un milieu plus riche que le
Milieu SBF. Hormis la présence de l’inducteur, chez S. pasteurii, la synthèse de l’uréase ne
semble pas régulée par la teneur en azote. En effet, il n’apparaît pas d’inhibition ou de
stimulation de la synthèse de l’enzyme lorsque de fortes concentrations en azote sont
présentes. Cependant, il existe une régulation complexe de l’uréase, principalement dûe à la
double fonction des ions ammonium au sein de la cellule. Pour mieux élucider cet aspect, 4
essais en duplicata, de production de biomasse avec des sources de carbone différentes et de
l’ammonium ajouté, ont été réalisés en Erlenmeyers à 28° C pendant 25 heures (Tableau
n°38).

Tableau n°38 : Composition des milieux de culture testés.

Composition SBF-1 SBF-2 SBF-3 SBF -4

Extrait de levure (g/l) 10 10 - -
Urée (g/l) 2.4 - - -
NiCl2 (mg/l) 0.58 0.58 0.58 0.58
NaCl (g/l) 3 3 3 3
Remplacement de l’extrait de
- - Mélasse Marmite
levure (g/l)
NH4Cl (g/l) - 10 10 10
H2O déminéralisée (ml) 1000 1000 1000 1000

Le milieu de SBF-1 sert de témoin, le milieu SBF-2 dans lequel l’urée a été retirée au
profit d’un ajout de chlorure d’ammonium permet d’évaluer l’excès l’impact de l’ammonium
sous la forme de sel dans un milieu riche. Les milieux SBF-3 et SBF-4 renferment tous les
deux une source alternative de carbone en présence d’un excès de chlorure d’ammonium. Le
milieu, SBF-3, avec la mélasse qui est un sous produit de l’industrie sucrière, est très riche en
hydrates de carbone et pauvre en azote. Issue de la canne à sucre, elle renferme 35 % de
saccharose, 20 % d’autres sucres, 10 % d’eau et 15 % de cendres. Sa teneur en matières
azotées, exprimée en matières sèches, est de seulement 6 %. Par contre, la Marmite (SBF-4)
est une source alternative d’extrait de levure issue de la fermentation du malt. Sa composition
est proche de celle de l’extrait de levure de laboratoire. Les activités enzymatiques sont
mesurées durant la phase de ralentissement entre 20 et 26 heures (Figure n°21).

99
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Milieu SBF 1
500
Milieu SBF 2
450 Milieu SBF 3
Milieu SBF 4
400

350
A.E (µS/min)

300

250
Figure n°21 : Activités
200
enzymatiques obtenues au cours
150
de la phase de ralentissement,
100 dans les différents milieux
50
testés.
0
20 h temps (h) 26 h

Le milieu SBF 1 a permis la production de la biomasse la plus riche en A.E, avec des
valeurs de 16 à 19 % supérieures, à 20 et 26 heures respectivement. Pour l’ensemble des
milieux, les productions d’activités enzymatiques sont meilleures durant la phase de
ralentissement (fin de phase exponentielle de croissance). Au delà, la teneur en enzyme reste
stable pour les milieux SBF-3 et SBF-4 ce qui traduit l’arrêt de la production (Tableau n°39).

Tableau n°39 : Production d’activité enzymatique moyenne par heure obtenue durant la fin
de phase exponentielle.

Production ∆T SBF-1 SBF-2 SBF-3 SBF-4

A.E
6h 7.3 10.2 0 1
(µS/min/h)

La production d’enzyme est plus importante dans un milieu de culture renfermant de

l’extrait de levure (SBF-1 ou SBF-2). Les quantités d’activités enzymatiques obtenues dans le
milieu SBF-1 sont toutefois plus élevées que dans le milieu SBF-2. L’induction par l’urée
semble meilleure que par le chlorure d’ammonium. Ces deux milieux sont riches et favorables
à la production d’une biomasse riche en uréase.

La présence d’une concentration équivalente d’ammonium dans les milieux SBF-2,

SBF-3 et SBF-4, ne permet pas cependant d’obtenir des activités enzymatiques équivalentes
au bout des 26 heures. Ceci suggère donc que la source de carbone joue un rôle important non
seulement dans la production de biomasse mais aussi dans la production d’enzyme.
4.000 Milieu SBF 1
Milieu SBF 2
3.500 Milieu SBF 3
Milieu SBF 4
3.000
Figure n°22 : Suivi des
moyennes de la D.O cellulaire
D.O. cellulaire

2.500

2.000
lues dans les quatre milieux
testés au cours de la phase de
1.500
décélération.
1.000

0.500

0.000
20 h Temps (h) 26 h

100
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Si l’on compare la production de biomasse (Figure n°22), dans le cas des milieux
SBF-1 et SBF-2, riche en matière organique, l’ajout d’ammonium à forte concentration,
semble plus efficace que l’ajout d’urée. Ceci suggère que l’ammonium est préférentiellement
utilisé pour la production d’énergie ce qui favorise les divisions cellulaires et la production de
nouvelles cellules. Il est aussi possible si d’autres sources d’azote sont disponibles ce qui
semble être le cas d’après la composition de l’extrait de levure. En effet, l’acide aminé
majoritaire est l’acide glutamique entre 6 et 10 %. Par contre, lorsque le milieu est moins
riche (SBF-3) notamment en substrat azoté, l’ammonium ajouté ici en quantité suffisante
semble orienté vers les deux fonctions, énergie et assimilation. Cependant, dans ces
conditions, le temps de latence apparaît plus allongé, ce qui décale d’autant l’apparition de la
phase de ralentissement. Cela peut avoir alors comme effet, une forte production d’enzyme.
De même, dans le cas de la culture du milieu SBF-4, la production d’enzyme n’a pas non plus
évolué durant cet intervalle de temps, très probablement en raison d’une phase de latence
courte qui implique une apparition plus précoce de la phase de ralentissement. Dans ce cas, la
diminution de la D.O. cellulaire est attribuée à l’entrée dans la phase stationnaire.

Ainsi, deux hypothèses peuvent être proposées, soit la quantité de sel d’ammonium est
suffisante, soit une troisième source d’azote intervient dans la régulation de l’uréase. Chez S.
pasteurii, deux enzymes ont été identifiées comme responsables de l’assimilation de l’azote
au sein de la cellule (Mörsdorf et Kaltwasser, 1989). La GDH-NADP dépendante
responsable de l’assimilation de l’ammonium dans les cellules, se trouve à son faible niveau,
lorsque les conditions de culture sont riches en azote organique. Par contre, la GDH-NAD
dépendante se trouve à des niveaux élevés. Cette dernière est responsable de la décomposition
du glutamate, fortement représenté dans un milieu complexe, tel que l’extrait de levure. Par
conséquent, il est moins couteux, pour la cellule de décomposer cet acide aminé ce qui permet
l’obtention d’une molécule d’ammonium et l’oxoglutarate. Cette molécule est au carrefour de
nombreuses voies métaboliques de synthèse d’acides aminés. Ainsi, lorsque les ressources du
milieu sont suffisantes, une telle voie permet de réaliser de nombreuses économies d’énergie.
Lorsque le milieu s’appauvrit durant la phase de ralentissement, la quantité de glutamate ainsi
que d’autres donneurs d’ammonium comme la glutamine diminuent fortement. La teneur en
azote global diminue, et la plus grande partie se trouve ainsi mobilisé pour l’assimilation au
détriment de la production d’énergie. A la fin de la phase exponentielle, l’énergie est requise
en grande quantité, sa limitation entraine une diminution du taux de croissance. Parallèlement,
la cellule engage la voie de synthèse de l’uréase en augmentant sa production.

Ce phénomène semble plus performant en milieu complexe, car une véritable

hiérarchisation de l’assimilation peut se réaliser. Les résultats obtenus peuvent s’expliquer par
une double régulation de la synthèse de l’uréase. Durant la première phase de croissance, un
faible niveau d’activité enzymatique est produit, résultant d’une synthèse de type constitutif
mais de faible intensité. Ceci peut expliquer les valeurs obtenues dans le milieu SBF-3.
Lorsque la phase de ralentissement se produit, alors, une activation ou une levée de la retro
inhibition permet un plus niveau de transcription de l’uréase. Le pool d’azote et la synthèse de
l’uréase seraient fortement liés d’autant plus que le milieu de culture est riche (Figure n°23).

101
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

200
180
A . E . S (µ S /c m /m i n /D .O )

160
140
Figure n°23 : Suivi des
120 activités enzymatiques
100 spécifiques (A.E.S) en fin de
80 phase exponentielle des quatre
60 suspensions.
40
20
0
20 h-26h 20 h-26h 20 h-26h 20 h-26h

Les activités enzymatiques spécifiques (A.E.S = A.E./DOcellulaire) sont entre 30 à 37 %

plus élevées dans les milieux témoins (SBF-1). Ceci conforte dans l’idée que l’ajout
d’ammonium à la hauteur de 10 g/l n’est pas nécessaire pour l’obtention de meilleures
activités enzymatiques. En effet, la qualité nutritive du milieu, c’est-à-dire la présence mixte
d’acides aminés clés du métabolisme associé à une seconde source d’azote (urée ou sel
d’ammonium) semble être plus favorable à la synthèse de l’enzyme. La notion de pool
d’azote intracellulaire semble être déterminante. Le pool d’azote est constitué d’acides
aminés, et d’ammonium.

Une seconde série d’essais avec différentes compositions de milieux a été réalisée en
faisant varier la nature de la source d’azote. Il sera ainsi possible d’en voir son influence sur la
synthèse de l’uréase. Sous la forme de sel, l’ammonium est directement utilisable, soit pour la
production d’énergie soit la production de biomasse. Par contre, lorsque l’ammonium doit être
fabriqué à partir de l’urée, alors la présence d’uréase est nécessaire et la souche doit donc la
fabriquer. Quatre compositions de milieux de culture ont été proposées : un milieu SBF-1
avec une source d’urée, son équivalent SBF-2 avec source d’ammonium sous forme de NH4Cl
(4.3 g/l), un milieu GD-1, avec de la marmite et 10 g/l de chlorure d’ammonium, et enfin son
équivalent noté GD-2, avec de l’urée deux fois plus concentrée que dans le SBF-1 et pas
d’ammonium. Il faut noter l’absence de NaCl dans les milieux GD-1 et GD-2. Les cultures
ont été réalisées en duplicata sur 22 heures à 28° C (Tableau n°40).

Tableau n°40 : Composition des milieux de culture utilisés pour l’évaluation de l’effet
de l’ammonium sur la production d’enzyme.

Milieux SBF-1 SBF-2 GD-1 GD-2

Extrait de levure (g/l) 10.0 10.0 - -
Marmite (g/l) - - 8.0 8.0
Urée (g/l) 2.4 - - 5.6
NH4Cl (g/l) - 4.3 10.0 -
NaCl (g/l) 3.0 3.0 - -
NiCl2 (mM) 10.0 10.0 10.0 10.0

102
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Dans ce cadre expérimental, les D.O. cellulaires sont similaires pour les quatre
duplicata (Tableau n°41). Dix grammes par litre d’extrait de levure produisent autant de
biomasse que 8 g/l de marmite.

Tableau n°41 : Résultats obtenus avec les différents milieux.

Milieux SBF-1 SBF-2 GD-1 GD-2

A.E 2.3 1.8 0.87 0.42
(mS/min/ml) CV = 6 % CV = 1 % CV = 8 % CV = 8 %
D.O 1.3 1.3 1.1 1.3
(cellulaire) CV = 1.6 CV = 5 % CV = 2 % CV = 2 %
CV : coefficient de variation.

Les activités enzymatiques obtenues sont très différentes. Le milieu SBF-1 a permis
d’obtenir une biomasse ayant une A.E entre 20 %(SBF-2) et 80 % (GD-2) supérieure à celles
produites dans les autres milieux. Or, entre les deux milieux de culture SBF-1 et SBF-2, la
seule variation réside dans l’ajout d’urée ou de NH4Cl. Par ailleurs, dans le cas des milieux de
culture contenant de l’extrait de levure cultivée sur malt, les A.E sont près de 50 % plus
élevées en présence d’un sel d’ammonium par rapport à une quantité équivalente d’azote sous
forme d’urée. Cependant, les valeurs de A.E restent très en dessous de celles obtenues avec un
milieu contenant un extrait de levure, particulièrement pur, utilisé en laboratoire. La
composition de l’extrait de levure semble influer fortement sur la production de l’uréase.

En effet, il existe deux types d’extrait de levure. Le premier est fabriqué avec des
levures qui seront utilisées dans l’industrie du pain. Le second provient de levures qui ont été
cultivées sur des produits issus de l’industrie des brasseurs. Dans ce cas, il s’agit d’un sous
produit qui nécessite une étape de nettoyage avant de le rendre propre à la consommation.
Dans le cas de l’extrait de levure de boulangerie, il s’agit d’un produit de première qualité
puisque la levure (Saccharomyces cerevisiae) est utilisée telle quelle dans les différents
procédés de panification industrielle. Il faut donc que le procédé de culture de Saccharomyce
cerevisiae soit reproductible et contrôlé afin de présenter une qualité nutritive constante. Cet
extrait de levure est destiné aux cultures de bactéries en batch ne nécessitant pas de conditions
particulières. Par contre, les cultures menées avec de l’extrait de brasserie doivent subir de
plus fortes aérations. Dans le cas de la marmite, les fortes variations des activités
enzymatiques d’un milieu à un autre peuvent s’expliquer par une plus grande variation de la
qualité du produit.

Ces essais ont permis d’évaluer les performances de différents milieux à fournir de
fortes activités enzymatiques de type uréase. Ces essais ont pû montrer que l’ajout de
phosphate n’a d’impact ni sur la croissance cellulaire ni sur la production d’enzyme. Par
ailleurs, un ajout de NaCl à hauteur de 3 g/l, a permis d’augmenter la croissance cellulaire et
la production d’enzyme. L’obtention des fortes activités enzymatiques est étroitement liée à la
qualité de l’extrait de levure et la nature de la source d’azote. Ainsi, lorsque l’extrait de levure
est raffiné, l’urée est préférable pour la synthèse de l’uréase, synthèse qui survient durant la
phase de ralentissement. Par contre, l’ajout d’un sel d’ammonium (NH4Cl) semble produire
une meilleure activité enzymatique lorsque la source d’extrait de levure est issue de l’industrie
de la brasserie.

103
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

6. Amélioration des conditions de culture.

La composition du milieu de culture pour S. pasteurii étant établie, l’étape

supplémentaire pour améliorer la production de l’enzyme, est la création des conditions
optimales de culture. Pour identifier ces conditions et en particulier le niveau d’oxygénation,
une série de tests a été entrepris, en s’appuyant sur le modèle de régulation pré établi.
Ce micro organisme est aérobie, la présence d’oxygène est donc indispensable pour
son développement. Pour évaluer dans un premier temps et de manière simple, le niveau
d’oxygénation requis, des croissances en Erlenmeyers ont été faites en jouant sur les échanges
gazeux entre le milieu de culture et l’air surnageant. Pour cela les volumes de milieu de
culture varient. Ainsi, plus grand est le volume, plus petite est la surface d’échange avec l’air.
Pour évaluer cet effet, deux lots de duplicatas en Erlenmeyers ont été testés. Le premier
contient 150 ml, soit 1/6 du volume de l’Erlenmeyer. Le second contient trois fois plus de
volume, soit 450 ml, c'est-à-dire, presque la totalité du volume disponible. Les croissances
dans ces flacons ont été suivies, durant 27 heures alors qu’ils étaient incubés à température
ambiante sur une table d’agitation à 120 rpm (Tableau n°42). µ (h-1)

Tableau n°42 : Récapitulatif des caractéristiques des suspensions de biomasse.

Duplicata Duplicata
Caractéristiques
(150 ml) (500 ml)
Phase de latence (h) 2 1
Phase exponentielle (h) (2-6) ≈ 4 (2-6) ≈ 4
Phase de décélération (h) (6-33) ≈ 27 (6-27) ≈ 21
Phase stationnaire (h) A partir de 33 h A partir de 27 h
Taux de croissance moyen 0.31 ± 0.01 0.073 ± 0.003
µ (h-1) CV = 3.7 % CV = 3.6 %
Temps de génération moyen 2 h 15 min 9 h 30 min
D.O moyenne fin de phase exponentielle 3.5 1.6
Y = 0.0154 x Y = 0.0304 x
Corrélation (1 à 33 h) : A.E /D.O = R2
R2 = 0.986 R2 = 0.719
A.E.S max (µS/cm/min) 68 23
Production Phase exponentielle 10.8
0.8
A.E /h Phase de décélération 7.76

La diminution du volume de milieu de culture dans les Erlenmeyers de 450 ml à 150

ml et donc l’intensification de l’oxygénation, permet d’augmenter le taux de croissance
moyen durant la phase exponentielle d’un facteur 4. Le temps de génération passe de 9 h 30
en condition de sous oxygénation à 2 h 15. Parallèlement, les valeurs de D.O. cellulaire
augmentent de 2 unités pour les milieux fortement aérés. Par ailleurs, contrairement aux
milieux sous-aérés, lorsque les conditions d’aération sont suffisantes, une courbe de tendance
linéaire entre la D.O. et les A.E montre, une forte corrélation, avec R2 = 0.986 (Figure n°24).

104
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Flacon: 150mL culture, A Flacon: 150mL culture, B

300.000 Flacon: 500mL culture, A Flacon: 500mL culture, B

250.000
Activité Enzymatique (µS/min)

Figure n°24 : Le suivi de

200.000
l’activité enzymatique en
150.000 fonction de la D.O
cellulaire dans les deux
100.000
Erlenmeyers de150 ml (♦) et
50.000 500 ml (▲).
0.000
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000
D.O. cellulaire

L’impact de l’oxygénation sur la production d’uréase apparait dès la première d’unité

de D.O. cellulaire. La production maximale est atteinte avec une activité enzymatique de 272
µS/min/ml pour une D.O. cellulaire moyenne de 3,9. En sous oxygénation, les AE sont six
fois plus faibles avec une biomasse deux fois moins concentrée. Le maximum d’activité
apparait à la fin de la phase de ralentissement entre 27 et 33 heures de culture à 28° C (Figure
n°25).

5 300

280
4
260
3 240
Figure n°25 : Les suivis des
220
activités enzymatiques et
2 200 des D.O cellulaires dans les
A.E (µS/cm/min)
D.O. cellulaire

DO 150
180 flacons de 150 ml ( ) et
D.O 500 160 500 ml ( ).
A.E 150 ml
1 A.E 500 ml 140

120

100

80

60

40

20

0 0
0 20 40 60 80 100 120 140

Temps (h)

L’oxygénation même peu maîtrisée, comme c’est le cas dans ces expériences, permet
déjà d’augmenter le rendement de production de biomasse et la quantité d’enzyme produite
d’un facteur 5. La synthèse de l’enzyme se fait toujours durant la fin de la phase de
ralentissement même si elle atteint des niveaux 30 % inférieurs en condition de sous-
oxygénation.
Parallèlement, un fort ralentissement, de la croissance cellulaire se produit, avec
l’augmentation du temps de génération de près d’un facteur de 5, passant ainsi de 2 h 15 à 9 h
30. Ceci suggère, la transition d’une régulation de la synthèse de l’uréase à dominance

105
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

constitutive, vers une régulation dominée par d’autres facteurs, très probablement en relation
avec l’épuisement nutritif du milieu. Ces essais confortent la nécessité d’une bonne aération
pour l’obtention d’une croissance élevée, mais n’impliquent pas de modification dans le
modèle de régulation de l’uréase. Cependant, plus le métabolisme cellulaire est à un niveau
énergétique bas, plus la production sera faible.

Pour compléter ces observations, d’autres essais de culture ont été incubés à
température ambiante (25° C) pendant 144 heures, mais avec des modes différents
d’oxygénation : l’agitation et le bullage à l’air. Les résultats des D.O. cellulaires montrent que
l’aération de manière générale est propice à la croissance cellulaire puisque les valeurs
obtenues correspondent à environ 1,78 . 1010 cellules/ml. De plus, il n’y a pas de différence
notable dans la production de biomasse entre les deux modes d’aération, les profils étant
quasiment superposables (Figure n°26).

6 300

5 280

260
4
240
3 220 Figure n°26 : Suivi des D.O
200 cellulaires et des activités
enzymatiques (A.E) lorsque
D.O. cellulaire

2
A.E (µS/min)
180

160 les cultures sont soit agitées

140 soit sous insufflation
1 120
(Bullage).
Agitation(G)
Bullage(G) 100
A.E agitation(D) 80
A.E bullage(D)
60

40

20

0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160

Temps (h)

De meilleures productions d’enzyme, environ 30 % supérieures, ont été mesurées

lorsque l’oxygénation est assurée par un bullage (Tableau n°43). Cependant, les taux
d’activités enzymatiques chutent différemment après la phase exponentielle de croissance.
Ces variations traduisent la dégradation de l’enzyme. Le maximum d’activité enzymatique est
obtenu durant la phase de ralentissement (Taux de croissance = 0.05 h-1 et temps de
génération = 13 h) dans les deux conditions testées. Comme précédemment, une forte relation
linéaire existe entre la D.O. et l’A.E jusqu’au maximum d’activité enzymatique.

106
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Tableau n°43 : Récapitulatif des paramètres de suivi de milieu de production

de biomasses testées selon deux formes d’aération (Agitation ou Bullage).

Oxygénation Agitation Bullage

Phase de latence (h) <1 <1
Phase exponentielle (h) (6) ≈ 6 (6) ≈ 6
Phase de ralentissement (h) (6 - 140) ≈ 136 (6 - 140) ≈ 136
Phase stationnaire (h) > 140 h > 140 h
Taux de croissance moyen (µ) (h-1) 0.2 0.196
Temps de génération moyen (Tg) (h) 3 h 18 3 h 31
A.E maximale (µS/cm/min) 204 (à 30 h) 288 (à 23 h)
3 ± 0.26 2.9 ± 0.36
D.O moyenne quand l’A.E est maximale
CV = 8 % CV = 10 %
y = 66.455x y = 93.615x
A.E /D.O jusqu'à l’A.E maximale
R2= 0.9915 R2= 0.987
A.E.S en fin de phase exponentielle
68 63
(µs/cm/min)
Production Phase exponentielle 6.4 12
d’A.E
Phase de ralentissement 5.7 9.9
(µS/min/h)
CV : coefficient de variation

Dans le cas, d’une aération par agitation le triplement de la quantité de biomasse, de la fin de
la phase exponentielle jusqu’au maximum d’activité enzymatique (h= 30 heures), est suivie
dans la même proportion de l’augmentation du taux d’activité enzymatique. Ceci pourrait
suggérer que la synthèse de l’uréase se réalise de manière constitutive, mais peut tout aussi
bien correspondre à l’impact d’une très bonne induction. Ceci est vrai, si l’on considère que
l’enzyme se répartit de manière homogène dans la population bactérienne. Par ailleurs, cette
tendance s’observe également durant la phase exponentielle dans les flacons soumis aux deux
types d’aération.

Par contre, les biomasses produites sous bullage, ne présentent plus la même
proportionnalité entre la D.O. cellulaire et l’activité enzymatique, entre la fin de la phase
exponentielle et le maximum d’activité enzymatique (23 h). En effet, le niveau des activités
enzymatiques à 6 heures de culture correspond à 57 µS/min/ml, pour atteindre 288 µS/min/ml
à 23 heures. Le rapport entre les DO durant cette période est de 3.33, alors que le rapport entre
les A.E est de 5. Il y a une dissociation entre la régulation constitutive et la régulation induite.
La levée de l’inhibition ou l’induction de la synthèse de l’uréase obéit très probablement aux
conditions d’oxygénation.

Normalement l’oxygénation est meilleure lorsqu’elle est assurée par le bullage d’air,
mais, la saturation n’est jamais atteinte. Ainsi le taux d’oxygène dissous à chaque instant,
dépend de son taux de solubilisation et de son taux de consommation qui est variable en
fonction de la phase de croissance. La demande en oxygène est maximale en fin de phase
exponentielle de croissance, lorsque les effectifs bactériens sont les plus grands. Dans les
conditions de cette expérience, l’analyse des profils de DO, similaires, et celle des paramètres
quantifiant la croissance, très voisins, laisse supposer que le taux d’oxygénation atteint est
identique quelle que soit la méthode employée.

En fait la production de biomasse semble moins exigeante en oxygène que la synthèse

de l’enzyme. Ceci est visible par les quantités d’enzyme obtenue qui sont très différentes et

107
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

bien meilleures lorsqu’il y a bullage. De plus, la conservation de l’uréase, dans la phase

stationnaire est différente. En ce qui concerne la synthèse de l’uréase, une hypothèse en
accord avec le modèle de régulation, peut être proposée. Le bullage permet un métabolisme
plus actif, qui favorise une consommation meilleure ou différente des substrats contenus dans
le milieu de culture. Une plus forte assimilation d’un substrat, conduit à un besoin plus élevé
en azote. Le pool azoté diminuant plus rapidement et plus intensément, favorise l’induction de
la synthèse d’uréase. La synthèse de l’uréase semble dépendante d’une hiérarchisation des
substrats contenus dans le milieu de culture donc, indirectement, au taux d’oxygénation et par
conséquent de la méthode d’aération.

L’oxygène favorise donc, l’induction de la synthèse de l’uréase. Le métabolisme des

organismes aérobies est souvent limité par la disponibilité en O2 car ce dernier est faiblement
soluble dans l’eau (8 mg/l à 20° C). Cette limitation est d’autant plus grande que les effectifs
sont élevés. Dans le cas des cultures faiblement agitées, seule la surface du milieu présente
une concentration en O2 suffisante pour la croissance. Quand l’agitation est grande, la
solubilisation d’oxygène en provenance de l’atmosphère est meilleure, simplement par
augmentation de la surface de contact. De plus, l’action mécanique assure l’homogénéisation
du milieu.

Deux autres productions ont été lancées en fermenteur afin de mieux évaluer la
consommation en oxygène de la biomasse au cours de sa production. Les milieux étaient en
permanence agités pendant 24 heures et la consommation en oxygène, la conductivité, le pH
et la D.O. cellulaire, suivis régulièrement à l’aide de sondes. Les variations de ces paramètres
se trouvent dans la Figure n°26-2.

4.0 14 9.0

12 12
3.5
10
Figure n°26-2 : Suivi de la
8.8
3.0 8
10 D.O cellulaire ( ), de la
consommation en oxygène
Conductivité (mS/cm)

( ) de la conductivité ( )
2.5 6 8
8.6 et du pH ( ) en fonction du
D.O. cellulaire
O2 (mg/l)

temps.
pH

2.0
6
4 8.4
1.5

4
D.O cell(G)
1.0 O2 (mg/l)(G)
8.2
Conductivité (µS/cm/min)(D)
2
0.5 pH(D)

0.0 2 0 8.0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (h)

Les points ne sont pas tous reliés entre eux notamment entre 7 et 22 heures de
croissance. Durant cette période, se déroule l’intégralité de la phase exponentielle et le début
de la phase de ralentissement. L’allure des premiers points, par extrapolation empirique
situerait le début de la phase de ralentissement entre 10 et 15 h. La D.O. cellulaire moyenne
finale est de 2.3 ce qui est comparable aux productions précédentes.

108
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Les mesures de la teneur en oxygène ont été réalisées sous agitation. La courbe
s’effondre avant la 5ième heure montrant ainsi que l’oxygénation est insuffisante. En effet, la
courbe reste à un seuil très bas (0.15 mg/l) dont on peut supposer qu’il s’agit du seuil de
détection du matériel. Durant le début de la phase exponentielle, la consommation en oxygène
a pu être calculée, elle est de 0.7 mg/l/h pour un taux de croissance moyen de 0.33 et un temps
de division cellulaire de 2 heures. Au delà, la totalité de l’oxygène apporté est consommé par
la biomasse soit au minimum, 3.5 mg/l/h.

Le suivi de la conductivité permet de déterminer la qualité ionique du milieu, c’est-à-

dire, la quantité de sels minéraux présents dans une solution. C’est un paramètre facilement
quantifiable, mais il ne peut être relié directement aux activités enzymatiques dont la mesure
est basée sur des variations de conductivité en présence du substrat de l’enzyme. Dans ce
cadre expérimental, la conductivité augmente avec une vitesse de 0.6 mS/cm/h, ce qui
équivaut à 11 µS/cm/min. Ceci traduit l’apparition d’un fort pouvoir tampon dans le milieu.
Cependant, les variations de conductivité enregistrée sont élevées. Elles résultent très
probablement à la fois, du fonctionnement des voies métaboliques utilisées par les cellules et
de l’augmentation de la densité cellulaire. En effet, la voie métabolique qui produit des ions
ammonium est celle de l’hydrolyse de l’urée (2,4 g/l). Celle-ci fonctionne et ceci est confirmé
par une élévation du pH et par des analyses chimiques de TAC (Titre alcalimétrique).
Réalisées sur des suspensions de biomasse les valeurs de TAC atteignent des valeurs proches
de 300° F, ce qui témoigne d’une concentration élevée en ions carbonates issus, de
l’hydrolyse de l’urée et de la respiration cellulaire.

L’urée est présente dès l’inoculation à raison de 2,4 g/l. L’hydrolyse de l’urée est
susceptible de débuter immédiatement. Elle est réalisée alors par les cellules de l’inoculum.
Dès le début de la culture il y a augmentation à la fois de la conductivité et du pH (de 8, 5 à
8.8). Au cours de la phase de croissance, la diminution du pH (de 8.8 à 8.1) suggère, une
phase d’assimilation de l’ammonium libéré par l’hydrolyse, et/ou une accumulation de rejets
du métabolisme, tels les acides organiques. Lorsque les conditions sont proches de la
microaérophilie ou de l’anaérobiose ces productions peuvent être plus abondantes.

L’augmentation de la conductivité au cours de la croissance, suit l’accroissement des

effectifs bactériens mais pas les variations de pH. Ceci s’explique car, l’augmentation du
nombre de cellules dans la suspension implique l’augmentation de la charge globale
électronégative. Ainsi, le suivi de la conductivité est susceptible de fournir des informations
sur les phases de croissance cellulaire de S. pasteurii dans ces conditions expérimentales. En
conséquence, le suivi de la conductivité montre une corrélation élevée avec la D.O. cellulaire
suivant l’équation : Conductivité (µS/ml/min) = 10.33 + 5.25 log10(x) avec (R = 0.95) (Figure
n°27).

109
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

13
12
11
10
9
Conductivité (µS/cm)

8
Figure n°27 : La
7
conductivité en fonction de
6 l’accroissement de la D.O
cellulaire.
5
Conductivité (µS/cm/min)(G)

4
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4
0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6

D.O. cell

Le suivi de la conductivité qui se mesure automatiquement, pourrait être un outil

appréciable dans des conditions industrielles, pour évaluer un suivi de croissance. En effet, la
conductivité semble fortement dépendante de la phase de croissance jusqu’à la fin de la phase
exponentielle dans ces conditions de culture et de composition de milieux. Cet outil déjà
utilisable comme un indicateur de performance de la production d’enzyme lorsque la synthèse
est constitutive, pourrait être utilisé aussi pour la détermination des phases de croissance. Le
niveau d’aération est impliqué à la fois dans la production de biomasse et dans la production
d’enzyme. La production serait de type constitutif, lorsque l’oxygénation est faible et de type
inductible lorsque l’aération est plus intensive, à moins qu’il s’agisse dans ce cas, d’une levée
totale de d’inhibition. Ceci semble principalement dû à un emballement du métabolisme qui
voit ses réserves énergétiques diminuer rapidement lorsque le milieu s’appauvrit.

Pour mieux évaluer ce phénomène de production d’enzyme liée à la consommation

d’oxygène, une seconde série de milieux de culture en duplicata a été ensemencées et soumis
au bullage dans un cas avec de l’air et dans l’autre avec de l’oxygène pur durant 30 heures à
température ambiante (25° C) (Figure n°28).

110
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

4.5 1600
4.0
3.5
1400
3.0

2.5 1200

2.0 Figure n°28 : Suivi des

1000
moyennes des D.O

A.E (µS/cm/min)
D.O. cellulaire

1.5
cellulaires et des activités
800
enzymatiques (A.E) en
1.0
600
présence d’oxygène
D.O Oxygène Moy(G) (D.O : et A.E ) et
D.O sans Oxygène Moy(G)
A.E oxygnène Moy(D) 400 sans apport d’oxygène
0.5
A.E sans Oxygène Moy(D) (D.O et A.E ).
200

0.0 -200
-5 0 5 10 15 20 25 30 35

Temps (h)

Les valeurs moyennes des activités enzymatiques des deux duplicata, au temps de 26
heures, sont 6 à 7 fois plus élevées que celles obtenues lors de cultures précédentes et ce sans
changement des conditions d’ensemencement. Par ailleurs, ces A.E ont une bonne stabilité R2
= 0.999, ce qui suggère une biomasse de qualité. En effet, plus le coefficient de dispersion est
élevé, plus la biomasse est considérée de bonne qualité. Cette dernière, est le reflet de la
stabilité membranaire lorsque les cellules sont plongées dans une solution d’urée à 1 M, à 20°
C. Des écarts de dispersion en fonction de la courbe de tendance telle qu’une légèrement
augmentation durant le temps de la mesure est synonyme de lyse cellulaire qui correspond
alors à une augmentation brusque de la conductivité de la solution. Par contre, lorsque
l’activité enzymatique s’affaiblit durant cette même période de mesure, cela suggère la
présence d’uréase libre en quantité suffisante pour déclencher une diminution de la variation
de conductivité. En effet, le Km étant beaucoup plus faible que celui des cellules, il y a une
diminution de la vitesse d’hydrolyse par excès de substrat. Par ailleurs, il semble que l’apport
en oxygène permette une meilleure production d’enzyme dans ces conditions expérimentales.
Cette production d’enzyme semble suivre la croissance cellulaire avec un maximum en fin de
phase de ralentissement pour les deux duplicatas (Tableau n°44).

111
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Tableau n°44 : Récapitulatif des paramètres contrôlant la production de biomasses en

présence et en absence d’oxygène.

Paramètres En présence d’02 En absence d’02

Phase de latence (h) 2 2
Début de la phase exponentielle T:2h T:2h
Phase stationnaire (h) > 26 > 26
Taux de croissance moyen
pendant la phase exponentielle 0.233 ± 0.013 0.126 ± 0.03
(µ h-1)
Temps de génération moyen
pendant la 2.9 ± 0.17 5.6 ± 0.13
phase exponentielle (h)
Temps de génération moyen
pendant la 8.5 ± 0.47 6.4 ± 0.35
phase de ralentissement (h)
D.O moyenne fin de phase 3.7 ± 0.26 2.9± 0.2
exponentielle CV = 7 % CV = 5 %
D.O cellulaire maximale 4.19 ± 0.870 2.9 ± 0.030
A.E en fonction de la D.O durant y = 23.51e 1.1687x y = 24.67 e 1.2937x
la phase croissance R2 = 0.997 R2 = 0.996
A.E (µS /ml/min) maximale 1484 ± 131 1154 ± 96
A.E.S fin de phase exponentielle
383 388
(µs/ml/min)
Phase
Production 4.3 ± 0.74 10.1 ± 0.99
exponentielle
A.E
Phase de
(µS/min/h) 73 ± 11 54 ± 4.6
ralentissement
CV : coefficient de variation

De nombreuses similitudes existent entre les témoins sans oxygène et les productions
hyper oxygénées. Chacun des duplicata, présente une courbe de tendance liant fortement (R2
= 0.99) la D.O. cellulaire et l’A.E. de manière exponentielle. De plus, le maximum de
production d’enzyme est atteint, durant la phase de ralentissement, de manière quasi
simultanément pour les quatre milieux (26 h). Par ailleurs, trois heures plus tard, il y a une
diminution des activités enzymatiques et de manière concomitante. La production d’enzyme
se traduit par un pic d’activité, dont la durée n’excède pas 2 heures. Par ailleurs, l’insufflation
d’oxygène dans le milieu semble stimuler fortement la synthèse de l’enzyme et la production
de biomasse. En effet, l’A.E maximale moyenne témoin est inférieure de 23 % (≈ 300
µS/ml/min) pour une D.O. cellulaire moyenne inférieure de 15 %. Cependant, une variabilité
intrinsèque existe également. Cette variabilité ne se situe pas au niveau des profils de
croissance, mais dans la production d’enzyme. Globalement, la production d’enzyme dans
cette série est bien meilleure que dans la série précédente. Il n’est donc pas exclu que la
qualité de l’inoculum joue un rôle important dans l’obtention d’A.E élevées. La production
d’enzyme est bien meilleure en présence d’oxygène (Figure n°29). Par ailleurs, la différence
d’uréase produite, pour les milieux soumis tous les deux à un influx d’O2, est probablement
due à une porosité différente du diffuseur ou à une vitesse d’insufflation plus ou moins grande
dans le milieu de culture. L’absence de mesures pendant la nuit dans cette expérience ne
permet pas de relier la totalité des points entre eux.

112
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

1800 5

4
1600

3
1400

1200
2
A.E (µS/cm/min)

D.O. cellulaire
1000

800
1

600

400

200

A.E O2(1)
D.O O2(1)
A.E O2(2) D.O O2 (2)
0 A.E ssO2(1) D.O ssO2(1)
A.E ssO2(2) D.O ssO2(2)

-200 0
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 -5 0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (h) Temps (h)

Figure n°29 : Les profils de production d’uréase à gauche et de D.O. cellulaire à droite, en
absence et en présence d’O2.

Généralement, le maximum d’activité enzymatique est obtenu en fin de phase de

ralentissement, peu avant la phase stationnaire. C’est une phase dynamique où le taux de
croissance est compensé par le taux de décès. Un peu avant cette phase, il y a arrêt de la
synthèse de l’uréase puis très rapidement une chute des valeurs des A.E. Ce phénomène
apparaît moins prononcé et plus stable lorsqu’il s’agit d’une aération classique. La
conservation de l’enzyme est plus difficile en présence d’oxygène.

La suroxygénation semble provoquer une dissociation de la synthèse de l’uréase. En

effet, dans le cas d’une synthèse constitutive, le rapport des D.O. entre le début de chaque
phase et la fin devrait correspondre également à celui des activités enzymatiques. Dans le cas
des cultures témoins, le rapport durant la phase exponentielle est de 2.8 et 2, pour la D.O.
cellulaire et les A.E, respectivement. Ces valeurs sont relativement proches avec une variation
de 0,8. Dans le cas d’une culture fortement oxygénée, le rapport des D.O. est de 2.3 contre 1.5
pour les A.E, pour cette même phase de croissance. La différence est identique puisque de
0.8.

Dans la phase de ralentissement de la croissance, le rapport des D.O. est de 5.5 pour
les milieux oxygénés et 3.7 pour les témoins. Pour les A.E, ce rapport est de 29 pour les
cultures sous insufflation d’oxygène contre 16 pour les témoins. Ces résultats suggèrent une
dissociation entre les deux modes de synthèse. Elle devient plus évidente en présence
d’oxygène. Ceci est très probablement dû au fait que la présence de l’oxygène favorise un
métabolisme plus actif pour une plus grande proportion de la population. Par voie de
conséquence, ceci conduit à une consommation plus intense et/ou légèrement différente, des
nutriments. Cet appauvrissement nutritif concerne en premier lieu le pool d’azote par rapport
à celui du carbone.

D’après le modèle développé, une hiérarchisation dans l’assimilation des acides

aminés se réalise, notamment pour les acides BCAA, qui sont les acides aminés principaux de
la matière organique. Lorsque ces derniers viennent à manquer, ils sont produits à partir

113
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

d’autres acides, tels que la glutamine et l’acide glutamate présents dans l’extrait de levure.
Ensuite, c’est l’ammonium présent dans le milieu qui est majoritairement mobilisé pour la
production d’énergie et au fur et à mesure, utilisé pour l’assimilation. Ceci lève de manière
graduelle l’inhibition et/ou favorise l’induction de l’enzyme.

L’arrêt brutal de la synthèse de l’uréase survient au début de la phase stationnaire dans

ces conditions de culture. Ainsi, la lyse cellulaire conduit rapidement à une fuite cellulaire
puis à une diminution du pool enzymatique par dégradation de l’uréase. Tous les composants
cellulaires sont déversés dans le biotope y compris les morceaux d’ADN chromosomique et
plasmidique, qui deviennent alors une source d’azote pour les bactéries survivantes. La
dégradation des acides nucléiques correspond à une cascade de réactions dont le produit final
est l’urée. Enfin, la lyse cellulaire conduit aussi à la démobilisation et la libération également
des ions ammonium qui devrait conduire soit à une augmentation du pH ou bien à sa
stabilisation.

7. Bilan des premiers essais de milieu de culture.

Ces essais ont mis en évidence deux points essentiels pour la création d’un milieu de
culture industriel. Le premier point, concerne sa composition qui est suffisamment complète
pour permettre l’obtention de fortes activités enzymatiques (> 1mS/min/ml) avec une
concentration en extrait de levure deux fois plus faible par rapport à celle initialement
recommandée. Le second point concerne les conditions d’aération des cultures. En effet, les
activités enzymatiques sont grandement améliorées lorsque l’aération est favorisée. Par
ailleurs, l’aération favorise également la croissance cellulaire qui peut doubler lorsque les
conditions sont très favorables. Dans tous les milieux testés le maximum d’activité
enzymatique est obtenu durant la phase de ralentissement entre la 20ième et la 26ième heure de
culture dans ces conditions expérimentales. La synthèse de l’activité enzymatique semble
d’abord liée à la croissance cellulaire durant la phase exponentielle, puis s’en dissocie durant
la phase de ralentissement. La synthèse est donc successivement constitutive puis induite.

La conservation de l’uréase est ensuite conditionnée à un stockage rapide de la

suspension bactérienne à 4° C, sans insufflation d’air ou d’oxygène. Or, dans ce procédé,
l’injection peut prendre plusieurs heures en fonction des volumes mis en jeu. Par conséquent,
c’est par anticipation que le refroidissement doit s’effectuer. Ainsi, il faut arrêter la culture
avant de constater la diminution de la production d’activité enzymatique car une suspension
de qualité permettra une meilleure conservation, sans fuite de l’enzyme hors de la cellule et
dégradation. Le choix d’une oxygénation par insufflation d’air est dans un premier temps
nécessaire pour bien maitriser la production de la biomasse et la synthèse de l’enzyme.
Cependant, malgré de grandes avancées pour l’obtention de fortes activités enzymatiques, il
semble que la qualité de l’inoculum joue un rôle également déterminant. La production
d’uréase chez S. pasteurii est sans aucun doute sous un contrôle plurifactoriel. Cependant, si
ceci reste encore du domaine du laboratoire de recherche, ce sont des bases pour développer
le milieu industriel. Celui-ci passera obligatoirement par un changement des volumes à
produire et une diminution des coûts de production liés aux prix des matières premières, aux
durées de production, aux stockages et/ou conditionnements de la biomasse.

114
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

II. DEVELOPPEMENT VERS L’INDUSTRIALISATION.

Le milieu de culture de type SBF est susceptible de fournir des niveaux élevés
d’activité enzymatique. Cependant, la phase industrielle, c’est-à-dire l’augmentation des
volumes nécessite de diminuer les coûts de production à leur maximum. En effet, le
changement d’échelle entraîne l’apparition de nouvelles contraintes, notamment, celle de
réaliser des cultures successives pour atteindre les volumes de chantier. Or, l’ensemencement
des milieux de culture se réalise à l’aide d’une suspension de biomasse représentant 1 % du
volume de la nouvelle culture. Ainsi, pour atteindre, 10 000 litres soit 10 m3, il est nécessaire
d’ensemencer avec 100 litres de biomasse, qui lui-même aura été inoculé avec 1 litre de
suspension. Cette technique est adaptée pour des cultures en batch. Cette méthode est la plus
la plus simple à mettre en œuvre pour permettre une montée en volume contrairement aux
cultures en continu. Pour cela une optimisation de la composition des milieux de culture est
recherchée ainsi que l’établissement des conditions propices de culture en bio réacteurs.

1. Optimisation de la composition du milieu de culture pour une production de

masse.

La nécessité de réduire les coûts de production, notamment les quantités d’extrait de

levure a conduit à rechercher des sources alternatives de nutrition. Une première démarche a
été donc de rechercher une source complète complexe et alternative de nutrition. C'est-à-dire
de remplacer complètement l’extrait de levure apporté (10 g/l) par un substitut à base d’extrait
de levures. Cette stratégie a été entreprise par Whiffin (2004) durant ses travaux de thèse. Ses
résultats ont montré une plus grande instabilité dans la production d’uréase. Ceci signifie qu’il
est risqué de remplacer totalement la source pure d’extrait de levure par une source alternative
à base d’extrait de levure telle que la Marmite ou la Végémite. La seconde stratégie a été la
réduction des coûts, non pas en remplaçant totalement la source de nutriment mais en
réduisant son apport d’extrait de levure dans le milieu de culture. Pour cela, il est nécessaire
de substituer une partie de la source de carbone par une autre, assimilable et contenu dans
l’extrait de levure. Ceci permettrait de réduire l’apport en l’extrait de levure sans pour autant
exclure cette source riche et complexe de la composition du milieu. Cette réduction de
l’extrait de levure pour minimiser les coûts n’est valable que si le produit substitué répond
aux impératifs du procédé. Cette source doit être peu coûteuse, assurer une bonne production
de biomasse sans en changer les propriétés physico-chimiques, et permettre une production
importante d’activité enzymatique.

Parallèlement, les injections de biomasse en colonne réalisées sur du sable fin ont
montré qu’une partie de la biomasse injectée parcourait sans se fixer les petites colonnes
construites en sable de Fontainebleau NE 34. Ceci amène à une perte du potentiel
enzymatique au sein de la colonne. Pour améliorer le taux de cellules retenues, l’ajout d’un
sucre assimilable par S. pasteurii, pourrait favoriser la formation d’exo polysaccharides (EPS)
et d’adhésines. Ces formations participent directement au processus général de fixation au
cours du premier stade de l’adhésion. Cette phase d’ancrage de la bactérie au support, dite
primaire, est réversible par le jeu d’interactions non-spécifiques. Ainsi, la stimulation d’EPS
faciliterait cette première étape cruciale. Ces deux voies de recherche ont conduit à réaliser un
screening des différents sucres qui existent pour identifier ceux qui sont à la fois assimilables
pour la croissance et qui stimulent la synthèse d’EPS ou d’adhésines.

115
 Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

1.1. Recherche d’un substitut à l’extrait de levure.

L’extrait de levure possède un large éventail d’acides aminés, de vitamines, de sels

minéraux et est, par contre, peu riche en glucides (Tableau n°45).

Tableau n°45 : Composition de l’extrait de levure en hydrates de carbone et acides aminés

libres et totaux d’après BD Bio-pharmaceutical production.
2-Désoxygalactose

Acide glutamique

Acide aspartique
Phénylalanine

Tryptophane
Méthionine

Asparagine
Rhamnose

Glutamine

Isoleucine

Thréonine
Tréhalose

Histidine

Tyrosine

Arginine
Glucose

Leucine
Glycine

Alanine
Lactose

Cystine
Proline
Fucose

Lysine
Pinitol

Valine
Serine
COMPO
SITION

%
7.3
0.1
1.6
0.3
2.5

2.7
0.9
2.7
1.3
1.3
1.7
0.7
0.9

5.7

2.2
0.2
4

2
1
LIBRE

%
3.3
1.4
4.7
6.2
4.9
1.1
4.4
2.3
1.9
1.8
0.9
1.2
4.8
6.2

5.9
11

3
/

/
TOTAL

Les hydrates de carbone identifiés sont un oligoside, le tréhalose, association de deux

molécules de glucose, ou des sucres simples tel que le fucose, le 2-désoxygalactose, le
rhamnose, le glucose et le lactose qui ont été identifiés par chromatographie HPLC (DB
diagnostique). Le tréhalose et le 2-désoxygalactose semblent être les sucres prépondérants,
bien que les concentrations ne soient pas précisées. Par contre, le glucose, le fucose, le
rhamnose et le lactose sont des sucres minoritaires. Leur présence dans l’extrait de levure ne
préjuge évidemment pas de leur assimilation par la souche de S. pasteurii. En effet, il est
nécessaire d’identifier les sucres potentiellement utilisables comme seules source de carbone
et d’énergie par S. pasteurii en ensemençant deux galeries de type API 20 E et API 50 CH.
Celles-ci, standardisées et miniaturisées, associent des tests biochimiques permettant l’étude
du métabolisme. Ces tests se présentent sous formes de micro-tubes contenant des substrats
déshydratés inoculés avec une suspension bactérienne. Les réactions produites pendant la
période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’addition
de réactifs. Les expériences ont été réalisées en aérobiose et anaérobiose notamment pour le
test Api50 CH. Les résultats sont lus après 24 et 48 heures d’incubation (Figure n°30 et
Tableau n°45).

Figure n°30 : Résultats des tests

biochimiques de la galerie API 20
E à 24 heures

116
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

La galerie API 20 E permet d’identifier la présence ou l’absence d’enzyme et

l’utilisation de certains glucides. Ces substrats peuvent être oxydés, fermentés entre 24 à 48
heures. Ces activités métaboliques se traduisent soit par un virage de couleur dans le micro
tube soit par une croissance du micro organisme.
Chez S. pasteurii (CIP 66.21), la seule enzyme identifiée après 24 heures a été
l’uréase. Au bout de 48 heures, l’arginine di hydrolase ou arginase (ADH), qui transforme
l’arginine en ornithine, avec libération d’ammonium et de gaz carbonique a été mise en
évidence. Une réaction positive a également été observée pour la production d’acétoïne (VP).
Par contre, il n’y a pas eu de fermentation, d’oxydation ou d’assimilation de glucides sur cette
galerie.
Pour la souche S. pasteurii (DSM 33), des réactions positives plus nombreuses ont été
identifiées avec, l’ADH, la lysine décarboxylase (LDC), l’ornithine décarboxylase (ODC), la
gélatinase (GEL) et l’uréase au bout de 24 h. Mais là aussi les glucides de la galerie API 20 E
n’ont pas été utilisés.
Ces résultats différents, suggèrent, une diversité métabolique au sein d’une même
espèce, ou bien, un équipement ou machinerie métabolique permettant une réponse plus ou
moins rapide en fonction des souches.

Des tests complémentaires sur le métabolisme général ont été réalisés et ont permis
l’identification de la catalase et de la nitrate réductase chez S. pasteurii (CIP 66.21). Cette
dernière permet d’utiliser le nitrate comme accepteur terminal dans la chaine respiratoire.
Autrement dit, le nitrate permet de maintenir un métabolisme actif en condition d’anoxie.
Ceci est à prendre en compte dans le choix du sel de calcium, notamment entre le nitrate ou le
chlorure de calcium.

Par ailleurs, d’après Smith et al., (1946), les acides gras, les acides butyriques, le β-
hydroxy butyrate et le β-hydroxy valérate, n’ont pas été attaqués par cette bactérie. Ces
derniers sont importants car ce sont des précurseurs de l’acide pantothénique, du coenzyme A
et des acides aminés tels que l’isoleucine, la valine et la leucine qui représentent près de 1/3
des acides aminés qui composent les protéines. Ils font partie de la Branched Chain Amino
Acide (BCAA). Par ailleurs, d’après le même auteur, les composants du cycle de Krebs
(acétate, citrate, α cetoglutarate, malate) n’ont pas été oxydés ou faiblement. Il en était de
même pour le glycérol, l’acide lactique, la glutamine et l’asparagine. Cependant, l’acide
glutamique indispensable pour le bon fonctionnement du métabolisme puisqu’il est à
l’intersection du métabolisme du carbone et de l’azote et peut représenter près de 50 % du
pool des acides aminés. Il permet via son catabolisme à l’aide de la NAD-GDH la formation
de l’α cétoglutarate. Cette molécule clé constitue le squelette de nombreux acides aminés et le
passage obligé de nombreuses voies d’anabolisme et de catabolisme. Par ailleurs, il a été
montré que l’α cétoglutarate est utilisé par S. pasteurii en présence d’ammonium ou de
sodium. En effet, le particularisme de S. pasteurii est de ne pouvoir assimiler un grand
nombre d’acides aminés qu’en présence d’un gradient de protons qui résulte de la dissociation
de l’ammonium et/ou de la présence de sodium. Ce gradient permet la translocation des
acides aminées à l’aide de diverses perméases et n’est très vraisemblablement pas un transport
de type symport (Willey et Stockes, 1963, 1964, Mörsdorf et Kaltwasser, 1989 ; Jahns,
1992 ; Kalpada et al., 1992 ; Jahns, 1993 , 1995 ; Beck et Jahns,1996, Kuhlmann et Brener,
2002). L’α cétoglutarate est oxydé par S. pasteurii seulement en présence d’un sel
d’ammonium.

117
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

L’étude complète du métabolisme glucidique de S. pasteurii est effectuée avec les

galeries API 50 CH. Les deux souches ont des profils d’utilisation des sucres, similaires.
Aucun sucre n’est oxydé ou fermenté, à l’exception de l’inuline ou une croissance sans virage
de couleur est observée pour S. pasteurii CIP (66.21) (Tableau n°46) et de l’esculine oxydée
à 48 heures pour S. pasteurii (DSM 33).

Tableau n°46 : Résultats des tests biochimiques des galeries API 20 E et API 50 CH à 24
heures pour S. pasteurii CIP (66.21).

GLYG

DARL
DFUC

LARL
MDM
MDG

AMD
MNE

MAL
NAG

MEL

MLZ
RHA

ARB

GEN

LYX
TAG
GAL

DUL

GNT
LAC

TUR

2KG
5KG
XLT
RAF
FRU

CEL

TRE
ESC
SBE

INU
+
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C

DARA

DXYL
ONPG

LARA

LXYL
UREE

MAN

MDX
ADH

ADO
MEL
RHA

ARA
TDA

GLU

GLY
LCD

ERY
GEL

SOR

SAC
IND

INO

RIB
H 2S

OX
VP

- - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Ces résultats sont conformes à ceux décrits par Willey et Stokes (1963) et repris par
Chester et al., (1889) puis Young et al., (2001). En effet, aucun de ces sucres n’a été oxydé.
Cependant, certains antibiotiques (streptomycine et actinomycine D) peuvent avoir un effet
stimulant sur ces activités enzymatiques (Coleman et Elliot, 1964 ; Mandal et Majumdar,
1968). De façon analogue, la présence, d’un poison, de type d’acétate de phényl-mercure
provoque chez S. pasteurii, une augmentation d’activité enzymatique. Ceci a conduit d’après
Pahan et al. (1992) à suggérer la présence d’un transporteur de glucose.

D’après les résultats des galeries API, les principaux sucres diagnostiqués dans
l’extrait de levure, tels que le glucose et le lactose ne peuvent être utilisés par S. pasteurii
comme seule source de carbone et d’énergie. Il en est de même des autres sucres : le
tréhalose, rhamnose et le fucose. Ces données amènent à exclure l'emploi d’une source
d’extrait de levure d’origine brassicole, naturellement riche en maltose (50 à 55 %),
maltotriose (10 à 20 %), avec toutefois de faibles teneurs en glucose, fructose et saccharose
(Maskell et al ;, 2001 Kennedy et al ;, 1995).

Parmi les 50 sucres proposés sur la galerie API 50 CH, un seul polysaccharide
(inuline) est assimilable pour la souche S. pasteurii CIP 66.21. Cette information permet
d’envisager la diminution de l’apport de l’extrait de levure au profit d’une autre source de
carbone. Cet apport d’inuline pourrait se faire sous la forme de chicorée car cette plante
l’accumule à raison de 78 % en poids sec.

L’inuline est un oligomère soluble composé de 2 à 70 unités de fructose (Leenheer et

al., 1994). C’est un fructane, c'est-à-dire un β (2→1) Fructosyl-Fructose (Waterhouse et al.,
1993). Le degré de polymérisation (DP) ainsi que le taux de ramification dépendent de son
origine. Cet oligosaccharide sert de sucre de réserve, notamment dans les organes de réserve
de la chicorée où il peut représenter près de 15 à 20 % en poids sec (Van Loo et al., 1995). La

118
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

forme native de l’inuline de la chicorée possède un DP de 12, et un faible degré de

ramification (1 – 2 %) (De Leenheer et al., 1994). Son occurrence est également élevée dans
le monde bactérien puisque l’inuline a été retrouvée chez les Pseudomonaceae, les
Enterobacteriaceae, les Streptococcaceae, les Actinomycètes, les Lactobacilles et les
Bacillaceae (Van Geel-Schutten, 2000). Ce sucre, très répandu, est connu pour faciliter le
transit intestinal chez l’homme, car il permet à la micro flore de se développer alors qu’il n’est
pas dégradé dans l’estomac. La chicorée lyophilisée qui renferme 78 % d’inuline et est
courante sur le marché, ne pourra cependant pas remplacer totalement l’extrait de levure car
elle est peu riche en acides aminés. Il ne s’agira donc que d’un complément permettant
éventuellement de réduire la quantité d’extrait de levure.

L’ajout de chicorée dans la composition du milieu de culture, doit compléter le rapport

C/N fourni par l’extrait de levure. De plus cet ajout ne doit pas perturber le rendement de la
croissance d’une part et d’autre part la production d’activité enzymatique. Dans la galerie
API, la concentration en inuline est de 6.6 g pour 1000 ml. De plus, la composition du milieu
de culture standardisé permettant de réaliser ces tests, renferme une concentration en Y.E de 5
g pour 1000 ml. Le rapport massique de l’inuline sur l’extrait de levure est de 1.32.
Les essais suivants de production de biomasse, en duplicata, à température ambiante
pendant 26 heures ont été faits en présence de concentration variable d’inuline (1 g de
chicorée lyophilisé contenant 0.78 g d’inuline). Ainsi le rapport massique évoqué ci-dessus,
exprimé en g de chicorée par g d’extrait de levure devient 1.69. Les essais sont donc réalisés
en faisant varier ce rapport de 0 jusqu’à environ 1,69 (1.5) (Tableau n°47).

Tableau n°47 : Les activités enzymatiques et les D.O cellulaires obtenues avec différentes
quantités de chicorée dans le milieu de culture.

Composition des milieux de

culture Activité enzymatique
D.O cellulaire
Chicorée Y.E Chicorée / (µS/ml/min)
(g/l) (g/l) Y.E
0 10 Milieu SBF 260 2.5
3 6 0.5 514 ± 52 CV = 10 % 2.5 ± 0.17CV = 7 %
5 5 1 282 ± 96 CV = 34 % 3.7 ± 0.47 CV = 12 %
6 4 1.5 98 ± 8.2 CV = 8 % 3.9 ± 1.14 CV = 29 %

Tous les milieux contenant un poids de chicorée supérieur ou égal, à celui de l’extrait
de levure ont conduit à de fortes productions de biomasse, supérieures d’un facteur 1.5 à celle
obtenue sur le milieu SBF. Mais elles sont associées aussi, à une faible production d’enzyme,
inférieure de plus de 60 % des activités enzymatiques obtenues sans ajout de Chicorée. Par
ailleurs les fortes concentrations ont conduit, à la formation d’agglutinats et d’endospores.
Ainsi, un rapport de 1/2 (3 g/l de chicorée avec 6 g/l de Y.E) semble être un bon compromis.
Il faut préciser que l’ajout de chicorée induit une coloration intense du milieu de culture ce
qui peut perturber les lectures de D.O.. D’autre part, il ne faut pas que ce produit soit en excès
car dans ce cas, il se retrouvera sur le chantier, dans les effluents d’injection et augmentera le
coût de leur traitement.

Ainsi, quatre productions de bactéries ont été réalisées en milieu liquide en

Erlenmeyers à 20° C en diminuant de moitié la quantité de chicorée apportée. Deux d’entre
elles constituent les témoins sans inuline, tandis que les deux autres renferment 1.5 g/l de
chicorée ajoutée à T0. Les croissances ont été suivies par la mesure de la D.O.600. Des taux de
croissance plus élevés ont été observés dans le cas des milieux additionnés de chicorée

119
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

(Figure n°31). L’apport de chicorée permet de réduire d’un tiers l’apport d’extrait de levure.
Ceci conduit donc à diminuer le coût de la culture. La composition de ce milieu de culture
nommé SBF-CHIC sera complétée à la suite des recherches issues du laboratoire de
Microbiogéologie d’Angers. En effet, ces travaux ont conduit à effectuer des ajouts
supplémentaires de vitamines après autoclavage et de 0.1 g/l de chlorure de magnésium
(MgCl2) et le milieu qui en résulte est nommé le Milieu SBF-CHIC-VIT.

5.0
4.5
4.0
3.5
3.0 D.O. cellulaire sans chicorée
D.O. cellulaire avec chicorée Figure n°31 : Suivis des
2.5
croissances de S. pasteurii
D.O. Cellulaire

2.0
avec et sans chicorée.
1.5

1.0

0.5

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Temps (h)

Les effets de l’incorporation de la chicorée dans la composition d’un milieu de

production identifié SBF-CHIC-VIT, ont été testés aussi pour évaluer son impact sur la
production d’uréase quantifiée au bout de 24 heures. Pour cela 20 essais de production de
biomasse ont été réalisés. Sans chicorée (Milieu SBF), l’activité enzymatique moyenne est de
0.612 ± 0.36 mS/min/ml avec un coefficient de variation de 54 %. Lorsque de la Chicorée est
ajoutée, la moyenne d’A.E est autour de 0.782 ± 0.27 mS/min/ml avec un coefficient de
variation de 35 %. L’ajout de la chicorée semble donc favoriser une augmentation en
moyenne de 20 %. Par ailleurs, la diminution du coefficient de variation montre que la
synthèse de l’uréase semble plus stable en présence de chicorée.

1.2. Augmentation des volumes de production.

L’élaboration maintenant acquise d’un milieu de culture de type industriel dont la

composition satisfait à la fois les contraintes économiques et biologiques, permet d’accéder à
l’étape suivante. Ainsi, il est possible d’augmenter les volumes de production de biomasse
pour satisfaire les besoins des essais de bio calcification en colonnes de plus grande taille. Ce
changement d’échelle ne doit pas entrainer de variation de la qualité de la biomasse
notamment en ce qui concerne la quantité d’enzyme produite.

Pour cela, cinq essais de culture en bio réacteur avec un volume utile de 1.5 litre ont
été réalisés, avec un milieu de culture de type SBF-CHI-VIT et avec le système de régulation
automatique de l’oxygène. Ce système de régulation automatique permet de maintenir un
niveau d’oxygénation fixé par l’opérateur au cours de la culture. En effet, une valeur de

120
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

niveau d’oxygénation optimum est choisie pour la culture et est encadrée par une consigne
maximale et minimale. Ce système de régulation, actionne les deux composants de l’aération
du bio réacteur, la rotation ou /et insufflation.

Ces essais de culture à 20° C, ont abouti à des productions d’uréase très variables d’un
batch à l’autre (38 - 798 µS/min/ml), avec des valeurs de D.O. cellulaires finales, toutes aussi
variables (2 - 5). Ces premiers essais de culture avec une automatisation de l’aération n’ont
donc pas apporté satisfaction. Par conséquent, une deuxième méthode a été utilisée. Elle
consiste à réaliser parallèlement aux essais en bio réacteur, des cultures de référence en
Erlenmeyers, avec le même inoculum mais de petits volumes (150 ml), afin de comparer les
performances des deux systèmes. L’oxygénation des milieux contenus dans les Erlenmeyers
est assurée par leur mouvement sur la table d’agitation. Chaque série d’essais permet d’ajuster
en conséquence les variables d’aération du bioréacteur, c’est-à-dire le nombre de rotations de
l’hélice par minute (RPM) et le débit d’air du bullage. Pour cela, un maximum de paramètres
au départ de chaque batch de bio réacteur (température, pH, volume de culture) sont
maintenus constants (Tableau n°48).

Tableau n°48 : Comparaison entre les résultats obtenus en bio réacteur et en Erlenmeyers.

Variables
d’aération dans le Bioréacteur Erlenmeyers
bioréacteur
N° des AIR Rotation D.O A.E D.O A.E
essais (l/min) (rpm) cellulaire (µS/min/ml) cellulaire (µS/min/ml)
1 0 50 1.98 455 2.85 656
2 1.5 100 1.05 237 3.1 450
3 1.5 100 1.36 538 2.73 678
4 1.5 120 1.8 766 3.23 618
5 3 100 2.4 776 2.84 865
6 3 100 2.05 438 3.2 493
7 3 200 1.75 705 2.76 646

L’essai n°1 suggère que l’agitation assurée par la rotation des hélices, à elle seule, est
insuffisante pour assurer une oxygénation suffisante pour une bonne production de biomasse
avec des niveaux d’A.E élevés. Les valeurs de D.O. et d’A.E du bio réacteur sont près de 30
% moins élevées que dans l’Erlenmeyer correspondant.
L’ajout du bullage et le doublement de la rotation permet de réduire l’écart moyen du
rapport AE bio/AE Erlen à 0.9 ± 0.4 avec un coefficient de variation (CV) de 42%.
L’accroissement du débit du bullage de 1.5 à 3 réduit la différence du rapport à 1 ± 0.1 avec
un CV de 12 %. Néanmoins des différences subsistent entre les performances obtenues en bio
réacteur et celles obtenues en Erlenmeyer. En effet, en moyenne l’activité enzymatique
obtenue en bio réacteur est de 576 ± 213 µS/min/ml, soit un coefficient de variation de 37 %
contre 625 ± 147 µS/min/ml avec un de CV = 23 %. Par ailleurs, des valeurs plus basses de
D.O. cellulaire ont également été constatées dans les milieux de culture du bio réacteur. Soit
en moyenne près de 1.7 ± 0.5 (CV de 27.7 %) contre le double avec 3 ± 0.2 avec un CV = 7.6
%. Ceci signifie que l’aération semble meilleure dans les Erlenmeyers.

Seulement, deux essais en bio-réacteur (n°4 et n°7) ont présenté des productions
enzymatiques supérieures à celles en Erlenmeyer et cela dans deux conditions d’aération bien
différentes. Les D.O. finales sont comparables entre les deux bio réacteurs mais sont très

121
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

inférieures à celles des suspensions produites dans les Erlenmeyers. Ceci pourrait être attribué
à l’influence du volume. Il est plus facile de maintenir une bonne oxygénation dans un petit
volume que dans un grand. D’autre part, il a été montré que des niveaux élevés d’oxygénation
favorisaient une meilleure synthèse d’enzyme. A l’opposé, lorsque la concentration en
oxygène devient limitante, il se produit un ralentissement de là consommation des nutriments.
Dans le cas d’un milieu riche comme celui-ci, les sources d’azote seront d’autant moins
utilisées, retardant ou diminuant par la même l’induction de la synthèse de l’uréase.

Par ailleurs, les premiers essais de culture avaient laissé penser que la qualité de
l’inoculum pouvait être également responsable de l’efficacité de la production d’enzyme.
Ainsi, un inoculum enzymatiquement très actif, se trouvant juste en fin de phase exponentielle
de croissance pourrait faciliter l’obtention d’une biomasse elle aussi efficace. La variabilité
constatée entre les duplicata peut résulter des conditions de stockage ou de culture sur milieu
gélosé. Selon Shapiro et Higgins (1989) ; Shapiro et Trubatch (1991), les colonies
bactériennes sur gélose sont extrêmement bien organisées et, répondent à de nombreuses
régulations de gènes qui coordonnent les divisions cellulaires, en fonction de l’accessibilité
nutritive. La communication intercellulaire permet de coordonner le développement cellulaire.
Il favorise par exemple en premier lieu, le développement en longueur des cellules jusqu’au
contact des cellules entre elles, pour former une colonie. Celles-ci sont formées de couches
successives de bactéries correspondant à des tranches d’âges différents et des capacités
métaboliques différentes. La principale contrainte pour les bactéries, lors d’une culture sur
gélose est l’accessibilité aux nutriments, l’oxygénation n’étant pas un facteur limitant. Par
conséquent, il n’est pas impossible en fonction de la diffusion de nutriment notamment azoté
d’avoir un gradient d’expression de l’uréase.

Pour identifier les conditions les plus propices au développement des activités
enzymatiques, une troisième méthode a été employée. Il s’agit d’une méthode d’optimisation
directe, la méthode Simplex. Ainsi, les deux valeurs (RPM) et débit d’air sont incrémentés
selon un plan factoriel à deux niveaux ; ceci pour connaître le sens de l’évolution vers une
fenêtre optimale. Cette méthode consiste à réaliser k + 1 expériences avec k correspond au
nombre de variables. Ceci permet de former une figure régulière de k + 1 sommets. Le
principe de cette méthode consiste à s’éloigner du plus mauvais point, dans notre cas celui qui
fournit la plus mauvaise activité enzymatique. Pour ce faire, une nouvelle expérience est
réalisée avec les coordonnées à l’opposé de ce plus mauvais point. Un nouveau Simplex est
ainsi réalisé et les itérations sont poursuivies jusqu'à l’obtention de l’optimum. Le critère de
performance pris en compte pour cette étude a été l’activité enzymatique spécifique (A.E.S)
(Tableau n°49).
Tableau n°49 : Résultats des cultures de 1.5 l en bio réacteur à température de 25° C
pendant 24 heures.

Activité Activité
Débit d’air Agitation enzymatique D.O Enzymatique
Essais n°
(l/min) (rpm) spécifique cellulaire (µS/min/ml)
(µS/ml/min/D.O)
1 1 100 394 1.36 535
2 2 100 323 2.4 775
3 3 200 403 1.75 705
4 2 200 316 3 948
5 2 150 675 2.4 1620
6 2 150 411 2.55 1048

122
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

Les essais n°1 et n°2 ont été réalisés avec deux niveaux de débit d’air différents (1
l/min et 2 l/min) en maintenant la vitesse de rotation constante (100 rpm). Les résultats sont
très similaires à ceux obtenus dans les essais précédents (essais n°3 et n°7). Un triangle (n°1)
peut être ainsi formé entre le point 0 et les coordonnées correspondant aux essais n°1 et 2, en
y précisant les AES obtenues. La détermination des coordonnées du triangle symétrique par
rapport au centre de gravité des points précédents donne les conditions d’aération de l’essai
n°3 (3 l/min et 200 rpm). L’AES obtenue dans ces conditions est meilleure que celles des
essais précédents. Ainsi est formé un nouveau triangle (n°2) présentant à ses sommets les
AES des essais n°1, 2 et 3. La valeur la plus mauvaise correspond à celle de l’essai n°2 (323
µS/min/ml). La recherche du symétrique de ce point se fait par la construction d’une droite
qui passe par le centre de gravité de la droite reliant les coordonnées des essais n°2 et n°3. Les
nouvelles coordonnées obtenues donnent les conditions d’aération à appliquer à l’essai n°4 (2
l/min et 200 rpm). La valeur de l’AES obtenue dans cet essai (316 µS/min/ml) est très
similaire à celle de l’essai n°2 (323 µS/min/ml). Ces deux valeurs sont les plus faibles
obtenues et sont donc retenues pour la recherche des conditions d’aération (coordonnées)
applicables à l’essai n°5 (2 l/min et 150 rpm). L’AES obtenue dans ces conditions est forte
(675 µS/min/ml). Cet essai a été répété dans les mêmes conditions (essai n°6) et a donné une
valeur d’A.E.S élevée, avec toutefois une variation importante.

L’obtention d’activités enzymatiques spécifiques suffisamment élevées a conduit à

l’arrêt de la procédure de la construction du Simplex (Figure n°32).

Débit (L/min)
Débit (L/min)

4 4
403

3 3
323
323
2
2 2

1 1 394
1 1 394

rpm
rpm
0 100 200 300 0 100 200 300

Débit (L/min) Débit (L/min)

4 4
403 403

3 3
323 2 323
411

2 3
316 2 675
316

1 1 394 1 394

rpm rpm
0 100 200 300 0 100 200 300

Figure n°32 : Représentation de l’évolution d’un simplex en fonction des deux variables
de l’aération (débit et rpm) suivant l’activité enzymatique spécifique.

Les meilleures conditions d’aération pour l’obtention d’une production importante

d’uréase caractérisée ici par l’AES (AE/DO) sont une insufflation de 2 l/min d’air et une
agitation obtenue par la rotation de l’hélice à 150 rpm. Ces résultats sont valables pour une
culture en bio réacteur de 1.5 l à 25° C. Si l’on avait utilisé simplement l’AE pour établir le
Simplex la progression aurait été la même ainsi que les conditions optimales d’aération pour

123
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

la production d’enzyme. Celles-ci ne correspondent cependant pas à une oxygénation très

intense.

Les D.O. cellulaires et les AE ont toutes été mesurées après 24 heures d’incubation.
Les croissances réalisées en bio réacteurs étaient toujours lancées la veille pour être lues en
milieu de matinée après une nuit de fonctionnement en automatique. Pendant cette période se
déroulait la phase exponentielle de croissance. Ainsi, les fortes chutes du taux de saturation en
oxygène du milieu ont longtemps été interprétées comme une consommation élevée de
l’oxygène par la biomasse durant cette phase. Cependant, à la fin de ces essais, quelques
résultats difficilement interprétables, ont laissé penser qu’il pouvait y avoir eu des conditions
d’aération défavorables pendant la nuit.

L’air comprimé fourni au Laboratoire des Matériaux et au laboratoire de

Microbiologie provient d’un compresseur. Une programmation de sécurité suspend l’arrivée
d’air automatiquement de 19 h 30 jusqu’à 7 heures du matin, sans que le personnel en ait
connaissance. Or, ce compresseur alimente l’entrée d’air du bio réacteur. Ainsi, pendant la
nuit, l’arrêt de l’insufflation d’air limitait l’oxygénation à la seule agitation. L’étude en bio
réacteur du suivi de la croissance de S. pasteurii prend en compte cette défaillance
systémique. Elle n’a pas été prise en compte dans l’établissement du Simplex qui a demandé
environ 3 semaines. Le temps imparti à l’ensemble des recherches présentées ici n’a pas
permis de refaire ces essais.

2. Description du suivi d’une production de biomasse riche en uréase.

L’ensemencement d’un bio réacteur se fait avec un inoculum liquide. Celui-ci est
fabriqué à partir de cultures bactérienne sur gélose et il représente entre 5 et 10 % du volume
total de la culture en fermenteur. L’évolution des bio réacteurs est contrôlée par le suivi de
paramètres physico-chimiques (T° C, pH, O2, NH4+) et biologiques comme la D.O. cellulaire,
l’activité enzymatique totale apparue dans le milieu (A.E.T) et l’activité enzymatique
spécifique (A.E.S). Le milieu de culture employé est celui référencé Milieu SBF-CHIC-VIT
qui renferme 8 g/l d’extrait de levure, 2.4 g/l d’urée, 1.5 g/l de Chicorée, 3 g/l de NaCl, 0.1 g/l
de MgCl2, 0.58 mg/l de NiCl2 et un cocktail de trois vitamines.

Des consignes sont données au bio réacteur pour fixer le niveau d’aération des cultures
(2 l/min et 150 rpm), et pour maintenir la température (30° C) constante tout au long de la
culture. De plus, le pH est suivi mais aucune consigne n’est transmise pour le réguler. Cette
approche a été choisie pour, dans un premier temps, reproduire les conditions de culture en
Erlenmeyer (Figure n°33).

124
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

Figure n°33 : Suivi d’une culture de S. pasteurii CIP 66.21 en bio réacteur. Deux zones
ont été identifiées en pointillé. La première, circulaire, correspond au suivi du taux de
saturation en oxygène du milieu. L’encadrement rectangulaire concerne le suivi de
l’A.E.T, de la D.O. cellulaire.

L’interprétation de l’ensemble de ces paramètres prend en compte l’arrêt du bullage

durant la nuit (entre les deux flèches rouges (environ 11 heures à chaque fois)). L’interruption
de l’oxygénation par insufflation d’air provoque une chute brutale de la courbe du taux de
saturation en O2. Ensuite, cette courbe qui au préalable présentait un profil hachuré, dû à la
consommation d’O2 par les bactéries, devient lisse et se maintient à un niveau très bas jusqu’à
environ la 20ième heure. L’agitation ne suffit pas pendant cette période pour maintenir la
concentration en O2 dans le milieu de culture et les bactéries se retrouvent en condition
d’oxygénation limitante pour leur croissance. A la reprise du fonctionnement du compresseur,
le taux d’oxygène dissous tend à remonter mais la consommation par les bactéries est alors
très grande. Une autre séquence d’arrêt de l’insufflation d’air apparait entre la 31ième et la
42ième heure.

2.1. Suivi et interaction des paramètres pH, O2 et D.O cellulaire.

Dès la première heure, le pH initial de 8.5 augmente à 8.9 pour se stabiliser autour de
8.6 quasiment jusqu’à la fin de la production. Ces variations avaient été constatées aussi lors
des cultures en Erlenmeyers.

L'accroissement du pH durant la première heure de culture est attribué à l’hydrolyse de

l’urée, ce qui correspond à une production de 1.4 g/l de NH4+ (pKa (NH4+/NH3) = 9.2.). Il
s’ensuit un maintien du pH durant près de 15 heures, suivi d’une première diminution, puis
d’une seconde diminution 5 heures plus tard, au moment de la ré-oxygénation. Ce phénomène
d’affaiblissement stratifié du pH après l’arrêt de l’aération est attribué à deux événements
physiologiques. Le premier phénomène concerne l’assimilation des ions ammonium qui
conduit à diminuer l’effet tampon du milieu. Il souligne, de manière indirecte, la faible
activité métabolique consécutive à l’arrêt du bullage. Le second phénomène, correspond à une
production plus importante de déchets de type acides organiques en relation avec le stress dû
à la carence en oxygène.

125
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

Lorsque l’interruption de l’aération se produit, le taux de saturation décroit de 80 % à

≈ 2 % c'est-à-dire, de 3.7 mg/l d’O2 à autour de 0.1 mg/l. Il s’y maintient durant les 11 heures
suivantes. Manifestement l’agitation dans le bio-réacteur a un impact très faible sur
l’oxygénation du milieu de culture. Celle-ci est assurée à peut-être plus de 90 % par
l’insufflation d’air. Cette consommation d’oxygène est estimée lors de l’arrêt du bullage à
0.78 mg/l/heure d’oxygène pour une biomasse ayant une D.O cellulaire de 0.5 et se trouvant
en début de phase exponentielle de croissance. L’accélération de la croissance est suggérée
par l’augmentation de la consommation en oxygène jusqu'à 9 heures de batch. La croissance
se ralentit puis vraisemblablement s’arrête pendant les 11 heures sans bullage. La D.O
cellulaire s’est accrue pendant cette période de 1.2 unité, soit un taux moyen de croissance de
0.111-h, sans que l’on puisse savoir quand cela s’est produit ce phénomène.

Lorsque le bullage est restauré à la 20ième heure il se produit d’abord un pic du taux de
saturation d’oxygénation (50 %), suivi d’une diminution qui dure environ 2 h 30 et qui reflète
l’accroissement de l’activité métabolique. Le profil de l’O2 se stabilise ensuite pendant 8
heures jusqu’à la seconde coupure d’aération.

La croissance cellulaire durant cet épisode est faible avec un taux moyen de croissance
0.115 h-1 (Tg = 6 heures). Ce taux est caractéristique d’une phase de ralentissement ou d’une
croissance menée en conditions limitantes, ce qui est le cas ici. Elle s’accompagne d’une
consommation de 0.59 mg 02/l/h, pour se stabiliser autour de 0.1 mg/l/h sous aération pendant
les 8 heures suivantes. Or c’est durant ce début de phase de ralentissement de la croissance
que se concentre la production d’activité enzymatique (68 µS/cm /min/heure). Une
augmentation d’un facteur de 2.5 pour l’A.E.T. et d’un facteur de 1.33 pour l’A.E.S est
enregistrée depuis le début du bullage (H = 20). Cette période de forte production d’enzyme
est fortement liée à la production de biomasse. En effet la courbe des A.E en fonction de la
D.O cellulaire d’équation y = 0.0021x + 0.5886 possède un coefficient de dispersion élevé (R2
= 0.9328) ce qui pourrait suggérer une synthèse orientée de type constitutive. Ceci est visible
durant le profil très haché du taux de saturation en oxygène.

Cependant, le particularisme des conditions expérimentales doit être pris en compte.

En effet, la présence de bactéries métaboliquement actives se visualise par le profil tailladé,
du taux de saturation en oxygène. Ces hachures résultent peut-être du passage cyclique de la
biomasse par parquet plus ou moins dense au niveau de la sonde à oxygène, mais surtout de la
rythmicité des divisions cellulaires et donc de la consommation en oxygène. Ceci n’apparaît
que faiblement en début de culture du fait de la plus faible concentration cellulaire. La forte
amplitude de ces hachures disparaît, lorsque le niveau d’aération est augmenté ou lorsque la
population bactérienne entre en phase stationnaire ce que nous avons observé lors des
premiers essais.

Or, ce style de profil du taux de saturation en O2, haché, où les amplitudes évoluent
entre 3 % et 25 % plusieurs fois par minute, avait été également observé à l’aide d’une sonde
à oxygène dans 6 essais de production de biomasse en Erlenmeyer, placés sous agitation
(Tableau n°50). A T24 heures, la sonde est maintenue pendant quelques minutes dans
l’Erlenmeyer et les variations sont concrétisées dans le tableau en donnant la valeur maximale
(O2 maximale) et la valeur minimale (O2 minimale).

126
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

Tableau n°50 : Les teneurs en oxygène dans six milieux de culture en Erlenmeyer, mesurées
au bout de 24 heures d’incubation.

Numéro de D.O 02 % 02 %
Conductivité
la culture cellulaire maximale minimale
1 2.29 8.6 / 3.10
2 2.23 8.3 36 2.10
3 2.01 8.27 36 2.00
4 2.3 8.31 21 1.60
5 2.43 8.31 14 1.60
6 2.56 8.4 10.4 1.60

Les oscillations du taux de saturation vont de 36 % à 1,6 % ce qui pourrait traduire le

passage alternatif au contact de la sonde d’eaux plus ou moins oxygénées. Ainsi, même pour
de petits volumes de culture, la concentration en oxygène n’est pas homogène. Malgré cela,
les activités enzymatiques obtenues dans ces conditions étaient bonnes, montrant ainsi que ces
variations de courte durée ne semblent pas nuire à la production d’uréase.

2.2. Interactions des paramètres biologiques et physico-chimiques.

La production d’ion ammonium semble fluctuante entre 20 et 30 heures, c’est-à-dire

pendant la période, où l’apport d’O2 reprend. Néanmoins, elle ne représente en moyenne
qu’environ 90 % de l’ammonium pouvant être produit à partir des 2.4 g/l d’urée présente
dans la composition du milieu de culture. Cet ammonium peut également provenir de la
dégradation de la matière organique. Il n’est pas non plus exclu qu’une partie d’ammoniaque
ait été dégazé. En effet, les conditions de culture, 30° C avec bullage et un pH de 9.2, sont
susceptibles de le faciliter au cours des 20 heures d’incubation. En cas de lyse cellulaire, le
cytoplasme des bactéries qui est riche en ions ammonium se déverse dans le milieu de culture.
Cet apport qui est minime, ne peut être responsable de l’accroissement de la concentration en
ammonium de 30 % entre 20 et 30 heures.

Malgré le particularisme de S. pasteurii qui peut utiliser l’ammonium, à la fois comme

une source d’énergie et comme une source d’azote, il s’avère que la source d’azote de la
souche pendant cette période n’est pas l’ammoniaque. Si l’ammonium est peu assimilé alors
d’autres sources d’ azote sont disponibles et exploitées de manière préférentielle, c’est
notamment le cas des acides aminés. Or, la composition des milieux de culture à partir
d’extrait de levure est riche en acides aminés, et tout particulièrement en glutamate.

