République Tunisienne

***
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
***
Université de Monastir
***
Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir
Ecole Doctorale Sciences Biologiques,
Biotechnologie et Santé

Mémoire de

Mastère
Présenté en vue de l’obtention du diplôme national de Mastère de Recherche :
Biologie & Biotechnologie Mention : Biologie Moléculaire, Cellulaire & Biotechnologie

Présenté par : Roubè BETTAIEB

Le traitement de l’alopécie et l’infertilité masculine :

effet du minoxidil sur la qualité spermatique
Soutenu le : 18 Décembre 2025

Devant le jury composé de :

Présidente : Dr. Raja REZG

Examinatrice : Dr. Lamia SAID
Directeur de mémoire : Dr. Manel BOUSSABBEH-BEN YAHIA

Laboratoire d’accueil : Laboratoire de Recherche sur les Substances

Biologiquement Compatibles (LRSBC)

Service d’accueil : Service de Biologie de la Reproduction du CMNN

Année Universitaire : 2025/2026

 Ce travail a été réalisé au sein du Laboratoire de Recherche
Sur les Substances Biologiquement Compatibles (LRSBC) à la
faculté de Médecine Dentaire de Monastir sous la direction du
Professeur Salwa ABID-ESSEFI

En collaboration avec

Le Service de Biologie de la Reproduction au Centre de

Maternité et de Néonatologie de l’Hôpital Fattouma
Bourguiba de Monastir sous la direction du Professeur Meriem
MEHDI
 Dédicace

Avec tout mon amour éternel et avec l’intensité de mes émotions

Je dédie ce travail accompagné d'un profond amour et d'un travail persévérant et continu aux
personnes les plus précieuses dans ma vie :

À ma mère, Souad,
Merci pour votre amour infini et votre soutien sans faille.
Votre force et votre tendresse ont illuminé mon chemin.
Sans vous, ce travail n'aurait pas été possible.
C'est à vous que je dédie ce premier grand accomplissement.

À mon père, Hedi

Mon premier héros, mon modèle éternel.
Tu m'as donné les armes pour affronter la vie.
Ce mémoire est ma première victoire, et elle t'appartient.

À mes sœurs, Malek, Nour Houda et Rahma

Votre présence a illuminé mon chemin,

Votre soutien a été mon refuge,
Vos rires ont rythmé mes jours de joie.
Je vous dédie ce mémoire, modeste reflet de la fierté que vous m'inspirez.

À mes frères, Abdrahmene et Nour Eddine

Votre fraternité a été mon rempart,

Votre soutien, une force tranquille.
À travers les défis, vous avez été mes alliés les plus fidèles.
Je vous dédie ce travail, fruit de notre entraide et de nos liens indéfectibles.
À mon amie, Elkaroui Chayma

Pour les années de complicité et les moments précieux,

Pour ton soutien indéfectible et ta présence lumineuse,
Je dédie ce mémoire à notre amitié, l'un des trésors de ma vie.

A tous mes enseignants...

A tous mes amis...

A tous ceux qui m'ont poussé à aller toujours en avant. Merci ! D’être là.
 Remerciements

Au terme de ce travail, mes remerciements vont d’abord au Dieu qui m’a maintenu en
santé pour mener à bien cette année d’étude. Je tiens aussi à adresser mes remerciements à ma
famille, qui m’a toujours soutenu et poussé à continuer mes études. Je veux exprimer par ces
quelques lignes de remerciements ma gratitude envers tous ceux qui, par leurs présences, leurs
soutiens, leurs disponibilités et leurs conseils avec lesquels j'ai trouvé le courage pour accomplir
cette mémoire.

Tout d’abord, j’adresse mes plus vifs remerciements au Pr. Salwa ABID-ESSEFI,
professeur et chef du Laboratoire de Recherche sur les Substances Biologiquement
Compatibles, pour m'avoir accueilli au sein de son laboratoire pour la réalisation de mon
mémoire. Je le remercie également pour sa confiance, sa patience et les précieux conseils qu'il
m'a prodigués tout au long de ce travail.

Je tiens à remercier sincèrement Mme. Meriem MEHDI, du Service de Biologie de la

Reproduction du Centre de Maternité et de Néonatologie de Monastir-EPS Fattouma Bourguiba
de Monastir, pour avoir accepté mon intégration au sein de son laboratoire pour la collecte des
échantillons spermatiques.

J’adresse mes vifs remerciements et gratitude à Dr. Manel BOUSSABBEH-BEN

YAHIA, maitre assistante au Service de Biologie de la Reproduction du Centre de Maternité et
de Néonatologie de Monastir-EPS Fattouma Bourguiba de Monastir, pour les conseils
enrichissants, pour son suivi et son énorme soutien qu’elle n’a cessé de me prodiguer tout au
long de la période du mémoire. Je vous remercie pour le temps que vous avez consacré et pour
les informations que vous m’avez fournies avec intérêt et compréhension. Merci pour tout.

Je tiens à remercier les membres du Laboratoire de Recherche sur les Substances

Biologiquement Compatibles, en particulier Mme Mlle Rania kdhiri, Mlle Asma M’NASSRI,
Mlle Abir CHAIEB, Mlle Ryhem ROUATBI, Mlle fatma ABDERRAZEK, Mlle hanen
CHAABEN et Mlle Siwar RICH pour leurs aides.
 J’exprime ma sincère reconnaissance à tout le personnel du LRSBC, spécialement Mme
Salwa CHOUCHENE, technicien supérieur et secrétaire de notre laboratoire pour sa
disponibilité, ses encouragements et son aide.

Mes sincères remerciements vont également aux membres du Service de Biologie de la

Reproduction, en particulier Dr, Amira SALLEM, Mme Mouna ZARRAD, Mme Hana
MESSADI, Mme Hayet REBAI, Mme Bouthaina KILANI, Mme Sondos MEKSI et Mme
Fadhila CHBIL dont la présence et l'aide ont été inestimables.

Je tiens à remercier chaleureusement les résidents en médecine du service de Biologie de la

Reproduction Dr Elhem GHODHBANE, Dr. Faouez BOUJELBENE et Dr. Ranine Selmi
pour leur aide précieuse, leur disponibilité tout au long de mon stage.

Remerciements au jury :

Je tiens tout d'abord à exprimer ma profonde gratitude à l'ensemble des membres du jury pour
l'honneur qu'ils me font en acceptant d'évaluer ce travail de master.

Je remercie tout particulièrement au Docteur Raja REZG, Maître de Conférences à l'Institut

Supérieur de Biotechnologie de Monastir, d'avoir accepté de présider ce jury. Je lui témoigne
toute ma considération et mon sincère respect.

Mes remerciements vont également au Docteur Lamia SAID, Maître Assistante au sein du
même institut, pour avoir bien voulu en être l'examinatrice. Qu'elle trouve ici l'expression de
ma reconnaissance et de mon estime.
 RÉSUMÉ
L’infertilité masculine représente une préoccupation majeure de santé reproductive,
impliquée dans près de la moitié des cas d’infertilité conjugale. Parmi les facteurs susceptibles
d’altérer la qualité spermatique, les médicaments d’usage courant, notamment en dermatologie,
demeurent insuffisamment étudiés. Le minoxidil, traitement topique de référence de l’alopécie
androgénétique, est largement prescrit aux jeunes en âge de procréer, mais ses éventuels effets
sur la fonction reproductive masculine restent peu étudiés.
Cette étude expérimentale a évalué l’impact in vitro du minoxidil sur les paramètres
fonctionnels, biochimiques et moléculaires des spermatozoïdes humains. Les échantillons de
sperme ont été exposés à trois concentrations de minoxidil (0,126 µM, 1 µM et 10 µM) pendant
4 heures. Les analyses ont porté sur la mobilité, la vitalité, la production d’espèces réactives de
l’oxygène (ROS), la fonction mitochondriale (potentiel membranaire et activité métabolique),
les marqueurs du stress oxydatif (peroxydation lipidique, activité des enzymes antioxydantes
SOD et catalase) et l’intégrité de l’ADN (tests à l’acridine orange et de comète).
Les résultats ont révélé une altération dose-dépendante des paramètres spermatiques.
Une diminution significative de la mobilité a été observée à la concentration la plus élevée (10
µM). Le minoxidil a induit une augmentation très significative (p < 0,001) de la production de
ROS et une baisse du potentiel membranaire mitochondrial. Par ailleurs, une augmentation très
significative (p < 0,001) de la fragmentation de l’ADN a été enregistrée.
En conclusion, cette étude démontre que le minoxidil altère in vitro la qualité
spermatique par un mécanisme impliquant l’induction d’un stress oxydatif, une dysfonction
mitochondriale et des dommages à l’ADN. Ces données précliniques suggèrent un risque
potentiel pour la fertilité masculine et soulignent la nécessité d’une vigilance accrue.
Mots-clés : Minoxidil, infertilité masculine, qualité spermatique, stress oxydatif, dommages à
l’ADN, mitochondrie.
ABSTRACT
Male infertility constitutes a major concern in reproductive health, accounting for nearly
half of all cases of couple infertility. Among the factors that may impair sperm quality,
commonly used medications, particularly those prescribed in dermatology, remain
insufficiently investigated. Minoxidil, a first-line topical treatment for androgenetic alopecia, is
widely prescribed to young men of reproductive age, yet its potential effects on male
reproductive function are poorly characterized.
This experimental study assessed the in vitro impact of minoxidil on the functional,
biochemical, and molecular parameters of human spermatozoa. Semen samples were exposed
to three concentrations of minoxidil (0.126 µM, 1 µM, and 10 µM) for 4 hours. Analyses
focused on motility, vitality, reactive oxygen species (ROS) production, mitochondrial function
(membrane potential and metabolic activity), oxidative stress markers (lipid peroxidation,
antioxidant enzyme activities of SOD and catalase), and DNA integrity (acridine orange and
comet assays).
Our results demonstrated a dose-dependent alteration of sperm parameters. A significant
decrease in motility was observed at the highest concentration (10 µM). Minoxidil induced a
highly significant increase (p < 0.001) in ROS production and a marked reduction in
mitochondrial membrane potential. Furthermore, a highly significant increase (p < 0.001) in
DNA fragmentation was recorded.
In conclusion, our study shows that minoxidil impairs human sperm quality in vitro
through mechanisms involving oxidative stress induction, mitochondrial dysfunction, and DNA
damage. These preclinical findings suggest a potential risk for male fertility and highlight the
need for increased clinical vigilance.
Keywords: Minoxidil, male infertility, sperm quality, oxidative stress, DNA damage,
mitochondria
 Table des matières

Introduction ___________________________________________________________________ 0

Revue Bibliographique _________________________________________________________ 3

Chapitre 1 : Le follicule pileux et l’alopécie androgénétique ___________________________ 4

I. Le follicule pileux : _____________________________________________________________________ 4
1. Structure : __________________________________________________________________________ 4
2. Le cycle pilaire : _____________________________________________________________________ 5
• La phase anagène _____________________________________________________________ 5
• La phase catagène _____________________________________________________________ 5
• la phase télogène ______________________________________________________________ 5
3. Régulation multifactorielle du cycle pilaire : génétique, androgènes et nutrition : _________ 6
II. L’Alopécie Androgénétique (AAG) : ______________________________________________________ 7
1. Définition et prévalence : ____________________________________________________________ 7
2. Caractéristiques histologiques : ______________________________________________________ 7
3. Physiopathologies : _________________________________________________________________ 7
3.1 Sur le plan génétique : __________________________________________________________ 7
3.2 Sur le plan hormonal : __________________________________________________________ 8
3.3 Mécanismes cellulaires et tissulaires associés : __________________________________ 8
• Micro-inflammation : ___________________________________________________________ 8
• Vieillissement et Stress Oxydatif : _______________________________________________ 9
III. Alternative thérapeutique de l’AAG : Le minoxidil _________________________________________ 9
1. Définition et utilisation thérapeutique : ________________________________________________ 9
2. Mécanismes d'action du minoxidil : __________________________________________________ 10
3. Voies d’administration et posologie : _________________________________________________ 11
4. Pharmacocinétique du minoxidil : ___________________________________________________ 11
4.1 En utilisation topique :_________________________________________________________ 11
4.2 En administration orale : _______________________________________________________ 12
5. Effets secondaires : ________________________________________________________________ 12

Chapitre 2 : La Fertilité masculine ___________________________________________________ 13

I. L’appareil reproducteur masculin : _____________________________________________________ 13
1. Les testicules : _____________________________________________________________________ 13
1.1 La fonction exocrine : la spermatogenèse _______________________________________ 14
1.2 La fonction endocrine : la stéroïdogenèse _______________________________________ 14
2. Le tractus génital :__________________________________________________________________ 15
 3. Les glandes annexes : ______________________________________________________________ 15
3.1 Les vésicules séminales : ______________________________________________________ 15
3.2 La prostate : __________________________________________________________________ 15
3.3 Les glandes bulbo-urétrales : __________________________________________________ 15
4. La maturation post-testiculaire : _____________________________________________________ 16
5. La Spermatogenèse : _______________________________________________________________ 16
5.1 Phase de multiplication : ______________________________________________________ 17
5.2 Phase de maturation méiotique : _______________________________________________ 17
5.3 Phase de différenciation (spermiogenèse) : _____________________________________ 17
6. La Régulation Hormonale : __________________________________________________________ 18
II. L'infertilité masculine : ________________________________________________________________ 19
1. Diagnostic de l'infertilité masculine :_________________________________________________ 20
1.1 Le Spermogramme et le spermocytogramme :___________________________________ 20
• Définition : ___________________________________________________________________ 20
• Analyse des paramètres spermatiques : ________________________________________ 20
1.2 Les investigations complémentaires :___________________________________________ 21
• Le bilan hormonal_____________________________________________________________ 21
• L'échographie et doppler: ______________________________________________________ 21
• Le diagnostic génétique : ______________________________________________________ 21
2. Étiologies de l'infertilité masculine : _________________________________________________ 21
2.1 Infertilité masculine et médicaments : __________________________________________ 22

Matériel et Méthodes __________________________________________________________ 23

