TECHNIQUES ASEPTIQUES
Buts
Connatre les rgles de scurit au laboratoire de microbiologie, Se familiariser avec le matriel utilis au laboratoire de microbiologie S'initier aux techniques aseptiques
Matriel
Glose nutritive en Ptri couvillons striles Saline strile Brleur Bouillon strile Crayon gras couvillons non striles Saline non strile Anse de platine Dsinfectant
La microbiologie au laboratoire
L'lve en soins prhospitaliers devra tre particulirement conscient de l'existence des microorganismes et de l'importance de les contrler pour viter une contamination toujours possible de lui-mme ou de son patient. Que ce soit au laboratoire de microbiologie ou dans le cadre de sa future profession, la manipulation des microorganismes lui demandera des techniques spciales dont le but sera toujours de prvenir la contamination de sa personne, des autres ou de ses cultures. Au laboratoire de microbiologie de mme qu'en milieu hospitalier ou lors de votre travail prhospitalier, il y a parfois prsence de fortes concentrations de microorganismes. Ceux-ci doivent tre considrs comme potentiellement dangereux. Afin dviter les risques de contaminations, on doit suivre rigoureusement certaines rgles de scurit. Nettoyer les surfaces de travail avec un dsinfectant adquat avant et aprs toutes manipulations. Se laver les mains avant et aprs toutes manipulations. Ne placer sur laire de travail que le matriel ncessaire Disposer le matriel sur laire de travail de manire tre le plus l'aise possible pour manipuler. Bien connatre lensemble des tapes avant de commencer les manipulations.
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Porter un sarrau boutonn ou blouse afin d'viter de contaminer les vtements. Ne jamais manger ou boire. Nettoyer et dsinfecter rapidement tout dgt sur laire de travail.
Vous devrez appliquer ces rgles toutes les sances de laboratoire.
Le matriel Dans les laboratoires de microbiologie, nous devons utiliser divers instruments permettant d'observer et de manipuler les micro-organismes d'une faon scuritaire. La petitesse de ces formes de vie de mme que leur pouvoir potentiellement pathogne, pour certaines espces, expliquent l'utilisation d'un matriel spcialis. Voici une liste non exhaustive du matriel pouvant tre utilis, microscope, anse de platine, couvillon, dsinfectant, autoclave, tuve, Pour isoler, identifier ou conserver les bactries, il est ncessaire de les faire crotre et reproduire dans des conditions optimales. Les milieux de culture contiennent tous les lments qui permettront une croissance normale des bactries. Ces lments sont de diffrentes natures, des mtabolites nergtiques, des facteurs de croissance, des facteurs de dpart et des ions minraux essentiels. Les milieux de culture peuvent tre liquides, sous forme de bouillon, ou solides, sous forme de glose. Le milieu de culture liquide de base contient des extraits de viande de buf (bouillon de buf). Pour les milieux solides, on ajoute au milieu liquide une glatine extraite d'une algue et qui porte le nom d'agar. ces milieux on pourra aussi ajouter divers lments. Certains permettront de cultiver des espces ou groupes bactriens ayant des exigences diffrentes. Dautres lments quant eux permettront de slectionner et/ou didentifier des espces prcises. Il est important de savoir que lorsqu'on ensemence des bactries sur un milieu solide (une glose), celles-ci vont se multiplier et former une petite masse visible qui porte le nom de colonie bactrienne. Une colonie bactrienne est donc constitue d'un nombre trs lev de bactries, c'est en fait une population homogne de mme nature.
