Module: Méthodes d’analyses médicales

TP N°1 : Examen cytobactériologique des urines (ECBU)

Présenté par: Mme Merabet
 L’infection du tractus urinaire est surement l'infection
bactérienne la plus fréquenté en milieux communautaire
et hospitalier. Cela explique que l'examen
cytobactériologique des urines (ECBU) soit l'examen
bactériologique le plus demandé.
1. Phase pré-analytique :
1.1 Prélèvement :
 L’identification précise du prélèvement avec le nom
du patient et l'heure de prélèvement est, comme
pour toute analyse biologique, un pré-requis.
 Le méat urinaire de l'homme ou de la femme doit
être désinfecté avant le prélèvement d'urine. II en
est de même pour le nourrisson ou le petit enfant
chez qui a été pose un collecteur stérile spécifique.
 La contamination du prélèvement par les flores
saprophytes (cutanée, urétrale, vaginale, ou fécale) ou
par les bactéries de l'environnement entraine des
résultats faussement positifs.
 II est préférable de réaliser le prélèvement d'urine le
matin afin de recueillir une urine ayant séjourné
suffisamment longtemps dans la vessie.
 Selon l'étiologie suspectée, on distingue le premier jet
(recherche d'une infection urétrale ou prostatique) du
second jet (recherche d'une infection vésicale ou
rénale).
 1.2 Transport :
 Le transport vers le laboratoire doit se faire en
moins de deux heures, sauf si le recueil a été
effectué dans un pot contenant un stabilisateur de
croissance bactérienne. Un délai de transport
court (moins de 2 heures) permet de réduire la
multiplication des contaminants et de garder
intactes les cellules présentes dans l’urine avant
qu'elles ne se déforment ou ne se lysent. Ainsi, il
peut y avoir jusqu'à 50 % d'éléments cellulaires
lyses après la deuxième heure.
 En l'absence de conservateur et lorsque la
durée du transport est supérieure à deux
heures, les urines doivent être conservées à
+ 4 °C pour une durée maximale de 24
heures. Dans ce cas, le dénombrement des
bactéries est réalisable mais les leucocytes
peuvent être altérés.
2. Techniques d’analyses au laboratoire :