L’augmentation de la concentration en NH4+ constatée entre 20 et 30 heures

d’incubation n’est pas à confondre avec la seconde augmentation qui survient à 32 heures au
moment de l’arrêt du bullage (seconde série de flèches rouges). En effet, elle est dûe au retour
des conditions anoxiques qui provoquent la libération des ions NH4+ mobilisés pour la
production d’énergie chimique. Ceci est conforté par la diminution du pH qui rend compte
d’une manière indirecte, via la production de déchets du métabolisme, du stress anoxique. En
suivant cette logique, la diminution du pH, de faible amplitude et de très courte durée, lors de
la remise en route de l’aération à 43 h, confirme la réactivation du milieu. Cette chute est
immédiate, car la D.O cellulaire est deux fois plus élevée par rapport à la première reprise de
l’aération qui s’était produite à 20 h.

127
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

2.3. Bilan des interactions sur la synthèse de l’uréase.

L’uréase semble finement régulée, selon Mörsdorf et Kaltwasser (1989), à l’entrée de

l’ammonium dans le métabolisme. Chez S. pasteurii cet accès est restreint car ce micro-
organisme ne possède pas d’enzyme GS et GOGAT, mais se fait via la glutamate
déshydrogénase (NAD-GDH EC 1.41.3) (Jahns, 1992). Cette enzyme possède les deux
fonctionnalités que l’on retrouve auprès des deux autres iso formes (NAD-GDH E.C [Link] ;
NADP-GDH E.C [Link]). La NAD-GDH est active en milieu riche, lorsque celui-ci est à
forte teneur en glutamate. Cette enzyme produit une désamination pour libérer de
l’ammonium et de l’oxoglutarate. Les éléments obtenus (oxoacides, glutamate et ammonium)
sont les points de départ des composants azotés de la cellule dont les nouveaux acides aminés.
Ceci s’opère grâce à la forme NADP-GDH, qui s’active lorsque la teneur en acide aminé
diminue, notamment en acide glutamique, favorisant l’intégration de l’ion ammonium. Les
couples NADN/ADH + H+ et NADP/NADPH + H+ sont des molécules donneuses d’électrons.
Elles représentent une partie du potentiel électro-énergétique de la cellule. Ces deux enzymes
ont toutes les deux une faible affinité pour l’ion ammonium (Km ≈ 50 mM). Cette double
fonction est opérée par la NAD-GDH chez S. pasteurii. Ce procédé de synthèse d’acides
aminés à partir du glutamate est moins coûteux pour la cellule que celui de synthétiser des
acides aminés directement à partir d’ions ammonium. Ainsi, lorsque la cellule présente un
excès d’énergie chimique avec une diminution de la concentration en glutamate et en autres
acides aminés dans le milieu de culture, la synthèse des acides aminés se fait à partir des ions
NH4+, c’est la cas en fin de phase exponentielle. Cependant, la nécessité de la cellule à
maintenir un niveau d’énergie chimique suffisant (en ATP), oblige le maintien d’une certaine
concentration d’ammonium. Si cette dernière est suffisante alors, de brusques synthèses
d’uréase seraient trop coûteuses en énergie et correspondraient à un non sens évolutif. La
synthèse de l’uréase est donc finement régulée. Dans le cas, de cet essai en bio réacteur, la
synthèse est constitutive, il n’a pas eu d’emballement par manque de ressource nutritive et
ceci est très probablement dû aux arrêts de l’aération qui ont freiné la croissance bactérienne.

3. Suivi d’une production de biomasse et de son stockage en vue d’un

approvisionnement sur un chantier.

Pour évaluer l’effet d’un stockage à 4° C et sa réactivation avant l’injection, on a

réalisé un essai de production de biomasse. Pour cela, un bio réacteur a été suivi durant près
de 100 heures, séquencé en trois périodes. Une première période de 0 à 25 heures, correspond
à la production de la biomasse à 30° C, et est suivie d’une phase d’une durée de 60 heures, qui
comprend le refroidissement et le stockage à 4° C. Enfin, suit une phase de réactivation qui se
caractérise par la restauration des conditions initiales de culture, précédant l’injection en
colonne (Figure n°34).

128
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

Figure n°34 : Suivi

d’une culture de
biomasse, avec
impact d’un
refroidissement à 4°
C et de la
réactivation (entre
les flèches rouges :
arrêt du bullage, la
flèche bleue
correspond à la
baisse de la
température).

La première partie de l’expérience, de 0 à 25 heures, est marquée comme

précédemment par une hydrolyse de l’urée entre 0 et 1 heure, ce qui produit l’élévation du pH
de 8.5 à 9.2. Une seconde élévation du pH de 0.2 unité apparaît au début de phase
exponentielle, alors que survient malencontreusement l’arrêt du bullage (Flèche rouge). Celui-
ci entraine, comme précédemment, l’arrêt de la croissance exponentielle qui est une phase
grande consommatrice d’oxygène. Une démobilisation des ions ammonium utilisés comme
source d’énergie et d’azote survient provoquant avec les ions carbonates cette légère
augmentation du pH. Ces ions sont de nouveau mobilisés par les cellules, lorsque le bullage
est restauré à 17 heures. Il s’ensuit une légère baisse de pH pour atteindre la valeur initiale en
début de phase exponentielle. L’action du bullage de 17 h à 25 h relance, comme dans
l’expérience précédente, une phase de croissance exponentielle puis de ralentissement (µ =
0.072 h-1) (Figures n°33 et 34).

La seconde partie de l’expérience qui s’étend entre la 25ième et la 85ième heure,

correspond à un abaissement progressif de la température jusqu’à 4° C avec arrêt de
l’oxygénation. Elle conduit très rapidement à une augmentation du pH de 0.5 unité. Cette
baisse de température provoque un arrêt progressif du métabolisme visible. La courbe du taux
de saturation en O2 chute lentement en une quinzaine d’heures ce qui confirme le
ralentissement des activités métaboliques. Parallèlement, le pH diminue par paliers, dans les
mêmes proportions, approximativement toutes les 20 heures au cours de la période de
stockage à 4° C. Ceci correspond à une activité métabolique résiduelle. A la fin de cette
période, il est possible d’observer quelques amas denses de cellules. Des observations
similaires avaient été réalisées sur des milieux de culture, stockés pendant environ une
semaine dans les mêmes conditions (pas d’insufflation d’air et 4° C) (Figure n°35).

Figure n°35: Aspect de la biomasse en

Erlenmeyer après un séjour à 4° C.

Cette agrégation cellulaire est très probablement un moyen de protection thermo induit
lorsque la suspension bactérienne est suffisamment concentrée et placée à basse température

129
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

pendant un certain temps. Après la 85ième heure, l’aération est rétablie en même temps que la
température est remontée à 30° C. Une chute de pH de 0.3 unité survient. L’aération
provoque une croissance cellulaire deux fois plus élevée (µ = 0.03 h-1) avec un accroissement
d’un facteur de 2.5 de la production d’A.E (160 µS/cm/min) après deux heures d’aération. Au
delà, les premiers signes d’une phase stationnaire apparaissent. Ceci se visualise par une
diminution de la D.O cellulaire et de l’activité enzymatique.

L’effet du stockage de la biomasse à 4° C qui produit un effet stimulant sur la

production de l’enzyme, et sur la croissance cellulaire lors de la restauration des conditions de
culture a été observé dans d’autres expériences identiques à celle-ci (Figure n°36).

Figure n°36 : Suivi d’une

culture de biomasse, puis
effet de l’abaissement de
température et de la
restauration des conditions
initiales.

Si les conditions de chantier nécessitent le stockage à basse température (4° C) d’une

suspension bactérienne durant au moins 60 heures, les activités enzymatiques et la croissance
cellulaire sont susceptibles d’augmenter dès la réactivation des milieux. Ce gain semble varier
en fonction du moment au cours de la phase de ralentissement où survient la baisse de
température. Le milieu de culture contient suffisamment d’éléments nutritifs pour assurer une
légère croissance cellulaire ainsi qu’un accroissement des A.E. Cependant, ce phénomène
reste complexe et instable puisque une fois le maximum de production d’enzyme atteint, il
survient rapidement une disparition de l’activité enzymatique, dans ces conditions
expérimentales. Ceci suggère que le turn over de l’enzyme peut être extrêmement rapide. Par
conséquent, la phase de refroidissement doit être commencée bien avant que le maximum
d’activité enzymatique ne soit atteint, c'est-à-dire, lorsque les coefficients des courbes de
production et de croissance cellulaire diminuent. Par ailleurs, les expériences réalisées ici
portent sur des volumes somme toute réduits (quelques litres) pour lesquels les durées des
changements de température peuvent être réduites. Dans une application de chantiers, les
volumes s’estimeront en m3 et la gestion des températures sera plus difficile. Il est
vraisemblable que si des cultures doivent se faire sur le chantier elles seront soumises aux
conditions climatiques du lieu et non à 30° C. La durée des incubations sera alors adaptée et
déterminée par l’obtention de la DO et de l’AE souhaitées

4. Synthèse des résultats pour la production de biomasse et le maintien de

l’activité enzymatique.

Les premières estimations des volumes de biomasse nécessaires pour un chantier se

situent autour de 10 000 litres. Pour monter en volume, les premières cultures de production

130
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

de biomasse ensemencent les suivantes et la dernière culture est le volume final recherché
pour le chantier. Ainsi, avec un volume d’ensemencement de 1 %, il est nécessaire de réaliser
de 3 à 4 étapes dans le cas de culture en batch. Une autre solution consisterait à réaliser une
production d’enzyme en fed-batch. Mais, dans tous les cas, une parfaite maîtrise des
exigences de la souche pour une bonne production d’enzyme est nécessaire et ceci doit passer
par une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de l’activité enzymatique.
En effet, le temps d’hydrolyse, la concentration des solutions calcifiantes, le temps de
contact ou de séjour des bactéries dans le sous-sol ainsi que la qualité des effluents sont
directement dépendants des activités enzymatiques obtenues et, donc de ce qui peut être
maîtrisé en bio réacteur.
De nombreuses productions de biomasse (76) ont été réalisées, la description de
l’ensemble des résultats est présentée sous une forme statistique, plus légère qu’une longue
énumération. Ainsi, une première cartographie du maximum d’activité enzymatique en
fonction de la D.O cellulaire permet de souligner la très forte hétérogénéité de réponse des
niveaux d’A.E obtenus, ceci, tous milieux de culture confondus. Il y a tout d’abord, une
absence de relation entre la D.O et l’activité enzymatique maximale enregistrée entre chaque
milieu de culture. Si, la synthèse de l’enzyme avait été uniquement de type constitutif, il y
aurait eu une relation à peu près constante entre une valeur de D.O cellulaire et celle d’activité
enzymatique. Or d’après les premières observations, c’est plutôt un nuage de points dont
l’activité enzymatique maximale est autour de 500 µS/ml/min, et qui est située
majoritairement dans une gamme de D.O cellulaire entre 1 et 2.5. Par ailleurs, il apparaît
notamment que plus la D.O cellulaire est faible, plus les différences entres les activités
enzymatiques peuvent apparaître grandes, allant jusqu'à un facteur de 3. Ce nuage de points
est caractéristique d’une voie de synthèse de l’uréase régulée de manière complexe, à la fois
constitutive avec présence d’une A.E quel que soit le milieu de culture, mais également de
manière induite par la présence des fortes variations pour une même D.O cellulaire (Figure
n°37).

A.E max = 837.48 - 95.26 * D.O 2400

Corrélation: r = -.2240
40
2200

2000
20

1800 A.E max

Médiane
0 Points atypiques
1600
2500

1400
A.E max ( µS/min)

2000
1200

1000
1500
A.E max (µS/min)

800
1000
600

500 400

200
0
0

-500 -200
0 1 2 3 4 5 6 0 20 40 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
0.95 Int. Conf.
D.O. cellulaire D.O. cellulaire

Figure n°37 : Distribution des activités enzymatiques maximales en fonction de la D.O

cellulaire et représentation Bag plot de la tendance générale.

131
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

Par ailleurs, les valeurs de D.O cellulaires et les activités enzymatiques maximales ne
suivent pas une distribution normale (Figure n°38).

Droite de Henry : A.E max Droite de Henry : D.O

3 3

2 2

1 1
V. Normale Théorique

V. Normale Théorique
0 0

-1 -1

-2 -2

-3 -3
-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
Valeur Valeur

Figure n°38 : Les droites de Henry pour l’activité enzymatique à gauche et pour la D.O
cellulaire à droite.

Ces observations sont des éléments supplémentaires en faveur d’une production non
assujettie à une simple régulation constitutive. En effet, si la synthèse avait été constitutive,
alors, la teneur en uréase suivrait la loi normale qui se traduirait par l’alignement des points
sur la droite d’Henry. Or seule la D.O cellulaire semblerait suivre une distribution normale,
confirmée par le test Shapiro-Wilk (n = 50, P = 0.95, α = 0.05). Par contre, l’activité
enzymatique maximale ne suit pas une distribution normale, ceci est visible par un faible
alignement des points le long de la droite de Henry et est corroboré par le test Shapiro-Wilk
(n = 50 P = 0.89, α = 0.01). La distribution de la production d’enzyme reflète celle d’un
métabolite secondaire, c'est-à-dire, qu’une plus forte synthèse se réalise majoritairement en
phase de ralentissement. Cette induction est donc responsable de la forte variation des valeurs
d’activité enzymatique maximales (CV = 66 %) en fonction de la D.O cellulaire (CV = 37 %)
(Tableau n°51).

Tableau n°51 : Distribution statistique des valeurs d’activité enzymatique maximales et des
DO cellulaires obtenues dans 76 essais de production de biomasse.

Ecart- Coefficient
N Actifs Moyenne Médiane Minimum Maximum
type de variation
D.O 76 2.49 2.40 1.03 4.9 0.94 37.7
A.E 76 601.7 511 21. 2177. 397 66.

Ces variations entre la production d’activité enzymatique maximale et la croissance

cellulaire sont plus particulièrement visibles dans la phase de ralentissement (Figure n°39,
Tableau n°52). Cinq bio-réacteurs ont été particulièrement étudiés dans ce sens.

132
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

950 3.0
2.8
2.6
2.4
900 2.2
2.0
1.8
850 1.6
1.4
1.2
800
1.0

750 0.8

D.O. cellulaire
A.E (µS/cm/min)

0.6
700

650 0.4
D.O cell n°5
D.O cell n°6
Bio 5 D.O cell n°7
600
Bio n°6 D.O cell n°8
Bio n°7 D.O cell n°9
Bio n°8 0.2
550 Bio n°9

500

450
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Temps (h) Temps (h)

Figure n°39 : Suivi de la production d’activité enzymatique et de la croissance cellulaire

durant la phase de ralentissement.

Tableau n°52 : Résultats obtenus durant la phase de ralentissement.

Bio Bio Bio Bio Bio
Caractéristiques réacteur réacteur réacteur réacteur réacteur
n°5 n°6 n°7 n°8 n°9
Taux de croissance
0.091 0.057 0.004 0.002 0.083
(h-1)
Production d’activité
52 22 21 29 36.3
enzymatique (A.E/h)
Corrélation AE/DO 0.92 0.75 0.65 - 0.53 0.95
Coefficient de
0.85 0.56 0.43 0.28 0.91
dispersion R2

Cette régulation fait intervenir de nombreux paramètres tels que la température, le

niveau d’aération, la qualité nutritive du milieu, la présence des ions ammonium et l’histoire
de l’inoculum. Du point de vue éco physiologique, l’uréase permettant un accès à une source
d’azote dissimulée, ceci confère à S. pasteurii un avantage sélectif non négligeable, par
rapport à d’autres micro-organismes. Par ailleurs, la présence d’ammonium crée et maintient
un micro environnement alcalin, également sélectif pour la majorité des microorganismes du
sol. En effet, son métabolisme aérobie anaérobie facultatif, confine S. pasteurii dans les
premiers centimètres du sol. Par ailleurs, Mobley (1989) a proposé que l’uréase puisse avoir
un rôle potentiel supplémentaire de protéine de réserve. Par conséquent, ce qui peut
s’apparenter à une instabilité de la souche à produire cette l’enzyme est très probablement une
régulation fine qui s’active plus fortement lorsque les concentrations nutritives
s’appauvrissent. Pour confirmer cette hypothèse deux expériences ont été réalisées pour
évaluer le potentiel de régulation de la souche vis-à-vis de l’uréase.

La première a consisté à réaliser des repiquages successifs dans des milieux de culture
à partir d’un inoculum de départ et de mesurer après production de biomasse les AE obtenues
(Figure n°40).

133
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

2400
2200
2000
1800
A.E max (µS/cm/min)

1600
1400
1200
Figure n°40 : Les AE obtenues
1000
800
en fonction du nombre de
600 repiquages.
400
200
0
A.E Repiquage n°1 A.E Repiquage n°3 A.E Repiquage n°5
[Link] n°2 A.E Repiquage n°4

Après le deuxième repiquage, les productions l’enzyme sont meilleures. Aux

repiquages suivants, la production enzymatique décroit d’un facteur de 2 à 5 puis semble se
stabiliser. Cette chute de la production d’enzyme ne s’accompagne pas d’une diminution de la
production de biomasse. En effet, les repiquages successifs favorisent l’adaptation de S.
pasteurii à la composition du milieu de culture. Ainsi, la croissance cellulaire est plus rapide
ce qui se concrétise par des D.O cellulaires plus élevées (Figure n°41).

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6
Figure n°41 : Suivi de la D.O
D.O. cellulaire

2.4

2.2 cellulaire correspondant aux

2.0 activités enzymatiques maximales
1.8

1.6
au cours des repiquages
1.4
successifs.
1.2

1.0
[Link] Repiquage n°1 [Link] Repiquage n°3
[Link] Repiquage n°2 [Link] Repiquage n°4

Il existe une corrélation positive entre le nombre de repiquages et l’accroissement de

la D.O cellulaire qui s’accompagne d’une anti corrélation entre le nombre de repiquages et le
maintien des fortes activités enzymatiques.

Il y a une adaptation physiologique aux éléments nutritifs du milieu de culture. En

effet, la tendance semble montrer un doublement de la D.O cellulaire en l’espace de 3
repiquages successifs sur un milieu de culture identique. Cette adaptation est l’établissement
de voies métaboliques préférentielles à l’assimilation qui favorisent la croissance cellulaire.
Elle passe par l’activation de gènes responsables des transporteurs tels que les perméases et la
sur expression de certaines enzymes. C’est un processus complexe qui établit une hiérarchie
de la transcription des gènes pour optimiser la croissance. Les gènes régulés en premier lieu
concernent en général les perméase et les enzymes des voies métaboliques. Certaines voies en
fonction de la composition du milieu de culture apparaissent moins compétitives car plus
coûteuse en énergie. L’ensemble de cette adaptation ne change pas la synthèse rapide
d’uréase, durant la phase de ralentissement de la croissance. Les activités enzymatiques de
type uréase semblent meilleures lorsque l’adaptation est en cours de développement. Lorsque
cette dernière est optimisée, la régulation en azote est plus performante et le besoin en uréase
plus faible. Il y a donc deux niveaux de régulation. La première, dite intergénérationnelle, qui

134
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

porte l’ « histoire » de la bactérie, entraine les générations suivantes à se dupliquer plus

rapidement dans ces conditions. C’est un acquis à l’échelle d’une population, lié à une
transmission de type épi génétique. La seconde régulation qui est à l’échelle de la cellule,
confirme ou non ces acquis lors de la culture et est transmissible aux générations suivantes.
Chez les procaryotes, la transcription produit un seul ARNm (monocistronique). La régulation
peut se produire au niveau transcriptionnel, grâce à la présence de facteurs de transcription
favorable à ce type de régulation de gènes. En effet, ce n’est pas l’ADN nu qui sert de support
moléculaire à la machinerie de transcription, mais l’ADN associé à des protéines. De plus,
pour qu’il soit transmissible, ceci peut s’opérer par des méthylations de quelques bases ce qui
procure une nouvelle configuration de l’ADN. Celle-ci facilite ou pas l’accessibilité directe de
certains gènes pour une transcription plus efficace. Cette adaptation fait partie des processus
de régulation épigénétique. Cependant, sans qu’il y ait méthylation des acides nucléiques, la
synthèse du nouvel ADN d’une cellule en cours de division a également tout le temps de
s’associer à des facteurs de transcriptions. Ces derniers permettent l’activation ou la
répression des gènes de la nouvelle cellule en formation. Ceci, favorise son adaptation
immédiate à son nouvel environnement. Cette acclimatation au milieu de culture est d’une
grande importance économique, si de fortes activités enzymatiques sont recherchées pour le
procédé.

En effet, si plusieurs ensemencements successifs en milieu riche sont nécessaires pour

augmenter en volume la production de biomasse, alors, cette capacité adaptative de la souche
est problématique, car il ne s’agit pas dans le cas de S .pasteurii, de produire uniquement des
cellules, mais bien de synthétiser un maximum d’uréase pour diminuer les coûts. Une
alternative consisterait à établir une culture en semi-continu. Ceci consiste à maintenir les
meilleures conditions non pas de croissance mais de production d’enzyme en bio réacteur.
Pour cela, un essai de culture de 1.5 litre a été réalisé durant 24 heures pour accéder aux
conditions propices de production d’enzyme dans un premier temps. Puis, ce milieu a été
complété durant 24 heures par un ajout en petite quantité de milieu de culture, au débit de 1
ml/min. Le suivi de la D.O cellulaire et de l’activité enzymatique a été fait pendant 48 heures
(Figure n°42).

Figure n°42 : Suivi des activités

enzymatiques en bleu et de la D.O
cellulaire(en rouge) d’un bio
réacteur en condition de semi-
batch.

Cette production en bio réacteur en semi continu n’a pas permis d’obtenir des valeurs
élevées d’activités enzymatiques. Elles ont très fortement diminué, de près d’un facteur 22,
pour un taux de croissance de 0.06 h-1 sur 24 heures. Le maintien ou la production d’enzyme
durant une phase de ralentissement ne semble pas se développer dans ces conditions
expérimentales. Ceci n’est pas une situation favorable à la production d’enzyme. Un second

135
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

essai a été réalisé et confirme cette tendance, avec une D.O cellulaire finale de 2.23 et une
activité enzymatique de 34 µS/ml/min.
Ce phénomène confirme les résultats obtenus avec l’expérience des repiquages
successifs. Il peut s’expliquer par un enrichissement du milieu de culture, insuffisant pour
soutenir une vraie croissance dans un milieu de culture de forte densité cellulaire, mais
suffisant pour réprimer la synthèse de l’uréase. Cette répression est certainement favorisée par
la présence d’acides aminés majoritaires tels que l’alanine, l’acide aspartique et le glutamate.
Ce dernier favorise de nombreuses synthèses d’acides aminés et par conséquent restaure le
pool d’acides aminés intracellulaires. Ceci conduit à la répression de l’uréase car, ni la
synthèse ni le maintien du pool d’uréase ne se justifient. En effet, l’apport d’ammonium en
vue de son assimilation n’est plus nécessaire. Il s’agit d’une acclimatation des bactéries à leur
environnement. Dans cette hypothèse, la situation inverse doit en principe réactiver la
synthèse de l’uréase. Si cela est vrai, alors une carence forcée en nutriment, notamment en
azote suffirait, dans le cas d’une synthèse inductible de l’uréase.

Pour vérifier cette hypothèse, des essais de stress en milieu carencé ont été réalisés.
Pour cela, deux suspensions de biomasse ont été centrifugées deux fois. Entre chaque
centrifugation le surnageant a été éliminé et le culot remis en suspension avec de l’eau
physiologique. Ces échantillons ont été placés sous agitation à température ambiante (25° C)
durant 180 minutes. Des mesures de D.O et d’activité enzymatique ont été répétées toutes les
60 minutes sur des échantillons placés soit dans de l’eau physiologique (témoin) soit
additionnés d’une source de carbone (chicorée de 0.25 g/l) soit avec une source de carbone
faiblement azoté (Bacto Casitone, 0.25 g/l) (Figures n°43 et 44).

2.9

2.8

2.7

2.6

2.5
Figure n°43 : Suivi au cours du
D.O cellulaire

2.4
A.E Eau phyio 2
temps de l’effet d’un stress azoté
2.3 D.O Eau physio
D.O Eau phy bacto casitone sur la D.O cellulaire.
D.O Eau phyio 2
2.2

2.1

2.0

1.9
0 60 120 180

Temps (min)

136
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

850

800

750

700
Figure n°44 : Suivi au cours
A.E (µS/min)

650 du temps de l’effet d’un stress

600 azoté sur la production
550
d’uréase.
500
A.E Eau physio
A.E Eau phy bacto casitone
450 A.E Eau physio chicorée
A.E Eau phyio 2
400

350
0 60 120 180

Temps (min)
Ces essais de stimulation de la production d’uréase ne sont pas entachés d’une
croissance ou bien d’une lyse cellulaire (Figure n°43). Ainsi, aucune fuite d’enzyme au cours
de l’expérience n’a été enregistrée.

De plus, pour compléter cette expérience, un second test a consisté à suivre la teneur
en ions ammonium, dans un milieu de culture âgé de 24 heures appauvri artificiellement par
l’ajout d’eau physiologique Ainsi, trois essais d’appauvrissement nutritionnel du milieu ont
été réalisés en Erlenmeyer, sous agitation, à température ambiante (25° C) et suivis durant 6
heures (Figure n°45).

0.16

0.14

0.12

0.10 Figure n°45 : Suivi de la

NH4+ ( g/L)

0.08 Essai n°1

concentration en N ammoniacal
Essai n°2 au cours du temps dans 3 milieux
Essai n°3
0.06
dilués.
0.04

0.02

0.00
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Temps (min)

Les trois profils de suivi du NH4+ montrent une absorption concomitante de

l’ammonium entre 60 et 90 minutes. Cette absorption, représente une réduction de la
concentration d’un facteur de 10. Ce phénomène peut-être attribué à la modification du rôle
de l’ammonium dans la cellule. En effet, dans un premier temps, il est essentiellement destiné
à servir la machinerie énergétique. Par conséquent, il est donc accessible à la mesure dans ces
essais, puis, il y a épuisement des réserves nutritives, ce qui conduit à ce que l’ion ammonium
soit assimilé par les cellules, pour la synthèse d’acides aminés. Ceci provoque la forte
réduction de la concentration extracellulaire de cet ion en solution (≈ 1 mM). Ainsi,
l’hypothèse selon laquelle, la synthèse de l’uréase est dépendante de l’état de la réserve du

137
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

pool d’acides aminés se confirme. Par ailleurs, il y a une concordance entre le moment où
s’opère le développement de la synthèse de l’uréase chez les témoins (Figure n°43) et la forte
diminution de l’ammonium en milieu dilué. L’augmentation de l’activité enzymatique de type
uréase se produire lorsque les cellules sont placées en situation de carence azotée. Cet
accroissement est de l’ordre d’un facteur de 1.25 à 1.97 en 3 heures, avec un maintien des
D.O cellulaires et pas de fuite de l’enzyme hors de la cellule. Avec l’ajout de Bacto-casitone,
le comportement est un peu différent, il y a une très légère baisse de la D.O cellulaire de 2.14
à 1.96, qui apparait dès la première heure.
Cet essai de stress par carence nutritive conduit à deux profils d’accroissement des
A.E. Un premier profil de type exponentiel, celui des témoins, nécessite une période de
latence ou d’acclimatation avant l’activation de la synthèse. Un gain d’activité enzymatique
de 181 µS/ml/min par heure est atteint entre 2 et 3 heures. Le second profil de type
logarithmique, présente, par contre, un développement immédiat des activités enzymatiques
de 151 µS/ml/min par heure. Dans les deux situations, l’augmentation des activités
enzymatiques est possible. Ceci sous entend l’existence d’un pool de nickel intracellulaire. La
constitution de ce pool s’établit via la protéine de transport UreE, durant la phase de
croissance dans le milieu de culture. Ceci est en accord avec le modèle classique de la
synthèse de l’uréase chez S. pasteurii. Par ailleurs, cette synthèse n’est possible que s’il y a
suffisamment d’énergie chimique. Ceci semble être confirmé par des expériences
complémentaires. Elles ont montré que le doublement du temps de l’expérience provoque de
fortes diminutions des activités suivies d’une fuite de l’enzyme dans la suspension. Cela
signifie que le pool énergétique est devenu insuffisant au maintien des bonnes conditions
physiologiques. Les voies du catabolisme sont très probablement activées en vue de la
sporulation. C’est un métabolisme de sénescence qui succède à celui de l’induction de
l’activité enzymatique.
Ces expériences permettent de rendre compte d’une certaine inertie avant l’activation
de la synthèse de l’uréase. Ceci tend à corroborer l’hypothèse de la présence d’un pool
d’énergie chimique (ATP, NADP) et d’un pool d’acides aminés qui régulent la synthèse de
l’uréase. En effet, lorsque l’un ou bien les deux pools diminuent du fait du métabolisme
d’entretien, ceci enclenche la synthèse d’uréase. L’ensemble de ces informations conforte
l’hypothèse d’une double régulation ; l’une de type constitutive et la seconde de type induite.
L’induction est activée durant la phase de ralentissement, c'est-à-dire en période
d’appauvrissement du milieu ce qui conduit à l’épuisement de pool d’énergie et d’acide
aminés. Or, lorsqu’une source de sucre assimilable est fournie, autrement dit une source
d’énergie, la synthèse est activée immédiatement. Par ailleurs, l’apport d’une source de
carbone pauvre en azote, déséquilibre le rapport C/N en faveur du carbone, provoquant une
rapide et courte induction de la synthèse de l’uréase. Elle s’atténue 2 heures après, très
certainement à cause de l’épuisement du pool d’énergie. Sans apport de carbone, les cellules
doivent puiser dans leur réserve avant d’enclencher l’induction de la synthèse de l’uréase. De
plus, lorsqu’une source plus complète est additionnée, la réponse est tout aussi immédiate
mais plus courte. En effet la diminution de la production apparaît dès la première heure. Ceci
peut être attribué à une remise à niveau du pool d’acides aminés plus qu’à un épuisement du
pool d’énergie. En effet, la particularité du milieu Bacto Casitone, c’est sa faible teneur en
acides aminés comparativement à l’extrait de levure, sauf pour l’acide aspartique, l’acide
glutamique, l’isoleucine, la leucine et la lysine (Tableau n°53).

138
Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

Tableau n°53 : Teneurs en acides aminés majeurs dans la composition du Bacto-Casitone.

Composition du Acide Acide
Isoleucine Leucine Lysine
Bacto Casitone Aspartique Glutamique
(% Total) 5.5 16 5.9 7.9 5.9

Ces données semblent confirmer l’hypothèse d’une régulation induite par l’état du
pool d’acides aminés notamment celui des acides chaines branchés (BCAA) avec la leucine et
l’isoleucine. D’après Sonenshein (2007), les BCAA vont indirectement induire la synthèse de
l’uréase via un facteur de transcription appelé RelA. Ce dernier rentre en action lorsque
l’ARN polymérase est stoppée par le manque d’acides aminés. RelA va donc provoquer la
diminution du stock d’énergie (GTP), pour limiter la synthèse d’autres gènes, tout en
favorisant d’autres comme l’uréase. L’uréase permettrait de produire de l’ammonium qui sera
intégré via le 2 oxo–glutarate en glutamate ce qui aurait pour conséquence la restauration du
pool d’acides aminés. Pour vérifier cette hypothèse, de nouveaux essais de mise en carence de
suspension bactérienne ont été entrepris pour suivre l’absorption de l’ammonium. Ainsi, une
biomasse a été centrifugée deux fois selon le protocole identique au précédent. Le culot remis
en suspension à l’aide d’une solution physiologique est additionné d’une solution de
glutamate de sodium de façon à avoir une concentration finale de 0.2 g/l, ou d’une solution
d’arginine (0.2 g/l en final). Les tests se font en duplicata et sont maintenus sous agitation
durant 5 heures à 25° C (Figure n°46).

1.0

0.9

0.8
Figure n°46 : Suivi des teneurs
0.7
moyennes en N ammoniacal
NH4+ (g/L)

0.6
Moyenne ARG
après l’ajout de glutamate ou
0.5
Moyenne Glut
d’arginine dans une suspension
de S. pasteurii.
0.4

0.3

0.2
0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (min)
Ces deux métabolites sont des sources indirectes d’ammonium. Par conséquent, la
mesure de l’ammonium est une manière indirecte d’évaluer leur l’assimilation Il a été vérifié
au préalable sur galerie API, que ces deux acides aminés sont utilisés par S. pasteurii. La voie
métabolique de l’arginine nécessite sa dégradation pour libérer l’ornithine et l’urée. Cette urée
réclame la présence de l’uréase pour que la libération de l’ammonium puisse se réaliser. Le
glutamate est quant à lui dégradé par la GDH. Cette voie est rapide et nécessite moins
d’énergie que celle de l’arginine, car, dans ce cas, il y faut réaliser la synthèse de l’uréase
pour obtenir les ions NH4+. Cette étape supplémentaire expliquée le décalage dans le temps du
pic d’ammonium dans le cas d’arginine par rapport à celui du glutamate. Cette dépense
d’énergie supplémentaire conduit très probablement à un épuisement des cellules et à leur
lyse. Ceci se visualise par une stagnation de la concentration en ammonium après le pic. Par
contre, dans le cas du glutamate, l’assimilation du NH4+ est le signe d’un métabolisme plus
actif, ceci étant vraisemblablement lié à la réaction inverse par la NAD-GDH. Lorsque
l’arginine est additionnée dans un milieu de culture SBF incubé durant 24 heures à 20° C, elle
favorise la croissance cellulaire sans augmenter les activités enzymatiques spécifiques
(Tableau n°54).

139
 Chapitre IV. Amélioration de la production de biomasse.

Tableau n°54 : Suivi des activités enzymatiques au bout de 24 heures dans un

milieu SBF avec et sans arginine.

Milieu SBF SBF + Arginine

A.E (µS/ml/min) 222 300
D.O cellulaire 2 2.6
A.E.S
111 115
(µS/ml/min/D.O)

950
2.4
2.3
2.2
2.1 900

2.0

1.9
850
1.8
A.E (µS/min)
D.O. cellulaire

1.7 800

D.O cell n°40

1.6 D.O cell n°42 750
D.O cell n°26 Bio 40
Bio 42
Bio 26
1.5 700

650

1.4 600
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Temps (h) Temps (h)

Figure n°47 : Suivi de la croissance cellulaire (à gauche) et des activités enzymatiques (à

droite) au cours de la phase de ralentissement.

L’arginine étant une des meilleures sources d’azote, sa présence en excès dans le
milieu de culture déjà riche, ne favorise pas l’induction de l’uréase, mais au contraire,
maintient un faible niveau de transcription. Ceci renforce l’hypothèse de l’existence d’une
double régulation. D’autres voies de régulation ont été recherchées pour expliquer la brusque
chute des teneurs en N ammoniacal qui apparaît après le pic de production. En effet, la
synthèse de l’uréase peut très rapidement être induite durant la phase de ralentissement et est
souvent suivie d’une diminution très rapide des activités enzymatiques (Figure n°47).

Si la synthèse de l’uréase peut se dissocier en deux éléments de régulation, l’une

constitutive, apparaît essentiellement durant la phase exponentielle, lorsque les concentrations
en nutriments sont élevées, la seconde, de type inductible se réalise plus facilement pendant la
phase de ralentissement de croissance. Pourtant, une diminution du niveau des activités
enzymatiques s’opère très rapidement en fin de phase de ralentissement et ceci dans certains
cas en l’espace d’une heure ou deux. Cet arrêt rapide et brutal de la production d’enzyme
laisse entrevoir un événement supplémentaire dans la régulation. En effet, à la fin de cette
période, un début de lyse cellulaire peut apparaître, et peut être estimée à partir des valeurs
d’activités enzymatiques libres (A.E.L) (Figure n°48).

140
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

140

120 Figure n°48 :

100
Distribution des A.E.L en
A.E.L fonction de la D.O
80 Median
A.E.L (µS/min)

Outliers
cellulaire.
60

40

20

-20

-40
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

D.O. cellulaire

Les valeurs les plus élevées d’A.E.L sont situées dans une gamme où les D.O
cellulaires sont comprises entre 2 et 3 et où le maximum d’activité enzymatique (A.E) est
enregistré. La lyse cellulaire semble être une réalité durant la phase de ralentissement
notamment à la fin. Par ailleurs, une tendance à une diminution de la quantité d’enzyme libre
apparaît lorsque de la D.O cellulaire augmente. Ceci peut être attribué au turn-over de l’uréase
qui limite d’autant la libération dans le milieu de culture.

De manière générale, la lyse cellulaire peut contribuer indirectement, à la brusque

diminution du niveau des activités enzymatiques uréasiques, car elle libère l’ADN bactérien.
Or, les acides nucléiques et plus particulièrement l’adénine et la guanine qui composent
l’ADN peuvent également être une source d’azote lorsque la voie catabolique des purines est
activée par un facteur de transcription spécifique ubiquitaire, appelé PucR. Sa synthèse est
induite par la présence de purines mais également avec le facteur de transcription globale
appelé TnrA qui est un facteur actif en période d’affaiblissement des réserves en azote
(Fisher, 1999 ; Brandenburg et al., 2002). Il s’ensuit, une cascade de réactions dont les
produits finaux sont l’ammonium et des ions carbonates, obtenus par hydrolyse de l’urée.
L’arrivée donc massive d’ammonium par la voie catabolique peut être une explication à la
répression de la synthèse de l’uréase durant cette phase de culture. Cette hypothèse sous-
entend que S. pasteurii ait la capacité de dégrader l’ADN ou que celui-ci soit fortement
dénaturé sous l’effet des conditions environnementales telles que le pH alcalin,
l’oxygénation…

Cependant, dans l’hypothèse où une autre voie d’activation de la synthèse de l’uréase

serait due à la présence d’ADN de cellules lysées, la libération d’ammonium produirait une
rapide rétro inhibition de la synthèse de l’enzyme.

Pour élucider cette hypothèse, un ajout dans le milieu de culture, d’acide urique ou
d’allantoïne qui sont des produits intermédiaires de cette voie catabolique, permettrait
d’obtenir un profil de synthèse différent de celui du témoin. On pourrait s’attendre à un
démarrage plus rapide de la synthèse suivi d’un rapide ralentissement. Les ajouts d’acide
urique ou d’allantoïne ont été réalisés dans des milieux de culture au début de la phase de
ralentissement de la croissance. Cette expérience a été effectuée au laboratoire de
Microbiogéologie de l’Université d’Angers par S. Castanier et G Levrel. Elle regroupe quatre
flacons en verre de 5 l, contenant au départ le même milieu de culture de type SBF avec 2,4
g/l d’urée, et ensemencés de la même façon. La production de biomasse est faite avec
insufflation d’air par bullage et à température ambiante et suivie de façon à déterminer la

141
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

courbe de croissance et la production d’enzyme. Lorsque la phase de ralentissement apparait

vers la 17ième heure, les ajouts sont réalisés dans trois flacons. Le premier flacon ne reçoit rien
et sert de témoin. Les trois autres reçoivent soit de l’urée (1.25 mM = 0.075 g/l), soit de
l’allantoïne (1.6 mM = 0.25 g/l) soit de l’acide urique ([Link] = 0.2 g/l). Les différentes
concentrations ont été calculées de façon à fournir potentiellement la même teneur en azote
ammoniacal. Les mesures de D.O cellulaire et d’A.E réalisées au cours de la phase de
ralentissement, c'est-à-dire entre 17 et 24 heures sont portées dans la Figure n°49.

900

800 Figure n°49 : Suivi de

l’activité enzymatique
700
dans les milieux de
A.E(µS/cm/min)

culture additionnés de
600
A.E Témoin
différentes sources
A.E Témoin+urée
d’azote en fonction du
500
A.E Témoin+ Allantoine temps
400 A.E Témoin+A uréique

300

200
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44

Temps (h)

Les produits apportés n’ont aucune influence sur la production de biomasse. Les valeurs
maximales d’activité enzymatique obtenues en fin de phase de ralentissement ne sont pas
significativement différentes. Par ailleurs, la production d’enzyme est essentiellement
localisée au début de la phase de ralentissement et se maintient en position intracytoplasmique
jusqu’à la 42ième heure. Une très forte similitude dans le profil de production d’enzyme est
remarquée parmi les milieux testés à l’exception du milieu témoin. Par ailleurs, ces profils
d’accroissement d’activité sont très similaires à ceux obtenus lors d’essais sur le stress
nutritif. En effet, les milieux additionnés d’une source d’azote (urée, allantoïne et acide
urique) présentent des profils d’accroissement des A.E de type logarithmique dès la 17ième
heure. Par contre, chez le témoin, l’augmentation des activités montre un profil de type
exponentiel, après une période de latence de près de 5 heures, soit à partir de 22 heures et
durant 2 heures. Après 24 heures de croissance, la biomasse, dans les quatre flacons, va
rentrer en phase stationnaire et la synthèse d’enzyme s’arrêtera. Ceci a été clairement montré
par toutes les expériences menées précédemment, l’entrée en phase stationnaire se situant aux
alentours de la 26ème heure. Les valeurs d’activité enzymatique mesurées après 42 heures,
alors qu’aucun dosage n’a été fait depuis la 24ème heure, ne sont qu’indicatives. En effet, c’est
pendant cette période que la conservation de l’enzyme est la plus délicate. Seules les valeurs
mesurées à 24 heures sont très fiables (Tableau n°54). Le pH est resté stable entre 9,6 et 9,5
dans les quatre milieux entre 17 et 24 heures, ce qui indique que la concentration en ions
ammonium y est stable et suffisante.

La demande des cellules en azote apparaît lorsqu’il y a bien un appauvrissement du

milieu. Les coefficients directeurs des courbes des vitesses de production d’enzyme

142
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

suggèrent une induction de la synthèse de l’uréase par la présence d’urée. L’induction de

l’uréase sans ajout supplémentaire d’urée (témoin) conduit à un profil de milieu carencé avec
une très forte de production d’uréase par heure, soit 130 µS/ml/min/h entre 22 et 24 heures
contrairement aux milieux additionnés d’une autre source d’azote. Le milieu additionné en
urée produit moins vite de l’enzyme (3.5 µS/ml/min/h). Il en est de même avec l’ajout
d’allantoïne qui présente une vitesse de 10 µS/ml/min/h et de 48 µS/ml/min/h, pour l’acide
urique.

Tableau n°54 : Résultats du suivi de la production d’enzyme en fonction des apports

faits à la 17ième heure.

Ajout
Ajout Ajout
Paramètres Témoin d’acide Moyennes
d’urée d’allantoïne
urique
Vitesse de production
40.5
d’uréase entre 43 48 35 36
CV = 15 %
17 et 24 h (µS/ml/min /h)
3.05
D.O cellulaire à 42 h 3.2 3.3 3 2.7
CV = 7.5 %
pH à 42 heures 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5
613
A.E intracellulaire à 24 h 660 625 561 607
CV = 7 %
760
A.E intracellulaire à 48 h 795 797 780 693
CV = 6%

Cette chronologie peut être résumée ainsi, la phase de ralentissement reflète un

appauvrissement du pool d’acides aminés exogènes. Ces conditions sont propices à
l’induction de la synthèse de l’uréase par une source d’azote non directement métabolisable.
Cette induction se produit de manière préférentielle avec l’urée puis de manière concomitante
avec l’allantoïne et l’acide urique. Une fois le taux d’ammonium suffisant, la cellule restaure
son pool endogène d’acides aminés via la synthèse du glutamate.
Dans, le cas du témoin, il n’y a pas de source d’azote supplémentaire,
l’appauvrissement des pools exogène et endogène, produit une très forte induction, qui aboutit
à une augmentation des taux d’ammonium intracellulaires qui sont alors suffisants pour la
synthèse de nouveaux acides aminés. L’induction obtenue chez le témoin, est donc différente,
puisqu’elle provient d’un stress azoté. Il y a une levée complète de l’inhibition pendant une
courte durée, puisque très probablement l’urée contenue dans le milieu de culture se retrouve
totalement hydrolysée. Comme le montrent les autres essais, d’autres voies pour l’obtention
d’azote sont activées notamment celle du catabolisme des purines qui permet l’acquisition
d’une source d’azote alternative. Chose curieuse, le niveau d’activité enzymatique obtenue est
similaire quelle que soit la voie empruntée.

143
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

III. PROPOSITION D’UN MODELE DE REGULATION DE L’ACTIVITE

ENZYMATIQUE DE TYPE UREASE CHEZ S. pasteurii.

1. Détermination d’un modèle de régulation de l’uréase.

Un premier bilan concernant les conditions de production de l’uréase peut être établi.
En effet, elle est de type constitutif, lorsque la composition du milieu de culture est riche et
complet. Elle devient inductible, lors de l’appauvrissement de ce milieu, notamment en fin de
phase de ralentissement de la croissance. Ceci est accentué en présence d’une oxygénation
soutenue. Deux profils de production d’activité enzymatique, sont ainsi observés, l’un de type
logarithmique et le seconde de type exponentiel. L’obtention de l’un ou de l’autre des profils,
dépend du niveau et de la vitesse d’épuisement nutritif du milieu de culture. Par ailleurs,
lorsque la phase stationnaire de croissance est atteinte, il y a alors un arrêt total de la synthèse
et éventuellement une forte dégradation de la réserve en uréase. Ceci est très probablement dû
à l’activation des voies cataboliques telles que celles des purines qui peuvent libérer de
grandes quantités d’azote.

Ainsi, quatre états de composition de milieu de culture peuvent être décrits au cours de
la croissance cellulaire et ayant un rôle dans la production d’uréase. Ces quatre situations sont
représentées en associant deux niveaux à la teneur en carbone C (glucides, polysaccharides) et
à la teneur en azote (NH4+, acides aminés). Un niveau noté « + » lorsque le milieu de culture
renferme des teneurs en carbone et azote élevées et un niveau noté par « - », quand une des
deux sources vient à manquer. Cette même notation peut être utilisée pour déterminer le
niveau de production d’enzyme (Tableau n°55).

La synthèse de l’uréase chez S. pasteurii, se réalise à partir d’un opéron constitué de

gènes de structure (ureA, ureB, ureC) et de gènes accessoires (ureD, ureF, ureG), mais ne
possède pas le gène de régulation ureR de l’opéron. Par conséquent, la régulation se réalise à
l’aide d’un ou de plusieurs facteurs de transcription globale ou spécifique du métabolisme.
Ces facteurs peuvent être activateurs ou répresseurs. Ils se lient directement sur l’ADN au
niveau de séquences spécifiques ou bien indirectement par une interaction protéine - protéine.
Leur présence ou leur absence favorise ou pas l’affinité du facteur sigma (σ) de l’ARN
polymérase à l’ADN et donc la transcription des gènes de l’opéron uréase.

Tableau n°55 : Récapitulatif des conditions propices observées à la production d’enzyme en

fonction des conditions nutritives (+ = teneurs élevées, - = teneurs faibles)
((+) = synthèse constitutive, (++) = synthèse induite, (-)= inhibition).

Activité Profil de
enzymatique production
Stade de la croissance Teneur Teneur
du milieu de d’enzyme
cellulaire en C en N
culture
observée
Phase d’accélération et
+ + (+)
phase exponentielle
Début de phase de
+ - (+ +)
ralentissement

144
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Fin de la phase de
- - (+ +)
ralentissement

Phase stationnaire - + (-)

Pour élaborer un premier modèle de régulation de la synthèse de l’uréase chez S.

pasteurii au cours de la croissance cellulaire, un premier système est proposé à partir d’un
seul facteur. Dans le cas d’un modèle avec un facteur de transcription, plusieurs cas de figures
sont possibles. En effet, il est soit activateur, soit répresseur de la synthèse de l’uréase en
relation avec le pool intracytoplasmique de carbone et/ou celui d’azote (Tableau n°56). Le
pool de carbone correspond à la réserve en molécules que la bactérie utilise préférentiellement
pour édifier les squelettes carbonatés. Le pool d’azote est la source d’azote préférentielle
(NH4+, NO3-). Certains acides aminés sont utilisés préférentiellement comme source d’azote
bien qu’ils contiennent évidemment du carbone et qu’ils puissent être potentiellement une
source de C. Il s’agit du glutamate, la glutamine, l’arginine et ils rentrent donc dans le pool
azoté.

Tableau n°56 : Différentes combinaisons associant un facteur de transcription avec les pools
de carbone et d’azote, susceptibles d’intervenir dans la régulation de l’enzyme.

Facteur de
transcription de Pool de carbone Pool d’azote
l’uréase.
Facteur AC activateur Oui Non
Facteur AN activateur Non Oui
Facteur RC répresseur Oui Non
Facteur RN répresseur Non Oui

Lorsqu’il y a un seul facteur activateur lié à un pool, il s’active lorsque celui-ci est en
quantité suffisante dans la cellule. Par contre, dans le cas d’un répresseur, il entre en action,
lorsque le pool dont il est représentatif (C ou N) diminue en dessous d’un certain seuil
(Tableau n°57).

Tableau n°57 : Influence des différents facteurs de transcription sur le profil

de production d’uréase (+ = teneurs élevées, - = teneurs faibles)
((+) = synthèse constitutive, (++) = synthèse induite, (-)= inhibition)
(AC : activateur sur le C, AN : activateur sur l’N,
RC : répresseur sur le C, RN : répresseur sur l’N).

Activité
Teneur en C Teneur en N AC AN RC RN
enzymatique
+ + (+) actif actif
+ - (+ +) actif actif
- - (+ +) actif actif
- + (-) actif actif

145
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

La production d’uréase ne semble pas être régulée par un seul facteur de transcription
qu’il soit activateur ou répresseur du pool de C ou N. En effet, aucune des combinaisons
présentées ci-dessus ne présente le profil de production de l’uréase rencontré au cours des
différents essais de culture. Donc, un système plus complexe peut être envisagé, par une
action simultanée de deux facteurs de transcription sur une séquence consensus ou bien sur
deux séquences spécifiques à chaque facteur sur le même promoteur. La combinaison de deux
facteurs de transcription permet d’obtenir des réponses plus modulables du fait d’un plus
grand nombre de combinaisons (Tableau n°58).

Tableau n°58 : Combinaison des couples de facteurs de transcription pour la détermination

du profil de production d’enzyme (AC : activateur sur le C, AN : activateur sur l’N,
RC : Répresseur sur le C, RN : répresseur sur l’N).

Activateur Facteur
Répresseur AC Facteur AN
Facteur RC RC-AC RC-AN
Facteur RN RN-AC RN-AN

Les couples de facteurs activateurs ou répresseurs représentant un même pool ne

peuvent fonctionner (RC-AC ou RN-AN)). Seuls les autres couples RN-AC et RC-AN, sont
pris en compte, avec comme principe, que seul un double négatif bloquerait totalement la
synthèse de l’uréase (RC-RN) (Tableau n°59).

Tableau n°59 : Actions combinées des différents couples de facteurs de transcription sur le
profil de production d’uréase (+ = teneurs élevées, - = teneurs faibles)
((+) = synthèse constitutive, (++) = synthèse induite, (-)= inhibition)
(AC : activateur sur le C, AN : activateur sur l’N,
RC : répresseur sur le C, RN : répresseur sur l’N .

Teneur en Teneur en Activité

RN-AC RC-AN
C N enzymatique
+ + (+) Actif Actif
+ - (+ +) Très actif
- - (+ +) Actif Actif
- + (-) Très actif

Le couple de facteur de transcription RN-AC, permet un profil de production de

l’uréase similaire à ceux qui ont été observés. Ceci signifie que le profil d’activité de l’uréase
chez S. pasteurii peut être obtenu de manière acceptable en intégrant dans un modèle de
régulation, deux facteurs de transcription. L’un, répresseur, est assujetti au niveau d’azote
contenu dans la cellule. Son action de répression s’active lorsque les concentrations en azote
sont élevées. Le second facteur est un activateur, dont l’action est liée au pool de carbone
intracellulaire. Il autorise la bactérie à satisfaire ses besoins en azote par l’induction de
l’uréase.
Pour finaliser cette hypothèse chez S. pasteurii, il est possible d’étudier le système de
régulation de B. subtilis qui est, semble-t-il proche. Rappelons aussi que S. pasteurii a été
rangé taxonomiquement dans le même genre. Cette même configuration de régulation de
l’uréase existe également chez d’autres micro-organismes.

146
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

2. Le modèle de régulation de l’uréase chez Bacillus subtilis appliqué à S.

pasteurii.

Bacillus subtilis est un micro-organisme gram +. Il ne possède pas non plus de gène de
régulation (ureR) de l’opéron uréase. Ceci lui confère, une production d’uréase, en apparence
de type constitutive tout comme chez S. pasteurii. Chez B. subtilis, le système de régulation,
complexe, actionne la transcription des gènes de l’uréase lorsque le milieu est carencé en
azote. Par ailleurs, lorsqu’une série de repiquages en milieu riche est réalisée, une réduction
de la synthèse de l’uréase apparaît (Fisher, 1889). La répression et l’induction de ce gène se
réalise par l’intermédiaire deux facteurs de transcription, l’un répresseur (GlnR) le second
activateur (TnrA). Ces similitudes permettent de proposer un modèle de régulation de l’uréase
pour S. pasteurii se rapprochant de celui ci. Il y a cependant certaines différences (Tableau
n°60).
Tableau n°60 : Caractéristiques enzymatiques présentes chez S. pasteurii
et absente chez B. subtilis.

Enzymes Rôle Référence

L-Glutamine amidohydrolase Catabolise la glutamine en glutamate
Klein et al., 2002
glutaminase et NH4+ en présence de PO43-
NAD GDH et NADP GDH 2-Oxoglutarate + NH4+ <=> glutamate
Absence de glutamine Catabolise la glutamine en glutamate
Mörsdorf and
synthétase (GS) et NH4+
Kaltwasser, 1989
Absence de la glutamate +
2-Oxoglutarate + NH4 => glutamate
synthétase (GOGAT )
Glutamate dehydrogénase
2-Oxoglutarate + NH4+ <=> glutamate Jahns, 1992
NAD-GluDH ([Link])
Absence de transport actif
Importation de l’urée dans la cellule. Jahns et al., 1988
d’urée
+
Dissociation du couple NH4 /NH3
ATPase / NH4+ La libération de protons permet la Jahns, 1996
synthèse d’ATP.

Le système global de régulation chez B. subtilis prend en compte l’ensemble des

besoins de la cellule pour réguler la synthèse de l’uréase. En effet, en fonction de la
composition du milieu de culture et de l’état physiologique, trois protéines ou facteurs de
régulation globale, CcpA, CodY et TnrA interviennent activement dans le métabolisme (Wray
et al., 1996, 2001; Fisher, 1999 ; Deuscher et al, 2003). Ces facteurs sont capables de réguler
de nombreux gènes et opérons. Ces protéines régulatricees perçoivent l’état énergétique
global et l’état nutritif de la cellule grâce aux molécules GTP, NADP qui reflètent l’état
énergétique de la cellule et les BCAAs qui sont des acides aminés à chaines branchés pour
l’aspect nutritif (Sonenshein, 2004 , Levdikov et al., 2006 ). En effet, des acides aminés tels
que l’isoleucine, la leucine et la valine ont une importance cruciale puisqu’ils sont à
l’interface de nombreuses voies métaboliques indispensables pour les cellules. Par ailleurs, ils
ont une action sur TnrA et sur un autre facteur de transcription spécifique (GlnR). Les autres
acides aminés tels que l’aspartate, l’asparagine, l’alanine, l’arginine, l’histidine et la proline
entrent dans des voies de dégradation substrat dépendantes.

147
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Les 3 facteurs de régulation (CcpA, CodY et TnrA) ont chacun leur domaine d’action.
Le facteur de transcription CodY possède une action généraliste à la fois sur les gènes du
métabolisme carboné et azoté, sur les gènes codant pour les protéines des transporteurs et de
compétence. Il régule la voie de production du glutamate. C’est un facteur global mais aussi
local puisqu’il intervient directement sur la synthèse des BCAA (IlvB) par la présence de
GTP. En effet, ce facteur de transcription possède des affinités avec le GTP et les BCAA. Ces
dernières sont les principaux effecteurs. Quant à TnrA son action concerne les gènes du
métabolisme azoté notamment l’activation de la transcription. Lorsqu’une culture est réalisée
à partir d’une source nutritive riche et complexe telle que l’extrait de levure, autrement dit en
excès d’azote, la présence de glutamine séquestre le TnrA (Wray et al., 2001). La glutamine
est donc un effecteur de TnrA. Il intervient alors dans l’activation des voies de dégradation
des purines et dans l’activation de l’uréase (Fisher, 1999). Enfin, le facteur CcpA est
responsable de la répression catabolique, dont l’effecteur principal est le FBP. Il intervient
directement sur la régulation des acides aminés (IlvB), son action est antagoniste à celle de
CodY.
Ainsi, durant la phase de croissance cellulaire la bactérie développe facilement son
pool d’énergie chimique (GTP) et son pool d’azote (BCAA). Le facteur CodY n’active pas les
gènes du métabolisme azoté. En effet, les acides aminés représentent près de 70 % de la
source en ammonium de la cellule. La présence d’un pool élevé de BCAA indique des
niveaux également élevés de glutamate et de glutamine. Leur dégradation n’est donc pas utile
puisque leur présence signale l’abondance en ressources azotées. Leur voie de dégradation est
réprimée par la présence d’un facteur spécifique, GlnR, situé au niveau du promoteur de
l’opéron de la glutamate synthétase (glnRA). En condition d’excès de source azoté, GlnR
rentre en compétition avec TnrA pour réprimer la synthèse de l’uréase au niveau du
promoteur P3 de l’opéron uréase (Fisher,1999 ; Brandenburg et al., 2002). En effet, ce
phénomène de double régulation n’est possible qu’au niveau de promoteur de l’opéron uréase
par la présence deux double sites (GlnR/TnrA). Cette configuration permet une co-activation
ou une inhibition. Ce sont des séquences consensus reconnaissables par les deux protéines
GlnR et TnrA. Une séquence identique est également placée en amont (-35) de l’opéron de la
glutamine synthétase (glnRA).
La clé de la régulation de l’uréase réside dans le jeu d’équilibre au cours de la
croissance cellulaire de la teneur entre ces deux facteurs aux actions antagonistes. Ainsi,
lorsque les conditions sont favorables pour la croissance, le niveau du pool azoté est élevé, le
facteur de transcription TnrA est inhibé, par la présence en grande quantité de GlnR. Au fur à
mesure de la croissance cellulaire, il y a une diminution quantitative en acides aminés
exogènes. Leur assimilation étant hiérarchisée, il y a également une variation qualitativement
au sein du pool. Il y a préférentiellement une assimilation du glutamate, de l’aspartate, de la
serine et de l’alanine durant la phase exponentielle de croissance. Ensuite, durant la phase de
ralentissement, ce sont les acides aminés tels que l’arginine, la glycine et la proline qui sont
assimilés (Liebs et al., 1988). L’histidine, l’isoleucine, la thréonine et la valine ne sont pas
significativement assimilés avant la phase stationnaire. Le mécanisme qui prévient
l’assimilation des acides animés tels que l’histidine, l’isoleucine et la valine est dû à la
répression de CodY sur les opérons hut et bkd (Fisher et al., 1996 ; Wray et al.,1994).
Lorsque le milieu est épuisé, la transcription ne peut plus se réaliser au niveau du site A du
ribosome où l’ARNt attend vainement des acides aminés. Ce processus enclenche une
cascade de réactions qui provoque l’apparition via le facteur de transcription RelA, de
molécules ppGpp au profit de GTP. Cette dernière est un signal qui permet de diminuer
l’expression des gènes. Par ailleurs, la présence de RelA induit la synthèse de l’uréase à l’aide
de TnrA. En effet, la cellule doit synthétiser des acides aminés à tout prix. Une entrée d’azote
est donc nécessaire.

148
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

De plus, durant la phase de ralentissement, un autre facteur spécifique entre en action

(AbrB) pour stimuler la synthèse de TnrA . L’augmentation de la teneur en TnRA dans la
cellule et la diminution conjointement du facteur GlnR conduit à la mise en place d’un nouvel
équilibre en faveur de l’induction de la synthèse de l’opéron ure ABC chez B. subtilis. Ce
nouvel équilibre intervient principalement sur la GDH. En effet, durant cette phase de
croissance, la cellule a besoin de synthétiser de nouveaux acides aminés qui ne sont plus
présents ou aussi abondants dans le milieu de culture. Cette synthèse endogène d’acides
aminés nécessite de puiser dans les réserves c'est-à-dire dans le pool des oxacides
principalement constitué de 2-oxoglutarate, de glutamate, de glutamine et d’ions NH4+. Elle se
réalise par l’activation de l’enzyme GDH, dans le sens de la synthèse du glutamate à partir
d’une molécule de 2–cétoglutarate et d’une molécule d’ammonium. Or la glutamate est un
acide aminé clé, il participe à la synthèse de nombreux autres acides aminés (glutamine,
proline). L’activation de cette voie nécessite l’apport d’une plus grande quantité d’ions
ammoniums. Ceci est d’autant plus valable lorsque cet ion à une double fonction comme chez
S. pasteurii. Pour cela, une levée de l’inhibition apparaît lorsque la teneur en glutamine
intracellulaire diminue. Cet acide est un donneur par excellence de groupements amine. Cet
appauvrissement du milieu fait intervenir un second acteur, une protéine de régulation
spécifique RocR qui permet la conversion du glutamate en 2-oxoglutarate et donc de
nombreuses synthèses d’acides aminés. Or le gène rocG (GDH) est situé en amont de
l’opéron rocABC impliqué dans le métabolisme d’ornithine-proline. Le gène rocR est co-
régulé avec l’opéron rocABC par l’action commune de RocR et de l’ornithine. L’ornithine est
le produit de dégradation avec l’urée de l’arginine par l’arginase. L’ornithine peut former de
l’acide aspartique et de l’arginine via le cycle de l’urée. Ce cycle est en connexion étroite avec
le cycle des acides tricarboxyliques. Or l’acide aspartique se forme au dépend de l’acide
glutamique, lui-même formé à partir du 2-oxoglutarate. Autrement dit, il existe une
interconnexion entre le métabolisme carbonaté et le métabolisme azoté. Ceci signifie que
l’activation de la GDH vient en réponse à différents signaux en provenance du métabolisme
azoté mais également carboné.

En effet, en conditions d’excès, la glycolyse permet la synthèse de FBP qui à son tour
prévient la protéine régulatrice CcpA en réprimant l’action de RocR et donc de l’enzyme
GDH dans le sens de la formation de 2-oxoglutarate, pour éviter la conversion des AA en
glutamate et alternativement en source de carbone. En effet, dans cette situation, le pool
d’acides aminés est par ailleurs à son maximum, et celui de BCAA constitué des quatre acides
aminés, l’aspartate, la thréonine, la valine et l’isoleucine est également à son niveau le plus
haut. Dans ces conditions, ATP BCAAs et GTP renforcent l’action répressive de CodY qui
réprime l’enzyme GOGAT pour la formation du glutamate. Cette voie est en « stand by ».
Elle est réactivée lorsque les réserves nutritives du milieu diminuent. Il y a réduction des
pools et une levée d’inhibition qui conduit à une forte demande d’azote sous forme d’ions
ammonium, ce qui déclenche l’activation de l’uréase pour soutenir un métabolisme de
croissance cellulaire et de maintenance.

L’entrée de l’azote est donc nécessaire, un second système de régulation s’active via la
voie du catabolisme des purines (Adénine) qui après une cascade de réactions conduit à la
libération de l’urée. Cette voie stimule la synthèse de l’uréase par l’intermédiaire d’un facteur
de transcription spécifique PucR. Ce facteur spécifique est activé par la présence de TnrA au
niveau du site TnrA/glnR en amont du promoteur pucR en position +1. (Cruz-Ramos et
al.,1997 ; Schultz et al., 2001 ; Beier et al., 2002 ; Brandenburg et al.,2002). Or, l’abondance

149
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

en bases purines apparaît lors des premières lyses cellulaires qui conduisent à la libération de
l’ADN, c'est-à-dire durant la phase de ralentissement et la phase stationnaire.

Les principales différences identifiées entre S. pasteurii et B. subtilis sont au nombre

de trois. La première concerne l’absence d’enzyme GS et GOGOT chez S. pasteurii qui est
remplacé par la GDH ([Link]) qui possède une double fonction. La deuxième concerne,
l’absence de l’enzyme GS chez S. pasteurii (Mörsdorf and Kaltwasser, 1989). Ceci suggère
également l’absence de son opéron et par conséquent l’absence du facteur spécifique de
GLnR. Son remplacement a déjà été noté par le facteur transcription global CodY, comme
cela est le cas chez Streptococcus pneumoniae (Kloosterman et al., 2006). Le troisième
élément est la double fonction des ions ammonium chez S. pasteurii, qui sert à la fois comme
source d’azote et d’énergie. Ceci nécessite une plus grande concentration intracellulaire de cet
ion dans la cellule et logiquement nécessite une enzyme ayant une plus faible affinité avec
NH4+. Or c’est le cas pour la GDH avec un Km de 55.2 mM, c’est également pour cette raison
que cette bactérie nécessite au moins 40 mM d’ammonium pour sa croissance (Mörsdorf and
Kaltwasser, 1989). De plus, c’est l’isoforme GDH EC [Link] qui a été mise en évidence chez
S. pasteurii. Cette isoforme est capable de catalyser la réaction dans les deux sens et elle est
NAD dépendante (Jahns, 1992).

3. Proposition d’un système de régulation de l’uréase chez S. pasteurii.

En adaptant les particularités physiologiques de S. pasteurii au modèle de régulation

de Bacillus subtilis, une séquence des événements peut être proposée, avec comme ligne de
base, le profil de la croissance cellulaire et le profil de la production d’enzyme (Figures n°50
à 53).

150
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

Hiérarchisation de l’assimilation des acides

aminés
N
D.O cellulaire A.E%
100%

Valine, histidine, isoleucine, thréonine Désamination oxydative

NH4+
Oxo glutarate

NADH+H+ Acide aminé

GDH

Asparagine/serine/Arginine, proline
NAD glutamate Céto acide

H2O
Amination réductrice

Glutamate, aspartate, serine alanine

N
Temps (h)

Voie principale assimilative de l’ammonium chez S. pasteurii

Culture de S. pasteurii
D.O cell A.E [NH4+ pH
]
100%
Voie de la production
d’énergie chez S.
pasteurii

Temps (h)

Figure n°50 : Hiérarchisation ATPase

activité
pH =8.4
NH4+/urée
de l’assimilation des acides NH4+ H+ + NH3 U/mg prot
pH =7.6
H+ H+H+
aminés et la double fonction des ADP +Pi
H+ H+H+
H+H+
∆pH
Absence NH4+

ions NH4+ chez S. pasteurii. H+H+

ATP
pH

NH3
NH4+
ATPase

∆p
NH4+ H+ + NH3

NH4+ H+ + NH3

Figure n°50 : Hiérarchisation de l’assimilation des acides aminés et la double fonction des ions NH4+ chez S. pasteurii

151
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

PucR A.E 100 % Synthèse réprimée

D.O
cell TnrA
Sigma ?

GlnR/TnrA GlnR/TnrA

-35 -10
Synthèse de type Inductible

Temps (h)
Facteur de Transcription
Sigma A
X (CodY)?

GlnR/TnA GlnR/TnA
Synthèse de type constitutive
-35 -10

Sigma A
Uréase

GlnR/Tnr GlnR/Tnr
A A
Uréase
-35 -10
OPERON Uréase
Ure A Ure B Ure C Ure E Ure F UreG
Promoteur
Gènes de structure Gènes accessoires

Figure n°51 : Proposition d’un modèle de régulation de l’opéron uréase chez S. pasteurii.

152
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

AA% D.O % A.E

100 %

Source
Excès AA Carence alternative
AA N

Temps
Appauvrissement nutritif

Asparagin
e
Thréonine
NAD-GDH
CcpA Cystéine

glucide Histidine
Oxo Glutamate Synthèse
glutarate acide Tryptopha
FBP amines ne
Pyruvate
Lysine
TF X Arginine
Citrate
Aspartate Glutamine
Iso CodY
CK citrate méthionine
X
2-Oxo-
glutarate ATP-GTP BCAAs Ure A Ure B Ure C Ure E Ure F UreG
Voie alternative d’accès à une source d’azote

Figure n°52 : Fonctionnement du modèle de régulation de l’opéron uréase chez S. pasteurii, proposé, durant la phase exponentielle de
croissance.

153
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

AA% D.O % A.E

100 %

Source
Excès AA Carence alternative
AA N

Temps
Appauvrissement nutritif
Pool
endogène
Ornithine
RocR Asparagine
Thréonine
NH4+ Cystéine
NAD-GDH Histidine
Tryptophane
glucide
Oxo glutarate Glutamate Lysine
Arginine
FBP
Glutamine
Pyruvate
méthionine
ATP-GTP
AbrB TnrA
Citrate TnrA PucR
+ RelA proline
Aspartate
Iso BCAAs
CK citrate

2-Oxo-
glutarate CcpA CodY GlnR Ure A Ure B Ure C Ure E Ure F UreG
Voie alternative d’accès à une source d’ azote

Figure n°53 : Fonctionnement du modèle de régulation de l’opéron uréase chez S. pasteurii, proposé, durant la phase de ralentissement.

154
Chapitre IV- Amélioration de la production de biomasse

4. Prise en compte de la régulation de l’uréase pour une production industrielle.

Pour maintenir une forte production d’uréase tout au long des ensemencements
successifs, et en tenant compte des informations fournies par le modèle proposé, une nouvelle
expérience a été montée en continuant le protocole décrit dans le paragraphe 4 de ce chapitre.
Les biomasses ayant subi deux sortes de stress azoté (passage dans l’eau physiologique, ajout de
Bacto Casitone), ont servi à ensemencer deux Erlenmeyers contenant un milieu SBF-Chic-Vit,
incubés pendant 24 h à température ambiante, sous agitation. L’activité enzymatique a été
mesurée sur l’inoculum et après 24 h de croissance (Tableau n°61).

Tableau n°61 : Variation à 24 heures des A.E après ensemencement en milieu de culture SBF-
Chic-Vit avec une suspension ayant subi au préalable un stress azoté.

A.E initiale
A.E
de
Essais (SBF Chic Vit)
l’inoculum
(µS/ml/min)
(µS/ml/min)
Bacto Casitone 775 743
Eau physiologique 814 840

Les valeurs d’A.E sont très voisines ce qui pourrait laisser supposer qu’un stress azoté
serait bénéfique pour le maintien d’AE élevées. Cependant dans cette expérience le suivi de la
croissance n’ayant pas été fait, les mesures faites à 24 heures ne correspondent peut-être pas à
l’entrée en phase stationnaire. Le stress a pu ralentir la croissance dans les deux cas de figure et
« 24 heures » ; pourraient alors correspondre au début de la synthèse de l’enzyme. Ainsi, le stress
azoté serait encore plus bénéfique que les résultats le montrent. Cependant, si rien ne permet de
l’affirmer, l’ensemble des résultats précédents vont dans ce sens. C’est sur cette base qu’un
brevet a été déposé.

Ainsi, si entre chaque étape de réensemencement dans le cadre des augmentations de

volumes, un stress azoté était réalisé, il permettrait de stabiliser le rendement enzymatique.
Malgré cela, il semble difficile d’intégrer cette étape dans le procédé de production de biomasse
sans en augmenter le coût. Ceci sera d’autant plus vrai que les productions se feront sur le
chantier et dans de très gros volumes.

155
Chapitre V. Les premiers essais.

CHAPITRE V

LES PREMIERS ESSAIS DE BIO CALCIFICATION EN COLONNES.

I. LES PREMIERS ESSAIS DE CALCIFICATION BACTERIENNE

EN COLONNES. 157

1. La première série. 158

2. La deuxième série. 161
3. La troisième série. 164
4. Conclusion. 165

II. IMPACT DE LA SOLUTION CALCIFIANTE SUR LA SUSPENSION

DE BIOMASSE. 167

III. IMPACT DE LA FLOCULATION SUR L’HOMOGENEITE DE LA

BIOCALCIFICATION. 171

1. Introduction. 171
2. Protocole. 172
3. Résultats. 173
4. Conclusions. 177

IV. LES CINETIQUES ENZYMATIQUES DE L’UREASE ET LEURS

IMPLICATIONS DANS LE PROCESSUS DE BIOCALCIFICATION. 178

1. Introduction. 178
2. L’activité enzymatique de l’uréase pure « Jack Bean ». 178
3. L’activité enzymatique de l’uréase de S. pasteurii, en position intracellulaire. 182
4. Les cinétiques enzymatiques en présence de Ca(NO3)2. 183

V. DETERMINATION DU MAINTIEN DES ACTIVITES ENZYMATIQUES

ET DE L’ACCROCHE DES BACTERIES EN COLONNE. 192

VI. CONCLUSIONS SUR LES PREMIERS ESSAIS D’INJECTION. 195

VII. IMPACT DES PREMIERS ESSAIS SUR L’INDUSTRIALISATION DU

PROCEDE. 196

156
Chapitre V. Les premiers essais.

I. LES PREMIERS ESSAIS DE CALCIFICATION BACTERIENNE EN COLONNES.

Les premiers essais de bio calcification bactérienne en colonne étaient destinés à établir
une première carte des conditions favorables à la bio précipitation. Ainsi quatre conditions ont
été choisies pour leur importance dans le procédé. Le mode d’injection en continu et en semi
continu permet de tester deux gammes de vitesses réelles d’injection lors de la mise en place de
la solution calcifiante.
Une première vitesse d’injection, de 0.05 m/h, permet un temps de contact élevé de la
solution calcifiante dans la colonne et un front homogène d’avancement. Cette vitesse est
également destinée à favoriser les échanges ioniques entre les cellules et leur environnement, car
les perturbations hydrauliques y sont réduites. Ces mêmes conditions d’écoulement existent en
chantier dans les zones les plus périphériques entre les points d’injection et de pompage. La
comparaison avec des vitesses de chantier 4 fois plus élevées permettra de mieux appréhender
leur l’effet sur le processus de bio calcification. En effet, les vitesses de 0.2 m/h représentent les
vitesses des lignes d’écoulement les plus courtes entre le point d’entrée et le point de sortie des
effluents.
Deux concentrations en sel de calcium ont été utilisées 0.5 et 0.75 M pour ces premiers
essais. Ces valeurs sont de 2 à 3 fois inférieures aux concentrations inhibitrices pour l’activité
enzymatique (Whiffin, 2004) (Tableau n°62). Pour faciliter la comparaison des résultats, les
conditions de montage, le type de sable, ainsi que le nombre de volumes de pore de biomasse
injectée sont maintenus identiques (Tableau n°63). Le rendement du procédé est évalué par la
résistance maximale à la compression simple, la teneur en carbonate de calcium et le taux
d’hydrolyse de l’urée.

Tableau n°62 : Les paramètres impliqués dans l’élaboration d’un protocole

d’injection sur les colonnes de 20 cm.

Mode d’injection continu semi continu

Concentration de la
[Urée/CaCl2] = 0.5-0.75 M [Urée/CaCl2] = 0.5M
solution calcifiante
Vitesse réelle d’injection
5 cm/h 20 cm/h 20 cm/h
de la solution calcifiante
Réalisation de batch non oui

Tableau n°63 : Les paramètres maintenus constants lors des essais.

Nombre de Volumes Sels de

Type de sable Méthode de
de pore de biomasse calcium Température Pression
utilisé compactage
injectée utilisés
Pluviation et 1
Fontainebleau 1 CaCl2 20° C
tapotement atmosphère

157
Chapitre V. Les premiers essais.

1. La première série.

Une première série de colonnes en duplicata a été réalisée à partir d’une même suspension
de biomasse (D.O600 = 2) et d’activité enzymatique spécifique (A.E.S) de 0.5 mS/min/ml. La
mise en place de la biomasse se fait par l’injection d’un volume de pore (V.p) en condition
chantier (0.2 m/h). Cette injection a été immédiatement suivie par celle de la solution calcifiante
à 0.5 M de CaCl2, à une vitesse réelle de 0.05 m/h. Six volumes de pore (V.p) de solution
calcifiante, au total, ont été mis en place. Parallèlement, les deux autres colonnes (n°3 et n°4) ont
été injectées dans des conditions identiques, à l’exception des vitesses de chantier qui ont été
maintenues pour l’injection de la solution calcifiante (Tableau n°64).

Tableau n°64 : Les caractéristiques générales des colonnes de la série n°1 et leurs résultats.

Colonne Colonne Colonne Colonne

Caractéristiques
n°1 n°2 n°3 n°4
A.E (mS/min/ml) 1 0.53
D.O600 2 1.06
A.E.S (mS/min/D.O) 0.5 0.5
Mode d’injection Continu
Concentration de la
[Urée/CaCl2] = 0.5 M
solution calcifiante
V.p de solution
5 V.p
calcifiante
Vitesse réelle
d’injection de la 5 cm/h 20 cm/h
solution calcifiante
Réalisation de batch Non
Taille de l’échantillon
9 9 - -
consolidé (cm)
Résistance maximale
à la compression 0.68 0.14 - -
simple (MPa)
(- : non cimenté)

Les premières observations semblent indiquer une diminution de l’efficacité de la bio

calcification en conditions de chantier. En effet, seules les colonnes n°1 et n°2, injectées à vitesse
réduite, montrent des calcifications sur la moitié supérieure avec une très forte disparité de la
résistance à la compression, entre les duplicata, de près d’un facteur de 5. Par contre, dans les
colonnes n°3 et n°4, l’injection réalisée à la vitesse mise en jeu lors des chantiers semble
diminuer le rendement du processus de bio précipitation. En effet, aucune zone n’a été
suffisamment cimentée pour permettre des essais de compression.

Le résultat macroscopique de la bio calcification des colonnes injectées à 0.2 m/h est
montré dans la Figure n°54. La partie centrale de la colonne n’est pas consolidée, seule la zone
semi - périphérique proche du point d’injection montre une meilleure cimentation du sable. Ces
zones consolidées dévoilent une succession de rigoles disposées de manière concentrique,
orientées dans le sens de l’injection. Plusieurs hypothèses peuvent être proposées à partir de ces
observations macroscopiques quant aux effets de la vitesse.

158
Chapitre V. Les premiers essais.

Figure n°54 : Bio

calcification périphérique
d’une des deux colonnes
qui ont été injectées en
continu aux vitesses de
chantiers (photo n°1). La
seconde colonne a été
Photo n°1 Photo n°2 totalement détruite (photo
n°2)

En effet, si l’injection permet le dépôt de la biomasse de manière homogène dans la

colonne, alors la présence de sable non consolidé au centre de la colonne est peut-être dûe à
l’effet de la vitesse.
Dans ce cas, les écoulements seraient plus rapides dans la zone centrale que près des bords. Ainsi
cette zone serait, plus sujette au lessivage lors de l’injection du liquide calcifiant, les bactéries
seraient chassées. Par ailleurs, les effluents issus des colonnes injectées à faibles vitesses sont
translucides dans les bacs de réception alors que ceux de celles injectées en condition de chantier
se recouvrent de larges dépôts organo-calcaires.
D’autre part, l’effet des vitesses élevées pourrait favoriser la formation d’une nano-
couche d’eau autour des cellules, rendant plus difficiles les échanges entre les cellules et la
solution. Par voie de conséquence, l’un ou l’autre de ces phénomènes diminuerait la précipitation
du carbonate de calcium et donc la cimentation du sable dans cette zone.

Par contre, dans l’hypothèse où la biomasse ne serait pas répartie de façon homogène au
moment de l’injection mais se localiserait préférentiellement en périphérie, la localisation
centrifuge de la bio précipitation trouverait une explication (colonnes n°3 et 4).
Or, dans le cas des colonnes où la solution calcifiante a été injectée à faible vitesse, les zones
centrales situées en haut de la colonne sont par contre fortement consolidées. Ceci suggère que la
distribution de la biomasse se réalise de façon homogène au moins au niveau du point
d’injection.
Cependant, ces mêmes échantillons ne présentaient pas d’élancement de 2 en raison d’un
manque de sable cimenté dans la partie basale de colonne. Ces observations complémentaires
conduisent à privilégier la première hypothèse, c'est-à-dire une bio calcification liée aux zones de
dépôt bactérien elle lié à la vitesse d’injection..

Pour vérifier ces hypothèses, trois colonnes témoins ont été réalisées a posteriori. La
première colonne témoin (L = 30 cm et Ø=9cm), pour évaluer la distribution de la biomasse, a
été injectée uniquement avec celle-ci, puis mise immédiatement après à l’étuve à 104° C pendant
24 heures. Le but était d’oxyder la matière organique présente qui apparaîtra avec une teinte
brune. La seconde a été injectée dans des conditions identiques (5 cm/h) à celles de la série n°1,
pour estimer l’effet de la biomasse seule sur la résistance à la compression. La troisième colonne
a reçu la biomasse, puis 5 V.p de solution calcifiante injectée à la vitesse de chantier (20 cm/h)
mais en recirculation durant un temps équivalent à celui d’une injection à faible vitesse (20
heures).

159
Chapitre V. Les premiers essais.

30 cm
9 cm
6.3 cm

Point d’injection

o Photo n°1 Photo n°2

Figure n°55 : Photo n°1 : Aspect macroscopique d’une colonne sans bactérie (en haut)
et d’une colonne injectée avec les bactéries (en bas) après la révélation
de la matière organique. Photo n°2 : Aspect macroscopique des dépôts
carbonatés d’une colonne injectée en continu en condition de chantier
avec recirculation de la solution calcifiante durant 24 heures.

La colonne injectée avec des bactéries et soumise au chauffage, présente une couleur
marron sur toute sa longueur et une teinte plus foncée du coté du point d’injection de la
suspension de culture (Figure n°55). Il faut cependant retenir que la biomasse est injectée
avec son milieu de production. C’est-à-dire enrichi en déchets organiques (solubles) issus du
métabolisme des bactéries, et en bactéries elles mêmes. Le chauffage agit de la même façon
sur les corps bactériens et sur la matière organique résiduelle. La migration de la matière
organique particulaire (bactéries) est très différente de celle de la matière organique soluble.
La coloration marron correspond donc soit aux bactéries soit à la matière organique soluble,
soit localement aux deux. Le témoin à 104° C sans bactérie injectée, garde sa couleur grise de
base (Photo n°1). L’observation importante est qu’il n’y a pas « d’effet de bord » de la
colonne, c’est à dire que les bactéries ne se sont pas déposées longitudinalement à la limite
entre le sable et le tube en PVC. Par contre un gradient de coloration du sable semble
apparaître entre le point d’injection et les 10 premiers centimètres. Ceci semblerait suggérer
un dépôt de biomasse plus important et par conséquent un effet filtrant du sable.

Le second témoin a permis de montrer un doublement de la résistance avec 0.034 MPa

contre 0.018 MPa par rapport à une colonne composée uniquement de sable de Fontainebleau
compacté. Ces valeurs servent de référence pour estimer l’état de progression du procédé.

Le troisième témoin a permis d’évaluer le rôle des vitesses de chantiers et le temps de

séjour sur le processus de bio précipitation. Il a montré une meilleure bio précipitation par
rapport aux colonnes ayant subit une vitesse de 20 cm/h de la série n°1. La bio consolidation,
notamment, s’est effectuée sur toute la longueur de la colonne mais y est restée concentrique,
et au niveau du point d’injection, où elle a atteint une profondeur de deux à trois centimètres
(Figure n°55).

Ces résultats confirment que le temps de séjour est important pour favoriser un
processus de bio précipitation. En effet, même la section proche du point d’injection est
consolidée. Cependant, les vitesses de chantier n’encouragent pas ce processus au centre de la
colonne car elles semblent entraîner un important effet de lessivage. De plus, la cimentation

160
Chapitre V. Les premiers essais.

du sable au niveau du point d’injection, est attribuée à la biomasse lessivée, qui en raison de
la recirculation des fluides, se retrouve au niveau du point d’injection de la colonne. Ce
phénomène semble confirmer ce qui a déjà été observé dans les bacs de réception de la série
n°1. Le potentiel enzymatique lessivé (bactéries) garde son pouvoir adhérent et calcifiant.

