LES MILIEUX DE CULTURE EN BACTÉRIOLOGIE
1- Définition :
Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des micro-organismes peuvent se
multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme étudié ce qui implique :
- couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance, apporter la source de carbone et
dénergie ;
- présenter un pH voisin du pH optimal ;
- présenter une force ionique optimale (le milieu peut être isotonique mais ce nest pas obligatoire).
2- Les différents types de milieux :
Il existe une grande variété de milieux de culture en rapport avec la diversité des exigences nutritives
des micro-organismes. On distingue généralement :
- les milieux synthétique
- les milieux empirique
a. Milieux synthétique :
Sont des milieux dont la composition chimique n’est pas bien définie, l’exemple le plus simple et celui du
bouillon nutritif , qui comprend de l’extrait de viande de bœuf, de la peptone, du chlorure de sodium et
de l’eau. Ce milieu permet la préparation des autres milieux. Autrement dit ; ils sont de composition
exactement connue, qualitativement et quantativement. Ces milieux sont surtout utilisés pour létude
des bactéries autotrophes ou pour étudier les besoins nutritifs dun germe. Ils sont rarement utilisés en
routine à lexception de quelques uns : Citrate de Simons, Citrate de Christensen, Urée-Tryptophane...
b. Les milieux empiriques :
Sont des milieux dont la composition chimique n’est pas bien définie, l’exemple le plus simple et celui du
bouillon nutritif , qui comprend de l’extrait de viande de bœuf, de la peptone, du chlorure de sodium et
de l’eau. Ce milieu permet la préparation des autres milieux. Autrement dit qu'ils sont de composition
exactement connue, qualitativement et quantativement. Ces milieux sont surtout utilisés pour létude
des bactéries autotrophes ou pour étudier les besoins nutritifs dun germe. Ils sont rarement utilisés en
routine à lexception de quelques uns : Citrate de Simons, Citrate de Christensen, Urée-Tryptophane
Les milieux empiriques de composition connue seulement avec approximation car dépendant des
matières premières utilisées : extrait de viande ou de levure, peptones, sucres et éventuellement
liquides biologiques (sérum, sang) mais qui conviennent aux micro-organismes étudiés. Ce sont
les milieux les plus employés aujourdhui. Exemple : LB, Columbia, Gassner, Tryptycase soja, Chocolat, ...
* REMARQUE :
Il y les milieux sélectifs et d'enrichissements.
• Sur les milieux non sélectifs :
On regroupe sous ce vocable tous les milieux ne contenant aucune molécule inhibitrice. Ils sont en
général de préparation assez simple et généralement peu coûteux. Ces milieux contiennent une base
nutritive constituée de molécules azotées (acides aminés, facteurs de croissance diverses) provenant de
lhydrolyse de produit dorigine vivante (animale, végétale, mycélienne) comme les peptones, les extraits
de viande ou de levure.
Souvent, les milieux non sélectifs comportent une molécule et son système de révélation (sucre le plus
souvent) ce qui permet une première discrimination des genres mais ce nest pas obligatoire.
Exemple : La gélose Mueller-Hinton
Infusion de viande de buf 300 ml.L-1
Peptone de caséine 17.5 g.L-1
Amidon de maïs 1.5 g.L-1
Agar 17 g.L-1
Ce milieu riche est la gélose de référence pour la réalisation dantibiogramme selon la méthode de Kirby-
Bauer. Sa composition (notamment la concentration en magnésium, en calcium, en thymine et en
thymidine), son épaisseur sont standardisées (norme standards M6-P du NCCLS). Il permet la pousse de
nombreux micro-organismes.
• Sur les milieux non sélectifs enrichis :
Ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des liquides ou suspensions riches en
molécules organiques diverses : du sang, du sérum, du liquide dascite, de lextrait globulaire, des
suppléments polyvitaminiques Les qualités nutritives peuvent être améliorées par dénaturation
thermique
des
constituants, en particulier pour le sang. Ils permettent la pousse de nombreux germes exigeants ou très
exigeants. Les plus utilisées sont les géloses au sang frais ou au sang cuit, et la gélose chocolat.