I. Type de l’étude : ______________________________________________________________________ 24
II. Considérations Éthiques : _____________________________________________________________ 24
III. Population d’étude : ___________________________________________________________________ 24
1. Critères d'inclusion ________________________________________________________________ 24
2. Critères d’exclusion ________________________________________________________________ 25
IV. Matériel ______________________________________________________________________________ 25
1. Produits et réactifs : ________________________________________________________________ 25
2. Matériel biologique : Le sperme _____________________________________________________ 25
2.1 Origine des échantillons : ______________________________________________________ 25
2.2 Protocole de recueil ___________________________________________________________ 25
V. Méthodes : ___________________________________________________________________________ 26
1. Préparation et analyse initiale des échantillons de sperme : ___________________________ 26
1.1 Liquéfaction : _________________________________________________________________ 26
1.2 Évaluation des paramètres spermatiques selon les critères de l'OMS: _____________ 26
2. Traitement des échantillons spermatiques : __________________________________________ 27
3. Dosage des protéines totales (méthode de Bradford) : _________________________________ 29
 • Principe : _____________________________________________________________________ 29
• Mode opératoire : _____________________________________________________________ 29
4. Évaluation de la fonction mitochondriale :____________________________________________ 30
4.1 Activité métabolique cellulaire (test MTT) : ______________________________________ 30
• Principe : _____________________________________________________________________ 30
• Mode opératoire : _____________________________________________________________ 30
4.2 Etude du potentiel membranaire mitochondriale (test à la Rhodamine 123) : _______ 31
• Principe : _____________________________________________________________________ 31
• Mode opératoire : _____________________________________________________________ 31
5. Etude du statut oxydatif : ___________________________________________________________ 31
5.1 Dosage des espèces réactives de l’oxygène in vitro par le test DCFH-DA : __________ 31
• Principe : _____________________________________________________________________ 31
• Mode opératoire : _____________________________________________________________ 32
5.2 Étude de la peroxydation lipidique : dosage du Malondialdehyde (MDA) ___________ 33
• Principe : _____________________________________________________________________ 33
• Mode opératoire : _____________________________________________________________ 33
5.3 Evaluation de l’activité antioxydante de la superoxyde dismutase (SOD) : __________ 34
• Principe : _____________________________________________________________________ 34
• Mode opératoire : _____________________________________________________________ 34
5.4 Evaluation de l’activité antioxydante de la catalase (CAT) _________________________ 35
• Principe : _____________________________________________________________________ 35
• Mode opératoire : ______________________________________________________________ 35
6. Évaluation de l'intégrité de l'ADN : ___________________________________________________ 36
6.1 Test de comète : ______________________________________________________________ 36
• Principe : _____________________________________________________________________ 36
• Mode opératoire ______________________________________________________________ 37
6.2 Test à l'acridine orange ________________________________________________________ 38
• Principe ______________________________________________________________________ 38
• Mode opératoire ______________________________________________________________ 38
7. Analyse statistique : ________________________________________________________________ 38

Résultats _____________________________________________________________________ 39
1. Etude de l’effet du minoxidil sur la mobilité spermatique : _____________________________ 40
1. Etude de la mobilité progressive : _________________________________________________ 40
1.2 Etude de la mobilité totale : ____________________________________________________ 40
2. Etude de l’effet du minoxidil sur la vitalité spermatique ________________________________ 41
3. Effet du Minoxidil sur le statut oxydatif au niveau du sperme : __________________________ 42
3.1 Mesure des ROS au niveau des spermatozoïdes : le test DCFH-DA ________________ 42
 3.2 Étude de la peroxydation lipidique au niveau des spermatozoïdes : dosage du
Malondialdehyde (MDA) : ______________________________________________________________ 43
3.3 Evaluation de l’activité enzymatique antioxydante au niveau du liquide séminale :__ 44
• Activité de la superoxyde dismutase (SOD) : _____________________________________ 44
• Evaluation de l’activité antioxydante de la catalase (CAT) : ________________________ 45
4. Effet du Minoxidil sur la fonction mitochondriale au niveau des spermatozoïdes : ________ 46
4.1 Evaluation de l’activité mitochondriale des spermatozoïdes (test MTT) : ___________ 46
5. Effet du Minoxidil sur la qualité de l’ADN spermatique : ________________________________ 48
5.1 Test de comètes : _____________________________________________________________ 48
5.2 Test à l'acridine orange : _______________________________________________________ 50

Discussion ____________________________________________________________________ 52

Conclusion ___________________________________________________________________ 57

Références bibliographiques ___________________________________________________ 0

Annexes _______________________________________________________________________ 0
 Liste d’abréviations

°C : degré Celsius (unité de température)

ADN : Acide désoxyribonucléique
AAG : Alopécie androgénétique
AO : Acridine orange
Agarose LMP : Agarose Low Melting Point (à bas point de fusion)
Agarose NMP : Agarose Normal Melting Point (à point de fusion normal)
AR : Récepteur aux androgènes (Androgen Receptor)
ARN : Acide ribonucléique
ATP : Adénosine triphosphate
BET : Bromure d’éthidium
BSA : Sérum albumine bovine (Bovine Serum Albumin)
C1 : 0,126 µM de minoxidil
C2 : 1 µM de minoxidil
C3 : 10 µM de minoxidil
CAT : Catalase
DHT : Dihydrotestostérone
DCFH-DA : 2',7'-Dichlorodihydrofluorescéine diacétate (sonde de stress oxydatif)
DMSO : Diméthylsulfoxyde
DO : Densité optique
ERO : Espèces réactives de l’oxygène
FDA : Food and Drug Administration
FSH : Hormone folliculo-stimulante
FP : Follicule pileux
GnRH : Gonadolibérine
H₂O₂ : Peroxyde d’hydrogène
HCl : Acide chlorhydrique
HPG : Axe hypothalamo-hypophyso-gonadique
KATP : Canaux potassiques ATP-dépendants
LH : Hormone lutéinisante
LMP : Agarose à point de fusion bas (Low Melting Point)
mg/mL : milligramme par millilitre
µL : microlitre
µM : micromolaire
MTT : Bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltétrazolium
NaOH : Hydroxyde de sodium
OMS : Organisation mondiale de la santé

Rh123 : Rhodamine 123

ROS : Reactive Oxygen Species (Espèces réactives de l’oxygène)
SDH : Succinate déshydrogénase
SOD : Superoxyde dismutase
SO : Stress oxydant
SPZ : Spermatozoïde
SULT1A1 : Sulfotransférase folliculaire
SULT1A2 : Sulfotransférase hépatique
T : Témoin non traité
TBA : Acide thiobarbiturique
TCA : Acide trichloroacétique
Tris-HCl : Tris-Hydrochloride
WHO : World Health Organization (équivalent anglais de l’OMS)
 Liste des Figures

Figure 1 : Schéma du follicule pileux . ..................................................................................... 4

Figure 2 : Les phases du cycle pilaire. ...................................................................................... 5

Figure 3: Mécanisme moléculaire androgène-dépendant dans la papille dermique ................ 8

Figure 4: Mécanisme d'action cellulaire et moléculaire du minoxidil dans le follicule pileux.

.................................................................................................................................................. 10

Figure 5 : Parcours pharmacocinétique du minoxidil ............................................................. 11

Figure 6: Schéma anatomique de l'appareil reproducteur masculin ..................................... 13

Figure 7 : Structure du testicule .............................................................................................. 14

Figure 8: Processus de la spermatogenèse dans le testicule ................................................... 16

Figure 9: La spermiogenèse : transformation de la spermatide en spermatozoïde mature .... 18

Figure 10:La régulation hormonale de la spermatogenèse .................................................... 19

Figure 11 : La réduction du MTT par la succinate déshydrogénase mitochondriale. ........... 30

Figure 12 : Schéma illustrant le mécanisme réactionnel du DCFH-DA ............................... 32

Figure 13: Impact dose-dépendant du minoxidil sur la mobilité progressive ......................... 40

Figure 14 : Effet du minoxidil sur la mobilité totale des spermatozoïdes ............................... 41

Figure 15: Effet du Minoxidil sur la vitalité spermatique après 4 heures d'exposition .......... 41

Figure 16: Effet du minoxidil sur la production de ROS dans les spermatozoïdes ................. 42

Figure 17: Effet du minoxidil sur la peroxydation lipidique au niveau des spermatozoïdes . 43

Figure 18: Activité de la superoxyde dismutase (SOD) après traitement au Minoxidil .......... 44

Figure 19 : Evaluation de l’activité antioxydante de la catalase ............................................ 45

Figure 20 : Effet du minoxidil sur l'activité mitochondriale des spermatozoïdes ................... 46

Figure 21: Effet du minoxidil sur le potentiel de membrane mitochondriale des spermatozoïdes
.................................................................................................................................................. 47

Figure 22:Effet du minoxidil sur le % de fragmentation de l'ADN spermatique .................... 49

Figure 23:Effet du minoxidil sur la dénaturation de l'ADN spermatique ............................... 50

 Liste des Tableaux

Tableau 1 : Anomalies spermatiques et valeurs de référence de l'OMS (2021) (OMS

2021)......................................................................................................................................... 20

Tableau 2 : Paramètres spermatiques analysés : type d'examen, méthodes, interprétation

et valeurs de référence selon l'OMS (2021) .......................................................................... 26

Tableau 3: Techniques d’évaluation de la toxicité du minoxidil sur les spermatozoïdes . 28

Introduction
 Introduction générale

L’infertilité du couple est aujourd’hui reconnue comme un problème majeur de santé

publique, touchant environ un couple sur six dans le monde (OMS 2021). Dans près de la
moitié des cas, un facteur masculin est impliqué, mettant en lumière l’importance de la prise en
charge de l’infertilité masculine au sein du couple.

L’infertilité masculine est souvent attribuée à des anomalies de la qualité spermatique,

qui se traduisent par des spermatozoïdes anormaux en termes de nombre, de mobilité, ou de
morphologie (OMS 2021). Ces anomalies constituent un défi majeur pour de nombreux couples
en vue de concevoir un enfant conduisant à des problèmes psychologiques importants.

L’enquête étiologique de l’infertilité masculine est essentielle, car elle conditionne la

stratégie thérapeutique et la prévention des causes évitables. De nombreux facteurs peuvent
altérer la qualité spermatique. Ces facteurs peuvent être d’origine génétique, environnementale,
ou liés au mode de vie (Tesarik 2025).

La prise médicamenteuse constitue également un facteur souvent sous-estimé (Semet et

al. 2017; Ajayi et Akhigbe 2020). De nombreux traitements peuvent exercer des effets
reprotoxiques par différents mécanismes : altération de la spermatogenèse, perturbation
hormonale ou induction d’un stress oxydatif. Les anticancéreux, antiépileptiques,
antidépresseurs, antifongiques ou antihypertenseurs figurent parmi les classes les plus
concernées (Adelakun et al. 2022; Hamed et al. 2023a; Asghar et al. 2024a) Au-delà des
médicaments indispensables à visée thérapeutique, certains traitements dits de confort, destinés
à améliorer la qualité de vie, comme les psychotropes, les antiacides ou les médicaments
dermatologiques, peuvent eux aussi exercer un impact négatif sur la reproduction masculine.
Ces effets indésirables, souvent sous-estimés et insuffisamment explorés, représentent un enjeu
majeur de pharmacovigilance reproductive.

Parmi ces médicaments, le minoxidil, une solution thérapeutique largement prescrite à

l'échelle mondiale pour traiter l’alopécie androgénétique, mérite une attention particulière.
L’alopécie androgénétique constitue la forme la plus fréquente de chute de cheveux chez
l’homme. L’alopécie androgénétique (AGA) constitue la cause la plus fréquente de la chute de
cheveux chez l’homme liée à la sensibilité des follicules pileux aux androgènes, principalement
la dihydrotestostérone (DHT). Bien qu’elle ne mette pas en jeu le pronostic vital, cette affection
chronique affecte considérablement la qualité de vie, l’estime de soi et les relations sociales
(Park et al. 2018).
1
 Introduction générale

Au regard de son efficacité sur le follicule pileux, ses effets secondaires, notamment sur
la fonction reproductive, restent peu étudiés et constituent un enjeu sous-estimé de la
pharmacovigilance.

Dans cette optique, notre travail vise à explorer l’effet du minoxidil sur les
spermatozoïdes humains in vitro, tout en étudiant les paramètres fonctionnels des
spermatozoïdes et élucidant les mécanismes sous-jacents afin de contribuer à une meilleure
compréhension de ses éventuelles conséquences sur la fertilité masculine et d’alimenter la
réflexion en matière de pharmacovigilance reproductive.

2
 Revue
Bibliographique
 Revue Bibliographique

Chapitre 1 : Le follicule pileux et l’alopécie androgénétique

I. Le follicule pileux :

1. Structure :

Le follicule pileux (FP) (ou unité pilo-sébacée) est une annexe spécialisée de la peau qui
produit le poil. Il est composé de cellules d'origine épithéliale (éctoderme) et mésenchymateuse
(mésoderme). Le FP et ses structures associées, la glande sébacée et le muscle arrecteur du poil,
forment l'unité pilo-sébacée. Histologiquement, il est constitué de la profondeur vers la surface
de la peau (Figure 1) (Wosicka et Cal 2010; Cuevas-Diaz Duran et al. 2024):

• Le bulbe (à la base du follicule) abrite la matrice cellulaire proliférative ainsi que la

papille dermique, qui joue un rôle central dans la régulation de la croissance pilaire par
ses signaux et son apport vasculaire
• La région suprabulbaire est la zone au-dessus du bulbe. Elle correspond à la
différenciation cellulaire pour former les gaines internes et externes ainsi que la tige
pilaire.
• L'isthme st la portion intermédiaire du follicule, comprise entre l’abouchement du canal
sébacé et le renflement du bulge, niche des cellules souches.
• L'infundibulum constitue la partie supérieure du follicule qui s'ouvre à la surface
cutanée.

Figure 1 : Schéma du follicule pileux

(Cuevas-Diaz Duran et al. 2024).