2. La deuxième série.

Pour limiter le lessivage de la biomasse par le passage du liquide calcifiant, tout en

maintenant un temps de séjour suffisant, une deuxième série de colonnes a été testée avec de
nouvelles conditions. Ainsi, pour prendre en compte ces effets, un batch (temps de pause) est
inséré entre chaque injection de V.p de solution calcifiante ce qui correspond à un mode
d’injection en semi continu. Le temps consacré à l’immobilisation du fluide calcifiant (batch)
encadre la durée d’une injection d’un volume de pore. Ces injections ont été réalisées dans
des colonnes de dimension deux fois plus grande pour s’assurer que les bio minéralisations
périphériques, observées précédemment (Figures n°54 et 55) n’étaient pas dues à des
courants préférentiels. Les nouvelles conditions d’injection de la deuxième série sont
regroupées dans le Tableau n°65.

Tableau n°65 : Les conditions d’injection de la série n°2.

Caractéristiques Colonne n°5 Colonne n°6

A.E (mS/min/ml) 0.65 0.79
D.O600 1.43 2.89
A.E.S (mS/min/D.O) 0.45 0.33
Mode d’injection Semi continu
Concentration de la
[Urée/CaCl2] = 0.5 M
solution calcifiante
V.p de solution calcifiante 5 V.p
Vitesse réelle d’injection de
20 cm/h
la solution calcifiante
Durée de batch (h) 8 6
Taille de haut 17 17
l’échantillon
(cm) bas 17 17
Résistance à la haut 0.071 0.196
compression
simple (MPa) bas 0.010 0.100

Cette deuxième série de colonnes est injectée en condition de chantier soit, avec une
vitesse de 20 cm/h et avec 5 V.p de solution calcifiante. Les durées de batch sont de 6 ou 8
heures.

Ces premiers essais d’injection ont abouti à des résistances à la compression simple
faibles avec un gradient décroissant entre le point d’injection (haut de la colonne) et la partie
basse. L’intégration d’une étape d’immobilisation des fluides pendant une durée équivalente à
la durée d’une injection à faible vitesse (5 cm/h) améliore les résistances à la compression par
rapport à une injection à la même vitesse mais en continu. De plus, ces premiers résultats
semblent montrer que, plus la suspension de biomasse est concentrée (D.O.600 élevée)
meilleure est la distance de consolidation.

161
Chapitre V. Les premiers essais.

Par rapport à la colonne n°5, la n°6 présente une résistance à la compression simple
plus élevée d’un facteur 2 sur le tronçon supérieur et d’un facteur 10 sur la partie basale. Cet
effet est cependant associé avec une A.E.S près de 30 % plus faible que son duplicata. Les
A.E. sont cependant comparables (0.65 – 0.79). Mais, ces résistances apparaissent peu élevées
par rapport au témoin (0.034 MPa). Elles ne reflètent pas la réalité, car, les courbes de
résistance/déplacement sont de rupture. La compression simple a provoqué des tassements des
sections inférieures des échantillons. Ceci est dû à la faible consolidation de la partie du
tronçon la plus éloignée du point d’injection.

L’observation macroscopique montre qu’il y a de véritables morceaux de sable

consolidés (Figure n°56). Ils présentent des d’arrêtes tranchantes qui se délitent dans le sens
de la longueur. La faible résistance est due au tassement du sable dans la section inférieur de
l’échantillon, encerclé en rouge.

10 cm

Figure n°56 : Partie supérieure d’une colonne dont l’écrasement a ouvert l’échantillon en
libérant des blocs de sable consolidés.

L’injection d’une suspension bactérienne deux fois plus concentrée dans la colonne
n°6 pourrait expliquer la présence de portions de sable cimenté et aisément indentifiables dans
la partie basale de la colonne, que l’on ne retrouve pas dans la colonne n°5, où la précipitation
s’est majoritairement produite dans le haut de la colonne.
La mise en place d’un temps de batch favorise le processus de bio calcification. Mais
une bio calcification plus intense en début de colonne tend à suggérer que le processus de
précipitation est spatialement lié à la distribution de biomasse.

Avant d’engager une troisième série d’expériences, un test à l’aide de bleu de

méthylène a été réalisé pour tenter d’évaluer les effets de bords sur des petites colonnes de 20
cm de hauteur et de 6.3 cm de diamètre. La coloration bleue se dépose sur les grains de sable
au niveau de l’écoulement. Ce test à permis de montrer que les effets de bords peuvent être
limités par l’application d’une vaseline banche sur les bords du tube en PVC, surtout lorsque
les vitesses de chantier étaient appliquées (Figure n°57). Le démoulage des colonnes est aussi
facilité.

162
Chapitre V. Les premiers essais.

6.3cm

a) b) c)

Figure n°57 : Colonne de sable de Fontainebleau injectée avec un volume de

pore d’une solution colorée au bleu de méthylène.

Cette amélioration a été décrite et intégrée dans le protocole de montage des colonnes
(voir le chapitre Matériels et Méthodes). Ce modèle de petite colonne (l = 20 cm et Ø = 6.3
cm) a été définitivement retenu pour sa facilité de montage, pour les plus faibles volumes à
injecter ainsi que pour la rigidité de ses embases. En effet les embases en téflon
précédemment utilisées avaient tendance à se déformer sous la contrainte et à favoriser
l’apparition de fuites. De plus, pour mieux observer les effets de la bio calcification en
fonction de la quantité de biomasse et du sel de calcium injecté, les colonnes peuvent être
découpées en deux. Le tronçon supérieur ( a,b) s’étend du point d’injection jusqu’à la moitié
de la colonne et le tronçon inférieur (c) coïncide avec la second moitié.

163
Chapitre V. Les premiers essais.

3. La troisième série.

Pour se rendre compte, de l’impact du sel de calcium et de la biomasse sur le

processus de bio calcification, une troisième série de petites colonnes a été réalisée avec une
injection en mode continu. En effet, ces conditions d’injection s’étaient révélées propices à la
bio précipitation, et permettent de mieux appréhender les interactions biomasse –
précipitation. Quatre colonnes ont été injectées dont deux (colonnes n°7 et 8) en condition de
chantier avec 5 V.p de solution calcifiante. Les deux autres (colonnes n°9 et 10) ont eu 20 V.p
avec, en plus, une solution calcifiante de 25 % plus concentrée, de façon à ce que la
concentration en calcium ne soit pas un facteur limitant (Tableau n°66).

Tableau n°66 : Les paramètres du protocole d’injection de la série n°3.

Identification Colonne n°7 Colonne n°8 Colonne n°9 Colonne n°10

A.E (mS/min/ml) 2.5 2.3 1.5
D.O600 1.2 3.9 2.4
A.E.S (mS/min/D.O) 2.3 0.6 0.6
Mode d’injection continu
Concentration et nature [Urée/Ca(NO3)2] [Urée/CaCl2] =
[Urée/CaCl2] = 0.75 M
de la solution calcifiante = 0.5 M 0.35 M
Volumes de pore de
solution calcifiante 5 V.p 20 V.p
injectée
Vitesse réelle d’injection
5 cm/h
de la solution calcifiante
Durée de batch non
Taille de haut 6 6 9.7 9.6
l’échantillon
bas détruite 6 9.6 9.6
(cm)
Résistance haut 1.05 1.40 0.40 2.63
maximale à la
compression bas - 0.03 4.90 2.68
simple (MPa)
(- : non cimenté)
Les premiers résultats montrent une bio calcification importante dans les colonnes n°7
et n°8. Les résistances à la compression simple sont mesurables et plus élevées dans les 6
premiers centimètres, c'est-à-dire dans le premier tiers des colonnes. Dans la colonne n°8, le
taux d’hydrolyse de l’urée moyen tout au long de l’injection a été de 90 %. Ce taux confirme
une bonne hydrolyse de l’urée du moins au niveau des 6 premiers cm. Ces éléments
concordent pour dire que l’activité enzymatique se maintient pendant l’injection des 5.V.p
Elle peut donc se maintenir dans ces conditions de chantier pendant près de 24 heures en
présence d’une solution calcifiante.

La colonne n°8 a été injectée avec une suspension de biomasse ayant une A.E
représentant 92 % de celle injectée dans la colonne n° 7, avec une D.O.600 trois fois plus
grande et donc une A.E.S, 4 fois plus faible. Ces conditions ont conduit à un quasi
doublement de la longueur de cimentation et une résistance maximale à la compression simple
de près de 30 % supérieure. Ceci suggère que la bio calcification est meilleure quand les
A.E.S sont plus faibles et les effectifs bactériens plus élevés. Ces paramètres agissent sur la
distance de pénétration dans la colonne et donc sur l’homogénéité de la calcification.

164
Chapitre V. Les premiers essais.

L’homogénéité ou l’hétérogénéité de la cimentation de la première section des colonnes peut

être déduite à partir de la forme des courbes de résistance à la compression simple. En effet,
celle de la partie supérieure de la colonne n°7 est très hachée (Figure n°58). Ces phénomènes
de rupture et de reprise d’effort caractéristiques un sol hétérogène. Ceci n’apparait pas dans la
courbe de la partie supérieure de la colonne n°8 qui est plus lisse et en forme de cloche est
donc homogène.

Figure n°58 : Courbe

« d’effort/déplacement » très
hachée de la colonne n°7.

Dans les colonnes n°9 et n°10, qui ont été injectées dans des conditions extrêmement
éloignées des exigences de chantiers (20 V.p de liquide calcifiant) pour s’assurer que le
facteur limitant ne serait pas le sel de calcium ([urée/CaCl2] : 0.75 M), les résistances à la
compression simple sont entre 2 à 4 fois plus élevées. Cependant une forte disparité existe
dans ce duplicata à la fois dans la répartition et dans l’intensité de la bio calcification. En
effet, la colonne n°9 possède une faible valeur de résistance maximale à la compression dans
le premier tronçon de la colonne (0.403 MPa). Par contre la résistance maximale est 10 fois
plus élevée dans la partie basse (4,902 MPa) et près de deux fois plus grande que dans sa
colonne jumelle (colonne n°10) au même niveau. Cette hétérogénéité ne se retrouve pas au
sein de la colonne n°10, les sections, haute et basse, présentent la même gamme de résistance
(2.6 MPa) et les deux courbes de compression sont très hachées et très similaires entre elles.

Par ailleurs, la qualité des effluents de sortie des colonnes n°9 et n°10 montre un
phénomène de décrochage ou de lessivage de la biomasse, notamment pour la colonne n°9.
Ce phénomène pourrait expliquer, pour le tronçon inférieur, sa résistance à la compression
simple deux fois plus faible que celle obtenue dans sa colonne jumelle (n°10).

4. Conclusion.

Ces premiers essais de bio calcification en colonne ont permis de constater que le
procédé de bio calcification résulte d’un processus complexe liant à la fois la distribution de la
biomasse, son activité enzymatique, le lieu de bio précipitation, les vitesses d’injection et les
concentrations de la solution calcifiante.
Une tendance semble toutefois se dégager, décrivant une première série de conditions
propices à la bio précipitation. En effet, dans des colonnes de sable de Fontainebleau, les
faibles vitesses réelles d’injection (0.05 m/h) sont favorables à la bio précipitation quelle que
soit la concentration du milieu calcifiant (0.35 - 0.75 M) ainsi que le nombre de volumes de
pore injecté (5 - 20 V.p) et la valeur de l’activité enzymatique spécifique (0.6 - 2.3
mS/ml/min). Par contre, aux vitesses de chantiers, un mode d’injection en semi-continu est
obligatoire car le lessivage et les perturbations hydrauliques sont trop importantes quel que

165
Chapitre V. Les premiers essais.

soit le nombre de volumes de pore (5 – 20 V.p) appliqué dans la gamme de concentration

utilisée.
Pour établir un protocole expérimental d’injection applicable au chantier, il est
nécessaire d’approfondir plus avant l’impact de chaque paramètre sur le processus de bio
précipitation. En effet, des phénomènes observés au cours de ces injections ; tels que le
lessivage des bactéries, l’impact de la solution calcifiante sur l’activité enzymatique et le
maintien de l’activité enzymatique en milieu poreux sont autant de points à élucider.

166
Chapitre V. Les premiers essais.

II. IMPACT DE LA SOLUTION CALCIFIANTE SUR LA SUSPENSION DE

BIOMASSE.

Ces premiers essais d’injection, ont permis d’observer un autre phénomène. Il apparaît
dans certaines colonnes, cimentées uniquement dans le tronçon inférieur. Celles-ci lorsqu’elles
avaient été injectées, avaient émis en sortie, plus que les autres, des effluents blanchâtres. Ceux-ci
collectés dans un bac de réception, ont présenté une intense floculation. Le précipité blanchâtre
qui ressemble de visu à des flocons blancs en suspension se forme lorsque la solution calcifiante
rencontre la suspension bactérienne (bactéries flottant dans le milieu de culture dont les réserves
ont été consommées). Le volume estimé de cette production blanchâtre peut représenter jusqu’à
0.2 V.p

Ces flocons que l’on peut appeler aussi des flocs résultent généralement d’un phénomène
de floculation que l’on peut définir ainsi : La floculation est un phénomène physico-chimique au
cours duquel les matières en suspension forment des flocons, s’agrègent en un floc, ce qui détruit
la stabilité de la solution et entraine leur sédimentation. On peut également parler de flocs pour
des précipités d’hydroxydes de métaux dont la formation et la stabilité dépendent du pH.

Il était nécessaire d’identifier la nature et le processus de la formation de ces flocs. En

effet s’ils se produisent dans la porosité du sable pourraient limiter les écoulements et les
échanges ioniques. Une expérience a consisté à réaliser en tubes, ce qui se produit éventuellement
à l’intérieur des colonnes. Ainsi, deux suspensions bactériennes additionnées de concentrations en
urée très différentes (2.4 et 20 g/l), de pH respectivement 8 et 9.4, ont été centrifugées et les
surnageants récupérés puis filtrés sur membrane de 0.2 µm de porosité. Ils ne contiennent donc
plus de bactéries et donc plus de potentiel carbonatogène. Le choix de ces deux concentrations
très différentes en urée a été fait pour obtenir deux concentrations en carbonate très différentes.
Ceci simule deux situations de contact avec la solution calcifiante (urée/calcium). Le premier cas
correspond à celui d’une solution calcifiante dont l’urée n’a pas encore été hydrolysée. Le second
cas, simule un contact prolongé de la suspension bactérienne avec une solution calcifiante.
Parallèlement, une solution calcifiante de 0.3 M (pH = 7.5) a été réalisée et répartie dans trois
tubes. Lorsqu’un ml de suspension de biomasse est ajouté à la solution calcifiante (pH 7.5), une
floculation blanchâtre apparait instantanément (Figure n°59). Ceci a été fait aussi avec du soude
à 1 M.

1) 2)
1cm

Figure n°59 : Photo 1 : De gauche à droite, la suspension de biomasse, trois tubes de

solution calcifiante (liquide translucide), le surnageant de la deuxième
suspension de biomasse. Photo 2 : Un exemple de floc dans une solution
calcifiante avec une suspension bactérienne.

167
Chapitre V. Les premiers essais.

L’ensemble des résultats se trouve dans le Tableau n°67.

Tableau n°67 : Résultats des essais réalisés pour l’identification des phénomènes de
floculation et leur conséquence.

Suspension Suspension Solution

bactérienne bactérienne calcifiante,
n°1 (pH = 8) n°2 (pH = 9.4) 0.5 M
Solution calcifiante, 0.5 M Précipité blanc Précipité blanc -
Solution de NaOH, 1 M Précipité blanc Précipité blanc Précipité blanc

Enfin pour une identification plus complète du floculat, 1 ml de HCl à 1.1 M a été
ajouté dans chacun des tubes, ce qui a produit une dissolution instantanée du floculat suivi
d’un léger dégagement de gaz pour la suspension bactérienne à 2.4 g/l d’urée et un fort
dégagement gazeux pour la suspension bactérienne contenant 20 g/l d’urée. Dans le cas du
précipité blanc de la solution témoin (NaOH – Ca2+), dès l’abaissement du pH, le floc est
dissous mais aucun dégagement gazeux n’a été observé. Ceci suggère, fortement la présence
d’hydroxydes de calcium. Par contre, dans le cas des précipités réalisés avec les suspensions
bactériennes, il semblerait que ce soit un mélange de deux précipités cristallographiquement
amorphes de natures différentes, de l’hydroxyde de calcium (Ks = 1.310-6) et du carbonate de
calcium (Ks = 8.710-9). Le rapport volumique de ces deux composants est étroitement
dépendant des valeurs de pH. Cette floculation suit une cinétique extrêmement rapide dans le
cadre de cette expérience ce qui exclurait totalement une intervention bactérienne directe dans
un premier temps. Par contre en colonne, l’hydrolyse de l’urée par les bactéries va rapidement
exporter une très de grande quantité de carbonates dans leur micro environnement ce qui est
favorable à leur précipitation rapide sous forme de carbonate de calcium amorphe puis ensuite
cristallin. En effet, dans un tube témoin, réalisé avec une suspension bactérienne brute, non
filtrée, le floc a sédimenté au fond du tube en entrainant les corps bactériens. Ensuite, une
précipitation du carbonate calcium est apparue après 24 heures sur les bords du tube sur une
hauteur de 2 cm au dessus du floc.

Deux hypothèses peuvent être avancées quant aux conséquences sur le procédé de bio
calcification.

Le premier effet de l’apparition de floc en colonne concerne le changement local des

propriétés physico-chimiques de la solution calcifiante. En effet, ces précipités amorphes
augmentent la viscosité du milieu. Or ce changement se réalise au fur et mesure de son
avancée dans la colonne ce qui a pour effet d’accentuer de lessivage la surface des grains de
sables en leur arrachant le potentiel enzymatique. Ce phénomène s’intensifie en même temps
que la quantité de carbonate de calcium augmente dans le floc. En effet, ce phénomène est
directement dépendant de l’hydrolyse de l’urée c'est-à-dire de l’activité des bactéries.

Le second désavantage résulte du changement de propriétés du floc. En effet, la

formation de ce précipité au sein de la matrice poreuse augmente de manière croissante, et
ceci jusqu’à sa désagrégation sous l’effet de la pression exercée par la solution calcifiante en
amont. Cela provoque l’arrêt du déplacement du floc. La taille et la forme des dépôts, sont
dépendantes des vitesses d’injection, la taille étant inversement proportionnelle à la vitesse
d’écoulement. De plus dans un modèle en colonne, ce processus semble évoluer en doigt de

168
Chapitre V. Les premiers essais.

gants (Figure n°60). Dans la partie supérieure d’une colonne, les zones de sable non
consolidé ont été dégagées par une succession de trempages ce qui a fait apparaitre
l’interconnexion des zones de macroporosité en un réseau complexe en doigts de gants.

HAUT DE LA COLONNE
1 cm
Figure n°60 : La consolidation ne se
réalise pas de manière uniforme, mais
en doigts de gant.

Bas

En conséquence, les injections en mode continu aboutiraient à des flocs de grande

taille qui se localiseraient dans la partie supérieure de la colonne. Par contre, les injections en
vitesse de chantier, plus rapides, pourraient fragmenter les flocs. Ces accumulations
pourraient donner lieu à l’apparition de zones mieux calcifiées. Ainsi, la présence récurrente
de petites boulettes de sable consolidées au sein d’une matrice de sable non calcifiée en est un
exemple (Figure n°61). On peut parler de nodules de sables.

Figure n°61 : Exemple de

nodules de sable
consolidés présents dans
15 cm les sections non
consolidées d’une
colonne.

De la même manière, un dépôt homogène dans la partie inférieure de la colonne

renforce la résistance de ce tronçon (colonne n°9). Ce phénomène est ubiquiste, puisqu’il sera
observé sur quasiment tous les échantillons écrasés par compression simple. Dans les courbes
« effort/déplacement », c’est la succession de ruptures et de reprises d’efforts qui se
matérialise par une série de dents de scie, qui figurerait ce phénomène (Figure n°62).

Bas
Haut mm Figure n°62 : Exemple caractéristique
mm de courbes « effort/ déplacement », en
dents de scie, du haut (orange) et du
bas de la colonne n°10.

mm

169
Chapitre V. Les premiers essais.

Des mesures réalisées à l’aide du Calcimètre Bernard ont permis de quantifier les
variations de la teneur massique en carbonate de calcium au sein des nodules de sable. Elles
peuvent varier de 10 % à 17 % alors que dans le sable non cimenté, elles atteignent à peine 3
%. A ce stade des recherches, l’hétérogénéité du procédé a été mise en évidence. Une étude
plus approfondie sur 8 colonnes, a été menée pour élucider l’impact réel de la formation d’un
floc sur l’homogénéité de la bio calcification.

170
Chapitre V. Les premiers essais.

III. IMPACT DE LA FLOCULATION SUR L’HOMOGENEITE DE LA BIO

CALCIFICATION EN COLONNE.

1. Introduction.

De nouveaux essais d’injection ont été réalisés en colonnes, en changent le type de sable,
la méthode de compaction, la souche, la composition du milieu de production de la biomasse et
le niveau d’hydratation de la colonne. Pour cela, huit colonnes ont été confectionnées, quatre
pour chaque mode d’injection et parmi elles trois en sable d’Itterbeck et une avec du sable de
Fontainebleau.

Le sable d’Itterbeck est un sable fluviatile non lavé de composition siliceuse à 99 %,

possédant une granulométrie avec 20% de fine à celui du sable de Fontainebleau qui lui est un
sable issu d’un faciès marin, et ayant subi une érosion éolienne. Lorsque le sable d’Itterbeck est
placé dans un bac à ultrasons, des particules de dimensions nanométriques se décrochent de
grains de sable contrairement au sable de Fontainebleau. Les courbes granulométriques de ces
deux sables et de leurs fines sont présentées dans la Figure n°63.

Figure n°63 : Les courbes

granulométriques des sables
de Fontainebleau et
d’Itterbeck.

La méthode de compactage utilisée pour cette expérience, consiste à tapoter le sable

verticalement puis latéralement l’aide d’un pilon. Cette méthode permet d’obtenir un maximum
de compactage sous eau.
Une nouvelle souche de S. pasteurii (DSMZ 33) a été cultivée en bio réacteur sur le
milieu de culture préconisé par DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und
Zellkulturen) dans lequel ont été ajoutés 10 µM de chlorure de nickel (Tableau n°68).

Tableau n°68 : Composition Milieu de culture (liquide)

et notation du milieu utilisé 20 g/l de Y.E.
(Y.E. :Yeast extract ou 10 g/l NH4Cl
Extrait de levure). 1.28 mg/l NiCl2
pH = 8.5
Notation
DSMZ modifié

171
Chapitre V. Les premiers essais.

Les conditions de culture (température, oxygénation…) sont identiques à celles appliquées à

la souche de S. pasteurii CIP 66.21. L’activité enzymatique (A.E) et l’activité enzymatique
spécifique (A.E.S) de la suspension de biomasse sont présentées dans le Tableau n°69. Les mêmes
mesures ont été faites sur le liquide obtenu après filtration sur membrane de cellulose à 0.45 µm de
porosité, de la suspension bactérienne. Il ne renferme plus de cellules bactériennes et l’activité
enzymatique dosée correspond à une activité uréasique extra cellulaire. Lorsque la suspension
bactérienne vieillit, l’enzyme a tendance à sortir du cytoplasme des bactéries.

Tableau n°69 : Les activités enzymatiques du milieu de culture DSMZ modifié,

avec et sans bactérie.

A.E. A.E.S
Type de milieu T (° C) D.O.600nm
(mS/ml/min) (mS/ml/min/D.O)
DSMZ modifié
1.8 2.8 1.6
(avec bactéries) 20
DSMZ modifié et filtré
0 0.8 - 1.2 -
(sans bactérie)

Le milieu DSMZ modifié et filtré (dépourvu de bactéries) présente une activité enzymatique
résiduelle très élevée, qui atteint presque la moitié de l’activité enzymatique totale et qui ne peut être
attribuée à une enzyme intra cytoplasmique.
L’injectabilité d’une suspension de biomasse se définit par rapport à la quantité d’enzyme
intracellulaire. Il faut qu’elle ait une activité spécifique de 0.3 mS/min/ml/DO ou une activité de 0.3
mS/min/ml (4.32 mM urée hydrolysée par min/ml) avec une D.O de 1. Si ces valeurs sont
supérieures une dilution de la suspension de biomasse avec de l’eau déminéralisée stérile peut être
envisagée.

2. Protocole.

Un et demi V.p de cette suspension bactérienne a été injecté au débit de 175 ml/min pendant
deux minutes soit à une vitesse réelle de 9 m/h. Cette vitesse d’injection, très supérieure à celle de
chantier (20 cm/h), permet de disperser au mieux la biomasse le long de la colonne. En effet,
l’augmentation des vitesses permet de diminuer l’effet filtrant du sable. Cette injection est
immédiatement suivie d’une deuxième injection, dans des conditions identiques à celle de la
biomasse, d’une solution de 5.5 g/l de sel de calcium (CaCl2). Il ne s’agit pas là d’une solution
calcifiante, celle-ci, plus concentrée est injectée après avec de l’urée. Ces 5.5 g/l de CaCl2 doivent
permettre de produire des flocs lorsque la solution calcifiante rencontre la suspension bactérienne.
Les fortes turbulences produites par les vitesses d’injection privilégient le mélange avec la
suspension bactérienne. Les flocs ainsi formés, vont potentiellement engluer les bactéries et
favoriser leur fixation échelonnée tout long de la colonne.

L’injection de la solution calcifiante à 0.75 M suit sans attendre l’étape n°2. Elle est faite
en mode continu ou en mode semi continu selon les colonnes. Dans le cas du mode continu, 10
V.p sont injectés pendant 72 heures à la vitesse de 0.05 m/h. En mode semi continu, 5 V.p
passent pendant 20 heures entrecoupés de batch de 3 heures. Enfin pour mieux appréhender
l’impact des flocs sur les liquides résiduels de la bio calcification, deux types de sortie de
colonnes ont été élaborés. Une position haute, pour maintenir la colonne totalement hydratée et
une position basse qui consiste à ne pas remonter le flexible de sortie de colonne mais à le laisser

172
Chapitre V. Les premiers essais.

au niveau de l’embase inférieure. Ceci doit favoriser une légère déshydratation du milieu poreux
par l’introduction d’une bulle d’air lors de l’injection de la solution calcifiante (Figure n°64). Le
Tableau n°70 récapitule les caractéristiques des colonnes.

Entrée Entrée
eeee e

Sortie Figure n°64 : Les deux systèmes

d’évacuation des effluents permettent de
maintenir deux niveaux de d’hydratation
1 2 de la colonne.
3

Sortie

Sortie
des
N° Nature du Type
effluents
Colonne Sable d’injection
de
colonne
11 Itterbeck Par le
12 Itterbeck bas Tableau n°70 : Caractéristiques des
13 Itterbeck En continu colonnes pour tester l’impact des flocs sur
Par le
Sable de haut le processus de bio calcification.
14
Fontainebleau
15 Itterbeck Par le
16 Itterbeck haut
En semi-
17 Itterbeck continu Par le
Sable de
18 bas
Fontainebleau

3. Les résultats.

Les résultats de la résistance à la compression simple (Rc) et de la teneur en carbonate de

calcium pour les colonnes en sable Itterbeck sont très différents (Tableau n°71). En effet, les
duplicat n°11 et n° 12 présentent une différence de 25 % en Rc et avec seulement une variation de 3
% de la teneur en CaCO3. Ces variations ont été obtenues sur des colonnes possédant une sortie
d’effluent par le bas. Lorsque la sortie se fait en position haute (colonne n°13), les résistances (Rc)
comparées avec celles du premier groupe sont de 41 et 55 % plus faibles et les teneurs en carbonate
de calcium sont de 7 à 9 % plus basses. Par contre, lorsque le sable d’Itterbeck est remplacé par du
sable brut de Fontainebleau (colonne n°14), les valeurs de Rc sont de 18 à 40 fois plus faibles et ceci
avec en moyenne 4 fois moins de CaCO3 par cm3.

173
Chapitre V. Les premiers essais.

Tableau n°71 : Résultats des colonnes réalisées en mode continu.

Sortie des Résistance Teneur en
N° Mode
Sables effluents de UCS (MPa) CaCO3
Colonne d’injection
colonne (Rc) (mg/cm3)
11(1) Itterbeck 4.60 300
Par le bas
12 (2) Itterbeck 6.10 292
13 (3) Itterbeck En continu 2.70 273
Sable de Par le haut
14 (4) 0.15 67
Fontainebleau
En effet, la colonne en sable de Fontainebleau n’a été consolidée que dans sa partie
inférieure et notamment dans le dernier tiers. Cette section a été soumise à la compression,
développe une courbe « effort/déplacement », dont le profil est haché (Figure n°65). Ceci est
caractéristique d’une bio précipitation hétérogène. Par contre, lorsqu’il s’agit d’échantillon de sable
d’Itterbeck, comme par exemple dans la colonne n°12, les courbes sont lisses et en forme de cloche
(Figure n°65).

Colonne n°14 (sable de Fontainebleau) Colonne n°12 (sable d’Itterbeck)

Figure n°65 : Les courbes « effort/déplacement » des colonnes n°14 et12.

Pour comparer plus aisément les résultats entre les injections continues et semi continues,
aucune modification n’avait été apportée aux étapes n°1 et n°2 du protocole d’injection. Ainsi, les
conditions chantier ne s’appliquent-elles que sur la troisième étape du protocole, c’est-à-dire la
vitesse d’injection de la solution calcifiante. Les résultats de ces colonnes se trouvent dans le
Tableau n°72.

Tableau n°72 : Résultats des expériences réalisées en conditions de chantier.

Teneur
Sortie des Résistance
N° Mode en
Sables effluents de UCS (MPa)
Colonne d’injection CaCO3
colonne RC
(mg/cm3)
15 Itterbeck 0.360 163.6
Par le haut
16 Itterbeck 0.880 206.0
17 Itterbeck Semi continu 0.580 159.5
Sable de Par le bas
18 0.008 36.0
Fontainebleau

Les résultats sont très hétérogènes à la fois pour les résistances maximales à la compression
simple et pour les teneurs en carbonate de calcium dans les quatre colonnes injectées en condition

174
Chapitre V. Les premiers essais.

de chantier. En effet, dans la colonne n°15 dont l’effluent sort par le haut, la résistance est 2.5 fois
plus faible, avec 20 % en moins de carbonate de calcium par rapport à son duplicata (Colonne
n°16). Dans la colonne n°17, la teneur en CaCO3 est similaire à celle de la colonne n°15, mais sa
valeur de résistance maximale est de 1.6 fois plus élevée. Ces écarts de résistance se retrouvent
également avec le sable de Fontainebleau (colonne n°18). Tout comme dans la colonne n°14, la
précipitation s’est réalisée dans la section inférieure de la colonne. De la même manière, la courbe
d’« effort/déplacement » est hachée contrairement à celle des échantillons de sable d’Itterbeck qui
sont lisses et en forme de cloche.

Le type de sable influence les résistances, par exemple, car le sable d’Itterbeck présente une
proportion plus importante de particules de petite taille dites fines (en dessous de 0.1 mm) (20 %),
que le sable de Fontainebleau. Ces fines créent un plus grand nombre de contact entre les grains et
améliorent la cohésion du sable dans un état de compactage maximum (d = 1.7). Des observations
comparatives au MEB ont été réalisées par le Laboratoire de Microbiogéologie, de l’Université
d’Angers. Ces deux sables montrent des différences notables quant à la taille et la forme des grains
(Figure n°66). Dans le sable de Fontainebleau, les grains sont à peu près tous de même taille mais
avec des formes différentes, rondes ou plates et des arêtes arrondies. Les grains de sable d’Itterbeck,
de tailles et de formes différentes, sont plus anguleux et ménagent de nombreuses anfractuosités.

Le sable de Fontainebleau.

Le sable d’Itterbeck.

(Images S. Castanier et G. Levrel)

Figure n° 66 : Etude ultramicroscopique du sable de Fontainebleau et du sable d’Itterbeck.

La plus forte angulosité des grains de sable d’Itterbeck et les nombreuses anfractuosités
permettent d’une part une meilleure compaction dans les colonnes et d’autre part, une meilleure
accroche bactérienne, même si la nature exacte de ces fines n’a pas été déterminée. Les
caractéristiques du sable agissent donc sur plusieurs niveaux. Ainsi, l’enchevêtrement des particules
est optimisé ce qui augmente la surface de contact dans les zones inter granulaires. Le mode
d’injection en continu a également son importance, car, l’application d’une faible vitesse
d’injection, dans le sable d’Itterbeck, apporte, sans turbulence et en tout point de la colonne, le
substrat et le calcium nécessaires à la précipitation du carbonate de calcium. Ceci ne favorise pas

175
Chapitre V. Les premiers essais.

pour autant l’encroûtement des bactéries, car les fluides n’étant pas immobilisés, les produits de
réaction sont rejetés en dehors du nano - environnement de la bactérie. Les effluents se chargent en
ions carbonates et ammonium, au fur et à mesure de leur passage dans les pores. La précipitation et
la croissance cristalline se réalisent préférentiellement dans les réseaux inter granulaires là le
carbonate de calcium issu des flocs est présent et sert, préférentiellement, de site de nucléation. Or,
ces réseaux inter granulaires sont plus nombreux et plus étroits, que ceux du sable de Fontainebleau,
ce qui permet aussi à davantage de petits cristaux d’avoir un rôle mécanique de consolidation.
La performance de ce procédé semble être améliorée lorsque les colonnes présentent une
sortie d’effluent vers le bas et sont donc par moment, seulement partiellement hydratées. C’est en
particulier le cas pour le sable d’Itterbeck. En effet, lorsque l’injection en continu est réalisée, il faut
entre 49 et 65 mg/cm3 de CaCO3 pour obtenir 1 MPa de résistance à la compression (Rc).
Cependant, ces valeurs sont deux fois inférieures (101 mg/cm3) lorsque les colonnes injectées
restent toujours totalement hydratées (sortie haute). En mode semi continu, pour une colonne
partiellement hydratée, cette valeur augmente jusqu’à 275 mg/cm3. Par contre, dans les colonnes
totalement hydratées, la teneur en carbonate de calcium augmente d’un facteur de 0.85 à 1.6 soit
entre 234 et 475 mg/cm3. Lorsque les colonnes subissent temporairement une déshydratation, le floc
a tendance à s’étaler sur la surface des grains et donc à augmenter le nombre de sites de fixation
pour les bactéries. D’autre part, il ne reste pas dans les pores (espace entre au moins trois grains),
mais migre, en entrainant les bactéries, plus facilement dans les espaces inter granulaires même les
plus fins (pont capillaire). Ceci, par opposition à un état hydraté permanent, a pour conséquence
d’augmenter significativement la surface disponible pour l’adhésion des bactéries. Dans le sable
d’Itterbeck la présence de fines ménage un réseau partiellement obturé (pore en cul de sac) et
l’impact du floc s’en trouve accentué ainsi que la bio calcification. Dans les colonnes en sable de
Fontainebleau, il y a un plus grand nombre de pores interconnectés ce qui constitue un réseau
ouvert. La fragmentation du floc est moindre et donc le lessivage est plus intense et la bio
calcification moins rentable.
Ces phénomènes transparaissent dans les courbes d’« effort/déplacements ». Celles du sable
d’Itterbeck sont lisses, les reprises des efforts sont continues et homogènes avec des ruptures plus
nettes, sans dents de scie. Même en condition de chantier, lorsque le nombre de V.p injectés est
deux fois moins grand, et que les résistances à la compression sont 7 fois moindres, les échantillons
en sable Itterbeck présentent toujours des courbes en forme de cloche (Figure n°67). Les courbes
obtenues avec le sable de Fontainebleau sont hachées (Figure n°65).

Figure n°67 : Les courbes « effort/déplacement » des colonnes n°16 et n°17.

176
Chapitre V. Les premiers essais.

4. Conclusion.

Ces premiers essais tendent à montrer une différence de comportement de la bio calcification
vis-à-vis de ces deux sables testés. Les flocs améliorent grandement le rendement du procédé
notamment dans le cas du sable d’Itterbeck. Le lessivage dans ces conditions est moins marqué et
améliore les performances mécaniques du sable. Ces observations ainsi que celles des expériences
précédentes suggèrent également une très forte relation spatiale entre le lieu de dépôt de biomasse,
l’activité enzymatique et les zones de consolidation.
L’efficacité de l’homogénéisation de la bio calcification repose sur la répartition de la
biomasse et aussi sur le comportement de l’activité enzymatique en présence d’une solution
calcifiante.

177
Chapitre V. Les premiers essais.

IV. LES CINETIQUES ENZYMATIQUES DE L’UREASE ET LEURS

IMPLICATIONS DANS LE PROCESSUS DE BIO CALCIFICATION.

1. Introduction.

Le comportement de l’uréase contenue dans le cytoplasme de S. pasteurii, en présence de

la solution calcifiante est peu connu. De plus, de nombreux processus biologiques ou chimiques
semblent interférer dans la bio calcification, tels que l’inhibition de l’activité enzymatique ou la
perte du potentiel enzymatique. L’étude de ces effets à l’échelle moléculaire et cellulaire, permet
de mieux maîtriser le processus de bio calcification y compris lorsqu’il sera mis sur le chantier.
Les mesures de l’activité enzymatique reposent sur l’équation de l’hydrolyse de l’urée par
l’uréase :
H2NCONH2 + H2O → CO32- + 2 NH4+ [n° ]
Uréase

L’étude de la cinétique enzymatique est réalisée dans les conditions de Mickaëlis-

Menten. Le substrat est toujours en excès par rapport à l’enzyme pendant les six minutes que
dure la mesure de l’activité enzymatique. La température est maintenue à 20° C et le pH stabilisé
à 9.2. Deux techniques peuvent être employées. L’une est chimique, par une quantification du
NH4+ produit (Méthode au réactif de Nessler), avec un dosage toujours fait en duplicata. La
seconde, par une technique électrochimique, met en jeu une sonde de conductivité.
Cette seconde méthode a l’avantage d’être extrêmement sensible et simple d’utilisation.
Une corrélation entre l’activité enzymatique résultant de la quantification des ions NH4+ libérés
et la variation de conductivité du milieu enzymatique en fonction temps a pu être établie à partir
de l’uréase pure de Jack Bean en présence d’urée :

1 mS/cm/min = 14.4 mM d’urée /min.

Cette relation est une première estimation, car les conditions sont ici très éloignées de
celles de l’uréase intracellulaire de S. pasteurii. Ainsi, la mesure est faite d’une part, sans
l’impact de la diffusion du substrat à travers une membrane cytoplasmique, et d’autre part sans la
gène pouvant résulter de la présence des ions calcium et agissant sur l’accessibilité du substrat à
l’enzyme. Avec l’uréase pure, la quantité d’urée hydrolysée en fonction du temps est maximale
et surestimée. Néanmoins le comportement de l’enzyme libre vis-à-vis du substrat seul et en
présence d’ion calcium fournit de précieux renseignements sur les mécanismes du processus de
la bio calcification. Cela est possible par l’établissement des constantes cinétiques avec l’uréase
pure à la concentration de 0.18 U/ml, puis avec l’uréase cellulaire de S. pasteurii.

2. L’activité enzymatique de l’uréase pure « Jack Bean ».

La Figure n°68 regroupe les courbes d’activité enzymatique de l’uréase pure pour des
concentrations en urée variant de 0 à 1 M soit de 0 à 60 g/l.

L’activité uréasique est de type Mickaëlis Menten, avec les constantes cinétiques
suivantes : un Km de 5.1 mM (306 mg/l) et un Vmax pour l’enzyme pure de 129 µS/cm/min soit
à 1.85 mM d’urée hydrolysée/min (soit 111 mg/l/min) pour une concentration d’enzyme de 0.18
U/ml. La forme en cloche de la courbe (graphique n°1) est caractéristique d’un excès de
substrat ce qui est confirmé par la représentation de Lineweaver-Burk (graphiques n°3 et 4). En

178
Chapitre V. Les premiers essais.

effet, ces représentations montrent que l’effet inhibiteur devient important dès que 1/ [S] est
inférieure à 10. Ceci produit une diminution approximative de la vitesse d’hydrolyse de 33
µS/cm/min/mole d’urée, soit une perte de 25 % par rapport à la vitesse d’hydrolyse maximale
dans ces conditions de mesure. Cette inactivation est partielle et réversible. Lorsque les mêmes
conditions de mesure sont appliquées, mais en présence d’ion calcium sous la forme de CaCl2 en
concentration finale de 0.5 M (55 g/l), une diminution de la vitesse de l’activité enzymatique de
417 µS/cm/min/mole d’urée apparaît (Figure n°69).

140 Représentation Lineweaver-Burk

0.013

130
0.012

120
Vitesse d'hydrolyse (µS/cm/min)

0.011

1/ Vitesse (µS/cm/min)
110

0.010
100

0.009
90

0.008
80

70 0.007
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 20 40 60 80 100 120 140
Urée (M) 1/ [Substrat] M-1

0.014
Representation Lineweaver-Burk
0.014

0.012 1/Substrat (M):1/ Vitesse (µS/cm/min): y = 0.0084 + 3.0877E-5*x;

r = 0.8341; p = 0.0100; r² = 0.6957
0.012

1/ Vitesse (µS/cm/min) (µS/cm/min)

0.010
0.010
1/ Vitesse (µS/cm/min)

0.008
0.008
1/ Vitesse (µS/cm/min) = Ajustement impossible en raison d'un intervalle de valeurs incor
0.006
0.006

0.004 0.004

0.002 0.002

0.000
0.000 -400 -300 -200 -100 0 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
-1
Urée (M) 1/ [Substrat] M

Figure n°68 : Les courbes d’activité enzymatique de l’uréase pure pour des concentrations en
substrat de 0 à 1 M (graphique n°1) et de 0 à 0.06 M (graphique n°2). Les représentations de
Lineweaver-Plot pour la détermination des constantes cinétiques1/V en fonction de 1/S
(graphiques n°3 et 4).

179
Chapitre V. Les premiers essais.

24 0.50

22 0.45

20 0.40

18
0.35

16
0.30

1/ Vitesse (µS/cm/min)
Vitesse (µS/cm/min)

14
0.25
12 1/ Vitesse (µS/cm/min)
0.20 1/Vitesse Ca2+ (µS/cm/min)
10
0.15
8
0.10
6

0.05
4

2 0.00

0 -0.05
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07
[Urée] M + [ CaCl 2 ] 0.5 M Urée (M)+ 0.5 M Ca2+

Figure n°69 : Variation de la vitesse d’hydrolyse de l’urée en présence de différentes

concentrations de CaCl2.

Les ions calcium interfèrent sur l’activité enzymatique en présence d’uréase pure. Dans la
première partie de la courbe du graphique 1, le Vmax semble augmenter en présence de faibles
concentrations physiologiques d’urée (10 µM). Une première approximation des constantes
cinétiques à l’aide de la représentation Lineweaver-Burk conduit à un Vmax’ 28 µS/cm/min de
substrat à un Km’ voisin de 18 mM. Ceci correspond à une augmentation d’un facteur de 3.5 du
Km par rapport aux conditions précédentes, c'est-à-dire une perte de l’affinité de l’enzyme pour
son substrat en présence d’un sel de calcium. Dans la seconde partie de la courbe, une inhibition
complexe, apparaît, très probablement induite par le produit de la réaction d’hydrolyse. Les ions
calcium sont ajoutés ici à des concentrations très supérieures aux besoins physiologiques d’une
bactérie. Très nombreux, lorsqu’ils sont proches de l’enzyme, ils vont modifier l’accessibilité de
l’urée à son site actif soit directement par modification de la structure de l’enzyme, soit
indirectement par la formation de nano flocs qui vont s’interposer entre l’enzyme et son substrat.
Un autre phénomène peut entrer en jeu, de manière concomitante. En effet, la précipitation du
carbonate de calcium libère des protons qui acidifient légèrement le nano-environnement, ce qui
peut diminuer l’affinité du site actif de l’enzyme pour son substrat.

Par ailleurs, des observations sur lames au microscope photonique ont été réalisées en
présence d’uréase pure (Jack Bean) et d’une source d’urée-calcium. Ainsi, 10 µl d’une solution
d’uréase à la concentration de 0.18 U/ml ou de 0.54 U/ml ont été déposés sur des lames puis mis
en contact avec 10 µl de solution calcifiante 1 M, d’un mélange équimolaire d’urée et de CaCl2.
Ceci correspond, à T0, à 60 g/l d’urée et 110 g/l de CaCl2. Le système, recouvert d’une lamelle
de verre pour éviter l’évaporation, est maintenu à 20° C pendant 10 minutes afin que la réaction
enzymatique ait lieu (Figure n°70). Les observations sont faites à un grossissement cumulé de
800. La quantité et la forme des cristaux de carbonate de calcium produit est en relation directe
avec la quantité d’enzyme pure employée. Le mélange peu concentré (Photos n°1 et 2) présente
des particules dont certaines sont sphériques alors que d’autres, plus structurées, s’organisent en
un assemblage de cristaux enchevêtrés. Dans la solution la plus concentrée en uréase, les

180
Chapitre V. Les premiers essais.

particules de plus grande taille ont tendance à s’organiser en sphères (Photo n°3) alors que des
cristaux polymorphes s’assemblent en formant des agrégats.

10 µm 10 µm

Photo n°1 Photo n°2

10 µm 10 µm

Photo n°3 Photo n°4

Figure n°70 : Les précipités de carbonate de calcium obtenus avec 0.18 U (Photos n°1 et 2)
et 0.54 U (Photos n°3 et 4) d’uréase pure après 10 minutes de contact.

Selon Langmuir (2005) qui a testé cette enzyme issue du haricot, la forme des cristaux
serait étroitement dépendante de la composition en acides aminés de l’uréase et notamment de
ceu qui ,dans sa structure tertiaire, se retrouvent en périphérie de l’édifice moléculaire. Le rôle de
nucléation de la surface de l’enzyme et les interactions physico chimiques avec la croissance
cristalline conditionnent la morphologie des cristaux. L’auteur, suggère également qu’avec de
l’uréase de plante, les premiers cristaux de carbonate qui se forment, sont préférentiellement de
la vatérite. Par contre ce sont des cristaux de calcite lorsqu’il s’agit de l’uréase de S. pasteurii. La
position extra cytoplasmique de l’enzyme pourrait expliquer cette différence car une petite
quantité d’uréase libre dans les suspensions bactériennes a souvent été repérée.

Par ailleurs, l’uréase pure est vendue, conditionnée dans du glycérol qui joue le rôle de
stabilisateur. Son implication dans la croissance cristalline doit être envisagée.

181
Chapitre V. Les premiers essais.

3. L’activité enzymatique de l’uréase en position intra cellulaire, de S. pasteurii.

Les travaux précédents ont été repris, avec une suspension cellulaire de S. pasteurii âgée
de 24 heures, ayant une D.O.600 de 1, ce qui correspond à environ 1.2 108 cellules. Les activités
enzymatiques estimées par la mesure de la conductivité, sont matérialisées dans les courbes de la
Figure n°71.

400 Représentation Lineweaver-Burk

0.007

350
0.006
Vitesse d'hydrolyse cellulaire (µS/cm/min)

300

1/ Vitesse cellulaire (µS/cm/min)

0.005
250

0.004
200

0.003 y = 0.0019 + 0.0005*x; r² = 0.9903

150

0.002
100

0.001
50

0 0.000
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 -4 -2 0 2 4 6 8
[Urée] M 1/[Substrat] M

Figure n°71 : Les suivis de l’hydrolyse de l’urée et la détermination des constantes cinétiques
(Km et Vmax) cellulaire de S. pasteurii.

L’activité uréasique est de type Mickaelis-Menten (graphique n°1). L’uréase intra

cellulaire de cette suspension de 1.2 108 cellules/ml présente un Km de 263 mM et un Vmax de
526 µs /cm/min soit une vitesse d’hydrolyse de 7.5 mM d’urée par min (soit 454 mg
d’urée/l/min). Par rapport à l’enzyme libre, l’enzyme en position intracellulaire présente un Km
près de 50 fois plus élevée, donc une affinité plus faible, en raison très certainement, des
phénomènes de diffusion membranaire (Kurée = 0.1 - 0.01 m/s) mais surtout de migration dans le
gel cytoplasmique. Les effets d’inhibition par excès de substrat apparaîtront à des concentrations
plus élevées, bien au dessus de ce que le procédé industriel peut-être amené à utiliser et traiter.
Cette suspension contient, en première approximation, près de 15 . 103 unités internationales
d’activité enzymatique (U) soit environ 1 unité pour 8 . 103 cellules/ml. Cependant il ne semble
pas exister de corrélation linéaire entre la D.O et l’activité enzymatique d’après ces premiers
résultats (Figure n°72).

Activ ité e nzymatique (A.E.) e n fonction de la D.O ce llulaire

2500

2000
Figure n°72 : L’activité
enzymatique (A.E) en
A.E. ( µS/cm/min)

1500
fonction de la D.O pour
1000
des suspensions
bactériennes en fin de
500 phase exponentielle.

0
0 1 2 3 4 5 6 7
D.O.(600nm )

182
Chapitre V. Les premiers essais.

La synthèse de l’uréase chez S. pasteurii dans nos conditions de culture n’est donc pas
constitutive contrairement a ce qui a été décrit dans la littérature (Mörsdorf et Kaltwasser 1989).
Ceci entraîne l’impossibilité de quantifier de manière plus précise la répartition de l’uréase dans
une population de bactéries. Cette synthèse étant de type inductible, cela favorise une
distribution hétérogène de l’uréase au sein de la population bactérienne, car l’induction se réalise
dans un contexte précis et pas tout au long de la croissance.

4. Les cinétiques enzymatiques en présence de Ca(N03)2.

Ces cinétiques enzymatiques ont été déterminées avec différentes concentrations en urée.
Or, la bio calcification réside dans la capacité des cellules bactériennes à hydrolyser l'urée en
présence de concentrations différentes de calcium. Les premiers essais de suivi de l’activité
enzymatique, ont porté sur l’emploi du nitrate de calcium (Ca(NO3)2) à diverses concentrations.
Trois ml d’une suspension de biomasse, de D.O600 = 3.7, d’activité enzymatique 370 µS/ml/min,
et d’AES de 0.1 mS/cm/min soit près de 1.5 mM d’urée hydrolysée par minute (90 mg/l/min).
Les mesures ont été réalisées en condition dynamique c’est à dire sous agitation. Celle-ci
empêche la sédimentation des flocs et maintient l’accessibilité de l’urée au micro environnement
des cellules. Ces conditions ont été maintenues durant 420 minutes avec des mesures toutes les
dix minutes pour les premières 60 minutes puis tous les heures jusqu’à 420 minutes. Le suivi de
l’hydrolyse de l’urée en présence d’une gamme de concentrations croissantes de nitrate de
calcium est présenté dans la Figure n°73.
80
Phase n°1 Phase n°2 Phase n°3

70
Urée hydrolysée (mM)

60

50

40

30

[Ca(NO3) 2] 0.05 M
20
[Ca(NO3) 2] 0.25 M
[Ca(NO3) 2] 0.5 M
10
[Ca(NO3) 2] 0.75 M
[Ca(NO3) 2] 1 M
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Temps (min)

Figure n°73 : L’hydrolyse de l’urée par l’uréase de S. pasteurii en présence de diverses

concentrations en Ca(NO3)2.

183
Chapitre V. Les premiers essais.

Ces conditions expérimentales maintiennent l’urée en excès durant toute la durée de

l’expérience, ce qui permet de mieux appréhender les effets des différentes concentrations en
calcium. Les courbes d’hydrolyse de l’urée semblent se décomposer de trois phases. Leurs
profils sont identiques pour les deux premières phases lorsque les concentrations en nitrate de
calcium varient de 0.05 à 1 M. Par contre, durant la phase III, seule la solution de 0.05 M de
calcium se comporte différemment des autres.
La première phase est chaotique, et dure approximativement une heure. Elle est
caractérisée par de faibles variations des concentrations en urée hydrolysée, avec des profils en
dents de scie et ceci pour toutes les concentrations en nitrate de calcium. La phase n°2, qui
survient entre 50 et 180 minutes, est caractérisée par une rapide augmentation du nombre de
molécules d’urée hydrolysées et donc une augmentation de la teneur en NH4+ des solutions,
jusqu’à un plateau (Tableau n°73). La troisième phase débute après 180 minutes et se poursuit
jusqu’à la fin de l’expérience. Elle se caractérise par une stabilisation des concentrations en ions
ammonium émis ce qui traduit un arrêt de l’hydrolyse de l’urée, quelles que soient les solutions
calcifiantes testées hormis pour la solution à 0.05M. L’hydrolyse, dans ce cas, se maintient voire
augmente, puisque la concentration en urée hydrolysée passe de 30 à 60 mM durant ce laps de
temps.

Tableau n°73: Evolution de l’activité enzymatique et des taux d’hydrolyse en fonction de la

concentration en nitrate de calcium à température ambiante sous agitation, pendant la période
de 0 à 180 min.

Concentration utilisée
0.05 0.25 0.50 0.75 1.00
Ca(NO3)2 [M]
Vitesse d’hydrolyse de
147 168 257 298 437
l’urée en µmol/min
R2 (des vitesses) 0.64 0.88 0.81 0.90 1
Taux d'hydrolyse (%)
64 17 8 7 7.4
à T = 180min
Une relation positive entre la vitesse moyenne d’hydrolyse en fonction de la
concentration est observable sur les 180 minutes en fonction des concentrations en calcium
testées est illustrée dans la Figure n°74.

500
Vitesse d'hydrolyse (mM/urée/min)

450

400 Figure n°74 : La variation

350 des vitesses d’hydrolyse de
300
l’urée pendant les 180
250
premières minutes.
200 y = 20.8618 + 414.742*x;
r = 0.9726; r² = 0.9460
150

100

50

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

[Ca(NO3)2] M

184
Chapitre V. Les premiers essais.

L’ensemble de ces observations permet d’identifier trois phases dans le processus de bio
calcification. La première est une phase d’adaptation qui se caractérise par des vitesses
d’hydrolyse réduites et instables, et qui dure approximativement une heure dans ces conditions.
La phase suivante, est une période d’hydrolyse de l’urée qui s’étale sur 180 minutes, soit le
double de la période d’acclimatation. Elle est caractérisée par un accroissement de la vitesse
d’hydrolyse proportionnelle à la concentration en sel de calcium. La dernière phase est marquée
par un épuisement du potentiel enzymatique c‘est à dire un arrêt de l’hydrolyse de l’urée. Ce
cycle de 3 phases est intéressant puisque le temps d’hydrolyse ne semble pas correspondre au
temps de contact avec la solution calcifiante. Enfin, ces observations ne s’appliquent pas aux
concentrations dites physiologiques (0.05 M) puisque l’hydrolyse se maintient au cours de la
durée de l’expérience et augmente au fur et à mesure que la concentration en calcium diminue.
Par ailleurs, la vitesse estimée d’hydrolyse de l’urée de la suspension de biomasse est près de 5
fois supérieure à la vitesse moyenne d’hydrolyse en présence de calcium.

Cependant, les expériences ont été réalisées sous agitation soit en dynamique (120 Rpm
de l’aimant), ce qui signifie que le brassage du fluide réduit les effets de floc et maintient la
diffusion du substrat vers les cellules. Or le protocole d’injection sur le chantier ne peut se faire
en continu et donc ne peut pas maintenir un brassage des fluides. En effet, ces conditions
d’injections favorisent un fort lessivage des cellules hors du système ainsi qu’une diminution des
échanges chimiques. Ce sont les raisons pour lesquelles les colonnes de sables sont injectées en
mode semi continu. Ce mode implique une immobilisation des fluides au sein du système
poreux. L’évaluation de l’activité enzymatique cellulaire dans ces conditions c'est-à-dire sans
agitation est donc nécessaire.

Pour cela, une étude de l’influence des ions calcium sur l’activité enzymatique en
fonction de l’agitation du milieu a été réalisée avec une même gamme de solution calcifiante.
Deux conditions ont été retenues pour évaluer cette influence, un état dynamique et un état
statique. Les mesures de l’activité enzymatique cellulaire en solution calcifiante en présence de 1
M d’urée, sont comparées avec une suspension bactérienne de D.O 4.25, une activité
enzymatique (A.E) de 568 µS/cm/min soit une A.E.S estimées à 1.93 mM urée/min/DO.

160

140
Figure n°75 : Suivi de
120
Urée hydrolysée (mM)

l’hydrolyse de l’urée avec et

100 sans agitation.
80 Avec agitation
Sans agitation
60

40

20

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

Temps (min)

185
Chapitre V. Les premiers essais.

Le suivi de l’hydrolyse de l’urée a été réalisé pendant 240 minutes (Figure n°75). Les
deux courbes présentent deux phases. La première phase (0-60 minutes), commune aux deux
conditions) est caractérisée par une absence de détection de l’ammonium. La seconde phase
quant à elle, présente une production d’ammonium d’intensités différentes selon qu’il y a ou non
de l’agitation.
Sans agitation, l’hydrolyse de l’urée, n’est perceptible qu’après 60 minutes de contact,
alors qu’avec agitation, elle débute entre 20 et 40 minutes, ce qui est trois fois plus précoce.
L’hydrolyse est également plus rapide (700 µM d’urée par minute) que sans agitation (vitesse 60
% plus faible soit 300 µM d’urée hydrolysée par minute). La seconde phase, avant ou sans
agitation, est marquée par une période de ralentissement de l’hydrolyse pendant
approximativement une heure, immédiatement suivie d’une reprise de l’hydrolyse avec à peu
près les mêmes vitesses. La teneur en NH4+ en fin d’expérience dans les conditions statiques est
de 30 % plus élevée que celles en condition dynamique ; avec un taux d’hydrolyse de l’urée de
12% en condition statique et 8 % en condition dynamique. Ce taux de conversion de l’urée se
caractérise par une instabilité (R2 = 0.97) plus forte en condition statique quand condition
dynamique (R2 = 0.99). La faible A.E.S de la suspension, associée à une inhibition par excès de
substrat peut expliquer ce temps de retard d’hydrolyse. D’autre part, un facteur 3 de différence
existe entre ce qui a été estimé par l’hydrolyse de l’uréase et ce qui est mesuré en condition
réelle.
Lorsque cette solution de biomasse est placée dans différentes concentrations de calcium
(0.05, 0.25, 0.5 et 1 M), ces premières tendances sont confirmées (Figure n°76). Les courbes du
suivi de l’hydrolyse en présence de calcium semblent s’accentuées par rapport aux courbes
témoins. En effet, les deux tendances se dégagent quelles que soient les conditions
expérimentales, mais la phase d’acclimatation est de plus en plus longue lorsque l’on augmente
la concentration en calcium. La seconde phase est un accroissement quasi linéaire de l’hydrolyse
de l’urée pendant toute la durée de l’expérience et là, varient les vitesses d’hydrolyse. De plus,
la tendance au tassement des courbes s’inscrit moins dans la durée lorsqu’il s’agit de conditions
statiques sauf dans le cas de concentration très élevée (1 M). Les vitesses d’ hydrolyse sont elles
aussi plus élevées sans agitation, jusqu’à 1 M de calcium (Tableau n°74, Figure n°77). Dans les
conditions de cette expérience, l’absence d’agitation est plus favorable à l’hydrolyse de l’urée
sauf dans le cas de 1 M de sel de calcium.

160 160

Avec agitation + [Ca(NO3)2 ] 0.05 M Avec agitation + [Ca(NO3)2 ] 0.25 M

140 140
Sans agitation + [Ca(NO3)2 ] 0.05 M Sans agitation + [Ca(NO3)2 ] 0.25 M

120 120
Urée hydrolysée (mM)

Urée hydrolysée (mM)

100 100

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
Temps (min) Temps (min)

186
Chapitre V. Les premiers essais.

160 160

140 140

120 Avec agitation + [Ca(NO3)2 ] 0.5 M 120

Avec agitation + [Ca(NO3)2 ] 1 M
Urée hydrolysée (mM)

Sans agitation + [Ca(NO3)2 ] 0.5 M

Urée hydrolysée (mM)

100 100
Sans agitation + [Ca(NO3)2 ] 1 M

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

Temps (min) Temps (min)

Figure n°76 : Suivis de l’urée utilisée au cours du temps en fonction de la concentration en

calcium.

Tableau n°74 : Récapitulatif des vitesses d’hydrolyse de l’urée en fonction de la concentration

en calcium à température ambiante en condition statique et dynamique pendant 30 à 240 min

Tableau des vitesses d’hydrolyse sans et avec agitation

Concentration
utilisée 0 0.05 0.25 0.50 1.00
Ca(NO3)2 [M]
Vitesse
d’hydrolyse
de l’urée en 570 690 430 410 120
µmol/min
statique
R2 0.97 0.94 0.95 0.94 0.8
Vitesse
d’hydrolyse
de l’urée en 370 320 110 370 350
µmol/min
dynamique
R2 0.98 0.79 0.76 0.99 0.93

187
Chapitre V. Les premiers essais.

Vitesse d'hydrolyse de l'urée en condition statique

Vitesse d'hydrolyse de l'urée en condition dynamique
1.0
1.0

0.8
0.8
Vitesse d'hydrolyse urée (mM/min)

Vitesse d'hydrolyse urée (mM/min)

y = 0.6288 - 0.5006*x; r² = 0.9084

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 0.2

0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
[Ca(NO3)2] M [Ca(NO3)2] M

Figure n°77 : Les vitesses d’hydrolyse en fonction de la concentration en calcium, à partir de

30 minutes et jusqu’à la fin de l’expérience

La vitesse d’hydrolyse de l’urée décroit rapidement en condition statique. La

réduction de la vitesse d’hydrolyse est en moyenne de 500 µM d’urée hydrolysée par minute
pour 1 M de calcium. Elle se stabilise autour de 100 µM d’urée hydrolysée par minute en fin
d’expérience. Lorsque l’agitation est suffisante la vitesse moyenne d’hydrolyse durant ce pas
de temps, semble se maintenir quelle que soit la concentration de la solution de calcium
utilisée (R2 = 0.027). En effet, la vitesse d’hydrolyse se stabilise autour de 350 µM d’urée
hydrolysée/min. Cela signifie une relation d’indépendance entre la faculté d’hydrolyse de
l’urée et la teneur en calcium dans les solutions testées pendant ce laps de temps. En effet, le
brassage permet de maintenir un accès à l’urée en évitant un encroutement de la cellule. Au
demeurant, les conditions expérimentales ne montrent pas d’arrêt de l’hydrolyse ; en effet, la
phase III n’est pas observée, cependant la durée de l’expérience n’a peut-être pas été
suffisante. Enfin, l’activité enzymatique moyenne en dynamique et en présence d’une source
de calcium est 5.5 fois plus faible que celle estimée en début d’expérience.

Une première hypothèse décrivant l’ensemble de ce processus physiologique serait la

suivante. Les facultés cellulaires d’hydrolyse sont étroitement dépendantes de la présence
d’ion calcium dans son micro environnement. Les concentrations physiologiques favorisent
un meilleur taux d’hydrolyse de l’urée, mais en contre partie ne déclenchent pas de réaction
de stress. La conséquence est l’apparition d’une concentration calcique intracellulaire plus
élevée mais en dessous du seuil de toxicité. La conséquence directe est une inhibition plus
importante des étapes d’hydrolyse de l’urée. Lorsque les ions calcium sont plus concentrés
dans l’environnement, ils provoquent une dépolarisation membranaire ainsi qu’une cascade
de réactions qui aboutit à une détoxification cellulaire, très énergétivore. En effet, la cellule
bactérienne doit maintenir un potentiel de membrane suffisant pour limiter l’influx de
calcium. Une partie de cette énergie, nécessaire au maintien du potentiel membranaire,

188
Chapitre V. Les premiers essais.

provient de la pompe membranaire ATPase/NH4+ (Jahns, 1996). Elle utilise les ions
ammonium issus de l’hydrolyse de l’urée pour entretenir le gradient de concentration du
calcium. Cette réaction produit une acidification locale dans le nano environnement cellulaire
grâce aux pompes ATPase Ca 2+ / 2H+ (Mac Connaughey et al ., 1997). Selon Hammes et
Venstraete (2002), une des conséquences lorsque de fortes concentrations en calcium sont
présentes est la réduction temporairement de l’encroutement cellulaire. Ceci est en accord
avec ce qui a été observé au microscope photonique (objectif X 80) sur un prélèvement de
floc issu d’une suspension bactérienne dans une solution calcifiante de 1 M en sortie de
colonne (Figure N°78).

Figure n°78 : Présence

simultanée de bactéries
Bactéries
libres et de bactéries
Bactéries libres encroutées avec une
encroûtées
solution calcifiante 1 M.

10µm

En effet, les vitesses d’hydrolyse en présence de fortes concentrations de calcium sont

donc plus sujettes à être élevées et cela jusqu’à l’épuisement du potentiel enzymatique et
physiologique. De ce fait, les solutions calcifiantes très concentrées produiront un important
efflux de carbonates, sans qu’ils se déposent obligatoirement sur la cellule.
Généralement, la précipitation des ions calcium et des ions carbonates se fait à
l’extérieur de la cellule et crée une couche de carbonate de calcium qui entoure la cellule petit
à petit. Ceci a pour effet immédiat de limiter la pénétration de l’urée et des ions calcium dans
la cellule bactérienne. Ainsi, la vitesse d’hydrolyse diminue fortement et lentement en raison
d’une indisponibilité progressive en substrat. En effet, ces phénomènes de limitation de la
diffusion et de stress physiologique consécutifs aux fortes concentrations en urée-calcium
sont des explications possibles à la baisse de l’activité enzymatique en condition statique en
présence de fortes concentrations en ions calcium.
Ainsi, l’activité enzymatique est dépendante du niveau d’agitation du milieu et un
environnement statique est moins favorable au maintien de l’hydrolyse de l’urée qu’un milieu
agité. La phase d’adaptation y est deux fois plus longue et le phénomène d’inhibition plus
intense aux fortes concentrations.

Il est difficile de comparer le « statique » (qui correspond en fait à une diffusion) et le

« dynamique » tels qu’ils ont été réalisés dans cette expérience avec ce qui se passe dans une
colonne soumise au procédé de bio calcification. L’injection est suivie d’une période de batch
pendant laquelle les cellules bactériennes sur les grains de sable sont mises en contact avec le
liquide calcifiant et donc avec des concentrations élevées en ions calcium. Au début du batch,
la concentration du liquide calcifiant est uniforme en tous points de l’espace concerné par
l’injection. Les concentrations en ions calcium varient pendant la durée du batch sous
l’influence de l’activité bactérienne. Il apparaît alors une diminution progressive de la
concentration en ions calcium, en même temps que l’inhibition sur l’uréase diminue.

189
Chapitre V. Les premiers essais.

L’uréase cellulaire subit donc les variations de concentrations en ions calcium telles qu’elles
ont été testées dans cette expérience.

Cette étude tend aussi à montrer également que l’activité enzymatique mesurée en
dynamique dans une solution d’urée (sans calcium) produit nécessairement une surestimation
du potentiel d’hydrolyse de la suspension bactérienne à injecter par rapport à ce qui se passera
dans le sous-sol (l’action inhibitrice de la température du fond voisine de 12° C
s’additionnera). C’est la raison pour laquelle une estimation de l’activité enzymatique
d’hydrolyse en présence d’une solution calcifiante est proposée. En effet, compte tenu des
résultats précédent, la relation initiale qui reliait la variation de la conductivité par une
quantité d’urée hydrolysée ne soit plus 1mS = 14.4 mM d’urée hydrolysée par minute mais de
2.8 mM d’urée hydrolysée/min en dynamique pour une concentration en calcium de 0.25 à 1
M. Cette relation a été divisée par un facteur de 5.

Par contre, pour élaborer une estimation plus précise de l’hydrolyse de l’urée en
statique, d’autres essais auraient été nécessaires notamment une étude complète de l’effet du
calcium à différentes concentrations d’urée. Ces études qui auraient demandé beaucoup de
temps n’ont pu être réalisées au cours du programme de recherche qui a privilégié un axe de
mise en œuvre plus industrielle. Malgré cela, pour compléter l’étude sur le processus
d’hydrolyse de l’urée, des tests ont été entrepris concernant l’impact des solutions utilisées
sur la stabilité de l’urée. En effet, d’autres facteurs peuvent présenter des propriétés
d’inhibition ou d’activation de l’hydrolyse. Ainsi une analyse des effets de la suspension
bactérienne sans cellules et de flocs a été entreprise. Les tests ont été réalisés avec le
protocole de mesure de l’activité enzymatique. La seule différence est que les 3 ml de
suspension de biomasse ont été remplacés par 3 ml de solutions tests. Le suivi de la variation
de conductivité au cours de temps est présenté dans le Tableau n°75.

Tableau n°75 : Les différentes conditions testées pour évaluer l’impact de la solution
calcifiante.

Récapitulatif des essais de mesure

Impact des solutions
Solutions testées
sur la solution d’urée. Remarques et interprétations

Suspension sans
bactérie (surnageant de 20 ou 0.28 mM d’urée Présence d’uréase libre dans
centrifugation pH = hydrolysée/min les suspensions.
9.2).
Mélange d’une Variation de la conductivité
solution de Ca (NO3)2 forte mais elle devient nulle à T
avec une solution de = 10 min.
394 µS/cm/min
NaOH donne des Une probable hydrolyse de
hydroxydes de calcium l’urée due aux fonctions
(Ca (OH) 2), Ca(HCO3)2 hydroxydes

190
Chapitre V. Les premiers essais.

Très faible diminution de la

NaOH (pH = 12) 2 ou 0.028 mM d’urée
conductivité. Les ions OH- ont
pH = 9 solution mesurée hydrolysée /min
peu d’impact.
Pas d’autolyse de l’urée
Urée 1M
0 durant ce laps de temps
pH = 8.15
(5 min)
Pas de variation de conductivité
Solution calcifiante
0 donc pas d’hydrolyse de l’urée
CaCl2 (pH ≈ 7.6) et urée
pendant ce laps de temps

La lyse chimique de l’urée est une réaction spontanée mais lente qui dans le cadre du
procédé ne doit pas intervenir. L’urée hydrolysée observée ici, proviendrait de deux sources
identifiées. La première est l’action de l’uréase extracellulaire dans la suspension. La seconde
source suspectée proviendrait de la présence des hydroxydes de calcium (Ca (OH)2, Ca
(HCO3)2 ) sous forme de floc. Ces derniers apparaissent lorsque la suspension bactérienne
(pH = 9.2) rencontre une solution de calcium. Lorsque ces flocs sont soumis à une
acidification, un léger bullage se produit, ce qui indique la présence de carbonate de calcium.
L’origine de celui-ci pourrait être l’hydrolyse de l’urée par les hydroxydes. Il s’agit d’un
mécanisme mal connu et ceci d’autant plus lorsqu’il s’agit de cristaux hydroxyde de calcium
amorphe en présence d’urée. Mais, la structure des cristaux en hydroxyde favorise
l’hydrolyse de l’urée, très probablement grâce à la réactivité du doublet libre de l’oxygène. La
présence de ces cristaux augmenterait donc la probabilité d’agencement moléculaire favorable
à cette hydrolyse. Ces deux sources « d’hydrolyseurs » vont intervenir en favorisant la
formation de floc au cours de l’injection dans le système poreux, ce qui est indissociable de
ce procédé.

Les premiers essais sur le comportement de l’hydrolyse en présence de calcium ont

permis de mettre en évidence l’impact des fortes concentrations ainsi qu’une durée de « vie »
du potentiel enzymatique dans des conditions dynamique ou statique. Par contre un paramètre
important concerne le maintien de l’activité enzymatique au cours de la mise en place de la
biomasse et durant la phase de batch dans le système poreux. En effet, la bactérie S. pasteurii
est un micro-organisme aérobie connu pour sa capacité à synthétiser une grande quantité
d’enzyme de type uréase. Cette synthèse se réalise essentiellement en fin de phase
exponentielle lorsque les conditions de milieux de culture sont encore favorables et comme
toute protéine, l’uréase possède une durée de vie au sein de la cellule. Cette durée de vie
détermine le maintien du pool enzymatique au sein de la cellule et par extension au sein de la
suspension de biomasse donc de la colonne. En effet le taux de renouvellement (turn-over)
de l’enzyme est fortement dépendant de l’état physiologique de la cellule et donc, des
conditions environnementales. Il est important de dégager une tendance générale du maintien
de l’activité enzymatique (A.E) en conditions de chantier avant de procéder aux essais
d’injections.

191
Chapitre V. Les premiers essais.

V. DETERMINATION DU MAINTIEN DES ACTIVITES ENZYMATIQUES ET

DE L’ACCROCHE DES BACTERIES EN COLONNE.

Cette analyse a pour objectif d’étudier l’évolution de la D.O. cellulaire et de l’activité

enzymatique en fonction du temps (24 H et 48 H) aux températures de 12° C et 20° C. Le
procédé de bio calcification dépend de la présence de l’uréase en quantité suffisante et de son
maintien au sein de la cellule. Les exigences de chantier sont très éloignées des conditions
optimales de laboratoire qui sont favorables au développement et au maintien de l’activité
enzymatique cellulaire. Les principaux paramètres « biologiques » sont résumés dans la
Figure n°79.

Figure n°79 : Les

principaux paramètres
contrôlant la synthèse et
le maintien du pool
enzymatique

Les conditions de chantier ayant un impact potentiel sur l’activité enzymatique des
bactéries, sont les suivantes :
• la gamme de températures d’application entre 12° C et 20° C,
• la durée de la mise en place des bactéries, jusqu’à 12 heures d’injection,
• la durée d’application des passes du milieu calcifiant jusqu’à 48 heures,
• les conditions anoxiques,
• la diminution des surfaces d’échanges entre les bactéries libres et celles qui sont
accrochées sur un support.

Pour étudier certains de ces effets, vingt quatre petites colonnes ont été élaborées pour
quantifier l’effet du temps (24 et 48 heures) et de la température (12° C et 20° C) sur l’activité
enzymatique et la D.O. cellulaire (Tableau n°76). Ces colonnes sont constituées d’un tube en
plexiglas de 1.0 cm de diamètre intérieur et 30 cm de haut. Elles ont été injectées au débit de 6
ml/mn soit une vitesse réelle de 9 m/h avec une suspension de biomasse de référence, de
D.O600 4.4 et d’activité enzymatique de 441 µS/cm/min soit une A.E.S de 1.4 mM d’urée
hydrolysée par minute. Cette vitesse d’injection élevée permet de diminuer le temps de mise
en place des bactéries et de ne pas réchauffer les colonnes à 12° C lors de l’injection. En effet,
les colonnes initialement «12° C» ont été placées au préalable à cette température pendant 24
heures dans l’armoire réfrigérante avant injection de la biomasse et ceci pour se rapprocher au
mieux des conditions de chantier. La suspension de biomasse contenue dans la colonne est
recueillie par le « flushage » de cette colonne avec 1 V.p d’eau déminéralisée injectée aux
vitesses de chantier. Les mesures de la D.O600 et de l’activité enzymatique sont réalisées dans
les conditions standard (Urée : 1 M, 20° C, 5 min) et immédiatement en sortie de colonnes.
Les mesures de D.O.600 des échantillons en sortie de colonnes sont représentées dans la
Figure n°80.

192
Chapitre V. Les premiers essais.

Tableau n°76: Récapitulatif

Temps Nombre de des caractéristiques des
Identifiant Température
de batch réplica colonnes.

A 24 h 12° C 3
B 24 h 12° C 3
C 24 h 20° C 3
D 24 h 20° C 3
E 48 h 12° C 3
F 48 h 12° C 3
G 48 h 20° C 3
H 48 h 20° C 3
Total des colonnes 24

Figure n° 80 : D.O.
Fixation de la D.O.
cellulaire fixée dans les
colonnes à 12° C et 20° C
5
au temps de batch de 24
4.5
4
et 48 heures. La
3.5 suspension « entrée»
D . O . c e llu la ir e

3 correspond à la D.O. de
2.5 D.O. référence.
2
1.5
1
0.5
0
MILIEU 24 h 12°C 24 h 20°C 48 h 12°C 48 h 20°C
ENTREE

Celle-ci montre une fixation de la D.O. de l’ordre de 50 % pour les colonnes à 12° C
après 24 et 48 heures de batch. Par contre, elle est de 25% lorsque les échantillons sont placés
à 20° C quel que soit le temps de batch. Les échantillons à 12° C présentent une plus faible
dispersion des résultats par rapport à ceux placés à 20° C, ce qui tend à montrer une meilleure
stabilité biologique et une meilleure accroche cellulaire à 12° C qu’à 20° C. Les activités
enzymatiques en sortie de colonnes (Figure n°81) sont comparées à celle de la suspension de
biomasse avant injection soit 441 µS/cm/min (6.3 mM d’urée hydrolysée par minute). Les
échantillons placés à 12° C présentent les activités enzymatiques les plus élevées. On observe
une légère augmentation de l’activité enzymatique entre 24 et 48 heures à 12° C. Ce
phénomène s’inverse à 20° C.

193
Chapitre V. Les premiers essais.

Activités enzym atiques en sortie de colonne

500
450
400 Figure n°81 : Maintien
A.E ( µS/min)

350
300
des activités enzymatiques
250 A.E dans les colonnes à 12° C
200 et 20° C après 24 et 48
150
100 heures.
50
0
MILIEU 24 h 12°C 24 h 20°C 48 h 12°C 48 h 20°C
ENTREE

Le maintien de l’activité enzymatique des échantillons par rapport au milieu de

référence à 12° C et 20° C en fonction du temps de batch est représenté dans la Figure N°82.

M aint ien de l' activité enzymatique à 24 et 48 M aitien de l'activité enzymatique à 24 et 48

heures à 12°C heures à 20°C

100,0 100,0
24h 12°C

90,0
48h 12°C 90,0 24h 20°C
48h 20°C
80,0 80,0

70,0 70,0

60,0 60,0

50,0 50,0

40,0 40,0

30,0 30,0

20,0 20,0

10,0 10,0

0,0 0,0

Figure n°82 : Maintien de l’activité enzymatique à 24 et 48 heures pour

les colonnes placées à12° C et à 20° C
.

Pour les colonnes placées à 12° C, l’activité enzymatique est maintenue autour de 65
% par rapport au milieu de référence. Elle est divisée par deux à 20° C après 24 et 48 heures.
Les colonnes placées à 12° C donnent une meilleure accroche cellulaire et permettent un
meilleur maintien des activités enzymatiques. Les bactéries s’accommodent mieux des
conditions de stress présentes dans la colonne (stress anoxique, épuisement du milieu…) à
basse température. Les colonnes représentent en effet, des environnements hostiles pour la
bactérie. Les conditions rapidement anoxiques et toxiques de la suspension bactérienne ne

194
Chapitre V. Les premiers essais.

permettent pas un maintien des conditions initiales quels que soint la température et le temps
de batch de cette expérience.
Les mesures ont montré que les suspensions maintiennent près de la moitié de leur
D.O. cellulaire à 12° C, et près de 65 % de leur activité enzymatique initiale pendant 48
heures. A 20° C, l’activité enzymatique se maintient autour de 25 % sur les 48 heures avec
une D.O. cellulaire fixe, de l’ordre de 25 %.
Dans les conditions de chantier, il pourrait être souhaitable que le temps de séjour des
bactéries dans le sous-sol soit inférieur à 24 heures pour obtenir une calcification performante.
Cependant ceci pourrait être contrebalancé par des suspensions bactériennes plus riches ou
plus actives. D’autre part, il est important de noter que le sous-sol regorge d’éléments
(biologiques et physico-chimiques) susceptibles d’amoindrir ou d’intensifier ces
performances.

VI. CONCLUSIONS SUR LES PREMIERS ESSAIS D’INJECTION.

L’objectif de ces premiers essais d’injection était l’établissement d’un état des lieux du
procédé de bio calcification pour faire évoluer celui-ci vers une utilisation industrielle. Ils ont
effectivement permis d’œuvrer dans la compréhension du processus et de dégager les
principaux paramètres utiles pour une application sur chantier.

En premier lieu, les zones de sables consolidées correspondent effectivement avec le

lieu de dépôt de la biomasse. Cette relation « bactéries-carbonate produit » s’identifie dans
l’espace et dans le temps, mais est déplacée lorsque le système poreux est fortement perturbé,
comme c’est le cas au moment des injections. En effet, les vitesses d’injection sur chantier
(0.2 m/h) suffisent à provoquer le déplacement du potentiel enzymatique par décrochage des
corps bactériens.

Par ailleurs, le dépôt de biomasse est particulièrement sensible au type de sable. En

effet, pour une granulométrie similaire et un état de compactage identique l’angulosité, les
anfractuosités du sable ainsi que la présence de fines sont des critères déterminants pour la
fixation et le maintien des bactéries. De surcroît, un autre phénomène contribue également
activement au processus de fixation. En effet, lors de l’injection du premier volume de pore de
la solution calcifiante, des flocs se forment au contact de la suspension bactérienne. Cette
réaction piège les bactéries dans une matrice amorphe qui favorise en fonction des vitesses
d’injection soit l’accroche, soit le lessivage des grains de sables. L’accroche est
particulièrement efficace lorsque les vitesses sont faibles (0.05 m/h) quel que soit le type de
sable utilisé. Par contre, en conditions de chantier, les vitesses augmentent le phénomène de
fragmentation et de dispersion du précipité au sein de la colonne. Or ces fragments sont autant
de zones où s’opèreront les fortes précipitations et donc la consolidation du sable, créant ainsi
un enchevêtrement de blocs dans la colonne. Ce point est d’une importance cruciale car il
participe activement à l’hétérogénéité de la bio calcification. Ce phénomène est accentué par
la tendance naturelle des sables fins à jouer un rôle de filtre sur les bactéries. Ainsi, deux
sources d’hétérogénéité se superposent, créant un gradient de concentration de « biomasse –
floc » discontinu dans le sens de l’injection entre l’entrée et la sortie de colonne, avec une
zone de lessivage au niveau du point d’injection. En revanche, ce phénomène peut être
contenu si une phase d’immobilisation de fluide est opérée après chaque injection de volume
de pore (temps de batch).

195
Chapitre V. Les premiers essais.

L’analyse de ces phénomènes doit également prendre en compte, le comportement des

bactéries et de leur activité vis-à-vis des fortes concentrations urée – calcium. En effet, une
diminution de l’activité enzymatique de façon linéaire se produit au contact de la solution
calcifiante. Celle-ci est liée à une phase d’acclimatation des bactéries à leur nouvel
environnement qui peut durer une ou deux heures. Ces premières estimations de l’effet du
calcium sur l’activité enzymatique mettent en évidence que le temps de contact avec la
solution calcifiante ne correspond pas à celui de l’hydrolyse. En effet, elle est fortement
dépendante de l’état d’agitation du milieu et de la concentration en urée-calcium. Ces données
ont permis d’évaluer, en première approximation, une vitesse d’hydrolyse moyenne 5 fois
moindre en présence de calcium.

A cela s’ajoute, un potentiel enzymatique étroitement dépendant du temps de séjour

des bactéries dans la colonne. En effet, une perte de l’ordre de 40 % du potentiel enzymatique
de la colonne a été identifiée sur 48 heures à 12° C. Par contre, une diminution de l’activité
peut atteindre entre 60 à 80 % entre 24 et 48 heures à 20° C. Cette réduction d’activité est
certainement dûe aux conditions de stress anoxique et d’accumulation de toxines dans la
suspension bactérienne.

VII. IMPACT DES PREMIERS ESSAIS SUR L’INDUSTRIALISATION DU

PROCEDE.

