Contrôle qualité microbiologique
I. Evaluer l’efficacité des conservateurs antimicrobiens dans
les produits :
Importants pour les :
- Préparation aqueuses
- Produits multidoses
Principe du test :
Le test d’efficacité des conservateurs antimicrobiens consiste à inoculer le produit avec des microorganismes de
référence (bactéries, levures, moisissures) puis à mesurer la réduction de ces microorganismes sur une période de
temps déterminée (généralement 6h, 24h, 7j, 14j et 28j). On vérifie si le conservateur peut réduire ou inhiber la
croissance microbienne selon des critères spécifiques.
Les germes recherchés :
Germe Caractéristique Rôle
Staphylococcus aureus Indique une contamination
(Staphylocoque doré) Manu-porté due à une mauvaise
manipulation du produit
Pseudomonas aeruginosa
Candida albicans indicateurs de la
(levure) ubiquitaire contamination
environnementale
Aspergilus niger
(champignon)
Autres :
Témoin d’une contamination
Escherichia coli naturellement présente dans oro-fécale et bon témoin de
le tube digestif la présence des
entérobactéries BGN
Saccharomyces sp peut se développer meme Juger l’efficacité
dans des concentrations antifongique/antimycosique
élevées en sucres qui du conservateur dans les
inhibent la croissance des préparations orales très
champignons concentrée en sucres
NB : Les tests se font sur des souches uniques : car certains germes peuvent inhiber les croissances d’autres.
Etapes :
1. Préparer l’inoculum :
Le milieu (Bactérie milieu gélosé B « TS » ; levures milieu gélosé C « Sarbouraud »)
Le délai avant de lancer l’inoculation :
La concentration de l’inoculum : 106 microorganismes / g de produit
1 ml
108 UFC/ml
106 UFC/ml
100 ml
2. Dilutions Ensemencement incubation dénombrement bactérien :
Si on ensemence directement l’échantillon on risque de ne pas pouvoir dénombrer les UFC et avoir un tapis
bactérien vue la charge bactérienne qu’il contient (environ 106 UFC/ml),
Il est donc nécessaire de réaliser des dilutions décimales de l’échantillon puis on ensemence dans des boites
de pétri et on laisse incuber pendant un certain temps.
80 ÷ 0.1 ☓ 104
[10-1 ] [10-2 ] [10-3 ] [10-4 ] [10-5 ] [10-6 ]
8. 106 UFC/ml
0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
1000 UFC/ml 80 UFC/ml 5 UFC/ml 0 UFC/ml
[20 – 300] UFC/ml
3. Filtration/neutralisation : pour le contrôle
La filtration ou la neutralisation est essentielle lorsque le médicament testé contient un agent antimicrobien ou
conservateur qui pourrait continuer à inhiber la croissance des micro-organismes pendant le test. Ce processus
consiste à éliminer ou neutraliser ces agents antimicrobiens, pour que le test puisse évaluer l’efficacité
antimicrobienne de manière précise.
La filtration sur membrane : réalisée sur les produits liquides avant d’atteindre la fin de la durée
d’incubation : les bactéries retenues par le filtre sont récupérée par rinçage puis ensemencées.
La Neutralisation : réalisées sur les formes non liquides (10% max de produit), en ajoutant un
neutralisant (lécithine, saponine ...) pour inhiber l’action des antimicrobiens contenus dans le
médicament.
NB : La neutralisation nécessite des contrôles :
+ Agent antimicrobien
+ Neutralisant + Bactéries
Ensemencement
Ensemencement
Bactéries
Les bactéries doivent etre Antimicrobien Les bactéries doivent
retrouvées éliminé
etre retrouvées
le neutralisant ne doit pas avoir d’effet manifeste sur les Vérifier que le neutralisant est vraiment efficace et qu’il
bactéries inhibe l’agent antimicrobien
Interprétation des résultats :
Les résultats sont exprimés en termes de logarithme de réduction (Log réduction) de la population microbienne. On
compare la charge microbienne initiale (au début du test) avec celle mesurée à chaque intervalle de temps (6h, 24h, 7,
14, 28 jours).
Critères d’Efficacité :
Les critères d’acceptation dépendent du type de produit (forme galénique) et des types de microorganismes :
Catégorie A (préparations injectables, ophtalmiques, etc.) : doivent présenter une réduction rapide et forte
de la charge microbienne.
Catégorie B (préparations orales et préparations non stériles) : exigent une réduction progressive, mais
avec un seuil d’acceptabilité plus tolérant que les injectables.
Catégorie C (préparations topiques, cosmétiques) : requièrent une réduction mais avec des critères encore
plus souples.
Pour la catégorie A (préparations injectables, ophtalmiques) : si on part d’une suspension bactérienne à 106
UFC/ml :
- à 6h : < 104 UFC/ml
- à 24h : < 103 UFC/ml
- Au bout de 28 j tous les microorganismes doivent etre éliminés
Les termes NR et NI sont souvent utilisés pour classer les résultats et interpréter la réponse des micro-
organismes aux antimicrobiens testés.