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Vous devrez identifier et connatre les fonctions du matriel prsent et qui est couramment utilis dans un laboratoire de microbiologie. Pour ce faire, suite la prsentation par le professeur du matriel, tentez dassocier le nom la bonne fonction et linstrument. Noms :
Microscope, Bote de Ptri, Autoclave, tuve, couvillon, Glose en Ptri, Dsinfectant, Anse de platine Culture en bouillon,
Fonctions :
a) d) c) d) e) f) g) h) i) Appareil d'optique permettant l'observation des microorganismes. Instrument servant ensemencer des microorganismes sur un milieu de culture. Instrument servant prlever des chantillons. Contenant servant recevoir un milieu de culture solide base d'agar (glose). Milieu liquide servant au dveloppement des microorganismes. Produit chimique antimicrobien utilis pour le nettoyage des objets ou des surfaces. Appareil servant la strilisation des milieux de culture et des instruments. Bote contenant un milieu solide permettant le dveloppement des microorganismes. Appareil servant la croissance des cultures des tempratures adquates.
Instruments : Voir le numro appos sur lappareil. Inscrire les rsultats dans le tableau suivant. Noms Microscope Autoclave Anse de platine Culture en bouillon Dsinfectant couvillon Glose en Ptri tuve Bote de Ptri Fonctions Instruments
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Les techniques d'asepsie
En milieu prhospitalier, lapplication des rgles dasepsie est trs importante. Par une mauvaise technique aseptique, on risque de se contaminer et de contaminer les patients ou toutes autres personnes avec qui on aura un contact. Dans le laboratoire de microbiologie, des rgles dasepsie similaires sont applicables en plus de rgles spcifiques aux diffrentes techniques employes. Afin dviter les contaminations il est important de toujours tre conscient(e) que les bactries sont prsentes partout au niveau de notre environnement (air, objet, peau, etc.) et qu'elles risquent de venir contaminer notre espace de travail tout moment. Pour viter que des microorganismes indsirables viennent contaminer notre surface de travail, il faut travailler de faon aseptique. Cela suppose que vous devez respecter scrupuleusement les rgles suivantes : Tous les instruments de travail doivent tre striliss Avant et aprs les manipulations, le matriel doit tre striliser et la surface de travail dsinfecter.
Associez le terme la dfinition approprie : 1- Dsinfection 2- Strilisation 3- Antisepsie
4- Asepsie
a) C'est une mthode pour inhiber la croissance et la multiplication des bactries. Les diffrences entre la dsinfection et l'antisepsie sont troitement lies la concentration de la substance en question. b) Cest labsence de bactries vivantes. La technique aseptique consiste viter la contamination du malade et des objets. c) C'est une mthode pour tuer les microbes pathognes sur des objets. Les agents chimiques utiliss pour la dsinfection sont dits dsinfectant. d) C'est une mthode pour dtruire tous les microbes pathognes et non pathognes, vgtatifs et sporuls.
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Pour appliquer la technique aseptique sur les instruments, surface et sur le patient, il est important de connatre les diffrentes possibilits. Pour rendre aseptique tous les objets rsistant la temprature leve et l'humidit, on utilise lautoclave pour la strilisation. Les objets striliss sont placs dans un systme ferm. En utilisant la pression de vapeur, la temprature peut tre denviron 121C Le temps de strilisation dure gnralement entre 15 et 20 minutes. Dans ce cas-l, tous les micro-organismes peuvent tre tus. Lbullition, dans leau 100C pendant 5 10 minutes, peut aussi tre utilise pour striliser. Cependant, elle possde des limites car certains microorganismes (bactries sporules) ne sont pas dtruits par cette mthode. Il est aussi possible, en cas durgence, dutiliser lincinration pour les instruments mtallique. Les rayons ultraviolets peuvent tre utiliss pour les instruments ou surface qui ne peuvent tre soumis la chaleur ou au liquide. Ces rayons peuvent rduire de la flore microbienne. Pour certaines surfaces ou instruments, la strilisation est impossible alors lantisepsie est employe. Lalcool est un agent antiseptique, lthanol et l'isopropanol sont les plus actifs. Cependant il est important de savoir que la prsence deau est ncessaire son action et sa rapidit daction. L'alcool absolu est peu actif, on utilise alors de l'alcool 70% Les drivs iods (teinture diode, alcool iod, lugol ou composs iodophores) sont aussi utiliss comme antiseptique. La teinture diode 5% et lalcool iod 1% sont des solutions alcooliques, alors que le lugol est une solution aqueuse diode. Les composs appels iodophores nont pas les inconvnients des solutions aqueuses ou alcooliques. Ils ne brlent pas et ne tachent pas, ils demandent cependant un temps dapplication denviron 5 minutes pour tre efficaces, contrairement au solution alcoolique ou aqueuse.