Dans l’état actuel des connaissances, l’effet des vitesses élevées (0.2 m/h) de chantier
ne semblent pas favorables au processus de bio calcification et ceci est aggravé par un nombre
important d’injections. Ainsi, ils induisent des zones de lessivage au niveau des points
d’injection et de pompage qui correspondent à la présence de sables non consolidés. Par
conséquent, les zones fortement consolidées seront celles qui auront les plus faibles vitesses.
En effet pour un même nombre de volume croissant, l’importance du lessivage sera croissante
au fur et à mesure de l’augmentation des vitesses et deviendra maximale à l’endroit où la
distance entre l’entrée des fluides et la sortie est la plus courte.

Le second phénomène à prendre en compte concerne les propriétés filtrantes des

sables. En effet, le dépôt de biomasse semble se concentrer autour du point d’injection. Cet
effet, peut être nuancé par les vitesses d’injection ou/et les volumes de pores de solution
calcifiante appliqués. Ainsi, le phénomène de décrochement de la biomasse par les flocs peut
être utilisé si elle ne sort pas de la zone à consolider. En effet, les flocs possèdent un grand
potentiel enzymatique susceptible de cimenter d’autres zones à condition d’appliquer une
phase d’immobilisation des flocs pendant la séquence d’injection.

Enfin, un troisième événement est à prendre en compte puisqu’il concerne le maintien

des activités enzymatiques qui est contrôlé par de nombreux facteurs. Pour ne pas perdre le
potentiel enzymatique, il est recommandé de ne pas excéder une mise en place des bactéries
au delà de 24 heures. Une perte du potentiel d’hydrolyse pourrait ne pas se résoudre par une
simple augmentation du temps de batch, car, le matériel biologique risque de subir un stress
plus important dû à la solution calcifiante.

196
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

CHAPITRE VI

ETUDE DE LA BIOCALCIFICATION.

I. MISE EN PLACE DE BATCHS DE DUREES INFERIEURES A

24 HEURES ET IMPACT SUR L’ADHESION DES BACTERIES ET SUR
LEUR ACTIVITE ENZYMATIQUE (20° C). 198

1. Contexte biologique pour la mise en place de batch. 198

2. Détermination de l’effet d’un batch sur l’adhésion de la biomasse en colonne simple. 199
3. Implications sur les conditions d’application en chantier. 203

II. AMELIORATION DE L’ADHESION BIOLOGIQUE DE S. pasteurii. 205

1. Contexte d’un développement du pouvoir d’adhésion de S. pasteurii. 205

2. Développement de l’amélioration de l’adhésion. 206
2.1. Amélioration par ajout d’inuline lors de la production de biomasse. 207
2.2. Amélioration par ajout d’inuline à la fin de la production de biomasse. 207

III. AMELIORATION DE LA SOLUTION CALCIFIANTE. 215

1. Etude des premières étapes de la formation des cristaux. 215

2. Impact d’une solution calcifiante non équimoléculaire. 218
3. Impact de la réinjection de la solution calcifiante. 220
4. Impact de l’ajout d’inuline dans la solution calcifiante. 220

IV. CHOIX DU SEL DE CALCIUM (CaCl2 ou Ca(NO3)2) LE PLUS PERFORMANT

POUR OBTENIR UNE BIO CALCIFICATION MAXIMALE. 227

1. Introduction. 227
2. Impact de la nature du sel de calcium sur les résistances à la RC. 228
2.1. Le protocole expérimental. 228
2.2. Détermination des facteurs essentiels agissant sur la bio calcification et
leurs interactions. 229
2.3. Impact de la nature du sel de calcium sur la bio calcification. 239
2.4. Impact de la nature du sel de calcium en fonction des activités
enzymatiques. 242
2.4.1. Impact sur les RC et les teneurs en CaCO3. 242
2.4.2. Impact sur le rapport CaCO3/RC. 243
2.4.3. Impact sur le taux de précipitation (CaCO3 mesuré/CaCO3
théorique) et sur les vitesses d’hydrolyse de l’urée. 245
3. Visualisation statistique des performances de la biocalcification en fonction de
la nature du sel de calcium. 248
3.1. Visualisation statistique des performances avec le chlorure de calcium. 249
3.2. Visualisation statistique des performances avec le nitrate de calcium. 250
4. Visualisation au MEB de l’impact de la nature du sel de calcium sur les cristaux
de carbonate de calcium produits. 252
5. Conclusion sur l’impact de la nature du sel de calcium sur la bio calcification. 256
6. Choix du sel de calcium pour une application de chantier. 256

V. IMPACT DES BASSES TEMPERATURES SUR LA BIO CALCIFICATION. 261

197
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

I. MISE EN PLACE DE BATCH DE DUREES INFERIEURES A 24 HEURES

ET IMPACT SUR L’ADHESION DES BACTERIES ET SUR LEUR
ACTIVITE ENZYMATIQUE (20° C).

1. Contexte biologique pour la mise en place de batch.

Le mécanisme d’adhésion des bactéries est fondamental pour l’application en

conditions de chantier. En effet, le procédé repose sur l’accroche dans un milieu poreux
constitué de grains de sable et d’eau interstitielle, des bactéries en nombre suffisant, pour
déclencher une bio calcification efficace pour solidariser les grains de sable entre eux. Ce
processus se déroule en deux étapes. La première, de cinétique rapide et réversible fait appel à
des forces physico-chimiques telles que les interactions électrostatiques et hydrophobes. La
seconde étape, plus lente, est un processus biologique de consolidation de l’attachement.
L’ensemble de ce processus peut durer de quelques dizaines de minutes à plusieurs heures et
leur connaissance est nécessaire pour déterminer les conditions d’application du procédé sur
le chantier. Ces informations pourront permettre de développer des méthodes et des
recommandations d’injection pour favoriser ces mécanismes d’adhésion, telles que la durée
du temps de batch, la valeur minimum de la D.O.600 et d’activité enzymatique ou phasage
d’injection. Par ailleurs, les premières simulations d’une application chantier du processus de
bio-calcification ont permis d’établir une gamme de vitesse réelle d’injection allant de 0.2 m/h
à 0.6 m/h. Or, ces vitesses d’injection de la solution calcifiante, ne favorisent pas l’hydrolyse
de l’urée en injection continue. Deux raisons principales semblent en être la cause ; un
décrochage excessif de bactéries de leur support et une dynamique des fluides peu propice à
une diffusion de la solution calcifiante à l’échelle cellulaire. A la suite de ces observations, il
a été nécessaire d’introduire la notion de batch pour améliorer l’adhésion et la diffusion de la
solution calcifiante tout en respectant les conditions de chantier.

Les surfaces cellulaires notamment celles des bactéries, sont chimiquement complexes
et hétérogènes. Les mécanismes d’adhésion des bactéries peuvent être divisés en deux modes
principaux. Le premier à agir, est sous le contrôle des interactions physico-chimiques du
milieu (force ionique, nature des sels dissous, température, agitation, nature du support) avec
les propriétés des parois bactériennes (degré d’hydrophobicité). Ce degré d’hydrophobicité
peut-être décrit par des interactions Acide - Base (AB) qui sont plus influentes que les forces
électrostatiques et que celles de Van der Waals (EW) (Chen et al., 2001). Ceci est de première
importance puisque les cellules bactériennes sont globalement chargées négativement
(Marshall, 1980) et que les propriétés de la surface des grains de sable changent au fur et à
mesure de l’injection de la biomasse. En effet, le coefficient de dépôt évolue au fur et à
mesure du recouvrement de la surface siliceuse par les bactéries, par les molécules organiques
de faibles poids moléculaire, hydrophobes. Cette accumulation réduit les interactions
négatives entre le grain de sable et la bactérie par la formation d’un film favorisant cette
première étape d’adhésion (Chen et al., 2001 ; Tufenkji et al, 2003). Cette phase est dite
passive car elle ne fait pas intervenir directement un phénomène biologiquement actif. Par
ailleurs, ces interactions physico - chimiques peuvent être associées à des processus de
filtrations mécaniques. Ces derniers dépendent à la fois des caractéristiques granulométriques
du sable, et de son état de compaction, et de celles du micro-organisme (taille et forme). Cette
première phase doit être prise en compte dans sa globalité puisqu’il s’agit d’une injection en
milieu poreux de type sable fin avec une souche en forme de bâtonnet. Par ailleurs, un rôle
non négligeable dans le processus d’adhésion passif a été également attribué au flagelle qui

198
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

peut atteindre 1 à 2 µm de long pour 5 à 25 nm de diamètre (Fletcher et al., 1983 ; Kogue,

1989).

La seconde étape du processus d’adhésion est elle, irréversible. En effet, les cellules à
la surface du support se mettent à sécréter des exo polysaccharides (EPS) ou adhésines qui
verrouillent l’adhésion pour la rendre irréversible. Pour cela, un temps de contact prolongé
avec le support est nécessaire. Cette phase, extrêmement importante puisqu’elle pourrait
limiter lessivage, se produit de préférence durant une phase d’immobilisation des fluides
injectés.

Ainsi, la mise en place d’un temps de batch adéquat pourrait augmenter les
performances de la bio calcification de deux manières, d’une part du fait de l’augmentation de
l’adhésion et d’autre part de l’amélioration de la distribution des bactéries au sein de la
colonne. La bio calcification serait ainsi plus homogènement répartie dans le sable.

S. pasteurii possède un flagelle, qui lui permet potentiellement des mobilités

relativement élevées au sein de la porosité. D’après Harwood et al. (1989), il est possible que
des bactéries puissent atteindre des vitesses de 44 µm/s sur des durées de 1à 3 secondes avant
de s’arrêter et éventuellement de changer de direction. Ceci conduirait à des distances
linéaires de 50 à 150 µm. Ces performances décroissent en fonction du degré de tortuosité du
milieu poreux (Barton et al., 1995). D’après Sharma et al. (1994) qui ne tiennent pas compte
du taux de compaction, le taux de pénétrabilité des bactéries en milieu poreux est corrélé avec
le diamètre des particules, notamment lorsque le diamètre se situe est entre 0.1 et 0.281 mm.
Au-delà, le taux de pénétration est indépendant de la taille des particules. Or, le sable utilisé,
le sable de Fontainebleau, possède un d10 à 0.15 mm et un d85 à 0.32 mm. Il y a donc une
possibilité de mise en contact et d’adhésion.

Par ailleurs, le pouvoir d’adhésion de la plupart des microorganismes diminue avec

l’augmentation du pH. En effet, pour elles, le maximum d’adhésion est estimé pour une
gamme de pH 5 à 7. Dans notre cas, S. pasteurii est une bactérie qui est alcalinophile et ne se
développe bien que lorsque le pH est supérieur à 8,5, et dont l’activité uréasique élève le pH
jusqu’à 9,5. Pour elle, on peut donc supposer que son adhésion puisse se faire à des pH de cet
ordre là. Ainsi, les suspensions bactériennes injectées sont autour d’un pH de 8.5 à 9. De plus,
un autre paramètre à prendre en compte est l’évolution du caractère hydrophobe de la souche
en fonction de la phase de croissance. Le degré d’hydrophobicité change au fur et à mesure de
sa croissance en relation avec la synthèse de l’enzyme uréase qui survient dans la fin de la
phase exponentielle. Cependant ce paramètre est peu influent dans la mesure où la suspension
de biomasse est toujours injectée lorsqu’elle atteint le début de la phase stationnaire.

2. Détermination de l’effet d’un batch et de sa durée sur l’adhésion de la

biomasse en colonne simple.

Pour quantifier, à température ambiante, ce phénomène d’accroche en milieu poreux,

en fonction de durées de batch variables (0 à 20 heures), neuf colonnes ont été réalisées avec
du sable de Fontainebleau. Les suspensions de biomasse ont été élaborées à partir d’un milieu
de culture de type SBF. La phase biologique privilégiée est la fin de la phase exponentielle car
elle se caractérise par un maximum d’activité enzymatique. Les colonnes ainsi testées ont été
injectées avec 1 V.p de suspension, suivi d’un batch, puis 2 V.p d’eau déminéralisée. Les
effluents en sortie de colonnes sont envoyés pour une mesure en continu de la D.O. cellulaire

199
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

(600 nm) par spectrophotométrie. Parallèlement des mesures d’activité enzymatique sont
réalisées toutes les 15 min en temps réel en sortie de colonnes (Tableau n°77). Le test de
suivi de la fixation des bactéries repose sur une moyenne de D.O. cellulaires de 1.2 ± 0.36, ce
qui correspond à 108 cellules/ml. Ces D.O. sont représentatives des suspensions injectées en
milieu poreux. L’accroche des bactéries a été déterminée en réalisant la différence de cumul
des D.O. cellulaires entre ce qui est entré et ce qui est sorti à la fin de chaque batch pour
chaque colonne.

Tableau n°77 : Les caractéristiques des neuf colonnes permettant de quantifier l’adhésion de
S. pasteurii sur les grains de sable en fonction de la durée d’un batch.

Caractéristiques des essais

Montage Colonnes de 0.2 m
Type sable Sable Fontainebleau NE 34
Sable d10 = 150 µm, d 50 = 205 µm, d 60 = 220 µm, d 90
d 10 d 50 d 60 d 90
= 320 µm
Nombre de colonnes testées 2 2 2 2 1
Durées de batch (h) 0 3 4 16 20
D.O cellulaire
1.4 1.42 1.02 0.97 1.70
Caractéristiques moyenne
de la biomasse A.E mS/min 0.70 0.2 0.69 0.45 0.2
Nombre de V.p 1
Nombre de V.p de solution de lavage
2 V.p
(H2O déminéralisée)

La Figure n°83 montre, que sans batch, le taux de fixation des bactéries sur le sable de
Fontainebleau NE 34 est faible (< 25 %), ceci constitue le témoin de cette expérience. La
fixation pour une durée de batch de 4 heures, augmente bien qu’elle reste encore en dessous
de 30 %. Cette différence est peu significative par apport aux témoins. Elle le deviendra
lorsque la durée de batch sera portée à 16 heures. Cependant, plus la durée de batch augmente,
plus l’écart type augmente. Ceci signifie une augmentation de l’instabilité du système
biologique qui semble très apparent pour un batch de 20 heures où le taux de fixation est très
faible, voisin de 10 %. Il faut cependant noter qu’il n’y a pas eu de dupliqua pour cette durée
de batch et qu’il peut donc s’agir d’un artefact.

100.00

90.00

80.00

70.00
Figure n°83 : Estimation du
TAUX DE FIXATION %

60.00
taux de fixation de S. pasteurii
50.00 en fonction de la durée de batch
40.00 en colonne de sable de
30.00
Fontainebleau NE 34.
20.00

10.00

0.00
0 3 4 16 20
BATCH (H)

200
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

Malgré cela, cette expérience montre que S. pasteurii peut résister à ces conditions
difficiles au moins pour des durées de batch allant jusqu’à 16 heures. Puisque le temps de
génération (Tg) de S. pasteurii est en moyenne de 2.5 heures, il n’est pas exclu que dans ces
conditions, une petite croissance se soit produite. Ceci est cependant peu probable dans la
mesure où le milieu de culture est épuisé. La résistance de la souche peut ne pas aller jusqu’à
la possibilité de reproduction, mais permettre l’activité uréasique nécessaire au procédé.

Au-delà de 16 heures de batch, des conditions anoxiques et une concentration plus

importante de déchets de métabolisme, toxiques pour les bactéries, pourraient expliquer le
décrochage cellulaire noté au bout de 20 h. Ceci est en accord avec les odeurs de putréfaction
apparues après ce délai. Par conséquent, à 20° C, une biomasse qui séjourne en colonne de
sable pendant un temps de près de six fois le temps de division cellulaire, risque fort de
conduire à une dégradation qualitative de la suspension et donc du processus de bio
calcification.
Il faut insister sur le paramètre température qui ici favorise la dégradation des
conditions de vie de la souche et qui ne correspond pas aux 12° C des sables profonds. De
plus, les lessivages ont été réalisés avec de l’eau déminéralisée dont le pH est 8,5. La
différence de pression osmotique peut expliquer à elle seule, soit les forts taux de décrochage
des bactéries soit la lyse bactérienne.

Bien qu’il n’y ait pas de différence significative sur ce type de sable, pour les durées
de batch entre 0, 3 et 4 heures, une tendance apparaît plus favorable lorsque la suspension est
laissée immobile entre 3 et 4 heures. Ces deux durées de batch ont un taux de fixation
similaire (≈ 26 %) contre 20 % pour le témoin. Cette variation ne semble pas provenir de la
valeur de D.O cellulaire moyenne puisque ces différences ne justifient pas les écarts qui
existent entre 3, 4 et 16 heures. Cependant, pour estimer plus précisément le temps de batch le
plus adéquat, cette étude est complétée une estimation de l’A.E. conservée au sein des
colonnes pour ces différentes durées de batch. Pour cela il est nécessaire au préalable de
visualiser le déplacement de l’A.E. après l’injection du 1er V.p d’eau et après celle du second.
De ces informations découlent les taux de fixation enzymatique (Figure n°84). Ils restent en
corrélation avec les taux de fixation bactérienne si l’on admet premièrement que chaque
cellule bactérienne contient la même quantité d’uréase ce qui ferait une suspension
bactérienne enzymatique homogène, deuxièmement soit que l’enzyme reste en position intra
cellulaire, soit que l’enzyme fuit en partie mais se fixe sur les grains de sable.

100.00

90.00

80.00 Figure n°84 : Estimation

70.00 moyenne de la quantité
60.00 d’activité enzymatique fixée
50.00
% de A.E fixée dans les colonnes de sable de
%

V.p 1; 1 % de A.E fixée

40.00 V.p 2
Fontainebleau NE 34 testées
30.00 pour 1 ou 2 V.p d’eau injecté.
20.00

10.00

0.00

La quantité A.E retenue moyenne est établie en regroupant l’ensemble des colonnes de
cette expérience et donc en ne tenant pas ici compte des durées de batch. Ceci a pour but de

201
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

n’observer que l’effet du nombre de V. p d’eau injectée. La Figure n°84 montre que dans ce
type de sable la fixation est faible ou par contre coup le lessivage est fort. En effet, il ne reste
que 40 % d’enzyme fixée dans la colonne après le premier lessivage et autour de 33 % après
la seconde injection V.p d’eau déminéralisée. La différence est faible et suggère que le
lessivage s’opère essentiellement lors de la première injection d’eau déminéralisée. Les
réserves émises sur l’emploi d’eau déminéralisée sont à renouveler car elle peut en plus
entrainer une lyse cellulaire qui libérerait l’enzyme sans pour autant totalement la dénaturer.
Elle serait alors quantifiable dans les effluents. Une solution calcifiante qui est le liquide dont
l’injection déplacera les bactéries et/ou le potentiel enzymatique, pourrait ne pas se comporter
de la même façon en raison même de sa composition et de son pH.
Ainsi, ce taux faible de fixation enzymatique voisin de 30 % pourrait être considéré
comme une valeur minimale.

Lorsque la fixation de l’A.E est étudiée en fonction de la durée de batch, alors, des
différences dans les taux d’A.E fixée apparaissent (Figure n°85). Il faut cependant noter que
pour une même durée de batch, les taux de fixation des bactéries et les taux de fixation d’A.E
sont différents. Ainsi pour un batch de 4 heures, environ 30 % des bactéries sont fixées dans
la colonne pour environ 50 % d’A.E. La différence est encore plus grande lorsque le batch
dure 16 h avec environ 50 % de cellules fixées et seulement un peu plus de 10 % d’A.E. La
durée de 20 h pour un batch qui avait été rejetée car ayant un taux de fixation cellulaire faible
(10 %) permet malgré cela la conservation de plus de 30 % de l’activité uréasique.
L’interprétation des données de la Figure n°85, doit donc être faite avec précaution.

100.00
90.00
80.00 Figure n°85 : A.E fixée en
70.00 fonction de la durée de batch,
60.00
après l’injection des deux V.p
50.00
%

40.00 d’eau déminéralisée dans des

30.00 colonnes de sable de
20.00 Fontainebleau NE 34.
10.00
0.00
0H 3H 4H 16 H 20 H

Ainsi, elle pourrait suggérer que l’augmentation de la durée de batch va en défaveur du

maintien de l’activité enzymatique dans la colonne. En effet, l’estimation de la quantité d’A.E
retenue entre 0 et 4 heures est équivalente, voisine de 50 %. Par contre, lorsque le temps de
batch est quadruplé l’activité enzymatique retenue semble diminuer d’autant (batch de 16 h).
Cependant, il a été observé dans une des colonnes de batch de 16 heures un excès d’A.E en
sortie par rapport à la quantité injectée. Cet excès d’A.E pourrait confirmer la possibilité
d’une lyse cellulaire, mais fausse le résultat présenté ici puisqu’il s’agit d’une valeur
moyennée.

En synthèse et en se basant sur ces seuls résultats obtenus avec des vitesses d’injection
particulières et des conditions très agressives pour les bactéries, une durée de batch courte, au
maximum de 3 à 4 heures permet d’augmenter l’adhésion tout en limitant une perte
potentielle d’activité enzymatique, par décrochage ou lyse cellulaire. Ainsi, la fenêtre

202
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

optimum du procédé pour une bonne adhésion et un maintien des activités enzymatiques in
situ nécessite la prise en compte au minimum des éléments suivants :
- à ces vitesses d’injection, lorsque les fluides sont injectés en continu, l’accroche des
bactéries n’est pas favorisée, (seulement 1/5 des bactéries injectées sont fixées avec
une activité enzymatique retenue autour de 50 % pour des durées de batch
inférieures à 4 heures),
- l’efficacité du procédé, qui réside dans le couple accroche cellulaire/maintien des
activités enzymatiques peut être améliorée avec des batch de courte durée (batch ≤ 6
fois le temps de division cellulaire), au delà, une dégradation de l’activité
enzymatique et une diminution de l’accroche pourraient se produire à 20° C.
En effet, la qualité de la biomasse est fondamentale pour maintenir une intégrité
membranaire efficace. Celle-ci permet à la cellule de maintenir les conditions propices à
l’hydrolyse de l’urée. La dégradation des qualités de la suspension (production de toxines,
enzymes protéolytiques, chute de pH,..) conduit directement à la détérioration des membranes
qui deviennent alors perméables et permettent la fuite de l’enzyme hors de la bactérie. Le
pouvoir uréasique est plus facilement déplaçable au gré des fluides injectés que les bactéries
elles même. L’activité enzymatique globale en est donc perturbée.

3. Implications sur les conditions d’application en chantier.

En condition de chantier, deux facteurs fondamentaux seront différents, la qualité du

sable et la température de subsurface. En effet, dans le modèle expérimental, le sable utilisé,
est le NE 34 de Fontainebleau lavé qui présente des grains arrondis et une granulométrie
étroite Cu < 2, Cc = 0.51 avec d10 = 0.13 ; d50 = 0.205) et bien graduée (Figure n°86).

Figure n°86 : Le sable de Fontainebleau NE

34 observé au M.E.B (S. Castanier et G.
Levrel).

Ces caractéristiques granulométriques sont peu favorables à l’adhésion car elles

favorisent un réseau poral interconnecté et car la présence de particules fines est limitée. Ces
conditions ne se retrouveront pas sur un chantier réel où une granulométrie plus complexe et
certainement plus étalée interviendra de manière importante dans le processus d’adhésion. A
cela s’ajoute la composition chimique de ces sols très éloignés de celui qu’offre le sable NE
34 (99.6% de silice). Par ailleurs, le rôle de la température du sous sol en moyenne de 12° C
influencera favorablement le maintien de l’activité enzymatique même si par ailleurs, la
réaction enzymatique sera ralentie. Ainsi, ce facteur abiotique, intervient d’une part,
directement sur les cinétiques de réactions biochimiques en diminuant l’activité métabolique
globale et en favorisant la conservation de la souche, et d’autre part, réduit la cinétique des
processus biologiques d’adhésion. Ceci conduira à cette température, à favoriser des durées
de batch plus longues.

203
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

Enfin, la suspension de biomasse si elle est dénaturée, peut être une source de
nutriments pour les micro-organismes autochtones. Par conséquent, une durée de batch trop
longue, pourrait favoriser leur développement in situ. Ceci est d’autant plus à craindre que
cette population autochtone est, elle, habituée à la température en place. Il faut toutefois tenir
compte des concentrations bactériennes injectées qui sont très élevées et du ratio avec les
populations en place. De celui-ci dépendra la réponse des bactéries autochtones dont une
partie d’ailleurs sera déplacée avec les flux d’injection.

Ces éléments permettent de suggérer un scenario. Avec les vitesses choisies et pour
l’instant avec la température de 20° C, si une injection nécessite au moins 12 heures, tous les
phénomènes décrits ci-dessus se dérouleront de manière concomitante. En effet, les premières
bactéries injectées auront au moins 12 heures de contact avec le sol. Leur métabolisme
continuera de fonctionner durant l’injection, en tendant à épuiser l’oxygène dissous.
Cependant, la température ralentira ce phénomène et la durée nécessaire pour atteindre cet
état d’anoxie n’est pas chiffrable. Ces conditions sont équivalentes à celles d’une phase
stationnaire avancée. D’un point de vue microbiologique, il semblerait nécessaire de réduire
le temps de contact de la biomasse avec le sol avant l’arrivée de la solution calcifiante. Si le
cadre technico – économique le permet, alors il serait utile de sectionner la distance
d’injection, en additionnant d’autres points d’injection de biomasse sur le trajet hydraulique
initialement prévu. Ceci permettrait de réduire le délai avant l’injection de la solution
calcifiante. Ce procédé pourra être complété par l’augmentation des vitesses d’injection (0.6
m/h).

Dans ce contexte, il est intéressant d’appliquer des batchs entre les injections mais il
devient essentiel de développer le potentiel d’adhésion de S. pasteurii sur les grains de sable.

204
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

II. AMELIORATION DE L’ADHESION BIOLOGIQUE DE S. pasteurii.

1. Contexte d’un développement du pouvoir d’adhésion de S. pasteurii.

L’amélioration de l’adhésion des cellules de S. pasteurii passe par une diminution des
interactions entre les surfaces des bactéries et des grains de sable. Ceci est possible si les
propriétés électrochimiques de la capsule et/ou de la paroi bactérienne sont changées. En
effet, ces propriétés peuvent être modifiées en apportant certains éléments assimilables dans la
suspension. C’est le cas des sucres et leurs assimilations par S. pasteurii ont été recherchées.
L’objectif est de stimuler par ajout d’un sucre, certaines voies métaboliques qui aboutissent à
la synthèse d’exo polysaccharides (EPS) ou capsule polysaccharide (CPS). Ces EPS, par leur
propriété de chélation de cations réduiraient les interactions entre la cellule et le support
siliceux. Ceci faciliterait ainsi la première étape de la fixation.
Dans le chapitre IV, l’optimisation de la composition du milieu de culture a amené le
remplacement d’une partie de l’extrait de levure par de l’inuline qui s’est révélé le seul sucre
assimilable par S. pasteurii (Tableau n°78).

Tableau n°78 : Indentification biochimique de S. pasteurii CIP 66.21. Le (+) correspond à

une assimilation du produit ou à la possession d’un caractère.
Tests Composants Résultats
ONPG 2- NITROPHENYL β D-GALACTOPYRANOSIDE -
pour la β-galactosidase
ADH L-Arginine/ARGININE DIHYDROLASE -
LDC L-Lysine/LYSINE DECARBOXYLASE -
L-Ornithine/ORNITHINE DECARBOXYLASE -
CIT Citrate/UTILISATION DU CITRATE -
H 2S Sodium thiosulfate/PRODUCTION DE H2S -
UREE UREASE +
TDA TRYPTOPHANE DESAMINASE -
IND PRODUCTION D’INDOLE -
VP Na Pyruvate/PRODUCTION D’ACETOÏNE -
GEL Gélatinase/DEGRADATION DE LA GELATINE -
GLU D-Glucose /fermentation et oxydation -
MAN D-Mannitol/fermentation et oxydation -
INO Inositol//fermentation et oxydation -
SOR D-Sorbitol/fermentation et oxydation -
RHA L-Rhamnose/fermentation et oxydation -
SAC D-Saccharose/fermentation et oxydation -
MEL Amygdaline/fermentation et oxydation -
ARA L-Arabinose/fermentation et oxydation -
OX Cytochrome oxydase -
GLY Glycérol -
ERY Réthritol -
DARA D-Arabinose -
LARA L-Arabinose -
RIB D-Ribose -
DXYL D-Xylose -
LXYL L-Xylose -
ADO D-Adonitol -
MDX Methyl β D-Xylopyranoside -
GAL D-Galactose -
FRU D- Fructose -
MNE D-Mannose -

205
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

SBE L-Sorose -
RHA L-Rhamnose -
DUL Dulcitol -
MDM Méthyl α D-Mannopyranoside -
MDG Méthyl α D-Glucopyranoside -
NAG n-Acétylglucosamine -
ARB Arbutine -
ESC Esculine citrate de fer -
SAL Salcine -
CEL D-Cellobiose -
MAL D-Maltose -
LAC D-Lactose -
MEL D-Mélibiose -
TRE D-Tréhalose -
INU Inuline +
MLZ D-Mélézitose -
RAF D-Rafinose -
AMD Amidon -
GLYG Glycogène -
XLT Xylitol -
GEN Gentiobiose -
TUR D-Turanose -
LYX D-Lyxose -
TAG D-Tagatose -
LFUC L-Fucose -
DARL D-Arabitol -
LARL L-Arabitol -
GNT Potassium gluconate -
2KG Potassium 2 cétogluconate -
5KG Potassium 5 cétogluconate -

L’identification du seul sucre assimilable par S. pasteurii, l’inuline, a permis de

réaliser ensuite des tests en culture pour déterminer la quantité nécessaire pour stimuler la
synthèse d’EPS. La méthode a consisté à ajouter en fin de phase exponentielle de la chicorée
entre 8 et 4 g/l. A ce stade, l’ajout d’une source de carbone dépourvue d’azote, dans une
suspension qui ne possède plus assez d’éléments nutritifs pour permettre une croissance
cellulaire, accroit le déséquilibre entre les fractions C et N assimilables. Le rapport C/N qui
devient supérieur à 20, ne permet pas la division cellulaire car il y a alors une carence en
azote. Les bactéries se trouvent en excès de sucres ce qui stimule la synthèse des exo -
polysaccharides dans le cytoplasme. Ceux-ci sont alors exportés à la surface des cellules où
les unités de base polymérisent et forment un enchevêtrement de fibres polysaccharidiques.
Ce feutrage serré autour de la bactérie possède un fort pouvoir d’adhésion qui est accru
lorsque le maillage est stabilisé par des ions calcium (Wingender et al., 1999).

2. Développement de l’amélioration de l’adhésion.

Dans le procédé de bio calcification, la fixation des bactéries peut être améliorée soit :
- lors de la production de la biomasse par l’apport à T0 de composés
osidiques sous forme d’inuline (Chicorée), ce qui favorise la synthèse de la
capsule de Sporosarcina pasteurii,
- au moment de l’injection de la biomasse, par un second ajout d’inuline.

2.1. Amélioration par ajout d’inuline lors de la production de biomasse.

206
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

Quatre productions de bactéries ont été réalisées en milieu liquide en Erlenmeyers à

20° C. Deux d’entre elles constituent les témoins sans inuline, tandis que les deux autres
renferment 1.5 g/l de chicorée ajoutée à T0 (voir Chapitre IV). Les croissances ont été suivies
par mesure de la D.O600. Des taux de croissance plus élevée ont été observés dans le cas de
milieu de production de biomasse additionnée de chicorée.
Sans chicorée (Milieu SBF), l’activité enzymatique moyenne est de 0.612 ± 0.36
mS/min/ml avec un coefficient de variation de 54 % (sur 20 essais). Lorsque de la Chicorée
est ajoutée, la moyenne d’A.E est autour de 0.782 ± 0.27 mS/min/ml avec un coefficient de
variation de 35 % (toujours sur 20 essais). L’ajout de la chicorée semble donc favoriser une
augmentation en moyenne de 20 %. Par ailleurs, la diminution du coefficient de variation
montre que la synthèse de l’uréase semble plus stable en présence de chicorée.

2.2. Amélioration par ajout d’inuline à la fin de la production de biomasse.

Une première étude a été entreprise pour quantifier la fixation des cellules avec et sans
chicorée. Ensuite, l’addition simultanée de calcium et de chicorée a été testée dans le but de
l’intégrer dans le procédé industriel. L’ajout s’effectue dans les deux cas, dans la suspension
bactérienne à la fin de la phase stationnaire et avant l’injection en colonne. La fin de la phase
exponentielle dans une croissance bactérienne correspond à un ralentissement des divisions
cellulaires en réponse à un épuisement des sources nutritives et à une accumulation des
déchets du métabolisme.

La première expérience d’adhésion a consisté à distribuer une suspension bactérienne

en fin de phase exponentielle, de D.O600 2 .07, dans 12 petits Erlenmeyers. Le premier lot de 6
flacons est maintenu sans agitation, le second (6 flacons) est soumis à une forte agitation (120
rpm) afin de matérialiser d’une certaine manière les étapes d’injection. Dans chaque lot, se
trouvent deux flacons témoins sans Chicorée, deux avec 4 g/l de Chicorée et les deux derniers
avec 8 g/l (Tableau n°79).

Observations
Flacons sans Flacons avec
Tableau n°79 : Flacons semi
agitation agitation
Description de quantitatives
l’expérience n°1. 12 6 6 oui
Témoin sans chicorée 2 2
Chicorée ajoutée (4 g/l) 2 2
Chicorée ajoutée (8 g/l) 2 2

La capacité d’adhésion des bactéries est repérée, par la formation d’agglutinats dans
ces différentes conditions (Figure n°87) et est seulement estimée par des observations semi-
quantitatives (Tableau n°80), réalisées au bout de 3 heures (durée d’un batch) et de 24 heures
(effet à long terme). L’adhésion n’est pas recherchée sur les parois des flacons. Il faut noter
que pour une bactérie adhérer sur une paroi de verre est une action extrêmement difficile en
raison de la composition et de la régularité du support. Le verre présente un microrelief très
plat sans réelle accroche pour les bactéries. Cette recherche sur verre, représenterait donc les
conditions les plus difficiles possibles pour l’adhésion. Observer les agglutinats permet
néanmoins de repérer les moindres petites améliorations. Dans le contexte d’un sable, les
améliorations seront amplifiées par le microrelief des grains.

207
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

10µm

Figure n°87 : La photo de gauche est une observation au microscope au grossissement x 80

d’une suspension témoin sans agglutinat. La photo de droite est prise au microscope au
grossissement de x 50 d’une suspension de biomasse présentant un début d’agglutination. Les
cellules bactériennes se réunissent en des micro-agglutinats de 4 à 6 cellules.

Tableau n°80 : Normalisation des observations semi quantitatives de l’adhérence

bactérienne dans les flacons en verre.

Temps
Chicorée Chicorée et
Observations Quantification de
seule Ca(NO3)2
contact
Taille de la bactérie petite moyenne grande
Mobilité de la bactérie - + ++ +++
Cristaux de CaCO3 - + ++ +++ Avec et
Avec et sans 3 heures
Peu sans
agitation 24 heures
Nombre Rare fréquente Fréquente agitation
Agglutination
+ ++ +++
Taille petite moyenne grosse

Le Tableau n°81 regroupe les observations réalisées au bout de 3 heures de contact,

sans et avec agitation, tandis que le Tableau n°82 concerne celles de 24 h.
Tableau n°81 : Résultats des observations après 3 heures de contact, sans et avec agitation.

Flacon Flacon Flacon Flacon

Observations Témoin Témoin
4g/l 4 g/l 8 g/l 8 g/l
Sans agitation
Taille de la bactérie petite petite petite petite petite petite

Mobilité de la bactérie ++ ++ ++ ++ ++ ++

Cristaux de CaCO3 - - - - - -

Nombre - - - - + +
Agglutination
Taille - - - - petite petite
Avec agitation

208
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

Taille de la bactérie petite petite petite petite petite petite

Mobilité de la bactérie +++ ++ +++ +++ ++ ++

Cristaux de CaCO3 - - - - - -

Nombre - - - - -/+ -/+

Agglutination
Taille - - - - petite petite

Dans ces conditions, et par comparaison avec les flacons témoins, les agglutinats
apparaissent dés les 3 premières heures de contact, lorsque les concentrations de chicorée sont
de 8 g/l. L’agglutination, stimulée par l’ajout de chicorée seule, est favorisée lorsque le milieu
est immobile, ce qui correspond à la phase de batch.

Tableau n°82 : Résultats des observations après 24 heures de contact, sans et avec agitation.

Flacon Flacon Flacon Flacon

Observations Témoin Témoin
4 g/l 4 g/l 8 g/l 8 g/l
Sans agitation
Taille des bactéries petite moyenne petite petite petite petite

Mobilité des bactéries +++ ++ +++ +++ - +

Cristaux de CaCO3 - - - - - -

Nombre - - - - -/+ -/+

Agglutination
Taille - - - - Grosse Grosse
Avec agitation

Taille des bactéries moyenne moyenne petite moyenne moyenne moyenne

Mobilité des bactéries ++ +++ ++ +++ +++ ++

Cristaux de CaCO3 - - - - - -

Nombre - - - - -/+ -/+

Agglutination
Taille - - - - - -

Ces résultats confirment la tendance observée au bout de 3 heures de contact. La

chicorée favorise la production d’agglutinats lorsqu’elle est fournie à une concentration de 8
g/l et que les flacons ne subissent pas d’agitation. Ainsi, l’ajout de chicorée permet la
formation d’agglutinats seulement si elle est présente à des concentrations élevées (8 g/l).
Mais ces agglutinats ne sont pas assez solides pour maintenir leur cohérence en milieu agité.
L’ajout d’un cation tel que du calcium, permettrait de renforcer la structure de l’agglutination
par la formation de ponts calciques.
Ainsi, pour la deuxième expérience, une source de calcium est ajoutée en même temps
que la chicorée (Tableau n°83). La quantité (10 mM) est très faible en comparaison avec
celle de la solution calcifiante. Là aussi, les flacons sont tous pilotés en duplicata.

209
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

Tableau n°83 : Description de l’expérience n°2.

Flacons Observations
Flacons avec
Flacons sans semi
agitation
agitation quantitatives
12 6 6 oui
Témoin sans chicorée, sans Ca (NO3)2 1 1
Témoin sans chicorée, avec Ca (NO3)2 1 1
Chicorée (4 g/l) + Ca (NO3)2 2 2
Chicorée (8 g/l) + Ca (NO3)2 2 2

Dans ces tests d’adhésion avec un ajout de chicorée en présence de 10 mM de nitrate

de calcium, la suspension bactérienne utilisée présentait une D.O. cellulaire de 2.13, ce qui est
comparable à celle de l’expérience n°1. Les deux concentrations de chicorée 4 g/l et 8 g/l ont
été conservées afin de pouvoir comparer l’ensemble des résultats. Les résultats des
observations semi-quantitatives après 3 heures de contact, avec et sans agitation, se trouvent
dans le Tableau n°84. Le Tableau n°85 regroupe les observations réalisées après 24 heures.

Tableau n°84 : Résultat des observations après 3 heures de contact sans et avec agitation, en
présence de nitrate de calcium.

Témoin Flacon Flacon Flacon Flacon

Observations Témoin
Ca(NO3)2 4 g/l 4 g/l 8 g/l 8 g/l
Sans agitation
moyenn
Taille des bactéries moyenne moyenne petite petite moyenne
e

Mobilité des bactéries +++ ++ +++ +++ +++ +++

Cristaux de CaCO3 - - - - + +

Nombre - - +++ +++ + +

Agglutination moyenn
Taille petite - grosse grosse grosse
e
Avec agitation

Taille des bactéries moyenne moyenne petite petite petite petite

Mobilité des bactéries +++ ++ ++ +++ ++ ++

Cristaux de CaCO3 - - - - + +

Nombre - - +++ +++ + +

Agglutination Petite/
Taille petite - petite petite petite
moyenne

Après 3 heures de contact en présence de nitrate de calcium, les agglutinations

apparaissent préférentiellement avec 4 g/l de chicorée et dans les flacons sans agitation. Les
agglutinats sont plus nombreux et plus gros. Ils sont de taille équivalente à ceux fabriqués
dans les suspensions bactériennes ayant reçu de la chicoré à une concentration de 8 g/l. Il en

210
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

est de même avec agitation, ce qui indique que l’adhésion est plus forte en présence d’ions
calcium. Ceci s’explique car les bactéries ont commencé à fabriquer du CaCO3.

Tableau n°85 : Résultat des observations après 24 heures de contact sans et avec agitation,
en présence de nitrate de calcium.

Témoin Flacon Flacon Flacon Flacon

Observations Témoin
Ca(NO3)2 4 g/l 4 g/l 8 g/l 8 g/l
Sans agitation

Taille des bactéries Hétérogène moyenne petite petite petite petite

Mobilité des bactéries ++ ++ + + - -

Cristaux de CaCO3 + - - - - -

Nombre + - +++ +++ +++ +++

Agglutination
Taille petite - grosse grosse grosse grosse
Avec agitation

Taille des bactéries moyenne moyenne moyenne moyenne petite petite

Mobilité des bactéries ++ ++ +++ +++ + +

Cristaux de CaCO3 + - - - - -

Nombre + - + + ++ ++
Agglutination
Taille petite - petite petite moyenne petite
(Hétérogène : mélange de différentes tailles).
Au bout de 24 heures, sans agitation, les suspensions bactériennes de tous les flacons
contiennent des agglutinats dont le nombre et la taille sont équivalents quelle que soit la
concentration en chicorée. Le nombre d’agglutinats est plus élevé dans les échantillons à 8 g/l
de chicorée, avec l’agitation, mais leurs tailles sont par contre équivalentes entre les deux
concentrations (4 g/l et 8 g/l).
Ainsi, l’ajout de la chicorée et d’une petite source de calcium améliore grandement la
formation d’agglutinats au sein d’une suspension bactérienne de D.O. voisine de 2, agitée ou
non. La concentration de chicorée de 4 g/l semble plus performante sur de courtes durées que
celle de 8 g/l. La taille des agglutinats est dépendante du niveau de turbulence présent dans
l’environnement. Par contre, la taille des bactéries est inversement proportionnelle aux
concentrations de chicorée. Un contact de 3 heures avec de la chicorée et de nitrate de calcium
est suffisant pour permettre l’apparition de grandes quantités d’agglutinats aussi bien en
milieu agité qu’en milieu immobile.
L’ajout de chicorée et d’une source de calcium dans la suspension bactérienne permet
donc d’améliorer l’agglutination des bactéries en milieu agité et en contexte immobile. Ces
deux évènements se retrouvent dans le protocole de chantier d’injection des colonnes et
correspondent respectivement à l’injection et au batch. Ces phénomènes d’agglutinations
apparaissent dans les délais assez courts. Des adhésions fortes ont été observées à partir d’une
heure de contact jusqu’à 3 heures, y compris sur la paroi des Erlenmeyer sous agitation. Ceci
signifie que cette durée est nécessaire en condition aérobie pour stimuler l’action d’adhésion.
Il faut cependant remarquer que les agglutinats, et donc l’adhésion, doivent apparaître dans la

211
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

porosité du sable et non dans les suspensions à injecter, ce qui provoquerait le colmatage dès
les premiers centimètres. Ainsi donc, le calcium qui favorise l’adhésion doit être ajouté
quelques minutes seulement avant injection. C’est ce qui sera fait dans les expériences avec
sable.
Une troisième expérience a été monée avec l’injection de 10 petites colonnes de sable
(Tableau n°86). Quatre colonnes servent de témoins de fixation, deux ont reçu seulement les
10 mM de nitrate de calcium, les deux autres seulement la chicorée, l’une 4 g/l et l’autre 8 g/l.
Enfin, un premier lot de 3 colonnes a été injecté avec une suspension bactérienne additionnée
de 4 g/l de chicorée et de nitrate de calcium (10 mM). Le deuxième lot de 3 colonnes ne se
différencie que par la concentration de chicorée, 8 g/l.

Nombre Ajout de Ajout de nitrate

de Type chicorée de calcium
Tableau n°86 : Répartition colonnes (g/l) (10 mM)
des additifs dans les essais 2 Témoin oui
d’amélioration de 1 Témoin 4
l’adhésion en colonnes de
1 Témoin 8
sable de Fontainebleau.
série n°1
3 Colonnes tests 4 oui
3série n°2 Colonnes tests 8 oui

Le Tableau n°87 regroupe les paramètres appliqués à ces colonnes. Les injections ont
été réalisées aux vitesses réelles de chantier de 0.2 m/h. Les suspensions bactériennes
injectées avaient une D.O cellulaire moyenne de 2.46 ± 0.6 avec un coefficient de variabilité
(CV) de 24 %. Une dispersion similaire est constatée pour leur activité enzymatique moyenne
de 0.93 ± 0.19 avec un CV de 21 %. Les deux séries de 3 colonnes ont été testées avec des
D.O. moyennes non significativement différentes, 2.48 ± 0.82 contre 2.69 ± 0.63,
respectivement pour la série n°1 et série n°2. Ceci autorise la comparaison entre les deux
séries mais aussi avec les témoins (D.O cellulaire = 2.32 ± 0.63), (Figure n°88). L’adhésion
des bactéries sur les grains de sable est estimée avec le protocole précédemment décrit, qui
consiste à mesurer les D.O des effluents de sortie des colonnes.

Tableau n°87 : Récapitulatif des caractéristiques des colonnes et des conditions d’injection.

Série n°1 Série n°2 Témoin Témoin

Caractéristiques des Témoin
Chicorée Chicorée Chicorée Chicorée
colonnes Ca2+
4 g/l + Ca2+ 8 g/l + Ca2+ 4 g/l 8 g/l
Type de sable Sable de Fontainebleau brut
Montage des colonnes Pluviation et vibration
Nombre de colonnes 3 3 1 1 1
D.O
2.47 3.3 2.6 2.2 2.4 3.4 2.56 1.6 2.8
cellulaire
Biomasse
A.E
0.8 1.2 0.9 0.7 1.0 0.9 1.0 0.7 1.0
(mS/min)
Densité du sable fin 1.71 ± 0.03 avec un CV = 1.4 %
Porosité apparente 0.39 ± 0.01 avec un CV = 2.65 %
Durée de batch 3 heures
(CV : coefficient de variabilité)

212
Chapitre VI. Etude de la bio calcification

100

90 Figure n°88 : Les taux de

80
fixation de S .pasteurii sur
70
un sable de Fontainebleau
60
brut, en colonnes, après
%

50

40
l’ajout de 4 ou 8 g/l de
30
chicorée et de 10 mM de
20 nitrate de calcium dans la
10 suspension bactérienne.
0
Echantillon 4g/L Echantillon 8g/L témoin10 mM témoin 4g/L témoin 8 g/L

Les résultats montrent que, l’ajout de chicorée à raison de 4 ou 8 g/l couplé avec 10
mM de nitrate de calcium dans la suspension bactérienne juste avant l’injection, permet
d’obtenir des taux de fixation plus élevée de 10 à 20 %, que ceux obtenus dans les témoins.
Par ailleurs, les différences de taux de fixation par rapport aux essais précédents faits sans
additif, sont deux fois plus grandes. Mais il faut noter que ces derniers essais ont été réalisés
avec du sable Fontainebleau Brut qui se comporte différemment. Par confirmer ces résultats,
deux autres colonnes ont alors été réalisées avec du Sable de Fontainebleau NE 34. Elles ont
été injectées avec respectivement 2 et 1.9 de D.O cellulaire. Dans la première colonne, les
deux additifs ont été ajoutés (chicorée et sel de calcium) suivant le même protocole. Dans la
seconde colonne, aucun additif n’est présent. Il en ressort une estimation du taux de fixation
de 45 % pour la première colonne et plus de deux fois moins (20 %) dans la seconde. Ceci
semble confirmer, l’effet favorable de la chicorée et du calcium sur l’adhésion des bactéries.
Cet effet est très probablement dû à la diminution des charges d’interfaces entre bactérie et
support siliceux (Turakia et al.,1993)
La meilleure efficacité pour augmenter la fixation est donc d’ajouter 4 g/l de chicorée
avec 10 mM de nitrate de calcium dans la suspension bactérienne en fin de phase
exponentielle, juste avant l’injection. Cette augmentation de la fixation pourra très
vraisemblablement permettre d’accroître l’homogénéité et la résistance du procédé de bio
calcification. Pour compléter, ces données sur l’ajout d’additifs dans la suspension de
biomasse, deux colonnes ont été réalisées pour observer l’attachement des bactéries sur un
support siliceux au MEB (Tableau n°88).

Caractéristiques des colonnes Colonne n°1 Colonne n°2

Type de sable Sable de Fontainebleau brut
Tableau n°88 : Montage des colonnes Pluviation et vibration
Caractéristiques DO cellulaire 1.43 1.82
Biomasse
des colonnes injectées pour A.E (mS/min) 0.482 0.968
l’étude ultramicroscopique Densité du sable 1.73 1.71
de l’adhésion des bactéries Porosité apparente 0.37 0.37
en présence d’additifs. Durée de batch (H) 3
Chicorée (g/l) 4 8
Additifs
Ca(N03)2 (mM) 10

Un volume de porosité de suspension de biomasse additionnée de 4 g/l ou 8 g/l de

chicorée avec 2.36 g /l de nitrate de calcium (10 mM) a été injecté sans que ne suivent les

213
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

injections de milieu calcifiant. Ceci a été fait pour ne voir que l’adhésion des bactéries sur les
grains de sable sans que le carbonate de calcium résultant de leur activité ne masque les corps
cellulaires. Les observations au MEB ont été réalisées par Mmes Castanier et G. Levrel. La
Figure n°89 montre des photographies prises sur des échantillons de la colonne n°1.

Figure n°89 : La fixation de S. pasteurii sur des grains de sable de Fontainebleau brut
(Images MEB réalisées par Mmes S. Castanier et [Link]).

Les bactéries se fixent en amas et sont apparemment orientées dans le mêmes sens. Par
ailleurs, elles se déposent dans des anfractuosités de petite taille (10 µm) de préférence à des
surfaces lisses. Elles se localisent plus facilement sur des surfaces de contact entre deux grains
au niveau des espaces inter-granulaires formant parfois même des portions des tapis bactérien.
Ces dépôts peuvent-être attribués aux bactéries ayant développé un fort pouvoir d’adhésion.
Ces bactéries potentiellement adhérentes, ont très bien pu s’agglomérer pendant la phase
d’injection ou pendant la durée du batch. Certains passages inter-granulaires étroits favorisent
l’adhésion sous l’effet du flux hydraulique. Ce potentiel enzymatique sous forme de tapis
bactérien se trouve alors mieux situé pour développer des cristaux de carbonate de calcium à
effet mécanique. D’après Vadevivere et al., 1992, l’adhésion peut également être stimulée par
le contact avec le support, en effet, plus la bactérie a un nombre élevé des point de contact
avec le sable, plus sa voie de production d’exo polysaccharides (EPS) est stimulée.
Malgré une amélioration de la fixation, une proportion non négligeable de corps
bactériens, estimée entre 35 à 40 % sort du système poreux. Cette proportion est stable pour
ce type de sable et dans son état de compaction. Ceci conduit à prendre en compte d’autres
éléments responsables de la fixation ou de la retenue de la biomasse. En effet, dans une
colonne de 0.2 m, plus d’un tiers de la suspension bactérienne traverse le système poral sans
s’y fixer. La présence au sein de la suspension de biomasse d’une sous population au pouvoir
adhérent différent pourrait en être la cause. Il s’agirait d’une sous population soit ayant un
faible pouvoir hydrophobe soit assimilant peu ou pas la chicorée, soit étant de plus petite
taille. Par ailleurs, la théorie de la filtration de colloïde, décrit un dépôt intense dans la zone
proximale qui décroît de manière exponentielle en fonction de la distance. Le taux de fixation
est d’abord très élevé, ce qui sature les capacités de rétention du sable, l’excès est alors rejeter
hors du système (Bolster et al ,1999). Dans notre cas, cela pourrait signifier que la biomasse
injectée en colonne est trop concentrée en corps bactériens. Alors, même les valeurs les plus
faibles de D.O cellulaires seraient suffisantes. Or les très nombreux essais de bio-calcification
réalisée avec des suspensions présentant une gamme très large de valeurs de D.O cellulaires,
n’ont pas montré de différence. Cela infirme la théorie présentée ci-dessus.
L’amélioration de la fixation ainsi réalisée, favorise le dépôt de bactéries sous forme
de tapis dans les zones inter granulaires, où elles fabriquent des ponts de carbonate de calcium

214
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

qui augmentent la cohésion des grains de sable entre eux par conséquent celle de la résistance
à la compression simple. L’étape complémentaire est celle de l’amélioration de la solution
calcifiante.

III. AMELIORATION DE LA SOLUTION CALCIFIANTE.

1. Etude des premières étapes de la formation de cristaux.

L’efficacité du procédé de bio calcification repose sur l’activité enzymatique uréasique

de S. pasteurii et sur la croissance cristalline du CaCO3 qu’elle produit dans la porosité des
sols sableux. Il faut distinguer les espaces inter-granulaires et les pores. Les premiers sont les
espaces entre 2 grains de sable, les seconds entre 3 grains. Les cristaux de CaCO3 produits
dans les espaces inter granulaires sont les plus susceptibles de produire une résistance
mécanique à la compression simple. Pour mieux connaître et décomposer les séquences de
croissance cristalline et en déduire l’efficacité en fonction de la quantité de calcium, quatre
colonnes ont été injectées avec des volumes croissants de solution calcifiante (Tableau n°89).

Caractéristiques des Colonne Colonne Colonne Colonne

colonnes n°1 n°2 n°3 n°4
Type de sable Sable de Fontainebleau brut
Montage de la colonne Pluviation et vibration
DO
1.85
Tableau n° 89 : cellulaire
Biomasse
Caractéristiques des A.E
1.295
colonnes et du (mS/min)
1.74 ± 0.02
protocole d’injection Densité du sable fin
avec un coefficient de variation de 1.2 %
pour l’évaluation de
0.38 ± 0.09
la formation des Porosité apparente
avec un coefficient de variation de 2.4 %
cristaux. Durées de batch (h) 3 heures
Solution calcifiante
0.5 M
[Urée/Ca2+]
Nombre de V.p de
1 2 3 4
solution calcifiante
Durées de batch de la
3
solution calcifiante (h)

Bien que toutes les colonnes aient été injectées avec une suspension de biomasse identique,
elles ont eu un nombre différent de volumes de pore de solution calcifiante. Le dernier
volume de pore de solution calcifiante a été laissé en place et non pas flushé à l’eau
déminéralisée. Les colonnes ont été envoyées à l’Université d’Angers, pour des observations
au MEB, réalisées par S. Castanier et G. Levrel. Deux séquences complètes ont pû être
observées. La première concerne la formation du cristal de carbonate de calcium (Figure
n°90).

215
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

3
5
2
1

6
4

Figure n°90 : Séquence numérotée de 1 à 6, de formation des cristaux de calcite.

Les observations ont également permis de mettre en évidence que le nombre de

cristaux et leur forme, sont directement dépendants du volume d’urée et de calcium introduit
dans le système. La croissance cristalline semble se réaliser au niveau d’une surface et non à
partir d’une arête, étape n°6 (Figures n°90 et 91).

Figure n°91 : Croissance cristalline en cours. Les flèches pleines montrent les dépôts
impliqués dans la formation du cristal. La flèche en pointillé pointe l’empreinte d’une
bactérie qui était partiellement piégée dans le cristal de carbonate de calcium.

Par ailleurs, ces croissances cristallines se réalisent autour d’un film non identifié mais
vraisemblablement organique. La Figure n°91, suggère que l’élongation du cristal
rhomboédrique s’effectue au niveau des surfaces, par à coup et sur les faces les plus exposées
au flux hydraulique. Les couches nouvelles sont irrégulières, alvéolaires avec un aspect
poreux dans un premier temps. Les couches sont ensuite lissées et les croissances cristallines
de surface tendent à produire des structures emboitées de cristaux.

Une seconde séquence concerne le passage d’un cristal rhomboédrique unique à un

amas en cours de formation. (Figure n°92).

216
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

9
8

11
10

Figure n°92 : Passage du cristal rhomboédrique unique à un amas (étapes 7 à 11),

images réalisées par S. Castanier et G. Levrel.

La croissance cristalline produit des amas de cristaux jusqu’au stade 11 dés le premier
volume de pore de solution calcifiante injecté. Ces structures peuvent mesurer jusqu’à 60 µm
de longueur. D’après les observations de S. Castanier et de G. Levrel, les pores ne sont pas le
premier lieu de la bio minéralisation. En effet, d’après cette étude, la formation des cristaux
est préférentiellement située dans les zones inter granulaires. Ceci concorde avec la
localisation des dépôts de biomasse. Par ailleurs, il apparait clairement que les cristaux
croissent là où les bactéries adhèrent, dans les anfractuosités des grains de sable. Ceci
explique que parfois, les bactéries apparaissent enchevêtrées ou encroutées dans une matrice
de carbonate de calcium. Il n’est pas exclu que la matière organique issue de la biomasse ou
résiduelle dans la suspension participe également à la croissance cristalline et ceci notamment
lors de l’injection du premier volume de pore de solution calcifiante. En effet, le réseau
poreux est constitué à la fois d’une porosité ouverte, c'est-à-dire d’une interconnexion de vide,
et d’une porosité fermée formée de pores en cul de sac. Les flux hydrauliques s’y comportent
différemment. Par ailleurs, des phénomènes d’absorption-désorption de la matière organique
sur les grains de sable, permettent qu’une certaine quantité de matière organique, autre que
l’urée soit présente pendant la phase de nucléation et de croissance cristalline. Cette présence
pourrait expliquer des croissances enchevêtrées de cristaux, donnant lieu à ces agrégats
cristallins de grandes dimensions.

Dans des conditions de fabrication purement chimique, sous106 Pa ou un bar et à 45°

C, la distribution des tailles des cristaux obtenus montre une courbe en forme de cloche avec
un pic à 5 µm de longueur, qui s’étend jusqu’à 20 µm (Domingo et al, 2004). Par ailleurs,
Mitchell et Ferris (2006), ont observé, qu’en présence S. pasteurii, donc dans une bio
calcification, la distribution s’étend jusqu'à 15 µm. Dans les mêmes conditions, en absence de
biomasse, les solutions testées montrent que la taille des particules varie seulement de 3 à 10
µm de diamètre. Selon ces auteurs qui n’envisagent pas d’autre rôle, la seule présence de S.
pasteurii augmenterait la taille de cristaux de carbonate de calcium et ceci serait dû à
l’influence directe des surfaces bactériennes c’est-à-dire de ses macro molécules pariétales.

217
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Néanmoins, comme le suggèrent Sondi et al. (2001), les fortes concentrations d’urée et
d’ammonium (< 0.66 M) pourraient avoir un rôle non négligeable sur la croissance cristalline
et sur la morphologie des cristaux, bien que l’urée soit une molécule non chargée et apolaire.
Il est couramment admis qu’un excès de matière organique peut empoisonner la croissance
cristalline. Dans ce cas, une trop forte concentration ou un déséquilibre entre la source de
calcium et l’urée contenues dans la solution calcifiante pourrait inhiber la précipitation et
donc diminuer les résistances à la compression simple.

2. Impact d’une solution calcifiante non équimolaire.

Pour compléter, cette étude sur la formation des cristaux de carbonate de calcium dans
le cadre de ce procédé, quatre colonnes ont été montées et injectées, soit en continu soit en
mode semi continu (batch) avec une solution calcifiante non équimolaire. En effet, ces
nouvelles solutions calcifiantes présentent près de 33 % d’urée supplémentaire par rapport à
une solution équimolaire (Tableau n°90). Dans chaque colonne, l’injection de la biomasse a
été réalisée à la vitesse de chantier, puis elle est suivie d’un batch de 3 heures. Cette étude a
été complétée par celle de 4 colonnes témoins dont la solution calcifiante injectée est
équimolaire (0.5 M) (Tableau n°91).

Tableau n°90 : Caractéristiques des colonnes injectées avec une solution calcifiante non
équimolaire.

Caractéristiques des Colonne Colonne Colonne Colonne

colonnes n°1 n°2 n°3 n°4

Type de sable Sable de Fontainebleau NE 34

DO cellulaire 1.45
Biomasse
A.E (mS/min) 0.377
Densité du sable 1.74 ± 0.1 avec un coefficient de variation de 3.3 %
Porosité apparente 0.4 ± 0.02 avec un coefficient de variation de 5.8 %
Durées de batch 3 heures
0.5 M
0.5 M 0.5 M
Solution calcifiante CaCl2/ 0.5 M CaCl2/
Ca(NO3)2/ Ca(NO3)2/
[Urée/Ca(NO3)2] 0.75 M 0.75 M Urée
0.75 M Urée 0.75 M Urée
Urée
Nombre de V.p de
5 5 5 5
solution calcifiante
Mode d’injection Continu Semi continu
Durées du batch de la
/ 3h
solution calcifiante
Vitesse réelle d’injection
<0.05 0.2
(m/h)

218
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Tableau n°91 : Caractéristiques des colonnes témoins injectées avec une solution
calcifiante équimolaire.

Caractéristiques des Colonne Colonne Colonne

Colonne n°5
colonnes n°6 n°7 n°8
Type de sable Sable de Fontainebleau NE 34
DO
0.68
Biomass cellulaire
e A.E
0.377
(mS/min)
Densité du sable 1.74 ± 0.04, coefficient de variation de 3 %
Porosité apparente 0.38 ± 0.01, coefficient de variation de 2 %
Durées de batch 3 heures
Solution calcifiante 0.5 M Urée - 0.5 M Urée - 0.5 Urée - 0.5 M Urée -
[Urée/Ca 2+] CaCl2 Ca(NO3)2 CaCl2 Ca(NO3)2
Nombre de V.p de
5 5 5 5
solution calcifiante
Mode d’injection En continu Semi continu
Temps de batch de la
/ 3
solution calcifiante (h)
Vitesse réelle
<0.05 0.2
d’injection (m/h)

Pour évaluer, l’impact d’un excès de substrat, deux types d’injections ont été testés.
L’injection en mode continu avec des vitesses réelles lentes d’injection, favorise l’hydrolyse
de l’urée en continue et donc la production de CaCO3 en continu. La concentration des
substrats fournis restent en un point donné, élevée. Par contre, les injections réalisées en
conditions de chantier qui se caractérisent par une vitesse plus grande, suivies d’un batch font
évoluer de façon différente la concentration des substrats. En effet, sous l’action des bactéries,
ils sont utilisés et leur concentration décroit tout au long du batch. En conséquence, si l’excès
de substrat a un effet négatif sur la croissance, cela sera visible dans les deux cas de figure, et
ceci quel que se soit le type de sel de calcium utilisé, du chlorure ou du nitrate de calcium
(Tableau n°92).

Tableau n°92 : Les effets d’un excès d’urée dans la solution calcifiante sur les résistances à
la compression simple(Rc).

Colonnes n°1 n°2 n°3 n°4 n°5 n°6 n°7 n°8

Stœchiométrie Non équimolaire Equimolaire

Type
Continu Semi continu Continu Semi continu
d’injection
Nature des sels CaCl
Ca(NO3)2 CaCl2 Ca(NO3)2 CaCl2 Ca(NO3)2 CaCl2 Ca(NO3)2
de Ca 2+ 2
Rc (MPa) 0.133 0.077 0.124 0.297 0.767 détruite 0.534 0.727
CaCO3 (g/cm3) 0.075 0.069 0.043 0.104 0.068 0.049 0.122 0.112
CaCO3/Rc
0.564 0.896 0.347 0.350 0.089 - 0.228 0.154
(g/cm3/MPa)
CaCO3/Rc
Moyenne 0.730 Moyenne 0.349 0.089 - Moyenne 0.191
(g/cm3/MPa)
CaCO3/RC Moyenne 0.539 Moyenne 0.157
(g/cm3/MPa)

219
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Les résultats des Rc (résistances à la compression simple) obtenues pour les colonnes
ayant reçu des solutions de calcification non équimolaires sont globalement plus faibles, variant
de 0,077 à 0,297 MPa tout sel de calcium confondu par rapport à un traitement équimolaire
classique (0.534 à 0.767 MPa). Par ailleurs, les deux types d’injection, continu et semi continu,
dans les conditions non équimolaires sont d’efficacité équivalente avec le CaCl2 comme le
montrent les RC de 0.133 et 0.124 MPa. Mais, il n’en est pas de même lorsque le calcium est lié
au nitrate, les RC varient alors de 0.077 MPa en continu à 0.297 en mode semi continu. La durée
du batch permet aux bactéries de travailler plus longtemps.

Par ailleurs, la moyenne des teneurs en carbonate de calcium obtenues avec des solutions
non équimolaires d’urée/chlorure de calcium est de 0.059 ± 0.023 g/cm3 et de 0.087 ± 0.025
g/cm3 avec le Ca(NO3)2. Les performances du procédé peuvent être estimées par le rapport
CaCO3/RC qui donne la quantité de carbonate de calcium par cm3 permettant d’obtenir 1 MPa de
résistance à la compression simple. Cette valeur étant fortement dépendante du type de sable, du
mode et du taux de compactage de celui-ci, et de la localisation des cristaux de carbonate de
calcium formé, entre autres, son interprétation doit donc être prise avec précaution. Néanmoins,
plus la valeur est faible, plus le procédé tant vers une meilleure efficacité.

Les solutions calcifiantes équimolaires sont plus efficaces, avec un rapport moyen de
0.157 g/cm3/MPa contre 0.539 g/cm3/MPa dans le cas de solutions non équimolaires, quelle que
soit la source de calcium. Les performances par rapport au sel de calcium utilisé semblent peu
varier dans les conditions équimoléculaires (0.159 pour le chlorure de calcium et 0.154 pour le
nitrate de calcium). Dans le cas de solutions calcifiantes non équimolaires, les rapports sont
globalement trois fois plus élevés (efficacités trois fois moins grandes), variant de 0.456
g/cm3/MPa dans le cas du chlorure de calcium à 0.623 avec le Ca(NO3)2. Ainsi, l’excès d’urée
(0.75 M au lieu de 0.5 M) par rapport aux ions calcium, ne favorise pas l’obtention de fortes
résistances mais au contraire semble plutôt gêner la précipitation du carbonate de calcium.
L’interprétation des mécanismes mettant en jeu l’urée reste néanmoins difficile à appréhender,
cela est dû au fait que son implication ne se limite pas à son unique présence en excès ou pas
dans le milieu. En effet, elle est le substrat de l’uréase et donc, indirectement responsable du
processus de bio précipitation du CaCO3. Malgré cette relation complexe liant les performances
de ce système avec la présence d’urée ; plusieurs hypothèses peuvent-être proposées. Si la
concentration plus élevée d’urée avait déclenché une plus forte réaction enzymatique, alors la
teneur en carbonate de calcium, aurait été également plus élevée. Ce n’est pas le cas. Donc, le
substrat en excès peut très bien avoir des effets nocifs pour la bactérie ou pour l’uréase. Lorsque
la bio calcification est intense, l’encroutement cellulaire est favorisé ce qui induit un
ralentissement des transferts membranaires et donc un ralentissement de la production. En
définitive, les solutions non équimolaires avec un excès d’urée, tout en restant en dessous des
seuils d’inhibition pour l’enzyme (1.1 M) diminuent l’efficacité du procédé soit par un
emballement du processus enzymatique soit par une action plus notable sur une des étapes de la
nucléation et /ou de la croissance cristalline.

La formation des cristaux de carbonate de calcium peut être influencée par la présence de
matière organique autre, par exemple les déchets du métabolisme présents dans la suspension
bactérienne. Il est possible que l’impact soit plutôt favorable lorsque les concentrations restent
faibles.

220
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

3. Impact de la réinjection de la solution calcifiante, sur la formation des cristaux.

Le procédé de bio-calcification repose sur le couple biomasse – solution calcifiante qui

déclenche la précipitation du carbonate de calcium. Mais, en fonction du lieu d’adhésion des
bactéries et de leur concentration, la précipitation se déroulera dans des pores ou dans les
zones inter-granulaires. Lorsque les cristaux se développent dans les zones intergranulaires, la
disponibilité en urée et/ou en calcium est moindre que dans les pores, et devient rapidement
un facteur limitant de la croissance cristalline. En effet, cette croissance pendant la durée de
batch repose essentiellement sur des phénomènes de convection ionique autour des bactéries
et des cristaux. Par ailleurs, si la croissance cristalline se réalise de manière anarchique, elle
crée des amas de cristaux de carbonate de calcium, imbriqués. Ces amas croissent dans toutes
les directions ce qui, à première vue, limite, à l’échelle nanométrique, l’efficacité du procédé.
Mais des cristaux imbriqués, de par leur taille et leur forme, sont plus difficiles à déplacer que
des monocristaux, lorsqu’arrivent les flux suivants. Dans l’hypothèse première, pour
améliorer le procédé, il faudrait réduire les pertes de ces croissances anarchiques au profit de
l’apparition de nouveaux cristaux ou de l’élongation du cristal de départ.
Ces phénomènes d’élongation cristalline avaient été observés au MEB, lors des
premiers essais d’injection en colonne (Figure n°93). Une recirculation des effluents en
colonne avait été appliquée pour évaluer l’effet des vitesses d’injection de chantier sur la
précipitation des cristaux de carbonate de calcium. Dans ce type de protocole, une partie de la
biomasse et de la matière organique résiduelle de la suspension poussée par la solution
calcifiante est collectée en sortie de la colonne et est injectée à nouveau dans celle-ci. Ce
liquide est donc un mélange, de proportions inconnues, de bactéries, d’urée et d’ions calcium.

Figure n°93 : L’élongation des cristaux selon un seul axe. Images MEB de [Link].

Il semble que ces conditions soient propices à des allongements de cristaux. Cependant, les
croissances cristallines obéissent aussi et surtout à la taille de l’espace dont elles disposent
pour se développer. Les colonnes dont sont issues ces observations ont été compactées
différemment et leur espace inter granulaire était plus grand.

4. Impact de l’ajout d’inuline dans la solution calcifiante.

Il est difficile d’intégrer ces résultats dans les références bibliographiques que l’on
peut trouver. En effet, deux types de publications apparaissent, les unes sont des études
purement cristallographiques réalisées sur des minéraux synthétisés chimiquement, sous
différentes contraintes, mais sans intervention bactérienne. Les secondes, plus rares, décrivent
des cristaux de carbonate de calcium obtenus par action bactérienne, dans des systèmes très
différents de celui des colonnes.

221
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

D’après Tainchu Chen (2005), la formation de cristaux de carbonate de calcium dont

la croissance se développe selon un axe, avec des bords arrondis, ne peut pas être obtenue
dans une solution purement minérale. L’intervention des molécules organiques est nécessaire
pour obtenir ces formes atypiques. Ces expériences n’étant pas menées en conditions
aseptiques, une bio minéralisation peut être suspectée. Le rôle de macro molécules dans le
contrôle de la croissance cristalline a été également soulevé par Xie et al. (2005). Cet auteur
précise que 0.1 et 0.5 % de macro molécules sont présentes dans les biominéraux testés. Dans
le cas de la nacre, la masse de la matière organique est estimée à près de 2 %. L’implication
de la matière organique est confirmée par les expériences de Larsen (1997), où l’auteur a
observé des morphologies complexes de carbonate de calcium avec 2 µg/l de peptides
contenant des paires d’acides aspartiques. L’élimination du peptide de la solution conduit à la
reprise d’une croissance cristalline pour former des rhomboèdres. Au-delà d’une certaine
quantité, il y a diminution du taux de précipitation par complexification des cations dans la
matrice cristalline. Ce phénomène est amplifié lorsque la concentration en calcium est
limitante (Kitano et al., 1965 ; Meldrum et al., 2001, Bosak et al., 2004 ; 2005). La vitesse de
cristallisation peut être diminuée de moitié en présence de matière organique (Ferris, 2006).
La morphologie des cristaux est déterminée par la face qui croit le moins vite. De plus,
d’après cet auteur, une croissance de carbonate de calcium sans ajout de matière organique
donnerait un cristal rhomboédrique. Par contre, l’allongement des cristaux le long d’un axe a
été observé en présence de dipeptides à 3° C. Selon Kitamura, 2002 ; Wei et al., 2007, non
seulement, l’action de la matière organique sur la croissance cristalline ne fait aucun doute,
mais, les auteurs ont montré qu’en ajoutant différents polymères celle-ci était contrôlable. Ils
suggèrent que l’ajout de ces additifs permet de réaliser des formes très variées de cristaux de
carbonate de calcium, mais précisent que la température de l’expérience a une influence non
négligeable.
Pour tenter d’intervenir sur la création de site de nucléation, et/ou de diriger la
croissance cristalline de la matière organique sous la forme de 1 g/l de chicorée, a été ajoutée
dans la solution calcifiante, bien que celle-ci contienne déjà de l’urée. La chicorée est une
source d’inuline dont l’ajout dans la biomasse présentait un impact positif sur l’adhésion des
bactéries. Pour la tester dans la solution calcifiante, un premier essai a été réalisé sur deux
colonnes de sable de Fontainebleau NE 34 (Tableau n°93). Les résistances à la compression
simple sont deux fois plus élevées lorsque de la chicorée a été ajoutée à une concentration de
1 g/l (Tableau n° 93 et Figure n°94).

Tableau n°93 : Caractéristiques des colonnes Colonne n°1 Colonne n°2

Caractéristiques des Type de sable Sable de Fontainebleau NE 34
colonnes mises en jeu DO cellulaire 0.68
Biomasse
pour tester l’impact A.E (mS/min) 0.377
de la chicorée dans la Densité du sable 1.74 ± 0.04 coefficient de variation 3 %
solution calcifiante. Porosité apparente 0.38 ± 0.01 coefficient de variation 2 %
Durée de batch de la biomasse 3 heures
2+ 0.5 M Urée – 0.5 M Urée - CaCl2
Solution calcifiante [U/Ca ]
CaCl2 chicorée 1g/l
Nombre de V.p de solution
5
calcifiante
Mode d’injection Continu Semi continu
Durée de batch de la solution
/ 3
calcifiante (h)
Vitesse réelle d’injection (m/h) 0.2
Rc (MPa) 0.037 0,072

222
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Figure n°94 : Deux courbes

2
de résistance simple à la
compression. La courbe n°1 a
été obtenue avec la solution
1
calcifiante sans additif, la
seconde lorsque 1 g/l de
chicorée lyophilisée a été
ajouté.

Cependant cette amélioration pourrait aussi être attribuée au mode d’injection de la

solution calcifiante. Donc, pour confirmer et compléter ces premières données, une étude, sur
un plus grand nombre de colonnes (12) a été mise en place. Ces nouvelles colonnes seront
ensuite comparées à des colonnes qui ont été faites pour étudier l’impact de la nature du sel de
calcium sur le processus de bio calcification. Par ailleurs, pour une meilleure efficacité du
traitement et des raisons technico – économiques telles que le coût du traitement des effluents,
une réduction de la quantité d’additif a permis de passer de 1 g/l à 0.5 g/l (Tableau n°94).

Tableau n°94 : Caractéristiques des colonnes pour le test de l’ajout de la matière organique
dans la solution calcifiante.

Caractéristiques générales des colonnes

Type de sable Sable de Fontainebleau brut
DO cellulaire 1.68 ± 0.7322 avec un coefficient de variation de 45 %
Biomasse
A.E (mS/min) 0.618 ± 0.29 avec un coefficient de variation de 47 %
Densité du sable 1.68 ± 0.02, coefficient de variation de 1 %
Porosité apparente 0.38 ± 0.01, coefficient de variation de 2 %
Durée de batch de la
3 heures
biomasse
2+
Solution calcifiante [U/Ca ] 0.5 M Urée - CaCl2 avec 0.5 g/l de chicorée
Nombre de V.p de solution
5
calcifiante
Mode d’injection Semi continu
Durée de batch de la solution
3 heures
calcifiante
Vitesse réelle d’injection
0.2
(m/h)

Ces essais sont marqués par de fortes variations de la qualité de la suspension de

biomasse. Ceci est la conséquence du pilotage en parallèle des deux axes de recherche,
l’amélioration de la production de la biomasse et l’amélioration de la bio calcification en
colonnes et du décalage dans la progression. La qualité de la biomasse est un paramètre
difficile à maitriser, car la production d’enzyme est inductible et dépend de nombreux facteurs
de culture.

Ce travail a nécessité de nombreux essais sur des milieux de culture différents, avec
des conditions différentes. Les suspensions obtenues, lorsque les DO étaient voisines ou
supérieures à 1 avec des activités enzymatiques supérieures à 500 µS/ml/min, servaient à faire

223
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

les tests en colonnes. On peut considérer que ces variations ont permis ainsi de tester une
large gamme de qualités différentes de biomasse (Tableau n°95).

Tableau n°95 : Variation des paramètres biologiques des biomasses injectées cultivées sans
ou avec chicorée (CHIC).

Effectifs Moyenne Minimum Maximum Ecart-type Coefficient

de Variation
A.E (µS/min) 13 746 294 1190 258 34 %
D.O cellulaire 13 1.80 0.84 2.50 0.60 33 %
A.E (µS/min)
12 617 377 1200 290 47 %
(CHIC)
D.O cellulaire
10 1.3 0.67 1.6 0.38 28 %
(CHIC)

Les différents essais ont conduit à une amélioration à la fois sur les valeurs moyennes
de résistance à la compression simple (RC) et des teneurs en carbonates de calcium. La
présence de chicorée dans la solution calcifiante semblerait entrainer une amélioration des
performances de la bio calcification (Figures n°95 et 96), ce qui permettrait alors d’obtenir
de meilleures résistances à la compression simple avec une teneur en carbonate de calcium
plus faible. Cependant les trop grandes variations de la qualité des suspensions de biomasse
injectées dans les deux lots de colonnes testées ne permettent pas d’avoir une certitude totale.

0.90 0.080
Moyenne
Moyenne±Erreur-Type Moyenne±1.96*Err
0.85 0.075

0.80 0.070

0.75 0.065
CaCO3 (g/cm3)
RC (MPa)

0.70 0.060

0.65 0.055

0.60 0.050

0.55 0.045

0.50 0.040

0.45 0.035
RC- sans CHIC CaCO3 -sans CHIC
RC-CHIC CaCO3 -CHIC

224
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Figure n°95 : Représentation des variations des Rc et des teneurs en CaCO3 en présencede la
chicorée (CHIC) ou en son absence de chicorée (sans CHIC) dans le milieu calcifiant (12
colonnes).

0.15
Figure n°96 : Représentation
0.14 des variations du rapport
CaCO3/RC en fonction de la
0.13
présence (CHIC) ou de
l’absence (sans CHIC) de
CaCO3/ RC ( g/cm3/Mpa)

0.12
chicorée dans la solution
0.11 calcifiante.

0.10

0.09

0.08

0.07

0.06

0.05
(CaCO3/RC)-Sans CHIC
(CaCO3/RC)-CHIC

Pour compléter l’analyse de l’effet de la chicorée sur le processus de bio

minéralisation, des observations au MEB sur 3 colonnes ayant eu un ajout de matière
organique sous forme de chicorée ont été réalisées par S. Castanier et G. Levrel (Figure
n°97).

Sable

Sable

Figure n°97 : Illustrations de quelques cristaux de carbonate de calcium dont l’élongation se

réalise le long d’un axe (flèches pleines). Les amas de cristaux enchevêtrés apparaissent
moins nombreux (flèche en pointillée). Les flèches en pointillée vertes en tirets montrent une
zone de croissance cristalline avec sur cette surface la présence de bactéries.

L’amélioration de la solution calcifiante, permet d’augmenter les performances de la

bio calcification, et, il semblerait, de plus, que la précipitation du carbonate de calcium sous
l’impact des bactéries, puisse être dirigée à l’échelle nanométrique. Ceci est d’autant plus
intéressant que les concentrations nécessaires pour engager ces phénomènes sont très faibles

225
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

<1 g/l. Par ailleurs, la chicorée est peu coûteuse à l’achat, et d’après les sociétés HYTEC et
IANESCO Chimie, chargées du traitement des rejets, sa présence dans la solution calcifiante
ne produira pas de surcoût lors du traitement des effluents. En fait, dans le cas où elle ne serait
pas utilisée in situ, elle serait traitée dans le pool de C organique, car c’est un produit bio
assimilable et donc bio dégradable. Elle augmenterait cependant la DBO5. L’impact sur
l’environnement est donc minimisé.

Il a été envisagé que cette voie ait un intérêt industriel, puisqu’elle permettrait
éventuellement de réduire les quantités d’urée et de calcium utilisées. La chicorée dont le
sucre majoritaire est l’inuline est donc ajoutée à la fois dans les suspensions de biomasse pour
stimuler l’adhésion de bactéries et dans la solution calcifiante. Dans les deux cas, cela ne
conduit pas à l’augmentation des volumes de solution, ni au changement des viscosités des
fluides injectés. Ainsi l’utilisation de la chicorée comme procédé d’amélioration de l’adhésion
de S. pasteurii sur les grains de sable et son emploi dans la solution calcifiante a fait l’objet
d’un dépôt de brevet.

226
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

IV. CHOIX DU SEL DE CALCIUM (CaCl2 ou Ca (NO3)2) LE PLUS

PERFORMANT POUR OBTENIR UNE BIO CALCIFICATION
MAXIMALE.

1. Introduction.

La solution calcifiante est un mélange équimolaire d’une source d’ions carbonates,

sous forme d’urée et d’une source de calcium, sous forme d’un sel. La source de calcium peut
être du chlorure de calcium (CaCl2) ou bien du nitrate de calcium (Ca (NO3)2). Le choix du
sel de calcium a une importance cruciale sur le coût du procédé. En effet, deux principaux
paramètres sont à prendre compte : le coût des matières premières et celui du traitement des
effluents. Ainsi une première estimation des coûts a été réalisée pour une qualité de la source
de calcium, dite technique (Tableau n°96).

Tableau n°96 : Comparaison

entre les critères économiques et Ca(NO3)2 CaCl2
les contraintes pratiques entre le 21,4 € / kg 11,5 € / kg
nitrate de calcium et le chlorure Coût 5 € / mole de 1,8 € / mole de Ca2+
de calcium (modifié d’après Ca2+
Paradis, 2007). Nécessité de filtrer les
Prétraitement
aucun impuretés après
nécessaire
dissolution
Formation d’un précipité
Réactions blanc lors de la
aucune
secondaires dissolution dans de l’eau
du réseau urbain

Ainsi, une mole de calcium sous forme de nitrate de calcium est 2.7 fois plus onéreuse
qu’une mole de Ca2+ sous forme de chlorure de calcium. De plus, en fonction de l’état
d’hydratation de la molécule, une mole de nitrate calcium représente entre 164 et 236 g soit à
peu près une fois et demi à deux fois la masse d’une mole de chlorure de calcium (112 g). En
raison des volumes manipulés et des concentrations utilisées sur le chantier, ces paramètres
influent fortement sur le coût du transport et du stockage des produits. Ils sont également des
facteurs directement liés à l’efficacité du procédé et sont déterminants pour le choix du sel de
calcium.

En contre partie, le chlorure de calcium nécessite un prétraitement de filtration pour

retirer les différentes impuretés et éviter un colmatage du sable au niveau du point d’injection.
Par ailleurs, la dissolution de ce sel entraine une réaction très exothermique qui dans certains
cas et dans certaines régions, pourrait favoriser une précipitation de carbonate de calcium avec
les carbonates contenus dans l’eau du réseau urbain. Le nitrate de calcium est plus pur et sa
dissolution dans l’eau est endothermique, et ceci n’induit pas le même phénomène, même à une
forte concentration (1 M).