1. NR (Non Résistant) : Indique que le micro-organisme est sensible à l’antimicrobien testé et que la
croissance du micro-organisme est inhibée.
2. NI : descendre à au moins 103 UFC/ml mais ça ne doit pas ré-augmenter.
(NI = Non interprétable ???? i need to ask )
II. Evaluer la qualité microbiologique de la préparation
pharmaceutique et substances pour usage pharmaceutique
non stériles :
Les médicaments doivent satisfaire aux critères de pureté microbiologique appropriés inclus dans les monographies
des pharmacopées. Des études de pharmacopée sont préparées spécifiquement en vue de s'assurer que le médicament
est efficace sur le plan thérapeutique et sans danger pour la santé.
Les critères d'acceptation applicables aux produits pharmaceutiques non obligatoirement stériles sur la base du
dénombrement des germes aérobies totaux (DGAT) et du dénombrement des moisissures/levures totales
(DMLT), la présence ou l'absence des microorganismes pathogènes spécifiques.
Etapes du test :
1. Préparation des échantillons :
Les échantillons de la préparation ou de la substance pharmaceutique sont prélevés en suivant des procédures
spécifiques pour éviter toute contamination externe selon les monographies de la pharmacopée.
Les échantillons peuvent être dilués avec un solvant stérile pour permettre une meilleure homogénéisation et
facilité de test.
2. Filtration / Neutralisation (si le produit contient un agent antimicrobien) :
Car la croissance bactérienne risque d’etre inhibée
Ne pas oublier le facteur de dilution :
Exemple :
1ml (1g) de produit + 9ml de neutralisant 1ml étalé sur une boite de petri dénombrement de 25 UFC/ml
0.1 g 25 UFC/ml
1 g 250 UFC/ml
3. Ensemencement :
1g (1ml) de produit étalé sur une boite de pétri.
L’ensemencement se fait sur des milieux spécifiques pour favoriser la croissance microorganisme :
Bactérie milieu TS (Tryptone Soja)
Levures/champignons Sabouraud
4. Incubation :
Bactérie : 24-48h
Levures/champignons : une semaine
5. Dénombrement :
La DGAT et DMLAT diffèrent en fonction de la forme pharmaceutique :
Plus on tolère de
microorganismes
plus on doit
rechercher des
pathogènes
spécifiques
Dans le cas des médicaments à base de plantes :
préparé avec de l’eau bouillante : tisanes
DGAT : 107
Non préparé avec de l’eau bouillante :
DGAT : 105
6. Recherche de germes spécifiques :
- Enrichissement : augmenter artificiellement la charge bactérienne de l’échantillon ;
- : On doit avoir 1g de produit dans le milieu d’enrichissement
Ensemencement sur milieux sélectifs aux bactéries recherchées. Et on ne doit pas
retrouvé des colonies. P. aeruginosa : milieu « cétrimide »
S. aureus : milieu « Parker .. »)
- Parfois on est amené à réaliser plusieurs enrichissements : le cas de E. coli où plusieurs bacts peuvent
pousser (milieu Mac Conkey)
- Certaines bactéries nécessitent la revivification apres la neutralisation
- Le contrôle :
Comparer avec un témoin positif. Produit + bactérie ensemencé dans une boite pétri)
III. Test de stérilité :
Produits de catégorie 1 : préparé dans des conditions extrêmement propres et aseptiques (locaux classe A et B) et
puis le produit final est stérilisé.
Idem au test précédent, les seuls deux différences :
On ne doit pas retrouver de germes à la fin ;
On s’intéresse aux germes anaérobies également (ensemencer 1g de produit dans un milieu pour les aérobies
et 1g de produit dans un milieu pour les germes anaérobies).
Méthodes de Test de Stérilité :
1. Par inoculation directe : un échantillon de produit (max 10% de produit) est directement introduit
dans les milieux de culture.
2. Par filtration sur membrane stérile : qui sera ensuite placée dans un milieu de culture approprié et
incubée utile pour les grandes quantités de liquide (les poches à sang)
3. Immersion Directe : Les dispositifs médicaux dans de l’eau stériles et dans des conditions de stérilité
afin de mettre les microorganismes, s’il y en a, en suspension, puis filtrer puise ensemencer.
Milieux utilisés :
- Milieu liquide au thioglycolate (anaérobie) : les milieux anaérobies sont spécifiquement utilisés pour
tester la stérilité
- Milieu liquide au trypcase soja (aérobie)
Incubation : 14 jrs d’incubation + 7 jrs
Interprétation : on doit avoir une absence de croissance visible par mesure de turbidimétrie
NB : Si c’est ininterprétable : on ajoute 1m du mm produit au 14e jr et ajouter 4 jrs d’incubation.
IV. Les types d’antimicrobiens qui peuvent etre utilisés :
En noir : CFC/ml
En rouge : la DO