4
 Revue Bibliographique

2. Le cycle pilaire :

Le cuir chevelu humain abrite environ 100 000 follicules pileux, chacun évoluant de
manière asynchrone dans son propre cycle de renouvellement (Park et al. 2018). Après la
naissance, ces follicules n’ont pas une croissance de façon cyclique mais suivent un processus
de renouvellement périodique comprenant trois phases : anagène catagène et télogène
(Schneider et al. 2009; Lee et al. 2024).

Figure 2 : Les phases du cycle pilaire (Cuevas-Diaz Duran et al. 2024).

• La phase anagène : une phase de croissance active qui peut durer de 2 à 7 ans. Durant
cette phase, le bulbe pileux atteint sa taille maximale et s'ancre profondément dans le derme,
les cellules de la matrice prolifèrent activement pour former la tige pilaire, et la mélanogenèse
est activée, conduisant à la production d'un cheveu pigmenté (Park et al. 2018; Stone et al.
2021).
• La phase catagène : il s’agit d’une courte phase d’involution d'environ 2 à 4 semaines.
Cette phase est marquée par l’arrêt de la prolifération, l’apoptose des cellules folliculaires et la
régression du follicule (Paus et Cotsarelis 1999a; Stone et al. 2021).
• la phase télogène : C’est une période de quiescence (repos) relative d'environ 3 mois.
Le follicule réduit sa taille et le cheveu peut être expulsé et le cycle reprend (Park et al. 2018;
Stone et al. 2021).

5
 Revue Bibliographique

La Figure 2 révèle les transformations structurales majeures entre les phases anagène,
catagène et télogène. Ce cycle se poursuit par une étape supplémentaire, connue par la phase
exogène (ou téloptose), qui suit le télogène et correspond au détachement et à l'expulsion
effective du cheveu (Devjani et al. 2023; Owecka et al. 2024). Concomitamment, le follicule
pileux entame déjà un nouveau cycle anagène, initiant la formation d'un nouveau cheveu avant
même l'élimination du précédent. Parfois, le follicule peut entrer dans une période d'inactivité
prolongée, dite la phase cénogène (Cortez et al. 2025).

3. Régulation multifactorielle du cycle pilaire : génétique,

androgènes et nutrition :

La croissance capillaire est régulée par une synergie complexe de facteurs intrinsèques
et extrinsèques, qui orchestrent l’entrée, le maintien et la transition entre les phases anagènes,
catagène et télogène. Parmi lesquels, on distingue :

➢ La prédisposition génétique : elle module la sensibilité du follicule pileux aux signaux

hormonaux, les androgènes, conditionne la durée des phases du cycle et participe aux
phénomènes de vieillissement capillaire, incluant le grisonnement (Trueb 2009; Park et al.
2018).
➢ L'action des androgènes : les androgènes et en particulier la dihydrotestostérone (DHT)
exercent une action dite paradoxale sur la croissance pilaire. Ils stimulent la pilosité ou
inhibent la croissance pilaire selon la densité locale des récepteurs androgéniques, de
l’activité de la 5--réductase et du profil moléculaire propre à chaque zone corporelle
(Randall 2007; Owecka et al. 2024).
➢ Les facteurs nutritionnels : Les carences des micronutriments en fer, zinc ou vitamines
du groupe B, perturbent la prolifération des cellules matricielles, réduisent la durée de
l’anagène et favorisent l’entrée prématurée en télogène. Ces déficits constituent ainsi des
causes bien documentées de chute diffuse ou de retard de repousse (Almohanna et al.
2019).

6
 Revue Bibliographique

II. L’Alopécie Androgénétique (AAG) :

1. Définition et prévalence :

L’alopécie androgénétique constitue la forme la plus fréquente de chute de cheveux,

également connue sous les termes de calvitie masculine (Male Pattern Hair Loss ou MPHL) et
féminine (Female Pattern Hair Loss - FPHL) (Goren et Naccarato 2018). Elle touche environ
80% des hommes et 50% des femmes (Goren et Naccarato 2018; Nestor et al. 2021). Sur le
plan clinique, la MPLH se manifeste par un dégagement fronto-pariétal et une perte vertex.
Quant à la FPLH, la chute est plus diffuse, avec un élargissement de la raie médiane.

2. Caractéristiques histologiques :

L’AAG est caractérisée par la transformation des follicules pileux terminaux en follicules
miniaturisés produisant des cheveux plus fins et plus courts (Cuevas-Diaz Duran et al. 2024;
Cortez et al. 2025). Elle est accompagnée également par une réduction du volume de la papille
dermique qui contrôle la croissance du cheveu.

3. Physiopathologies :

La physiopathologie de l’AAG est multifactorielle, impliquant une interaction complexe

entre une prédisposition génétique, des facteurs hormonaux et des mécanismes cellulaires
aboutissant à la miniaturisation caractéristique du follicule pileux (Cuevas-Diaz Duran et al.
2024; Asilian et al. 2024). Les cycles pilaires sont altérés ; la phase anagène (croissance) se
raccourcit tandis que la phase télogène (repos) s'allonge (Paus et Cotsarelis 1999b; Nestor et al.
2021b). Ceci conduit à la transformation progressive des cheveux terminaux (épais et
pigmentés) en duvet (cheveux vellus, fins et dépigmentés), aboutissant à une calvitie
cliniquement visible (Paus et Cotsar :elis 1999b).

3.1 Sur le plan génétique :

L’alopécie androgénétique masculine (AAG) est une pathologie courante dont

l’héritabilité est complexe et polygénique. Des variations du gène du récepteur aux androgènes
(AR) sur le chromosome Xq12 peuvent augmenter l’expression de ce récepteur et la
susceptibilité à l’AAG, mais elles ne suffisent pas à provoquer la calvitie (Goren et Naccarato

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 Revue Bibliographique

2018; Cortez et al. 2025). D’autres loci ont été identifiés, expliquant la diversité des phénotypes
et l’âge variable d’apparition (Choi et al. 2024).

3.2 Sur le plan hormonal :

L'AAG résulte principalement d'une réponse excessive aux androgènes, bien que d’autres
hormones (œstrogènes, hormones thyroïdiennes, glucocorticoïdes, prolactine, GH) puissent
intervenir (Goren et Naccarato 2018; Owecka et al. 2024; Cortez et al. 2025). Le mécanisme
moléculaire clé implique le rôle de l’enzyme 5-alpha-réductase de type 2 au niveau du follicule
pileux dans la conversion de la testostérone en dihydrotestostérone (DHT), un métabolite avec
une affinité cinq fois plus élevée pour AR que la testostérone (Cuevas-Diaz Duran et al. 2024;
Cortez et al. 2025). Une fois liée à l’AR, elle active une cascade de signaux intracellulaires qui
conduit progressivement à l’amincissement de la tige pilaire, puis à la miniaturisation du
follicule (Figure 3).

Figure 3: Mécanisme moléculaire androgène-dépendant dans la papille dermique

(Cortez et al. 2025)
3.3 Mécanismes cellulaires et tissulaires associés :

• Micro-inflammation :

Une inflammation légère et chronique autour du follicule, la flore microbienne ou la

pollution, peut endommager les cellules souches et participer à la perte de densité
folliculaire (Paus et Cotsarelis 1999b; Cuevas-Diaz Duran et al. 2024; Cortez et al. 2025).

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 Revue Bibliographique

• Vieillissement et Stress Oxydatif :

Le vieillissement s'accompagne d'une diminution des défenses antioxydantes (comme

la catalase), permettant l'accumulation de peroxyde d'hydrogène qui endommage les
mélanocytes et pourrait accélérer la sénescence de la papille dermique (Goren et Naccarato
2018; Cuevas-Diaz Duran et al. 2024).

III. Alternative thérapeutique de l’AAG : Le minoxidil

1. Définition et utilisation thérapeutique :

Le minoxidil est le 2,4-pyrimidinediamine 6-(1-pipéridinyl) -3-oxyde. Il s’agit d’un dérivé

de l’imidazole, un composé de la famille des pyrimidines de formule chimique C9H15N5O
(Suchonwanit et al. 2019a).

Ce médicament est un vasodilatateur initialement développé comme un antihypertenseur

dans les années 1960. L’effet secondaire d’hypertrichose a conduit à son repositionnement
comme un traitement dermatologique (Campese 1981; Zins 1988; Suchonwanit et al. 2019b;
Gupta et al. 2023a). Il est devenu le premier médicament approuvé par la FDA (Food and Drug
Administration) pour l’alopécie androgénétique (Price et al. 1999; Suchonwanit et al. 2019b).

Figure 4: structure chimique du minoxidil (Suchonwanit et al. 2019a)

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2. Mécanismes d'action du minoxidil :

Figure 5: Mécanisme d'action cellulaire et moléculaire du minoxidil dans le follicule

pileux (Gupta et al. 2023b).

- Le Minoxidil agit comme un vasodilatateur : il active les canaux potassiques ATP-dépendants

(KATP), provoque une hyperpolarisation des cellules musculaires lisses, limite l’entrée du
calcium et entraîne une relaxation vasculaire (Shorter et al. 2008; Wosicka et Cal 2010; Gupta
et al. 2022).
Cette vasodilatation augmente le flux sanguin périfolliculaire et améliore l’apport en nutriments
indispensables à la croissance du cheveu pileux (Graczyk et al. 2022; Cuevas-Diaz Duran et al.
2024).
- Le Minoxidil active les voies de signalisation et module le cycle pilaire: il stimule la voie Wnt/β-
caténine, et augmente l’expression du VEGF, renforçant l’angiogenèse et soutenant la
croissance folliculaire (Devjani et al. 2023; Cuevas-Diaz Duran et al. 2024). De plus, le
métabolite actif du Minoxidil, le minoxidil sulfate, stimule la prolifération cellulaire au niveau
du bulbe folliculaire (Devjani et al. 2023).
Le minoxidil prolonge également la phase anagène, raccourcit la phase télogène favorisant
l’épaississement des cheveux et la transformation des cheveux duveteux en cheveux terminaux
(Paus et Cotsarelis 1999c; Gupta et al. 2022).
- Le Minoxidil exerce des effets anti-inflammatoires : il inhibe l’IL-1α. Il module les
prostaglandines en augmentant la PGE2 et diminuant la PGD2, réduisant la micro-inflammation
périfolliculaire (Paus et Cotsarelis 1999c; Gupta et al. 2022; Cuevas-Diaz Duran et al. 2024)
(Cuevas-Diaz Duran et al. 2024).

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 Revue Bibliographique

3. Voies d’administration et posologie :

Aujourd’hui disponible en solutions ou mousses (2–5 %), il constitue un traitement de première

intention de la calvitie en application topique et peut être utilisé seul ou en association à d’autres
médicaments (Adil et Godwin 2017; Park et al. 2018; Lee et al. 2024).

- Application topique : le minoxidil s'inscrit dans le cadre d'une posologie standard bien
établie, consistant en l'application de 1 mL, deux fois par jour, sur le cuir chevelu sec (Olsen
et al. 2002; Gupta et al. 2022).
- Administration orale : l’administration orale est généralement recommandée comme
alternative thérapeutique, particulièrement chez les patients non répondeurs au traitement
topique (Gupta et al. 2023b). Il est administré à raison de 5 mg par jour (Gupta et al. 2023a).

4. Pharmacocinétique du minoxidil :

Figure 6 : Parcours pharmacocinétique du minoxidil (Cortez et al. 2025)

4.1 En utilisation topique :

L’absorption cutanée du minoxidil est d’environ 50% après 1 heure d’application et 75%
après quatre heures (Graczyk et al. 2022). En présence des sulfotransférases (principalement
SULT1A1) présentes dans la gaine radiculaire externe des follicules pileux, ce médicament est
converti en minoxidil sulfate, la forme active du minoxidil (Goren et Naccarato 2018; Cuevas-
Diaz Duran et al. 2024). La variabilité interindividuelle de l'expression enzymatique des
sulfotransférases explique les différences de réponse au traitement. Les patients porteurs de

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 Revue Bibliographique

mutations du gène SULT1A1 sont souvent qualifiés de non-répondeurs (Cuevas-Diaz Duran et

al. 2024)

Seulement 1,4% à 2% du minoxidil atteignent la circulation sanguine (Almohanna et al. 2019;

Ponomareva et al. 2024). Après l'arrêt d'un traitement topique, environ 95% du minoxidil
absorbé de manière systémique est éliminé dans un délai de 4 jours (Gupta et al. 2022).

4.2 En administration orale :

Le minoxidil, administré oralement, est absorbé par l’intestin. La quasi-totalité de la

quantité absorbée passe vers la circulation sanguine. La métabolisation du minoxidil fait
intervenir la sulfotransférase hépatique (SULT1A2), distincte de l'enzyme folliculaire, ce qui
pourrait expliquer ses différences d'efficacité en administration orale (Cortez et al. 2025).

La demi-vie d'élimination du minoxidil oral est de 3 à 4 heures, et il est principalement excrété

par les reins. Ces paramètres pharmacocinétiques confirment que si le passage systémique est
limité, il n'est pas négligeable et justifie une évaluation complète des effets à distance.

5. Effets secondaires :

La majorité des effets indésirables du minoxidil sont d'ordre local, et se manifestent

par des irritations du cuir chevelu, des démangeaisons, une sécheresse cutanée ou une
desquamation (Messenger et Rundegren 2004). De manière plus paradoxale, une hypertrichose
faciale peut survenir, notamment chez les femmes, un effet cohérent avec son mécanisme
d'action systémique (Trueb 2009).

Les effets indésirables systémiques sont généralement rares et se manifestent principalement

par des symptômes cardiovasculaires tels que des palpitations, une tachycardie, ou œdèmes liés
à une rétention hydro-sodée, notamment en cas d'application de doses élevées ou sur une peau
lésée (Suchonwanit et al. 2019b).

Les données bibliographiques sur l’effet du minoxidil sur l’infertilité masculine restent limitées.
En revanche, les données précliniques suggèrent qu’une exposition systémique élevée au
minoxidil peut affecter la fonction testiculaire et les paramètres spermatiques chez les modèles
animaux (Santana et al. 2023).