Le second aspect à prendre en compte est celui du traitement des effluents du procédé.
En effet, selon les normes en vigueur et d’après la loi Cadre (2006/118/NE), l’eau contenue
dans le sous-sol de la zone traitée doit retrouver ses qualités chimiques initiales. Ainsi, le

227
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

niveau de traitement dépend donc de la composition chimique de l’eau de la nappe, de son

histoire et de son utilisation (irrigation ou potabilisation) ainsi que de la nature du sel de
calcium utilisé et de son degré de pureté.
En effet, la pureté du chlorure de calcium est moins bonne que celle du nitrate, car il est
associé à différents métaux lourds (zinc, plomb) à des concentrations de l’ordre de la centaine
de milligramme par kilo de chlorure de calcium. Ceci n’est pas le cas avec le nitrate de
calcium. Or, une étude menée par deux sociétés spécialisées dans l’analyse chimique et le
traitement des effluents industriels (IANESCO et HYTEC), a pû montrer que la technique
employée ainsi que le dimensionnement des installations, dépendront surtout du sel de calcium
choisi. Ces effluents n’auront pas les mêmes propriétés physico chimiques. En effet, dans le cas
d’un sel de chlorure de calcium, les rejets sont hautement corrosifs. Ces problèmes de
corrosion s’intensifient au fur et à mesure des étapes de concentration des effluents à pH
maîtrisé. Pour le CaCl2, un facteur de concentration de 15 peut être obtenu (NH4Cl) contre un
facteur de 30 avec le nitrate de calcium (NO3 (NH4)2). Or, dans le cas du chlorure d’ammonium
les chlorures sont très rapidement toxiques pour l’environnement, ce qui est une limite
supplémentaire à sa revalorisation. Pour ce qui est du nitrate d’ammonium, il possède un risque
d’ignition en fonction de son état de déshydratation (solide ou liquide). Mais sous forme
liquide, il est aisément revalorisable sous forme d’engrais.

Le choix du sel de calcium nécessite de réaliser le compromis le plus judicieux pour à la

fois obtenir un procédé performant dans le cadre d’une exploitation industrielle et respecter les
paramètres environnementaux. Il est donc nécessaire au préalable d’étudier l’impact de la
nature du sel sur le processus de bio calcification.

2. Impact de la nature du sel de calcium sur les résistances à la compression

verticale.

2.1. Le protocole expérimental.

Les tests ont été faits sur 27 colonnes dont 14 ont reçu du chlorure de calcium et 13 du
nitrate de calcium. Les suspensions de biomasse ont été produites sur le milieu de culture SBF-
Chic-Vit et caractérisées par des mesures d’activité enzymatique et de D.O.600 faites juste avant
l’injection.
La suspension de biomasse et la solution calcifiante à 0.5 M (Urée-CaCl2 ou Ca(NO3)2)
ont été injectées dans des colonnes de 20 cm avec le protocole adapté aux conditions de
chantier (0.2 m/h). L’injection d’un V.p de biomasse est suivie d’un batch de 3 heures (semi
continu), puis cinq volumes de porosité de solution calcifiante sont injectés, chacun séparés par
un batch de 3 heures. Une séquence complète d’injection se réalise en 24 heures et à
température ambiante (20° C). Enfin les colonnes n’ont pas subi de rinçage en fin d’expérience
et ainsi, le cinquième volume de porosité de la solution calcifiante reste en place jusqu’aux
essais de compression simple immédiatement à la fin de l’expérience (Figure n°98). Dans ces
conditions les activités bactériennes sont maintenues.

228
 Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Figure n°98 : Les 13 premières colonnes

de cette série sont découpées puis
débarrassées de leur enveloppe en PVC
pour être enfin soumise à la compression
non confinée. Elles ont toutes un
élancement de 2.

Les colonnes dégagées de leur coque en PVC sont soumises à la compression non
confinée à l’aide d’une presse uni axiale. Ensuite, des échantillons de ces colonnes ont été
broyés puis soumis à des analyses de teneur en carbonate de calcium. L’ensemble des résultats
brut ayant servi aux diverses études statistiques se trouvent dans le Tableau n°97

Tableau n°97 : Résultats obtenus avec les 17 colonnes injectées avec soit du chlorure de
calcium, soit du nitrate de calcium.

CaCO3 Vitesse
CaCO3 A.E A.E.S D.O. RC Densité (CaCO3 mesuré
A.E/Rc d’hydrolyse
(g/cm3) (µS/min
/Rc) /CaCO3 (mS/min/MPa)
Rc/D.O.
(µS/min) cellulaire (MPa) apparente de l’urée
/D.O.) théorique
(µM/min)
609
Ca(NO3)2 0,093 450 360 1,250 0,674 1,674 0,137 0,877 0,668 0,539
CaCl2 0,072 623 541 1,150 0,503 1,662 0,143 0,680 1,239 0,437 472
CaCl2 0,072 408 381 1,070 0,852 1,671 0,084 0,680 0,479 0,796 472
Ca(NO3)2 0,066 737 545 1,350 0,501 1,674 0,132 0,627 1,471 0,371 435
Ca(NO3)2 0,042 360 428 0,840 0,598 1,682 0,071 0,401 0,602 0,712 278
CaCl2 0,093 658 582 1,130 0,904 1,662 0,102 0,877 0,728 0,800 609
CaCl2 0,066 342 388 0,880 0,560 1,662 0,118 0,627 0,611 0,636 435
Ca(NO3)2 0,072 637 458 1,390 1,053 1,663 0,068 0,680 0,605 0,758 472
Ca(NO3)2 0,064 294 303 0,970 0,798 1,645 0,081 0,609 0,368 0,823 423
CaCl2 0,093 664 477 1,390 1,216 1,655 0,076 0,877 0,546 0,875 609
Ca(NO3)2 0,066 735 378 1,940 0,387 1,649 0,171 0,627 1,899 0,199 435
CaCl2 0,051 735 378 1,940 0,364 1,685 0,141 0,487 2,019 0,188 338
CaCl2 0,062 735 378 1,940 0,831 1,661 0,075 0,592 0,884 0,428 411
CaCl2 0,082 912 396 2,300 0,417 1,649 0,196 0,773 2,187 0,181 536
CaCl2 0,076 912 396 2,300 0,936 1,708 0,081 0,718 0,974 0,407 498
Ca(NO3)2 0,080 912 396 2,300 0,790 1,714 0,101 0,755 1,154 0,343 524
Ca(NO3)2 0,070 912 396 2,300 0,430 1,682 0,163 0,664 2,121 0,187 460
Ca(NO3)2 0,082 1190 487 2,440 0,523 1,685 0,156 0,773 2,275 0,214 536
CaCl2 0,064 1190 487 2,440 0,477 1,675 0,134 0,606 2,495 0,195 421
Ca(NO3)2 0,057 776 301 2,570 0,304 1,682 0,186 0,536 2,553 0,118 372
Ca(NO3)2 0,059 776 301 2,570 0,393 1,674 0,149 0,555 1,975 0,153 385
CaCl2 0,056 776 301 2,570 0,361 1,676 0,155 0,529 2,150 0,140 367
CaCl2 0,050 776 301 2,570 0,189 1,655 0,267 0,477 4,106 0,074 331
Ca(NO3)2 0,054 961 549 1,750 0,484 1,658 0,112 0,515 1,986 0,277 357
Ca(NO3)2 0,055 961 549 1,750 0,693 1,678 0,080 0,524 1,387 0,396 363
CaCl2 0,044 961 549 1,750 0,154 1,649 0,283 0,413 6,240 0,088 286
CaCl2 0,046 961 549 1,750 0,161 1,685 0,283 0,431 5,969 0,092 299

229
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Plusieurs traitements ont été appliqués à ces données. L’établissement d’une droite de
Henry, bien qu’elle ne constitue pas, réellement, un test statistique, est une procédure
graphique, pratique et rapide, permettant de vérifier la présomption de normalité pour une
population dont on observe un échantillon. Le principe de la méthode repose sur la liaison
linéaire entre une variable normale x (moyenne m, écart-type σ) et la variable réduite u, (u = (x
– m)/ σ). Le tracé d'un graphique de Henry peut suffire dans de nombreux cas. Dans d’autres il
est nécessaire de le compléter avec des tests plus statistiques. Ainsi, le test de Kolmogorov-
Smirnov qui est basé sur la différence maximale entre la distribution cumulée de l’échantillon
et la distribution cumulée théorique, a été appliqué. Alors que le test de Kolmogorov-Smirnov
permet de comparer la fonction de répartition d'une variable aléatoire centrée et réduite à celle
de la loi normale de moyenne nulle et d'écart-type unité; celui de Lilliefors, appliqué ensuite,
compare la fonction de répartition d'une variable aléatoire quelconque à celle d'une loi normale
de moyenne et d'écart-type non spécifiée (µ et σ).

2.2. Détermination des facteurs essentiels agissant sur la bio calcification et de leurs
interactions.

L’étude porte sur l’interaction de 6 variables : l’activité enzymatique (A.E), la densité

optique (D.O. cellulaire), l’activité enzymatique spécifique (A.E.S), la résistance à la
compression maximale (Rc), la teneur en carbonate de calcium (CaCO3 (g/cm3))) ainsi que la
densité (d). Pour chacune de ces variables, 27 observations ont été réalisées. Une première
analyse de corrélation a été établie sans prendre en compte dans un premier temps, la nature du
sel de calcium. Cette étude permet d’établir une tendance générale des interactions
significatives entre les variables dans ces conditions expérimentales (Tableau n°98). Les
corrélations sont significatives lorsque la valeur de p, l’indice de fiabilité du résultat, est par
convention inférieure à 0.05 lorsqu’on analyse des données biologiques. Lorsqu’on analyse
simultanément six variables mathématiquement indépendantes, le taux de corrélation doit être
supérieur à 0.4 pour déclarer que les corrélations sont significatives. Les corrélations peuvent
être positives, et dans ce cas les paramètres évoluent dans le même sens. Elles peuvent être
négatives, évoluant en sens inverse.

Tableau n°98 : Les corrélations pour les 6 variables composées chacune de 27 observations.
Les corrélations significatives sont marquées en rouge et correspondent à p < 0.05.

CaCO3 A.E A.E.S D.O RC Densité

Variables
(g/cm3) (µS/min) (µS/min/D.O) cellulaire (MPa) apparente
CaCO3
1.00
(g/cm3)
A.E (µS/min) - 0.09 1.00
A.E.S
0.06 0.35 1.00
(µS/min/D.O.)
D.O.
- 0.14 0.75 - 0.34 1.00
cellulaire
Rc (MPa) 0.64 - 0.34 0.09 - 0.43 1.00
Densité
0.02 0.02 - 0.05 0.30 - 0.05 1.00
apparente

Quatre variables sont significativement liées entre elles dans le processus de bio
calcification. Il s’agit de l’A.E, de la D.O.., de la Rc et de la teneur en carbonate de calcium
(CaCO3). Deux corrélations positives lient l’AE et la D.O., et, la Rc et la teneur en CaCO3. Par
contre, la D.O. cellulaire de la suspension de biomasse n’est pas du tout en relation avec la Rc.

230
 Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Les caractéristiques de ces variables présentent une forte dispersion des points ce qui traduit
une très forte hétérogénéité intrinsèque (Tableau n°99).

Tableau n°99 : Description statistique des variables significatives de la bio calcification.

Coefficient
N Ecart -
Moyenne Médiane Mode Minimum Maximum de
Actifs type
variation
CaCO3
27 0.066 0.066 Multiple 0.042 0.093 0.014 22
(g/cm3)
A.E (µS/min) 27 753 776 Multiple 294 1190 236 31
D.O cellulaire 27 1.800 1.750 Multiple 0.840 2.57 0.5871 33
Rc (MPa) 27 0.576 0.503 Multiple 0.154 1.216 0.2737 47.5

En fait dans ce tableau, sont réunies des variables qui contrôlent le procédé (D.O. et
A.E) que l’on peut appeler des « variables d’entrée » ainsi que des variables d’évaluation des
performances de celui-ci telles que la Rc, la teneur en CaCO3 (« variables de sortie »). Les
coefficients de variations (CV) provenant de la biomasse (A.E et D.O.) montrent des
coefficients de variation plus élevés mais comparables (31 et 33 %). Mais, la teneur en
carbonate de calcium a un CV de 22 %, soit deux fois moins grand que celui de la variable Rc
(47 %). Ceci suggère que la bio production dans la colonne est contrôlée par d’autres
paramètres qui jouent sur l’impact des variations de la biomasse en les atténuant. La variable
Rc semble dévoiler une hétérogénéité dans le procédé. Cette hétérogénéité se remarque
également par la présence de la multitude de modes pour chacune des variables observées,
créant ainsi, des nuages de points sans liaison apparente. Ceci signifie que l’hétérogénéité à
l’entrée du procédé pourrait se retrouver amplifiée dans le produit final.

Il est donc nécessaire de caractériser plus précisément les tendances liant les différentes
variables et de tenter d’identifier les phénomènes impliqués dans ces trois corrélations
significatives. Dans un premier temps, il a été fait une recherche de la nature des liaisons entre
les variables d’entrée, premières sources éventuellement responsables de l’hétérogénéité du
processus de bio précipitation. Dans ce cadre, la liaison D.O. cellulaire – A.E présente un
coefficient de dispersion élevé (R2 = 0.55) (Figure n°99) ce qui tend à confirmer l’hypothèse
précédente.

Nuage de Points : A.E (µS/min) vs. D.O cell (Obs. à VM ignorées) Figure n°99 :
D.O cell = .40133 + .00186 * A.E (µS/min) Représentation de la
Corrélation: r = .74672
10
corrélation liant l’activité
5
enzymatique (A.E) et la densité
optique (D.O). Les
0
3.0
histogrammes montrent la
2.8
2.6
distribution des observations
2.4
2.2
en fonction de la valeur de la
2.0 D.O cellulaire (X) ou de l’A.E
D.O c ell

1.8
1.6
1.4 (Y). La courbe en rouge figure
1.2
1.0 une distribution théorique
0.8
0.6 suivant la loi normale. Les
0.4
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 5 10 courbes en pointillés délimitent
A.E (µS/min)
95% de confiance
l’intervalle de confiance à
0.95.

231
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Le paramètre d’activité enzymatique spécifique (A.E.S) est à interpréter avec

précaution, car la relation significative liant l’activité enzymatique (A.E) avec la D.O. cellulaire
montre une forte dispersion des points, en dehors même de la bande de confiance. Cette
information suggère également fortement, qu’une synthèse non constitutive de l’enzyme est en
partie responsable de ce décalage. En effet, ceci signifie que l’enzyme n’est pas distribuée de
manière homogène dans la population bactérienne, mais que sa distribution obéit très
probablement à une autre loi. La distribution des points de la D.O. cellulaire, est proche d’une
droite de Henry, ce qui tend à confirmer l’hypothèse d’une distribution suivant la loi de Gauss
(Figure n°100), mais ceci n’est pas totalement confirmé par les tests de normalité (Tableau
n°100). De manière encore plus significative, pour l’activité enzymatique, les points s’alignent
en une droite (R2 = 0.98) (Figure n°101). Ceci est également confirmé par les tests de
normalité.

A.E A.E.S D.O CaCO3 Rc

Test de
Tableau n°100 : Test de Kolmogorov- oui non non oui oui
normalité sur les 5 variables Smirnov (D)
principales du procédé. Test de
oui non oui oui oui
Lilliefors (D)
Normalité
Pas
avec 5 % de
oui non assez oui oui
risque
représentatif
d’erreur

Droite de Henry : D.O cell

2.0
1.5
1.0 Figure n°100 : Les D.O
V . No rm a le Th é o riq u e

0.5 cellulaires des

0.0 Histogramme : D.O cell
K -S d=.17316, p> .20; Lilliefors p<.05
suspensions bactériennes
-0.5 11
10
Courbe Normale Théorique
avant injection présentent
N ombre d' obs ervations

-1.0 8
7
6
dans le diagramme de
5

-1.5 4
3
2
Henry un nuage de points
1

-2.0 0
0.5 1.0 1.5 2.0

X <= B orne de catégorie

2.5 3.0 ne suivant pas totalement
-2.5 une ligne droite.
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8
Valeur

232
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Droite de Henry : A.E (µS/min)

2.0

1.5

1.0 Figure n°101: Les

V . No rma le Th é o riq u e

0.5 activités enzymatiques

0.0 Histogramme : A.E (µS/min)
K-S d=.13487, p> .20; Lilliefors p<.20
Courbe Normale Théorique
(A.E) des suspensions
-0.5
14

12 bactériennes avant

N ombre d' obs erv ations

-1.0
10

8 injection, présentent dans

-1.5
6

4 le diagramme de Henry
-2.0
2

0
200 400 600 800 1000 1200
un nuage de points ne
-2.5
X <= B orne de catégorie
suivant pas une droite.
200 400 600 800 1000 1200 1400
Valeur

Contrairement à l’activité enzymatique, la distribution de l’activité enzymatique

spécifique (AES = AE/D.O..) ne suit pas la loi normale (Figure n°102). Ceci est confirmé par
les tests de normalité réalisés suivant le test de Kolmogorov - Smirnov et celui de Lilliefors
(Tableau n°99) sur les variables d’entrée et de sortie du procédé.

Droite de Henry : A.E.S (µS/min/D.O)

2.5
His togram me : A.E.S (µS/mi n/D.

2.0 K-S d=.19 20 0, p<.20 ; Lil li efo rs p<

Courbe Normal e Thé ori que
11
10

1.5 9
N o m b re d ' o b s e rv a t i o n s
V. N o rm a le T hé or iq ue

8
7
6

1.0 5
4
3
Figure n°102 : Les A.E.S
2

0.5 1
0
250 300 350 400 450 500 550 600
s‘écartent de la droite des
valeurs normales
X <= Borne de c atégorie

0.0
-0.5 théoriques.
-1.0
-1.5
-2.0
250 300 350 400 450 500 550 600
Valeur

La faible liaison de l’A.E.S avec l’A.E ou la D.O., prises séparément, s’explique par
l’éloignement de la distribution de l’activité enzymatique spécifique d’une distribution
normale. Ces observations confirment que la variable A.E.S n’est pas suffisamment
représentative pour être utilisée dans l’analyse de cette étude. De plus, l’éloignement d’une
distribution par rapport à la normale peut également être dû à des suspensions injectées, de
qualités différentes. En effet, lorsque les suspensions bactériennes atteignent la phase
stationnaire, une toxicité cellulaire peut rapidement apparaître et provoquer une libération de
l’enzyme par lyse des cellules. Ce phénomène provoquerait ainsi une différence significative
entre l’A.E réelle (activité de l’enzyme intracellulaire) et l’AE apparente (enzyme
intracellulaire et enzyme libre) conduisant à une valeur de l’A.E.S biaisée. Ainsi, deux
phénomènes concomitants peuvent expliquer ce décrochage, la distribution non homogène de
l’enzyme dans une population bactérienne et l’existence de fuite d’enzyme par lyse cellulaire
ce qui a pour effet d’augmenter artificiellement l’activité enzymatique globale de la suspension
bactérienne.

233
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

L’existence d’enzyme libre peut modifier l’efficacité du processus de précipitation.

Leur adhésion sur les grains de sable n’est pas identique à celle d’une bactérie et donc leur
lessivage non plus. De plus, la dénaturation de l’enzyme hors de la protection cellulaire sera
plus rapide. On peut penser que ce pouvoir enzymatique ne sera pas pérenne dans un substrat
sableux. Par ailleurs, ces enzymes libres, malgré les différentes inhibitions qu’elles peuvent
subir durant le procédé, tendent vers un système où les conditions de sursaturation seront
élevées et plus rapidement atteint du fait de l’absence de membrane celluliaire. Dans ce cas, les
cristaux de carbonate de calcium pourront être de plus petits tailles. Cet aspect est très
probablement une source supplémentaire d’hétérogénéité dans le procédé de bio calcification.

Les impacts de la D.O., du Rc et de la teneur en CaCO3 sont liées par deux corrélations
significatives (Rc/CaCO3) et (Rc/D.O.). Elles indiquent deux tendances opposées, ce qui
contribue à l’hétérogénéité du processus de bio calcification (Figure n°103).

Nuage de Points : CaCO3 (g/cm3) vs. RC (MPa) (Obs. à VM ignorées) Nuage de Points : D.O cell vs. RC (MPa) (Obs. à VM ignorées)
RC (MPa) = -.2256 + 12.122 * CaCO3 (g/cm3) RC (MPa) = .93738 - .2007 * D.O cell
Corrélation: r = -.4306
Corrélation: r = .64191
8
8

4 4

0 0
1.6 1.6

1.4 1.4

1.2 1.2

1.0 1.0
RC (MPa)

0.8
RC (MPa)

0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
-0.2
0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11 0 4 8 -0.2
0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 0 4 8
CaCO3 (g/cm3)
95% de confiance D.O cell 95% de confiance

Figure n°103 : Corrélations liant les variables (Rc/CaCO3) à droite et (Rc/DO) à gauche.

Ainsi, la liaison positive lie l’augmentation de la teneur en carbonate de calcium avec la

résistance maximale à la compression, ceci malgré une dispersion importante (R2 = 0.41). La
liaison négative se trouve entre la résistance à la compression (Rc) et la densité optique
(D.O.600) avec un R2 égal à 0.18. Les deux n’ont pas une liaison linéaire comme semblent le
confirmer des coefficients de variation élevés (Tableau n°99). Le nuage de points répond à une
autre loi de distribution notamment pour le carbonate de calcium car les points s’alignent
autour d’une droite de Henry (Figure n°104). La distribution de type gaussienne de la teneur
en carbonate de calcium est confirmée par les tests de normalité (Tableau n°100).

234
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Droite de Henry : CaCO3 (g/cm 3)

2.0

1.5

1.0 Figure n°104 : Droite de

V. Normale Théorique

0.5 Henry pour la variable

0.0
Histogramme : CaCO 3 (g/cm

K-S d=.09066, p> .20; Lilliefors p> .20

Courbe Normale Théorique
3
)
teneur en carbonate de
-0.5
9

8 calcium. L’histogramme

No m b r e d 'o b se r va tio n s
7

-1.0
6

4
présente la distribution du
-1.5
3

2
CaCO3. La courbe en
1

-2.0
0
0.03 0.04 0.05 0.06 0.07
X <= Borne de catégorie
0.08 0.09 0.10 rouge montre une
-2.5 distribution suivant la loi
0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 normale.
Valeur

Cette étude statistique semble souligner une forte dépendance entre la teneur en
carbonate de calcium et l’activité enzymatique et dans une moindre mesure avec la D.O.
cellulaire.

La Figure n°103 montrait la relation entre la Rc et la D.O., et bien que la distribution

des résistances mécaniques (Rc) suive une loi normale (Tableau n°100), le rapport Rc/D.O.
s’en écarte, ce qui suggèrerait que la distribution des points n’est pas dominée seulement par un
phénomène biologique. En effet, l’étude statistique des résultats semble indiquer, qu’il existe
aussi une relation susceptible d’augmenter la dispersion des points, à dominance physique telle
que, par exemple, un effet filtrant du sable. Cette propriété du sable conduirait au phénomène
suivante, plus la D.O. cellulaire est élevée, plus la Rc est faible. Cependant sous le caractère
D.O. se cache aussi le caractère AE (activité enzymatique) et ceci peut fausser les
interprétations.

Ainsi, pour comprendre ce phénomène, une hypothèse peut–être proposée dans le cas
des colonnes fabriquées avec du sable de Fontainebleau qui sont fortement compactées de
densité apparente 1.67 ± 0.02.

Dans cette hypothèse, si la D.O. cellulaire est augmentée, la pénétration de la

suspension bactérienne à ces vitesses d’injection, est limitée par l’effet de filtration du sable.
En conséquence, la bio calcification devient hétérogène avec la création d’un gradient
décroissant de cimentation depuis le point d’injection. En effet plus la D.O. cellulaire est élevée
plus elle est filtrée, ceci provoquerait alors, au passage de la solution calcifiante, de fortes
précipitations de carbonate de calcium dans les zones où la densité cellulaire est élevée. Ce
phénomène entrainerait alors une diminution notable du volume poreux dans les premiers
centimètres de la colonne pouvant aller jusqu’au colmatage. Le sable des zones éloignées du
point d’injection, contenteraient peu de carbonate de calcium, ou en tous cas, en dessous de la
quantité nécessaire et serait très peu ou pas cimenté. Cette tendance ne peut pas être observée
avec la seule analyse statistique de la teneur en carbonate de calcium puisqu’il s’agit d’une
valeur moyenne de tout l’échantillon ( L = 12 cm), le gradient de carbonate de calcium est ainsi
effacé.

L’intérêt d’identifier par cette analyse statistique, la nature des liaisons entre les
variables significatives du procédé, était de mieux appréhender l’influence des phénomènes
observés. Cependant, cette analyse permet aussi d’identifier pour un suivi de qualité, les points
aberrants, c'est-à-dire ceux qui sortent d’une distribution normale. Pour cela, d’autres tests
statistiques sont nécessaires pour renforcer ces tendances.

235
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Pour établir un premier profil type de l’interaction des variables significatives de la bio
calcification en colonne, une représentation en 3 dimensions des résultats obtenus est associée à
un ajustement par la distance pondérée des moindres carrés. Cette méthode ajuste une courbe
en utilisant une régression polynomiale calculée pour chaque valeur sur l’échelle de la variable
X afin de déterminer la valeur Y correspondante de sorte que l’influence des points individuels
décroisse à mesure que leur distance à une valeur X particulière augmente. Cette méthode
facilite l’interprétation des différents phénomènes mis en jeu (Figures n°105 et 106).

> 1
< 1
< 0.8
< 0.6
< 0.4
< 0.2
< 0

Figure n°105 : Représentation en 3D de l’A.E (µS/min) en fonction du CaCO3 (g/cm3) et du

Rc (MPa) (Z = Distance pondérée des Moindres Carrés).

La Figure n°105 présente une bosse là où le maximum de résistance à la compression

maximale simple est obtenu avec des teneurs en carbonates de calcium entre 0.6 et 0.1 g/cm3 et
des A.E. comprises entre 400 et 800µs/cm/min. Ainsi, les courbes d’iso réponses suggèrent que
ces résistances plus élevées ne sont pas obtenues avec de fortes activités enzymatiques ni avec
des D.O. cellulaires élevées. En effet, le décrochage du processus s’opère lorsque la D.O. est
dans les valeurs les plus élevées (D.O. > 2.6, ce qui correspond à des concentrations
supérieures à 1.109 cellules /ml (Figure n°106).

236
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

>1
<1
< 0.8
< 0.6
< 0.4
< 0.2
<0

Figure n°106 : Représentation en 3 D, de la D.O cellulaire en fonction du CaCO3 (g/cm3) et du

Rc (MPa) (Z = Distance pondérée des Moindres Carrés).

Cette étude statistique, sans tenir compte pour l’instant de la nature de la source de
calcium (chlorure ou nitrate), identifie des paramètres clés dans le processus de bio
calcification lorsque celui-ci est dans le cadre d’une séquence d’injection de 5 V.p de solution
calcifiante à 0.5 M, à 20° C, espacés par des batch durant 3 heures, et cela avec du sable de
Fontainebleau en colonne de 20 cm et à des vitesses d’injection basses (0.2m/h).

En conclusion et pour ces conditions, le procédé de bio calcification aboutit à des sables
mieux cimentés lorsque les teneurs en carbonate de calcium avoisinent les 0.1 g/cm3 ; par
contre, il semble que les fortes activités enzymatiques et les densités optiques élevées parce
qu’elles créent de l’hétérogénéité, soient contre performantes pour les valeurs les plus élevées,
testées dans le cadre de cette expérimentation. Il s’agit de performances limitées à la partie
supérieure des colonnes, c'est-à-dire dans le premiers tiers. Ceci signifie qu’un faible volume
de sable est réellement consolidé, accentuant l’hétérogénéité du processus.

D’autre part, la diminution des performances du processus de bio calcification montre

que l’activité enzymatique, liée ou pas à une forte D.O. cellulaire, provoque un changement
rapide des conditions du micro environnement en favorisant un état de sursaturation rapide et
maintenu élevée très propice à la précipitation et la croissance de cristaux de plus petites tailles.
Ces derniers ont une probabilité moins grande d’intervenir mécaniquement dans la colonne
sauf s’ils sont en grande quantité, ce qui est le cas de colmatage au niveau du point d’injection.
Ce phénomène est dû à la double fonction de la biomasse, agent de l’hydrolyse de l’urée et site
de nucléation. Ainsi lorsque, la D.O. cellulaire est élevée, l’effet filtrant du sable est plus
efficace, ce qui favoriserait une bio calcification préférentiellement à l’entrée des zones inter
granulaires qui représentent des espaces plus étroits où l’écoulement des fluides est perturbé.
Le temps de contact favorise l’agglutination des cellules à l’entrée et dans les zones inter
granulaires (2 grains de sables) et une production de CaCO3 localisée.

Or, pour obtenir une résistance mécanique maximale, il faut que l’activité enzymatique
soit propice à la formation de grands cristaux constituant des ponts plus ou moins liés avec les

237
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

grains de sable, mais localement stables. De plus, éviter que l’AE ne soit pas trop élevée pour
ne pas induire un changement trop rapide des concentrations en substrats (urée et calcium) tout
en maintenant élevée la concentration en carbonate qui contrôle la croissance des cristaux. Par
ailleurs, les trop fortes D.O. cellulaires favorisent aussi la fixation des bactéries dans les pores
(espace entre trois grains) peut-être au détriment de la colonisation des espaces inter
granulaires. Il y aura un effet de dilution des cristaux. Les cristaux auront une probabilité
moindre à croitre dans les zones intergranulaires. Aux vitesses d’injection testées et avec les
durées de batch appliquées ce phénomène a beaucoup d’impact. Cette tendance doit être
confirmée et/ou vérifiée en fonction la nature du sel de calcium utilisé.

2.3. Impact de la nature du sel de calcium sur la bio calcification.

Cette étude statistique qui inclut 27 colonnes pour deux sources de calcium (chlorure de
calcium ou nitrate de calcium) et intègre cette nouvelle variable, suggère deux comportements
distincts de ces sels, dans les conditions expérimentales testées (Tableaux n°101 et 102)

Tableau n°101 : Corrélations entre les 5 variables composées chacune de 27 observations,

lorsque la source de calcium est le nitrate de calcium. Les corrélations significatives sont
marquées en rouge (avec p < 0.05).

Ecarts CaCO3 A.E D.O RC

Ca(NO3)2 Moyennes Densité
Type (g/cm3) (µS/min) cellulaire (MPa)
CaCO3 (g/cm3) 0.066 0.0134 1.000
A.E (µS/min) 746 258 0.143 1.000
D.O. cellulaire 1.80 0.6058 0.144 0.762 1.000
RC (MPa) 0.59 0.2094 0.287 - 0.320 - 0.525 1.000
Densité apparente 1.67 0.0178 0.010 0.376 0.321 - 0.321 1.000

L’analyse montre que seule la liaison positive liant la D.O. cellulaire et l’activité
enzymatique est significative dans le cas de colonnes injectées avec une solution calcifiante de
nitrate de calcium. Ceci semble indiquer que la source de calcium n’agit pas sur l’ensemble de
ces variables. Par contre, ce qui peut être déterminant dans le succès de la bio calcification, ce
sont les interactions de la D.O. cellulaire et de l’activité enzymatique avec les ions nitrates
libérés dans les liquides interstitiels. Par contre, dans le cas du chlorure de calcium, deux
liaisons significatives sont influencées par la présence des ions chlores (Tableau n°102).

Tableau n°102 : Corrélations entre les 5 variables composées chacune de 27 observations,

lorsque la source de calcium est le chlorure calcium. Les corrélations significatives sont
marquées en rouge (avec p <0.05).

Ecarts CaCO3 A.E D.O RC Densité

CaCl2 Moyennes
Type (g/cm3) (µS/min) cellulaire (MPa) apparente
CaCO3 (g/cm3) 0.066 0.016 1.000
A.E (µS/min) 760 223 - 0.296 1.000
- 0.371
D.O. cellulaire 1.8 0.592 0.733 1.000
RC (MPa) 0.57 0.330 0.824 - 0.381 - 0.393 1.000
Densité apparente 1.67 0.016 - 0.144 0.210 0.246 0.091 1.000

En effet, le procédé de bio calcification, lorsqu’il met en jeu une solution calcifiante de
chlorure de calcium, est significativement lié de manière positive aux caractéristiques de la

238
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

biomasse (D.O. et A.E) mais aussi à la teneur en CaCO3 pour obtenir une résistance à la
compression non confinée(Rc). Ces observations suggèrent un comportement différent de ces
sels au moment de la précipitation, mais cela ne se traduit pas dans les résistances à la
compression simple obtenues (Figure n°107).

1.0 Figure n°107 : Résistances maximales

0.9
moyennes atteintes lors des tests de
Résistance (MPa)

0.8
0.7
compression verticale simple en fonction de
0.6 Ca(NO3)2
la source de calcium (sur 27 colonnes).
CaCl2
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

Cette figure semble montrer qu’il n’existe pas de différences significatives sur les
moyennes des résistances maximales à la compression non confinée entre les deux sels de
calcium pour du sable de Fontainebleau. Ceci est confirmé par un test de Student bilatéral
(0.92 ; p < 0.05). Cependant, l’écart-type des Rc issus des essais avec du chlorure de calcium
est de 1/3 plus élevé par rapport à celui du nitrate de calcium (Tableaux n°101 et 102). Cette
tendance est confortée par un coefficient de variation plus élevé (CV = 0.58) pour le chlorure
de calcium contre 0.35 pour le nitrate de calcium, soit une différence de 40 %. Ces variations
intrinsèques de Rc peuvent être dues à des distributions différentes de la teneur en carbonate de
calcium, influencées par la nature du sel et cela, sans que les résistances maximales à la
compression ne montrent de différences significatives sur l’ensemble du lot testé. De plus,
lorsque la résistance à la compression résiduelle est prise en compte, près de 38 % des
échantillons traités avec du chlorure de calcium ont une absence de résistance résiduelle, contre
15 % pour le nitrate de calcium. Ceci semble décrire une distribution plus uniforme du
carbonate de calcium avec le chlorure de calcium. Peut-être ceci est-il lié à une formation plus
abondante de flocs lors de l’injection d’une solution calcifiante contenant du nitrate de calcium.
Lorsque les résistances à la compression sont comparées aux teneurs en carbonate de
calcium de ces mêmes échantillons en fonction du sel utilisé, une corrélation plus élevée (R =
0.8242) a été mise en évidence avec le chlorure de calcium malgré une dispersion élevée (R2 =
0.6998) (Figure n°108).
RC (MPa) CaCl2 = 0.0456*exp(35.2501*x)
1.4

1.2

1.0 Figure n°108 : Courbe de

tendance liant la résistance à la
RC (MPa) CaCl2

0.8
compression avec la teneur en
0.6 carbonate de calcium lorsque la
source de calcium est le chlorure
0.4
de calcium.
0.2

0.0
0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10

CaCl2 (CaCO3 g/cm3)

239
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Un coefficient de dispersion R2 de 0.7 a pu être mis en évidence avec une courbe de

tendance de type exponentiel entre la Rc et la teneur en carbonate de calcium pour le chlorure
de calcium. Ce coefficient de dispersion est beaucoup trop élevé pour que cette tendance soit
prise sérieusement en compte, on peut cependant noter que cette même tendance n’apparaît pas
du tout, avec le nitrate de calcium (R2 = 0.086). Donc dans ce cas, il y a, une absence totale de
liaison linéaire ou exponentielle entre le RC et la teneur en carbonate de calcium (Figure
n°109).

RC (MPa) Ca(NO3)2 = 0.2888+4.505*x; 0.95 Int. Conf.

RC (MPa) Ca(NO3)2 = 0.3308*exp(7.8086*x)
1.1

1.0
Figure n°109 : Absence de
0.9
R2 = 0.0826
liaison entre la Rc et la teneur en
CaCO3 en présence de nitrate de
RC (MPa) Ca(NO3)2

0.8

0.7 calcium (linéaire : rouge,

0.6 exponentielle : vert).
R2 = - 1.359
0.5
Les courbes en pointillés
représentent l’intervalle de
0.4
confiance de 0.95.
0.3

0.2
0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
Ca(NO3)2 CaCO3 g/cm 3

L’absence de liaison linéaire ou exponentielle entre Rc et la teneur de CaCO3 est

confirmée par la dispersion de nombreux points en dehors de la bande de confiance. Cependant
il est possible que le nitrate de calcium suive un autre type de distribution, car, le nuage de
point semble plus compact que celui du chlorure de calcium.

Tableau n°103 : Récapitulatif des résultats pour la résistance à la compression (Rc,) de la

teneur en carbonate de calcium et l’activité enzymatique (A.E), pour les deux sels.

Nature
Ecart- Coefficient de
Paramètres du sel de N Actifs Moyenne
type variation %
calcium
(CaCO3) (g/cm3) CaCl2 14 0.066 0.016 24
RC (MPa) CaCl2 14 0.566 0.330 58
A.E (µS/min) CaCl2 14 761 224 29
(CaCO3) (g/cm3) Ca(NO3)2 13 0.066 0.013 20
RC (MPa) Ca(NO3)2 13 0.587 0.209 35
A.E (µS/min) Ca(NO3)2 13 746 258 34

Si l’on rassemble les résultats pour les deux sels (Tableau n°103), la distribution des
teneurs en carbonate de calcium est plus compacte lorsque la source de calcium est sous forme
de nitrate de calcium. Ceci est vérifié par un coefficient de variation des teneurs en CaCO3 de
20 %, soit 4 % de moins par rapport à celui obtenu en présence de chlorure de calcium. A cela
s’ajoute, un écart type de 0.013 g/cm3, pour Ca(NO3)2 soit 19 % moins élevé que pour le CaCl2
(0.016 g/cm3). Ceci n’est cependant pas significatif et surtout n’est pas en accord avec le test de

240
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Student (test Student : 0.7831 avec p < 0.05) qui ne montre pas de différence significative entre
ces deux sels de calcium testés, quant à la quantité de carbonate de calcium précipité. Cette
différence de distribution si elle est admise, ne provient pas non plus d’une différence d’A.E
injectée (0.99 avec p < 0.05) ni d’une différence significative de D.O.
Cette différence de répartition de nuage de points mise en évidence par l’étude
statistique laisse supposer qu’il y a des interactions autres, probablement au niveau des anions
de ces sels de calcium et des cellules et/ou au niveau du processus de précipitation. Ceci est
d’autant plus valable que la souche est susceptible d’utiliser le nitrate comme accepteur
terminal d’électrons en anaérobiose en remplacement de l’oxygène. Il pourrait donc avoir un
rôle important en ce qui concerne la physiologie bactérienne et donc peut-être indirectement
l’hydrolyse de l’urée. A cela s’ajoute les concentrations utilisées (0.5 M) qui sont suspectées
d’entrainer certaines contraintes physiologiques importantes.

2.4. Impact de la nature du sel de calcium en fonction des activités enzymatiques.

2.4.1. Impact sur les RC et sur les teneurs CaCO3.

Les analyses précédentes ont abouti à la conclusion que la nature du sel de calcium
n’avait pas une influence très notable. Cependant, il faut vérifier ceci en fonction de l’activité
enzymatique. Lorsque les teneurs en carbonate de calcium et les RC, en fonction du type de sel
de calcium employé, sont représentées en liaison avec une activité enzymatique (AE)
croissante, deux tendances semblent se dégager (Figure n°110).
1.4 1.4

Ca(NO3)2 CaCl2
1.2
RC (MPa)
1.2 Médiane RC (MPa)
Points atypiques Médiane
1.0 Points atypiques

1.0
0.8
RC (MPa)

RC (MPa)

0.8 0.6

0.4
0.6

0.2

0.4
0.0

0.2 -0.2
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 200 400 600 800 1000 1200 1400
A.E (µS/cm/min) A.E (µS/cm/min)

0.11 0.11
CaCl2
Ca(NO3)2 0.10
0.10
CaCO3 (g/cm3)
Médiane CaCO 3 (g/cm3)
Points atypiques Médiane
0.09
0.09 Points atypiques

0.08
CaCO 3 (g/cm3)

CaCO 3 (g/cm3)

0.08

0.07

0.07
0.06

0.06
0.05

0.05
0.04

0.04 0.03
200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 1400
A.E (µS/cm/min) A.E (µS/cm/min)

241
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Figure n°110 : Représentations en bag plot de la distribution des résistances à la

Compression maximales (Rc) et de la teneur en CaCO3 en fonction de l’accroissement
des activités enzymatiques. Les graphiques du haut concernent de droite
à gauche, les Rc en fonction du chlorure de calcium et du nitrate de calcium.
Les deux graphiques du bas, mettent en relation la teneur en carbonate de calcium en fonction
de l’accroissement de l’A.E pour le CaCl2 à gauche et pour le Ca(NO3)2 à droite.

La teneur en carbonate de calcium et Rc en fonction de l’accroissement de l’activité

enzymatique ne montrent pas de liaison forte. En effet, le nuage de points apparaît plus
compact lorsque le sel de calcium utilisé est sous forme de nitrate que ce soit pour les valeurs
de Rc ou pour les teneurs en carbonate de calcium. L’augmentation de l’activité enzymatique
semble n’avoir que peu d’impact sur l’efficacité de processus bio-calcification en présence de
nitrate de calcium, contrairement, à ce qui se produit avec le chlorure de calcium. Avec celui-
ci, les réponses présentent plus de variations.

2.4.2. Impact sur le rapport CaCO3/Rc.

L’étude de la distribution statistique des valeurs du rapport (CaCO3/Rc) en fonction de

la nature du sel de calcium et de l’accroissement de l’A.E, montre une réduction de l’efficacité
du processus (Figures n°111 et 112 et Tableau n°104). Elle est plus prononcée pour le
chlorure de calcium car il y a diminution simultanée de la teneur en CaCO3 et des Rc.

Ca(NO3)2 CaCl2
0.11 1.1 0.11 1.4

CaCO3 (g/cm3)(G)
Médiane(G) 1.0
0.10 Points atypiques(G) 0.10 1.2
RC (MPa)(D)
Médiane(D)
Points atypiques(D) 0.9
0.09 0.09 1.0

0.8
0.08 0.08 0.8
CaCO3 (g/cm3)
CaCO3 (g/cm3)

(Rc)MPa

0.7
RC (MPa)

0.07 0.07 0.6

0.6

0.06 0.4
0.06
0.5

0.05 0.2
0.05 CaCO3 (g/cm3) (G)
0.4
Médiane(G)
Points atypiques(G)
0.04 RC (MPa) (D) 0.0
0.04 0.3 Médiane(D)
Points atypiques(D)
0.03 -0.2
0.03 0.2 0 400 800 1200
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 200 600 1000 1400
A.E (µS/cm/min) A.E (µS/cm/min)

Figure n°111 : Superposition pour chacun des sels de calcium des teneurs en CaCO3 et des
valeurs de Rc en fonction de l’accroissement des activités enzymatiques.

242
 Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Ca(NO3)2 CaCl2
0.40 0.40

0.35 0.35 (CaCO3/RC)- CaCL2

Médiane
Points atypiques

0.30 0.30
(CaCO3/Rc)-Ca(NO3)2

(CaCO3/Rc)- CaCl2
0.25
0.25

0.20
0.20

0.15
0.15

0.10
0.10

0.05
0.05

0.00
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 200 400 600 800 1000 1200 1400
A.E (µS/cm/min) A.E (µS/cm/min)

Figure n°112 : Rapport (CaCO3/RC) par rapport à la nature du sel de calcium en fonction de
l’accroissement de l’A.E.

Tableau n°104 : Variations des rapports CaCO3/RC en fonction du sel de calcium et des A.E
injectées.

Nature du sel Ecart Coefficient de

Paramètres N Actifs Moyenne Minimum Maximum
de calcium - type Variation %
A.E (µS/min) Ca(NO3)2 13 746 294 1190 258 34
A.E (µS/min) CaCl2 14 760 342 1190 223 29
(CaCO3/RC) CaCl2 14 0.153 0.075 0.283 0.076 49
(CaCO3/RC) Ca(NO3)2 13 0.124 0.068 0.186 0.040 32

L’efficacité du procédé semble dépendre de l’augmentation de l’activité enzymatique

injectée, mais de manière plus prononcée dans le cas du chlorure de calcium. Ceci suggère une
plus grande instabilité du système pour ce sel. A contrario, le processus de bio calcification
apparaît plus stable en présence de nitrate de calcium. En effet, il faut en moyenne 0.12 g/cm3
de CaCO3 pour obtenir une résistance maximale de 1 MPa pour une activité injectée de 1200
µS/cm/min. Avec le chlorure de calcium, l’efficacité du traitement diminue d’au moins 20 %
pour cette même gamme d’activité passant ainsi à 0.15 g/cm3.

243
 Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

2.4.3. Impact de la nature du sel de calcium sur le taux de précipitation

(CaCO3 mesuré/CaCO3 théorique) et sur les vitesses d’hydrolyse de
l’urée.

La diminution de l’efficacité de la bio calcification quantifiée par le rapport « CaCO3

mesuré/CaCO3 théorique » en fonction de l’accroissement de l’A.E n’est pas accentuée ou
atténuée par l’une ou l’autre des sources de calcium (Tableau n°105).

Tableau n°105 : Variations du taux de précipitation en fonction de la nature du sel de calcium

et de l’activité enzymatique injectée.
Coefficient
Nature
N Ecart- de
Paramètres du sel de Moyenne Minimum Maximum
Actifs type Variation
calcium
%
A.E (µS/min) Ca(NO3)2 13 746 294 1190 258 34
A.E (µS/min) CaCl2 14 760 342 1190 223 29
CaCO3 mesuré/CaCO3
CaCl2 14 0.626 0.413 0.877 0.151 24
théorique
CaCO3 mesuré/CaCO3
Ca(NO3)2 13 0.626 0.401 0.877 0.127 20
théorique

En effet, les moyennes de taux de précipitation sont identiques, avec un taux de 62 %. Par
contre, il semble que l’ensemble du processus de bio précipitation soit moins stable lorsque le
sel utilisé est le chlorure de calcium. En effet, le coefficient de variation est 4 % de plus élevé
et ceci pour un coefficient de variation d’activité enzymatique de 6 % plus faible. Cette légère
variation suggère en conséquence une réponse plus stable et plus compacte lorsque le sel de
calcium utilisé est le nitrate de calcium.
L’augmentation de l’activité enzymatique a un effet non négligeable mais l’impact sur
l’hydrolyse est différent comme le montre une représentation en "Bag Plots (Figure n°113).
Celle-ci permet de mieux apprécier la tendance des taux de précipitation en fonction de la
nature du sel de calcium.

1.1 1.1

1.0 1.0
CaCO3(Ca(NO3)2 mesuré)/CaCO3 théorique

0.9 0.9
CaCO3(CaCl2 mesuré)/CaCO3 théorique

0.8 0.8

0.7 0.7

0.6 0.6

0.5 0.5

0.4 CaCO3(CaCl2 mesuré)/CaCO3 théorique 0.4 CaCO3(Ca(NO3)2 mesuré)/CaCO3 théorique

Médiane
Médiane Points atypiques
Points atypiques 0.3
0.3

0.2 0.2
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 1400
A.E CaCl2 (µS/cm/min) A.E Ca(NO3)2 (µS/cm/min)

Figure n°113 : Distribution du taux de précipitation en fonction de l’accroissement de

l’activité enzymatique selon la nature du sel de calcium (CaCl2 à gauche) et Ca(NO3)2 (à
droite) pour une solution calcifiante de 0.5 M et une durée totale de batch de 15 heures.

244
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Ceci suggère l’hypothèse d’un agissement différent des anions issus de ces deux
sels de calcium. Dans les deux cas, ces anions (Cl- et NO33-) interviennent dans le processus de
précipitation du carbonate de calcium et ont un rôle biologique différent. En effet, les ions
chlorures transitent au niveau des canaux ioniques chlorures qui se trouvent dans la membrane
cytoplasmique et interviennent dans la régulation des charges inter membranaires en
maintenant le potentiel de membrane. Par contre, les ions nitrates, ont besoin pour pénétrer
dans la cellule de transporteurs membranaires qui se mettent en place lorsque la concentration
en oxygène devient limitante (< 0.5 mg/l). Dans ce cas, ces ions deviennent les accepteurs
terminaux d’électrons de la chaine respiratoire.

Or, plus l’activité d’hydrolyse est élevée, plus le maintien de l’équilibre ionique devient
énergétiquement couteux et ceci probablement d’autant plus, qu’il s’agit du CaCl2. Les ions
chlorures pénètrent plus rapidement dans la cellule ce qui consomme de l’énergie et épuise la
bactérie et, donc, limite son potentiel enzymatique d’hydrolyse de l’urée et la bio calcification
dans la colonne. Les effets de ces anions sur le processus de précipitation sont nombreux et
complexes. Ils peuvent masquer des sites potentiels de nucléation, notamment pour les ions
nitrates qui sont les plus encombrants. Ce mécanisme épargnerait très probablement les sites de
nucléations les plus importants, c'est-à-dire les parois bactériennes et cela pourrait expliquer, la
plus grande stabilité du taux de précipitation. Ce taux de précipitation moyen identique pour
ces deux sels peut également s’expliquer par une perte du potentiel enzymatique conséquent à
une mort cellulaire accélérée par la diminution des réserves énergétiques et/ou par un
encroutement des cellules dans une gangue de carbonate de calcium.

En conséquent, l’obtention de 100 % d’hydrolyse semble difficile à atteindre, d’autant

plus que le taux réel est établi à partir d’une valeur moyenne de la teneur en carbonate de
calcium dosée sur des échantillons de colonnes écrasées en excluant les extrémités de colonne.
Ainsi, ces valeurs ne peuvent pas montrer les variations fines intrinsèques des teneurs réelles.
Par ailleurs, l’accessibilité de la solution de calcifiante et la diffusion de l’urée aux bactéries
diminuent au fur et à mesure des injections et cela sans prendre en compte la diminution du
potentiel enzymatique de la colonne. En effet, la bio précipitation freine la diffusion de l’urée et
du calcium dans le réseau ouvert de porosité. Les ponts calciques diminuent la taille des
espaces inter granulaires. A cela, s’ajoutent les difficultés de diffusion à travers la membrane
bactérienne encroutée.
Ceci semble signifier que la durée des batchs pourrait être de plus en plus longue entre les 5
injections de solution calcifiantes. De plus, un autre phénomène et non des moindres, limite
l’obtention de taux élevés d’hydrolyse. En effet, les injections successives peuvent accentuer
l’effet de lessivage du potentiel enzymatique hors de la colonne. Par conséquent,
l’établissement d’une nouvelle relation permettant d’estimer la vitesse d’hydrolyse en condition
réelle doit être établi. En effet, une première estimation a permis de relier la variation de
conductivité avec l’hydrolyse de l’urée (1 mS/min = 14.4 mM hydrolysées/min). Cette relation
a été obtenue avec de l’uréase pure dans les conditions de Mickaëlis Menten à pH 9.2 et à 20°
C. Pendant les premiers essais en colonne, des expériences parallèles, réalisées dans des
béchers, ont permis de proposer une seconde estimation de l’hydrolyse de l’urée en présence
d’un sel de calcium. Cette nouvelle relation suggérait de diviser la quantité d’urée hydrolysée
par 5 ou 5.5. Mais ces derniers essais restent encore très éloignés des conditions réelles. Ces
derniers essais de bio précipitation en colonne en fonction de la nature du sel autorisent
l’élaboration d’une troisième estimation de la vitesse l’hydrolyse de l’urée à partir de
conditions plus en adéquation avec une application de chantier.

245
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Les taux de précipitation ont été enregistrés à partir de la teneur en carbonate de

calcium présent dans des échantillons soumis à la compression non confinée. Le protocole a
permis d’injecter 5 V.p de 0.25 l chacun, d’une solution équimolaire d’urée et de calcium à 0.5
M soit un volume total de 1.25 l. La quantité d’urée injectée totale est de 0.625 mole pour les 5
V.p. Ces 5 volumes ont été injectés en une heure, avec un temps d’immobilisation des fluides
de 3 heures entre chaque injection. C’est au cours de cette stabilisation de la solution calcifiante
que l’hydrolyse s’opère préférentiellement. A partir de ces données il est possible d’établir une
série de coefficients à appliquer à l’activité enzymatique mesurée avant injection pour obtenir
la vitesse d’hydrolyse en conditions réelles. Ainsi, la relation stœchiométrique de la réaction de
précipitation permet de dire que 0.625 mole d’urée donneront autant de mole de carbonate et
donc autant de mole de carbonate de calcium. Ainsi, la quantité théorique de carbonate de
calcium pouvant être obtenu dans une colonne modèle est d’environ 62.5 g pour 1034 g de
sable, soit près de 0.06 g pour 1 g, soit 0.108 g/cm3. Cette valeur permet d’estimer le taux de
précipitation (CaCO3 mesuré / CaCO3 théorique) des échantillons écrasés et d’en déduire la
quantité d’urée hydrolysée durant la durée des temps de batch (Tableau n°106).

Tableau n°106 : Distribution des vitesses d’hydrolyse en fonction de la nature du sel de

calcium.
sel de Coefficient
N Ecart
Paramètres Moyenne Minimum Maximum de Variation
calcium Actifs - type
(%)
V hydrolyse urée CaCl2
14 434 286 609 105 24
(µM/min)
V hydrolyse urée Ca(NO3)2
13 435 278 609 87 20
(µM/min)

Ainsi, les vitesses d’hydrolyse de l’urée dans les 27 colonnes montrent dans ces
conditions d’application une vitesse moyenne de 435 µM/min tout sel de calcium confondu. La
vitesse d’hydrolyse trouvée est en moyenne 26 fois plus faible par rapport à la première
estimation obtenue avec de l’uréase pure et de 5 fois plus faible par rapport à la deuxième
estimation réalisée en bécher en présence de calcium. En fait, la vitesse d’hydrolyse de l’urée
est influencée par la quantité de sel de calcium et très légèrement voire pas du tout par la nature
du sel utilisé.
Si l’on considère les vitesses d’hydrolyse par rapport aux Rc, en fonction du type de sel
de calcium, une différence existe. Il y a une très légère corrélation (R = 0.87) avec le Rc en
présence du chlorure de calcium de (R2 = 0.67) (Figure n°114) qui n’existe pas du tout (R =
0.28) en présence du nitrate de calcium (R2 = 0.08).
RC (MPa) = -0.5608+0.0026*x; 0.95 Int. Conf.
1.4

1.2

r = 0.8242; p = 0.0003; r² = 0.6793

1.0
RC (MPa)

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
250 300 350 400 450 500 550 600 650
V hydroyse urée(µM/min)-CaCl2

Figure n°114 : Rc en fonction des vitesses d’hydrolyse estimées pour le chlorure de calcium.

246
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Ces conclusions ont été établies pour une concentration de solution calcifiante. de 0.5 M
Or, si le procédé est amené à changer de sel de calcium, de concentration ou de durée de batch,
elles seront à compléter.

3. Visualisation statistique des performances de la bio calcification en fonction de la

nature du sel de calcium.

Pour réaliser un choix entre les deux sels, il est maintenant nécessaire de faire une
analyse statistique globale de l’ensemble des variables significatives du procédé. En effet,
l’efficacité du procédé (CaCO3/RC) pour ce type de sable est étroitement dépendante de la
vitesse d’hydrolyse, du taux de précipitation de la D.O. cellulaire de la nature du sel utilisé et
de la concentration de la solution calcifiante (Figures n°115 et 116).

3.1. Visualisation statistique des performances avec le chlorure de calcium.

La figure n°115 montre dans le cas d’une solution contenant du chlorure de calcium, la
présence d’un « couloir vert » où l’efficacité est maximale pour un rapport CaCO3/RC faible.

Plus les valeurs des vitesses d’hydrolyse et de D.O. cellulaires augmentent, plus le rapport
CaCO3/RC augmente, ce qui signifie qu’il faut une teneur en carbonate de calcium de plus en
plus élevée pour obtenir une résistance de 1 MPa.

> 0.575
< 0.55
< 0.45
< 0.35
< 0.25
< 0.15
< 0.05

Figure n°115 : Représentation en 3D de la vitesse d’hydrolyse (Hydrolyse urée (µM/min)) en

fonction de la D.O. cellulaire et de l’efficacité du procédé (CaCO3/RC) lorsque le calcium est
sous forme de CaCl2.

247
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Deux raisons sont liées à cela, d’une part une vitesse d’hydrolyse de l’urée trop élevée ce qui
favorise l’apparition simultanée d’une multitude de points de nucléation et d’autre part, le
maintien en conséquence d’une vitesse de précipitation élevée. Ces mécanismes conduisent
vers une distribution de cristaux de petites dimensions ce qui peut réduire leur impact
mécanique pour une même quantité de calcium introduite. D’autre part, lorsque la D.O.
cellulaire est trop élevée, l’effet filtrant du sable diminue la pénétrabilité de la biomasse aux
vitesses d’injection, appliqués actuellement.
Ce couloir d’ailleurs se rétrécit lorsque les D.O. et les activités enzymatiques
augmentent (550 à 650µM/min) mais se maintient pour des activités enzymatiques comprises
entre 300 et 400 µM/min. De part et d’autre de ce rétrécissement, trois situations néfastes
apparaissent.
Lorsque les vitesses d’hydrolyse sont faibles avec une D.O. élevée, la tendance est
propice à la production de gros cristaux, mais elle est limitée. En effet, la formation des
cristaux se réalise plus souvent dans un pore (3 grains de sables) et se limite à la section
supérieure de la colonne réduisant artificiellement ainsi le rapport CaCO3/RC.
Dans le cas des fortes vitesses d’hydrolyse et de D.O. cellulaires élevées, la bio
calcification est également rapidement limitée puisque la précipitation est intense avec la
formation de plus petit cristaux mais réduite à la moitié supérieure de la colonne.
Enfin, lorsque les D.O. cellulaire et les activités enzymatiques sont faibles. La durée des
temps d’immobilisation des fluides « batch » dans ces conditions expérimentales est insuffisant
pour permettre une la bio précipitation suffisante.

De manière similaire, lorsque l’activité enzymatique injectée est analysée par rapport au
taux de précipitation et à l’indicateur d’efficacité (CaCO3/RC), une zone de maximum
d’efficacité en forme de Y apparait (Figure n°116).

1
2

> 0.7
< 0.7
< 0.6
< 0.5
< 0.4
< 0.3
< 0.2
< 0.1

Figure n°116 : Représentation en 3D de l’activité enzymatique injectée (A.E (µS/min) en

fonction du taux de précipitation (CaCO3 mesuré/CaCO3 théorique) et de l’indicateur
d’efficacité (CaCO3/RC) pour une source de calcium sous forme de CaCl2.

248
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

A la base du Y, une zone de maximum d’efficacité, élargie, peut être définie par un taux
de précipitation compris entre 60 et 90 % et des activités injectées allant de 300 à 800 µS/ml.
Les deux fourches du Y suggèrent, deux tendances. La première (1) est délimitée par des
activités élevées de 1000 à 1100 µS/min, pour des taux de précipitation de 50 à 70 %. De part
et d’autre de cette zone, l’efficacité décroit. Du coté droit (3), le taux de précipitation faible ne
permet pas la formation d’une quantité suffisante de cristaux pour fournir une résistance
mécanique efficace. Cette zone peut être également associée à des D.O. cellulaires élevées mais
dans ce cas il y aura très probablement un plus grand nombre de cristaux de petite taille. De
l’autre coté (2), il y a à la fois une forte activité et une forte précipitation, la diminution de
l’efficacité sera essentiellement due à de cristaux de petites tailles. Enfin, une dernière zone de
perte d’efficacité, située au niveau des faibles activités et des faibles précipitations, suggère que
le décrochage du processus peut-être dû à une quantité insuffisante de carbonate de calcium
précipité dans ces conditions expérimentales.

Dans l’hypothèse de solutions calcifiantes plus concentrées en chlorure de calcium,

avec la même distribution d’activité enzymatique, une nouvelle projection peut-être
présupposée. Très probablement, sous l’effet des différentes inhibitions (calcium, urée, et
produits de réaction) apparaissant selon les concentrations employées, un rétrécissement de la
cuvette en Y, par sa base devrait survenir. En effet, des taux de précipitation, trop faibles,
associés à des activités enzymatiques injectées également trop faibles, produiront peu de
cristaux ce qui diminuera l’efficacité du procédé. Vraisemblablement, la branche de droite du
Y, disparaitra et ne restera qu’un couloir de maximum d’efficacité au niveau des fortes
activités, associées à une diminution du taux d’hydrolyse. Cette projection est valable bien sûr
uniquement pour un protocole identique. En effet, la réduction du nombre de volumes de pore
de solution calcifiante réduira l’efficacité du procédé, sauf si elle est compensée par une
augmentation de la concentration en substrats ou en quantité. En effet, pour un cristal de
carbonate donné, et dans le cadre de ce protocole, la croissance cristalline se réalise de manière
successive au fur et à mesure des injections en suivant les lois de la cristallographie.

3.2. Visualisation statistique des performances avec le nitrate de calcium.

L’utilisation du nitrate de calcium conduit à une zone d’efficacité en cuvette plus

prononcée (Figure n°117). Le maximum d’efficacité (CaCO3/Rc compris entre 0.2 et 0.1
g/MPa), est situé dans une cuvette, délimitée par une gamme de D.O. cellulaire de 0.8 à 2 et
une vitesse d’hydrolyse entre 300 et 800 µM/min. La particularité avec le nitrate de calcium est
l’absence de zone de plateau. L’éloignement des conditions optimales conduit très rapidement
à une saturation du système. Cette tendance est très probablement due à l’interaction des ions
nitrates avec la biomasse sans que ses modalités ne soient identifiées. Néanmoins, une
hypothèse peut être proposée, puisque la diminution de l’efficacité augmente avec
l’accroissement simultané de la D.O. et l’A.E. Dans ce contexte, il y a un emballement du
système du fait du maintien de certaines fonctions vitales de la cellule. En effet, S. pasteurii
peut utiliser des ions nitrates, en condition anoxique, comme accepteur terminal d’électrons
dans sa chaine respiratoire. Ce processus de réduction dissimilatrice des nitrates conduit, à la
formation d’ions ammonium libres supplémentaires qui contribue à une alcalinisation du
biotope favorable à la précipitation du CaCO3.

249
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

> 0.2
< 0.2
< 0.18
< 0.16
< 0.14
< 0.12
< 0.1
< 0.08
< 0.06
< 0.04

Figure n°117 : Représentation en 3D de la vitesse d’hydrolyse (Hydrolyse urée (µM/min)) en

fonction de la D.O. cellulaire et de l’efficacité du procédé ((CaCO3/Rc) lorsque le calcium
est sous forme de Ca(NO3)2.
Ce phénomène d’emballement s’observe par un plateau d’efficacité lorsque le taux d’hydrolyse
se situe entre 50 et 80 %, et par une bande d’A.E entre 600 et 800 µS/min. Ce plateau s’élargit
en direction des plus fortes activités enzymatiques sans jamais atteindre de pic (Figure n°118).

> 0.3
< 0.3
< 0.2
< 0.1
<0
< -0.1

Figure n°118 : Représentation en 3D de l’activité enzymatique injectée (A.E) (µS/min) en

fonction du taux de précipitation (CaCO3 mesuré/CaCO3 théorique) et de l’indicateur
d’efficacité (CaCO3/Rc) lorsque le calcium est sous forme de Ca(NO3)2.

250
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Les deux sels de calcium ont des zones d’action qui se recoupent partiellement.
Cependant, chaque sel possède sa propre spécificité. En effet, le chlorure de calcium présente
une meilleure stabilité sur une plus grande gamme d’activité enzymatique malgré un rapport
d’efficacité moins performant en moyenne. Par contre, le nitrate de calcium est plus performant
lorsque la vitesse d’hydrolyse est faible. Ce sel a un impact physiologique probablement plus
important que les chlorures, conduit rapidement à une diminution de l’efficacité par effet de
saturation «physiologique».

L’existence de comportements différents entre ces deux sels, dans le processus de bio-
calcification, peut suggérer l’existence d’autres interactions ; telles que des interférences dans
la croissance cristalline pouvant conduire à la formation de cristaux aux performances
mécaniques moins élevées tels que la vatérite ou l’aragonite. C’est dans cette optique que des
observations au MEB sur des échantillons de deux colonnes ayant reçus des sels différents, ont
été réalisées par S. Castanier et G. Levrel..

4. Visualisation au MEB de l’impact de la nature du sel de calcium sur les cristaux

de carbonate de calcium produits.

Deux colonnes de 20 cm ont été injectées en suivant le protocole standard, avec deux
fractions d’une même biomasse, mais avec des solutions calcifiantes différentes. Les
résistances à la compression maximale obtenues sont similaires (Tableau n°107).

Tableau n°107 : Caractéristiques générales des colonnes destinées à l’observation au

MEB.

Biomasse Solution calcifiante Résultats

Résistance à
Solution
D.O. (600 A.E Source de la
Colonnes équimoléculaire
nm) (µS/min) calcium compression
[Urée/Ca++]
(MPa)
102 Ca(NO3)2 0.542
2.44 1190 0.5 M
104 CaCl2 0.577

Les échantillons permettent d’observer les cristaux à la fois dans les pores (espaces
entre 3 grains) et dans les espaces inter granulaires (espace entre deux grains). Dans ce dernier
cas, lorsqu’on voit des cristaux à la surface d’un grain de sable, ils se trouvaient in situ dans un
espace inter granulaire.
Les échantillons prélevés en haut et à mi hauteur de la colonne présentent les porosités
résiduelles les plus faibles. Les cristaux rhomboédriques, se localisent rarement dans les pores
et préférentiellement sur certains grains en fonction de leur microrelief (Figure n°119).
L’aspect des cristaux est classique. Ils ont une forme rhomboédrique et se présentent soit sous
forme de monocristaux soit sous forme de cristaux imbriqués.

251
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

COLONNE N°102 avec du Ca(NO3)2.

HAUT MI-HAUTEUR BAS

Figure n°119 : Distribution des cristaux rhomboédriques, en fonction du niveau

de la colonne n°102 (S. Castanier et G. Levrel).

La courbe d’essai de compression de cette colonne montre une série de rupture et de

reprises d’efforts, suggérant ainsi la localisation préférentielle de cristaux rhomboédriques sur
certains grains, lors de l’injection du premier V.p de la solution calcifiante (Figure n°120).

Figure n°120 : Courbes d’effort/déplacement, de la colonne n° 102 ayant reçu du nitrate de

calcium (gauche) et de la colonne n°104 injectée avec du chlorure de calcium (droite).

La structure des cristaux rhomboédriques est identique, avec des arêtes nettes, seule
diffère leur taille entre la mi-hauteur et le bas de la colonne n°102 (Figure n°121). Ces
observations confortent l’idée d’un gradient de concentration en carbonate de calcium au sein
des colonnes et suggère également un gradient de biomasse dû aux propriétés filtrantes du sable
de Fontainebleau.

MI-HAUTEUR BAS
Figure n°121 : Différence de taille entre les amas de cristaux rhomboédriques,
de la mi-hauteur et du bas de la colonne n°102 d’après S. Castanier et G. Levrel.

252
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Les observations ultramicroscopiques sur la colonne n°104, réalisée avec du chlorure de

calcium, montrent une partie plus cohésive en haut de colonne, avec plus de cristaux
rhomboédriques et d’amas de cristaux imbriqués (Figure n°122).

COLONNE N°104 avec du CaCl2.

HAUT MI-HAUTEUR BAS

Figure n°122 : Comparaison de la porosité résiduelle et de l’organisation des cristaux

entre les trois niveaux de la colonne n°104.

Il ne semble pas y avoir de différences notables entre la quantité de cristaux

rhomboédriques et d’amas de cristaux, pour un niveau et une localisation identique. Il en est de
même pour l’aspect des cristaux.
COLONNE N°102 COLONNE N°104
avec du Ca(NO3)2 avec du CaCl2

MI-HAUTEUR CENTRE
Figure n°123 : Comparaison entre les colonnes n°102 (Photos n°542 et 538) et n°104
(Photos n°586 et 585) pour les échantillons prélevés à mi-hauteur et au centre de la colonne.

253
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Lorsqu’on compare les deux colonnes (Figure n°123), on constate que les cristaux sont
d’aspect identique. Les photos n°542 et n°586 n’ont pas été prises au même grossissement, x
2 000 et x 1 000 respectivement. Les cristaux imbriqués sont de même taille autour de 30 µm.
Les observations ont montré que les cristaux rhomboédriques et les cristaux imbriqués
adhérent à la surface d’un grain de sable. Cela conforte l’idée que la nature du sel de calcium
n’intervient pas ou peu dans la croissance cristalline. Par contre la présence de matière
organique peut expliquer la croissance sous forme de cristaux rhomboédriques ou de cristaux
imbriqués. En effet, d’après Larson (1997), la présence de manière concomitante de certains
dipeptides jusqu’à des concentrations de faible (2 µg/l), permettrait de changer la morphologie
des cristaux tels que ceux présentés dans la Figure n°123.
L’incidence de la nature du sel de calcium pourrait intervenir dans la formation des
flocs. Lorsqu’une solution concentrée en ions calcium est mise en contact avec une suspension
de biomasse ayant un pH élevé (> 8.5), il apparait un précipité floconneux d’hydroxyde de
calcium et/ou de carbonate de calcium cristallographiquement amorphe (CCA) qui piège des
bactéries, et que l’on a appelé précédemment un floc. Il se désagrège, sous l’effet de la vitesse
d’injection, en micro flocs. Les observations macroscopiques faites sur les effluents de sortie
des colonnes, notent que ces flocs sont plus fréquents quand le chlorure de calcium est la
source de calcium.

En conclusion, l’incidence de la nature du sel de calcium pourrait n’intervenir que dans

la formation des flocs plus abondants dans le cas du chlorue de calcium, et donc le déplacement
de petites concentrations de potentiel enzymatique à l’intérieur des colonnes. L’ensemble des
observations réalisées, dont il n’est présenté ici qu’une petite partie, confirme que la source de
calcium n’influe pas sur la morphologie des cristaux de carbonate de calcium, ni sur leur
localisation le long de la colonne.

5. Conclusion sur l’impact de la nature du sel de calcium sur le processus de bio

calcification.

L’impact de deux sels de calcium (CaCl2 et Ca (NO3)2) a été étudié sur 27 colonnes
injectées avec une concentration équimolaire d’urée et de calcium (0.5 M), à température
ambiante. La séquence d’injection a été établie avec 5 V.p avec une vitesse réelle de 0.2 m/h.
Chaque volume de pore de solution calcifiante injecté est immobilisé pendant 3 heures. Le
principal indicateur de performance pour les deux sels de calcium est le rapport CaCO3/RC.

L’ensemble des résultats montre que la source de calcium n’influe pas de façon notable
sur la qualité de la bio calcification.

Ainsi, quelle que soit la nature du sel de calcium, plus les activités enzymatiques sont
élevées, plus l’efficacité du système diminue. La principale raison de ce phénomène réside
dans le développement de conditions très favorables à des cinétiques de précipitation élevées.
Par voie de conséquence, ces conditions favorisent une distribution de cristaux de plus petite
taille dont l’impact mécanique est moindre. De la même manière, une suspension à D.O.
cellulaire élevée sera fortement filtrée par ce fuseau granulométrique dont est issu le sable de
Fontainebleau. Cette zone de forte densité cellulaire joue le rôle « barrière à hydrolyse ». La
quantité de cellules est telle qu’elle produira les conditions favorables aux précipitations
intenses et par là même renforcera le gradient de concentration en carbonate entre le haut et le
bas de colonne. Ceci est accentué par les fortes activités enzymatiques. La structure des

254
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

cristaux de carbonate de calcium ne semble pas être influencée par la nature du sel de calcium.
Néanmoins, le nitrate de calcium pourrait avoir un impact plus fort sur la formation ou la
cohésion des flocs.

L’utilisation du chlorure de calcium permettra au procédé, une gamme plus large de

performances, notamment pour des activités enzymatiques élevées. De plus, le rapport
d’efficacité CaCO3/RC est plus élevé que celui obtenu avec le nitrate de calcium, avec une plus
grande instabilité du système lorsque les vitesses d’hydrolyse sont élevées. Par contre, dans le
cas du nitrate de calcium des performances intéressantes pourront être obtenues lorsque les
activités enzymatiques seront faibles. Pour ce sel, un phénomène de saturation apparaît très
rapidement en dehors de ce contexte précis. La diminution de l’efficacité se limite à un plateau,
et un effondrement du système semble plus limité, cela tient au fait que les ions nitrates et la
biomasse sont liés par la réduction dissimilatrice en anaérobiose.

Cette étude s’est limitée à étudier l’effet de deux sels de calcium sur les performances
de la bio calcification pour une seule concentration (0.5 M) de solution calcifiante avec une
seule vitesse réelle d’injection (0.2 m/h) et uniquement sur des colonnes homogènes de sable
de Fontainebleau. Il serait nécessaire de faire d’autres études en diversifiant ou en faisant varier
ces paramètres, notamment en augmentant le nombre de V.p de biomasse à injecter, en
changeant de sables, en utilisant une solution calcifiante non équimolaire et en changeant la
température (12° C). On peut cependant supposer que les résultats seront identiques, à savoir
que la source de calcium n’a pas de rôle significatif sur la bio calcification.

6. Choix du sel de calcium pour une application chantier.

Le protocole d’injection de chantier consiste à placer les bactéries calcifiantes dans une
zone sableuse à consolider puis à y injecter un nombre variable de V.p de solution calcifiante
pour alimenter la bio calcification et ainsi obtenir la résistance recherchée dont l’intensité
dépend du contexte de la construction. Or, dans le cadre du chantier, des paramètres
supplémentaires différents de ceux envisagés précédemment interviendront aussi. Ils se
partagent en facteurs biotiques et abiotiques.
Parmi les facteurs biotiques déterminants dans le choix du sel se retrouveront : l’activité
enzymatique injectée, la concentration cellulaire de la suspension bactérienne et la variation de
la qualité de la suspension bactérienne en fonction des conditions de conservation et de
stockage, du lieu de production jusqu’au chantier. De plus, la durée d’injection et celle du batch
appliqué à la biomasse avant le contact avec la solution calcifiante ainsi que la température du
sol voisine de 12° C, peuvent avoir des impacts différents en fonction du sel de calcium injecté
ensuite. En effet, si la qualité de la suspension bactérienne au départ, correspond à une phase
stationnaire avancée, cela sera défavorable au maintien des activités enzymatiques au cours du
temps, et donc à une proportion d’enzyme intra cytoplasmique élevée. L’enzyme libre est plus
facilement déplacée avec les fluides injectés. La concentration cellulaire sera déterminante
quant à la pénétrabilité de cellules dans le terrain en fonction des vitesses d’injections. Ces
paramètres pourront influencer la durée maximale des séjours dans le sol et donc les vitesses
d’injections.
Parmi les facteurs abiotiques, se trouvent les caractéristiques hydrogéologiques et
granulométriques qui sont déterminantes pour la fixation des bactéries et leur capacité à créer
des points calciques. En effet, le fuseau granulométrique du sol, la composition du sol et la
perméabilité fourniront les informations nécessaires pour la configuration du maillage

255
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

d’injection de la zone d’intérêt. Ceci permet de connaître la distance et les vitesses d’injections
ainsi que la durée et par conséquent, le profil de dépôt de biomasse et les zones consolidées.
Ainsi, l’utilisation du chlorure de calcium est préconisée lorsque les conditions sont
propices (D.O. cellulaires élevées et de fortes A.E) et donc sur de plus petites distances
d’injection. Les ions chlore ont un impact physiologique plus élevé chez S. pasteurii, car c’est
un micro-organisme halotolérant. Il dispose donc très certainement de nombreux canaux
ioniques spécifiques à ces ions et il doit très probablement dépenser plus d’énergie pour
contrôler leur concentration et pour maintenir son potentiel membranaire. Dans le cas des ions
nitrate, l’affinité sera moindre si les cellules ne possèdent pas de canaux spécifiques. L’étude
statistique montre néanmoins que le nitrate de calcium pourrait avoir une meilleure action
lorsque les distances d’injection seront plus grandes. Cela entraîne pour les bactéries un temps
de séjour plus long et donc une mise en anoxie favorisant un ralentissement des vitesses
d’hydrolyse de l’urée et donc de la bio calcification. L’utilisation des ions nitrate par S.
pasteurii comme accepteurs terminaux d’électrons à la place de l’oxygène, permettra de
maintenir plus longtemps sa capacité d’hydrolyse de l’urée.

Il pourrait être envisagé soit une solution calcifiante mixte contenant un mélange des
deux sources de calcium, soit un cycle de solution calcifiante injectant en premier lieu du
chlorure de calcium pour finir avec du nitrate de calcium. Ceci pourrait ainsi prendre en compte
la diminution de l’activité enzymatique dûe au stress, au lessivage et/ou à l’encroutement des
cellules. En tout état de cause, la bio calcification peut se faire de façon quasiment identique
avec les deux sources testées. Ainsi, le choix entre celles-ci se fera sur des critères
économiques englobant les coûts des produits mais aussi les coûts du traitement des effluents.

256
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

V. IMPACT DES BASSES TEMPERATURES SUR LA BIO CALCIFICATION.

Des étapes importantes ont été réalisées en améliorant l’adhésion des bactéries sur les
grains de sable et en optimisant la solution calcifiante. Il est nécessaire pour une
industrialisation de ce procédé de tester l’effet des basses températures, celles qui sont
présentes en subsurface, avant même d’augmenter la taille des colonnes. Une étude du
comportement de la bio calcification à basse température a donc été entreprise à 12° C. Cette
valeur correspond à la température qui règne dans les sols sableux sous nappe, sous notre
latitude.

Les températures vont intervenir essentiellement à deux niveaux, sur le métabolisme

bactérien et donc, sur les réactions enzymatiques en les ralentissant, et par conséquence sur les
réactions physicochimiques. En effet, les températures de subsurface vont diminuer les vitesses
d’hydrolyse de l’urée et favoriser le maintien de l’état de sursaturation en substrats (urée et
calcium). Par ailleurs le produit de solubilité (ks0) de la calcite diminue avec la température
mais cela ne permet pas de compenser le ralentissement de l’hydrolyse de l’urée (Ferris, 2003).
Selon l’auteur, à 10° C le temps nécessaire pour la précipitation de la calcite est 2.3 fois plus
long qu’à 20° C. Des mesures d’activités enzymatiques ont montré une diminution par deux
des vitesses de réaction à 12° C.

Pour tester la bio calcification à 12° C, 4 colonnes ont été montées avec 3 sables
différents. Deux avec du sable de Fontainebleau brut, une avec de sable de Fontainebleau
normalisé NE 34, la dernière avec du sable d’Itterbeck (Tableau n°108). Pour tenter de
compenser la diminution des vitesses de réaction, la durée des batchs après les injections de
solution calcifiante ont été multipliées par deux, passant ainsi à 6 heures. La biomasse a été
cultivée à 12° C. Les colonnes ont été placées au préalable près de 24 heures à 12° C dans une
armoire climatique, ceci pour se placer au plus près des conditions de terrain. Les injections à
12° C ont été réalisées dans l’armoire climatique.
Caractéristiques des Colonne Colonne Colonne
Colonne n°4
Tableau n°108 : colonnes n°1 n°2 n°3
Caractéristiques Sable de Sable de
Sable de
des colonnes Fontaine- Fontaine-
Type de sable Itterbeck Fontainebleau
soumises à une bleau bleau
brut
Bio calcification NE 34 brut
DO
à 12° C. 4.96
cellulaire
Biomasse
A.E
0.986
(mS/min)
Densité du sable fin 1.73 ± 0.02 avec un coefficient de variation de 1 %
Porosité apparente 0.38 ± 0.01 avec un coefficient de variation de 3 %
Durée de batch 3 heures
Solution calcifiante
0.5 M Urée- Ca(NO3)2 + Chicorée 0.25 g/l
[U/Ca 2+] avec additif
Nombre de V.p de
5
solution calcifiante
Mode d’injection Semi continu
Durée de batch de la
6 heures
solution calcifiante
Vitesse réelle
0.2
d’injection (m/h)

257
Chapitre VI. Etude de la bio calcification.

Malheureusement, seule la colonne contenant du sable de Fontainebleau normalisé a

présenté du sable consolidé, suffisamment pour avoir un élancement de 2 avec une Rc de 0.1
MPa. Les autres colonnes ont été consolidées uniquement dans la zone d’injection. Une
hypothèse peut être proposée. En premier lieu, la suspension de biomasse possède une D.O.
très élevée (4.6) ce qui correspond environ à 1.8 . 1010 cellules/ml. Par ailleurs, elle est âgée de
168 heures, et ceci est dû à sa température d’incubation de 12° C qui ralentissant le
métabolisme et donc les divisions cellulaires, allonge considérablement cette durée. Cela n’a
pas empêché d’obtenir de fortes D.O. et une A.E correcte de 0.986 mS/ml/min. Cependant, il
n’est pas impossible que le stade de fin de phase exponentielle ait été très largement dépassé.
Ces deux paramètres peuvent expliquer les résultats de la bio calcification sur ces trois types de
sables.
En effet, le sable NE 34, possède un Cu plus faible, 1.47, avec un coefficient de
courbure Cc de 0.97. Ceci indique que ce sable est gradué. Autrement dit, c’est la qualité de la
porosité qui semble être déterminante. En effet, un réseau de pore interconnecté plus grand
induit une meilleure pénétrabilité. La tortuosité qui se définit comme un rapport entre la
longueur L’ d’une ligne de courant séparant deux points et la distance L entre ces deux points
(T = L’/L >1), qui caractérise les obstacles au cheminement des fluides. Celle-ci augmente
lorsque le nombre de particules augmente et donc lorsque la granulométrie s’éloigne d’une
courbe bien graduée vers une courbe plus étalée comme ce qui est le cas pour les autres sables
(Tableau n°109).

Sable de Sable de
Sable
Tableau n°109 : Coefficients Paramaètres Fontainebleau Fontainebleau
Itterbeck
granulométriques permettant Brut NE 34
le calcul de la perméabilité à Cu = D60/D10 1.87 1.47 1.73
l’état lâche des sables utilisés Cc = D302/D10 x
1.02 0.98 0.98
dans les colonnes de ce test. D60
Ce = D90/D10 2.33 2.13 2.86
K (m/s) 1.96 . 10-04 2.25 . 10-04 1.21 . 10-04

Le sable de Fontainebleau brut peut justifier le meilleur résultat très probablement par une
meilleure pénétrabilité de ce milieu poreux dans les conditions de cette expérience. Il semble
que l’effet de la température soit un facteur très important voire déterminant dans le choix du
protocole d’injection, notamment pour la durée des batch. Dans cette expérience, il aurait été
nécessaire de les augmenter beaucoup plus, jusqu’à peut-être 24 ou 48 heures. La
température, par contre, est un paramètre secondaire au regard de l’impact très important
qu’ont les caractéristiques du sol. Il est primordial de prendre en compte non seulement la
perméabilité du sol mais aussi ses caractéristiques granulométriques car le profil de bio
calcification en dépend quelle que se soit la température d’application du procédé sur le
chantier. Dans le temps imparti pour cette thèse, il n’a pas été possible de refaire ce type
d’expériences et celles-ci seront réalisées ultérieurement, dans le cadre plus large des tests de
chantier.

258
Chapitre VII. Impact de la distribution de la biomasse sur le profil de calcification.

CHAPITRE VII

IMPACT DE LA DISTRIBUTION DE LA BIOMASSE

SUR LE PROFIL DE CALCIFICATION EN COLONNE.