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Exprimentation
Afin de visualiser limportance de la technique aseptique, vous allez faire les manipulations suivantes, une premire srie sans technique aseptique et une seconde en utilisant la technique. Technique non aseptique 123456Identifier la glose sur la portion contenant le milieu de culture. Placer la glose, couvercle en haut, sur la surface de travail. Prendre un couvillon non strile et le mouiller avec la solution saline non strile Ouvrir la bote de Ptri Dposer lcouvillon sur la glose et faire un mouvement de va et vient. Fermer la bote de Ptri
Technique aseptique 123456789Laver les mains Laver la surface de travail avec le dsinfectant Identifier la glose sur la portion contenant le milieu de culture. Placer la glose, couvercle en haut, sur la surface de travail. Prendre un couvillon strile et le mouiller avec la solution saline strile Entrouvrir la bote de Ptri Dposer lcouvillon sur la glose et faire un mouvement de va et vient. Fermer la bote de Ptri Laver la surface de travail avec le dsinfectant
Rsultats Les rsultats sont observs au laboratoire suivant. Vrifier labsence de croissance des bactries, prouvant lapplication dune bonne technique aseptique.
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Ensemencement dune glose La technique densemencement est utilise pour faire ltude des bactries. Elle consiste taler des bactries sur un milieu de culture solide (glose) afin de les faire crotre. On peut appliquer cette technique avec des chantillons varis, bouillon, plaie, etc. Aprs une dmonstration effectue par le professeur, vous pratiquez la technique aseptique densemencement. Il est trs important que chacune et chacun d'entre vous, se familiarise avec cette manipulation, car vous aurez l'employer durant la session. 1234567891011121314151617181920Laver les mains et la surface de travail avec le dsinfectant Disposer sur laire de travail tout le matriel ncessaire en prenant soin dtre laise pour travailler et allumer le brleur Identifier la glose sur la portion contenant le milieu de culture. Placer la glose, couvercle en haut, sur la surface de travail. Prendre lanse de platine et la striliser en la passant dans la flamme De la mme main qui tient lanse, avec le petit doigt, ouvrir le tube de bouillon, plac dans la main oppose. Striliser louverture du tube la flamme Insrer lanse de platine dans le tube (il nest pas ncessaire de voir du liquide dans lorifice). Striliser de nouveau louverture du tube la flamme et le refermer. Entrouvrir la glose et y introduire jusqu loppos de louverture, lanse de platine, sans toucher au bord de la bote Dposer lanse sur la glose et faire un mouvement de va et vient. Retirer lanse et refermer la bote de Ptri. Tourner dun quart de tour la bote de Ptri. Entrouvrir la bote de Ptri de nouveau et y introduire lanse de platine sans toucher au bord de la bote. Dposer lanse sur lextrmit de ltalement prcdent et refaire un mouvement de va et vient. Retirer lanse et refermer la bote de Ptri. Rpter deux autres fois et terminer le mouvement de va et vient plus large vers le centre de la glose. Retirer lanse et refermer la bote de Ptri. Retourner la bote de Ptri couvercle sur la table. Placer la bote de Ptri dans ltuve 37C pour 24 heures. Elles y resteront pendant environ 24 heures pour permettre le dveloppement des microorganismes. Elles sont ensuite places dans le rfrigrateur pour ralentir leur dveloppement jusqu' la prochaine sance de travaux pratiques.
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Rsultats Les rsultats sont observs au laboratoire suivant. Vrifier la croissance des bactries. Un bon ensemencement partir dune glose strile et dun bouillon de culture pur donne un talement contenant quune seule forme, couleur et grosseur de colonies bactriennes. Avez-vous fait un bon ensemencement selon la technique aseptique?
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