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 Revue Bibliographique

Chapitre 2 : La Fertilité masculine

I. L’appareil reproducteur masculin :

L'appareil reproducteur masculin forme un système intégré dont la fonction principale est
d'assurer la production, la maturation, le stockage et la délivrance des gamètes mâles (Wu
2022). Comme l'illustre la Figure 7, l’appareil reproducteur renferme des structures externes,
le pénis et le scrotum, et internes telles que les testicules, l'épididyme, le canal déférent,
les vésicules séminales et la prostate.

Figure 7: Schéma anatomique de l'appareil reproducteur masculin

(Harry W. Schroeder et Barron 2023)

1. Les testicules :

Les testicules, gonades mâles pairs de configuration ovoïde d’une taille standard
d'environ 5 cm de long sur 3 cm de large, assurent une double fonction endocrine et exocrine
essentielle à la reproduction masculine. Localisés dans la poche scrotale où ils sont maintenus
par des structures ligamentaires spécialisées, leur position externe à la cavité abdominale est
cruciale : elle permet le maintien d'une température d'environ 2 à 4°C inférieure à la température
corporelle centrale, condition indispensable au bon déroulement de la spermatogenèse (Ivell
2007).

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 Revue Bibliographique

Figure 8 : Structure du testicule (Girsh 2021a)

1.1 La fonction exocrine : la spermatogenèse

Comme illustré dans la Figure 8, la fonction exocrine est assurée par les tubes
séminifères qui représentent 80% du volume testiculaire. Ces structures complexes abritent le
processus de la spermatogenèse, séquence de différenciation cellulaire qui transforme les
spermatogonies souches en spermatozoïdes matures en approximativement 74 jours chez
l'homme (França et al. 2016). Ce processus dépend étroitement de l'activité des cellules de
Sertoli, qui forment la barrière hémato-testiculaire et fournissent un support nutritionnel et
structural aux cellules germinales tout au long de leur différenciation (Smith et Walker 2014).

1.2 La fonction endocrine : la stéroïdogenèse

Localisée dans l'espace interstitiel, la fonction endocrine est principalement assurée par
les cellules de Leydig situées dans le tissu interstitiel. Ces cellules spécialisées synthétisent
la testostérone (Midzak et al. 2009). La testostérone, hormone stéroïdienne essentielle, exerce
des effets systémiques incluant le maintien des caractères sexuels secondaires, la libido, la
masse musculaire et la densité osseuse (Shigehara et al. 2021). La production testiculaire de

14
 Revue Bibliographique

testostérone est régulée par l'hormone lutéinisante (LH) via l'axe hypothalamo-hypophyso-
gonadique (Walker 2009).

Ces deux fonctions sont étroitement couplées : la testostérone produite par les cellules de
Leydig diffuse vers les tubes séminifères où elle maintient la spermatogenèse à des
concentrations localement élevées, tandis que les cellules de Sertoli sécrètent de l'inhibine qui
régule négativement la production de FSH hypophysaire (França et al. 2016).

2. Le tractus génital :

• Voies spermatiques intra testiculaires : tubes séminifères, tube droit et rete testis.
• Voies spermatiques extra testiculaires : canaux ou cônes efférents, épididyme, canal
déférent éjaculateur.

3. Les glandes annexes :

Trois glandes accessoires les vésicules séminales, la prostate et les glandes bulbo-
urétrales contribuent à la formation du liquide séminal (Girsh 2021b).

3.1 Les vésicules séminales :

Produisent environ 60 % du volume séminal. Leur sécrétion, alcaline et visqueuse, est

particulièrement riche en fructose qui constitue la source énergétique principale des
spermatozoïdes (Gadea et al. 2013a).

3.2 La prostate :

Elle sécrète un liquide laiteux représentant environ 30 % du volume de l'éjaculat. Riche en

enzymes comme la phosphatase acide, ce liquide participe à la liquéfaction du sperme et à la
mobilité des spermatozoïdes (Gadea et al. 2013a).

3.3 Les glandes bulbo-urétrales :

Produisent un liquide pré-éjaculatoire qui lubrifie l'urètre et facilite le transit des

spermatozoïdes (Girsh 2021b).

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 Revue Bibliographique

4. La maturation post-testiculaire :

Après leur production au niveau des testicules, les spermatozoïdes immatures acquièrent
progressivement leur maturation et leur pouvoir fécondant lors de leur passage dans
l’épididyme. Ce conduit long et segmenté fournit un micro-environnement spécialisé où les
gamètes subissent des modifications biochimiques, membranaires et métaboliques (Belleannée
et al. 2012; Breton et al. 2019).
En effet, l’épithélium de l’épididyme leur apporte via de petites vésicules appelées
épididymosomes, les protéines, lipides et ARN indispensables à l’acquisition progressive de
leur motilité et de leur pouvoir fécondant (Sullivan et Saez 2013).

5. La Spermatogenèse :

La spermatogenèse est un processus de différenciation cellulaire continu, initié à la puberté

et se maintenant tout au long de la vie adulte. Elle transforme, au sein des tubes séminifères
testiculaires, les cellules souches germinales diploïdes (spermatogonies) en spermatozoïdes
haploïdes fonctionnels. Ce processus, qui s'étend sur environ 74 jours chez l'homme, repose sur
une séquence rigoureuse de divisions mitotiques et méiotiques (Sharma et al. 2020), comme
illustré dans la Figure 9.

Sur le plan structural, cette différenciation s'articule autour de trois phases successives et
interdépendantes (Girsh 2021a).

Figure 9: Processus de la spermatogenèse dans le testicule

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 Revue Bibliographique

5.1 Phase de multiplication :

Localisées dans le compartiment basal du tube séminifère, les spermatogonies, cellules

souches diploïdes, initient le processus par des divisions mitotiques. Une division asymétrique
produit une cellule souche fille "Ad" maintenant le pool de cellules souches, et une cellule "Ap"
engagée dans la différenciation. Les spermatogonies Ap génèrent ensuite les spermatogonies B,
précurseurs des spermatocytes I (De Rooij et Grootegoed 1998; Staub et Johnson 2018).

5.2 Phase de maturation méiotique :

Cette phase comprend deux divisions successives réduisant le nombre de chromosomes

de diploïde (2n) à haploïde (n). La première division méiotique, réductionnelle, transforme les
spermatocytes I en spermatocytes II. La deuxième division, équationnelle, sépare les
chromatides sœurs pour produire les spermatides rondes haploïdes, assurant la diversité
génétique par recombinaison (Gadea et al. 2013b).

5.3 Phase de différenciation (spermiogenèse) :

La spermiogenèse correspond à la transformation progressive des spermatides rondes

en spermatozoïdes matures, sur une période d’environ 23 jours. Durant cette phase, plusieurs
modifications structurales et fonctionnelles essentielles se produisent. Le noyau subit une
condensation chromatinienne par remplacement des histones par des protamines, un processus
qui protège l’intégrité du génome et met un terme à l’activité transcriptionnelle (Hao et al.
2019). Simultanément, se forment l’acrosome, structure contenant les enzymes indispensables
à la fécondation, et le flagelle, dont la pièce intermédiaire accueille les mitochondries
fournissant l’énergie nécessaire à la mobilité. Enfin, le cytoplasme résiduel est éliminé. La
spermiogenèse s’achève avec la spermiation, étape au cours de laquelle les spermatozoïdes
matures sont libérés dans la lumière du tube séminifère (Hess et De Franca 2009).

Ces transformations structurales aboutissent à la formation d'un spermatozoïde mature, une

cellule hautement différenciée (Figure 10).

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 Revue Bibliographique

Figure 10: La spermiogenèse : transformation de la spermatide en spermatozoïde

mature(Girsh 2021a)

6. La Régulation Hormonale :

La fonction reproductive masculine est sous le contrôle intégré de l'axe hypothalamo-

hypophyso-gonadique (HPG)(Figure 11). L'activation de cet axe débute au niveau cérébral par
la sécrétion pulsatile de la GnRH (Gonadolibérine) par l'hypothalamus. Ce décapeptide est
acheminé via le système porte hypothalamo-hypophysaire vers l'hypophyse antérieure, où il
stimule la synthèse et la libération des gonadotrophines : la FSH (hormone folliculo-stimulante)
et la LH (hormone lutéinisante). La FSH, en synergie avec la testostérone secrétée par les
cellules de Leydig, module l’activité de l’épithélium séminifère en ciblant la lignée germinale
et les cellules de Sertoli. Ces dernières assurent un rétrocontrôle négatif sur la FSH via la
sécrétion d’inhibine. Parallèlement, la LH stimule les cellules de Leydig, induisant la
biosynthèse de testostérone (Sofikitis et al. 2008; Boehm et al. 2015).

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 Revue Bibliographique

Figure 11:La régulation hormonale de la spermatogenèse

(Brown et al. 2024)

II. L'infertilité masculine :

L'infertilité du couple, définie par l'incapacité à concevoir après au moins 12 mois de

rapports sexuels réguliers non protégés, représente un défi majeur de santé publique. Ce
problème affecte approximativement 15 % des couples en âge de procréer à l'échelle mondiale,
environ 48,5 millions de couples confrontés à cette difficulté (Agarwal et al. 2015; Murshidi et
al. 2020; OMS 2021; Huang et al. 2023).

L’infertilité masculine est impliqué dans près de 50 % des cas d'infertilité, agissant
comme cause exclusive dans environ 20 % des situations et en association avec un facteur
féminin dans 30 % (Choy et Eisenberg 2018; Agarwal et al. 2021; Sharma et al. 2021).

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 Revue Bibliographique

1. Diagnostic de l'infertilité masculine :

1.1 Le Spermogramme et le spermocytogramme :

• Définition :

Le spermogramme est l’examen-clé et de première intention dans l’exploration de

l’infertilité masculine. Il consiste en une analyse macroscopique et microscopique du sperme,
recueilli après une période d’abstinence de 2 à 7 jours, afin de fournir une évaluation
quantitative et qualitative de la fonction spermatique.

Le spermocytogramme se focalise sur l'analyse détaillée de la morphologie des

spermatozoïdes (Boitrelle et al. 2021).

• Analyse des paramètres spermatiques :

L’interprétation du spermogramme et spermocytogramme (Tableau 1) repose sur les valeurs

de référence établies par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Ces critères sont issus
d’un processus rigoureux et révisé périodiquement à partir de données épidémiologiques
mondiales (OMS 2021; Björndahl et Kirkman Brown 2022).

Tableau 1 : Anomalies spermatiques et valeurs de référence de l'OMS (2021) (OMS

2021).

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 Revue Bibliographique

1.2 Les investigations complémentaires :

Le diagnostic de l’infertilité commence par l’analyse spermatique (spermogramme) auquel

s’ajoutent des investigations complémentaires essentielles telles les antécédents médicaux, les
examens physiques, les analyses de sang et d'imagerie. Ces investigations complémentaires
s'articulent autour de trois axes principaux : le bilan hormonal, l'imagerie médicale et le
diagnostic génétique.

• Le bilan hormonal : il comprend le dosage de la FSH, de la LH, de la testostérone,

parfois de l’inhibine B ou d’autres marqueurs endocriniens pour évaluer la fonction
testiculaire et gonadique.
• L'échographie et doppler: elle permet de détecter d’éventuelles anomalies structurales
telles que la varicocèle, l’atrophie testiculaire, l’obstruction des voies spermatiques, les
malformations pouvant expliquer une altération spermatique (Huyghe et al. 2023).
• Le diagnostic génétique : il permet d’étudier la fragmentation de l’ADN, le caryotype,
les micro-délétions sur le chromosome Y ou les mutations lorsque le spermogramme et
les autres bilans ne suffisent pas à expliquer l’infertilité, notamment en cas
d’azoospermie ou d’oligozoospermie sévère (Tournaye et al. 2017; Krausz et Riera-
Escamilla 2018b).

2. Étiologies de l'infertilité masculine :

L’infertilité masculine résulte de multiples mécanismes pouvant altérer la production ou la

fonction des spermatozoïdes(Choy et Eisenberg 2018). Parmi les causes principales figurent :

- les anomalies génétiques affectant les gènes ou les chromosomes impliqués dans la
spermatogenèse (Krausz et Riera-Escamilla 2018a).
- les déséquilibres hormonaux perturbant l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique
(Babakhanzadeh et al. 2020).
- les anomalies structurelles du tractus génital pouvant obstruer le transport spermatique
(Agarwal et al. 2021; Henkel et al. 2021) .
- les infections génitales notamment à Chlamydia trachomatis ou Neisseria gonorrhoeae
(Agarwal et al. 2018).

21
 Revue Bibliographique

- les facteurs liés au mode de vie (toxines, tabac, alcool, obésité, exposition à la chaleur)
contribuent également à la dégradation de la qualité spermatique (C. H. Glazer et al. 2017;
Liu et al. 2017; Al-Otaibi 2018; Fainberg et Kashanian 2019).
- les maladies chroniques comme le diabète ou l’hypertension (C. Glazer et al. 2017; Fainberg
et Kashanian 2019).
- l’infertilité idiopathique connue sous le nom de l’infertilité inexpliquée lorsque aucune
cause identifiable n'est mise en évidence (Sengupta et al. 2022).

2.1 Infertilité masculine et médicaments :

Un large éventail de médicaments, en dehors de ceux utilisés pendant la chimiothérapie, sont

considérés toxiques pour les cellules germinales et peuvent compromettre la fertilité
masculine.
Les psychotropes tels que les antidépresseurs et les anxiolytiques peuvent induire une
toxicité testiculaire via un stress oxydatif accru, une inflammation et une apoptose, altérant
la spermatogenèse, la mobilité et la survie des spermatozoïdes (Hamed et al. 2023b).
D’autres médicaments comme les anti-hypertensifs, les anti-inflammatoires, les
immunosuppresseurs et les inhibiteurs hormonaux montrent des effets délétères sur la
spermatogenèse, la maturation spermatique, la fonction éjaculatoire, voire l’ADN
spermatique (Alhamam et al. 2023).