INTRODUCTION 260

I. LE PROTOCOLE EXPERIMENTAL POUR DES COLONNES DE

0.4 à 0.6 m. 260

II. LES PROFILS DE RESISTANCE A LA COMPRESSION SIMPLE SUR

COLONNE SIMPLE de 0.5 m 261

III. LES PROFILS DE BIO CALCIFICATION SUR DES COLONNES

EN SERIE DE 0.6 m EN SABLE DE FONTAINEBLEAU BRUT. 262

IV. ETUDE DU POTENTIEL FILTRANT DES SABLES DE FONTAINEBLEAU. 269

V. LES PROFILS DE BIO-CALCIFICATION SUR DES COLONNES EN

SERIE DE 0.6 m EN SABLE CORRECTEUR. 272

VI. LES EFFETS DU COMPACTAGE SUR LA BIO CALCIFICATION

DANS DIFFERENTS SABLES. 277

1. Sur le sable de Fontainebleau Correcteur. 277

2. Sur sable de Fontainebleau brut et Itterbeck. 279
3. L’injectabilité dans un sable fin d’une suspension bactérienne de type bâtonnet. 284

VII. LES EFFETS DE L’AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION

DE LA SOLUTION SUR L’EFFICACITE DE PROCEDE. 286

VIII. LES EFFETS DU DOUBLEMENT DU VOLUME DE PORE DE

BIOMASSE SUR LE PROFIL DE CALCIFICATION EN
COLONNE DE 0.4 m. 287

IX. BILAN DU PROFIL DE BIO CALCIFICATION EN FONCTION DE

LA DISTANCE SUR DU SABLE DE FONTAINEBLEAU. 293

X. CONCLUSIONS. 299

259
Chapitre VII. Impact de la distribution de la biomasse sur le profil de calcification.

INTRODUCTION.

L’accroissement de la taille des colonnes constitue un changement d’échelle qui est

nécessaire afin de mieux appréhender les phénomènes difficilement perceptibles sur de petites
unités telles que les colonnes de 20 cm. Cette approche permettra d’évaluer les performances
du processus de bio calcification en se rapprochant progressivement des conditions d’un
chantier. En effet, connaître le profil de la bio calcification et les principaux facteurs dont il
dépend en fonction de la distance, facilitera le maillage d’injection. De cela, découle le
nombre de puits d’injection et de puits de sortie ainsi que le coût final d’un chantier.

I. LE PROTOCOLE EXPERIMENTAL POUR DES COLONNES DE 0.5 à 0.6 m.

Dans un premier temps, un lot de deux colonnes de 0.5 m a été monté pour évaluer
uniquement l’effet de la biomasse sur le profil de résistance en fonction de la distance. Ce lot
a été complété ensuite par 5 lots de colonnes montées en séries. Ce type de montage permet
de récupérer des informations plus précises sur le profil de distribution de la biomasse,
comme les teneurs en carbonate de calcium et les résistances maximales à la compression
obtenues. Une cuve de spectrophotomètre est mise en place entre chaque colonne pour suivre
le passage des bactéries (V p.1) ainsi que l’injection du premier volume de pore de solution
calcifiante (Vp. n°2) (Figure n°124).
Injection de biomasse
D.O connue Mesure de DO

1 2 3

Mesure de DO Mesure de DO

Figure n°124 : Représentation du montage en série des 3 colonnes de 0.2 m avec le suivi de
la densité optique au cours de l’injection de la biomasse et du premier volume de pore de
solution calcifiante.

Le protocole d’injection appliqué pour ces essais est celui qui a été défini au départ. Il
comprend 5 V.p de solution calcifiante avec une concentration équimolaire de 0.5 M en
urée/calcium, améliorée par l’ajout de 0.25 g/l de chicorée, entrecoupés de batchs durant 3 h.
Les vitesses réelles d’injection sont de 0.2 m/h. Deux types de sables ont été testés, le sable de
Fontainebleau brut et un sable Fontainebleau appelé Correcteur. Le sable Correcteur présente
une proportion de 15 % de fines en dessous de 0.1 mm ce qui correspond à la plus petite
valeur du sable de Fontainebleau brut (Tableau n°110).

Les deux colonnes de 0.5 m ont été injectées avec des D.O cellulaires similaires (2.55
et 2.4) et des activités enzymatiques différentes mais élevées (> 1 mS/min/ml), il n’y a donc
pas de différence significative entre ces deux colonnes. Le mode de compaction du sable a été
quasiment identique et n’a entrainé qu’une faible différence de 4 % entre les densités. La
première colonne a une densité de 1.70 et la seconde de 1.74.

260
Chapitre VII. Impact de la distribution de la biomasse sur le profil de calcification.

Tableau n°110 : Caractéristiques des essais d’injections pour la détermination du profil de

bio calcification en fonction de la distance.

Caractéristiques des essais

Distance 0.5 m 0.6 m
Colonne
Montage unique 3 colonnes en série de 0.2 m
de 0.5 m
Sable Sable
Sable Fontainebleau
Type sable Fontainebleau Fontainebleau
brut
brut Correcteur
Sable
d10 = 92 µm,
d10 = 145 µm, d 50 = 257 µm,
d 10 d50 d90 d50 = 161 µm,
d 90 = 367 µm
d90 = 280 µm
Numéro des colonnes ou de série série série série série
n°1 n°2
séries testées n°1 n°2 n°3 n°1 n°2
D.O
2.55 2.4 1.52 2.36 2.07 2.28 1.38
cellulaire
Caractéristiques A.E
1.048 1.62 1.159 0.676 0.611 0.460 0.724
de la biomasse mS/min
Nombre
1
de V.p
Solution calcifiante
0.5 M + chicorée (0.25 g/l)
Urée/ Ca(NO3)2 + additifs
Nombre de Volumes de pore 5 V.p
Durée de batch 3 heures

II. LES PROFILS DE RESISTANCE A LACOMPRESSION SIMPLE DANS LES

DEUX COLONNES SIMPLES DE 0.5 m.

Les résistances maximales à la compression obtenues en fonction de la distance du

point d’injection montrent au moins, pour la colonne n°2, un gradient de Rc. En ce qui
concerne la colonne n°1, il semble qu’un lessivage de la biomasse se soit produit dans la
première moitié de la colonne, puisqu’aucune résistance n’a pu être mesurée (Tableau
n°111). Un gradient existe cependant dans la deuxième partie de la colonne (entre 24 et 36 cm
par rapport au point d’injection.

Résistance maximale à la
Tableau n°111 : Résistances compression simple (MPa)
maximales à la compression en Distance 0 -12 12 - 24 24 - 36 36 - 48
fonction de la distance du point (cm) cm cm cm cm
d’injection pour les deux colonnes Colonne
0 0 0.2 0.1
de 0.5 m. n°1
Colonne
0.447 0.185 0.142 0
n°2

Il est très peu probable que la faible différence de densité entre ces deux colonnes
(1.73 ± 0.014) puisse expliquer ce lessivage. D’autre part, en raison de coupures d’électricité,

261
Chapitre VII. Impact de la distribution de la biomasse sur le profil de calcification.

l’injection de la biomasse dans la colonne n°2 a été bien plus longue que dans la colonne n°1 :
la durée de mise en place a été de 9 heures au lieu de 2 heures. Ces difficultés d’injection qui
ont abouti à l’immobilisation du fluide pendant des durées plus ou moins grandes, ont
certainement facilité l’adhésion des bactéries sur les grains de sable. Cela a donc, contribué à
réduire le lessivage dans cette colonne et à obtenir une meilleure consolidation du sable.

Figure n°125 : Suspension de biomasse de forte

A.E (1.5 mS/ml/min) englobée dans un floc
récupérée en sortie de colonne à la fin d’injection
du 1er V.p de solution calcifiante.

Le phénomène de floculation qui survient lorsque le premier V.p de solution

calcifiante rencontre la suspension bactérienne, a été observé pour les deux colonnes. Il a été
intense dans les deux cas parce que les suspensions injectées possédaient de fortes activités
enzymatiques et des D.O. cellulaires élevées (Tableau n°110 et Figure n°125)). L’hypothèse
selon laquelle cette floculation favoriserait le lessivage a été précédemment émise. Avec cette
expérience, ce phénomène semble se confirmer.

III. LES PROFILS DE BIO CALCIFICATION SUR DES COLONNES EN SERIE DE

0.6 m, AVEC DU SABLE DE FONTAINEBLEAU BRUT.

Pour mieux définir la relation entre la distribution de la biomasse et les zones de sables
consolidés, trois montages (ou séries), chacun de 3 colonnes de 0.2 m montées en série ont été
élaborés avec du sable de Fontainebleau brut. Les diverses caractéristiques des trois séries
sont regroupées dans le Tableau n°112.

Tableau n°112 : Caractéristiques des colonnes des trois séries (sable de Fontainebleau
brut).
Caractéristiques des colonnes Série n°1 Série n°2 Série n°3
D.O cellulaire (600 nm) 1.5 2 2.36
A.E (mS/ml/min) 1.15 0.61 0.67
Biomasse Vitesses moyenne
d’hydrolyse de l’urée 630 337 370
estimées (µM/cm/min)
Densité 1.72 1.72 1.71 1.72 1.70 1.70 1.74 1.74 1.74
Col n°1, Col n°2, Col n°3
Porosité 0.37 0.38 0.38 0.38 0.4 0.39 0.38 0.37 0.37

Les gammes de D.O. et d’activité enzymatique correspondent à la fenêtre de

maximum d’efficacité Rc/CaCO3, selon les essais réalisés sur l’impact de la nature du sel de
calcium dans le processus de bio calcification. Par ailleurs, pour ses trois séries, la densité
moyenne du sable (1.72 ± 0.02) qui présente un coefficient de variation faible de 2.4 %, et la
porosité apparente moyenne de 0.38 ± 0.009 relativement constante, indiquent que l’ensemble

262
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

des colonnes est homogène. Ceci va permettre de comparer les colonnes entre elles ainsi que
les séries. Les taux de fixation, les mesures de Rc et les teneurs en carbonate de calcium, sont
présentés par rapport à la distance d’injection (Tableau n°113).

Tableau n°113 : Les résultats bruts de Rc, de CaCO3 et du taux de fixation en fonction de la
distance dans 3 séries de colonnes en sable de Fontainebleau.

Séries Distances à partir du point d’injection (cm) 3 - 15 23 - 35 43 - 55

Rc (MPa) 0.044 1.4 0
n°1 CaCO3 (g/cm3) 0.029 0.075 0.021
Estimation du taux de fixation de la biomasse (%) 54 22 24
Estimation du taux de fixation de la biomasse (%) 77 15 8
n°2
Rc (MPa) 1.65 0.7 0.078
n°3
Estimation du taux de fixation de la biomasse (%) 84 9 7

Le suivi de la D.O cellulaire au cours des injections fait apparaître un gradient

décroissant du taux de fixation en fonction de la distance. Celui-ci apparaît, lors de la mise en
place du premier volume de pore de liquide calcifiant (V.p n°1).
Le gradient de biomasse, globalisé sur les trois séries, décroit selon une loi
exponentielle (Figure n°126) dont l’équation est Y = 110.7672 e- 0.0444x. Il s’agit là d’une
tendance car la valeur de R2 est plutôt faible (R2 = 0.8316). Cependant, ceci est fréquent
lorsque des phénomènes biologiques sont impliqués.

100
90
80
70
60 R2 = 0.8316 Figure n°126 : Estimation du taux de
50
%

40
fixation moyen au cours de l’injection
30 de la suspension de biomasse dans 3
20 lots de 3 colonnes en série.
10
0
3-15 cm 23-35 cm 43-55 cm

L’équation correspond à l’estimation du taux de fixation de S. pasteurii en colonne de

sable de Fontainebleau en fonction de la distance au point d’injection, et le profil reflète le
pouvoir filtrant du sable. L’effet filtrant de la matrice porale sur la biomasse repose sur de
nombreux mécanismes. En effet, l’adhésion des bactéries est la résultante des caractéristiques
hydrophobes et électro phorétiques de la surface du sable et de celle des bactéries, et de leur
déplacement dans le milieu poreux.
L’adhésion est largement dominée par le potentiel Zeta (ζ) qui résulte des répulsions
électrostatiques entre le sable et les cellules, et qui est également fortement lié à la force
ionique de l’eau. Le potentiel Zeta du sable de Fontainebleau est proche de (- 47 mV) (Jacob
et al, 2007). Les bactéries gram +, comme Bacillus cereus et Bacillus subtilis, ont
respectivement, un potentiel Zeta de - 27.25 et – 31.5 mV. Les auteurs ont observé une
absence d’adhésion pour les Bacillus, lorsque les fluides sont immobilisés mais, dans le sable
de Fontainebleau, ils trouvent un taux de fixation qui approcherait les 95 %. Ils suggèrent,
malgré un potentiel Zeta négatif élevé qui devrait induire un frein à l’adhésion, que d’autres

263
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

mécanismes physico-chimiques interviennent. D’après Bradford et al., 2002, l’impact de la

filtration mécanique surviendrait lorsque le diamètre de la particule ou de la bactérie est
supérieur à 5 . 10-3 fois le diamètre significatif du sable (d50). Dans le cadre de cette étude
menée avec S. pasteurii qui a un diamètre bactérien moyen de 1µm et une longueur de 1.5
µm, les caractéristiques granulométriques des différents types de Sable de Fontainebleau
utilisés, présentent des d50 qui varient de 161 à 257 µm (Tableau n°114).

SABLE DE
d 10 d 50 d 90
FONTAINEBLEAU
Tableau n°114 : Caractéristiques 157 246 320
Sable NE 34
granulométriques des différents µm µm µm
sables de Fontainebleau. 145 257 367
Sable brut
µm µm µm
92 161 280
Sable Correcteur
µm µm µm
Ainsi, d’après les résultats de ces auteurs, S. pasteurii pour une taille inférieure à 1.3
µm, ne devrait pas être filtré et donc ne pas adhérer sous l’effet mécanique aux grains de
sable, hormis peut-être pour le sable Correcteur. Le profil de l’estimation du taux de fixation
(Figure n°126) obtenu expérimentalement, ne suit pas la règle dictée par Bradford et al.,
Dans ce cas, l’accroche aurait dû être minime or, la fixation de S. pasteurii est au contraire,
très prononcée, pouvant dépasser les 70 %. Soit, la théorie de Bradford et al., est erronée, soit
d’autres paramètres interviennent plus fortement et s’opposent à l’effet mécanique. Il pourrait
s’agir du nombre de collisions qui stimuleraient l’accroche, des irrégularités de la surface des
grains de sable ménageant des niches à bactéries, et/ou de la qualité du réseau poreux (forte
inter connectivité porale). D’autre part, le profil de fixation de la biomasse, suit celui des
valeurs moyennes des RC qui quantifient d’une certaine manière la bio calcification (Figure
n°127).

2.5

2
R2 = 0.9167
Figure n°127 : Résistances maximales à la
RC (M P a)

1.5
compression simple en fonction de la
1 distance dans 2 lots de 3 colonnes en série.
0.5

0
3-15 cm 23-35 cm 43-55 cm

Le profil global des Rc en fonction de la distance par rapport au point d’injection a été
obtenu en excluant l’absence de Rc de la 1ère colonne de la 1ère série (Tableau 113), cela du
fait de l’absence de sable cimenté dans les 10 premiers centimètres de cette colonne. Il suit
une courbe exponentielle décroissante d’équation y = 4.8927 e-0.9259x avec R2 = 0.917. Les
courbes sont toutes les deux exponentielles avec des équations très voisines. Ceci confirme
bien que la consolidation, conséquence de l’apparition de CaCO3 sous l’effet de la Bio
calcification, est liée aux sites d’adhésion des bactéries.
D’après les profils de consolidation obtenus dans les colonnes de 50 cm (page 301) qui
constituaient le premier lot expérimental, on constate que deux types de profils de Rc peuvent
apparaître, dans le cadre du protocole appliqué.

264
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Dans un premier cas de figure, la distribution de la biomasse est décroissante à partir du point
d’injection et suit le profil de résistance à la compression. La distribution obéit alors au jeu
des interactions liant le sable, la bactérie et l’écoulement hydrodynamique dans le milieu.
Dans un second cas de figure, la distribution de la biomasse ne suit pas une tendance
exponentielle décroissante mais une répartition polynomiale du second degré. Un phénomène
supplémentaire d’interactions intervient durant l’écoulement de la solution calcifiante qui
conduit à un lessivage.
La compréhension de ces deux profils de bio calcification est d’une importance
cruciale, puisqu’ils déterminent la qualité de la calcification, c'est-à-dire, son niveau
d’hétérogénéité
. Si l’on étudie plus précisément le comportement de la biomasse dans les trois
colonnes de la série n°1 (Tableau n°113), on constate que la majorité de celle-ci (54 %) s’est
fixée dans la colonne n°1, le reste se répartissant équitablement entre les deux colonnes
suivantes. Cependant, il semble qu’un lessivage a peut-être eu lieu au moment de l’injection
du premier V.p de solution calcifiante. En effet, le profil de calcification établi sur les
variations des Rc montre une consolidation limitée à la partie 1/4 basse de la colonne n°1, la
totalité de la colonne n°2 et la moitié haute de la colonne n°3 (Figure n°128). Il y a dans ce
cas de figure aucune superposition entre les profils de biomasse et de valeurs Rc. Il faut donc
s’interroger en premier lieu sur la validité de la mesure de la fixation de la biomasse qui est
établie sur une mesure de D.O. à 600 mm car celle-ci peut être parasitée par la sortie de
particules fines présentes dans le sable ou par l’apparition des flocs. Le rôle des tuyaux entre
les colonnes ne doit pas non plus être négligé car ils constituent des freins à la migration des
fluides injectés y compris à la suspension de biomasse. Un ralentissement des fluides dans la
porosité ouverte peut favoriser l’adhésion des bactéries dans celle-ci et dans les espaces inter
granulaire.

1 2 3

Figure n°128 : Représentation des trois colonnes de la série n°1, dans lesquelles les
sections en orange correspondent aux sables cimentés et en gris foncé aux sables restés
meubles.

Ce phénomène de consolidation en position médiane a déjà été constaté dans des

colonnes simples de 0.2 m et dans des séries de deux colonnes de longueur totale 0.4 m. Ce
phénomène de glissement de la biomasse est dû très probablement à plusieurs facteurs dont
certains ont été évoqués précédemment. Il faut y ajouter deux paramètres importants, la
vitesse d’injection de la suspension de biomasse qui est faible et la durée du batch (3 heures)
qui ne permet peut-être pas l’adhésion de toutes les bactéries injectées. Le passage de
plusieurs V.p de solution calcifiante peut faciliter le déplacement des bactéries, mais c’est le
premier V.p qui aura le plus d’impact. En effet, la bio calcification débutant dès le premier
V.p, le carbonate de calcium fabriqué va piéger les bactéries et les maintenir sur place.

265
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Ce lessivage peut se dérouler sur une distance représentant près de 1/3 à 1/2 de la
distance totale à injecter. Si l’on considère les séries n°2 et 3 qui ont également fait l’objet
d’un suivi de D.O. cellulaire en sortie de colonne, après la mise en place de la biomasse dans
le système et l’injection du premier V.p de solution calcifiante, on constate qu’il y a un
gradient décroissant de fixation en fonction de la distance mais sans phénomène de lessivage.
Cette dernière approche permet d’établir en fonction de la distance les deux profils, celui de la
fixation de la biomasse et celui des RC (Figure n°129) pour les colonnes de la série n°3.

100 2.0
RC (MPa)(D)
Taux fixation 1V.p(G)
1.8
Taux fixation 2V.p (G)
80 1.6 Figure n°129 : Répartition de
RC (MPa) = 9.4831*exp(-1.5259*x)
Taux fixation 1V.p = 209.1163*exp(-1.2425*x)
1.4 l’estimation du taux de fixation
Taux de fixation %

60 1.2 de bactéries et des valeurs de

RC (MPa)
1.0 RC pour la série n°3 en
40 0.8 fonction de la distance
0.6
d’injection de la biomasse.
20 0.4

0.2

0 0.0
3-15 cm 23-35 cm 43-55 cm

Dans la série n°3, le suivi a été également fait après l’injection du deuxième V.P de
solution calcifiante. Le profil (□) correspond aux valeurs de RC en fonction de la distance
selon l’équation exponentielle décroissante Y = RC (MPa) = 9.483 e(- 1.5259x). Cette même
tendance est également observée avec l’estimation du taux de fixation de biomasse (\\) après
V.p 1 (Y = 209.116 e (-1.2425x)). Par contre, la tendance du taux de fixation de biomasse après
V.p 2 présente un profil de type polynomial du second degré (║) Y = - 0.1569 + 0.0856x -
0.0015x2 avec R2 = 1. Ainsi, entre ces deux injections, une seule semble être responsable à la
fois du profil de distribution des bactéries et du profil RC. En effet, dans cette série, le profil
du lessivage semble peu ou pas enclin à intervenir dans la consolidation du sable dans cette
série. La première injection de solution calcifiante est donc déterminante dans le profil du RC.

Par ailleurs, ce profil de décroissance exponentiel du taux de fixation bactérien sur sol
a déjà été observé par Boster et al., (1999) dans des colonnes de sable mesurant de 15 à 60
cm. L’auteur a en effet, également, mis en évidence que ce type de profil d’adhésion résultait
de l’existence de deux sous populations, possédant chacune un pouvoir d’adhésion différent et
ceci, bien qu’il s’agisse d’une culture mono spécifique. Si l’on suit cette théorie, une
population avec un fort coefficient d’adhésion (K), serait représentée par la première partie de
la courbe c'est-à-dire la section décroissante exponentielle (Figure n°129). La seconde partie
de la courbe de type asymptotique proviendrait de bactéries ayant un plus faible coefficient
d’adhésion. Cette sous population d’après Gerba et Bitton (1984), est capable d’être
transportée sur de très grandes distances, pouvant correspondre à celles que l’on souhaite
mettre en jeu dans le cadre d’un chantier, sans adhérer aux particules du sol. Ceci est vrai pour
les bactéries qui ne sont pas dans la zone de contact avec la solution calcifiante. En effet, les
conditions du procédé limitent en partie des déplacements aussi grands, car à l’interface entre
la solution calcifiante et la suspension de bactéries, il se forme des précipités. C’est en effet,
ce mélange qui redessine le profil de dépôt de biomasse (V.p 2) et cela sans pour autant avoir
un impact prépondérant sur le profil de résistance, dans ce cadre expérimental.

Ce lessivage de bactéries semble être la conséquence d’une part, d’un détachement de

la biomasse fixée et, d’autre part du déplacement d’une fraction de la biomasse encore en

266
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

suspension. Dans le dernier cas, il s’agit de bactéries retenues mais non fixées donc
faiblement adhérentes, qui se localisent dans les pores et dans les espaces inter granulaires.
Celles-ci peuvent éventuellement se redéposer le long de la même colonne ou dans les
colonnes suivantes. Dans le second cas, les cellules encore libres se trouvent en contact avec
le front d’avancement de la solution calcifiante. Elles peuvent être piégées dans les flocs qui,
sous l’action du flux et donc en fonction de sa vitesse, peuvent arracher certaines bactéries
fixées.

L’intensité du lessivage, dépend de l’activité enzymatique et de la concentration

cellulaire. En effet, la conjugaison d’une forte A.E et d’une D.O cellulaire élevée amplifient le
lessivage (Figure n°125). Dans le cas des colonnes en séries, le lessivage apparaît lorsque la
suspension de biomasse possède une activité enzymatique inférieure à 1 mS/ml/min. Ce
précipité évolue au fur et à mesure de l’avancement du front de liquide calcifiant dans les
colonnes. Mais, ces flocs se déplacent moins vite du fait de leur encombrement dans la
matrice poreuse et se déposent par paquets le long de la colonne au fur et à mesure de
l’injection. Parallèlement, ils se régénèrent comme par vagues successives, car la solution
calcifiante derrière le précipité, tend à le dépasser au fur et à mesure de son dépôt le long de la
colonne. Ce phénomène dynamique est plus intense au niveau du point d’injection du fait du
gradient de fixation de la biomasse. Ce phénomène de précipité diminue donc au fur et à
mesure de son l’éloignement du point d’injection. Cependant, ces nouveaux précipités, moins
actifs car ils renferment moins d’activité enzymatique, se déplaceront sur de plus grande
distance. Ces hypothèses permettent d’expliquer dans le cas de la série n°3, que c’est
essentiellement le premier V.p injecté et non les injections suivantes de solution calcifiante
qui détermine le profil de bio précipitation.
Il a été également suggéré que le profil de bio calcification était étroitement dépendant
de l’activité enzymatique de la suspension bactérienne injectée. La 3ème série a été injectée
avec une D.O cellulaire élevée (2.36) et une activité enzymatique de 0.67 mS/ml/min,
contrairement à la série n°1, qui a été injectée avec une suspension ayant une A.E de 1.15
mS/ml/min et une D.O cellulaire de 1.5. Cette série a subi un fort lessivage de la biomasse.
Ceci suggère que des activités enzymatiques élevées (> 1 mS/ml/min) provoquent un
lessivage plus intense et redessine le profil de consolidation RC - CaCO3 (Tableau n°115).

Distances à partir du point

3 - 15 23 - 35 43 - 55
Tableau n°115 : d’injection (cm)
Récapitulatif des Rc (MPa) 0.044 1.4 0
données issues de CaCO3 (g/cm3) 0.029 0.075 0.021
la série n°1. Estimation du taux de fixation % 54 22 24
Taux d’hydrolyse (%) 20 71 27
Vitesse moyenne d’hydrolyse de l’urée
31 111 43
(µM / min)

Le lessivage déplace le profil de bio-calcification qui peut représenter près de la moitié

de la colonne pour des vitesses d’injection de 0.2 m/h. Ce phénomène a également été observé
sur la colonne de 0.4 m où la zone de lessivage correspond également à près de la moitié de la
colonne. Dans ces deux cas, les activités enzymatiques étaient supérieures à 1 mS/ml/min.

La seule différence ici, est la présence d’une résistance résiduelle (après la première
rupture) de 0.044 MPa en amont pour la série n°1. Ceci est très probablement dû au passage
d’une plus grande quantité de solution calcifiante. En effet, la première colonne d’une série de

267
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

3 colonnes reçoit à chaque injection l’équivalent de 3 V.p. Si les vitesses d’injection sont
basses, la concentration des ions calcium et de l’urée sous l’effet des bactéries, diminuent en
tête d’injection et la solution calcifiante est épuisée avant même d’atteindre la partie terminale
de la dernière colonne. Pour apprécier cette hypothèse, des vitesses moyennes d’hydrolyse de
l’urée en colonne ont été estimées dans la série n°1. Ces dernières (Tableau n°115) sont
inférieures de 95 % pour les colonnes n°1 et n°3 et de 83% pour la colonne centrale (n°2) par
rapport aux estimations du Tableau n°113. Ces informations associées avec celles obtenues
sur les colonnes précédentes, suggèrent, trois hypothèses de phénomènes possibles et
responsables des faibles valeurs estimées de l’hydrolyse de l’urée. La première hypothèse
suggère que la bio calcification favorise l’encroutement d’une forte proportion de la biomasse
(Figure n°130). Dans ce cas, une diminution graduelle du potentiel d’hydrolyse apparaîtrait.

Figure n°130 : Bactérie enrobée dans une

gangue de carbonate de calcium. Image
MEB (S. Castanier et G. Levrel,)

Dans cette hypothèse, la colonne n°1, présenterait une activité d’hydrolyse supérieure
à celle de la colonne n°2 ; elle-même supérieure à celle de la colonne n°3. Or, ce n’est pas le
cas dans la série n°1.
La deuxième hypothèse envisage que les vitesses réelles d’hydrolyse de l’urée
subissent les effets du lessivage de la biomasse. Dans ce cas, cela explique le profil de la
colonne n°1 et celui de la colonne n°3, mais pas celui de la colonne n°2. Ainsi, pour rendre
compte, du profil de l’ensemble de la série n°1, il faut associer non seulement le lessivage de
la biomasse mais également son activité enzymatique durant le lessivage. En fait, il s’agit de
deux phénomènes qui agissent de manière concomitante lorsque la suspension bactérienne a
une A.E élevée. Le lessivage a déplacé une partie des cellules bactériennes de la colonne n°1
à la colonne n°2 via le phénomène de précipitation. Par contre, initialement, la colonne n°3
n’a pas reçu suffisamment de cellules ce qui a réduit le rendement de la bio calcification et n’a
pas abouti à la consolidation du sable.
Ceci conduit aux interprétations suivantes. L’hydrolyse de l’urée et la fabrication de
CaCO3 se sont réalisées durant l’injection du premier V.p ce qui a permis la consolidation de
la colonne n°2. Celle-ci a été renforcée par un nombre suffisant de bactéries. Par ailleurs,
l’encroutement cellulaire limite la vitesse d’hydrolyse de l’urée et donc la précipitation du
carbonate de calcium. La concentration mesurée dans le système est faible, à peu près
équivalente à ce que l’on peut obtenir avec 1 seul V.p de solution calcifiante. Ceci suggère
que les V.p suivants de solution calcifiante auront eu dans ce cas, un effet limité. Enfin
l’estimation des vitesses d’hydrolyse à partir du temps de batch n’est pas totalement vraie.
Une proportion non négligeable d’hydrolyse se produit durant l’injection notamment avec le
déplacement du précipité et surtout avec des vitesses d’injection faibles.

268
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Lorsque la biomasse possède des activités enzymatiques élevées, la probabilité de

provoquer un lessivage augmente. Ce lessivage peut conduire à redessiner le profil de
résistance à la compression. Ce phénomène est dépendant de la qualité de la biomasse utilisée.
En effet, un événement supplémentaire apparaît lors de l’injection du 2ème V.p de solution
calcifiante. Dans les fluides de sortie des colonnes se trouvent des microsphères (Figure
n°131). Si on les compare avec des ooïdes, obtenues avec des cultures de S. pasteurii mise en
contact avec de la solution calcifiante, on constate qu’il y a une identité de forme et peut-être
de taille. En effet, les ooïdes mesurent entre 10 et 40 µm de diamètre et les microsphères
environ 20 µm. Les ooïdes sont constituées de carbonate de calcium cristallisé sous forme de
calcite. Elles sont fabriquées par les bactéries calcifiantes qui pour certaines restent piégées
dans ces structures. Il est cependant très difficile d’affirmer que les microsphères sont des
ooïdes.

Figure n°131 : Les photos du haut

(grossissement x 80, 1 graduation =
2.5 µm) montrent les microsphères
issues des colonnes au cours de
l’injection de la solution calcifiante.
Les photos du bas montrent des ooïdes
à partir d’un culot de suspension
bactérienne mis en présence d’une
solution calcifiante pendant 8 jours.
(Images MEB : S. Castanier et G
Levrel).

Cette production de microsphères, sortes de piège à bactéries, apparaît lorsque les

activités enzymatiques de la suspension bactérienne sont élevées (> 1 mS/min/ml), et il s’agit
là, lorsqu’elles sortent du système, d’un véritable relargage du potentiel enzymatique. Les
effluents qui en contiennent sont très instables puisque, lorsqu’ils sont conservés dans un
récipient, un film translucide de carbonate de calcium apparait rapidement, dans les 30
minutes qui suivent.

IV. ETUDE DU POTENTIEL FILTRANT DES SABLES DE FONTAINEBLEAU.

L’ensemble de ces observations conduit à prendre en considération un impact plus

important que prévu de l’effet de la filtration du sable sur S. pasteurii. Cet effet de filtration
intervient essentiellement à deux moments clés du procédé, lors de la mise en place de la
biomasse et durant l’injection du premier V.p de la solution calcifiante à faible vitesse (0.2
m/h). En effet, une rétention mécanique survient pour des particules de diamètre compris
entre 1 et 30 µm. Par ailleurs, lorsque le rapport entre d particule/d grain est compris entre 0.065 et
0.15, alors un blocage partiel dans le milieu poreux survient (Herzig et al., 1970). En dessous
de 0.065, et pour ces vitesses d’injection, la rétention mécanique est négligeable. Pour évaluer
l’effet filtrant du sable de Fontainebleau NE 34, une adaptation de cette formule est proposée
en substituant le diamètre de la particule à la longueur estimée moyenne de la bactérie soit d =
1.5 µm (Tableau n°116).

269
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Il faut retenir que la bactérie employée se présente sous la forme d’un bâtonnet dont la
longueur est fonction de son état physiologique. Avant la division cellulaire et pendant la
réplication du chromosome circulaire central, la bactérie double de longueur. Les bactéries
injectées ne sont plus en phase de division cellulaire et doivent donc avoir globalement la
même longueur, environ 1,5 µm. Dans le sable des colonnes de laboratoire, il n’y a pas de
réserve organique par conséquent, la bactérie oriente son activité exclusivement vers la
dégradation de l’urée et la bio calcification. Ainsi, la formule de Herzig et al., (1970),
modifiée, peut être utilisée. Notons cependant, que ces estimations ont été faites dans un
modèle constitué d’un milieu poreux, composé de billes de diamètre identique, ayant un taux
maximal de compaction, avec vraisemblablement, un effet important de celui-ci. Ce modèle
ne ressemble pas évidemment, aux colonnes de sable, fabriquées en laboratoire et encore
moins à la réalité du terrain. Les indications qu’il apporte doivent donc être interprétées avec
précaution.
GRANULOMETRIE d10 d50 d60 d90
SABLE BRUT 145 257 367
-
Rapport µm µm µm
d bactérie/d grain 0.0103 0.0058 - 0.0041
Taille maximale de la
1.29
bactérie selon
µm
Bradford et al*
SABLE 161 280 Tableau n°116 : Identification de l’effet
- filtrant des trois types de sable de
CORRECTEUR 92 µm µm µm
Rapport Fontainebleau sur S. pasteurii à l’aide du
-
d bactérie/d grain 0.0163 0.009 0.0053 rapport d sphère/d grain adapté.
Taille maximale de la
0.81
bactérie selon - (*) La taille maximale que la bactérie peut atteindre
µm
Bradford et al * sans qu’il y ait un effet filtre du sable, valable pour
SABLE NE 34 157 246 271 320 le d50.
Rapport x 100 µm µm µm µm
d bactérie/d grain
Taille maximale de la 0.01 0.006 0.055 0.0047
bactérie selon 1.23
Bradford et al * µm

Si l’on se réfère aux recommandations de Bradford et al.,2003 concernant le calcul des

tailles maximales que la bactérie peut atteindre avant de subir l’effet filtre du sable, on
constate que pour le sable Correcteur, la valeur est inférieure à la taille réelle de S. pasteurii (1
µm de diamètre pour 1,5 µm de longueur). La conclusion qui s’impose alors est que les sables
de Fontainebleau Brut et NE34, n’auront aucun effet de rétention mécanique. Il n’en sera pas
de même pour le sable Correcteur dont la fraction d50 retiendra les bactéries. Ainsi, la courbe
granulométrique d’un sable influencera-t-elle directement la phase de mise en place des
bactéries et devra toujours être établie avant toute injection.

Si l’on considère les rapports d bactérie/d grain, quel que soit le type de sable, aucun ne se
retrouve dans la gamme préconisée par Herzig et al., (1970) à savoir entre 0.065 et 0.15. On
peut donc en conclure qu’il n’y aura pas de rétention mécanique des bactéries. Nadji (1998) a
montré que lorsque le rapport d sphère/d grain est en dessous de 0.01, les phénomènes de
rétention sont dominés par des interactions électrostatiques. Dans ce cadre, seules les fractions
d10 des trois types de sable ont des rapports légèrement supérieurs à cette valeur seuil. Ceci
confirme que l’effet de rétention mécanique sera nul ou très faible (sable Correcteur).

270
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Ces conclusions placent les bactéries à la « croisée des chemins », car leur adhésion
n’obéit pas non plus aux deux théories de la cinétique d’adhésion DVLO (Derjaguin-Landau-
Verwey-Overbeek) et, XDVLO complétée, (Truesdail and al., 1998 ; Chen et al., 2002 ; Li et
Logan, 2004 ; Chen et al, 2006). Cette théorie (XDVLO) prend en compte les interactions
acide-base de Lewis, c’est à dire toutes les interactions non électrostatiques, non covalentes et
les interactions polaires existant dans un milieu aqueux. Mais elle n’explique pas les profils
d’adhésion notamment ceux de Bacillus. Ainsi, le profil granulométrique n’est pas suffisant et
il faut d’avantage prendre en compte la rugosité et la forme des grains de sable pour expliquer
ces phénomènes. Hoek et al., (2006), suggèrent que la rugosité des grains a un rôle
prépondérant car ce paramètre modifie le jeu des interactions et réduit les barrières d’énergie
pour rendre les interactions Van der Waals plus fortes sur une plus grande distance. Les
interactions de acide- base de Lewis et les interactions faibles deviennent alors, négligeables
ou nulles. Les auteurs précisent que cela favorise le dépôt des colloïdes et donc celui des
bactéries (Figure n°132).

Figure n°133 : Deux cellules de S. pasteurii

Figure n°132 : Surface d’un grain de sable de
en fin de phase de division cellulaire (3.4 µm
Fontainebleau avec de nombreuses crevasses
de long) posée sur un grain de sable avec
pouvant avoir jusqu’à 1 µm de largeur (Image
différents flagelles provenant d’autres
MEB S. Castanier et G. Levrel).
bactéries voisines (flèches en pointillé
rouge)(Image MEB S. Castanier et G.
Levrel).

D’après Jacob et al., 2007, le profil d’adhésion de Bacillus est particulier. Lorsque les
bactéries ont été placées en même temps que le sable dans une colonne positionnée
horizontalement sur un agitateur pendant toute la durée de l’expérience, seulement une très
faible adhésion a été observée. Celle-ci semble bien meilleure lorsque la biomasse est injectée
dans une colonne déjà construite.

S. pasteurii possède un flagelle polaire de quelques nanomètres de diamètre mais de

quelques dizaines de µm de longueur. Ce dernier dont le rôle premier est le déplacement, peut
avoir un rôle indirect en provoquant par les charges négatives qu’il porte l’agrégation et donc
d’adhérence (Figure n°133).

Si l’on considère maintenant la densité du sable dans les 3 séries de colonnes, et que
l’on regarde son impact sur les profils de bio calcification, on constate que 70 % de la

271
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

biomasse est fixée dans les quinze premiers centimètres de la première colonne. Pour
expliquer ceci, on peut calculer pour un sable de Fontainebleau NE 34 de densité apparente de
1.5 et de surface spécifique de 145 cm2/g (données Sifraco) un certain nombre de paramètres.
Dans une colonne de densité 1.72 (densité sur sable sec) et de porosité moyenne de
0.38, 1 cm de colonne correspond à 19.33 cm3, soit une masse de sable mis en place de 33.21
g. Pour une colonne de 57 cm, la surface totale de sable est de 274 549 cm². La suspension de
biomasse injectée est de 1 V.p soit 0.75 l avec une D.O. cellulaire de 2.36. Si l’on applique
l’équation qui relie la D.O. cellulaire à la concentration en cellule/ml (Y = 2 . 108 x3 – 8 . 107
x2 + 1 . 107 x – 345450 avec R2 = 1), le nombre total de cellules injectées dans les trois
colonnes pour un V.p de biomasse est de 1.65 . 10+12 cellules. Par ailleurs, pour S. pasteurii,
de 1 µm de diamètre et de 1.5 µm de longueur, la surface de contact possible avec un grain de
sable est de 1.5 µm2. Pour les 1.65 . 1012 cellules injectées, la surface cumulée correspond à
2.48 104 cm2, sans chevauchement des cellules. Si on fait le rapport entre la surface cumulée
de bactéries sur la surface totale des grains de sable on obtient une valeur de 0.0387. Ceci
indique que seulement 9 % de la surface du sable seront recouverts par les bactéries sur la
globalité de la colonne sans compter les phénomènes locaux d’adhésion et ceci, lorsque la
D.O est de 2.36 et lorsque la densité de la colonne est de 1.72. Cette valeur est très faible.

V. LES PROFILS DE BIO-CALCIFICATION DANS LES COLONNES MONTEES

EN SERIE AVEC DU SABLE CORRECTEUR.

Deux montages de 3 colonnes en série avec du sable Correcteur ont été élaborés
suivant le même protocole. Les deux séries de colonnes ont été injectées avec des D.O.
cellulaires similaires aux séries faites avec du sable de Fontainebleau brut. Les activités
enzymatiques sont également dans la gamme optimale d’efficacité Rc/CaCO3. De plus, la
densité moyenne (1.73 ± 0.03) et la porosité moyenne (0.39 ± 0.019) mesurées dans ces
colonnes ne sont pas significativement différentes des essais précédents (Tableau n°117).
La série n°1 présente une D.O. de 57 % supérieure à celle de la série n°2 mais en
contre partie l’activité enzymatique est deux fois plus faible. Ceci permettra de mieux se
rendre compte de l’effet de rétention du sable. En effet, les premières estimations du taux de
fixation montrent un comportement légèrement différent avec ce sable par rapport au sable
NE 34. Si l’on compare les deux séries, les gradients du taux de fixation et des valeurs de Rc
sont plus prononcés (Tableau n°118).

Tableau n°117 : Caractéristiques des essais en colonnes faites avec du sable Correcteur.

Caractéristiques Série n°1 Série n°2

D.O. cellulaire (600 nm) 2.28 1.38
A.E (mS/ml/min) 0.460 0.724
Biomasse Vitesses moyennes
d’hydrolyse de l’urée 0.267 0.400
estimées (mM/ml/min)
Densité 1.75 1.75 1.78 1.72 1.72 1.68
Porosité Col n°1, Col n°2, Col n°3
0.37 0.37 0.4 0.38 0.41 0.4
apparente

d 10 d 50 d 60 d 90
Sable Correcteur
92 µm 161 µm 190 µm 280 µm

272
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Tableau n°118 : Taux de fixation des bactéries, Rc et teneurs en CaCO3 en fonction de la

distance avec du sable de Fontainebleau Correcteur sur 3 colonnes en série.

Distance à partir du point d’injection (cm) 3 - 15 23 - 35 43 - 55

Série n°1
Rc (MPa) 0.80 0.06 0
3
CaCO3 (g/cm ) 0.082 0.061 0.021
Estimation du taux de fixation V.p 1 (%) 0.93 0.043 0.027
Série n°2
Rc (MPa) 0.40 0.02 0
3
CaCO3 (g/cm ) 0.084 0.075 0.027
Estimation du taux de fixation V.p 1 (%) 0.91 0.08 0

La tendance générale présente un très fort gradient décroissant de type exponentiel et

cela quelles que soient les variables des séries observées. Ainsi le taux de fixation moyen est
décrit par l’équation de type exponentiel Y = 6.2295 e (-2.110x) avec un R2 = 0.97 très similaire
à celui du profil des Rc d’équation Y = 622.95 e (-2.1108x) avec R2 = 0.999 (Figure n°134).

Figure n°134 : Estimation

100 1 moyenne du taux de
Taux de fixation %

80 0.8 fixation (courbe bleue) au

cours de l’injection d’une
RC (MPa)

60 0.6 suspension de biomasse et

R2 = 0.9742
40 0.4
profil des Rc (courbe
rouge), en fonction de la
20 0.2 distance du point
R2 = 0.9995
0 0
d’injection.
3-15 cm 23-35 cm 43-55 cm

La tendance montre un taux de fixation très élevé puisque près de 90 % de la biomasse

injectée dans la première colonne se trouve retenue. Cela correspond en moyenne à la fixation
de 1.108 cellules pour les 15 premiers centimètres, soit 2.4 107 cellules par cm. Cette tendance
concorde avec les données de la courbe granulométrique du sable Correcteur et les
caractéristiques des coefficients (Cu > 2 et un Ce = 3.04). Ceci suggère, un effet non
négligeable de la base de la courbe granulométrique sur le potentiel de filtration du sable. Par
ailleurs, un deuxième gradient décroissant celui de la teneur en carbonate de calcium en
fonction de la distance suivant une équation y = 0.1774 e (-0.6185x) confirme la première
tendance observée avec le dépôt de biomasse (Figure n°135). Il ne s’agit cependant que
d’une tendance car R2 = 0.8665, ce qui est trop faible.

273
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

0.12
Figure n°135 :
CaCO3 (g/cm )
0.1
3

0.08 La teneur en CaCO3

(g/cm3) moyenne en
0.06 R2 = 0.8665
fonction de la distance à
0.04 partir des 2 séries
0.02 élaborées avec du sable
0 Correcteur.
3-15 cm 23-35 cm 43-55 cm

Le profil de carbonate de calcium est nettement moins prononcé que celui du taux de
fixation et celui des Rc. En effet, la teneur en carbonate de calcium diminue d’un facteur de 4
entre la première et la dernière colonne, alors que la valeur de Rc tend à s’annuler dès la
deuxième colonne. Ce profil de CaCO3, moins prononcé, semble être dû à un lessivage de la
biomasse lors de l’injection du 1er V.p de solution calcifiante.
Taux de fixation 2ème V.p %

100
Figure n°136 :
80 Répartition moyenne du
taux de fixation de la
60 biomasse en fonction de
la distance obtenu après
40 l’injection du 2ème V.p
20 de solution calcifiante
pour les deux séries.
0
3-15 cm 23-35 cm 43-55 cm

L’efficacité des résistances est aussi, fortement liée au profil de distribution de la

biomasse du 1er V.p. Cependant, la faible résistance maximale à la compression simple de la
colonne n°2 et de la colonne n°3 ne concorde ni, avec la teneur en carbonates de calcium
mesurée dans ces deux colonnes, ni avec le profil de biomasse obtenu avec la 2ème injection
(V.p n°2) (Figure n°136). La courbe du taux de fixation, après l’injection du 2ème V.p en
fonction de la distance (Y = 106.95 e (-0.8491x)), n’est qu’une très légère tendance car le R2 est
bien trop faible (0.47).

Les résultats suggèrent que le lessivage a déplacé une partie de la biomasse (fixée
et/ou encore libre) de la première colonne vers les deux suivantes, et notamment dans la
dernière puisqu’il y a eu fabrication de carbonate de calcium. Le profil est atypique puisque la
seconde colonne a paradoxalement peu retenu de cellules. Ceci suggère que le déplacement de
cette biomasse a peut-être été associé à celui du carbonate de calcium du moins pour la
colonne n°3. Les cristaux de carbonates arrachés de la surface des grains de sable ou fabriqués
dans les fluides, se déplacent dans les pores et ne se retrouvent pas dans les espaces inter
granulaires où ils solidarisent les grains entre eux. Ainsi, la résistance maximale à la
compression simple reste faible ou nulle. Ces observations s’accordent avec les résultats des

274
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

contrôles de D.O par spectrophotométrie des colonnes entre elles. Un floc a été échantillonné
entre les colonnes mais est resté dans la troisième car l’injection a été arrêtée avant son
arrivée. Vraisemblablement compact et se déplaçant moins vite que le fluide, il n’est pas sorti
de la colonne (Figure n°137).

2.5

Sortie colonne n°2

2
Sortie de la Sortie de la
colonne n°2 colonne n°1
[Link]

1.5

0.5

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

V.P

Figure n°137 : Suivi de la DO cellulaire en sortie de colonne n°2 lors de l’injection du 1er
V.p de solution calcifiante (série n°1).

Le passage du floc est caractérisé par les deux pics successifs de D.O entre 0.5 et 0.63
V.p. Il se dépose dans la colonne n°3 entre 0.7 et 1 V.p. Plus le sable est fin, meilleure est sa
fixation, car la présence de particules fines et le compactage de la colonne semblent
augmenter la tortuosité et rendent le réseau poral plus complexe et moins interconnecté.
Paradoxalement, c’est un phénomène plus complexe qui s’est produit. En effet, en tête de
colonne, ce sable favorise très fortement la fixation des bactéries mais, lorsqu’un précipité ou
un floc se forme, il le laisse passer à travers la colonne n°2. Pour compléter ces observations,
des mesures de perméabilité ont été réalisées sur les colonnes de la série n°2. La perméabilité
est la capacité d’un milieu poreux à laisser passer un fluide. Le but était de déterminer le
coefficient de perméabilité K (m/s) après traitement dans un sable très fin. Ce sable possède
un coefficient d’uniformité (Cu = D60/D10) > à 2, et par conséquent le calcul du coefficient de
perméabilité à l’état dense se réalise par la formule approchée de Hazen K = ((e3)/ (1+e)) x
(d10)2, avec e qui est l’indice des vides et qui est relié à la porosité (n) par la formule e = n/ (1-
n) (Tableau n°119).

Tableau n°119 : Données de valeurs de Rc et calculs de perméabilité à l’état lâche pour la

série n°1.

Série n°1 en sable Correcteur Colonne n°1 Colonne n°2 Colonne n°3
Rc (MPa) 0.8 0.06 0
Hazen 8.46.10-5
K (m/s) pour
Hazen
l’état lâche 1.14.10-5
modifiée
K (m/s) Mesurée 3.10-6 2.10-6 3.10-6

A l’origine, la perméabilité à l’état lâche est faible (10-4 à 10-5); mesurée après la bio
calcification, elle diminue de près d’un facteur de 10. Ces valeurs correspondent à des valeurs
de zone faiblement perméable puisque 10-6 m/s représentent une vitesse de 30 cm/an. D’après,
les données ci-dessus, les particules y seront injectables lorsque leur diamètre moyen sera
inférieur à 1 µm (Cambefort, 1967). Ceci rend ce sable difficilement injectable et très
probablement dès le 1er V.p de solution calcifiante, favorisant ainsi les courants préférentiels.

275
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Une mesure de perméabilité a été réalisée sur les colonnes de sable de Fontainebleau et a
permis d’obtenir un coefficient de perméabilité de 5.10-5 m/s pour un coefficient de Hazen
calculé de 2.25 . 10-4 m/s. Le sable Correcteur étant plus fin, la diminution d’une puissance
semble se justifier. Pour s’assurer de la fiabilité des mesures de la perméabilité en colonnes
calcifiées, un colorant (bleu de méthylène) y a été injecté. Ce colorant est employé d’après la
norme NCEN 933-9 pour identifier l’argilosité (fine) car il possède une grande affinité pour
les éléments argileux. En effet, le bleu méthylène du fait de sa charge positive rend compte de
l’état d’activité de surface du sable et de l’écoulement en colonne. Les colonnes ont été
injectées du bas vers le haut séparément avec cette solution de bleu de méthylène (1 g/l). Dans
notre cas, le bleu de méthylène sert à identifier le parcours du fluide à l’intérieur de la série
n°1 (Figure n°138).

Figure n°138 : Les sections inférieures des colonnes injectées sont marquées avec du bleu de
méthylène. A droite est présentée une coupe transversale de la section inférieure de la
colonne n°2. Les zones blanches correspondent aux zones de sable cimentés.

Les zones d’écoulement sont imprégnées en bleu, elles le sont d’autant que la présence
de cristaux de carbonate de calcium et la biomasse résiduelle calcifiée favorisent la fixation
du bleu de méthylène. Les zones non imprégnées correspondent aux zones sans écoulement.
En effet, d’après Sifraco, ce sable est composé à 99 % de silice. Ces images suggèrent que les
écoulements en doigt de gants peuvent emprunter des chemins préférentiels dans les colonnes
calcifiées (Figure n°138 : flèches vertes). Ce mode d’écoulement a déjà été mis en évidence
lors de précédents essais. Ces observations invalident les mesures du coefficient de
perméabilité sur le sable Correcteur calcifié, car de nombreux courants préférentiels modifient
cette mesure, notamment les effets de bord. Par ailleurs, ces échantillons ont été compressés et
la distribution des zones calcifiées confirme ces observations (Figure n°139).

Figure n°139 : Des morceaux de la colonne n° 1 de la série n°1 après écrasement par
compression simple. Les flèches pleines montrent des morceaux consolidés de sable. Les
flèches en pointillés bleus indiquent des zones de sable compactées mais non consolidées.

276
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Ces informations tendent à montrer que le sable Correcteur est trop fin pour être
injecté. En effet, la suspension de biomasse ne migre que dans la périphérie de la colonne, le
long des parois en PVC, avec une pénétration vers le cœur, dès la première colonne en série,
sur une épaisseur moyenne de 1 cm environ. Ces observations permettent d’expliquer la
présence de carbonate de calcium dans les colonnes n°2 et n°3 sans pour autant avoir de
valeur de Rc. Comme le floc s’est déplacé le long de ces colonnes, seules les zones
périphériques ont été alimentées. Le sable s’est consolidé uniquement contre les parois. En
conséquence, avec du sable Correcteur, il est impossible d’exploiter ces résultats plus en
avant.

En conclusion : ces essais définissent, dans les conditions expérimentales données, une
limite granulométrique du procédé de bio calcification. L’effet filtrant de ce sable Correcteur,
plus particulièrement, dans sa fraction fine, est le facteur limitant prépondérant. Une meilleur
lisibilité de ce phénomène est possible grâce à la prise en compte des coefficients
granulométriques tels que Cu et Ce. Par ailleurs, d’après les valeurs des coefficients de
perméabilité du sable NE 34 et selon le critère de pénétrabilité de Cambefort (1967), le
diamètre moyen des particules injectables se situe autour de 1.5 µm. Avec le sable Correcteur,
ce diamètre moyen devient 0.86 µm ce qui est considérablement plus faible. Cet effet de
rétention réduit considérablement la distance d’injection et donc l’action de ce procédé dans
du sable fin et compacté, dans l’état actuel du protocole d’injection.

VI. LES EFFETS DU COMPACTAGE SUR LA BIO CALCIFICATION DANS DU

SABLE DE FONTAINEBLEAU.

1. Les effets du compactage sur la bio calcification dans le cas du Sable de

Fontainebleau Correcteur.

Pour s’assurer que les résultats précédents ne sont pas sous l’influence unique de la
méthode de compactage du sable Correcteur, 4 nouveaux essais d’injection en colonne simple
ont été réalisés. Deux techniques de compactage ont été employées. L’une classique, cumule
le dépôt dans un tube de PVC rempli d’eau, du sable par pluviation et l’application régulière
de vibration (P&V). L’autre, consiste en un simple tassement du sable à l’aide d’un pilon
(T&P). Elle a été utilisée au début, lors des premiers essais en colonne.
Au cours et en fonction des avancées de la recherche sur la bio calcification en
colonnes en série, le phasage d’injection a été modifié. Par ailleurs, une étude financière
réalisée en interne à la Société Soletanche-Bachy a porté sur les coûts de mise en place du
procédé en chantier. Les coûts obtenus ont amené à une réduction à trois, du nombre de
volumes de pore de solution calcifiante à injecter. Pour passer de 5 V.p à 3 V.p de solution
calcifiante et pour garder la même quantité de calcium introduit dans le système, il faut
augmenter la concentration équimolaire de 0.5 M initiale à 0.83 M. Les temps de batch sont
également passés de 3 heures à 9 heures de façon à prendre en compte les effets d’inhibition
consécutifs à l’accroissement des concentrations. Ainsi, plusieurs paramètres ont varié
simultanément.

Une première recherche a porté sur 4 colonnes simples faites en sable Correcteur
(Tableau n°120). Il a été choisi d’injecter une suspension bactérienne de D.O cellulaire
élevée (3.4) pour mieux appréhender l’effet de rétention du sable sur la biomasse. En effet,
plus la biomasse est concentrée plus l’effet filtrant du sable sera marqué.

277
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Tableau n°120. Caractéristiques des colonnes tests pour évaluer l’impact de la méthode de
compactage sur le sable de Fontainebleau Correcteur et résultats obtenus.

Caractéristiques Série n°1 Série n°2

Pluviation et Tassement par
Méthode de compactage
vibration pilon
Colonne Colonne Colonne Colonne
Numéro de colonnes simples
n°1 n°2 n°3 n°4
D.O cellulaire (600 nm) 3.4
Biomasse A.E (mS/min/ml) 0.718
Vitesses moyennes d’hydrolyse
415
de l’urée, estimées (µM/min)
Densité 1.72 1.72 1.74 1.75
Porosité apparente 0.39 0.39 - -
Rc (MPa) 0.27 0.13 0.066 0.079
Teneur en CaCO3 (g/cm3) 0.114 0.096 - -

Les mesures de Rc montrent une influence très nette du mode de compactage des
colonnes. La méthode par pluviation et vibration (série n°1) permet d’obtenir une meilleure
résistance maximale en compression simple (0.27 et 0.13), avec une moyenne de 0.2 ± 0.098
MPa contre, 0.0072 ± 0.009 pour la série n°2, par la méthode de tassement par pillon
(Tableau n°120). Les valeurs de Rc sont néanmoins plus proches avec cette méthode
(coefficient de variation = 2.5 %, seulement, contre 49 % avec la méthode de tassement).
Dans les deux cas, les mesures de Rc ont dévoilés des effets importants de bord ;
confirmant la faible pénétrabilité de ce sable. Par ailleurs, les colonnes tassées par pilon sont
caractérisées par la formation de strates. Ces dernières favorisent l’effet de filtration
mécanique de ce sable. En effet, le remplissage de la colonne par la méthode du pilon
s’effectue en une série de dépôts de sable sous eau sur des sections de 2 à 3 centimètres à la
fois, qui sont ensuite pilonées. Ceci a pour conséquence de créer un gradient granulométrique
au sein de chaque couche. Au cours de la pluviation, les grains de sables de plus gros diamètre
seront déposés avant les fines qui resteront de préférence en partie haute de la couche, en
raison d’une plus faible vitesse de sédimentation. Le pilonage ne changera pas ce
granuloclassement.
Cette surcouche de fines, crée une zone supplémentaire de filtration mécanique et
donc, augmente la tortuosité, celle-ci étant l’inverse du diamètre des particules, dans le cadre
de sable fin (Duffy et al., 1995). Le diamètre moyen de la porosité est estimé à partir de la
formule d15 < 4 d85 d’après Schiereck (2004) avec un diamètre moyen de pores de 30 à 35 µm.
Une analyse granulométrique des particules passant en suspension lors de la mise place du
sable Correcteur en colonne donne la distribution suivante (Tableau n°121). La tortuosité des
particules fines varie de 270 à 8 soit d’un facteur de plus de 37 avec le sable de Fontainebleau
Correcteur.

Tableau n°121 : Caractéristiques des

Caractéristiques granulométriques des particules fines en d 10 d 50 d 90
fines en suspensions et des niveaux de suspension
tortuosité pour le sable Correcteur. Diamètre en µm 3.71 12.8 125
Tortuosité 270 83 8

278
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Par ailleurs, d’après Wiffin (2005, communication personnelle), la granulométrie des

précipités formés durant l’injection du premier V.p d’une solution calcifiante de concentration
de 1 M, produit des flocs de 100 µm de diamètre. Par voie de conséquence, la zone faiblement
consolidée se situe juste après cette sous couche. Ce phénomène, conduit à des cassures
horizontales de la colonne au moment de son ouverture (Figure n°140).

Figure n°140 : Série de sections circulaires de sable consolidé qui se sont séparées lors du
démoulage d’une colonne compactée avec la méthode « pluviation et pilonnage ».

Ce phénomène n’apparaît pas lorsque la méthode de pluviation et vibration est utilisée,

puisque les grains de sables et les fines se répartissent de manière homogène sur toute la
longueur de la colonne ; ainsi sont-elles plus aisément mélangées au fur et à mesure.

Ainsi, d’après ces informations, pour un sable très fin, une première limite du procédé
peut être posée avec une certitude plus grande. La méthode de consolidation d’un milieu
poreux dans cette étude est indissociable de l’injection de la biomasse. Ces essais d’injection
unidimensionnelle mettent en évidence des phénomènes de filtration liés au procédé. Ces
expériences ont donc permis d’observer une accumulation de la biomasse au sein d’une
matrice homogène et poreuse, notamment au niveau du point d’injection. Le profil moyen des
Rc suit le profil de dépôt de la biomasse selon une courbe exponentielle décroissante en
fonction de la distance. Les performances de la consolidation peuvent être appréciées en
fonction du rapport : L/D = longueur colonne calcifiée/diamètre de la colonne. Ce rapport
varie en fonction du type de sable. Ainsi, pour un sable Correcteur il est de 5.5 et de 7.9 pour
le sable de Fontainebleau avec ce niveau dense de compactage . Ainsi, si l’on concevait une
colonne de 30 cm de diamètre on pourrait espérer une longueur de consolidation de 237 cm à
partir du point d’injection et dans des conditions expérimentales identiques. Les
caractéristiques de l’injectabilité sont donc à établir en premier à l’aide de la courbe
granulométrique, ce qui permet ensuite de mieux appréhender le phénomène de colmatage en
présence d’une suspension biologique.

2. Les effets du compactage sur la bio calcification dans les cas du Sable de
Fontainebleau brut et du sable d’Itterbeck.

Une expérience complémentaire a consisté à injecter, dans des conditions identiques,

12 colonnes constituées de deux sables différents ; 4 sont en sable Itterbeck et 8 sont en sable
de Fontainebleau brut. Chaque duplicata a été élaboré soit à l’aide de la méthode par
Pluviation et Vibration (P&V) soit par tassement du sable par pilon (T&P) (Tableau n°122).

279
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Les injections ont été réalisées à température ambiante avec une A.E moyenne de 0.83
± 0.07 mS/min/ml avec un coefficient de variation (CV) faible (9 %). La D.O cellulaire
moyenne est de 2.58 ± 0.28 avec un CV également faible de 11 %. Ces faibles variations
permettent de mieux comparer les résultats obtenus entre les différentes séries.

Tous les échantillons ont été écrasés pour obtenir les valeurs de Rc, puis analysés pour
mesurer leur teneur en carbonate de calcium (Tableau n°123).

Tableau n°122 : Les caractéristiques des colonnes et des conditions d’injection, résultats
obtenus.

Caractéristiques des colonnes Série n°4 Série n°5 Série n°6

Type de sable Fontainebleau brut Itterbeck
Méthode de compactage P&V T&P P&V T&P P&V T&P
Nombre de colonnes 2 2 2 2 2 2
D.O cellulaire (600 nm) 2.22 1.75 2.76
A.E (mS/min/ml) 0.624 0.891 0.805
Biomasse Vitesses moyennes
estimées d’hydrolyse de 445 507 417
l’urée (µM/cm/min)
Densité moyenne 1.72 1.72 1.74 1.75
Porosité apparente moyenne 0.39 0.39 / /
[Urée/Ca++] (M) 0.83
Solution
Nombre de VP 3
calcifiante
Durée d’un batch 9 heures
Colonne 1 0.541 0.684 0.469 0.140 0.287 0.277
Rc (MPa)
Colonne 2 0.208 0.289 0.338 0.063 0.189 0.450
Teneurs en Colonne 1 0.099 0.097 0.103 0.086 0.063 0.064
CaCO3 g/(cm3) Colonne 2 0.063 0.083 0.089 0.058 0.075 0.087

Tableau n°123 : Récapitulatif statistique des résultats tout sable confondu des valeurs de Rc
et de la teneur en carbonate de calcium issu des tests de compactage.

Méthode de Coefficient de
Paramètres N actifs Moyenne Ecart-type
compactage Variation
P&V 6 0.36 0.12 53 %
Rc (MPa) T&P 6 0.32 0.22 70 %
P&V 6 0.08 0.02 21 %
CaCO3 (g/cm3) T&P 6 0.10 0.04 41 %

Si l’on ne tient pas compte de la nature du sable, de très fortes variations apparaissent
entre les duplicata et entre les séries, quelle que soit la variable étudiée (Rc ou teneur en
CaCO3). Les deux techniques de compactage employées montrent des coefficients de
variations élevés pour les résultats de résistance maximales à la compression simple. Le
coefficient de variation est supérieur de 20 % lorsque la technique de compaction du sable est
celle du tassement par pilon que l’on considère les Rc ou les teneurs en CaCO3.
L’hétérogénéité des résultats confirme l’hétérogénéité du sable dans la colonne.

280
 Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Par ailleurs, la relation liant les valeurs de Rc sont en fonction de la teneur en

carbonate de calcium, tout sable et technique confondus, une courbe croissante ayant tendance
à être de type exponentiel, d’équation y = 0.0218 e (31.71x) avec une corrélation faible (R =
0.75), et une dispersion élevée (R2 = 0.5226) est obtenue (Figure n°141).

0.8 0.8

0.7 0.7
RC (MPa)
Médiane
0.6 0.6
Points atypiques

0.5 0.5
Rc (MPa)

Rc (MPa)
0.4 0.4

0.3
0.3

0.2
0.2

0.1
0.1

0.0
0.055 0.065 0.075 0.085 0.095 0.105 0.0
0.060 0.070 0.080 0.090 0.100 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11
3 3
CaCO3 (g/cm ) CaCO3 (g/cm )

Figure n°141 : Valeurs de Rc en fonction de la teneur en carbonate. Les ronds bleus (○)
correspondent au sable de Fontainebleau, tandis que le sable d’Itterbeck est des triangles
rouges (▲). La figure de droite est une représentation en bag plot.

Malgré une forte dispersion (4 points atypiques), la représentation graphique en bag

plot montre un comportement similaire qui, dans ce cadre expérimental, ne dépend pas du
type de sable. En effet, les variations avec le sable d’Itterbeck et le sable de Fontainebleau
sont similaires ce qui laisse penser que la technique de compactage a un impact beaucoup plus
fort. Une seule corrélation un peu significative a été identifiée lorsqu’on fait une étude
statistique englobant les 4 variables. Elle lie le compactage par la méthode de pluviation et
vibration (P&V) avec la teneur en CaCO3 (P&V - CaCO3) avec R = 0.88, avec p<0.05 et un
R2 = 0.7823 (Figure n°142). Une telle relation n’existe pas lorsque le sable est compacté par
pilon (T&P) et ceci quel que soit le type de sable.

281
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

T&P RC(Mpa) = 0.1353*exp(10.6715*x)

P&V RC (Mpa) = 0.0856*exp(17.2039*x)
0.8
0.8

0.7
0.7

0.6
0.6

T&P Rc (MPa)
P&V Rc (MPa)

0.5
0.5

0.4
0.4

0.3
0.3

0.2
0.2

0.1
0.1 0.055 0.065 0.075 0.085 0.095 0.105
0.060 0.065 0.070 0.075 0.080 0.085 0.090 0.095 0.100 0.105 0.060 0.070 0.080 0.090 0.100

P&V-CaCO3 (g/cm3) T&P-CaCO3 (g/cm3)

Figure n°142 : Profil des valeurs de Rc en fonction de la teneur en carbonate selon la

méthode de compactage du sable, à gauche méthode P&V et à droite méthode T&P. En rond
bleu (○), le sable de Fontainebleau, et en triangle rouge (▲) le sable d’Itterbeck .

Une même relation apparaît également avec les vitesses d’hydrolyse de l’urée, car
elles sont déduites par calcul des teneurs en carbonate de calcium. La relation entre les
vitesses et les Rc n’existe que lorsqu’il s’agit de la compaction par pluviation – vibration.

En effet, la méthode de compaction T&P favorise la formation de strates qui créent

une plus forte hétérogénéité dans la colonne. Cette hétérogénéité accentue la dispersion des
points, comme c’était le cas précédemment avec le sable Correcteur. Ces strates de sable fin
augmentent la tortuosité et jouent un rôle de puissant filtre. Dans ces zones, les bactéries vont
s’agglutiner préférentiellement et former une barrière où l’hydrolyse sera plus efficace par
effet de nombre. Ce phénomène d’agglutination a été mis en évidence aussi par Martin et al.,
(1996) qui ont pu déterminer dans le cas des sédiments hétérogènes le rôle prépondérant de la
fraction efficace (d10) dans le nombre de collisions avec des bactéries. La conséquence,
immédiate, est une diminution rapide de la concentration en urée et calcium en fonction de la
distance lors de l’injection. Par conséquent, les faibles valeurs de Rc obtenues avec cette
méthode sont dûes à un effritement de la base de l’échantillon par manque de sable
suffisamment consolidé. De plus, la qualité de tassement par la méthode du pilon est plus
aléatoire, puisque l’opérateur intervient tout au long de la conception de la colonne. Le
nombre d’interventions, fonction de la longueur totale de la colonne, et le facteur humain
intensifient d’autant plus son hétérogénéité.

Par ailleurs, lorsque le nombre de bactéries par cm3 de sable mis en place est au dessus
d’une certaine valeur seuil, l’hydrolyse de l’urée et la précipitation du carbonate de calcium se
font aussi durant l’injection, surtout lorsque la vitesse d’injection est basse. La diminution des
performances (CaCO3/Rc) est plus rapide lorsque le sable a été compacté par le pilon ce qui
indique une dépendance dans ce cas, plus forte vis à vis des caractéristiques de la biomasse.

D’une manière générale, pour deux suspensions de biomasse possédant une A.E
équivalente mais des D.O différentes, c’est la suspension la plus concentrée qui donnera la

282
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

meilleure consolidation. Une zone plus grande, de sable saturé en activité enzymatique,
apparaîtra, dans laquelle le nombre de cellules par cm3 de sol sera suffisant pour hydrolyser
une plus quantité de solution calcifiante. Par contre dans le cas où deux suspensions de
biomasse de même D.O cellulaire mais d’AE différentes sont injectées, c’est la suspension
possédant la plus faible activité enzymatique qui donnera la meilleure efficacité. L’effet de la
barrière à hydrolyse sera moins marqué et laissera plus de réactif pénétrer la colonne et la
consolidation s’étendra plus loin par rapport au point d’injection.

CaCO3/ RC-( g/cm 3/Mpa) -T&P = 1.7113-0.576*x

CaCO3/ RC-( g/cm3/Mpa) -P&V = 0.2189+0.0058*x
1.0
1.0

0.9
0.9

0.8
0.8

CaCO3/ Rc-( g/cm3/MPa) -T&P

CaCO3/ Rc-( g/cm3/MPa) -P&V

0.7
0.7

0.6 0.6

0.5 0.5

0.4 0.4

0.3 0.3

0.2 0.2

0.1 0.1
1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8

DOcell - P&V DOcell-T&P

Figure n°143 : Efficacité du procédé (CaCO3/Rc) en fonction de l’accroissement de la

D.O cellulaire selon le type de tassement du sable, (P&V à gauche) et (T&P à droite).
CaCO3/ RC-( g/cm3/Mpa) -P&V = 0.2549-2.9534E-5*x CaCO3/ RC-( g/cm 3/Mpa) -T&P = -0.9521+0.0017*x
1.0 1.0

0.9 0.9

0.8
CaCO3/ Rc-( g/cm3/MPa) -T&P

0.8
CaCO3/ Rc-( g/cm3/MPa) -P&V

0.7 0.7

0.6 0.6

0.5 0.5

0.4 0.4

0.3 0.3

0.2 0.2

0.1 0.1
600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920

A.E -P&V A.E-T&P

Figure n°144 : Efficacité du procédé (CaCO3/Rc) en fonction de l’accroissement de

l’A.E selon le type de tassement du sable (P&V à gauche) et (T&P à droite).

283
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Lorsque la technique employée est celle de la pluviation – vibration (P&V),

l’accroissement de la D.O. cellulaire ou de l’A.E. ont peu d’effet sur l’efficacité du procédé
(Figures n°143 et 144). En effet, une courbe de tendance linéaire et horizontale, place
l’efficacité du procédé à 0.220 g/cm3 la quantité de carbonate de calcium nécessaire par cm3
de sol mis en place pour atteindre 1 MPa. Cette relation peut s’expliquer d’une part par une
meilleure homogénéisation granulaire de la colonne permettant une meilleure pénétrabilité.
Ceci ne tient pas compte d’une part, d’une hétérogénéité du pouvoir d’adhésion suspectée
dans une population monoclonale et d’autre part, de la petite taille des colonnes (0.2 m) ce qui
ne permet pas pour l’instant d’extrapoler l’effet de la compaction sur de plus grande longueur.
Cependant ces essais suggèrent, que la présence de strates et plus généralement, les
différences granulométriques qui existeront obligatoirement dans le sous sol, seront des
sources supplémentaires d’hétérogénéité qui se traduiront par des zones d’écoulement
préférentiel des fluides et donc de consolidation.

Toute cette étude statistique n’a pas différencié le Sable de Fontainebleau du Sable
d’Itterbeck et ceci est dû d’une part, à leur similitude granulométrique et d’autre part, peut-
être au nombre réduit d’échantillons en Sable d’Itterbeck. Dans l’étude de l’influence du
mode de compaction sur la bio calcification la granulométrie du sable joue un rôle plus
important que le micro relief de chaque grain (forme et taille).

3. L’injectabilité dans un sable fin d’une suspension bactérienne de type bâtonnet.

Les analyses statistiques précédentes montrent très nettement que la bio calcification
n’aura pas le même rendement en fonction de la nature des sables rencontrés. Ainsi,
l’obstruction partielle des premiers centimètres des colonnes en sable Correcteur a favorisé
l’écoulement le long des bords, malgré la présence de vaseline, produit qui est étalé le long
des parois en PVC pour faciliter le démoulage des colonnes. De par sa haute viscosité, il n’est
pas affecté par le passage des fluides et reste en place ; il tend donc à limiter leurs
écoulements préférentiels contre la paroi.
Ces résultats ne sont que partiellement corroborés par les données externes telles que
la granulométrie et les formules déterminant la rétention. Le rapport dbactérie/dgrain établi pour
un diamètre moyen de bactérie de 1.5 µm suggèrent que l’effet de filtration n’est pas le
phénomène prépondérant (Cambefort, 1967 ; Herzig et al, 1970) mais qu’il est dominé par le
jeu des forces d’interaction. De plus, Schiereck (2004) suggère que l’effet de filtration
mécanique ne s’opère pas au niveau des pores de diamètre compris entre 25 et 30 µm selon le
type de sable utilisé, mais au niveau de la microporosité (< 0.4 µm) et de la mésoporosité (0.4
µm – 6 µm). Cette micro ou mésoporosité correspond à ce que l’on a appelé les zones inter
granulaires. Ainsi, c’est au niveau des zones interganulaires que l’effet de filtration
mécanique semble le plus probable notamment pour les portions les plus fines des courbes
granulométriques (Tableau n°124).

Les rapports sont naturellement plus élevés pour les sables plus fin. Néanmoins, ces
rapports sont inférieurs à 0.065 et par conséquent, il est estimé que l’effet de filtration n’est
pas mécanique. Cependant, d’après Bradford et al., (2002) l’effet de filtration apparaît lorsque
le diamètre des particules est 5.10-3 fois celui du d50. Autrement dit, l’effet de filtration
apparaît dès que le rapport des diamètres est tel que d Bactérie/d grain < 5.10-3. Dans ce cas, l’effet
filtrant apparaît sur toute la bande passante du sable Correcteur et à l’exception du d90 pour le
sable NE 34. Ceci concorde avec les observations pour ces deux sables. En effet, le profil de
bio calcification est similaire, c'est-à-dire de type exponentiel décroissant, sauf dans le cas du

284
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

lessivage. Ceci signifie également le sable d’Itterbeck dont les caractéristiques

granulométriques sont proches du sable de Fontainebleau et du sable Correcteur présente un
même profil de bio calcification (Tableau n°125).

Tableau n°124 : Evaluation et comparaison de l’effet de filtration mécanique du sable

selon dbactérie/dgrain pour une bactérie de dimension moyenne de 1.5 µm
pour deux sables fins.
Paramètres d 10 d 50 d 60 d 90
Sable Correcteur
Diamètre sable (mm) 0.092 0.16 0.19 0.28
Rapport d Bactérie/d grain 0,016 0,009 0,008 0,005
Sable NE 34
Diamètre sable (mm) 0.157 0.205 0.221 0.32
Rapport d Bactérie/d grain 0,01 0,007 6.7 . 10-3 4.6 . 10-3

Tableau n°125 : Caractérisation de courbes granulométriques de trois sables à partir du

coefficient granulométrique.

Sable
Sable
Paramètres Fontainebleau Sable Itterbeck
Fontainebleau brut
Correcteur
Coefficient d’uniformité
2.07 2.00 1.73
(Cu = D60/D10)
Coefficient d’étalement
3.04 2.50 2.86
(Ce = D90/D10)
Coefficient de courbure
0.97 1.02 0.98
(Cc = D302/D10 x D60)
Coefficient de symétrie
0.99 1.28 0.88
(Cs = D502/D90 x D10)
Perméabilité k (m/s) pour
8.46 . 10-5 1.96 . 10-4 1.21 . 10-4
l’état lâche

Le sable de Fontainebleau brut (SFB) et le sable d’Itterbeck (ITT) sont caractérisés

par un Cu < 2 contrairement au sable Correcteur. Ceci confirme la présence importante de
fines dans le sable Correcteur et est corroboré par un faible coefficient de perméabilité à l’état
lâche 8,46 . 10-5 (m/s). Les coefficients de courbure (Cc) et de symétrie (Cs) pour ces trois
sables sont similaires, ce qui ne permet pas d’évaluer l’impact de la filtration avec ces seuls
coefficients. Par contre, le coefficient d’étalement (Ce) complète les informations issues du
Cu. Ainsi, il est plus élevé pour le sable Correcteur ce qui suggère un glissement de la courbe
granulométrique dans le sens de la fraction efficace. Donc, un sable dont la granulométrie
possède un Cu > 2 et un Ce ≥ 3 a toutes les chances d’être difficilement pénétrable par une
biomasse de type S. pasteurii dans les conditions du cadre expérimental, entre autre avec des
vitesses réelles d’injection de 0.2 m/h.

L’injectabilité dépend aussi du compactage des sables. En effet, le type de mise en

place t fait intervenir le profil granulométrique du sable compacté et plus particulièrement la
faction efficace. Ainsi la méthode de compactage offrant la meilleure pénétrabilité est de type
P&V, car la distribution de la fraction efficace est plus homogène. Cette méthode permet de
réduire localement la porosité et par là même la tortuosité contrairement à la méthode T&P.
Ceci suggère également un impact non négligeable de la qualité du réseau de pore inter

285
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

connecté. La pénétrabilité de la biomasse le long de la colonne est très probablement liée à

cette connectivité. Si une première estimation de la qualité de l’injectabilité peutêtre estimée à
l’aide de trois coefficients granulométriques, le coefficient d’uniformité (Cu), le coefficient
d’étalement (Ce) et le coefficient de courbure (Cc), elle doit être complétée en prenant en
compte les caractéristiques de la biomasse. En effet, la DO et l’A.E sont susceptibles
d’accentuer le phénomène de colmatage dans le cadre de colonne stratifiée.

Par ailleurs, les essais ont tous été réalisés avec le maximum de compaction pour
maintenir un bon niveau de reproductivité et permettre la comparaison des colonnes entre
elles. Faire varier la compaction d’une colonne à l’autre est une approche qui n’a pas été mise
en jeu dans le cadre de cette recherche en raison des difficultés techniques et du temps
imparti. Les résultats ne tiennent pas compte des variations possibles de la compaction dans
les sous sols naturels mais permettent néanmoins de pallier certaines de ces contraintes.

VII. LES EFFETS DE L’AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION DE LA

SOLUTION CALCIFIANTE SUR L’EFFICACITE DU PROCEDE.

L’augmentation de la concentration de la solution calcifiante a été nécessaire pour

diminuer le nombre de volume de pore à injecter. Cette augmentation de 38 % a nécessité une
étude comparative de ces effets sur le processus de bio calcification. Ainsi, la comparaison
des différentes courbes de tendance de Rc-CaCO3 entre-elles, à partir de colonnes de même
dimension contenant le même sable avec la même méthode de compactage et enfin avec un
protocole d’injection identique, permet d’observer une amélioration dans le processus de bio
calcification (Figure n°145).

2.2

2.0

1.8

1.6 Figure n°145 : Rc en fonction de la

1.4 teneur en carbonate de calcium. La
courbe en rouge (large pointillé) a été
RC (MPa)

1.2

1.0 obtenue avec du nitrate de calcium 0.5

0.8 M, la courbe en vert (en continu) avec
0.6 du chlorure de calcium 0.5 M, la
0.4 courbe en bleu (pointillé fin avec du
0.2 nitrate de calcium 0.83 M.
0.0
0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
CaCO3 (g/cm 3)

La courbe en bleu (0.83 M de nitrate de calcium) correspond aux résultats obtenus

durant l’étude sur l’effet du compactage et montre que l’on obtient des valeurs de Rc plus
importantes. Néanmoins, il est difficile de repérer le paramètre responsable car ils sont
nombreux à avoir été changés (concentration de la solution calcifiante, ajout d’un additif
(Chicorée à 0.25 g/l) etc…). L’effet de synergique n’est pas non plus à négliger. L’allure de
cette courbe est cependant similaire à celle obtenue avec du chlorure de calcium (0.5 M) lors
des tests sur les effets de la nature du sel de calcium sur le processus de bio consolidation. Les
valeurs sont simplement plus élevées.

286
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

VIII. LES EFFETS DU DOUBLEMENT DU VOLUME DE PORE DE

BIOMASSE SUR LE PROFIL DE CALCIFICATION EN COLONNE DE
0.4 m.

L’homogénéité de la bio calcification est fortement liée à la quantité de biomasse

injectée. A ce stade des recherches, le sel de calcium utilisé était le nitrate de calcium. Pour
étudier l’impact du doublement de la quantité de biomasse injectée, quatre colonnes de 0.4 m
chacune ont été construites avec du sable de Fontainebleau, compacté par la méthode de
pluviation et de vibration. Le phasage d’injection est identique à celui mis en jeu dans les tests
de compaction, mais adapté pour des colonnes de 0.4 m. Les colonnes en fin d’expériences
sont ensuite découpées en trois tronçons d’élancement de 2, correspondant à trois gammes de
distances à partir du point d’injection, soit 3 – 12 cm, 12 – 24 cm et 24 - 38 cm. Ces tronçons
sont ensuite compressés pour obtenir les Rc puis broyées pour des analyses de la teneur en
carbonate de calcium (Tableau n°126).

Tableau n°126 : Les caractéristiques des quatre colonnes injectées pour l’étude de l’effet de
biomasse et résultats.

Colonne Colonne Colonne Colonne

Caractéristiques
n°1 n°2 n°3 n°4
D.O = 2.09, A.E = 857 µS/cm/min, âge 24
Biomasse
heures.
Nombre de V.p de
1 V.p 2 V.p
biomasse
Densité apparente 1.69 1.70 1.62 1.73
Solution calcifiante 0.83 M
Nombre de volume de
3 V.p
pore injecté
0 – 12 cm 0.5 0.9 0.2 0.7
Rc
12 – 24 cm 0.2 0.2 0.2 0.2
(MPa)
24 – 38 cm 0.1 0.2 0.05 0.06
0 – 12 cm 0.11 0.185 0.124 0.109
CaCO3
3 12 – 24 cm 0.073 0.047 0.070 0.085
(g/cm )
24 – 38 cm 0.042 0.052 0.096 0.053

Tableau n°127 : Les valeurs de Rc moyennées en fonction de la distance et du nombre de

V.p de biomasse.

0 - 12 12 – 24 24 – 38
Rc (MPa)
cm cm cm
Moyenne 1 V.p 0.7 0.2 0.15
Ecart-type 0.28 0 0.07
CV (%) 40 0 47
Moyenne 2 V.p 0.45 0.2 0.06
Ecart-type 0.35 0 0.01
CV (%) 79 0 13

Ces quatre colonnes ont été injectées avec une activité enzymatique permettant
d’obtenir un taux d’hydrolyse maximum. Elle se trouve dans une bande d’activité
enzymatique injectable entre 500 et 800 µS/cm/min pour des performances allant de 0.1 à 0.2
g/cm3. Les quatre colonnes ont été injectées en même temps.

287
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

1.20

1.00 Moyenne1V.p Figure n°146 : Moyennes des

Moyenne 2 V.p résistances maximales à la
0.80 compression (Rc) en fonction
R C (M P a)

de la distance par rapport au

0.60
point d’injection et du nombre
0.40 de V.p de biomasse injectés.
2
R = 0.8843
0.20

0.00
0-12 cm 12-24 cm 24-38 cm

Les résultats montrent que quelles ques soient les colonnes, un gradient de résistance à
la compression apparaît entre les sections supérieures et inférieures des colonnes (Tableaux
n°126 et 127). Ainsi un facteur moyen de 4.75 ± 0.35 existe pour les colonnes injectées avec
1 V.p de biomasse contre 7.83 ± 5.42 pour celles injectées avec 2.V.p. (Figure n°146). Une
diminution des Rc s’opère suivant une équation une courbe de tendance de type exponentielle
Y (Rc (MPa)) = 1.5539 e-0.0709 x)) avec un coefficient de dispersion de R2 = 0.8843.
Cependant, une forte hétérogénéité réside au sein de chaque duplicata mais de manière plus
prononcée dans le cas où 2 V.p de biomasse ont été injectés, notamment dans la première
section de colonne (0 - 12 cm). Cette forte variation (CV = 79 %) n’est probablement pas dûe
à la différence de densité de la colonne n°3. En effet, une différence de 7 % dans la densité
signifie une colonne moins compacte et par voie de conséquence une meilleure pénétrabilité
de la biomasse mais en contre partie, cela rend plus difficile sa consolidation. Dans ce cas, il
devrait y avoir une teneur en carbonate de calcium supérieure, sans pour autant produire une
résistance plus élevée ce qui semble être le cas (Tableau n°128 et Figure n°147).