2.1 Matériels- Réactifs :

-Boites de pétri
-Lames et lamelles
-Anses de platine
-Pipettes Pasteur
-Bec Bunsen
-Gélose nutritive
-Réactifs nécessaires pour coloration de Gram
2.2 Examen macroscopique :
L’ECBU débute par un examen macroscopique
de l’échantillon d’urines qui permet de noter :
• l’aspect limpide, trouble ou avec des hématies ;
• la couleur (jaune pâle ou jaune foncé) qui
renseigne sur la concentration en eau de
l’urine, sachant toutefois que certains
médicaments peuvent la teinter.
2.3 Examen microscopique :
L’examen cytologique :
La recherche des leucocytes urinaires est pratiquée avec des urines
non centrifugées et fraichement émises (moins de 2 heures).
Autres éléments cellulaires :
La recherche des autres éléments cellulaires se fait à partir d'urines
fraichement émises (moins de 2 heures). Pour certaines pathologies, il
est utile de reconnaitre et de quantifier les hématies et les cylindres.
La présence de cylindres granuleux, hématiques, leucocytaires ou
cireux doit être signalée ; en complément de résultat, les cristaux
urinaires peuvent être identifiés et semi-quantifiés.
Ceux-ci sont physiologiquement présents dans l'urine. Seuls, les
cristaux de cystine et une quantité abondante de cristaux d'acide
urique sont anormaux.
 Examen à l’état frais :
-Prendre une lame propre nettoyée;
-Déposer sur la lame une goutte de cette culture
(urine), à l’aide d’une pipette Pasteur stérile ou avec
une anse de platine;
-Observer au microscope optique à l’objectif x40 ou x
60.
-Pour mettre en évidence certains détails de structure,
l’objectif x 100 à l’immersion doit être utilisé.
2.4 Examen bactériologique:
L’examen bactériologique comprend l’examen
microscopique avec coloration de Gram, ainsi que
l’identification et le dénombrement des germes,
exprimé en unités formant colonies (UFC)/ml.
Escherichia coli reste le germe le plus fréquemment
rencontré dans les infections urinaires (70 à 80 %
des cas)
La recherche des bactéries urinaires doit s'effectuer
à partir d'urines fraichement émises (moins de 2
heures).
-Technique d’isolement des bactéries :
-Culture sur milieu gélosé
Inoculer les boites de gélose nutritive, par la technique des
stries, puis les incuber à 30°C ou 37°C selon les cas pendant
24 à 48 heures.
Après ce délai, observer à l’œil nu ou à l’aide d’une loupe
binoculaire les colonies bactériennes développés sur ces
milieux gélosés en boites de Petri et noter leurs caractères
culturaux.
-Examen avec coloration sur frottis :
L’examen de bactéries fixées et colorées sur des frottis complète l’état
frais, car elle permet de mieux observer les détails morphologiques des
cellules bactériennes
-Pour cela il faut d’abord préparer un frottis bactérien, puis le colorer.
-Le frottis destiné à la coloration est préparé selon le protocole
suivant :
- étalement : prendre une lame propre et dégraissée, faire un
prélèvement du produit à examiner et étaler en couche mince.
-séchage : sécher rapidement en passant la préparation au-dessus de la
flamme d’un bec Bunsen, ou poser la lame sur une plaque chauffante
électrique réglée à 37°C.
-fixation : verser quelques gouttes d’alcool à 95° et enflammer. Les
bactéries sont tuées et fixées sur la lame (sans altération de leur
structure).
-coloration : le frottis pourra ensuite être soumis à une des techniques
de coloration.
-Coloration de Gram :
-recouvrir le frottis de violet cristal oxalaté; laisser agir 1
minute ; rincer à l’eau distillée ;
-verser du lugol et le laisser agir pendant1 minute ; rincer à
l’eau distillée ;
-décolorer à l’alcool à 95°, entre 15 et 30 secondes ; rincer à
l’eau distillée ;
-recolorer avec la fuchine de Ziehl diluée au 1/10 pendant 1
minute; rincer à l’eau distillée ;
-sécher au dessus de la flamme d’un bec Bunsen.
-Observer au microscope à l’objectif x 100 à immersion.
-Avec cette coloration double, les bactéries Gram positif
apparaissent en violet foncé tandis que les bactéries Gram
négatif sont colorées en rose ou en rouge.
Bactéries responsables d'infections
urinaires :
L’interprétation doit prendre en compte la
combinaison de quatre paramètres : la
bactériurie quantitative, la leucocyturie
quantitative, les symptômes urinaires et
la pathogénicité reconnue de la (des)
souche(s) isolée(s).
Les bactéries susceptibles d'être isolées au
cours d'une infection urinaire ont été
classées en quatre groupes :
5.1.1. Bactéries du groupe I :
Ces bactéries sont reconnues comme des
uropathogènes, même en faible quantité
(> 103 CFU/mL) :- Escherichia coli;
- Staphylococcus saprophyticus
(essentiellement chez la jeune femme) ;
- Salmonella (rare) ;
- Mycobactéries (rare).
5.1.2. Bactéries du groupe II :
Ces bactéries sont moins fréquemment responsables
d'infection urinaire. Ces infections sont le plus souvent
d'origine nosocomiale lorsqu'il existe des facteurs
anatomiques favorisants :
- les autres enterobacteries (Klebsiella spp., Proteus spp.,
Enterobacter
spp., Morganella spp.) ;
- Enterococcus spp. ;
- Pseudomonas aeruginosa ;
- Staphylococcus aureus ;
- Corynebacterium urealyticum ;
- Haemophilus spp. (Rare) ;
- Streptococcus pneumoniae (rare).
5.1.3. Bactéries du groupe III
Ces bactéries doivent être considérées comme pathogènes avec
circonspection. Leur implication en pathologie exige un niveau de
bactériurie élevé (> 105 CFU/ml), une répétition de leur positivité sur au
moins deux échantillons d'urine et, si possible, des critères cliniques ou
d'inflammation. Les staphylocoques à coagulase négative sont le plus
souvent un témoin d'une contamination plutôt que responsables de
réelles infections. Ces bactéries ne doivent être prises en compte que si
elles sont détectées par aspiration vésicale sous-pubienne :
- Streptococcus agalactiae ;
- Candida spp. (C. albicans et C. glabrata, surtout) ;
- Les staphylocoques & coagulase negative (autres que S. saprophyticus)
sont le plus souvent un témoin d'une contamination plutôt que
responsables de réelles infections ;
- Acinetobacter baumannfi ;
- Stenotrophomonas maltophilia ;
- Burkholderia cepacia ;
- Oligella urethrafis ;
- Aerococcus urinae.
5.1.4. Bactéries du groupe IV :
Ce sont des bactéries de la flore urétrale ou
génitale de proximité pour lesquelles
l’identification et l'antibiogramme ne
doivent pas être réalisés en routine :
- streptocoques alpha hemolytiques ;
- Gardnerella vaginalis ;
- Lactobacillus spp. ;
- bacilles coryneformes (a I'exception de C.
urealyficum).
Interprétation :
• Bactériurie :
< 103 CFU/ml : absence d'infection
> 105 CFU/ml : infection probable
Entre 103 et 105 CFU/ml : c'est la zone d'incertitude
qui varie selon l'espèce bactérienne (le seuil est
abaissé pour les pathogènes urinaires reconnus),
selon l‘expression des signes cliniques d'infection
urinaire et selon le fait que le patient soit sondé ou
non. Éventuellement, ces valeurs peuvent être
rencontrées sur un autre échantillon d'urines.
Certaines conditions de prélèvement des urines
permettent d'abaisser encore ces seuils.
• Leucocytes
< 104/ml : pas de processus inflammatoire ;
> 104 /ml : présence d'un processus inflammatoire.
En théorie, I ‘interprétation s'effectue en prenant en compte la
combinaison des trois paramètres suivants : bactériurie
quantitative, leucocyturie quantitative et pathogénicité
reconnue de la souche isolée.
En pratique, ces critères, nécessaires mais non obligatoirement
suffisants, doivent être discutés au cas par cas en y intégrant les
paramètres complémentaires suivants :
- les symptômes évocateurs d'infection urinaire : dysurie,
pollakiurie, pesanteur vésicale, hématurie macroscopique,
incontinence urinaire, douleurs lombaires, hyperthermie (2
38°C), associés à un autre signe d'infection urinaire,
- les conditions de prélèvement et de transport,
- le caractère mono ou pluri microbien des cultures,
- les résultats d'ECBU précédents.