Par ailleurs, certains médicaments comme les anticonvulsivants ont aussi été identifiés
comme ayant un impact négatif sur la fertilité masculine, affectant la spermatogenèse et la
qualité spermatique chez les patients traités chroniquement (Asghar et al. 2024b).
Par conséquent, le traitement médicamenteux chez les hommes en âge de concevoir doit être
prescrit en tenant compte de son impact potentiel sur la fertilité.

22
Matériel et
Méthodes
 Matériel & Méthodes

I. Type de l’étude :

Il s’agit d’une étude expérimentale conduite sur des patients adressés pour exploration
d’infertilité au Service de Biologie de la Reproduction du Centre de Maternité et de
Néonatologie de l’Hôpital Fattouma Bourguiba de Monastir.

La période d’inclusion s’est étendue sur 6 mois, de février à juillet 2025.

II. Considérations Éthiques :

Cette étude a été menée en stricte conformité avec les principes éthiques de la recherche
impliquant des échantillons biologiques humains. Le protocole a été approuvé par le comité
d’éthique de la Faculté de Médecine de Monastir (référence : IORG 0009738 N°115/OMB
0990-0279 ; (voir Annexe 1). Un consentement éclairé, libre et écrit a été obtenu de chaque
participant, autorisant l'utilisation de leurs échantillons de sperme à des fins de recherche
(Annexe 2).

III. Population d’étude :

Notre cohorte est constituée de 50 patients adressés au laboratoire pour analyse de

spermogramme dans le cadre d'un bilan d'infertilité.

1. Critères d'inclusion

Dans cette étude, nous avons inclus les échantillons spermatiques des patients :
• Ayant un âge moins de 50 ans
• Sans antécédents urologiques
• Sans traitement médical
• Non tabagiques
• Non alcooliques
• Sans exposition professionnelle à des produits toxiques ou à la chaleur

24
 Matériel & Méthodes

2. Critères d’exclusion

Nous n’avons pas inclus les échantillons spermatiques présentant une :

• Azoospermie (absence de spermatozoïdes)
• Asténozoospermie (mobilité totale <40%)
• Oligozoospermie (concentration < 15 million/ml)
• Nécrozoospermie (vitalité < 58%)
• Leucospermie (leucocytes > 1 million/ml)
• Hypospermie (volume < 1,5 ml)

IV. Matériel

1. Produits et réactifs :

Les composés majeurs comprennent le diméthylsulfoxyde (DMSO), le bromure

d’éthidium (BET), le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium
(MTT), fournis par Saint Aubin (France). Le réactif de Bradford a été obtenu auprès de Bio-
Rad. Le 2',7'-dichlorodihydrofluorésceine diacétate (DCFH-DA), l’acide thiobarbiturique
(TBA) et la Rhodamine 123 (Rh 123) proviennent de Sigma-Aldrich (France). Tous les autres
produits chimiques utilisés sont de qualité analytique et ont été fournis par Sigma-
Aldrich ou Santa Cruz Biotechnology.

Le médicament utilisé : le minoxidil, médicament à usage topique à 5%.

2. Matériel biologique : Le sperme

2.1 Origine des échantillons :

Les échantillons de sperme utilisés dans cette étude proviennent de la cohorte de patients
précédemment décrite (section III).

2.2 Protocole de recueil

Le recueil du sperme est réalisé au service, après une période d’abstinence sexuelle de 2
à 5 jours, par masturbation dans un flacon stérile à large ouverture.

25
 Matériel & Méthodes

V. Méthodes :

1. Préparation et analyse initiale des échantillons de sperme :

1.1 Liquéfaction :

Après le recueil, chaque échantillon de sperme est incubé à 34°C pendant 30 minutes dans
une étuve pour permettre sa liquéfaction complète, conformément aux recommandations de
l'OMS (2021). Ce processus physiologique est principalement médié par des enzymes
protéolytiques d'origine prostatique.

1.2 Évaluation des paramètres spermatiques selon les critères de l'OMS :

L'analyse des échantillons de sperme après liquéfaction inclue une évaluation macroscopique
et microscopique. Les paramètres mesurés, les méthodes utilisées et les valeurs de référence
retenues, conformément au manuel de l'OMS (2021) sont synthétisés dans le Tableau 2.

Tableau 2 : Paramètres spermatiques analysés : type d'examen, méthodes, interprétation

et valeurs de référence selon l'OMS (2021)

Méthode Critères d'interprétation / Valeur de

Type d'examen Paramètre d'analyse Observation référence
(OMS 2021)
Normal : Homogène, blanchâtre
avec légère teinte jaunâtre. Homogène,
Aspect & Observation Anormal : très opaque. blanchâtre
Couleur visuelle directe Coloration rosée/brunâtre avec légère
(hémospermie). teinte
Macroscopique jaunâtre.
Volume Lecture sur tube Reflète la fonction des glandes ≥ 1,5 ml
gradué annexes.
Observation de Normal : Écoulement goutte à Écoulement
Viscosité l'écoulement goutte. goutte à
(pipette Pasteur) Anormal (hypervisqueux) : goutte.
Écoulement en fil continu.
Normal : Équilibre des
sécrétions.

26
 Matériel & Méthodes

Macroscopique pH Mesure au pH- < 7,2 : Suspecte un défaut 7,2 - 8,0

mètre vésiculaire.
> 8,0 : Suspecte un défaut
prostatique.
Classification : Mobilité
• a : Progressive rapide totale
Observation • b : Progressive lente (a+b+c) ≥
Mobilité microscopique • c : mobile sur place 42%
(x40) • d : Immobile Mobilité
progressive
(a+b) ≥ 30%
Vivant : Incolore (membrane
Test à l'éosine intacte).
Vitalité (Williams). Mort : Rose (membrane ≥ 58 %
perméable).
Microscopique Comptage sur Calcul : (N × Fd × 10) / 1000 ≥ 16
Concentration cellule de Thoma, • N = Nombre compté millions/ml
(x400) • Fd = Facteur de dilution
Coloration (kit Évaluation d'au moins 200 ≥ 4 % de
Morphologie spermoscan) sur spermatozoïdes formes
frottis typiques
Technique d'Endtz Calcul identique à la
+ comptage sur concentration.
Leucocytes cellule de Thoma Une leucospermie est avérée si <1
(x400) le résultat est ≥ 1 million/ml. million/ml

2. Traitement des échantillons spermatiques :

Après recueil et analyse initiale, un volume de 300 µL de chaque échantillon

spermatique sélectionné a été incubé en présence de concentrations croissantes de Minoxidil
(0,126 µM ; 1 µM ; 10 µM) pendant 4 heures à 37°C, 5 % CO₂. Le choix des concentrations de
minoxidil a été déterminé en se basant d’une part sur les concentrations plasmatiques observées
chez l’homme, afin de reproduire des conditions physiologiquement réalistes, et d’autre part
sur les valeurs de référence rapportées dans la littérature scientifique (Ponomareva et al. 2024).

27
 Matériel & Méthodes

Les échantillons spermatiques ont été répartis en quatre groupes expérimentaux :

• Groupe 1 : échantillon spermatique sans ajout du médicament

• Groupe 2 : échantillon spermatique + minoxidil à 0,126 µM
• Croupe 3 : échantillon spermatique + minoxidil à 1 µM
• Croupe 4 : échantillon spermatique + minoxidil à 10 µM

Afin d’évaluer la toxicité du minoxidil sur les spermatozoïdes, diverses techniques ont été
réalisées sur les spermatozoïdes à l’état frais et d’autres ont été effectuées sur le liquide séminal
et les spermatozoïdes après congélation (Tableau 3) :

Tableau 3: Techniques d’évaluation de la toxicité du minoxidil sur les spermatozoïdes

Echantillon biologique Techniques adoptées

Mobilité spermatique
Vitalité spermatique
A l’état frais Spermatozoïdes Test MTT
Mesure du potentiel mitochondrial
Test au DCFHDA
Mesure de la SOD
Liquide séminale
Mesure de la CAT
Après congélation Mesure de la peroxydation lipidique
Culot spermatique Test de comètes
Test à l’acridine orange

La mobilité et la vitalité spermatiques ont été décrite dans le tableau 2 ci-dessus dans la section
V .Les autres techniques sont décrites dans les sections suivantes.

28
 Matériel & Méthodes

3. Dosage des protéines totales (méthode de Bradford) :

La concentration des protéines totales a été déterminée par la méthode de Bradford (1976).
Ce dosage, essentiel pour normaliser les résultats des analyses biochimiques, permet d'exprimer
les concentrations spécifiques en milligrammes de protéines par millilitre (mg/mL).

• Principe :

La quantification des protéines totales a été réalisée selon la méthode colorimétrique de

(Bradford 1976). Cette technique repose sur le changement spectral du colorant Bleu de
Coomassie G-250 : de forme protonée rouge-brun à l'état libre, il passe à une forme déprotonée
bleue lors de sa liaison aux groupements basiques et aromatiques des protéines. Ce déplacement
du pic d'absorption à 595 nm permet un dosage rapide et sensible, l'intensité de la coloration
bleue étant directement proportionnelle à la concentration protéique.

• Mode opératoire :

Le dosage a été réalisé en mélangeant 5 µL d'échantillon et 200 µL de réactif de Bradford

avec 795 µL d'eau distillée. Le blanc de réaction a été préparé en remplaçant l'échantillon par
un volume équivalent d'eau distillée. Après homogénéisation, les mélanges ont été incubés 10
minutes à l'obscurité à température ambiante. L'absorbance a été mesurée à 595 nm à l'aide d'un
spectrophotomètre. Une courbe étalon a été établie avec des concentrations croissantes de
sérum albumine bovine (BSA).

La concentration protéique des échantillons a été déterminée selon la formule suivante:

(𝐃𝐎₅₉₅ × 𝐅𝐃)
𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚𝐭𝐢𝐨𝐧 (𝐦𝐠/𝐦𝐋) =
𝒂

Avec :

• DO₅₉₅ : Densité optique mesurée à 595 nm

• FD : Facteur de dilution

a : Pente de la courbe étalon de BSA (mg/mL)⁻¹

29
 Matériel & Méthodes

4. Évaluation de la fonction mitochondriale :

4.1 Activité métabolique cellulaire (test MTT) :

• Principe :

Le test MTT est une méthode colorimétrique permettant d'évaluer l'activité métabolique
cellulaire via la mesure de l'activité des déshydrogénases mitochondriales. Le sel de tétrazolium
MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium), de couleur jaune, est réduit
en formazan, un composé violet insoluble, principalement par l'action de la succinate
déshydrogénase (SDH) (Figure12) (Reza Momeni et al. 2020). L'intensité de la coloration du
formazan, mesurée par spectrophotométrie après solubilisation, est ainsi proportionnelle à
l'activité enzymatique mitochondriale et reflète indirectement la capacité métabolique des
spermatozoïdes.

Figure 12 : La réduction du MTT par la succinate déshydrogénase mitochondriale.

• Mode opératoire :

Après traitement par des concentration différentes en minoxidil, les spermatozoïdes ont été
déposés dans une plaque de 96 puits à raison de 0,5 millions/puit. Une solution de MTT à
0,5mg/mL, obtenue par dilution au 1/10 a été ensuite ajoutée dans chaque puit (Annexe 3,
solution 1). Les plaques ont été incubées pendant 1 heure à 37°C, 5% CO₂, centrifugées et le
surnagent a été éliminé (Aziz 2006). Les cristaux de formazan ont été solubilisés dans du
DMSO. L'absorbance a été mesurée à 540 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. L'activité
mitochondriale relative pour chaque condition expérimentale a été calculée en pourcentage par
rapport à l'absorbance moyenne des puits contenant les spermatozoïdes non traités.

30
 Matériel & Méthodes

4.2 Etude du potentiel membranaire mitochondriale (test à la Rhodamine 123) :

• Principe :

La Rhodamine 123 (Rh123) est un fluorochrome cationique et lipophile qui traverse

passivement membranes plasmiques. Ce fluorochrome s'accumule électrophorétiquement dans
la matrice mitochondriale en fonction du potentiel transmembranaire (ΔΨm). Une fois
incorporée, la Rh123 émet une fluorescence verte à une longueur d'onde d'émission de 525-530
nm après excitation à 485-490 nm. L'intensité de fluorescence mesurée est donc directement
proportionnelle à la valeur du ΔΨm. Inversement, une diminution de la rétention de la Rh123,
se traduisant par une baisse de la fluorescence, indique une dépolarisation membranaire
mitochondriale, signe d'une chute du potentiel mitochondrial (Reza Momeni et al. 2020).

• Mode opératoire :

La mesure du ΔΨm a été réalisée sur des échantillons spermatiques (0,5 million de
spermatozoïdes) incubés avec 5 µM de Rhodamine 123 (Annexe 4, solution1) pendant 30
minutes à 37 °C, à l’obscurité. Les spermatozoïdes ont été ensuite lavées par centrifugation
(2000 rpm, 10 min) afin d’éliminer l’excès de fluorochrome non incorporé. Après suspension
du culot dans du PBS, la fluorescence a été mesurée à l’aide d’un fluorimètre (Biotek FLx800
; λ_ex = 485 nm, λ_em = 525 nm).

5. Etude du statut oxydatif :

5.1 Dosage des espèces réactives de l’oxygène in vitro par le test DCFH -DA :

• Principe :

La production intracellulaire d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) a été quantifiée en

utilisant le fluorochrome 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine diacétate (DCFH-DA) (Curtin et al.
2002; Mahfouz et al. 2010). Le principe réactionnel de ce test est illustré dans la Figure 13.

Le DCFH-DA, lipophile et non fluorescent, diffuse passivement à travers la membrane

plasmique des spermatozoïdes. Une fois à l'intérieur de la cellule, il est hydrolysé par des
estérases cytoplasmiques en DCFH, non fluorescent. En présence de ROS, principalement le
peroxyde d'hydrogène (H₂O₂), le DCFH est oxydé en 2',7'-dichlorofluorescéine (DCF), un
composé hautement fluorescent.