CaCO3 (g/cm3) 0 - 12 cm 12 – 24 cm 24 – 38 cm
Tableau n°128 : Les teneurs en Moyenne1 V.p 0.15 0.06 0.05
carbonate de calcium en Ecart-type 0.05 0.02 0.01
fonction de la distance et du CV (%) 36 30 15
nombre de V.p de biomasse Moyenne 2V.p 0.12 0.08 0.07
injectée. Ecart-type 0.01 0.01 0.03
CV (%) 9 14 41

288
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

0.25
Moyenne1V.p

Moyenne 2 V.p
CaCO3 (g/cm ) 0.20 Figure n°147 : Moyennes des
teneurs en carbonate de
3

0.15 calcium en fonction du

2
R = 0.9007 nombre de V.p de biomasse
0.10 injectés et de la distance.
0.05

0.00
0-12 cm 12-24 cm 24-38 cm

Les teneurs en carbonate de calcium diminuent de manière significative entre la

première section et les deux suivantes (12 à 38) quelque se soit le nombre de V.p de biomasse
injectés dans les conditions de l’expérience. Le dernier tronçon des colonnes ayant reçu 2 V.p
de biomasse ne se suit pas cette constatation. Cependant, une courbe de tendance de type
exponentielle a pu être établie : Y (CaCO3 (g/cm3)) = 0.2061 e -0.0338 x avec un coefficient de
dispersion de (R2 = 0.9007). La déduction du taux moyen d’hydrolyse de l’urée à partir de la
teneur en carbonate de calcium conduit à la même tendance. Il n’y a pas significativement de
différence entre le lot ayant reçu 1 V.p de biomasse 84 ± 14 % et 2 V.p 89 ± 11 %. Par contre,
elle semble devenir plus prononcée entre la première section de colonne et les deux suivantes
(Figure n°148.)

1.4 Moyenne1V.p
Moyenne 2 V.p
Vitesse d'hydrolyse urée (mM/min)

1.2
Figure n°148 : Vitesses
1
moyennes d’hydrolyse de
0.8 l’urée en fonction du nombre
R2 = 0.8997
de V.p de biomasse injectés et
0.6 en fonction de la distance.
0.4

0.2

0
0-12 cm 12-24 cm 24-38 cm

Les vitesses d’hydrolyse décroissent en fonction de la distance. Ainsi une courbe de

tendance de type exponentiel a été établie : Y (Vitesse hydrolyse (µM/min) = 1109.8 e -0.0321 x
avec un coefficient de dispersion R2 = 0.8997, équivalent à celui de la distribution de la teneur
en carbonate de calcium en fonction de la distance. Ce gradient est obtenu avec une
suspension de biomasse identique. Il est fort possible que ce gradient de vitesse d’hydrolyse

289
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

de l’urée, coïncide avec un gradient de biomasse. Ceci conduit à suggérer que l’efficacité du
procédé dépend de la biomasse (Figure n°149).

2.50
Moyenne1V.p
Moyenne 2 V.p
2.00
CaCO3/Rc (g/cm /MPa)

Figure n°149 : Rapport

CaCO3/Rc en fonction du
3

1.50
nombre de V.p de biomasse
injectés et en fonction de la
1.00
distance d’injection.
2
R = 0.7499
0.50

0.00
0-12 cm 12-24 cm 24-38 cm

L’ajout d’un second volume de pore de biomasse ne montre pas sur l’efficacité du
procédé de différences significatives pour les deux premières sections (0 - 24 cm). Par contre,
il y a une différence très significative pour le dernier tronçon (24 - 38). L’ajout d’un deuxième
V.p de biomasse réduit l’efficacité du processus, ce qui peut être attribué dans le cadre de
cette expérience aux événements suivants. Le premier concerne la densité plus faible de la
colonne n°3, qui renforce la variation des résultats entre duplicata. Cependant, lorsque l’on
exclut de l’analyse cette colonne, la tendance reste identique. Ceci suggère que le processus
est moins efficace, lorsqu’il y a doublement de la quantité de biomasse injectée, notamment
en bout de colonne.

Par ailleurs lorsqu’un seul V.p de biomasse est injecté, il y a un meilleur maintien des
performances tout au long de la colonne. Dans le cas de la teneur moyenne en carbonate de
calcium, aucune différence significative sur les 3 tronçons n’apparaît entre les deux séries. Par
contre, il y une différence significative de valeurs de Rc entre les derniers tronçons de
colonnes (24 – 36 cm) entre ces deux duplicat. Ceci peut être attribué à deux phénomènes,
plus la quantité de biomasse injectée est élevée, plus l’effet filtrant est intense, tel un tamis
« cellulaire »d’une part et d’autre part, un nombre plus élevé de plus petites cellules se fixent
tout au long des colonnes injectées avec 2 V.p.

Mais, ce doublement de biomasse ne produit pas des résistances significativement

différentes sur les deux premiers tronçons par rapport aux colonnes injectées avec 1 seul V.p.
Ceci est confirmé, également par un coefficient de variation plus faible .La concentration
minimum de cellules par cm3 de sable mis en place est suffisante pour hydrolyse. Ainsi,
l’excès de biomasse semble amoindrir l’hétérogénéité dans ces deux premiers tronçons. Par
contre, lorsque la distance augmente, alors l’effondrement des performances du système est
notable, tient au fait que le substrat est en concentration limitante par rapport à la
concentration bactérienne..

En effet, le nombre de cellules bactériennes est supérieur à celui présent dans les
colonnes injectées avec 1 V.p. Il y a aura donc plus de précipitation, ceci corrobore la

290
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

distribution des valeurs de teneur en carbonate de calcium en fonction de la distance. A cela

s’ajoute également le rôle des cellules comme sites de nucléation de cristaux de carbonate de
calcium. Or, seules les cellules en zones inter granulaires sont susceptibles de produire des
cristaux ayant un fort impact mécanique. Par conséquent, dans la partie de la colonne la plus
éloignée du point d’injection, le substrat est limitant et la présence d’un grand nombre de
petites cellules favorisent un effet de «dilution des cristaux». Ceci diminue la probabilité
d’avoir de bons cristaux aux bons endroits.

En effet, puisque toutes les cellules sont des sites potentiels de nucléation, cela
n’implique pas forcement un emplacement stratégique dans la matrice porale. Par ailleurs,
plus le nombre de sites de nucléation est élevé, plus la probabilité de produire des cristaux de
plus petite taille est élevée pour une même quantité de calcium.

Ces observations confirment les résultats obtenus lors des essais sur l’influence de la
bio calcification. Une biomasse d’activité enzymatique identique, avec un doublement de
celle-ci diminue l’hétérogénéité sur les 30 premiers centimètres. Par contre, elle augmente au-
delà, lorsque la concentration de la solution urée-calcium devient limitante.

Une première estimation du nombre de cellules par gramme de sol mis en place tend à
montrer que le profil de biomasse suit le profil de valeur de Rc. L’ajout d’un second volume
de pore de biomasse réduit la distance entre ces profils notamment dans les premiers
centimètres de colonne (Figure n°150).

Figure n°150 : Profil

du rapport du nombre
1.010E+08 6
de cellules par gramme
9.100E+07
1V.p 5
de sol mis en place en
8.100E+07
2V.p fonction de la distance
Cellules/g de sable

7.100E+07 Profil RC moyen Col 0.4 m 4 associé à l’estimation

6.100E+07 Profil RC moyen Série n°3
RC (M P a)

du profil de résistance
5.100E+07 3
sur colonne de 0.4 m et
4.100E+07
2
sur colonnes en série
3.100E+07
n°3.
2.100E+07
1
1.100E+07
1.000E+06 0
1
5
9
13
17
21
25
29
33
37
41
45
49
53
57

distance (cm)

La zone la plus dense en cellules mises en place par gramme de sol, correspond
également aux zones où les Rc sont le plus élevées, c'est-à-dire au niveau proximal. Les
profils de biomasse et de RC décroisent de manière exponentielle.

La comparaison des profils moyens de résistances maximales à la compression simple

suggère des performances différentes entre les deux systèmes de colonnes. Ceci peut être dû à
l’effet d’inhibition par concentration car le système de trois colonnes en série a été injecté
avec une concentration de 0.5 M en 5 V.p contre une solution concentrée de 0.83 M en 3 V.p,
soit une augmentation de 40 %. Ainsi, l’accroissement de la concentration favorise très
probablement une réduction des performances par inhibition de l’enzyme. De manière
concomitante, pour une activité enzymatique équivalente, les concentrations plus élevées

291
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

favorisent la formation de plus de petits cristaux, car la vitesse de croissance est une fonction
linéaire de la concentration de noyaux de cristaux déjà présents. Ces derniers sont plus
nombreux du fait de la concentration la plus élevée. Par ailleurs, la réduction du nombre de
volume de pore injecté, diminue la probabilité de créer d’autres cristaux de carbonate de
calcium aux bons emplacements car la nucléation catalytique est d’autant plus efficace,
lorsque les structures cristallines servant de catalyseur sont similaires aux cristaux formés.
Ceci contribue également à diminuer la probabilité d’apporter suffisamment de calcium aux
cristaux ayant un fort impact mécanique. Par ailleurs, la qualité de l’injection de la biomasse
dépend également l’activité enzymatique et la D.O cellulaire. La libération du contenu
cellulaire, conduit à accélérer les précipitations du fait de la présence d’une grande quantité
d’enzyme libre dans un même espace temps mais cette enzyme est très facilement lessivable
par les fluides suivants.

En définitive, pour une biomasse donnée, le doublement du volume de biomasse

injectée ne conduit pas à une amélioration des performances du système sur un sable fin
compacté. De plus, dans ce cadre d’étude, l’augmentation des concentrations des solutions
calcifiantes semble réduire les performances de calcification à ces concentrations. Ces
observations corroborent les observations précédentes réalisées sur les essais en petites
colonnes. L’ensemble de ces profils dépendent de l’effet de filtration des sables fins en
colonnes compactées. En effet au dessus d’un certain seuil de nombre de cellules mises en
place par gramme de sol, l’hydrolyse se réalise durant l’injection.

292
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

IX. BILAN DU PROFIL DE BIO CALCIFICATION EN FONCTION DE LA

DISTANCE SUR DU SABLE DE FONTAINEBLEAU.

Le profil de bio consolidation dépend de nombreux paramètres qu’il est difficile de

dissocier car ils sont interconnectés. Il y a systématiquement cinq à six paramètres à prendre
en compte simultanément en fonction du phasage d’injection.

La première observation qui peut être réalisée sur le procédé, c’est la diminution des
résistances maximales à la compression simple en fonction de la distance au point d’injection,
et cela de manière exponentielle. Ce profil est superposable à celui de la biomasse dans un
modèle de colonne de sable compacté. Ceci conduit à une hétérogénéité du procédé sous
forme de gradient. Le rapport longueur de la colonne sur son diamètre (l/d) pour des fortes
résistances à la compression (1 MPa) ne dépasse pas 3.2. Des tendances similaires ont été
observées par Latil et al (2008). En effet, l’auteur souligne aussi le caractère hétérogène du
procédé de bio consolidation avec S. pasteurii qui a été observé avec les gradients de Rc en
fonction de la distance obtenus en colonne de 0.2 m avec du sable d’Itterbeck, lors
d’injections en continu et en mode semi continu. Ce gradient a été mis en évidence par des
observations directes et à l’aide d’un tomographe. D’autres auteurs, tels que Whiffin et
al.,(2007) et Marien et al.,(2008) ont observé des tendances similaires. Ainsi, Marien et al.,
(2008) ont testé différentes méthodes de fixation de S. pasteurii en colonne avec du sable
Itterbeck, suivies d’un nombre variable de V.p de solutions calcifiantes injectées à la vitesse
de chantier. L’auteur note une forte hétérogénéité des Rc en fonction du nombre de V.p
injectés 1.28 ± 0.18 MPa pour 5 Vp et 0.29 ± 0.052 MPa pour 2 V.p avec une biomasse
identique. Cette variation est associée, selon les auteurs, à une distribution inégale des
bactéries au sein des colonnes de sable. Des constatations identiques avaient été relatées par
Whiffin et al., (2007), dans une colonne de 5 m. L’auteur a observé un gradient décroissant de
la teneur en carbonate de calcium de 80 à 115 mg/cm3 à 1 mètre du point d’injection, pour
atteindre des valeurs proches de zéro mg/cm3 à 5 mètres de distance.

L’ensemble de ces données suggèrent que l’effet de filtration est dominant dans ces
modèles construits en sable fin. Les premiers calculs permettant d’évaluer l’effet de filtration
ou d’injectabilité d’une suspension de biomasse dans un milieu poreux, concordent à dire que
l’injectabilité de S .pasteurii est possible. Néanmoins la réalité des observations montrent que
la pénétrabilité est très limitée. Or le problème réside principalement dans deux sous-
estimations. La première concerne les formules de détermination de la pénétrabilité qui sont
toutes établies pour des particules sphériques. La seconde est une sous-estimation qui
concerne le diamètre de S. pasteurii. En effet, pour simplifier les calculs de pénétrabilité dans
un sol poreux, le diamètre moyen de cette bactérie, qui a une forme de bâtonnet, a été assimilé
à celui d’une sphère. Par conséquent, il est nécessaire d’obtenir des données granulométriques
plus réalistes pour la suspension de biomasse. En premier lieu, une suspension de biomasse
est caractérisée non pas par un diamètre moyen mais plus judicieusement par une distribution
de diamètre, ceci en prenant en compte à la fois les diamètres et les longueurs du bacille, sur
toute une population. La qualité de la pénétrabilité est interdépendante de la proportion de
longs bacilles au sein de cette biomasse, qui peut favoriser un effet de colmatage. Ainsi, 4
granulométries par suspension biomasse standard de S. pasteurii ont été réalisées avec (U) et
sans ultrason (SU) à l’aide d’un granulomètre laser Mastersizer 2000 version 5.40 de Malvern
Instruments (Tableau n°129).

293
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Tableau n°129 : Distribution granulométrique de deux suspensions de biomasse de S. pasteurii

souche CIP 66.21.

Paramètres d 10 d 50 d 60 d 90
Valeurs moyennes (µm)
0.46 0.83 0.98 1.75
(sans Ultrason)
Valeurs moyennes (µm)
0.52 1.12 1.5 2.74
(avec Ultrasons)
Valeurs moyennes (µm) 0.49 0.97 1.23 2.25

Cette distribution prend en compte à la fois le diamètre et la longueur de la bactérie.

Les ultrasons appliqués pendant une courte période séparent les cellules bactériennes qui
pourraient être associées en chainette ou en chaine. Par ailleurs des observations au MEB ont
montré que certaines cellules peuvent atteindre près de 4 fois le d90 (Figure n°151). C’est
notamment le cas lorsque les cellules sont en cours de division cellulaire (photo n°568).

Figure n°151 : Trois images de S. pasteurii, de longueur approximative de 3.7 µm,

3.5 µm et de 9 µm (Images MEB : [Link] et G. Levrel).

Lorsque les valeurs granulométriques moyennes obtenues sans ultrason sont utilisées
pour déterminer la pénétrabilité de cette biomasse en milieu poreux selon formule de
Bradford et al (2002), un effet filtrant apparaît lorsque la valeur du rapport (dbactérie/d50grain)
est ≥ 5 . 10-3 (Tableau n°130).

Tableau n°130 : Identification de l’effet filtrant du sable fin sur une population de S.
pasteurii.

Sable Sable
Rapport Sable Sable
Fontainebleau Fontainebleau
dbactérie/d50grain Correcteur Itterbeck
brut NE 34
d10 1.9 . 10-3 2.4 . 10-3 3.1 . 10-3 1.2 . 10-3
d50 3.8 . 10-3 4.7 . 10-3 6.0 . 10-3 2.4 . 10-3
d60 4.9 . 10-3 5.9 . 10-3 7.6 . 10-3 3.0 . 10-3
d90 8.9 . 10-3 10 . 10-3 14 . 10-3 5.6 . 10-3

Tous les sables ont un rôle de filtration mécanique pour la faction d90 de la biomasse.
L’effet de filtration apparaît pour tous les sables sauf pour le sable de Fontainebleau Brut
jusqu’au d60. Le sable Correcteur a même un potentiel filtrant jusqu’au d50 des bactéries. Ces
données corroborent les observations réalisées sur les colonnes en sable fin et compacté. La
sous-population filtrée mécaniquement se retrouvera préférentiellement dans la section
supérieure de la colonne. Par ailleurs, un effet cumulatif est à prévoir vis-à-vis des diamètres
plus petits. L’effet de filtration peut s’accentuer au fur et à mesure de l’injection du V.p de
biomasse, car le tapissage par les bactéries de grandes surfaces au niveau du point d’injection

294
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

et l’obstruction de nombreuses microporosités changent les répulsions. Des observations

similaires ont également été reportées par Whiffing (2005) (communication personnelle).
L’auteur a remarqué des dimensions élevées de S. pasteurii (souche DSMZ 33) à l’aide d’un
granulomètre laser Malvern Instruments Materserzer (Tableau n°131). Cette souche est
légèrement différente (DMSZ 33), de celle issue de la banque de l’Institut Pasteur (CIP
66.21), et de plus, la composition du milieu et les conditions de culture qui sont différentes,
peuvent influencer grandement la morphologie.

Distribution de
Tableau n°131 : Distribution d’une taille de la d 10 d 50 d 85 d 90
suspension, bactérienne de S. pasteurii, bactérie
souche DSMZ 33. (µm) 0.9 1.8 7 8.1

L’auteur suggère que ce profil serait dû à l’aggrégation des cellules de la biomasse car
les mesures de granulométrie ont été réalisées sans ultra sons. Par conséquent, de nouveaux
essais de mesures de biomasse ont été réalisés sur d’autres suspensions de biomasse contenant
la souche DSMZ 33, produites avec un milieu de composition trois fois plus riche que celui
employé pour la production de S. pasteurii souche CIP 66.21 (SBF CHI VIT). En effet, il
contient près de 3 fois plus d’extrait de levure. La granulométrie a été déterminée avec et sans
ultrason (30 secondes à 1 min) pour disloquer les agrégats (Tableau n°132).

Paramètres d 10 d 50 d 60 d 90
Valeurs moyennes
Tableau n°132 : Caractéristiques (µm) 0.77 2.79 5 20
granulométriques d’une suspension de (sans Ultrason)
biomasse mono spécifique DSMZ 33. Valeurs moyennes
(µm) 0.77 2.79 4 20
(avec Ultrasons)

Les résultats quasi identiques obtenus avec et sans ultrasons suggèrent que les
bactéries S. pasteurii souche DSMZ 33 ne se s’agrègent pas, sont bien en phase stationnaire et
s’y maintiennent. Ceci corrobore les données de Jasong et al (2006). Les dimensions de cette
souche présente un d50 équivalent au d90 de la suspension de biomasse de la souche CIP 66.21.
Autrement dit, la souche DSMZ 33 présente un potentiel à la filtration mécanique, bien
supérieur puisque le d30 correspond au d50 de la CIP 66.21. Ainsi, près de 70 % de la
population de la souche DSMZ 33 est susceptible d’être filtrée mécaniquement.

D’autre part, des phénomènes d’agrégation apparaissent, lorsque la souche CIP 66.21
est stockée pendant une longue période à 4° C. Ces agrégats sont alors visibles lorsque la
granulométrie n’est pas faite en présence des ultrasons (Figure n°152). Ceux ci permettent de
dissocier ces agrégats et d’obtenir une courbe de distribution de taille de type gaussien.

295
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Figure n°152 : Distribution de la taille de S. pasteurii (CIP 66.21)

sans ultra son (à gauche) et avec ultrason (à droite).

Lorsque ce même protocole d’ultrason est réalisé avec la souche de DSMZ 33, les
courbes granulométriques sont superposables avec et sans ultrasons (Figure n°153).

Figure n°153 : Granulométrie

de la souche de S. pasteurii
(DMSZ 33) courbe en rouge
sans ultrason et courbe en vert
avec ultrasons.

Les ultrasons ont un impact très limité sur la distribution granulométrique de cette
souche. Ceci signifie qu’il peut exister une forte variabilité de taille de près d’un facteur 7 ou
plus au sein d’une culture mono spécifique. Une telle hétérogénéité morphologique, dans une
culture mono spécifique peut résulter des conditions de culture et/ou de la nature de
l’inoculum (forme liquide ou support gélosé). Elle peut survenir lorsque la croissance
bactérienne a été limitée, notamment par une certaine toxicité du milieu (déchets du
métabolisme par exemple) ce qui induit un grandissement de la cellule sans qu’elle se divise.
Par ailleurs, la courbe de la souche DMSZ 33 ne présence pas un profil de distribution de
taille en forme de cloche mais en double cloche (Figure n°154).

Figure n°154 : Distribution de la taille de S. pasteurii souche DMSZ 33.

296
Chapitre VII Effet de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Les observations au microscope optique (Figure n°155), ainsi que les deux courbes
granulométriques superposées (Figure n°156) montrent les différences entre ces deux
souches.

Figure n°155 :
Observations au
microscope
photonique
grossissement x80 (à
gauche : S. pasteurii
souche CIP 66.21, à
6µm 6µm droite : S. pasteurii
souche DSM 33).

Figure n°156 : Comparaison des

courbes granulométriques de S.
pasteurii CIP 66.21 (rouge) et
DMS 33 (vert).

Les coefficients caractéristiques d’une granulométrie confirment un Cu = 3.9 et un Ce

de 26, pour DSMZ 33 avec une distribution étalée et hétérogène. Par contre, S. pasteurii CIP
66.21 possède en moyenne un Cu = 2.4 et un Ce = 4.5. L’injectabilité de la biomasse doit
prendre en compte ces coefficients ainsi que ceux du sable fin dans un sol.

La très forte hétérogénéité dans la taille de la souche utilisée peut provenir des
différentes étapes de préparation de la suspension, telles que le type de l’inoculum (liquide ou
solide), la composition du milieu, l’utilisation d’additifs et les conditions de cultures et de
stockage, mais ceci ne prend pas en compte le patrimoine génétique de ces deux souches
similaires mais non identiques.

En conclusion, l’injection d’une suspension bactérienne doit faire l’objet d’une

caractérisation granulométrique de la biomasse et du sol. L’impact de la filtration est donc le
premier facteur limitant de l’injection de la biomasse en colonne de sable fin compacté. Cet
effet filtrant correspond donc à la combinaison de facteurs physiques tels que la taille des
grains de sable, leur rugosité de surface, la vitesse d’injection et les courants préférentiels et
les propriétés de surface, les charges, le pH et la force ionique de la solution.

L’approche la plus simple pour caractériser le rayon de consolidation est la

détermination de la granulométrie du sol, notamment la fraction efficace d10 et le d50. Pour la
suspension de biomasse, c’est la détermination d90 qui sera déterminante car, ce sont les plus
grosses bactéries qui colmateront les pores. Or dans ce procédé, ce n’est pas l’obturation qui
est recherchée mais la consolidation autour des grains de sable. Ce procédé ne repose pas

297
Chapitre VII. Etude de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

uniquement, sur la quantité d’enzyme présente dans la cellule avant l’injection mais aussi
également sur leur capacité métabolique à maintenir leur intégrité. Ainsi les performances
d’hydrolyse du pool enzymatique cellulaire dépendent donc de la qualité de la biomasse
injectée et donc de son âge. En effet, il a été noté que des fuites enzymatiques apparaissent
lorsque les suspensions bactériennes rentrent en phase stationnaire. Ce point est fondamental
pour la maîtrise des phénomènes de précipité et de relargage qui rendent instables les
effluents du procédé.

298
Chapitre VII. Etude de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

X. CONCLUSIONS.

La bio calcification en colonne de sable fin dépend de nombreux paramètres physico-

chimiques et biologiques. Ces paramètres ou facteurs peuvent être organisés de manière
dichotomique selon l’ordre chronologique des étapes du procédé. Ainsi, les paramètres
déterminants durant la 1ère injection (suspension de biomasse), sont les paramètres primaires,
ceux de la deuxième injection, les secondaires. Chacun de ces niveaux est divisé de manière
également dichotomique, en paramètres biotique et abiotique. Les facteurs abiotiques sont, le
mode de compaction, la granulométrie du sable, la solution calcifiante. Les facteurs biotiques
concernent la D.O. cellulaire, l’activité enzymatique et l’état physiologique. Ces paramètres
identifiés sont les principaux responsables du profil de bio calcification en colonne et de son
évolution (Figure n°157).

Paramètres
primaires
Figure n°157 : Paramètres
Paramètres Paramètres
abiotiques biotiques primaires impliqués dans la
formation du gradient de
D.O cell
résistance maximale en colonne
Mode de
compactage de sable fin compacté lors de
l’injection du 1er V.p
Granulométrie du
(suspension de biomasse).
sable

Paramètres
secondaires

Paramètres Paramètres
abiotiques biotiques Figure n°158 : Paramètres
principaux secondaires
D.O cell impliqués dans la formation du
La soution
calcifiante gradient de résistance
A.E
maximale en colonne de sable
fin compact.
Age(qualité)

L’interaction de ces paramètres détermine le profil de distribution de la biomasse et

celui du sable consolidé. Cependant, il se peut que ce profil puisse être redéfini lors de
l’injection du 1er V.p de solution calcifiante. En effet, le dépôt de biomasse en colonne de
sable fin compacté, est lié à la qualité de la biomasse. Si cette dernière est de moins bonne
qualité alors un nouveau profil de dépôt de biomasse aura lieu. Cette redistribution intervient
lors de la deuxième injection et concerne donc les paramètres secondaires (Figure n°158).

Une biomasse peut être définie par 3 paramètres : la densité optique à laquelle on peut
faire correspondre une concentration (cellule/ml), son activité enzymatique intracellulaire et
son état physiologique. L’état physiologique correspond à la phase de développement dans la
quelle l’arrêt de la culture s’est produit. L’ensemble de ces trois paramètres biologiques
interagissent pour établir un nouveau gradient de bio calcification, lorsque la solution
calcifiante est injectée. Ainsi, une biomasse dont la culture a été arrêtée durant le début de la
phase de ralentissement engendre une biomasse de qualité car la suspension contient peu de

299
Chapitre VII. Etude de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

déchets du métabolisme et les cellules possèdent des niveaux élevés de réserve énergétique
ainsi qu’une bonne intégrité membranaire. Par contre, lorsque l’arrêt de la culture se produit
plus tardivement durant cette phase ou au début de la phase stationnaire, la suspension
s’appauvrit et devient moins bénéfique. Par conséquent, les bactéries, plus âgées, sont plus
affaiblies libéreront plus facilement leur contenu cytoplasmique, par lyse cellulaire. Il y aura
une plus grande proportion d’enzymes dont l’uréase, dans ces suspensions de biomasse
(Figure n°159).

Paramètres
secondaires

Paramètres
biotiques

Suspension -
Age (Jeune) Age (ancienne)
Age (qualité)

Figure n°159 : Impact du

D.O A.E intracelulaire A.E extracellulaire D.O cellulaire
vieillissement de la biomasse
Les cellules
sur le procédé de bio
résistent mieux
aux conditions du Lyse cellulaire calcification.
procédé

Forte perdition de l’A.E sous forme de

relargage et de destruction de l’uréase.

La bio calcification avec

de faibles niveaux de
déperdition de l’A.E
Perte du potentiel enzymatique
Bio calcification non contrôlable

Ces différentes situations conduisent à l’obtention de nombreux profils de bio

cimentation en colonne de sable fin compacté (Tableau n°133). Les profils de consolidation
du sable fin compacté en colonne vont être également influencés dans la concentration de la
solution calcifiante (0.5 M à 0.83 M). En effet, des flocs se formeront plus facilement avec
une suspension bactérienne ayant une activité enzymatique élevée, en présence de fortes
concentrations de solution calcifiante.

Tableau n°133 : Récapitulatif des impacts de la qualité de la biomasse sur le profil de

cimentation du sable fin sur colonne compactée.

Caractéristiques de la biomasse Profil de bio calcification

Activité enzymatique (µS/cm/min)
Rapport : Profil de Rc Profil
D.O Profil de Rc
AE A.E A.E exponentiel sur
cellulaire polynomial
intracellulaire extracellulaire totale décroissant colonne
/A.E totale
<1000 Faible <1mS
oui
<1/10<100 non
1 - 2.5
Fort 1/10 à
non
1/2 oui

300
Chapitre VII. Etude de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Fort 1/10 à
non oui
1/2
>2.5
Faible
oui
<1/10<100 non

Faible
1-2.5
<1/10<200
oui non
Faible
>2.5
<1/10<200
>1000 >1mS
Fort 1/10 à
1-2.5
1/2
non oui
Fort 1/10 à
>2.5
1/2

Les 3 facteurs principaux influant la formation de flocs sont : le pH légèrement

basique (8.5 à 9.5) de la suspension de biomasse, l’A.E et la D.O cellulaire. Les premiers
produits formés sont des carbonates de calcium. En effet, la suspension contient de nombreux
ions carbonates issus de l’hydrolyse de l’urée présente dans la composition du milieu de
culture mais aussi dûs à la respiration microbienne. Ce phénomène sera ensuite fortement
amplifié par l’hydrolyse de l’urée présente dans la solution calcifiante et son intensité
dépendra à la fois du niveau d’activité enzymatique de la suspension et de sa qualité. La
viscosité du floc augmente à cause de la présence de bactéries et de la formation permanente
de carbonate de calcium hydraté et vraisemblablement amorphe. Cette matrice
organominérale favorise la nucléation et la croissance cristalline du carbonate de calcium. Ces
effets sont cumulatifs et se produisent tout au long de la colonne. Cependant, leur intensité est
plus élevée au niveau proximale des colonnes en raison du gradient de dépôt de biomasse. Ces
effets s’additionnent et sont les sources d’hétérogénéité de la bio calcification (Figure n°160).

Impact à l’échelle microscopique Impact à l’échelle macroscopique

Ecoulements préférentiels,
avancement en doigt de
Images MEB de [Link] et [Link]

gants

Formation de Figure n°160 :

nodules de sable
consolidés
Principales
conséquences de
Profils
l’apparition de
de RC flocs sur le
hachés
processus de bio
Le fractionnement du floc produit des calcification.
dépots aléatoires de carbonate de
calcium sur les grains de sable Lessivage

301
Chapitre VII. Etude de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

La formation de ce floc au contact entre la suspension de biomasse et la solution

calcifiante provoque par lessivage une redistribution des bactéries dans la colonne. A ce
phénomène, s’ajoute la redistribution de la teneur en carbonate de calcium. Le piégeage local
du floc favorise les écoulements préférentiels en doigts de gants. Par ailleurs, le
fractionnement du floc qui s’opère au fur et à mesure de son avancée au sein de la colonne
conduit à la formation de micro dépôts à la surface des grains de sable et de dépôts de plus
grandes tailles. Ces derniers entraineront la formation de nodules, c'est-à-dire des zones de
sable plus consolidés que leur environnement immédiat. Ces nodules peuvent se retrouver
dans des zones de sable totalement lâches (zone distale) ou bien dans une matrice légèrement
consolidée.
Dans ce cas, ces nodules apparaissent dans un enchevêtrement de blocs de sable que
constitue l’échantillon de sable consolidé. Ils influent, lors de la compression simple en
donnant des profils hachés aux courbes d’effort/déplacement et correspondent aux
microruptures mécaniques. Ces nodules de sable consolidés ont des dimensions
centimétriques.
Ce phénomène est indissociable du procédé de bio calcification tel qu’il est employé
aujourd’hui. Les profils de consolidation de type exponentiel décroissant suivent ceux des
estimations du taux de fixation de la biomasse. Ces profils sont le résultat d’un effet de
filtration de sable fin (80 µm à 350 µm), à la fois par le jeu d’interactions physico-chimiques
mais également de filtration mécanique. Ainsi, les coefficients granulométriques (Cu, Ce) de
ces sables permettent d’estimer la qualité du réseau poral. Cependant, ceci n’est pas suffisant
car cela ne prend pas en compte le niveau de compactage du sable.
En effet, la qualité de l’inter connectivité des pores est influencée par la distribution de
la micro porosité et de la méso porosité ainsi que par la présence de pores fermés. La qualité
du réseau peut être déduite par des mesures du coefficient de perméabilité (K). Ce coefficient
K pour les colonnes compactées en sable est faible (K ≈ 10-5 m/s). Ceci est en faveur d’un
effet de filtration mécanique. Par ailleurs, ces effets de filtration physique peuvent être plus
prononcés pour une portion de la population de bactéries.
En effet, selon, Bradford et al., (2002), ces effets, se font ressentir pour le sable fin à
partir de 1.2 à 1.5 µm. La distribution de S. pasteurii (CIP 66.21) varie en moyenne de 0.49 à
2.25 µm de diamètre, avec un d60 de 1.23 µm. L’effet de filtration par capture s’additionne à
l’effet de filtration physico-chimique. De plus, certaines suspensions ont présenté des valeurs
d90 allant jusqu'à 20 µm. Ceci conforte, l’effet potentiel de filtration mécanique, et suggère
une forte hétérogénéité de taille dans une suspension mono-spécifique de S. pasteurii. Ainsi,
un nouveau critère d’injectabilité, en sable fin compacté avec S. pasteurii peut être défini
(Figure n°161).

302
Chapitre VII. Etude de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Paramètres
primaires

Paramètres Paramètres
abiotiques biotiques

Granulométrie D.O cellulaire

du sable

Granulométrie
Importance de la biomasse
du d50

Importance du d 90
Estimation de l’injectabilité
d90 bactérie/d 50 sable

NON OUI Biomasse difficilement

Biomasse Injectable
>5.10 -3 injectable

Figure n°161 : Critères d’injectabilité de S. pasteurii en colonne de sable fin compacté.

Lorsque ces critères d’injection sont favorables à l’injection, il faut les associer au
mode de compactage et à la concentration de la solution calcifiante pour mieux apprécier les
performances du système (Figure n°162).

Paramètres
Paramètre abiotiques
Biotique

Granulométrie du
sable fin
La solution
calcifiante [U/A]-
Mode de 0.5 à 0.83 M de
compaction 5 à 3 V.p

Biomasse 1 V.p
(D.O cellulaire 2.5, A.E T&P P&V
intra extracellulaire
< 1mS/cm/min)

Performance de la bio consolidation :

Zone consolidée => Longueur/diamètre = L/Ø ≈ 10 max

Limite de la zone de consolidation -

non consolidation => limite du
Nombre de cellules/g de sol = 106 à 107

Figure n°162 : Interactions des différents paramètres dans le processus de bio calcification.

Cette vue d’ensemble permet de définir une première étape pour la détermination de
l’injectabilité d’une suspension. En effet, une multitude de paramètres peuvent être pris en
compte ainsi que leurs interactions. Il est cependant possible d’organiser et de prévoir de
manière dichotomique les conditions les meilleures et les moins favorables. Ainsi, un premier

303
Chapitre VII. Etude de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

tableau d’appréciation de l’injectabilité de la biomasse peut être établi (Figure n°163) et être
associé à celui de l’évaluation de l’injectabilité d’un sol (Figure n°164).

Activité enzymatqiue D.O.. cellulaire Granulometrie bacterienne

1mS/min< A.E 2. 5<[Link] >2.5 1µm<d90>

>1mS /min 1µm

+ - + - + -

-
+

+
-

Figure n°163 : Evaluation de l’injectabilité d’une suspension de biomasse.

Granulométrie Perméabilité Composition

chimique

d50 10-4 Silice

2<Cu>2 <K(m/s)> argile
10-6

+ - + - -
+

+ -

+ -

Figure n°164 : Evaluation de l’injectabilité d’un sol.

304
Chapitre VII. Etude de la quantité de biomasse sur le profil de calcification.

Evaluation de l’injectabilité d’une suspension de biomasse Evaluation de l’injectabilité d’un sol

A.E D.O. cellulaire Granulometrie

Granulométrie Perméabilité Composition
bactérienne
chimique

1 mS/min 2.5 < D.O 1.6 µm

< A.E cellulaire < d90 D10
10-4 Silice
>1 mS > 2.5 >1.6µm >0.19
<K(m/S)>
/min mm +
10-6 argile
2<Cu>2

+ - + - + -
+ - + - + -

-
+ + -

+ -
- +

+ -

Figure n°165 : Arbre de décision pour l’exécution d’un procédé d’injection de bio
calcification en sable fin.

Le procédé de bio calcification nécessite de prendre en compte de nombreux

paramètres dans le cas des injections sur colonne de sable fin. Ceux de la Figure n°165 sont
les facteurs prépondérants responsables du profil de bio calcification et de son hétérogénéité.
Les voies en noir sont celles qui représentent les conditions idéales requises pour une
performance optimisée et un meilleur contrôle du procédé. Les voies en rouge, sont celles les
plus éloignées en vue d’une application optimum du procédé. Cet arbre de décision est un
arbre général pour une configuration générale de chantier d’injection. La combinaison de ces
principaux paramètres peut néanmoins conduire à l’apparition de phénomènes complexes
difficiles à prédire. Ceci est d’autant plus valable que de nombreux autres paramètres
devraient être testés.

Pour se rapprocher des conditions de chantier, il est nécessaire de tester toutes les
gammes de vitesse réelles d’injection ainsi que l’effet de la température en subsurface (12°
C). En effet, cela aura un impact direct sur l’activité enzymatique et sur les gammes de
concentrations de solutions calcifiantes utilisées et par conséquent sur les durées de batch. De
plus, la durée d’immobilisation en surface ou en profondeur de la biomasse, et la durée de
contact de celle-ci avec les grains avant l’injection de la solution calcifiante sont des
paramètres supplémentaires. Par ailleurs, des expériences en colonne, effectuées à partir de
carottages de terrain issuq de zones potentiellement liquéfiables compléteraient le tableau de
faisabilité du procédé. De plus, le modèle en colonne, limite les interprétations, du fait d’un
écoulement orienté et focalisé par le faible diamètre. Ainsi, les contraintes spatiales de la

305
 Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

colonne, accentuent les défauts d’écoulements. Une propagation des écoulements sans
contrainte spatiale donnerait très probablement une autre image du profil de bio calcification
(Tableau n°134)

Tableau n°134 : Récapitulatif des paramètres à évaluer avant des essais grandeur nature de
bio calcification.
Vitesse Effet de Nature
Paramètres Histoire Etude des
Pression Densité réelle la du
à tester du sous sol grains de sable
d’injection température terrain
Matière Nature
Effet du
Présence organique, chimique,
claquage sur 1.5 à 0.2 à 0.6
Gammes 12° C d’argile, pollution Morphologie
l’intégrité 1.74 m/H
sels ; pH minérale des grains de
membranaire
organique sable

Les recherches pourront s’élargir aux sols liquéfiables. En effet, le domaine des
injections en sols liquéfiables ne se limite pas aux trois sables testés dans cette étude. D’après
Sitharam et al., (2004), la gamme granulométrique des sols susceptibles d’être liquéfiables,
est plus étendue (Figure n°166).

Sable de
Sable Fontainebleau
correcteur

Limite de la
plupart des
sols
liquéfiables

Limite de la
potentialité
liquéfiable des
sols

Figure n°166 : L’encadrement en grisé correspond à la gamme de diamètres

des grains de sable testés dans cette étude.

La courbe granulométrique en orange correspond à celle du sable de Fontainebleau NE

34, en vert à celle du sable correcteur. Ces deux sables ont des profils de sables liquéfiables.
L’étude de la consolidation des sols liquéfiables devrait s’orienter vers un travail sur de plus
grands diamètres de grains, car au dessous de la limite établie par le sable Correcteur, les
injections de suspension de biomasse deviennent très limitées.

306
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

CHAPITRE VIII
SUIVI CHIMIQUE DES EFFLUENTS DU PROCEDE
DE BIO CALCIFICATION.

I. LE CONTEXTE ENVIRONNEMENTAL DANS LEQUEL S’INSCRIT

LE PROCEDE DE BIO CALCIFICATION. 308

II. LE SUIVI DE LA COMPOSITION DES EFFLUENTS. 308

1. Le protocole expérimental. 308

2. Les analyses réalisées. 309
3. Le phasage des injections et le traitement en fin d’expérience. 310
4. Le protocole de prélèvement et de conditionnement des échantillons. 311
5. Les résultats du suivi des effluents. 313
6. Interprétations des résultats et comparaison avec les deux essais précédents. 317
6.1. Le suivi des effluents de la suspension de biomasse. 318
6.1.1. Les teneurs en chlorures dans l’effluent de la suspension de
biomasse. 319
6.1.2. Le phosphore total dans l’effluent de la suspension de
biomasse. 319
6.1.3. Le carbone organique total dans l’effluent de la suspension de
biomasse. 319
6.1.4. Le Ca2+ dans l’effluent de la suspension de biomasse. 319
6.1.5. Le Mg2+ dans l’effluent de la suspension de biomasse. 320
6.1.6. Le TAC dans l’effluent de la suspension de biomasse. 320
6.1.7. Le N-NH4+ dans l’effluent de la suspension de biomasse. 320
6.1.8. Le NO3- dans l’effluent de la suspension de biomasse. 320
6.1.9. La conductivité dans l’effluent de la suspension de biomasse. 321
6.1.10. L’activité enzymatique dans l’effluent de la suspension de biomasse. 321
6.1.11 Conclusion. 321
6.2. Le suivi des effluents de la solution calcifiante. 322
6.2.1. Le carbone organique total dans les effluents de la solution calcifiante. 322
6.2.2. Le NO3- dans les effluents de la solution calcifiante. 322
6.2.3. Le N-NH4+ dans les effluents de la solution calcifiante. 323
6.2.4. Le Ca2+ dans les effluents de la solution calcifiante. 323
6.2.5. Le TAC dans les effluents de la solution calcifiante. 324
6.2.6. La conductivité dans les effluents de la solution calcifiante. 324
6.2.7. L’activité enzymatique dans les effluents de la solution calcifiante. 324
6.2.8. Les effectifs bactériens dans les effluents de la solution calcifiante. 325
6.2.9. Les teneurs en carbonate de calcium dans les effluents de
la solution calcifiante. 325

III. LES CONSEQUENCES POUR LES APPLICATIONS EN CHANTIER. 328

307
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

I. LE CONTEXTE ENVIRONNEMENTAL DANS LEQUEL S’INSCRIT LE

PROCEDE DE BIO CALCIFICATION.

L’originalité du procédé de bio calcification réside dans le traitement de ses effluents.

La complexité chimique des effluents déterminera la technologie et le dimensionnement des
unités de traitement. Il faut pour cela caractériser plus précisément leur composition chimique
et leur concentration tout au long des différentes étapes du procédé à l’aide d’un protocole
adapté.

II. LE SUIVI DE LA COMPOSITION DES EFFLUENTS.

1. Le protocole expérimental.

Pour mieux identifier les phénomènes de bio calcification tel que le gradient de
calcification ou de résistance, une colonne de 0.4 m a été construite avec du sable correcteur
(Tableau n°135). Elle va permettre de faire un suivi de ses effluents.

Caractéristiques des colonnes Colonne n°1

Age (h) 46
D.O.. cellulaire 2.48
Biomasse A.E totale 0.992
A.E intracellulaire
0.678
(mS/min/ml)
Type Pluviation et vibration
Méthode de Sable de
Nature du sable Tableau n°135 :
compactage Fontainebleau Correcteur
Densité du sable fin 1.65 Caractéristiques de la
Porosité apparente 0.41 colonne n°1.
Durée du batch de la biomasse 3 heures
0.75 M Ca(NO3)2/0.75 M
[U/Ca(NO3)2]
Solution Urée
calcifiante 2g/l de chicorée +
Additifs
2.3 g/l de Ca(NO3)2
Séquence Nombre de V.p 3
d’injection de Mode d’injection Semi continu
la solution Durée des batchs de la
calcifiante 8
solution calcifiante (h)
Vitesse réelle d’injection (m/h) 0.2

Le protocole opératoire de prélèvement, d’analyse et de conditionnement des

échantillons a été encadré par la Société IANESCO-CHIMIE. En effet, les effluents issus de
la bio calcification sont particulièrement instables, en raison de la présence simultanée de
bactéries, d’enzyme libre et de réactifs (urée, nitrate de calcium ou chlorure de calcium).
L’intérêt de ces analyses chimiques, est aussi de rendre compte du processus chimique
complet lors de la bio calcification. Elles permettent de plus, de valider ou d’invalider des
tendances observées au cours d’analyses chimiques antérieures (campagnes de décembre
2006 et de mai 2007). Enfin, elles apporteront les informations nécessaires pour déterminer
le choix technologique du traitement et son dimensionnement.

308
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

2. Les analyses réalisées.

Pour une étude complète du procédé, des analyses chimiques et biologiques ont été
réalisées au cours d’une expérience. Les paramètres chimiques pour chaque effluent sont : le
carbone organique total (COT), l’azote ammoniacal (NH4+), les nitrates (NO3-), le calcium,
l’azote total Kjeldhal (NTK), le phosphore, le magnésium, les chlorures et le titre
alcalimétrique (TAC). Le TAC est déterminé sur place car il évolue rapidement. Les
contrôles microbiologiques comprennent le suivi de la D.O. cellulaire, l’activité enzymatique
totale (A.E. totale) et l’activité enzymatique du surnageant (A.E. sur) ainsi que les effectifs
bactériens après culture sur milieu gélosé. Des mesures et des analyses physico-chimiques
telles que la conductivité, la température, le NH4+ et le pH, ont été également réalisées au
laboratoire. Des essais de résistance uni-axiale à la compression simple ont aussi été
effectués. Ces échantillons ont ensuite été envoyés pour la détermination de la teneur en
carbonate de calcium à un laboratoire extérieur. Le milieu de production de biomasse utilisé
pour ces expériences est appelé SBF CHI VIT. La mesure de l’activité enzymatique (A.E.) et
celle de la Densité Optique (D.O..) cellulaire des suspensions bactériennes sont réalisées
avant leurs injections.
Le protocole d’échantillonnage élaboré permet de partager le volume de pore de la
colonne en trois (Figure n°167).

Figure n°167 : Modèle de colonne avec la sortie des effluents à la même hauteur que
l’entrée des fluides pour maintenir la colonne totalement hydratée au cours des différentes
injections.

La colonne est ainsi notée dans le sens de la sortie des effluents. Ainsi, la section A
est située au niveau des 13 derniers cm, B au centre de la colonne et en C au point
d’injection.

3. Le phasage des injections et le traitement en fin d’expérience.

Les injections ont été réalisées dans les conditions de chantier. La phasage d’injection
comporte une injection de suspension de biomasse suivi d’un batch de 3 heures puis trois
injections de solution calcifiante espacées chacune de 8 heures de batch. Enfin, deux volumes
de pore d’eau de réseau ont été injectés pour nettoyer la zone consolidée.

309
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

4. Le protocole de prélèvement et de conditionnement des échantillons.

Les effluents sont récupérés pendant 2 h dans des flacons de 250 ml, placés dans un
bac d’eau réfrigérée à une température de 4° C. Ceci est destiné à inactiver les bactéries. Les
prélèvements et les analyses sont réalisés toutes les 40 minutes. Le débit est vérifié
régulièrement et le volume récupéré (180 ml/échantillon soit 1/3 de V.p) est réparti en 3
flacons (A, B, C) ce qui correspond aux trois zones de la colonne (Figure n°167).

Tableau n°136 : Récapitulatif des notations des volumes collectés en fonction

de leur disposition dans la colonne.

Volumes de porosité Description Notations

V.p 0 Volume de porosité contenu dans la
MELANGE
colonne en début d’expérience
C (haut)
V.p 1 1er volume de porosité de suspension de
B (centre)
EFFLUENT n°1 biomasse
A (bas)
C (haut)
V.p 2 1er volume de porosité de solution
B (centre)
EFFLUENT n°2 calcifiante
A (bas)
C (haut)
V.p 3 2ème volume de porosité de solution
B (centre)
EFFLUENT n°3 calcifiante
A (bas)
V.p 4 3ème volume de porosité de solution
MELANGE
EFFLUENT n°4 calcifiante
C (haut)
V.p 5
1er volume d’eau de lavage (eau du réseau)
B (centre)
EFFLUENT n°5
A (bas)
ème C (haut)
V.p 6 2 volume d’eau de lavage (eau du
B (centre)
EFFLUENT n°6 réseau)
A (bas)

Chaque flacon est homogénéisé avant d’être prélevé pour chaque analyse. Dans le cas
des mesures de TAC et de NO3- les échantillons sont filtrés sur une membrane à 0.45 µm de
porosité pour enlever les bactéries, puis stockés à 4° C. Pour d’autres analyses telles que le
COT, les ions calcium et magnésium, le NTK, le N-NH4 ou le phosphore, les échantillons ont
été stabilisés par acidification selon les normes en vigueur. L’étiquetage de l’ensemble des
échantillons suit le découpage du volume de pore (Tableau n°136).

Sur les 4 jours, 7 volumes d’effluents ont été ainsi récupérés. Le contenu de ces
prélèvements est décrit ci-après.

V.p 0 : Volume contenu dans la colonne avant la première injection (eau réseau ), Ce
volume est récupéré pendant l’injection de la suspension de biomasse. Il n’est pas
analysé dans le cadre des colonnes de laboratoire, mais le sera dans le cadre de
chantier. Les résultats établiront l’état des lieux du site avant le traitement de bio
calcification.

310
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

V.p 1 (EFFLUENT N°1) : Premier volume récupéré pendant l’injection du 1er volume
de solution calcifiante. Il correspond à la sortie d’une partie de la biomasse et a été
collecté dans une seule burette au cours de la nuit. On observe dans cette burette un
gradient important, qui a permis de le partager en 3 fractions : A, B et C.

V.p 2 (EFFLUENT N°2) : Deuxième volume récupéré pendant l’injection du 2e

volume de solution calcifiante, il a été collecté en 3 fractions à 40 min d’intervalle et
correspond à la sortie du nitrate de calcium et de l’urée non consommée.

V.p 3 (EFFLUENT N°3) : Troisième volume récupéré en 3 fractions pendant

l’injection du 3e volume de solution calcifiante. Il est de composition voisine au
précédent.

V.p 4 (EFFLUENT N°4) : Quatrième volume récupéré pendant l’injection du premier

lavage à l’eau du réseau, il a été collecté dans une seule éprouvette (mélange). A la
suite d’un problème de débit, seuls 300 ml ont été récupérés au lieu de 550 ml. Cet
effluent est aussi de composition voisine du précédent.

V.p 5 (EFFLUENT N°5) : Cinquième volume récupéré pendant l’injection du

deuxième lavage. Il correspond au premier volume de lavage à l’eau du réseau,
chargée en ions non utilisés.

V.p 6 (EFFLUENT N°6) : Il correspond au 2ème volume de lavage à l’eau du réseau.

C’est un effluent trouble de couleur jaune pâle et il semble caractérisé par un
relargage important de bactéries.

Un prélèvement d’eau du réseau utilisée lors des lavages a également été analysé et
sert de témoin. Les résultats des analyses chimiques réalisées au laboratoire de Montereau
sont regroupés dans le Tableau n°137 et celles faites à IANESCO dans le Tableau n°138.
Les fortes teneurs en nitrate ont provoqué des interférences dans le dosage de l’azote total
Kjeldhal et ont invalidé certains les résultats.

Tableau n°137 : Résultats des analyses faites au Laboratoire de Montereau, sur les divers
effluents de la colonne n°1.

V A.E A.E.
DEBIT
SECTION (ml) Totale Sur. Cond
mesuré T NH4+ Bac. TAC
COLONNE V.p ( ( µS/ D.O. pH (mS/
(Identification) (ml/ (°C) (g/l) /ml (°F)
µS/ml cm/ cm)
min)
/min) min)

EAU DE
MAX 0 0 0.01 7.2 0.570 0.01< 39 20
RESEAU

V.p
MELANGE n°0 575 4.5 0 0 0 6.9 1.574 0.046 >107 23

V.p
MELANGE
Bas n°1 180 4.5 2.7 160 146 0.77 8.1 11.4 0.017 >107 320
A

MELANGE
milieu 180 320 146 0.95 8.6 11.4 0.009
B

311
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

MELANGE
haut 180 220 146 0.57 8.6 40 0.106
C
A bas V.p 180 15 0 0 0 6.8 11.978 103 20
B milieu n°2 180 3.8 12 3.7 0 0 7.2 130 15.034 23
C haut 180 4.7 * * 0 7.2 140 19.220 25 26
3
A bas V.p 180 15 * * 0 6.65 135 18.681 10 16*
B milieu n°3 180 4.2 12 * * 0 7 140 17.155 23
104
C haut 180 4.7 * * 0 7.1 143 15.918 25
V.p
MELANGE n°4 540 2.3 5 * * 0 7.11 145 15.147 104 20

A bas V.p 180 2.2 8 * * 0 7.1 145 16.431 26

n°5 >107
B milieu 180 2.2 8 15 0 0 7.05 142 16.841 22
C haut 180 2.2 8 2 0 0 7 130 14.500 102 22
A bas V.p 180 2.8 12 15 15 0.199 7.7 15.8 0.806 50
B milieu n°6 180 2.8 10 12 12 0.299 8.4 2.31 0.625 >107 38
C haut 180 2.8 11 11 0 0.248 8.3 1.884 0.000

(Cond. : conductivité, * : dosage impossible en raison d’un taux de calcium très élevé, A.E.
sur. : Activité enzymatique hors du cytoplasme, Bac. : Effectifs bactériens).

Tableau n°138 : Résultats des analyses chimiques sur les effluents de la colonne n°1,
réalisées par IANESCO Chimie.

(N- P
SECTION COLONNE N° V COT NH4+ NO3- Cl Ca Mg
NH4) TOTAL
(Identification) V.p (ml) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)
(mg/l) (mg/l)
EAU DE RESEAU 0.7 <0.1 37 110
V.p
MELANGE 270 36 46 550 100
n°0 575
MELANGE C
haut 250 14000 1000
1BIS
MELANGE A bas 100 2000 980 1260 610 25 940 70 60
V.p
MELANGE B milieu n°1 100 2100 1000 1286 860 30 710 60 37
MELANGE C haut 100 2200 4170 5361 10000 30 1100 2000 38
A bas 180 2000 12900 16586 60000 8300
V.p
B milieu 180 1600 15400 19800 65000 8200
n°2
C haut 180 330 18300 23529 66000 3500
A bas 180 850 17700 22757 70000 5500
B milieu V.p 180 620 17300 22243 64000 4700
n°3
C haut 180 200 18200 23400 64000 3000
V.p
MELANGE 730 18400 23657 66000 4800
n°4 550
A bas 180 160 19100 24557 66000 3000
B milieu V.p 180 630 18700 24043 73000 4300
n°5 180 470 16000 20571 63000 3300
C haut
A bas V.p 180 45 1820 2340 6100 170
B milieu n°6 180 23 270 347 660 7

312
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

5. Les résultats du suivi des effluents.

Une première analyse des résultats (Tableaux n°137, 138 et 139) permet de mettre en
évidence deux groupes de paramètres directement sous l’influence du procédé. Le premier
groupe réunit ceux fortement associés à la biomasse tels que le TAC, le COT, le pH et l’A.E.
Le second groupe est plus caractéristique de l’état des performances de la calcification avec
NH4+, Ca2+, la conductivité.
Par ailleurs, les sections notées A, B et C ont été transformées de telle sorte que
chaque section corresponde à une longueur par rapport au point d’injection avec C de 0 à 13
cm, B de 13 à 26 cm et A de 26 à 40 cm.

Tableau n°139 : Résultats des analyses faites au Laboratoire de Montereau, sur les divers
effluents de la colonne n°1.
(NH4+) (NO3) (Ca) 2+
+
(NH4 ) mesuré/ mesuré/ mesuré/ Ca piégé dans le
SECTION COLONNE NO3 - Ca 2+
(identification)
V.p (mg/l) (NH4+) (NO3) (Ca) CaCO3
(mg/l) (mg/l)
théorique théorique théorique (%)
(%) (%) (%)
EAU DE
<0.1 37 110
RESEAU
V.p
MELANGE n°0 46 550 100

MELANGE C
bas 14000
1bis

MELANGE A bas V.p 1260 610 70

n°1
MELANGE B 1286 860 60
milieu

MELANGE C haut 5361 10000 2000

A bas 16586 61 60000 64.5 8300 27.7 72.3

B milieu
V.p 19800 73 65000 69.9 8200 27.3 72.7
C haut n°2 23529 87 66000 71.0 3500 11.7 88.3
A bas 22757 84 70000 75.3 5500 18.3 81.7
B milieu 22243 82 64000 68.8 4700 15.7 84.3
V.p
C haut n°3 23400 87 64000 68.8 3000 10.0 90.0
V.p
MELANGE 23657 88 66000 71.0 4800 16.0 84.0
n°4
A bas 24557 91 66000 71.0 3000 10.0 90.0
B milieu 24043 89 73000 78.5 4300 14.3 85.7
V.p
C haut n°5 20571 76 63000 67.7 3300 11.0 89.0
A bas 2340 6100 170
B milieu V.p 347 660 7
n°6
C haut 270 380 18

L’effluent n°1 (V.p 1) qui contient une partie de la suspension de biomasse (bactéries
et déchets du métabolisme) est caractérisé par des valeurs élevées de COT, TAC, D.O.
cellulaire et A.E (Figure n°168). En effet, les déchets du métabolisme ainsi que les bactéries

313
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

qui ne se sont pas fixés sur les grains de sable et sont restés dans la porosité ouverte, sont
chassés par le flux entrant. Lors de la deuxième injection de solution calcifiante (V.p 2) qui
chasse l’effluent n°2, ces paramètres reviennent à leur niveau initial à l’exception du COT
dont le profil est en léger décalage par rapport aux autres.
Ce décalage peut correspondre à une fraction de bactéries faiblement adsorbées sur les grains
de sable, qui peuvent encore être lessivées hors de la colonne, ou à la sortie d’un dépôt de
biomasse dans la portion proximale de la colonne. Ce décalage entre COT et D.O.. par
exemple, se constate au cours des injections suivantes. Le dosage du carbone organique total
titre toutes les formes de matière organique (dissoute et particulaire dont les bactéries) alors
que la D.O. ne traduit que la présence des bactéries. De plus, les dosages de COT sont
beaucoup plus précis que les mesures d’absorbance à 600 nm. Les variations du COT
correspondent dans les effluents suivants vraisemblablement à l’urée non utilisée.

2400 1.0 350

V.p n° 0 V.p n° 1 V.p n° 2 V.p n° 3 V.p n° 4 V.p n° 5 V.p n° 6
2200
300
2000 0.8
COT (mg/l)(G)
A.E -(mS/cm/min)(D)
1800 D.O(D) 250

1600
0.6

A.E (µs/cm/min),TAC(°F)
1400 200
COT (mg/L)

D.O cell
1200
0.4 150
1000

800 100
0.2
600

50
400

200 0.0
0
0

-200 -0.2 -50

0-13 26-40 13-26 0-13 26-40 13-26 0-13 26-40 13-26 0-13 26-40
13-26 0-13 26-40 13-26 0-13 26-40 13-26 0-13 26-40 13-26

Figure n°168 : Suivis des effluents (COT, TAC, D.O. cellulaire et A.E) en sortie de colonne
au cours des 6 injections et en fonction de la distance par rapport au point d’injection.

Ainsi, le lessivage de la suspension de biomasse, se produit essentiellement durant

l’injection du 1er V.p de solution calcifiante. Ce phénomène et en particulier le décrochage de
bactéries fixées, est facilité par les caractéristiques physico–chimiques de la solution
calcifiante. Cependant les bactéries qui sont restées en place, et qui font la bio calcification

314
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

s’encroûtent dans le carbonate de calcium fabriqué et ne seront plus soumises au lessivage

lors du passage des solutions calcifiantes suivantes. Cependant, dans le V.p 6 (effluent n°6)
qui correspond à la phase de lavage avec de l’eau du réseau, la D.O. cellulaire remonte alors
que le COT diminue

La figure n°169, montre que les fluctuations du pH et du TAC sont, dans certains
effluents, étroitement liées avec celle de la D.O.. Le pH est également un indicateur de la
phase de précipitation car il se stabilise autour de pH = 7 soit 1.5 unité de moins par rapport
au pH de la suspension de biomasse. L’indentification de cette phase de précipitation est
confirmée avec les teneurs en calcium, en ammonium et par la conductivité (Figure
n°170).

350 9.0 1.0

V.p n° 0 V.p n° 2 V.p n° 3 V.p n° 4 V.p n° 5 V.p n° 6

300
8.5 0.8

Tac(°F)(G)
D.O(D)
250 pH(D)
8.0 0.6

200

DO cell
Tac (°F)

pH
7.5 0.4

150

7.0 0.2
100

6.5 0.0
50

0 6.0 -0.2
0-13

0-13

0-13

0-13

0-13

0-13

0-13
13-26
26-40

13-26
26-40

13-26
26-40

13-26
26-40

13-26
26-40

13-26
26-40

13-26
26-40

Figure n°169 : Suivi des paramètres fortement associés à la biomasse

(la D.O. cellulaire, le TAC et le pH).

315
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

Tracé Curviligne de plusieurs variables

160000 20000
N-NH4(mg/l)(IANESCO)
140000 Ca(mg/l) 18000
Conductivté (µS/cm)

16000
120000

14000
100000

NH4+ (g/L) et Ca 2+ labo

Conductivité (µs/cm)

12000
80000
10000
60000
8000

40000
6000

4000
12900

0 2000
V.p n° 0 V.p n° 1 V.p n° 2 V.p n° 3 V.p n° 4 V.p n° 5 V.p n° 6

-20000 0
0-13 26-40 13-26 0-13 26-40 13-26 0-13 26-40 13-26 0-13 26-40
13-26 0-13 26-40 13-26 0-13 26-40 13-26 0-13 26-40 13-26

Figure n°170 : Les suivis des effluents (NH4+IANESCO, Ca et conductivité) en sortie de

colonne au cours des 6 injections et en fonction de la distance par rapport au point
d’injection.

Les premiers pics de ces trois paramètres (Ca2+, NH4+, conductivité) apparaissent dans
l’effluent n°1 (V.p 1). Ces pics correspondent à la sortie des flocs qui semblent
essentiellement localisés dans la partie proximale de la colonne. Les fluctuations des mesures
du calcium montrent au cours du cycle d’injection, une meilleure précipitation dans la section
proximale de la colonne, avec des rejets inférieurs à 4 000 mg/l. Les fluctuations de la
conductivité suivent plus celle de l’ammonium que celle du calcium dans cette colonne. Par
ailleurs, l’amplitude de ces fluctuations est moins marquée que celle du calcium. Ainsi, le
suivi du taux d’hydrolyse de l’urée en ion ammonium par dosage de ce dernier, ne semble
pas être un paramètre suffisant pour évaluer la précipitation de CaCO3 dans la colonne.

316
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

6. Interprétations des résultats de la colonne n°1 et comparaison avec les

deux essais précédents.

Deux suivis chimiques d’effluents avaient été réalisés précédemment. Le premier, en

décembre 2006 a suivi un protocole identique sauf pour le conditionnement des échantillons,
tandis que le second était plus particulièrement destiné à un test sur la maturation des liquides
injectés. Malheureusement, toutes les analyses n’avaient pu être faites car le conditionnement
des échantillons n’avait pas pris en compte la forte instabilité des effluents notamment ceux
de la solution calcifiante. Ce n’est qu’au cours des premières analyses chimiques que cette
instabilité a été mise en évidence. Le suivi étant donc incomplet, il ne peut en être tiré de
conclusions, en dehors d’une comparaison avec les résultats de la colonne n°1. Les
échantillons de celle-ci ont été conservés dans de bonnes conditions. Les résultats obtenus
dans le premier suivi précédent (colonne n-1) sont réunis dans les Tableaux n°140 et 141.

Tableau n°140 : Suivi chimique de différents effluents de solution calcifiante obtenus

dans différentes colonnes (mélange : ensemble des 4 premiers effluents, Cond. :
conductivité).

N° des DCO N- Cal2+

Cond. NTK NO2- P total Ni 2+
échantillons ou pH (mg NH4+ NO3- (g/l) Total
(mS/cm) (mg/l) (mg/l) ( mg/l) (mg/l)
des effluents d’O2/l) (g/l) (mg/l)
13 (mélange) 6.9 66.7 810 14 300 6.2 0.72 12 <1.25 4 700 <0.05
ième
13 (5 ) 1390 8 020 6.51 21 9 000 <0.05
14 (mélange) 8.6 77.5 910 15 100 12.6 0.81 10 9.2 1 000 <0.05
ième
14 (5 ) 100 14 300 14.1 4.6 420 <0.05
15 (mélange) 7.5 76.5 130 12 700 12 51 11 7.3 1 400 <0.05
ième
15 (5 ) 120 12 300 12 5.4 450 <0.05
16 (mélange) 8.45 77.1 1730 11 000 11 1.8 < 0.2 mg/l 14 600 <0.05
ième
16 (5 ) 2190 13 900 13.2 1.1 65 mg/l <0.05

Tableau n°141 : Suivi chimique de différents effluents de suspension bactérienne

obtenus dans différentes colonnes
(mélange : ensemble de tous les effluents d’une colonne, Cond. : conductivité).

Cond. DCO
N° des TA TAC COT MES NTK N-NH4+ NO2- NO3 -
pH (mS/ (mg
échantillons (°F) (°F) (mg/l) (mg/l) (g/l) (mg/l) (mg/l) (g/l)
cm) d’O2/l)
10 7.05 85.8 26.2 1500 570 11.9 10.3 1.3 20
11 7.25 73.9 27.7 1100 220 10.2 9.16 0.43 12
12 9.05 77.4 978 2600 1420 570 420 15.3 16 1.2 8.6
13 8.45 66.8 480 1500 660 570 10.2 9.78 1.1 7.1
3670- 2.37- 1.98-
Mélange 9.2 9.75 160 481 1300 140 1.3 0.23
5070 1.66 1.43

317
 Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

Dureté Ca 2+ Mg 2+ P
N° des Cl- S04 2- Ni2+
totale dissous dissous total
échantillons (mg/l) (mg/l) (mg/l)
(TH °F) (mg/l) (mg/l) (mg/l)
10 440 5000 20000 29 0.07 6.4
11 130 <100 1300 5100 28 <0.05 <1.25
12 500 <100 5.1 4.7 9.5 0.07 6.8
13 4200 <100 11 26 12 0.1 4.5
Mélange 990 <100 7.2 26 1.6 0.12 106-73

Les résultats concernant les effluents de l’expérience de maturation de la solution

calcifiante sont dans le Tableau n°142.

Tableau n°142 : Influence de la durée de maturation de la solution calcifiante dans la

colonne sur les résultats des analyses chimiques.

N- P Ca 2+
Durée Cond. TAC COT NTK + NO2 - NO3 - Cl - Mg 2+
pH NH4 total Total
(jours) (mS/cm) (°F) ( (g/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) Ni2+(mg/l)
(mg/l) (mg/l) (mg/l)
mg/l)

7 8.1 74.94 20.7 120 4.75 5.23 0.25 830 <0.25 <10 270 8.3 <0.05
7
7.85 84.8 110 120 11.9 13.1 5.7 12000 1 <10 320 23 <0.1
(notée J +12)
14 7.80 82 86 23 2.58 2.56 7.9 12000 <0.25 <10 55 5 <0.05
14 8 0.69 7.6 41 4.68 5.29 0.08 73 0.25 <10 120 9.2 <0.05
1 8.5 0.542 5.2 200 4.68 5.23 <0.03 47 <0.25 <10 530 10 <0.05
1 8.6 1.08 11.6 130 4.49 5.11 <0.03 97 <0.25 <10 210 8.3 <0.05
0 8.1 0.334 11.2 560 5.11 4.35 12 <0.2 <0.25 <10 1500 11 <0.05
0 8.6 0.337 7.7 1200 4.81 2.495 0.43 22 <0.25 <10 2800 11 <0.05

6.1. Les effluents de la suspension de biomasse.

Cet effluent, de couleur brune, à pH 8.6, possède une conductivité élevée (11.4 mS/cm).
La D.O.. cellulaire varie entre la section moyenne (B) et la section (A) basse de la colonne
environ du simple au double (0.95 à 0.57 unité). Une estimation du nombre de cellules
bactériennes montre un effectif supérieur à 107 cellules/ ml en sortie de colonne. Le taux de
fixation des cellules pour une D.O.. cellulaire injectée de 2.48, a été estimé entre 65 et 70 %.
La D.O.. moyenne de l’effluent de sortie est de 0.76 ce qui est globalement en accord avec
les taux de fixation proposés. L’activité enzymatique intracellulaire de la suspension de
biomasse avant injection était de 0.678 mS/ml/min pour une D.O.. cellulaire de 2.48 unité.
Une fuite de l’enzyme était déjà perceptible avant l’injection (0.314 ms/ml/min d’AE extra
cellulaire). Elle augmente très fortement dans l’effluent de la biomasse, pour passer de 33 %
à 54 % au minimum et 87 % au maximum. Ceci est vraisemblablement dû à une lyse
cellulaire ou à un vieillissement de la biomasse.

318
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

6.1.1. Les teneurs en chlorures dans l’effluent de la suspension de biomasse.

Les teneurs en chlorures de l’effluent de la suspension bactérienne se situent autour

de 1g/l. Elles sont en accord avec celles trouvées (0.99g/l) dans les effluents de suspension
bactérienne d’autres colonnes. Ces suspensions avaient été produites dans le milieu SBF
CHIC qui contient 3g/l de NaCl soit 1.81 g/l de Cl-. Pour la colonne n°1 la suspension de
biomasse a été fabriquée sur le milieu SBF-CHIC-VIT qui contient en plus des 3g/l de NaCl,
0.1g/l de MgCl2. L’apport de ce milieu en chlorure est de 1.88 g/l. Ainsi, un peu moins de la
moitié du chlorure initial (47 %) est monopolisé dans les cellules de la biomasse.

6.1.2. Le phosphore total dans l’effluent de la suspension de biomasse.

La concentration en phosphore total présent dans l’effluent de la suspension

bactérienne tourne autour de 30 mg/l. La même gamme de concentrations se retrouve dans
les effluents de la colonne d’essai n-1. Par contre, les analyses de décembre 2006 montrent
que la concentration peut être de 2 à 4 fois supérieure (70 et 110 mg/l). Cela est très
probablement dû au vieillissement de la biomasse. Ceci entraine une bien moins bonne
fixation de celle-ci sur les grains de sable. De plus, dans le cas d’une lyse cellulaire les
molécules énergétiques riches en P (ATP, ADP, AMP) et les phospholipides membranaires
vont être libérées. Une autre différence est à relever, en décembre 2006, les productions de
biomasse se faisaient en Erlenmeyers et non pas en bio réacteur. Ces deux modes de
production très différents peuvent influer sur la qualité de la biomasse.

6.1.3. Le carbone organique total (COT) dans l’effluent de la suspension de

biomasse.

La valeur du COT de l’effluent de la suspension bactérienne sortant de la colonne n°1

est autour de 2g/l, ce qui semble être une valeur moyenne, puisque le résultat moyen des
effluents de suspension de biomasse de décembre 2006 est de 1.3 g/l et celui de la colonne n-
1 à 2.7 g/l. Néanmoins ces valeurs sont entre 3 000 à 4 000 fois supérieures à celle de l’eau
de réseau (0.7 mg/l). D’autre part, il ne faut pas oublier que les milieux de production de la
biomasse contenaient initialement 8 g/l d’extrait de levure. Si toute la biomasse était restée
en place, ce qui n’est pas le cas, ces 2 g/l ne correspondraient qu’aux déchets du métabolisme
de la croissance et/ou à la matière organique non consommée, dans les deux cas il s’agit
d’une matière organique soluble. Elle correspond à 25 % de ce qui a été apporté initialement.

6.1.4. Le Ca2+ dans l’effluent de la suspension de biomasse.

La suspension de biomasse est poussée par l’arrivée du premier V.p de solution

calcifiante. Les premiers effluents qui sortent n’ont donc pas été au contact de celle-ci et ne
se sont pas chargés en Ca++ (65 mg/l dans la section B). Dans la colonne n-1, les effluents de
la biomasse présentaient une concentration similaire (90 mg/l). Cependant, ces valeurs sont
entre 2 à 3 fois et demie plus élevées par rapport aux résultats des analyses de décembre
2006. Cet écart tient au fait qu’une étape supplémentaire dans le protocole du procédé a été
ajoutée depuis la fixation. Il s’agit d’ajouter 10 mM de nitrate de calcium par litre (2.36 g/l)
soit 400 mg/l de calcium pour faciliter l’adhésion des bactéries sur les grains de sable. Les
sections centrale et distale contiennent du calcium en faible quantité (65 mg/l et 70 mg/l). Par
contre, les effluents de la section proximale qui n’est pas au contact direct de la solution
calcifiante sont très concentrés en calcium avec 2 000 mg/l. Ceci est dû à un floc qui se
forme de préférence en présence d’une forte concentration de cellules à pH élevé. A cette

319
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

interface lors de l’injection, il se produit du fait des fortes concentrations en calcium, une
précipitation d’hydroxyde de calcium qui se transforme ensuite en carbonate de calcium.
Cette précipitation purement chimique s’opère de manière instantanée pour former des flocs
d’aspect gélatineux. La section proximale est bien un mélange de deux solutions, et
contrairement aux sections suivantes, sa conductivité grimpe jusqu’à 40 mS/cm: et la
concentration en NH4+ à 4 000 mg/l avec un pH stabilisé autour de 8.5.

6.1.5. Le Mg2+ dans l’effluent de la suspension de biomasse.

Les concentrations mesurées dans les effluents de sortie des suspensions bactériennes
sont équivalentes pour les deux colonnes n-1 et n°1, sot autour de 45 mg/l. Cette valeur est à
peu près 28 fois plus élevée que celle trouvée dans les analyses de décembre. Une partie de
cette augmentation résulte de la présence dans le nouveau milieu SBF CHI VIT de 0.1 g/l de
MgCl2 soit 25 mg/l de magnésium.

6.1.6. Le TAC dans l’effluent de la suspension de biomasse.

La mesure du TAC, c'est-à-dire le titre d’alcalimétrique complet permet de connaître

les concentrations en bicarbonates et en carbonates présentes dans les effluents. Le TAC est
une mesure réalisée en temps réel car l’instabilité de la solution ne permet pas de
conditionner les échantillons pour des analyses ultérieures. Par conséquent, seules les
analyses faites en sortie des effluents des colonnes n°-1 et n°1 peuvent être prises en compte.
Pour ces deux essais, les teneurs en TAC sont équivalentes, entre 200 et 350° F soit près de
dix fois la valeur retrouvée dans l’eau de réseau et celle de l’eau présente dans la colonne.
Ces valeurs élevées sont le reflet du métabolisme de l’hydrolyse de l’urée (2.4 g/l) et de la
respiration. Des valeurs élevées de TAC confortent la formation de floc mixte d’hydroxyde
de calcium et de carbonate, lors de l’injection de la solution calcifiante. Ceci a été mis en
évidence notamment dans le chapitre des premiers essais.

6.1.7. Le N-NH4+ dans l’effluent de la suspension de biomasse.

Les dosages de l’ammonium ont été réalisés par IANESCO-CHIMIE. La présence de

NH4+ dans le milieu de production de biomasse varie considérablement dans une même
colonne. Ainsi la section proximale de la colonne présente une teneur voisine de 4 g/l alors
que dans les sections centrale et distale la concentration est 4 fois plus faible, avec environ
1.2 g/l. Quant aux analyses de la colonne n-1, les concentrations mesurées sont inférieures au
gramme par litre. La quantité d’ammonium apportée par le milieu de production de biomasse
provient essentiellement de la dégradation de l’urée ajoutée à raison de 2.36 g/l soit 1.44 g/l
de NH4+ potentiel.

6.1.8. Le NO3- dans l’effluent de la suspension de biomasse.

La concentration en nitrates est dans les sections centrale et distale, inférieure à 1 g/l
(entre 0.6 et 0.8 g/l). Ces ions résultent vraisemblablement de la phase de développement de
la fixation pendant laquelle 10 mM de Ca(NO3)2 soit 0.62 g/l sont ajoutés. En effet, lors des
analyses de décembre 2006, la teneur en nitrates était seulement de 0.23 g/l, ce qui tend à
montrer que l’apport supplémentaire du nitrate provient bien de l’additif fixant. A titre de
comparaison la teneur en nitrates dans l’eau de réseau est de 0.037 g/l, soit presque deux fois
moins que celle mesurée dans le milieu de biomasse. Par ailleurs, le volume de la section
proximale, qui est en contact avec la solution calcifiante lors de son injection, montre une

320
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

concentration en nitrate entre 10 g/l et 14 g/l. Ceci confirme la présence d’un mélange
d’interface à l’intérieur de la colonne lors de l’injection du1er V.p e la solution de calcifiante.

6.1.9. La conductivité dans l’effluent de la suspension de biomasse.

La conductivité d'une eau correspond à la conductance d'une colonne d'eau comprise entre
deux électrodes métalliques de 1 cm² de surface et séparées l'une de l'autre de 1 cm. L'unité
de conductivité est le micro-siemens par centimètre (µS/cm).La conductivité traduit la
minéralisation totale de l'eau. .C’est à dire la quantité de sels minéraux présents dans une eau
Sa valeur varie en fonction de la température. Elle est donnée à 20°C.
La conductivité de la suspension bactérienne est de 11.4 mS/cm, soit à peu près 10 fois plus
que celle de l’eau présente dans la colonne et 22 fois plus élevée que celle de l’eau de réseau.
Les variations de la conductivité semblent être essentiellement dûes à la présence
d’ammonium et de nitrates. En effet la section proximale (mélange C) renferme 2 g/l de
calcium et 4-5 g/l de NH4+ pour une conductivité de11.4 mS/cm. Par contre, la section
distale (mélange A), détient une concentration de calcium de 0.07g/l et 0.61 g/l de nitrates
mais une conductivité 4 fois plus grande (40 mS/cm).

6.1.10. L’activité enzymatique dans l’effluent de la suspension de biomasse.

Les valeurs de l’activité enzymatique (A.E) sont données à titre indicatif. En effet, les
ions calcium, en trop grande quantité, ne permettent pas de mesurer avec précision l’A.E par
suivi de la variation de conductivité au cours du temps. L’activité enzymatique intracellulaire
en sortie de colonne pour les trois sections est diminuée d’un facteur variant de 2 à 4 par
rapport à ce qui a été injecté (678 µS/cm/min). Une diminution également d’un facteur de 2 a
été observée avec l’activité enzymatique extracellulaire. La perte de l’activité enzymatique
de 20 à 30 % dans ces conditions d’injection confirme ce qui a été mesuré lors des essais
dans le chapitre VI sur le maintien des activités enzymatiques et la détermination du temps
de batch.

6.1.11. Conclusions.

Les 2/3 du volume de porosité (V.p 1) présentent des valeurs chimiques

caractéristiques d’une suspension bactérienne associée à la solution fixatrice. Le tiers restant,
possède des qualités chimiques proches d’une solution calcifiante. Cela est dû au mélange de
la suspension bactérienne et de la solution calcifiante lors de cette injection. De plus, ce
mélange chimiquement complexe est instable et son traitement nécessitera des installations
spécifiques résistantes à l’entartrage et à la corrosion. Par ailleurs, cette solution d’un point
de vue potentiel enzymatique est très riche puisqu’elle est composée de bactéries engluées
dans des flocs d’hydroxyde de calcium – carbonate de calcium. La possibilité d’une
neutralisation risque d’être fort complexe à mettre en œuvre. L’idéal serait de laisser le plus
longtemps possible cet effluent dans le sous sol pour optimiser la bio calcification et réduire
ainsi sa charge minérale et la rendre stable.

321
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

6.2. Les effluents issus de la solution calcifiante.

La solution calcifiante a été caractérisée chimiquement par l’azote avec les valeurs de
NH4 , de NO3-, NTK et par le calcium. La teneur en carbone organique total (COT) permet
+

de suivre avec plus de précision le processus complexe de bio calcification. En effet, la

source principale de COT est la biomasse présente dans la colonne.

6.2.1. Le carbone organique total (COT) dans les effluents de la solution calcifiante.

Le COT décroît d’un facteur de près de 3 entre le premier volume V.p 1 et V.p 2. Il
fait apparaître un gradient intrinsèque qui est léger dans le V.p 1 puis très prononcé dans le
V.p 2 entre la partie proximale et distale de la colonne, soit une différence d’un facteur de 7.
Cette observation est confirmée par la numération des effectifs bactériens sur gélose. Il y a
ainsi, près de 103 bactéries/ml pour la section proximale et seulement 25 bactéries/ml pour le
tronçon distal. Ces variations intra colonne sont le reflet de la différence de distribution des
bactéries. Le sable Correcteur jouant un rôle filtre important, la biomasse semble fortement
concentrée au niveau du point d’injection. Par ailleurs, la solution calcifiante semble avoir un
effet bénéfique sur le décrochage des bactéries. En effet, il y a un phénomène de glissement
des valeurs de COT de la partie proximale à la partie distale au fur et à mesure de
l’avancement dans la séquence d’injection. La chute du COT coïncide avec une sortie de
bactéries et une remontée des activités enzymatiques lors du passage du second volume de
pore de lavage (V.p 6). Ceci signifie qu’une poche de biomasse est restée très probablement
en dehors du processus de bio calcification qui piège les bactéries dans du carbonate de
calcium et limite donc leur sortie dans les effluents. La mesure de l’activité possible rend
compte d’une absence de calcium. Autrement dit, il est possible que des portions de colonnes
restent en dehors du processus de bio calcification, ce phénomène serait accentué par un
écoulement en doigt de gants et par la granulométrie du sable.

6.2.2. Le NO3- dans les effluents de la solution calcifiante.

La source de nitrate provient uniquement de l’apport de calcium sous la forme d’un

sel de nitrate de calcium. La concentration massique finale en nitrate est de 90 g/l soit 1.5
moles/l puisque le sel (Ca (NO 3)2) est introduit à une concentration initiale de 0.75 M. Le
nitrate apparaît déjà dès la sortie du V.p 1, dans le dernier tiers du volume de porosité de la
colonne. En effet, le V.p 1 (biomasse) est chassé hors de la colonne par le premier volume de
solution calcifiante. Il se crée une interface de mélange au sein de la colonne là où les nitrates
ont tout lieu de diffuser. Les volumes suivants, V.p 2, V.p 3 et V.p 4 correspondent à la phase
d’injection de la solution calcifiante. Les effluents de ces 3 volumes injectés présentent des
concentrations homogènes (66 g/l en moyenne). Ceci semble indiquer qu’il y a une saturation
de la colonne par les nitrates. Pourtant, la concentration initiale de la solution calcifiante
injectée est de 0.75 M soit 1.5 M pour le nitrate donc 90 g/l. Les analyses des effluents
montrent des concentrations rejetées voisines de 66 g/l, c'est-à-dire 1/3 plus faibles. Ce
nitrate manquant, apparaît lors de l’injection des deux volumes de porosité de lavage V.p5 et
V.p 6 mais essentiellement durant le V.p 5. Ces observations suggèrent que les phénomènes
de rétention (adsorption-désorption) sont prépondérants. Ils sont très probablement accentués
non seulement par les concentrations élevées, mais aussi par la présence de biomasse dans la
colonne. Cette différence entre ce qui est entré et ce qui est sorti de la colonne reflète un
chemin plus complexe. Même si l’ion nitrate est chargé négativement et n’intervient pas dans
les processus de bio calcification, sa concentration aussi élevée et la présence de biomasse
faussent les interprétations.