Exemple : Les géloses au sang frais et chocolat
Laddition de sang au milieu de base peut avoir plusieurs buts :
- apporter des facteurs de croissance nécessaire au micro-organisme étudié
- neutraliser certains inhibiteurs contenus dans les petones des milieux
- neutraliser, du fait de laction peroxydasique et catalasique de lhémoglobine, des ions superoxydes ou
des peroxydes toxiques produits par le micro-organisme (intéressant en particulier pour les bactéries
catalase comme les Streptococcaceae)
Par ailleurs, il permet la lecture dun caractère important lors de la détermination du germe : lhémolyse.
Le sang peut être dorigines diverses : cheval, mouton, lapin, homme, buf (attention certains germes
présentent un type dhémolyse sur un sang et un autre type dhémolyse avec un autre sang). Il est à
ajouter à raison de 5 à 10% au milieu de base (Columbia, Tryptycase soja, Mueller Hinton, cur cervelle).
Celui-ci ne doit pas contenir de glucose, car il inhibe les hémolysines.
Gélose au sang Gélose Chocolat
• Sur les milieux sélectifs :
Les milieux sélectifs sont des milieux empêchant la culture de certains micro-organismes. Ils sont utilisés
pour lisolement bactérien dans des produits polymicrobiens. La sélection peut être chimique ou
antibiotique. Ce sont des milieux riches ou non et donnant souvent un ou plusieurs caractères
biochimiques dorientations permettant une identification plus simple des germes.
La gélose Gassner
La gélose de Gassner est une gélose sélective des germes Gram négatifs non exigeants
(Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pseudomonaceae, Alcaligenaceae) Son activité sélective est due au
Jaune métachrome. Par ailleurs, il contient du lactose et du Bleu à leau (indicateur pH) qui permettent
de différencier les germes LACTOSE + (bleu) des germes LACTOSE (jaune).
Il
existe de nombreux milieux ayant le même pouvoir sélectif que la
Gélose de Gassner. Certain utilise les même indicateurs dautre non. On peut citer la gélose rouge
neutre/vert brillant, la gélose MacConkey, le milieu de Lévine ect...
• Sur les milieux d'enrichissement :
La présence de certaines bactéries à pouvoir pathogène spécifique dans un prélèvement, a une
signification pathologique indiscutable, même si elles sont peu représentées. Cest le cas par exemple
des Salmonella, des biotypes entéropathogènes, de Yersinia enterocolitica, des vibrions cholériques ou
encore des Listeria ou des Enterocoques. Quelques fois, leur proportion peut être minime par rapport à
celle de la flore commensale et leur présence ne peut être révélée par un isolement (sélectif). Labsence
de colonies suspectes sur lisolement sélectif ne suffit pas pour affirmer labsence de ces bactéries dans le
prélèvement. Cest pourquoi un enrichissement est mis en route en même temps que lisolement
(sélectif).
Enrichir, cest augmenter la représentation (proportion) dun sous-groupe de micro-organismes dans un
ensemble plus vaste.
Un milieu denrichissement réunit deux caractéristiques :
- il contient des molécules à action sélective inhibant totalement ou partiellement la culture des
micro-organismes non recherchés ou utilise une température dincubation particulière, ou encore une
atmosphére particulière ;
- il est liquide (bouillon) afin que son action sélective sexerce sur une population importante et
homogène.
N.B :
Milieux sélectifs et d'enregistrement sont des milieux solides pour les premiers et liquides pour les
seconds, en pratique médicale ces milieux sont utilisés pour favoriser la croissance des microorganismes
pathogènes aux dépend des espèces saprophiles, fréquemment présentes dans les produits soumis à
l’analyse. Pour sélectionner l’agent responsable de la maladie, on à recours à des agents sélectifs ou des
antibiotiques. Exemple le chlorure de sodium à la concentration de 7,5% permet la croissance des
staphylocoques, l’azide de sodium inhibe la croissance de tous les bacilles à Gram positif et enrichit la
culture des streptocoques fécaux, le milieu liquide au sélénite de sodium s’oppose au développement
des bactéries a Gram positif et favorise celui de Salmonella dans les coprocultures.
La gélose ordinaire additionnée de 5% de sang (mouton ou cheval) permet la croissance des
streptocoques. Cette gélose au sang peut être sélective par addition d’aminosides pour favoriser par
exemple l’isolement du streptocoque bêta hémolytique du groupe A à partir de la gorge et ce de
Stretococcus agalactiae à partir des prélèvements vaginaux.
La gélose au sang cuit ou gélose chocolat permet la croissance des bactéries plus exigeantes comme
Haemophilus inflenzae qui exige le facteur V (nicotinamide) et le facteur x( hémine ).