31
 Matériel & Méthodes

L'intensité de fluorescence du DCF est mesurée à des longueurs d'onde d'excitation et

d'émission de 485 nm et 535 nm, respectivement. Cette intensité fluorescente est directement
proportionnelle à la concentration intracellulaire en ROS, faisant de cette technique une
méthode sensible et largement utilisée pour évaluer le statut redox des spermatozoïdes
(Eruslanov et Kusmartsev 2010; Huang et al. 2016).

Figure 13 : Schéma illustrant le mécanisme réactionnel du DCFH-DA (Curtin et al. 2002)

• Mode opératoire :

Le dosage des radicaux libres a été réalisé dans des plaques 96 puits à une densité de 0,5
million de spermatozoïdes par puits. Les échantillons spermatiques ont été ensuite incubés
pendant 30 minutes à 37°C en présence du DCFH-DA à une concentration finale de
20µM (Annexe 5, solution 2). Après la période d'incubation, l'intensité de fluorescence a été
mesurée à l'aide d'un fluorimètre (Biotek FLx800) à une longueur d’onde d’excitation de 485
nm et d’émission de 525 nm.

32
 Matériel & Méthodes

5.2 Étude de la peroxydation lipidique : dosage du Malondialdehyde (MDA)

• Principe :

Le Malondialdehyde (MDA), produit terminal de la peroxydation des acides gras

polyinsaturés, a été conçu comme un marqueur spécifique de la peroxydation lipidique. La
méthode utilisée, selon Alvarez et Storey (1982), repose sur la formation d'un complexe coloré
entre le MDA et l'acide thiobarbiturique (TBA), formant un adduit MDA-TBA rose détectable
par spectrophotométrie à 546 nm.

• Mode opératoire :

La méthode consiste à ajouter 50 µL de lysat spermatique à 150 µL d'acide

trichloroacétique (TCA) à 40 % (Annexe 6, solution 1) et 100 µL d'eau distillée dans des tubes
maintenus dans la glace. Après centrifugation à 2500 tr/min pendant 10 min à 4°C, 100 µL de
surnageant ont été incubés avec 50 µL de TBA 0,14 M (Annexe 6, solution 2) et 20 µL de
NaOH 1 M (Annexe 6, solution 3). Les tubes, protégés de la lumière, ont été chauffés à 100°C
pendant 10 min puis refroidis 30 min à température ambiante. L'absorbance a été lue à 546 nm
sur lecteur ELISA (Biotek ELX).

La concentration en MDA a été calculée selon la loi de Beer-Lambert :

𝐃𝐎𝟓𝟒𝟔
Quantité de MDA (nmol MDA / mg de protéines) =
𝛆 ×𝑪

Où : DO₅₄₆ : Densité optique mesurée à 546 nm

ε : Coefficient d'extinction molaire = 0,11 L·nmol⁻¹·cm⁻¹

C : Concentration protéique de l'échantillon (mg/mL)

33
 Matériel & Méthodes

5.3 Evaluation de l’activité antioxydante de la superoxyde dismutase (SOD) :

• Principe :

La superoxyde dismutase (SOD) est une métalloenzyme antioxydante qui constitue la

première ligne de défense contre le stress oxydatif en catalysant la dismutation des radicaux
superoxydes (O₂•⁻) en peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) et en oxygène moléculaire (O₂) (Valko et
al. 2006), selon la réaction :
𝑺𝑶𝑫
2 O₂•⁻ + 2 H⁺→ H₂O₂ + O₂

La méthode de dosage spécifique utilisée dans ce travail repose sur le principe

d'inhibition de l'auto-oxydation du pyrogallol (Marklund et Marklund 1974). En présence
d'oxygène, le pyrogallol s'auto-oxyde spontanément dans un processus médié par les radicaux
O₂•⁻. La SOD neutralise le radical superoxyde en peroxyde d’hydrogène. Par conséquent,
l’inhibition de l’oxydation du pyrogallol est proportionnelle à l’activité enzymatique. Une unité
d'activité SOD est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour inhiber de 50 % l'auto-
oxydation du pyrogallol.

• Mode opératoire :

o Mesure de l'auto-oxydation:

Un mélange contenant 990 µL de tampon Tris (Annexe 7, solution 1) et 10 µL de pyrogallol

(Annexe 7, solution 2) a été préparé dans une cuve spectrophotométrique. Dès l'addition du
pyrogallol, l’auto-oxydation est mesurée à 420 nm pendant 1 minute. La variation d'absorbance
obtenue (ΔDO(blanc)) sert de référence pour 100% d'inhibition.

o Mesure de l'activité inhibitrice des échantillons :

Le protocole a été adapté en incorporant 20 µL d'échantillon et en ajustant le volume de

tampon Tris à 970 µL, avec maintien de 10 µL de pyrogallol. La variation d'absorbance
(ΔDO₍ₑᶜʰₐₙₜᵢₗₗₒₙ₎) a été déterminée dans des conditions identiques.

34
 Matériel & Méthodes

o Calcul de l'activité enzymatique spécifique :

L'activité SOD a été déterminée selon la formule :

(𝚫𝐃𝐎(𝐛𝐥𝐚𝐧𝐜)) − (𝚫𝐃𝐎₍ₑᶜʰₐₙₜᵢₗₗₒₙ₎)
% 𝒅′ 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒕𝒊𝒐𝒏 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍𝒆 = × 𝟏𝟎𝟎
(𝚫𝐃𝐎(𝐛𝐥𝐚𝐧𝐜))
% 𝒅′ 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒕𝒊𝒐𝒏
𝐀𝐜𝐭𝐢𝐯𝐢𝐭é (𝐔 𝐒𝐎𝐃 / 𝐦𝐠 𝐝𝐞 𝐩𝐫𝐨𝐭𝐞𝐢𝐧𝐞𝐬) =
𝒏 × 𝟓𝟎

Avec : DO : variation de la densité optique.

: quantité de protéine en mg présente dans le volume de l’échantillon utilisé.
50 : correspond à 1 U SOD = 50 % d’inhibition de l’auto-oxydation du pyrogallol.

5.4 Evaluation de l’activité antioxydante de la catalase (CAT)

• Principe :

L'activité catalase a été déterminée selon la méthode spectrophotométrique de (Aebi

1984). Cette enzyme catalyse la dismutation du peroxyde d'hydrogène en eau et oxygène
moléculaire selon la réaction :

Le dosage repose sur la mesure cinétique de la disparition du H₂O₂ par suivi de la diminution
d'absorbance à 240 nm.

• Mode opératoire :

Le mélange réactionnel a été préparé dans une cuve en quartz en ajoutant séquentiellement :

✓ 780 µL de tampon phosphate (Annexe 8, solution 1)

✓ 200 µL de peroxyde d’hydrogène (Annexe 8, solution 2)
✓ 20 µL d’échantillon

Le blanc a été préparé en remplaçant le peroxyde d’hydrogène par 200 µL de tampon phosphate.
La cinétique de disparition du H₂O₂ a été suivie par la diminution de la densité optique à 240
nm pendant 1 minute.

35
 Matériel & Méthodes

L'activité spécifique de la catalase a été déterminée selon la formule suivante :

 𝑫𝑶 × 𝟏𝟎
𝐀𝐜𝐭𝐢𝐯𝐢𝐭é 𝐜𝐚𝐭𝐚𝐥𝐚𝐬𝐞 (µ𝐦𝐨𝐥/ 𝐦𝐢𝐧 / 𝐦𝐠 𝐝𝐞 𝐩𝐫𝐨𝐭é𝐢𝐧𝐞𝐬) =
£ × 𝑪 × 𝑭𝒅

Avec : DO : Variation de la densité optique

£ : Coefficient d’extinction molaire de la catalase (0.04 mM-1 cm-1)

C : Concentration protéique (mg/ml)

Fd : Facteur de dilution

Une unité d'activité enzymatique (U) correspond à la quantité d'enzyme nécessaire pour
convertir 1 μmol de H₂O₂ par minute dans les conditions de l'essai.

6. Évaluation de l'intégrité de l'ADN :

6.1 Test de comète :

• Principe :

Le test comète, ou test de gel d'électrophorèse sur cellule unique, initialement décrit par
(Ostling et Johanson 1984), permet de détecter et de quantifier les cassures de l'ADN dans des
cellules individuelles. Après lyse cellulaire dans un gel d'agarose, les fragments d'ADN
endommagé migrent lors d'une électrophorèse, formant une « queue de comète »
fluorescente. La longueur et l'intensité de cette queue sont proportionnelles au degré de
dommage de l'ADN, permettant ainsi une évaluation visuelle et quantitative de la génotoxicité.

36
 Matériel & Méthodes

• Mode opératoire

- Le test comète a été réalisé selon la méthode décrite par (Ammar et al. 2019) avec
quelques modifications. Brièvement, les spermatozoïdes traités avec des concentrations
croissantes de minoxidil ont été fixés dans une solution méthanol-acide acétique (1, v/v) et
conservés à -20°C en attendant l'analyse. Pour la préparation des lames, une suspension
cellulaire de 60 µL a été mélangée à 60 µL d'agarose à point de fusion bas (LMP) à 1 % (Annexe
9, solution 1) et immédiatement déposée sur des lames préalablement enduites d'une couche
d'agarose à point de fusion normal (NMP) à 1 % (Annexe 9, solution 2). Les lames ont ensuite
été incubées pendant 10 minutes à 4°C pour solidification de l'agarose.
- Par la suite, les lames ont été immergées dans une solution de lyse (kit commercial,
Carid Medical Technology Co., Ltd.) et incubées pendant 1 heure à 4°C. Après la lyse, les lames
ont été placées dans une cuve d'électrophorèse horizontale remplie d'une solution tampon
d'électrophorèse (Annexe 9, solution 3) pendant 20 minutes pour permettre le débobinage de
l'ADN. L'électrophorèse a été réalisée pendant 30 minutes à 25 V. Les lames ont ensuite été
rincées trois fois, pendant 5 minutes chaque fois, dans un tampon de neutralisation (Annexe 9,
solution 4)
- Finalement, après séchage à l'air libre pendant 24 à 48 heures, les lames ont été colorées
avec 50 µL de bromure d'éthidium (BET). Les noyaux ont été observés et analysés à l'aide d'un
microscope à fluorescence Leica DM1000 LED équipé d'un objectif ×[Link] comptage visuel
de 100 comètes par lame (3 fois) permet de classer les noyaux des spermatozoïdes selon
l’intensité de la fluorescence de la queue de l’ADN obtenue en 5 classes : depuis la classe 0
(noyau intact) jusqu'à la classe 4 (noyau totalement endommagé).

L’indice de fragmentation de l’ADN (DFI) est estimé selon la formule suivante :

DFI comète = (% des cellules de la classe 0x0) + (% des cellules de la classe 1x1) + (% des cellules de la
classe 2x2) + (% des cellules de la classe 3x3) + (% des cellules de la classe 4x4)

Le DFI final est obtenu en calculant la moyenne de trois lectures réalisées sur différents champs
de la lame pour chaque échantillon.

37
 Matériel & Méthodes

6.2 Test à l'acridine orange

• Principe

Le test à l'acridine orange (AO) est une méthode fluorométrique permettant d'évaluer
l'intégrité de l'ADN spermatique, recommandée par le manuel de l'OMS. Cette technique repose
sur les propriétés métachromatiques du colorant : lié à l'ADN double brin natif, il émet une
fluorescence verte, tandis que sa liaison à l'ADN simple brin dénaturé produit une fluorescence
rouge/orange. Ainsi, le pourcentage de fluorescence verte est proportionnel au taux d'ADN
intact (Varghese et al. 2011).

• Mode opératoire

La méthode consiste à déposer 10 µL d'échantillon sur une lame propre, et laisser sécher à l’air
libre pendant 10 minutes. La solution de l’acridine orange (0,1 mg/mL, 20µl) est ensuite
ajoutée. La lecture s’effectue au microscope à fluorescence (filtre bleu, λex = 450, λem = 490nm).
L'analyse a porté sur un total de 300 spermatozoïdes par échantillon, comptés sur trois champs
microscopiques distincts (100 spermatozoïdes par champ).

La dénaturation de l'ADN spermatique a été calculé selon la formule suivante :

(𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐝𝐞 𝐒𝐏𝐙 à 𝐟𝐥𝐮𝐨𝐫𝐞𝐬𝐜𝐞𝐧𝐜𝐞 𝐫𝐨𝐮𝐠𝐞/𝐨𝐫𝐚𝐧𝐠𝐞)

% 𝐝𝐞 𝐝é𝐧𝐚𝐭𝐮𝐫𝐚𝐭𝐢𝐨𝐧 𝐝𝐞 𝐥′𝐀𝐃𝐍 = × 100
𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥 𝐝𝐞 𝐬𝐩𝐞𝐫𝐦𝐚𝐭𝐨𝐳𝐨ï𝐝𝐞𝐬 𝐜𝐨𝐦𝐩𝐭é𝐬)

7. Analyse statistique :

Les données ont été analysées en utilisant le logiciel SPSS, version 26 (Statistical Package for
Social Sciences). La normalité de la distribution des variables quantitatives est effectuée en
utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov et le test de Shapiro-Wilk. Les variables qui présentent
une distribution normale sont exprimés en moyenne ± écart type.
L'ensemble des résultats a fait l'objet d'une analyse de variance (ANOVA), suivie de tests post
hoc à comparaisons multiples avec correction de Bonferroni, pour la comparaison des
échantillons appariés.

Les différences sont calculées avec un pourcentage de confiance « p ».

38
Résultats
 Résultats

1. Etude de l’effet du minoxidil sur la mobilité spermatique :

1. Etude de la mobilité progressive :

L'exposition au minoxidil a montré une réduction de la mobilité progressive des

spermatozoïdes d’une manière dose-dépendante. Cette diminution est significative entre la
mobilité des spermatozoïdes non traités et ceux traités au minoxidil au 0,126 µM (p < 0,01),
µM et 10µM. À la concentration de 10 µM, une diminution de 47% a été observée par rapport
au groupe non traité, avec des valeurs passant de 17 ± 5,57% à 9±5,09% (p < 0,01).