322
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

En effet, l’évolution du profil de concentration en fonction des conditions

hydrodynamiques (advection, dispersion) et des processus réactionnels (sorption,
transformation biologique) peuvent avoir lieu durant le transport et durant le temps de batch
du soluté. Ceci tend à expliquer le retard observé, qui peut être de plus, amplifié par une
différence de texture qui se crée au fur et à mesure des injections (Carbonate de calcium et
silice). En effet, la chute du débit de 4.5 à 2.2 ml/min dûe au processus de bio calcification
doit fortement réduire le réseau de porosité ouverte et par voie de conséquence augmente la
proportion de celle qui est fermée. De plus, par expérience, les colonnes injectées dans les
conditions de chantier présentent des effets de bords importants du fait des vitesses réelles
d’injection avec le sable Fontainebleau Correcteur. Par ailleurs, la biomasse n’a pas pu
utiliser le nitrate comme accepteur terminal d’électrons en remplacement de l’oxygène car, le
produit de cette réduction dissimilatrice est le plus souvent, la forme réduite de l’azote, c'est-
à-dire l’ammonium. Si cela avait été le cas, le taux d’hydrolyse de l’urée aurait été plus
élevé, ce qui aurait conduit automatiquement à une meilleure précipitation du carbonate de
calcium. Or, l’estimation du taux moyen de précipitation du calcium en carbonate de calcium
est de 83 %. Cette inhibition peut être multifactorielle. Néanmoins les analyses chimiques
précédentes sur l’impact environnemental du dernier volume de pore de solution calcifiante,
ont montré, une très forte diminution du taux de nitrates lorsque la durée de batch dépasse les
24 heures. Ce laps de temps permet une consommation complète de l’oxygène injecté en
présence de la solution calcifiante, et une levée de l’inhibition.

6.2.3. Le N-NH4+ dans les effluents de la solution calcifiante.

L’ammonium dans les effluents de la solution calcifiante résulte de l’hydrolyse de

l’urée. Ainsi une solution calcifiante (Urée/Ca(NO3)2) équimoléculaire de 0.75 M produit si
la réaction d’hydrolyse de l’urée est de 100 %, 1.5 M de NH4+ soit près de 27 g/l. Les
résultats d’analyses montrent des taux d’hydrolyse équivalents de V.p 2 à V.p 4 (≈ 80 %).
Cette stabilité indique un bon maintien de l’activité d’hydrolyse au cours du temps, c'est-à-
dire pendant près d’une semaine. Le volume de lessivage n°1 qui correspond à V.p 5, a des
taux d’hydrolyse équivalents à ceux présent dans les effluents précédents. Cette observation
indique également un effet de retard dû aux conditions de l’injection mais aussi à la nature
chimique de cet ion. Il est un indicateur majeur de l’état d’hydrolyse de l’urée, mais ce n’est
pas le cas pour autant, dans la détermination du profil de bio calcification dans la colonne.
Par ailleurs, cet ion intervient d’une manière très active dans le métabolisme énergétique et
de ce fait serait plus enclin à être retenu et dispersé.

6.2.4. Le Ca2+ dans les effluents de la solution calcifiante.

Les ions calcium sont apportés par la solution calcifiante à raison de 0.75 M soit 30 g/l.
Plus la réaction d’hydrolyse de l’urée est intense, plus le taux de précipitation du calcium sous
forme de carbonate de calcium est important et donc moins il y a de calcium dans les effluents
de sortie. Les résultats indiquent un taux moyen de précipitation de 80 % au cours des 3
passages de solution calcifiante. Néanmoins des variations existent. Ainsi, les concentrations
en ion calcium dans les effluents de V.p 2 sont deux fois plus importantes que celles
rencontrées dans les effluents de V.p 3 et V.p 4. Des variations importantes sont également
observées à l’intérieur même de la colonne pour les différents volumes injectés. Ainsi, une
variation d’un facteur supérieur à 2 est constatée entre le haut de la colonne avec 3.5 g/l et le
bas de colonne avec 8 g/l pour le premier volume. Ce facteur diminue légèrement pour le V.p
3. Enfin, le V.p 4 présente une concentration moyenne de 4 .8 g/l. Le taux de précipitation du
calcium est élevé puisqu’il varie entre 72 et 84 % au cours des trois V.p 1, 2 et 3.

323
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

6.2.5. Le TAC dans les effluents de la solution calcifiante.

Les TAC dans les effluents mettent en évidence les ions carbonates qui sortent de la
colonne. Les valeurs de TAC dans les effluents de V.p 2 à V.p 6 sont constantes et
équivalentes à celles de l’eau du réseau urbain (20° F). Il n’y a donc pas de rejet d’ions
carbonates ou hydrogénocarbonates, et donc pas de décrochage des carbonates de calcium
précipités dans la porosité. Les carbonates de calcium produits par la bio calcification sont
donc stables et fortement accrochés aux grains de sable et contribueront de façon efficace à
l’obtention d’une résistance importante à la compression verticale.
Les valeurs de TAC dans les effluents de la suspension de biomasse sont 10 fois plus
élevées que celles de la solution calcifiante. Elles montrent dans ce cas que lorsque la
biomasse est lessivée, elle apporte des ions carbonates ou hydrogénocarbonates. La bio
calcification reste fortement associée à la présence de la biomasse. En effet, il a été
également remarqué une légère augmentation du TAC (32 - 50° F) dans le V.p 6. Celle-ci est
associée à un relargage de biomasse (D.O. entre 0.2 et 0.3) qui est apparu dans ce sixième
volume de pore. Ce paramètre pourrait donc servir à confirmer la présence de biomasse en
sortie de colonne. Ceci est d’autant plus valable que les bactéries respirent (production de
C02) et hydrolysent l’urée, ce qui en agissant sur l’équilibre des hydrogénocarbonates produit
in fine des carbonates.

6.2.6. La conductivité dans les effluents de la solution calcifiante.

La conductivité des effluents en sortie de colonne (140 mS/cm) augmente d’un

facteur de 10 par rapport celle de la biomasse lors du passage de la solution calcifiante. Ce
facteur est essentiellement associé aux ions ammonium et nitrate plus qu’aux ions calcium
qui sont minoritaires. La conductivité initiale de la solution calcifiante est de 70 mS/cm. Elle
double lorsque l’hydrolyse de l’urée survient mais les variations de la teneur en ions calcium
ne se font pas ressentir dans le suivi de la conductivité.

6.2.7. L’activité enzymatique dans les effluents de la solution calcifiante.

Le dosage de l’activité enzymatique par conductivité dans les conditions standards, ne

peut se faire à partir d’effluents contenant du calcium. Dans ces conditions, il apparaît du
carbonate de calcium dans la cuve de dosage et sur l’électrode. Par contre, il est possible
d’observer une variation négative de plusieurs dizaines de µS/min/ml qui sous entend une
activité d’hydrolyse associée à une précipitation du calcium. Les variations de conductivité
associées à des mesures de D.O. nulles ou très faibles en sortie de colonne suggèrent un
relargage d’enzyme sous forme libre. Des indications indirectes complémentaires sur
l’activité enzymatique peuvent provenir des concentrations, en sortie de colonne, de
l’ammonium ou bien du calcium. Le relargage imprévu de biomasse au niveau de V.p 6
fournit de précieuses indications. Malgré la faible D.O. cellulaire (0.248 en moyenne) et
après une semaine d’injection, une activité enzymatique résiduelle de 15 µS/min/ml persiste,
en présence de 18 mg/l de calcium ce qui correspond à une diminution d’un facteur de 66.
Cela correspond à une perte moyenne de l’activité enzymatique par heure, de 21 µS/min/ml.
Or il est fort possible qu’en absence de calcium, l’activité enzymatique soit
meilleure. Ces données correspondent alors aux plus mauvaises conditions dans ce cadre
expérimental, avec ces caractéristiques de suspension de biomasse. Par ailleurs, les activités
enzymatiques dosées ici correspondent à la fois à celle de l’enzyme intracellulaire et à celle

324
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

de l’enzyme libre sortie des bactéries. Ce relargage en continu de l’activité enzymatique

quelle que soit sa localisation, au cours de l’expérience, montre que les effluents seront
continuellement « contaminés » par le catalyseur de l’urée. Les solutions métastables ne
concerneront pas uniquement le V.p 1, mais également, les autres V.p. Ces données sont
nécessaires, pour le traitement des effluents, il faudra en tenir compte dans le circuit de
recyclage des effluents mais surtout s’il est envisagé une réinjection des effluents dans le sol
pour un épuisement naturel de ceux-ci avant un traitement final.

6.2.8. Les effectifs bactériens quantifiés sur milieu gélosé, dans les effluents de la
solution calcifiante.

Les conditions stressantes forcent S. pasteurii à s’adapter et/ou à fabriquer des formes
de résistance, les spores qui sont totalement inactives pour la bio calcification. Ces dernières
pourraient passer inaperçues au niveau d’une mesure de densité optique au
spectrophotomètre. La numération qui est basée sur le comptage de colonies bactériennes
issues soit de cellule végétative soit de spore de S. pasteurii est plus apte à rendre un profil de
lessivage de la colonne au cours de la bio calcification. La filtration sur membrane porte sur
des volumes plus importants (20 à 30 ml) par rapport à la mesure de la D.O. en cuvette de
spectrophotomètre (3 ml). Le lessivage est continu, et les numérations montrent des
variations importantes entre les différents V.p (de > 107 à 25 colonies pour 30 ml). Au cours
de l’expérience de bio calcification tous les effluents renfermaient du S. pasteurii, avec une
moyenne de 104/30 ml pour les V.p 2, 3 et 4. Le V.p 5 renferme lui plus de 107/30 ml après
reviviscence. Ces numérations n’indiquent pas si le dans la colonne, le S. pasteurii était sous
forme de cellules végétatives (actives pour la bio calcification) ou sous forme de spores
(inactives pour la bio calcification). On peut toutefois supposer avec beaucoup de certitude,
que les spores sont déplacées plus facilement que les cellules végétatives qui elles, adhèrent
aux grains de sable. De plus, le phénomène de sporulation (passage de la cellule végétative à
la construction endocellulaire de la spore) s’accompagne de la fuite de toute la réserve
enzymatique cytoplasmique au moment de la libération de la spore.
Ces observations confirment la problématique d’avoir des effluents « propres » c'est-
à-dire dénués de toute présence d’uréase sous forme cellulaire ou libre pour faciliter les
procédures de recirculation des eaux. En effet, 100% des volumes injectés présenteront une
instabilité physico-chimique.

6.2.9. Les teneurs en carbonate de calcium dans les effluents de la solution

calcifiante.

Le taux moyen de précipitation du CaCO3 est de 76 % au lieu des 80 % théoriques.

Cette différence est attendue puisque la bio calcification se réalise selon un gradient. Or dans
le protocole d’extraction, les deux extrémités de la colonne sont exclues de l’analyse. Il s’agit
des sections contenant le sable filtre (Figure n°171).

325
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

0.14

0.12

CaCO3 (g/cm3)(G)
0.10
RC (MPa)(D)
CaCO3 (g/cm3)

CaCO3 (g/cm3) = 0.1869*exp(-0.4445*x)

0.08 RC (Mpa) = 1.6*exp(-1.3863*x)

0.06

0.04

0.02

0.00
0-13 13-26 26-40
Distance (cm)
Figure n°171 : Evolution de la teneur en carbonate de calcium et la de Rc en fonction de la
distance du point d’injection.

Les courbes confirment les tendances précédemment observées pour la teneur en

carbonate de calcium et pour le profil de résistance. En effet, ce profil en décroissance de
type exponentiel a été rencontré dans une série de 3 colonnes (0.6 m) réalisées ave le même
type de sable (Tableau n°143).

Tableau n°143 : Les équations des tendances observées de résistance à la compression(RC)

et de teneur en carbonate de calcium en fonction de la distance dans des colonnes de sable
de Fontainebleau Correcteur.

Type de colonnes Série de 3 colonnes (0.6 m) Colonne de 0.4 m

Equation de la courbe de
Y = 0.1774 e60.6185 x Y= 0.1869 e-0.4445 x
tendance – CaCO3 (g/cm3)
Equation de la courbe de
Y = 622 e62.108 x Y = 1.6 e-1.3863 x
tendance – Rc (MPa)

La tendance du profil de RC est moins accentuée que celle de la série de 3 colonnes

en sable Correcteur. Cette différence peut être due au fait que les concentrations utilisées sont
33 % plus élevées. Par ailleurs, la réduction du nombre de volume de pore à injecter
contribue à diminuer l’efficacité du procédé comme ce qui a été vu précédemment pour le
test de l’ajout de biomasse en colonne de 0.4 m. Ces essais de suivi d’un processus de bio
cimentation de sable fin confirment l’impact filtrant de ces sables. Elle s’opère dans sa partie
proximale du fait d’une concentration cellulaire suffisante. Mais ce procédé est très limité
dans les sables fins. Par ailleurs, ces résultats montrent qu’il est encore difficile d’associer

326
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

une teneur en carbonate de calcium et une résistance mécanique. En effet, la teneur en

carbonate de calcium est un indicateur au même titre que les autres paramètres pour la bio
calcification. L’emplacement des cristaux de CaCO3 décrit exactement le gradient de
biomasse présent dans la colonne. Ce gradient a pu être mis en évidence indirectement par les
nombreux paramètres suivis au cours de cette expérience. Ainsi, il semble que la
précipitation soit directement liée dans l’espace- temps à la localisation des bactéries et à leur
activité. Autrement dit, le déficit de carbonate de calcium ici serait associé à essentiellement
à un seul élément, une concentration insuffisante de cellules bactériennes par unité de volume
de sol mises en place plus qu’une concentration en sel de calcium limitant.

De plus, la présence de bactéries en forte concentration favorise, la précipitation

d’une manière qualitative, car la croissance cristalline se réalise le plus souvent dans la zone
inter-granulaire. C’est, en effet, dans cette zone que la présence des bactéries est maximale.
C’est dans cet espace que se réalisent les ponts de calcite entre les grains, c'est-à-dire la
calcification efficace.

327
Chapitre VIII. Suivi chimique des effluents.

III. LES CONSEQUENCES POUR LES APPLICATIONS EN CHANTIER.

La qualité des effluents est fonction de l’enchaînement des différentes étapes du

procédé de Bio calcification.

Les analyses chimiques des effluents de colonne permettent de compléter le tableau

de la faisabilité des traitements de ceux-ci. En effet, quatre paramètres techniques sont à
prendre en compte :

1. les volumes qui atteindront plusieurs milliers de m3 par jour,

2. la composition qui est très complexe mélangeant de la matière organique et des sels,
3. les concentrations qui sont très fortes, > 0.5 M et variables,
4. l’instabilité des effluents et la corrosion potentielle.

Par ailleurs, lorsque ces effluents sont brassés et aérés, ils deviennent encore plus
instables à cause de la reprise de l’activité enzymatique. Une des solutions viendrait par
l’installation d’une série de bacs de réception ou de décantation. Ceci faciliterait la
décantation de la biomasse (enzyme intracellulaire et libre) par une coprécipitation avec le
carbonate de calcium avec des temps de séjour aussi longs que possible.
Une autre solution consisterait à modifier le protocole d’injection en augmentant la
durée de batch une fois la solution calcifiante installée. La Bio calcification durerait plus
longtemps, son rendement augmenterait, ainsi d’ailleurs que les résistances à la compression
simple. Par voie de conséquence, il y aurait comme effet immédiat une diminution des
concentrations en calcium résiduaire dans les effluents. De cette façon, il serait possible de
réduire le nombre de V.p de lavage ou faciliter le traitement.
Une étude sur l’évolution chimique du dernier volume des effluents suggère qu’une
durée supérieure à 24 heures pourrait réduire fortement les concentrations en calcium et
éventuellement le nitrate qu’il contient. Enfin, une légère acidification des effluents pour
amener le pH à la neutralité permettrait de faciliter les différentes étapes des traitements et de
recirculation des eaux. Cette méthode stopperait totalement l’activité enzymatique ce qui
permettrait de stabiliser ces effluents.
Il serait également nécessaire de suivre deux autres paramètres physiques tels que la
mesure de la turbidité et des mesures en UV à la longueur d’onde standard de 254 nm. Cette
absorption provient de la résultante des absorptions élémentaires des doubles liaisons C=C,
C=O et C=N des différentes molécules organiques.

328
Conclusion

CONCLUSION GENERALE

329
Conclusion

L’objectif principal de ce travail a été la pré industrialisation d’un processus de précipitation

du carbonate de calcium par voie biologique pour la consolidation des sols in situ. Pour cela
une approche pluridisciplinaire de microbiologie et de géotechnique a permis d’entreprendre
conjointement trois axes de recherche.

L’amélioration de la production de biomasse constitue le premier axe de l’étude. Ses

objectifs ont été la définition des spécificités nutritives et des conditions de culture de la
souche bactérienne (Sporosarcina pasteurii) et ceux de façon à coupler à la fois une forte
production d’uréase, de cellules et une diminution des coûts.

Cette approche a autorisée l’élaboration d’un milieu culture de production de biomasse

de type industriel et ceci grâce à l’ajout de chlorure de nickel, de sodium et d’une nouvelle
source de carbone, l’inuline. L’apport de l’inuline a permis la réduction d’un facteur de 3 de
la quantité d’extrait de levure apportée initialement dans la composition du milieu de culture.

Les progrès obtenus dans la mise en place de meilleures conditions de cultures ont
permis de substantielles avancées en termes de production d’uréase, puisqu’un accroissement
de l’activité enzymatique de plus d’un facteur de 10 a été obtenu. Le maximum d’activité
enzymatique se produit durant la phase de ralentissement début de la phase stationnaire.
Ainsi, une mauvaise maîtrise des conditions de culture et de son arrêt conduisent rapidement à
un affaiblissement du potentiel enzymatique, soit par une fuite de l’enzyme hors de la cellule
dans la suspension de biomasse, soit par sa destruction. Ce phénomène rend instable le
processus d’induction de la bio calcification in situ en réduisant l’homogénéité de la
consolidation des zones d’intérêt.

Ce travail d’amélioration de la production de biomasse à également permis d’identifier un

système complexe de régulation de l’enzyme uréase chez ce micro-organisme. Ce système de
régulation est responsable des fortes variations de production d’enzyme qui a été observées
dans de plus de 70 milieux de culture. Ce phénomène a permis d’affiner la compréhension des
mécanismes de régulation de la production d’uréase chez S. pasteurii et de proposer un
modèle général de régulation de l’uréase.

Le second axe de ce travail s’est attaché à la réalisation d’une solution calcifiante,

mélange d’urée et d’une source de calcium, pour soutenir une précipitation efficace, dans le
but d’appliquer ce procédé à l’échelle industrielle. Pour cela trois thèmes de recherche ont été
entrepris.

Tout d’abord, il a été nécessaire d’évaluer l’action de la solution calcifiante sur le

comportement de l’activité enzymatique de l’uréase purifiée et cellulaire en verrerie ; puis
d’identifier l’influence de cette solution sur les performances de la bio calcification in situ.
Enfin, une recherche de réduction des coûts, a été commencée en améliorant l’efficacité
mécanique de la bio calcification.
Cette approche a mis en évidence un effet complexe d’inhibition de la solution calcifiante sur
l’activité enzymatique de l’uréase purifiée et cellulaire. Les faibles concentrations de la
solution (0-0.05 M) semblent produire un effet stimulant sur l’action d’hydrolyse de l’urée
contrairement aux plus fortes concentrations (0.25-1 M). En effet, une phase d’adaptation ou
d’acclimatation apparaît, caractérisée par une diminution de la vitesse d’hydrolyse. Cette
phase d’inhibition semble proportionnelle à la concentration de solution calcifiante et peut
durée plus de 120 min. Ce phénomène est lié également à un encroutement cellulaire dans une

330
Conclusion

gaine de carbonate de calcium, corrélé par de nombreuses observations au microscope

photonique et à électronique à balayage (MEB).

Le deuxième volet de l’étude concerne l’impact de la nature du sel de calcium sur le

processus de bio calcification, entre le chlorure et le nitrate de calcium, deux sources de
calcium disponible de manière industriel. Il a été montré aucune différence significative de la
résistance à la compression simple existe entre ces deux sels. Par ailleurs, l’ensemble des
observations réalisées au MEB confirment que la nature du sel de calcium n’influence pas ni
la morphologie ni la localisation des cristaux. Par contre plus les activités enzymatiques sont
élevées, plus l’efficacité du système de bio calcification diminue et cela quel que soit le sel de
calcium utilisé. La raison principale de ce phénomène provient des cinétiques élevées qui
favorisent la formation une population de cristaux de plus petite taille, dont l’impact
mécanique est plus faible.
A ceci, il faut associer, le rôle des anions chlorures et nitrates issus de ces sels et présent dans
la solution calcifiante durant le processus de bio calcification. En effet, ces anions influencent
indirectement le processus de bio calcification par leurs actions physiologiques distinctes sur
la bactérie. Ainsi, une réduction des performances semble plus marquée en présence d’ions
chlorures, lorsque les activités enzymatiques sont de plus en plus élevées. Une diminution des
performances de la bio calcification in situ a également été remarquée lorsque la solution
calcifiante est non équimolaire, c'est-à-dire lorsque cette dernière possède un excès d’urée.

Pour accroître l’efficacité de la bio calcification, une voie de recherche a été

entreprise et a pour objectif de l’allongement des cristaux de calcite dans les zones inter-
granulaires, ceci pour diminuer l’apport de la solution calcifiante. Pour cela, des ajouts en très
faibles concentrations de matière organique (<0.5 g/l) sous la forme d’un oligomère (inuline)
ont été réalisés. Des améliorations de la résistance à la compression ont pu être observées et
confortées par des observations au MEB. Toutefois, d’autres essais seront nécessaires pour
confirmer ces résultats.

Le troisième axe de cette étude a été la mise en place d’un protocole d’injection pour
une application industrielle. Les conditions de chantier (vitesse réelle d’injection, nombre de
volume de pore injecté, durée du chantier, coût des traitements des effluents) ont constitué le
cadre technico-économique élaboré conjointement dans cette étude. Ce protocole d’injection
industriel a été conçu pour comporter de deux phases, une première phase d’injection de
bactéries dans la zone d’intérêt, suivie d’injection de solution calcifiante. Pour cela il a été
nécessaire d’évalué la capacité de la souche à maintenir son activité enzymatique in situ et
d’estimer le taux de fixation d’une suspension, ceci aux températures de subsurface (12 et
20°C). Cette première étude a été complétée par une estimation des performances du
processus de la bio calcification en terme de distance par rapport au point d’injection et cela
en fonction du type de sable fin. Ces données ont été complétées par une étude chimique des
effluents produits lors de la bio calcification.

Le potentiel enzymatique de la suspension de biomasse injectée est étroitement

dépendante du temps de séjour dans la colonne. En effet, une perte de 40 % du potentiel
enzymatique de la colonne a été identifiée sur 48 heures à 12°C. Par contre, cette diminution
de l’activité peut atteindre entre 60 et 80 % à 24 et 48 heures à température ambiante (20°C).
Une étude complémentaire souligne l’importance d’une immobilisation de la suspension de
biomasse dans le système poreux de courte durée (3 à 4 heures) pour favoriser le taux de
fixation des bactéries (30 %) tout en limitant la dégradation du potentiel d’activité
enzymatique par décrochage lors de l’injection calcifiante ou par lyse cellulaire.

331
Conclusion

Cependant, l’efficacité du procédé réside dans le couple accroche cellulaire et maintien des
activités enzymatiques. La qualité de la biomasse est donc fondamentale pour maintenir
l’intégrité membranaire in situ. Celle-ci permet de conserver des conditions intracellulaires
propices à l’hydrolyse de l’urée. Ainsi, la dégradation des qualités de la suspension
(production de toxines, d’enzyme protéolytiques, chute de pH) conduit à la détérioration des
membranes et facilite la fuite de l’uréase ou/et de sa destruction.
Pour accroitre l’efficacité de la fixation bactérienne, un sucre assimilable, l’inuline, associé
avec un cation sont ajoutés à la suspension de biomasse peu de temps avant l’injection pour
stimuler l’accroche grâce à la synthèse d’exo polysaccharides (EPS). Cette nouvelle méthode
a permis de doubler le taux de fixation (60 %) sur ces mêmes petites colonnes.

Pour consolider ces avancées, des essais sur de plus grandes distances ont été réalisés
avec un montage de 3 colonnes en série. La détermination du taux et des profils de fixation,
de résistance à la compression (RC) et de teneur en carbonate de calcium (CaCO3) auprès de
deux types de sable fin (le sable de Fontainebleau brut et Correcteur) a été rendu possible par
ce type d’assemblage. Ces essais ont mis en évidence une corrélation entre les zones de dépôt
de biomasse et celles des zones consolidées. Les profils rencontrés du taux de fixation de
biomasse de RC et de CaCO3, sur sable de Fontainebleau sont de type exponentiel
décroissant.
Par contre, les injections réalisées sur colonne en sable Correcteur, se sont montrées difficiles.
La pénétrabilité de la suspension de biomasse a été extrêmement limitée, puisque bornée à la
zone du point d’injection. Ces résultats sont l’effet d’une filtration essentiellement mécanique
pour une grande portion de la population bactérienne. Ce phénomène a également été observé
auprès de tous les sables fin de l’étude lorsque la méthode de tassement (T&P) du sable
choisie favorise la formation de strate dans les colonnes. L’ensemble des ces résultats tendent
à montrer une limite inférieure à l’injectabilité d’une suspension de S. pasteurii dans un
système poreux constitué de sable fin compacté.

Ce procédé a également produit une multitude d’autres profils de bio calcification,

c’est à dire des zones ou portions de sable consolidées depuis la zone proximale jusqu’ à la
zone distale des colonnes et ceci jamais d’une manière continue. Cette profusion de profils est
la combinaison du lessivage de la biomasse dû à la formation de précipités au cours de
l’injection de la solution calcifiante. Cette réaction apparaît immédiatement à l’interface entre
la suspension de biomasse et de la solution calcifiante lors de l’injection du premier volume
de pore de cette dernière.
Ce phénomène de floc prend son origine auprès de 3 facteurs indissociables du procédé. Le
pH légèrement basique de la suspension de biomasse (8.5-9.5), l’A.E et la D.O. cellulaire. Ils
favorisent ensemble, la précipitation de carbonates de calcium amorphe (CCA). L’intensité de
ce processus de floculation dépend pour une grand part du niveau des activités enzymatiques
(A.E) et de la concentration de bactéries présente dans le sol injecté. Cet événement favorise
le lessivage et la redistribution de ces bactéries dans le système poreux et par conséquent
redéfinit le profil de bio-calcification. En effet, le floc produit un changement local de la
viscosité du fluide et augmente au fur et à mesure de son avancement dans la colonne. Ce
lessivage a été observé lors du suivi chimique des effluents mettant en évidence un
phénomène supplémentaire, le relargage cellulaire, c'est-à-dire la libération du contenu de la
cellule dans la solution calcifiante. Ceci apparait dès la mise en place du 2ème V.p de solution
calcifiante et est particulièrement important lorsque la suspension de biomasse est âgée. Cet
événement rend les effluents du procédé métastables du fait de la présence concomitante de
calcium, d’urée et de son catalyseur, l’uréase.

332
Conclusion

En conclusion, les performances de la bio calcification sont multifactorielles,

combinaison de facteurs physiques, chimiques et biologiques tels que la granulométrie des
grains de sable, leur rugosité, la vitesse d’injection des solutions, l’intensité des écoulements
préférentiels, la formation de flocs, l’âge, la concentration cellulaire, son l’activité
enzymatique et la granulométrie bactérienne… L’ensemble des interactions produisent
différents niveaux de bio calcification qui ont permis d’élabore un protocole d’injection pour
une application industrielle. Ce protocole intègre, lors de l’injection de la biomasse, une phase
d’immobilisation des fluides in situ pour réduit le pour accroitre l’accroche et réduire le
lessivage et une phase d’immobilisation après chaque injection de solution calcifiante pour
optimiser la précipitation.

Avec aux résultats obtenus, les perspectives de ce travail sont nombreuses .Pour se
rapprocher des conditions de chantier, il serait nécessaire d’étudier d’autres paramètres tels
que l’effet de température (12°C), l’effet du claquage, les grandes vitesses d’injection
(0.6m/h) auprès d’échantillons de prélèvement de sol potentiellement liqué[Link]
recherches pourront s’élargir également vers un travail sur de plus gros diamètres de
particules de sol car en dessous de la limite établie par le sable Correcteur, les injections de
suspension de biomasse sont très limitées.

Par ailleurs, le modèle en colonne, limite les interprétations, du fait d’un écoulement
orienté et focalisé par le faible diamètre. Ainsi, les contraintes spatiales de la colonne,
accentuent les défauts d’écoulements. Une propagation des écoulements sans contrainte
spatiale donnerait très probablement une autre image du profil bio calcification.

333
Bibiographie

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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349
Liste des abréviations

LISTE DES ABREVATIONS

ADN
ADP Acide désoxyribonucléique
A.E Adénosine diphosphate
A.E.S Activité enzymatique
A.E.T Activité enzymatique spécifique
A.E.L Activité enzymatique totale
ATP Activité enzymatique libre
BCAA Adénosine triphosphate ou acide adénylique triphophorique
Branched-chain amino acid ou Acides aminés chainés
CCA branchés (Leucine,isoleucine,valine)
CIPS Carbonate de calcium amorphe
C/N
COT Rapport carbone organique/azote organique/
CPS Carbone organique total
CV Capsule polysaccharidique
DIC Coefficient de variation
D.P Dissolved inorganic carbon
D.O. Degré de polymérisation
EPS Densité optique
GC% Exopolysscharides
GTP % de guanine et de cytosine
IAP Guanine tri- phosphate
NAD+, ou NADH
NADP+,NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide (oxydé, réduit)
Nicotinamide adénine dinucléotide-phosphate (oxydé,
NTK réduit)
M.O. Azote Kjedhal
MEB Matière organique
SI Microscope à balayage electronique
Indice de saturation
SBF Indice de sursaturation en carbonate
SBF CHIC Milieu de culture
SBF CHI VIT Milieu de culture
TAC Milieu de culture
UCS Titre d’alcalinétrique
V.p
Y.E Volume de pore
Extrait de levure

350
Liste des figures

LISTE DES FIGURES

CHAPITRE 1.
Figure n°1 : Ensemble des paramètres identifiés influençant la bio cimentation en
milieux poreux dans les conditions d’injection en colonne.
012

CHAPITRE II.
Figure n°2 : Les diverses origines des carbonates (d’après Castanier et al., 1997).
Figure n°3 : Les voies métaboliques bactériennes impliquées dans la carbonatogenèse 018
autotrophe (d’après Castanier et al., 1997).
Figure n°4 : Les voies métaboliques bactériennes impliquées dans la carbonatogenèse 020
hétérotrophe et dans le cycle de l’azote (d’après Castanier et al., 1997).
Figure n°5 : Les voies métaboliques bactériennes impliquées dans la carbonatogenèse 022
hétérotrophe et dans le cycle du soufre (d’après Castanier et al., 1997).
Figure n°6 : Position taxonomique de S. pasteurii d’après le Bergey’s manuel, 2004. 023
Figure n°7 : Les réactions de dégradation de l’urée chez S. pasteurii. 026
Figure n°8 : Schéma représentant les phases de maturation de l’uréase et son 031
fonctionnement dans la cellule chez S. pasteurii.
034

CHAPITRE III
Figures n°9 : Les granulométriques des quatre sables. 062
Figure n°9-2Les limites de pénétrabilité des coulis basées sur la perméabilité des
terrains (Cambefort, 1967).
Figure n°10 : Schéma d’ensemble d’une colonne (d’après Paradis, 2007) 064
Figure n°11 : Schéma du protocole de pluviation et vibration en immersion (d’après 066
Paradis, 2007).
Figure n°12 : Dispositif expérimental permettant de suivre l’injection et le dépôt de 068
biomasse
Figure n°13 : Représentation théorique de la fixation bactérienne à l’intérieur de la 076
colonne
Figure n°14 : Représentation du lessivage de la biomasse des colonnes n°1 et n°2, 076
montées en série, par l’injection de la solution calcifiante
Figure n°15 : Schéma d’une colonne dont est extrait l’échantillon destiné à la 077
compression verticale simple.
Figure n°16 : La force axiale appliquée à l’éprouvette en fonction de la déformation F 078
= f (∆h).
Figure n°17 : L’organigramme représentant les différentes étapes des tests 079
085
CHAPITRE IV
Figure n°18 : Les différents points abordés pour le développement d’une fenêtre
optimale pour l’obtention d’activité enzymatique spécifique 095
Figure n°19 : Comparaison des courbes de croissance avec (■) et sans
orthophosphate(♦) 97
Figure n°20 : Comparaison des activités enzymatiques obtenues en absence (♦) et en
présence(■) d’orthophosphate dans le milieu de culture 97
Figure n°21 : Activités enzymatiques obtenues au cours de la phase de ralentissement,
dans les différents milieux testés 100
Figure n°22 : Suivi des moyennes de la D.O cellulaire lues dans les quatre milieux
testés au cours de la phase de décélération 100

351
Liste des figures

Figure n°23 : Suivi des activités enzymatiques spécifiques (A.E.S) en fin de phase
exponentielle des quatre suspensions 102
Figure n°24 : Le suivi de l’activité enzymatique en fonction de la D.O cellulaire dans
les deux Erlenmeyers de150 ml (♦) et 500 ml (▲). 105
Figure n°25 : Les suivis des activités enzymatiques et des D.O cellulaires dans les
flacons de 150 ml ( ) et 500 ml ( ). 105
Figure n°26 : Suivi de la D.O cellulaire ( ), de la consommation en oxygène ( )
de la conductivité ( ) et du pH ( ) en fonction du temps 108
Figure n°27 : La conductivité en fonction de l’accroissement de la D.O cellulaire 110
Figure n°28 : Suivi des moyennes des D.O cellulaires et des activités enzymatiques
(A.E) en présence d’oxygène (D.O : et A.E ) et sans apport d’oxygène (D.O
et A.E ). 111
Figure n°29 : Les profils de production d’uréase à gauche et de D.O. cellulaire à
droite, en absence et en présence d’O2 113
Figure n°30 : Résultats des tests biochimiques de la galerie API 20 E à 24 heures 116
Figure n°31 : Suivis des croissances de S. pasteurii avec et sans chicorée. 120
Figure n°32 : Représentation de l’évolution d’un simplex en fonction des deux
variables de l’aération (débit et rpm) suivant l’activité enzymatique spécifique. 123
Figure n°33 : Suivi d’une culture de S. pasteurii CIP 66.21 en bio réacteur. Deux
zones ont été identifiées en pointillé. La première, circulaire, correspond au suivi du
taux de saturation en oxygène du milieu. L’encadrement rectangulaire concerne le
suivi de l’A.E.T, de la D.O. cellulaire. 125
Figure n°34 : Suivi d’une culture de biomasse, avec impact d’un refroidissement à 4°
C et de la réactivation (entre les flèches rouges : arrêt du bullage, la flèche bleue
correspond à la baisse de la température). 129
Figure n°35: Aspect de la biomasse en Erlenmeyer après un séjour à 4° C. 129
Figure n°36 : Suivi d’une culture de biomasse, puis effet de l’abaissement de
température et de la restauration des conditions initiales 130
Figure n°37 : Distribution des activités enzymatiques maximales en fonction de la D.O
cellulaire et représentation Bag plot de la tendance générale. 131
Figure n°38 : Les droites de Henry pour l’activité enzymatique à gauche et pour la
D.O cellulaire à droite. 132
Figure n°39 : Suivi de la production d’activité enzymatique et de la croissance
cellulaire durant la phase de ralentissement. 133
Figure n°40 : Les AE obtenues en fonction du nombre de repiquages. 134
Figure n°41 : Suivi de la D.O cellulaire correspondant aux activités enzymatiques
maximales au cours des repiquages successifs. 134
Figure n°42 : Suivi des activités enzymatiques en bleu et de la D.O cellulaire(en
rouge) d’un bio réacteur en condition de semi-batch 135
Figure n°43 : Suivi au cours du temps de l’effet d’un stress azoté sur la D.O cellulaire 136
Figure n°44 : Suivi au cours du temps de l’effet d’un stress azoté sur la production
d’uréase 137
Figure n°45 : Suivi de la concentration en N ammoniacal au cours du temps dans 3
milieux dilués 137
Figure n°46 : Suivi des teneurs moyennes en N ammoniacal après l’ajout de glutamate
ou d’arginine dans une suspension de S. pasteurii. 139
Figure n°47 : Suivi de la croissance cellulaire (à gauche) et des activités enzymatiques
(à droite) au cours de la phase de ralentissement. 140
Figure n°48 : Distribution des A.E.L en fonction de la D.O cellulaire.
Figure n°49 : Suivi de l’activité enzymatique dans les milieux de culture additionnés de
différentes sources d’azote en fonction du temps 142
Figure n°50 : Hiérarchisation de l’assimilation des acides aminés et la double fonction
des ions NH4+ chez S. pasteurii 151
Figure n°51 : Proposition d’un modèle de régulation de l’opéron uréase chez S.
pasteurii.
Figure n°52 : Fonctionnement du modèle de régulation de l’opéron uréase chez S. 152
pasteurii, proposé, durant la phase exponentielle de croissance.

352
Liste des figures

Figure n°53 : Fonctionnement du modèle de régulation de l’opéron uréase chez S.

pasteurii, proposé, durant la phase de ralentissement. 154

CHAPITRE V
Figure n°54 : Bio calcification périphérique d’une des deux colonnes qui ont été
injectées en continu aux vitesses de chantiers (photo n°1). La seconde colonne a été
totalement détruite (photo n°2 159
Figure n°55 : Photo n°1 : Aspect macroscopique d’une colonne sans bactérie (en haut)
et d’une colonne injectée avec les bactéries (en bas) après la révélation de la matière
organique. Photo n°2 : Aspect macroscopique des dépôts carbonatés d’une colonne
injectée en continu en condition de chantier avec recirculation de la solution
calcifiante durant 24 heures. 160
Figure n°56 : Partie supérieure d’une colonne dont l’écrasement a ouvert l’échantillon
162
en libérant des blocs de sable consolidés
Figure n°57 : Colonne de sable de Fontainebleau injectée avec un volume de pore
d’une solution colorée au bleu de méthylène. 163
Figure n°58 : Courbe « d’effort/déplacement » très hachée de la colonne n°7. 165
Figure n°59 : Photo 1 : De gauche à droite, la suspension de biomasse, trois tubes de
solution calcifiante (liquide translucide), le surnageant de la deuxième suspension de
biomasse. Photo 2 : Un exemple de floc dans une solution calcifiante avec une
suspension bactérienne. 167
Figure n°60 : La consolidation ne se réalise pas de manière uniforme, mais en doigts
de gant. 169
Figure n°61 : Exemple de nodules de sable consolidés présents dans les sections non
consolidées d’une colonne 169
Figure n°62 : Exemple caractéristique de courbes « effort/ déplacement », en dents de
scie, du haut (orange) et du bas de la colonne n°10. 169
Figure n°63 : Les courbes granulométriques des sables de Fontainebleau et
d’Itterbeck. 171
Figure n°64 : Les deux systèmes d’évacuation des effluents permettent de maintenir
deux niveaux de d’hydratation de la colonne. 173
Figure n°65 : Les courbes « effort/déplacement » des colonnes n°14 et12. 174
Figure n° 66 : Etude ultramicroscopique du sable de Fontainebleau et du sable
d’Itterbeck. 175
Figure n°67 : Les courbes « effort/déplacement » des colonnes n°16 et n°17. 176
Figure n°68 : Les courbes d’activité enzymatique de l’uréase pure pour des
concentrations en substrat de 0 à 1 M (graphique n°1) et de 0 à 0.06 M (graphique
n°2). Les représentations de Lineweaver-Plot pour la détermination des constantes
cinétiques1/V en fonction de 1/S (graphiques n°3 et 4). 179
Figure n°69 : Variation de la vitesse d’hydrolyse de l’urée en présence de différentes
concentrations de CaCl2. 180
Figure n°70 : Les précipités de carbonate de calcium obtenus avec 0.18 U (Photos n°1
et 2) et 0.54 U (Photos n°3 et 4) d’uréase pure après 10 minutes de contact. 181
Figure n°71 : Les suivis de l’hydrolyse de l’urée et la détermination des constantes
cinétiques (Km et Vmax) cellulaire de S. pasteurii. 182
Figure n°72 : L’activité enzymatique (A.E) en fonction de la D.O pour des suspensions
bactériennes en fin de phase exponentielle 182
Figure n°73 : L’hydrolyse de l’urée par l’uréase de S. pasteurii en présence de
diverses concentrations en Ca(NO3)2. 183
Figure n°74 : La variation des vitesses d’hydrolyse de l’urée pendant les 180
premières minutes 184
Figure n°75 : Suivi de l’hydrolyse de l’urée avec et sans agitation 185
Figure n°76 : Suivis de l’urée utilisée au cours du temps en fonction de la
concentration en calcium. 186
Figure n°77 : Les vitesses d’hydrolyse en fonction de la concentration en calcium, à
partir de 30 minutes et jusqu’à la fin de l’expérience 188
Figure n°78 : Présence simultanée de bactéries libres et de bactéries encroutées avec
une solution calcifiante 1 M. 189

353
Liste des figures

Figure n°79 : Les principaux paramètres contrôlant la synthèse et le maintien du pool

enzymatique 192
Figure n°80 : D.O. cellulaire fixée dans les colonnes à 12° C et 20° C au temps de
batch de 24 et 48 heures. La suspension « entrée» correspond à la D.O. de référence. 193
Figure n°81 : Maintien des activités enzymatiques dans les colonnes à 12° C et 20° C
après 24 et 48 heures 194
Figure n°82 : Maintien de l’activité enzymatique à 24 et 48 heures pour les colonnes
placées à12° C et à 20° C. 194

CHAPITRE VI
Figure n°83 : Estimation du taux de fixation de S. pasteurii en fonction de la durée de
batch en colonne de sable de Fontainebleau NE 34. 200
Figure n°84 : Estimation moyenne de la quantité d’activité enzymatique fixée dans les
colonnes de sable de Fontainebleau NE 34 testées pour 1 ou 2 V.p d’eau injecté. 201
Figure n°85 : A.E fixée en fonction de la durée de batch, après l’injection des deux V.p
d’eau déminéralisée dans des colonnes de sable de Fontainebleau NE 34. 202
Figure n°86 : Le sable de Fontainebleau NE 34 observé au M.E.B (S. Castanier et G.
Levrel). 203
Figure n°87 : La photo de gauche est une observation au microscope au grossissement
x 80 d’une suspension témoin sans agglutinat. La photo de droite est prise au
microscope au grossissement de x 50 d’une suspension de biomasse présentant un
début d’agglutination. Les cellules bactériennes se réunissent en des micro-agglutinats
de 4 à 6 cellules. 208
Figure n°88 : Les taux de fixation de S .pasteurii sur un sable de Fontainebleau brut,
en colonnes, après l’ajout de 4 ou 8 g/l de chicorée et de 10 mM de nitrate de calcium
dans la suspension bactérienne. 213
Figure n°89 : La fixation de S. pasteurii sur des grains de sable de Fontainebleau brut
(Images MEB réalisées par Mmes S. Castanier et [Link]). 214
Figure n°90 : Séquence numérotée de 1 à 6, de formation des cristaux de calcite. 216
Figure n°91 : Croissance cristalline en cours. Les flèches pleines montrent les dépôts
impliqués dans la formation du cristal. La flèche en pointillé pointe l’empreinte d’une
bactérie qui était partiellement piégée dans le cristal de carbonate de calcium.
216
Figure n°92 : Passage du cristal rhomboédrique unique à un amas (étapes 7 à 11),
images réalisées par S. Castanier et G. Levrel. 217
Figure n°93 : L’élongation des cristaux selon un seul axe. Images MEB de [Link]. 221
Figure n°94 : Deux courbes de résistance simple à la compression. La courbe n°1 a
été obtenue avec la solution calcifiante sans additif, la seconde lorsque 1 g/l de
chicorée lyophilisée a été ajouté. 224
Figure n°95 : Représentation des variations des Rc et des teneurs en CaCO3 en
présence de la chicorée (CHIC) ou en son absence de chicorée (sans CHIC) dans le
milieu calcifiant (12 colonnes). 225
Figure n°96 : Représentation des variations du rapport CaCO3/RC en fonction de la
présence (CHIC) ou de l’absence (sans CHIC) de chicorée dans la solution calcifiante 229
Figure n°97 : Illustrations de quelques cristaux de carbonate de calcium dont
l’élongation se réalise le long d’un axe (flèches pleines). Les amas de cristaux
enchevêtrés apparaissent moins nombreux (flèche en pointillée). Les flèches en
pointillée vertes en tirets montrent une zone de croissance cristalline avec sur cette
surface la présence de bactéries. 231
Figure n°98 : Les 13 premières colonnes de cette série sont découpées puis
débarrassées de leur enveloppe en PVC pour être enfin soumise à la compression non
confinée. Elles ont toutes un élancement de 2. 232
Figure n°99 : Représentation de la corrélation liant l’activité enzymatique (A.E) et la
densité optique (D.O). Les histogrammes montrent la distribution des observations en
fonction de la valeur de la D.O cellulaire (X) ou de l’A.E (Y). La courbe en rouge
figure une distribution théorique suivant la loi normale. Les courbes en pointillés
délimitent l’intervalle de confiance à 0.95. 233
Figure n°100 : Les D.O cellulaires des suspensions bactériennes avant injection
présentent dans le diagramme de Henry un nuage de points ne suivant pas totalement 233
une ligne droite.

354
Liste des figures

Figure n°101: Les activités enzymatiques (A.E) des suspensions bactériennes avant
injection, présentent dans le diagramme de Henry un nuage de points ne suivant pas
une droite. 233
Figure n°102 : Les A.E.S s‘écartent de la droite des valeurs normales théoriques. 233
Figure n°103 : Corrélations liant les variables (Rc/CaCO3) à droite et (Rc/DO) à
gauche. 234
Figure n°104 : Droite de Henry pour la variable teneur en carbonate de calcium.
L’histogramme présente la distribution du CaCO3. La courbe en rouge montre une
distribution suivant la loi normale. 235
Figure n°105 : Représentation en 3D de l’A.E (µS/min) en fonction du CaCO3 (g/cm3)
et du Rc (MPa) (Z = Distance pondérée des Moindres Carrés). 236
Figure n°106 : Représentation en 3 D, de la D.O cellulaire en fonction du CaCO3
(g/cm3) et du Rc (MPa) (Z = Distance pondérée des Moindres Carrés). 237
Figure n°107 : Résistances maximales moyennes atteintes lors des tests de
compression verticale simple en fonction de la source de calcium (sur 27 colonnes). 239
Figure n°108 : Courbe de tendance liant la résistance à la compression avec la teneur
en carbonate de calcium lorsque la source de calcium est le chlorure de calcium. 239
Figure n°109 : Absence de liaison entre la Rc et la teneur en CaCO3 en présence de
nitrate de calcium (linéaire : rouge, exponentielle : vert). Les courbes en pointillés
représentent l’intervalle de confiance de 0.95. 240
Figure n°110 : Représentations en bag plot de la distribution des résistances à la
Compression maximales (Rc) et de la teneur en CaCO3 en fonction de l’accroissement
des activités enzymatiques. Les graphiques du haut concernent de droite à gauche, les
Rc en fonction du chlorure de calcium et du nitrate de calcium.
Les deux graphiques du bas, mettent en relation la teneur en carbonate de calcium en
fonction de l’accroissement de l’A.E pour le CaCl2 à gauche et pour le Ca(NO3)2 à
droite. 241
Figure n°111 : Superposition pour chacun des sels de calcium des teneurs en CaCO3
et des valeurs de Rc en fonction de l’accroissement des activités enzymatiques. 242
Figure n°112 : Rapport (CaCO3/RC) par rapport à la nature du sel de calcium en
fonction de l’accroissement de l’A.E. 243
Figure n°113 : Distribution du taux de précipitation en fonction de l’accroissement de
l’activité enzymatique selon la nature du sel de calcium (CaCl2 à gauche) et Ca(NO3)2
(à droite) pour une solution calcifiante de 0.5 M et une durée totale de batch de 15
heures. 244
Figure n°114 : Rc en fonction des vitesses d’hydrolyse estimées pour le chlorure de
calcium. 246
Figure n°115 : Représentation en 3D de la vitesse d’hydrolyse (Hydrolyse urée (µM/min))
en fonction de la D.O. cellulaire et de l’efficacité du procédé (CaCO3/RC) lorsque le
calcium est sous forme de CaCl2. 247
Figure n°116 : Représentation en 3D de l’activité enzymatique injectée (A.E (µS/min)
en fonction du taux de précipitation (CaCO3 mesuré/CaCO3 théorique) et de
l’indicateur d’efficacité (CaCO3/RC) pour une source de calcium sous forme de CaCl2. 248
Figure n°117 : Représentation en 3D de la vitesse d’hydrolyse (Hydrolyse urée (µM/min))
en fonction de la D.O. cellulaire et de l’efficacité du procédé ((CaCO3/Rc) lorsque le
calcium est sous forme de Ca(NO3)2 250
Figure n°118 : Représentation en 3D de l’activité enzymatique injectée (A.E) (µS/min)
en fonction du taux de précipitation (CaCO3 mesuré/CaCO3 théorique) et de
l’indicateur d’efficacité (CaCO3/Rc) lorsque le calcium est sous forme de Ca(NO3)2.
Figure n°119 : Distribution des cristaux rhomboédriques, en fonction du niveau 250
de la colonne n°102 (S. Castanier et G. Levrel). 252
Figure n°120 : Courbes d’effort/déplacement, de la colonne n° 102 ayant reçu du
nitrate de calcium (gauche) et de la colonne n°104 injectée avec du chlorure de
calcium (droite). 252
Figure n°121 : Différence de taille entre les amas de cristaux rhomboédriques,
de la mi-hauteur et du bas de la colonne n°102 d’après S. Castanier et G. Levrel. 252
Figure n°122 : Comparaison de la porosité résiduelle et de l’organisation des cristaux
entre les trois niveaux de la colonne n°104. 253

355
Liste des figures

Figure n°123 : Comparaison entre les colonnes n°102 (Photos n°542 et 538) et n°104
(Photos n°586 et 585) pour les échantillons prélevés à mi-hauteur et au centre de la 253
colonne.

CHAPITRE VII
Figure n°124 : Représentation du montage en série des 3 colonnes de 0.2 m avec le
suivi de la densité optique au cours de l’injection de la biomasse et du premier volume 260
de pore de solution calcifiante.
Figure n°125 : Suspension de biomasse de forte A.E (1.5 mS/ml/min) englobée dans un
floc récupérée en sortie de colonne à la fin d’injection du 1er V.p de solution 262
calcifiante.
Figure n°126 : Estimation du taux de fixation moyen au cours de l’injection de la
suspension de biomasse dans 3 lots de 3 colonnes en série. 263
Figure n°127 : Résistances maximales à la compression simple en fonction de la
distance dans 2 lots de 3 colonnes en série. 264
Figure n°128 : Représentation des trois colonnes de la série n°1, dans lesquelles les
sections en orange correspondent aux sables cimentés et en gris foncé aux sables restés
meubles. 265
Figure n°129 : Répartition de l’estimation du taux de fixation de bactéries et des
valeurs de RC pour la série n°3 en fonction de la distance d’injection de la biomasse. 266
Figure n°130 : Bactérie enrobée dans une gangue de carbonate de calcium. Image
MEB (S. Castanier et G. Levrel,) 268
Figure n°131 : Les photos du haut (grossissement x 80, 1 graduation = 2.5 µm)
montrent les microsphères issues des colonnes au cours de l’injection de la solution
calcifiante. Les photos du bas montrent des ooïdes à partir d’un culot de suspension
bactérienne mis en présence d’une solution calcifiante pendant 8 jours. (Images MEB :
S. Castanier et G Levrel). 269
Figure n°132 : Surface d’un grain de sable de Fontainebleau avec de nombreuses
crevasses pouvant avoir jusqu’à 1 µm de largeur (Image MEB S. Castanier et G.
Levrel). 271
Figure n°133 : Deux cellules de S. pasteurii en fin de phase de division cellulaire (3.4
µm de long) posée sur un grain de sable avec différents flagelles provenant d’autres
bactéries voisines (flèches en pointillé rouge)(Image MEB S. Castanier et G. Levrel). 271
Figure n°134 : Estimation moyenne du taux de fixation (courbe bleue) au cours de
l’injection d’une suspension de biomasse et profil des Rc (courbe rouge), en fonction de
la distance du point d’injection. 273
Figure n°135 :
La teneur en CaCO3 (g/cm3) moyenne en fonction de la distance à partir des 2 séries
élaborées avec du sable Correcteur. 274
Figure n°136 :
Répartition moyenne du taux de fixation de la biomasse en fonction de la distance
obtenu après l’injection du 2ème V.p de solution calcifiante pour les deux séries.
Figure n°137 : Suivi de la DO cellulaire en sortie de colonne n°2 lors de l’injection du
1er V.p de solution calcifiante (série n°1). 275
Figure n°138 : Les sections inférieures des colonnes injectées sont marquées avec du
bleu de méthylène. A droite est présentée une coupe transversale de la section
inférieure de la colonne n°2. Les zones blanches correspondent aux zones de sable
cimentés. 276
Figure n°139 : Des morceaux de la colonne n° 1 de la série n°1 après écrasement par
compression simple. Les flèches pleines montrent des morceaux consolidés de sable.
Les flèches en pointillés bleus indiquent des zones de sable compactées mais non
consolidées. 278
Figure n°140 : Série de sections circulaires de sable consolidé qui se sont séparées
lors du démoulage d’une colonne compactée avec la méthode « pluviation et pilonnage. 279
Figure n°141 : Valeurs de Rc en fonction de la teneur en carbonate. Les ronds bleus
(○) correspondent au sable de Fontainebleau, tandis que le sable d’Itterbeck est des
triangles rouges (▲). La figure de droite est une représentation en bag plot. 281

356
Liste des figures

Figure n°142 : Profil des valeurs de Rc en fonction de la teneur en carbonate selon la

méthode de compactage du sable, à gauche méthode P&V et à droite méthode T&P. En
rond bleu (○), le sable de Fontainebleau, et en triangle rouge (▲) le sable d’Itterbeck. 282
Figure n°143 : Efficacité du procédé (CaCO3/Rc) en fonction de l’accroissement de la
D.O cellulaire selon le type de tassement du sable, (P&V à gauche) et (T&P à droite). 283
Figure n°144 : Efficacité du procédé (CaCO3/Rc) en fonction de l’accroissement de
l’A.E selon le type de tassement du sable (P&V à gauche) et (T&P à droite). 283
Figure n°145 : Rc en fonction de la teneur en carbonate de calcium. La courbe en
rouge (large pointillé) a été obtenue avec du nitrate de calcium 0.5 M, la courbe en
vert (en continu) avec du chlorure de calcium 0.5 M, la courbe en bleu (pointillé fin
avec du nitrate de calcium 0.83 M. 286
Figure n°146 : Moyennes des résistances maximales à la compression (Rc) en fonction
de la distance par rapport au point d’injection et du nombre de V.p de biomasse
injectés. 288
Figure n°147 : Moyennes des teneurs en carbonate de calcium en fonction du nombre
de V.p de biomasse injectés et de la distance 289
Figure n°148 : Vitesses moyennes d’hydrolyse de l’urée en fonction du nombre de V.p
de biomasse injectés et en fonction de la distance. 289
Figure n°149 : Rapport CaCO3/Rc en fonction du nombre de V.p de biomasse injectés
et en fonction de la distance d’injection. 290
Figure n°150 : Profil du rapport du nombre de cellules par gramme de sol mis en
place en fonction de la distance associé à l’estimation du profil de résistance sur 291
colonne de 0.4 m et sur colonnes en série n°3.
Figure n°151 : Trois images de S. pasteurii, de longueur approximative de 3.7 µm, 3.5 294
µm et de 9 µm (Images MEB : [Link] et G. Levrel).
Figure n°152 : Distribution de la taille de S. pasteurii (CIP 66.21) sans ultrason (à 296
gauche) et avec ultrason (à droite).
Figure n°153 : Granulométrie de la souche de S. pasteurii (DMSZ 33) courbe en rouge 296
sans ultrason et courbe en vert avec ultrasons.
Figure n°154 : Distribution de la taille de S. pasteurii souche DMSZ 33. 296
Figure n°155 : Observations au microscope photonique grossissement x80 (à gauche :
S. pasteurii souche CIP 66.21, à droite : S. pasteurii souche DSM 33). 297
Figure n°156 : Comparaison des courbes granulométriques de S. pasteurii CIP 66.21
(rouge) et DMS 33 (vert). 297
Figure n°157 : Paramètres primaires impliqués dans la formation du gradient de
résistance maximale en colonne de sable fin compacté lors de l’injection du 1er V.p
(suspension de biomasse). 299
Figure n°158 : Paramètres principaux secondaires impliqués dans la formation du
gradient de résistance maximale en colonne de sable fin compact. 299
Figure n°159 : Impact du vieillissement de la biomasse sur le procédé de bio
calcification. 300
Figure n°160 : Principales conséquences de l’apparition de flocs sur le processus
de bio calcification. 301
Figure n°161 : Critères d’injectabilité de S. pasteurii en colonne de sable fin
compacté. 303
Figure n°162 : Interactions des différents paramètres dans le processus de bio
calcification. 303
Figure n°163 : Evaluation de l’injectabilité d’une suspension de biomasse. 304
Figure n°164 : Evaluation de l’injectabilité d’un sol. 304
Figure n°165 : Arbre de décision pour l’exécution d’un procédé d’injection de bio
calcification en sable fin 305
Figure n°166 : L’encadrement en grisé correspond à la gamme de diamètres des
grains de sable testés dans cette étude. 306
CHAPITRE VIII
Figure n°167 : Modèle de colonne avec la sortie des effluents à la même hauteur que
l’entrée des fluides pour maintenir la colonne totalement hydratée au cours des
différentes injections. 309
Figure n°168 : Suivis des effluents (COT, TAC, D.O. cellulaire et A.E) en sortie de 314
colonne au cours des 6 injections et en fonction de la distance par rapport au point.

357
Liste des figures

Figure n°169 : Suivi des paramètres fortement associés à la biomasse

(la D.O. cellulaire, le TAC et le pH). 315
Figure n°170 : Les suivis des effluents (NH4+IANESCO, Ca et conductivité) en sortie
de colonne au cours des 6 injections et en fonction de la distance par rapport au point
d’injection. 316
Figure n°171 : Evolution de la teneur en carbonate de calcium et la de Rc en fonction
de la distance du point d’injection. 326

358
Liste des tableaux.

LISTE DES TABLEAUX

CHAPITRE 1.
15
Tableau n°1 : Les différents types de carbonates.

CHAPITRE II.
Tableau n° 2 : Récapitulatif des différentes constantes (Vmax et Km) issues des
activités enzymatiques de l’uréase chez S. pasteurii.*: activités enzymatiques
spécifiques en fonction de la D.O ND : non déterminé. 32
Tableau n°3 : Les mécanismes identifiés de la régulation de l’uréase dans le monde
microbien. 38

CHAPITRE II.

Tableau n°4 : Comparaison des principaux paramètres des coulis classiques et

bactériens.(cP = mPas : millipascal par seconde). 60
Tableau n°5 : Les caractéristiques principales d’un sol sableux considéré
susceptible de liquéfaction selon la norme NF 06-031. 61
Tableau n° 6 : Les caractéristiques granulométriques des quatre sables. 61
Tableau n°7 : Les perméabilités calculées pour l’état lâche et l’état dense pour les
quatre sables sélectionnés. 63
Tableau n°8 : Récapitulatif des estimations des diamètres de pore moyen pour la
détermination de l’injectabilité du coulis bactérien pour les quatre sables
sélectionnés. 65
Tableau n°9 : Le protocole expérimental. 67
Tableau n°10 : Exemple de fiche de synthèse des données techniques d’une colonne. 70
Tableau n°11 : Les modes de conservation et de culture des précultures pour S.
pasteurii. 71
Tableau n°12 : Les milieux de culture utilisés pour la production de biomasse et
d’enzyme. 72
Tableau n°13 : Les caractéristiques de la solution améliorant la fixation. 73
Tableau n°14 : Exemple de fiche regroupant les caractéristiques techniques de la
suspension bactérienne avant injection. 74
Tableau n°15: Exemple de fiche technique regroupant les caractéristiques de
la solution calcifiante. 74
Tableau n°16 : Exemple de fiche précisant la composition des solutions calcifiantes
améliorées. 75
Tableau n°17 : Synthèse des conditions chantiers définissant le protocole
d’injection en colonne. 75
Tableau n°18 : Exemple de fiche présentant les caractéristiques des essais
compressions. 79
Tableau n°19 : Exemple de fiche établie pour les dosages de CaCO3. 81
Tableau n°20 : Les analyses physico-chimiques pratiquées sur les effluents. 82
Tableau n°21 : Liste des paramètres complémentaires mesurés au Laboratoire de
Montereau. 83
Tableau n°22 : Les paramètres impliqués dans l’élaboration d’un protocole
d’injection. 86
Tableau n°23 : Les caractéristiques générales des colonnes injectées. 87
Tableau n°24 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer l’effet de la
quantité de biomasse. 88
Tableau n°25 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer l’impact du
taux de fixation de la biomasse. 88

359
Liste des tableaux.

Tableau n°26 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer le maintien

de l’activité enzymatique de la biomasse. 89
Tableau n°27 : Caractéristiques des colonnes injectées pour détermine la nature du
sel de calcium. 89
Tableau n°28 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer le rapport
urée/Ca. 89
Tableau n°29 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer l’effet du
mode de compactage. 90
Tableau n°30 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer la nature
chimique des effluents. 90
Tableau n°31 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer l’impact
des modalités d’injection. 90
Tableau n°32 : Caractéristiques des colonnes injectées pour déterminer l’effet de la
température. 90
Tableau n°33 : Caractéristiques des colonnes injectées pour étudier la formation
des cristaux de calcite.

CHAPITRE IV. 93

Tableau n°34 : Composition chimique de l’extrait de levure BD (Difco). 94

Tableau n°35 : Les deux niveaux testés pour les trois éléments entrant dans la
composition du milieu de culture. 95
Tableau n°36 : Influence de l’ajout de NaCl sur la croissance de S. pasteurii CIP
66-21.(CV : coefficient de variation) 98
Tableau n°37 : Les paramètres en absence et en présence d’orthophosphate. 99
Tableau n°38 : Composition des milieux de culture testés.
Tableau n°39 : Production d’activité enzymatique moyenne par heure obtenue 100
durant la fin de phase exponentielle.
Tableau n°40 : Composition des milieux de culture utilisés pour l’évaluation de
l’effet de l’ammonium sur la production d’enzyme. 102
Tableau n°41 : Résultats obtenus avec les différents milieux. 103
Tableau n°42 : Récapitulatif des caractéristiques des suspensions de biomasse. 104
Tableau n°43 : Récapitulatif des paramètres de suivi de milieu de production
de biomasses testées selon deux formes d’aération (Agitation ou Bullage). 107
Tableau n°44 : Récapitulatif des paramètres contrôlant la production de biomasses
en présence et en absence d’oxygène. 112
Tableau n°45 : Composition de l’extrait de levure en hydrates de carbone et acides
aminés libres et totaux d’après BD Bio-pharmaceutical production. 116
Tableau n°46 : Résultats des tests biochimiques des galeries API 20 E et API 50 CH
à 24 heures pour S. pasteurii CIP (66.21). 118
Tableau n°47 : Les activités enzymatiques et les D.O cellulaires obtenues avec
différentes quantités de chicorée dans le milieu de culture. 119
Tableau n°48 : Comparaison entre les résultats obtenus en bio réacteur et en
Erlenmeyers. 121
Tableau n°49 : Résultats des cultures de 1.5 l en bio réacteur à température de 25°
C pendant 24 heures. 123
Tableau n°50 : Les teneurs en oxygène dans six milieux de culture en Erlenmeyer,
mesurées au bout de 24 heures d’incubation. 128
Tableau n°51 : Distribution statistique des valeurs d’activité enzymatique
maximales et des DO cellulaires obtenues dans 76 essais de production de biomasse. 135
Tableau n°52 : Résultats obtenus durant la phase de ralentissement. 136
Tableau n°53 : Teneurs en acides aminés majeurs dans la composition du Bacto-
Casitone. 142
Tableau n°54 : Suivi des activités enzymatiques au bout de 24 heures dans un
milieu SBF avec et sans arginine. 146

360
Liste des tableaux.

Tableau n°55 : Récapitulatif des conditions propices observées à la production

d’enzyme en fonction des conditions nutritives (+ = teneurs élevées, - = teneurs
faibles)((+) = synthèse constitutive, (++) = synthèse induite, (-)= inhibition).
Tableau n°56 : Différentes combinaisons associant un facteur de transcription avec 147
les pools de carbone et d’azote, susceptibles d’intervenir dans la régulation de
l’enzyme.
Tableau n°57 : Influence des différents facteurs de transcription sur le profil 148
de production d’uréase
Tableau n°58 : Combinaison des couples de facteurs de transcription pour la 148
détermination du profil de production d’enzyme.
Tableau n°59 : Actions combinées des différents couples de facteurs de 149
transcription sur le profil de production d’uréase.
Tableau n°60 : Caractéristiques enzymatiques présentes chez S. pasteurii 149
et absente chez B. subtilis.
Tableau n°61 : Variation à 24 heures des A.E après ensemencement en milieu de 150
culture SBF-Chic-Vit avec une suspension ayant subi au préalable un stress azoté.
158
CHAPITRE V.
Tableau n°62 : Les paramètres impliqués dans l’élaboration d’un protocole
d’injection sur les colonnes de 20 cm.
Tableau n°63 : Les paramètres maintenus constants lors des essais. 160
Tableau n°64 : Les caractéristiques générales des colonnes de la série n°1 et leurs 160
résultats.
Tableau n°65 : Les conditions d’injection de la série n°2. 161
Tableau n°66 : Les paramètres du protocole d’injection de la série n°3. 164
Tableau n°67 : Résultats des essais réalisés pour l’identification des phénomènes de 167
floculation et leur conséquence
Tableau n°68 : Composition et notation du milieu utilisé (Y.E. :Yeast extract ou 171
Extrait de levure).
Tableau n°69 : Les activités enzymatiques du milieu de culture DSMZ modifié, 175
avec et sans bactérie.
Tableau n°70 : Caractéristiques des colonnes pour tester l’impact des flocs sur le 176
processus de bio calcification.
Tableau n°71 : Résultats des colonnes réalisées en mode continu. 177
Tableau n°72 : Résultats des expériences réalisées en conditions de chantier. 178
Tableau n°73: Evolution de l’activité enzymatique et des taux d’hydrolyse en 178
fonction de la concentration en nitrate de calcium à température ambiante sous
agitation, pendant la période de 0 à 180 min.
Tableau n°74 : Récapitulatif des vitesses d’hydrolyse de l’urée en fonction de la 188
concentration en calcium à température ambiante en condition statique et
dynamique pendant 30 à 240 min
Tableau n°75 : Les différentes conditions testées pour évaluer l’impact de la 191
solution calcifiante.
Tableau n°76: Récapitulatif des caractéristiques des colonnes. 194
197
CHAPITRE VI.
Tableau n°77 : Les caractéristiques des neuf colonnes permettant de quantifier
l’adhésion de S. pasteurii sur les grains de sable en fonction de la durée d’un batch. 204
Tableau n°78 : Indentification biochimique de S. pasteurii CIP 66.21. Le (+)
correspond à une assimilation du produit ou à la possession d’un caractère.
Tableau n°79 : Description de l’expérience n°1 205
Tableau n°80 : Normalisation des observations semi quantitatives de l’adhérence 211
bactérienne dans les flacons en verre.
212

361
Liste des tableaux.

Tableau n°81 : Résultats des observations après 3 heures de contact, sans et avec
agitation. 212
Tableau n°82 : Résultats des observations après 24 heures de contact, sans et avec
agitation. 213
Tableau n°83 : Description de l’expérience n°2. 214
Tableau n°84 : Résultat des observations après 3 heures de contact sans et avec
agitation, en présence de nitrate de calcium. 214
Tableau n°85 : Résultat des observations après 24 heures de contact sans et avec
agitation, en présence de nitrate de calcium. 215
Tableau n°86 : Répartition des additifs dans les essais d’amélioration de l’adhésion
en colonnes de sable de Fontainebleau. 216
Tableau n°87 : Récapitulatif des caractéristiques des colonnes et des conditions
d’injection. 216
Tableau n°88 : Caractéristiques des colonnes injectées pour l’étude
ultramicroscopique de l’adhésion des bactéries en présence d’additifs. 217
Tableau n° 89 : Caractéristiques des colonnes et du protocole d’injection pour
l’évaluation de la formation des cristaux. 219
Tableau n°90 : Caractéristiques des colonnes injectées avec une solution calcifiante
non équimolaire. 222
Tableau n°91 : Caractéristiques des colonnes témoins injectées avec une solution
calcifiante équimolaire. 223
Tableau n°92 : Les effets d’un excès d’urée dans la solution calcifiante sur les
résistances à la compression simple(Rc). 22 3
Tableau n°93 : Caractéristiques des colonnes mises en jeu pour tester l’impact de la
chicorée dans la solution calcifiante. 226
Tableau n°94 : Caractéristiques des colonnes pour le test de l’ajout de la matière
organique dans la solution calcifiante. 227
Tableau n°95 : Variation des paramètres biologiques des biomasses injectées
cultivées sans ou avec chicorée (CHIC). 228
Tableau n°96 : Comparaison entre les critères économiques et les contraintes
pratiques entre le nitrate de calcium et le chlorure de calcium (modifié d’après
Paradis, 2007). 231
Tableau n°97 : Résultats obtenus avec les 17 colonnes injectées avec soit du
chlorure de calcium, soit du nitrate de calcium. 233
Tableau n°98 : Les corrélations pour les 6 variables composées chacune de 27
observations. 234
Tableau n°99 : Description statistique des variables significatives de la bio
calcification. 235
Tableau n°100 : Test de normalité sur les 5 variables principales du procédé. 236
Tableau n°101 : Corrélations entre les 5 variables composées chacune de 27
observations, lorsque la source de calcium est le nitrate de calcium. Les corrélations
significatives sont marquées en rouge (avec p < 0.05). 240
Tableau n°102 : Corrélations entre les 5 variables composées chacune de 27
observations, lorsque la source de calcium est le chlorure calcium. Les corrélations
significatives sont marquées en rouge (avec p <0.05). 240
Tableau n°103 : Récapitulatif des résultats pour la résistance à la compression
(Rc,) de la teneur en carbonate de calcium et l’activité enzymatique (A.E), pour les
deux sels. 242
Tableau n°104 : Variations des rapports CaCO3/RC en fonction du sel de calcium et
des A.E injectées. 245
Tableau n°105 : Variations du taux de précipitation en fonction de la nature du sel
de calcium et de l’activité enzymatique injectée. 246
Tableau n°106 : Distribution des vitesses d’hydrolyse en fonction de la nature du
sel de calcium. 248
Tableau n°107 : Caractéristiques générales des colonnes destinées à l’observation
au MEB. 253
Tableau n°108 : Caractéristiques des colonnes soumises à une Bio calcification à
12° C. 259
Tableau n°109 : Coefficients granulométriques permettant le calcul de la
perméabilité à l’état lâche des sables utilisés dans les colonnes de ce test. 260

362
Liste des tableaux.

CHAPITRE VII.
Tableau n°110 : Caractéristiques des essais d’injections pour la détermination du
profil de bio calcification en fonction de la distance. 263
Tableau n°111 : Résistances maximales à la compression en fonction de la distance
du point d’injection pour les deux colonnes de 0.5 m. 263
Tableau n°112 : Caractéristiques des colonnes des trois séries (sable de
Fontainebleau brut). 264
Tableau n°113 : Les résultats bruts de Rc, de CaCO3 et du taux de fixation en
fonction de la distance dans 3 séries de colonnes en sable de Fontainebleau. 264
Tableau n°114 : Caractéristiques granulométriques des différents sables de
Fontainebleau.
Tableau n°115 : Récapitulatif des données issues de la série n°1. 266
Tableau n°116 : Identification de l’effet filtrant des trois types de sable de 269
Fontainebleau sur S. pasteurii à l’aide du rapport d sphère/d grain adapté.
Tableau n°117 : Caractéristiques des essais en colonnes faites avec du sable 272
Correcteur.
Tableau n°118 : Taux de fixation des bactéries, Rc et teneurs en CaCO3 en fonction 274
de la distance avec du sable de Fontainebleau Correcteur sur 3 colonnes en série.
Tableau n°119 : Données de valeurs de Rc et calculs de perméabilité à l’état lâche 275
pour la série n°1.
Tableau n°120. Caractéristiques des colonnes tests pour évaluer l’impact de la 277
méthode de compactage sur le sable de Fontainebleau Correcteur et résultats
obtenus.
Tableau n°121 : Caractéristiques granulométriques des fines en suspensions et des 280
niveaux de tortuosité pour le sable Correcteur.
Tableau n°122 : Les caractéristiques des colonnes et des conditions d’injection, 280
résultats obtenus.
Tableau n°123 : Récapitulatif statistique des résultats tout sable confondu des 282
valeurs de Rc et de la teneur en carbonate de calcium issu des tests de compactage.
Tableau n°124 : Evaluation et comparaison de l’effet de filtration mécanique du 282
sable selon dbactérie/dgrain pour une bactérie de dimension moyenne de 1.5 µm pour
deux sables fins.
Tableau n°125 : Caractérisation de courbes granulométriques de trois sables à 287
partir du coefficient granulométrique.
Tableau n°126 : Les caractéristiques des quatre colonnes injectées pour l’étude de 287
l’effet de biomasse et résultats.
Tableau n°127 : Les valeurs de Rc moyennées en fonction de la distance et du 289
nombre de V.p de biomasse.
Tableau n°128 : Les teneurs en carbonate de calcium en fonction de la distance et 289
du nombre de V.p de biomasse injectée.
Tableau n°129 : Distribution granulométrique de deux suspensions de biomasse de 290
S. pasteurii souche CIP 66.21.
Tableau n°130 : Identification de l’effet filtrant du sable fin sur une population de S. 296
pasteurii.
Tableau n°131 : Distribution d’une suspension, bactérienne de S. pasteurii, souche 296
DSMZ 33.
Tableau n°132 : Caractéristiques granulométriques d’une suspension de biomasse 297
mono spécifique DSMZ 33.
Tableau n°133 : Récapitulatif des impacts de la qualité de la biomasse sur le profil 297
de cimentation du sable fin sur colonne compactée.
Tableau n°134 : Récapitulatif des paramètres à évaluer avant des essais grandeur 302
nature de bio calcification.
304

363
Liste des tableaux.

CHAPITRE VIII.
Tableau n°135 : Caractéristiques de la colonne n°1. 310
Tableau n°136 : Récapitulatif des notations des volumes collectés en fonction
de leur disposition dans la colonne.
Tableau n°137 : Résultats des analyses faites au Laboratoire de Montereau, sur les 312
divers effluents de la colonne n°1.
Tableau n°138 : Résultats des analyses chimiques sur les effluents de la colonne 313
n°1, réalisées par IANESCO Chimie.
Tableau n°139 : Résultats des analyses faites au Laboratoire de Montereau, sur les 314
divers effluents de la colonne n°1.
Tableau n°140 : Suivi chimique de différents effluents de solution calcifiante 315
obtenus dans différentes colonnes (mélange : ensemble des 4 premiers effluents,
Cond. : conductivité).
Tableau n°141 : Suivi chimique de différents effluents de suspension bactérienne 319
obtenus dans différentes colonnes
Tableau n°142 : Influence de la durée de maturation de la solution calcifiante dans 319
la colonne sur les résultats des analyses chimiques.
Tableau n°143 : Les équations des tendances observées de résistance à la 320
compression(RC) et de teneur en carbonate de calcium en fonction de la distance
dans des colonnes de sable de Fontainebleau Correcteur 328

364
 Résumé Français

RESUME

Dans les pays à fort risque sismique, les fondations bâties sur un sous-sol trop meuble peuvent
avoir des conséquences désastreuses. En effet, dans certain cas, les mouvements sismiques provoquent
des tassements, en particulier lorsque les sous-sols granulaires sont saturés en eau. Ce phénomène dit de
liquéfaction ou perte de la résistance des sols, résulte de la montée de la pression interstitielle de l’eau
lorsque les vibrations sismiques tendent à tasser les grains les uns contre les autres. Pour éviter
l’effondrement des édifices, le génie civil renforce la résistance mécanique des terrains plus ou moins
perméables, en procédant à des injections de matériaux par le biais de forages.

Afin d’améliorer les procédés de consolidation des sols, une nouvelle technique compte
apporter une réponse en utilisant des cristaux de carbonate de calcium précipités in situ par voie
microbiologique.
La précipitation bactérienne du carbonate de calcium peut s’accomplir par l’hydrolyse de
l’urée, via l’enzyme uréase. Ceci conduit à l’alcalinisation du micro environnement, permettant la
précipitation d’ions carbonates en présence d’ions calcium. Sporosarcina pasteurii a été choisi car c’est
un micro-organisme alcalinophile, non pathogène et détenteur de concentration intracellulaire élevée en
uréase. L’objectif était d’utiliser industriellement ce micro-organisme pour son pouvoir calcifiant, afin
d’améliorer la cohésion des grains de sol, en milieu saturé, sans en obturer la porosité.

Trois axes de recherche menés conjointement, ont été définis pour ce travail de pré-
industrialisation du procédé de bio consolidation in situ.

Le premier axe a été l’obtention d’un milieu de production de biomasse, industriel, permettant
de stabiliser l’accession aux fortes activités enzymatiques. Cette étape est indispensable du fait des
exigences d’application du procédé sur le chantier, éloignées des conditions physiologiques de la
bactérie S. pasteurii. Il a été vital de décoder les modalités et la composition d’un milieu de culture
industriel propre à favoriser la production de S. pasteurii et d’uréase. Ce travail a établi les principaux
paramètres de suivi de culture et leur signification physiologique. Il a permis d’étudier la régulation de la
synthèse de l’enzyme uréase et de proposer un modèle de régulation chez S. pasteurii.

Le second aspect de recherche s’est attaché à créer une solution calcifiante à partir d’un
mélange d’urée et de sel de calcium. Des colonnes de sable fin ont été utilisées pour évaluer l’impact,
sur la bio calcification, de deux sources de sel de calcium, le nitrate et le chlorure de calcium. Les
résultats mettent en avant, l’existence d’une réduction de la vitesse d’hydrolyse en présence d’ion
calcium et l’absence de différence significative de résistance à la compression (RC) entre les deux sels.
D’autre part, lorsque les activités enzymatiques d’hydrolyse sont moindres, le processus de bio
calcification, paraît plus stable et efficace. De nombreuses images au microscope électronique à
balayage (MEB) ont confirmé ces résultats. Enfin, une amélioration du procédé vient de la proposition
d’une solution calcifiante, additionnée de très faibles quantités de matière organique, afin de favoriser
l’élongation des cristaux de carbonate de calcium dans les zones inter-granulaires.

Le troisième axe a été la mise en place pour une application en chantier, d’un protocole
d’injection en colonne de sable fin d’une suspension de biomasse suivie d’une solution calcifiante. Ces
travaux ont permis d’identifier, une corrélation entre les zones de dépôt de biomasse et les portions de
sable consolidés, ainsi que les principaux facteurs responsables de l’hétérogénéité de la bio calcification.
La densité cellulaire et la granulométrie bactérienne définissent par filtration mécanique et physico-
chimique un premier profil de distribution de la biomasse en milieu poreux. En fonction du niveau
d’activité enzymatique et de la qualité de la suspension bactérienne injectée, la solution calcifiante
interagit en précipitant sous forme de flocs et en amenant un changement local de viscosité. Pendant
l’injection, l’écoulement des fluides redéfinit le premier profil de biomasse par un lessivage au sein du
système poreux. La granulométrie du sable et la vitesse d’injection influencent également le lessivage.
Grâce à ces travaux, l’hétérogénéité de la bio-calcification a été diminuée en intégrant dans le protocole
d’injection, des temps d’arrêt d’injection pour l’immobilisation des fluides.

365
Résumé anglais

SUMMARY

In countries with high seismic risk, foundations built on too loose a basement can lead to
disastrous consequences. Indeed, in some cases, the seismic movements cause subsidence, particularly
when the sub-granular soils are saturated with water. This loss of strength of the soil, a phenomenon
called liquefaction, is due to from the increase of the interstitial water pressure when seismic
vibrations tend to pack the grains against each other. To avoid the collapse of buildings, civil
engineering techniques reinforce the strength of more permeable soils by drilling and making
injections of appropriatematerials.

To improve the processes of land consolidation, a new technique has been proposed using
crystals of calcium carbonate precipitated microbiologically in situ.

Bacterial precipitation of calcium carbonate can be accomplished by hydrolysis of urea, using the
enzyme urease. This leads to alkalinization of the microenvironment, allowing the precipitation of
carbonate ions in the presence of calcium ions. Sporosarcina pasteurii was chosen because it is a
alkaline micro-organism, non-pathogenic and with high levels of intracellular urease. The objective is
to develop an industrial process based on the calcifying power of this micro-organism to improve the
cohesion of the grains of soil, without plugging theporosity.

Three areas of research, conducted in parallel, were identified for this pre-industrialization
phase of the process of bio-consolidation in situ.

The first priority was to obtain an industrial biomass production with a consistent level of high
enzymatic activity. This step is essential because of the constraints of the implementation of the
process on site, far from the ideal physiological conditions for the bacterium S. pasteurii. It is vital to
decode the modalities and composition of an industrial culture medium for optimising the production
of S. pasteurii and urease. This work has established the main parameters for monitoring culture
growth and their physiological significance. It has helped to study the regulation of the synthesis of the
enzyme urease and to propose a regulatory model in S. pasteurii.

The second aspect of research is to create a calcifying solution from a mixture of urea and
calcium salt. Columns of sand were used to assess the impact on bio-calcification of two different
types of calcium salt, calcium nitrate and calcium chloride. The results show a reduction in the rate of
hydrolysis in the presence of calcium ion and no significant difference in resistance to compression
(RC) between the two salts. On the other hand, when the enzyme hydrolysis is lower, the process of
bio-calcification seems more stable and effective. Images from a scanning electron microscope (SEM)
confirmed these results. Finally, an improved process is proposed for a calcifying solution including
small amounts of organic material in order to promote the elongation of the crystals of calcium
carbonate in the inter-granular zones.

The third axis was the development of a protocol for industrial site use, involving the injection
into a column of fine sand of a biomass suspension followed by a calcifying solution. This work has
first identified a correlation between the biomass deposition zones and stretches of consolidated sand,
and has also shown the main factors responsible for the heterogeneity of bio-calcification. The initial
distribution of biomass in porous media is due to filtration, both chemical and mechanical which is
influenced by cell density and bacterial [Link] on the level of enzyme activity and the quality
of the bacterial suspension the calcifying solution precipitates into flocs producing local changes in
viscosity. During the fluid injection the first profile of biomass is redefined by a leaching-out of the
porous system. The sand grain size and speed of injection also influence leaching. This study has
allowed a better understanding of these phenomena. The heterogeneity of bio-calcification was
reduced by incorporating temporary immobilization of the fluids into the injection protocol.

366