25

20 a**
Mobilité progressive (%)

b**
c*
15

10

0
0 0,1 1 10
Minoxidil (µM)

Figure 14: Impact dose-dépendant du minoxidil sur la mobilité progressive

(** a : différence hautement significative vs groupe non traité (p< 0.01), **b : différence
hautement significative vs concentration 0,1µM (p< 0.01), *c : différence significative vs
concentration 1µM (p< 0.05).)

1.2 Etude de la mobilité totale :

La figure ci-dessous montre que le minoxidil inhibe significativement la mobilité totale des
spermatozoïdes. Comparativement au groupe non traités, l'exposition à 10 µM réduit cette
mobilité de 30%, avec des valeurs passant de 43% ± 10,32 à 30% ± 9,76 (p < 0,01). Des
différences significatives sont également observées entre la concentration de 10 µM et celles
de 0,1 µM (p < 0,05) et 1 µM (p< 0,05).

40
 Résultats

60

50 a**
b*
Mobilité totale (%) 40 c*

30

20

10

0
0 0,1 1 10
Minoxidil (µM)

Figure 15 : Effet du minoxidil sur la mobilité totale des spermatozoïdes

* a : différence hautement significative vs le groupe non traité (p< 0.01), *b : différence
significative vs concentration 0,1µM (p< 0.05), *c : différence significative vs concentration
1µM (p< 0.05)).

2. Etude de l’effet du minoxidil sur la vitalité spermatique

L'évaluation de la vitalité spermatique après 4 heures d'exposition au minoxidil n'a

révélé aucune variation statistiquement significative, quel que soit la concentration testée
(0,126 ; 1 et 10 µM), par rapport au groupe non traité (p > 0,05).

90
80
% de vitalité spermatique

70
60
50
40
30
20
10
0
0 0,126µM 1µM 10µM
Minoxidil (µM)

Figure 16: Effet du Minoxidil sur la vitalité spermatique après 4 heures d'exposition
41
 Résultats

3. Effet du Minoxidil sur le statut oxydatif au niveau du sperme :

3.1 Mesure des ROS au niveau des spermatozoïdes : le test DCFH-DA

Le test DCFH-DA a révélé une production dose-dépendante d'espèces réactives de

l'oxygène (ROS) sous l'effet du minoxidil (Figure 17). Comparativement au groupe témoin non
traité (4503,83 ± 1737,15), les concentrations de 0,126 µM, 1 µM et 10 µM augmentent
significativement les niveaux de ROS d’environ 1,6 fois, 1,69 fois et 1,96 fois respectivement
(p < 0,001). Les valeurs correspondantes sont de (7219,34 ±2001,23) à 0,126 µM, (7634,85 ±
1941,48) à 1 µM, et (8856,09 ± 2627,46) à 10 µM.

14000

12000 a***

10000 a*** a***

Fluorescence (DCF)

8000

6000

4000

2000

0
0 0,1 1 10

Minoxidil (µM)

Figure 17: Effet du minoxidil sur la production de ROS dans les spermatozoïdes
(*** a : différence très hautement significative vs non traité (p< 0.001))

42
 Résultats

3.2 Étude de la peroxydation lipidique au niveau des spermatozoïdes : dosage du

Malondialdehyde (MDA) :

L'exposition au minoxidil pendant 4 heures augmente significativement la peroxydation

lipidique, mesurée par le taux de Malondialdehyde (MDA). Une élévation spécifique est
observée à la concentration de 10 µM, avec une augmentation de 19,92 % par rapport au groupe
non traité (p < 0,01). Les valeurs passent de 88,02± 18,07µmol/mg de protéine au niveau du
groupe non traité à 105,55 ± 10,03µmol/mg de protéine au niveau du groupe traité à 10 µM.

140

120 a*,b*,c*
µmol de MDA/mg de prot

100

80

60

40

20

0
0 0,1 1 10
Minoxidil (µM)

Figure 18: Effet du minoxidil sur la peroxydation lipidique au niveau des spermatozoïdes

(*a : différence significative vs non traité (p < 0,005), *b : différence significative vs au

concentration 0,1 µM (p < 0,005), *c : différence significative vs au concentration 1 µM
(p<0,005))

43
 Résultats

3.3 Evaluation de l’activité enzymatique antioxydante au niveau du liquide

séminale :

• Activité de la superoxyde dismutase (SOD) :

L'évaluation de l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) n'a révélé aucune variation

statistiquement significative après 4 heures d'exposition des spermatozoïdes aux différentes
concentrations de minoxidil (0,126 ; 1 et 10 µM) par rapport au groupe non traité (p > 0,05).

60

50
U SOD/mg de prot

40

30

20

10

0
0 0,1 1 10
Minoxidil (µM)

Figure 19: Activité de la superoxyde dismutase (SOD) après traitement au Minoxidil

44
 Résultats

• Evaluation de l’activité antioxydante de la catalase (CAT) :

Bien qu'une augmentation dose-dépendante de l'activité catalase ait été observée après
exposition des spermatozoïdes au minoxidil (0,126 ; 1 et 10 µM) pendant 4 heures, les
différences avec les groupes non traités ne sont pas statistiquement significatives (p > 0,05).

1400
Activité catalase (µmol H2O2/min/mg de

1200

1000

800
prot)

600

400

200

0
0 0,1 1 10
Minoxidil (µM)

Figure 20 : Evaluation de l’activité antioxydante de la catalase

45
 Résultats

4. Effet du Minoxidil sur la fonction mitochondriale au niveau des

spermatozoïdes :

4.1 Evaluation de l’activité mitochondriale des spermatozoïdes (test MTT) :

L'activité mitochondriale, évaluée par le test MTT, est significativement inhibée par le
minoxidil. La concentration de 10 µM réduit l'activité de 52,7% par rapport au groupe non
traité, avec des valeurs passant de 1,16 ± 0,47 à 0,55 ± 0,2 (p < 0,01). Une diminution hautement
significative est également observée entre 10 µM et 1 µM (p < 0,001).

1,8

1,6

1,4
Absorbance MTT (DO)

1,2

1
a**
0,8 c***
0,6

0,4

0,2

0
0 0,1 1 10
Minoxidil (µM)

Figure 21 : Effet du minoxidil sur l'activité mitochondriale des spermatozoïdes

( ** a : différence très hautement significative vs non traité (p< 0.01), ***c : différence très
hautement significative vs au concentration 1 µM (p< 0.001))

46
 Résultats

4.2 Mesure du potentiel membranaire mitochondrial

L'exposition des spermatozoïdes à différentes concentrations de minoxidil (0,126 ; 1 et 10

µM) a montré une diminution significative (p < 0,001) du potentiel membranaire mitochondrial,
proportionnelle à la dose, par rapport à ceux non traités.

Comparativement au groupe non exposé (84975,73 ± 11565,45), on observe des réductions

progressives et significatives : 38,7% à 0,126 µM (52060,62 ±14448,13 ; p<0,001), 57% à 1
µM (36536,88 ± 11702,86 ; p<0,001), et 72,2% à 10 µM (23615,35 ± 9185,29 ; p<0,001). La
concentration de 10 µM diffère également significativement des concentrations inférieures (p
< 0,001).

120000

100000
Fluorescence (Rh123)

80000
a***
60000
a*** a***
b***
40000
c***

20000

0
0 0,1 1 10
Minoxidil (µM)

Figure 22: Effet du minoxidil sur le potentiel de membrane mitochondriale des

spermatozoïdes
(*** a : différence très hautement significative vs non traité (p< 0.001), ***b : différence très
hautement significative vs concentration 0,1 µM (p< 0.001), ***c : différence très hautement
significative vs 1 µM (p< 0.001)).

47
 Résultats

5. Effet du Minoxidil sur la qualité de l’ADN spermatique :

5.1 Test de comètes :

L'analyse par microscopie à fluorescence (Figure 23 A) a révélé une nette différence

morphologique entre les groupes. Les spermatozoïdes du groupe non traité présentent
majoritairement des noyaux à la forme circulaire et homogène, caractéristique d'un ADN intact
et non fragmenté. En revanche, les spermatozoïdes des groupes exposés au minoxidil montrent
des noyaux avec un aspect de « comètes ». La présence et la longueur de la queue de chaque
comète sont directement corrélées au degré de fragmentation de l'ADN spermatique au niveau
du spermatozoïde.

Après avoir fait l’analyse quantitative de la fragmentation de l’ADN (figure 23 B), nous
avons montré une augmentation significative et dose-dépendante du pourcentage de
fragmentation de l’ADN spermatique (p < 0,001), comparativement au groupe non traité. En
effet, ce pourcentage passe de 4,39 ± 3,57 dans le groupe non traité à 19,79 ± 13,25 pour la
concentration de 0,126 µM, soit une augmentation d’environ 4,5 fois. Cette élévation devient
plus marquée à 1 µM, où la fragmentation atteint 36,78 ± 16,15, correspondant à une
multiplication par 8 (p < 0,001). La concentration de 10 µM induit l’augmentation la plus
importante, avec une valeur de 48,09 ± 13,46, soit environ 11 fois celle du témoin (p < 0,001).
Par ailleurs, les concentrations de 1 µM et 10 µM diffèrent significativement de celle de 0,126
µM (p < 0,001), indiquant une progression nette de l’effet du minoxidil avec la dose. Enfin, le
minoxidil à 10 µM entraîne une fragmentation significativement plus élevée que celle observée
à 1 µM (p < 0,001). Ces résultats quantitatifs viennent étayer les observations qualitatives
réalisées en microscopie à fluorescence.

48
 Résultats

A.

c***
70
b***
% de fragmentation de l'ADN spermatique (DFI)

60 b*** a***
a***
50

40
a***
30

20

10

0
0 0,126 µM 1 µM 10 µM

Minoxidil (µM)
B

Figure 23:Effet du minoxidil sur le % de fragmentation de l'ADN spermatique

(A : observation au microscope à fluorescence x1000, B : analyse quantitative de la

fragmentation de l’ADN, T : groupe non traité, C1 : 0,126 µM de minoxidil, C2 : 1 µM de
minoxidil et C3 : 10 µM de minoxidil ) (***a : différence très hautement significative vs non
traité (p < 0,001), ***b : différence très hautement significative vs au concentration 0,1 µM (p
< 0,001), ***c : différence très hautement significative vs au concentration 1 µM (p < 0,001))

49
 Résultats

5.2 Test à l'acridine orange :

Les spermatozoïdes du groupe non traité présentent essentiellement une fluorescence verte,
indiquant un ADN intact et non dénaturé. À l’inverse, les spermatozoïdes exposés au minoxidil
montrent une proportion plus importante de têtes fluorescentes jaune-orange, correspondant à
un ADN dénaturé et donc altéré (Figure 24A). Cette fluorescence jaune-orange apparaît
nettement plus prononcée dans les groupes traités, témoignant d’une atteinte de l’intégrité de
l’ADN induite par le minoxidil.

60 a***
b***
50 a***
b**
% Dénaturation de l'ADN

40

30
a***

20

10

0
0 0,1 1 10
Minoxidil (µM)
B

Figure 24:Effet du minoxidil sur la dénaturation de l'ADN spermatique

(A : observation au microscope à fluorescence x1000 ; B : analyse quantitative ; T : témoin
non traité, C1 : 0,126 µM de minoxidil, C2 : 1 µM de minoxidil et C3 : 10 µM de minoxidil) ,
(***a : différence très hautement significative vs non traité (p < 0,001), ***b : différence très
hautement significative vs au concentration 0,1 µM (p < 0,001), **b : différence hautement
significative vs concentration 0,1 µM (p< 0.01)).

50
 Résultats

L'analyse quantitative (Figure 24 B) a révélé une augmentation significative et dose-

dépendante de la dénaturation de l'ADN spermatique après traitement au minoxidil (p < 0,001).
Comparativement au groupe non traité (4 503,83 ± 1 737,15), le pourcentage de spermatozoïdes
présentant une dénaturation de l’ADN est six fois plus important à 0,126 µM, 8,5 fois plus
important à 1 µM, et onze fois plus important à 10 µM. Les concentrations de 1 µM et 10 µM
induisent également une augmentation significativement plus élevée que celle observée à 0,126
µM (p < 0,001).

51
Discussion
 Discussion

Le minoxidil est aujourd’hui un traitement de référence contre l’alopécie

androgénétique, mais son effet sur la fertilité masculine reste peu documenté. C’est dans ce
cadre que s’inscrit l’objectif de ce travail qui consiste à évaluer l'impact de ce médicament, sur
la qualité spermatique humaine.
Nos résultats ont révélé que le minoxidil à 0,1, 1 et 10 µM altère la qualité spermatique
en inhibant la mobilité progressive et totale après 4 h d’incubation. La diminution observée,
particulièrement de la mobilité progressive d’environ 47 % à 10µM, a un impact direct sur la
fertilité masculine. En effet, la mobilité progressive est essentielle pour que les spermatozoïdes
puissent atteindre l’ovule et assurer la fécondation. Selon les recommandations de l’OMS, une
mobilité progressive inférieure à 30 % définit une asthénozoospermie, une pathologie
fréquemment associée à l’infertilité masculine (OMS 2021). Nos résultats suggèrent donc que
le minoxidil, en compromettant significativement la mobilité spermatique, peut être un facteur
de risque d’asthénozoospermie et contribuer à l’apparition d’une infertilité masculine. L’effet
reprotoxique a été confirmé dans d’autres études in vivo, où ils ont montré que l’application
topique du minoxidil chez les rats réduit le volume des testicules, de l’épididyme et diminue la
mobilité des spermatozoïdes (Turkina et al. 2020). D’autres travaux ont révélé que
l’administration orale du minoxidil chez le rat, induit une diminution non seulement de la
mobilité spermatique, mais également une altération de la morphologie et une réduction de la
vitalité des spermatozoïdes (Santana et al. 2023; Turkina et al. 2020). Dans notre étude, la
vitalité spermatique n’a pas présenté de diminution significative après le traitement au
minoxidil. Cela suggère que le minoxidil n’a pas induit de mortalité notable.

Pour comprendre le mécanisme responsable de l’altération de la mobilité des

spermatozoïdes, nous avons étudié le statut oxydatif. En effet les espèces réactives de l’oxygène
(ROS) sont indispensables à plusieurs étapes clés nécessaires à la fécondation, notamment
l’hyperactivation, la capacitation, la réaction acrosomique et la fusion avec l’ovocyte (Serafini
et O’Flaherty 2022). Néanmoins, une production excessive de ROS devient délétère, car elle
peut altérer la qualité spermatique et induire des dommages oxydatifs (Wang et al. 2025).

Dans notre étude, le test au DCFH-DA a mis en évidence une augmentation notable de la
production de ROS, atteignant presque le double de celle observée dans les spermatozoïdes non
traités. Toutefois, les activités de la SOD et de la CAT n’ont montré aucune variation
significative. Cette divergence peut s’expliquer par le fait que le traitement induit une
production accrue de ROS à l’intérieur des spermatozoïdes, tandis que les enzymes
antioxydantes mesurées principalement sont localisées dans le liquide séminal et ne pénètrent
53
 Discussion

pas dans le spermatozoïde. Ainsi, malgré l’élévation intracellulaire des ROS, le système
enzymatique extracellulaire reste inchangé, ce qui explique l’absence de différence d’activité
entre les spermatozoïdes traités et non traités. Nos résultats confirment que les spermatozoïdes
sont particulièrement vulnérables aux radicaux libres en raison de leur faible capacité
antioxydante intracellulaire.
Par ailleurs, un excès de radicaux libres peut endommager les lipides, les protéines voir même
l’ADN des spermatozoïdes (Dutta et al., 2019). Par exemple, une production incontrôlée de
ROS peut déclencher une cascade de réactions conduisant à la peroxydation lipidique. Dans
notre étude, nous avons montré via le dosage du MDA, que le minoxidil induit une peroxydation
lipidique d’environ 20% à 10µM. L’augmentation des niveaux des ROS et de la peroxydation
lipidique observés après exposition des spermatozoïdes au minoxidil pourraient expliquer
l’altération de la mobilité. En effet, les lipides membranaires jouent un rôle central dans la
mobilité spermatique. La membrane des spermatozoïdes est riche en phospholipides contenant
des acides gras polyinsaturés (AGPI), qui assurent une fluidité optimale nécessaire au
déplacement des spermatozoïdes (Collodel et al. 2020). Cependant, les AGPI sont des cibles
majeures pour les ROS (Chakroun Feki et al. 2003). Cette interaction conduit à une
peroxydation lipidique, un processus en chaîne où les lipides sont oxydés et cette cascade de
peroxydation altère à son tour la fluidité membranaire et réduit la mobilité des spermatozoïdes.
Le minoxidil est un médicament largement connu pour son action vasodilatatrice,
principalement utilisée dans le traitement de l’hypertension artérielle et de l’alopécie, par
stimulation des canaux potassiques ATP-dépendant (KATP) (Patel et al. 2025). Cependant, peu
d’études se sont intéressées à son rôle dans le stress oxydatif. L’augmentation des ROS et de la
peroxydation lipidique observées pourraient s’expliquer par le fait que le minoxidil favorise
indirectement la production de radicaux libres en stimulant les canaux KATP. Par exemple,
l’étude de Fukushiro-Lopes et al., a montré que le minoxidil stimule la production de ROS au
niveau des mitochondries dans un modèle expérimental de cancer de l’ovaire (Fukushiro-Lopes
et al. 2020). Ces résultats suggèrent que, au-delà de ses effets pharmacologiques classiques, le
minoxidil peut induire un stress oxydatif susceptible d’affecter la fonction mitochondriale.

Les mitochondries, quant à elles, jouent un rôle primordial dans la génération d'énergie
nécessaire à la mobilité spermatique et la production contrôlée de ROS. En conséquence, toute
altération mitochondriale peut entraîner une augmentation de la production de radicaux libres
et induire un état de stress oxydatif au niveau des spermatozoïdes (Kumar 2023).

54
 Discussion

Afin de mieux comprendre la toxicité induite par le minoxdil, nous avons évalué l’activité de
la succino-déshydrogénase par le test MTT. Cette enzyme, participant à la fois au cycle de Krebs
et au complexe II de la chaîne respiratoire, sert d’indicateur de l’activité mitochondriale. Nos
résultats ont montré que l’activité de la succino-déshydrogénase est diminuée d’environ 52% à
10µM. Par ailleurs, nous avons observé une chute du potentiel mitochondrial d’environ 50 % à
1 µM et 72 % à 10 µM de minoxidil. Ces résultats confirment que les mitochondries constituent
une cible du minoxidil.
Le dysfonctionnement mitochondrial traduit non seulement une perturbation du moteur
énergétique des spermatozoïdes, mais peut également déclencher notamment à travers la chute
du potentiel mitochondrial (Dieamant et al. 2017). Afin de confirmer l’activation de cette voie,
nous avons évalué la fragmentation de l’ADN spermatique à l’aide du test des comètes et du
test à l’acridine orange. La fragmentation de l’ADN représente en effet l’une des étapes
terminales caractéristiques de l’apoptose.
Nos résultats confirment l’induction du processus apoptotique. En effet le minoxidil induit une
fragmentation significative de l’ADN atteignant environ 19%, 36% et 48% à 0.1 µM, 1 µM et
10µM, respectivement. De manière concordante, le test à l’acridine orange révèle une
dénaturation de l’ADN d’environ 22%, 32% et 42% pour ces mêmes concentrations.
Par ailleurs, la fragmentation de l'ADN spermatique est souvent associée à une diminution de
la fertilité masculine (Kim 2018). Une telle altération génétique peut compromettre la qualité
du sperme et réduire les chances de conception (McQueen et al. 2019). Ainsi, nos résultats
suggèrent que l’exposition au minoxidil pourrait potentiellement contribuer à une infertilité
masculine.

En conclusion, nos résultats ont montré que le minoxidil altère la mobilité spermatique, un effet
probablement lié à une perturbation de la fonction mitochondriale. Cette altération
mitochondriale induit un stress oxydatif marqué, active la voie apoptotique intrinsèque et
conduit finalement à une fragmentation de l’ADN spermatique. L’ensemble de ces effets
pourrait être expliqué par l’ouverture des canaux KATP au niveau des mitochondries.

Ces observations nécessitent toutefois d’être confirmées par des études

complémentaires, notamment des essais cliniques, afin de confirmer le potentiel reprotoxique
du minoxidil chez l’être humain. Un dosage sérique du minoxidil est requis chez les patients
sous traitement à long terme. Une évaluation de la mobilité, de la vitalité, et de la fragmentation
de l’ADN doit être également envisagée.

55
 Discussion

Compte tenu du risque possible pour la fertilité masculine, il est essentiel que les cliniciens
soient conscients de ces effets et qu’ils en tiennent compte lors de la prescription du minoxidil,
en particulier chez les patients en âge de procréer ou présentant des troubles de la fertilité. Une
surveillance andrologique ciblée, incluant un spermogramme et un test de fragmentation de
l’ADN, peut être recommandée chez les hommes ayant recours au minoxidil.

56
Conclusion
 Conclusion

Le minoxidil constitue aujourd’hui l’un des traitements les plus répandus de l’alopécie
androgénétique. Pourtant, malgré son utilisation fréquente chez l’homme, ses effets potentiels
sur la fonction reproductive masculine demeurent encore mal explorés. Dans cette optique, nous
visons à analyser l’effet du minoxidil sur les spermatozoïdes humains in vitro.

Nos résultats ont montré qu’à des concentrations de 0,1 à 10 µM, le mioxidil entraîne
une diminution nette de la mobilité progressive et totale dès 4 heures d’exposition. La réduction
marquée à 10 µM mène à déduire que le minoxidil peut être considéré comme un risque pour
la fertilité masculine. En effet, une mobilité insuffisante peut s’inscrire dans le cadre d’une
asthénozoospermie, pathologie intimement liée à une baisse du potentiel fécondant masculin
(OMS 2021).

L’exploration du statut oxydatif a permis de mieux comprendre l’origine de la baisse de

la mobilité spermatique. Les ROS (espèces réactives de l’oxygène), indispensables en faible
quantité à certaines étapes fonctionnelles du spermatozoïde, deviennent rapidement toxiques
lorsqu’ils s’accumulent. Nous avons constaté, via le test DCFH-DA, une augmentation
importante de la production des ROS dans les groupes traités. En revanche, les activités de la
SOD et de la CAT du liquide séminal restent stables, probablement parce que les ROS générés
se trouvent majoritairement à l’intérieur du spermatozoïde, où les réserves antioxydantes
naturelles sont limitées. La conséquence directe de cette surcharge oxydative est une attaque
des lipides membranaires. Les membranes des spermatozoïdes, riches en acides gras
polyinsaturés, sont essentielles à la fluidité et à la mobilité, mais très vulnérables à l’oxydation
(Chakroun Feki et al. 2003; Collodel et al. 2020). Une augmentation significative du taux du
MDA à 10 µM a été remarquée confirmant une peroxydation lipidique importante. Les ROS
ainsi que la peroxydation lipidique peuvent être une cause ou conséquence du
dysfonctionnement mitochondriale.

Afin de bien élucider le mécanisme de toxicité du minoxidil, nous avons évaluer la

fonction mitochondriale. Nous avons remarqué une diminution importante de l’activité de la
succino-déshydrogénase à la dose la plus élevée du médicament. Également, nous avons
observé une chute du potentiel mitochondrial. Une telle baisse du potentiel mitochondrial
constitue souvent un signal déclencheur de la voie apoptotique intrinsèque.

58
 Discussion

Ces observations nous ont conduit à évaluer l’intégrité de l’ADN spermatique. Les
analyses de comètes ont montré une fragmentation de l’ADN dose-dépendante corroborée par
la dénaturation mesurée par acridine orange.

L’ensemble de nos résultats converge vers l’idée que le minoxidil, peut perturber la
qualité spermatique notamment la mobilité, l’équilibre oxydatif, le fonctionnement
mitochondrial et l’intégrité de l’ADN. Bien qu’il s’agisse d’une étude in vitro, ces éléments
soulignent l’importance de conduire des investigations cliniques, notamment chez les hommes
utilisant le minoxidil de manière prolongée. Une évaluation régulière de la mobilité spermatique
et de la fragmentation de l’ADN pourrait être envisagée, particulièrement chez les patients en
âge de procréation.

59
 Références
bibliographiques
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X
Annexes
 Annexes

Annexe 1 :
 Annexes

Annexe 2 :
 Annexes

Annexe 3 : la solution utilisée pour Mesurer l’activité mitochondriale

(Test MTT)

Solution 1 : Préparation de la solution mère de MTT (5mg/ml) : dissoudre 5mg du MTT

(PM : 414.32 g\mol) dans 1ml du PBS.

NB : cette solution est conservée à -4°C.

 Annexes

Annexe 4 : la solution utilisée pour évaluer le potentiel membranaire

mitochondrial : test Rhodamine 123

Solution 1 : Préparation de la concentration finale de 5 µM de Rh123 : mélanger 0,83 µL de

Rh123 à partir de la solution mère (6,56 mM) dans 100 µl du milieu RPMI non complet.

NB : cette solution est préparée et conservé dans l’obscurité à -20°C.

 Annexes

Annexe 5 : les solutions utilisées pour le dosage des ROS

• Solution 1 : Préparation de la solution mère de DCFH-DA (10mM) : dissoudre

4.87mg dans 1ml éthanol absolue 60%.

• Solution 2 : Préparation de la concentration finale 20µM : mélanger 0,2µl prélevé à

partir de la solution mère (10mM) dans 100µl du milieu RPMI non complet.

NB : cette solution est préparée et conservé dans l’obscurité à -20°C.

 Annexes

Annexe 6 : les solutions utilisées pour le dosage du MDA

• Solution 1 : Préparation de la solution d’acide trichloracétique (TCA) 40 %. : Dissoudre

40 g TCA (PM : 163.39g\mol) dans 100 ml d’eau distillée.

NB : cette solution est préparée à l’obscurité.

• Solution 2 : Préparation de la solution d’acide Thiobarbiturique TBA (0.14M) :

dissoudre 20.18 mg TBA (PM :144.15g/mol) dans 1ml d’eau distillée.

• Solution 3 : Préparation de la solution NaOH (1M) : dissoudre 40mgNaOH

(39.99g/mol) dans 1ml ED.
 Annexes

Annexe 7 : les solutions utilisées pour le dosage de l’activité enzymatique de

la superoxyde dismutase

• Solution 1 : préparation la solution tampon : dissoudre 1,2114g de tris HCL dans 200
ml H2O à PH=8,5

• Solution 2 : préparation de la solution du pyrogallol : dissoudre 30,3 mg de

pyrogallol(126,11g/mol) dans 10ml H20 avec 10µl HCL 0,01 M (11µl HCl 37% dans
989 H2O)
 Annexes

Annexe 8 : les solutions utilisées pour le dosage de l’activité enzymatique de

la catalase

• Solution 1 : préparation du tampon phosphate (100mM) (PH=7)

Solution (S1) : dissoudre 5,56 g de NAH2PO4 (137,99g/mol) dans 1L d’eau distillée
Solution (S2) : dissoudre 3,53 g de KH2PO4 (136,086g/mol) dans 1L d’eau distillée

Réglage de PH à 7 et on le conserve à +4°C.

• Solution 2 : préparation de la solution H2O2 (20mM) : mélanger 200µL H2O2avec une

concentration mère (8,82M) dans 10ml H2O.

NB : cette solution est préparée à l’obscurité

 Annexes

Annexe 9 : les solutions utilisées pour le test de comète

Solution 1 : Gel d’agarose à point de fusion bas (LMP)

60 mg 5ml PBS

Solution 2 : Gel d’agarose à point de fusion normal (NMP)

0,5 g 5ml PBS

Solution 3 : Une solution d’électrophorèse (pH > 13):

Pour 1 L :

30 ml de NaOH (0,3 M)

5ml Na2-EDTA (1 mM)

Qsp 1L H2O

Solution 4 : Un tampon de neutralisation (pH= 7,5):

Pour 500 ml :

Tris-HCl (0,4 M)

Qsp 500 ml H2O