République Algérienne démocratique et populaire
Ministère de l’enseignement et de la recherche scientifique
Université Akli-Mouhand-Oulhadj Bouira
Faculté des sciences de la nature et de la vie et sciences de la terre
Département des sciences biologiques
Comptes rendus :
Technologie de l'ADN recombinant
Séquençage de l'ADN de Sanger
Module : outils biotechnologique
NOMS DES ETUDIANTES :
Benkassem Hiba
Haddad Chaima
Hamaz Yasmine Chahinez
2024/2025
La première vidéo (recombinant DNA technology) décrit le processus de création de
banques d'ADNc et la technologie de l'ADN recombinant, en se concentrant sur le clonage
d'un gène d'intérêt dans un plasmide et son introduction dans une cellule hôte bactérienne (E.
coli) pour la production de protéines
I. Matériels nécessaire :
1. Matériel Biologique :
Cellules sources d'ARNm (synthèse d'ADNc).
Bactéries hôtes compétentes (E. coli).
Plasmide vecteur (avec origine de réplication, gène de résistance, site de clonage).
Gène d'intérêt (ADN double brin).
2. Réactifs et Solutions :
Pour la synthèse d'ADNc (si nécessaire) : Oligo(dT), transcriptase inverse, dNTPs,
ADN polymérase.
Enzymes de restriction et tampons associés.
ADN ligase et tampon de ligation (avec ATP).
Milieux de culture (récupération, sélectif avec antibiotique, enrichi).
X-gal (pour le criblage).
Tampon de lyse (purification de protéine).
Tampons de lavage et d'élution (chromatographie).
3. Matériel de Laboratoire Essentiel :
Tubes stériles, pipettes et embouts.
Bain-marie.
Centrifugeuse.
Boîtes de Pétri stériles et anse d'inoculation.
Incubateur.
Système de chromatographie (purification)
II. Protocole expérimentale :
Première partie : Création de banques d'ADNc
L'ARN messager (ARNm) est isolé des cellules grâce à sa queue poly(A).
Une courte molécule d'oligo(dT) s'hybride à cette queue et sert d'amorce pour la
synthèse d'un brin d'ADN complémentaire (ADNc) par la transcriptase inverse.
Une ADN polymérase synthétise ensuite le deuxième brin d'ADN, formant un ADNc
double brin.
Le séquençage de l'ADNc permet de déterminer la séquence génétique, qui est ensuite
incorporée dans les banques d'ADNc.
Une fois le gène d'intérêt identifié, il peut être synthétisé.
Deuxième partie : Technologie de l'ADN recombinant (Clonage)
1. Préparation du vecteur de transfert :
Un vecteur d'ADN (plasmide, cosmide, virus, chromosome artificiel) est utilisé
pour transporter le gène d'intérêt dans la cellule hôte.
Les plasmides, petits ADN circulaires bactériens, sont les vecteurs les plus
couramment utilisés.
Un plasmide typique d'E. coli (comme pUC8) possède :
Une origine de réplication.
Un gène de résistance à un antibiotique (ex : ampicilline).
Un site d'insertion pour l'ADN (ex : le gène lacZ contenant un site de clonage
multiple).
2. Digestion par des enzymes de restriction :
L'ADN du gène d'intérêt et le plasmide vecteur sont coupés à des sites spécifiques
par la même enzyme de restriction.
Certaines enzymes créent des extrémités cohésives ("sticky ends"), d'autres des
extrémités franches ("blunt ends").
3. Légation de l'ADN :
Le gène d'intérêt coupé et le plasmide vecteur coupé sont mélangés.
L'enzyme ADN ligase catalyse la formation de liaisons phosphodiester, insérant le
gène dans le plasmide pour former un ADN recombinant. L'ATP est nécessaire
comme cofacteur.
4. Transformation : Introduction de l'ADN recombinant dans la cellule hôte :
La méthode de transformation chimique utilisant du chlorure de calcium est décrite.
Des cellules compétentes d'E. coli sont utilisées comme hôtes.
Le chlorure de calcium neutralise les charges négatives de l'ADN et de la surface
bactérienne, favorisant la liaison de l'ADN au contact de la cellule.
Un choc thermique (42°C pendant 90 secondes) déstabilise la membrane bactérienne,
créant des pores temporaires permettant à l'ADN plasmide de pénétrer.
Un refroidissement sur glace permet aux cellules de récupérer et de retenir le
plasmide.
Un milieu de récupération riche en nutriments est ajouté, et les cellules sont incubées
à 37°C pour favoriser leur rétablissement.
5. Culture et sélection des cellules transformées :
Les bactéries transformées sont cultivées sur un milieu contenant un antibiotique
(ampicilline).
Seules les bactéries ayant incorporé le plasmide (porteur du gène de résistance à
l'ampicilline) survivent.
Pour identifier les plasmides recombinants (contenant le gène d'intérêt inséré dans
le gène lacZ), un substrat chromogène (X-gal) est utilisé.
Les colonies bactériennes avec un plasmide non modifié (gène lacZ fonctionnel)
produisent la β-galactosidase, qui clive le X-gal en un produit bleu.
Les colonies bactériennes avec un plasmide recombinant (gène lacZ interrompu) ne
produisent pas de β-galactosidase et apparaissent blanches.
Les colonies blanches sont isolées.
6. Croissance de l'ADN recombinant et production de protéines :
Les bactéries contenant le plasmide recombinant sont cultivées à petite échelle en
laboratoire ou à grande échelle dans des bioréacteurs pour produire la protéine
d'intérêt.
7. Purification de la protéine :
Si la protéine est intracellulaire, une lyse cellulaire (disruption cellulaire) est
nécessaire (par centrifugation et traitement avec un tampon de lyse).
Des méthodes de chromatographie (comme la chromatographie d'affinité) sont
utilisées pour séparer la protéine d'intérêt des autres composants cellulaires.
La protéine se lie à une phase stationnaire spécifique, les impuretés sont éliminées par
un tampon de lavage, et la protéine purifiée est ensuite éluée à l'aide d'un tampon
d'élution.
La deuxième vidéo (Sanger DNA sequencing) décrit le protocole Expérimental : Séquençage
de Sanger
Principe : Le séquençage de Sanger, également connu sous le nom de méthode de
terminaison de chaîne, est une technique qui détermine l'ordre des bases nucléotidiques dans
un fragment d'ADN. Elle repose sur l'incorporation aléatoire de didésoxynucléotides
(ddNTPs) qui terminent l'élongation de la chaîne d'ADN par l'ADN polymérase.
I. Matériel :
ADN matrice : L'ADN à séquencer.
Amorce(s) de séquençage : Oligonucléotide complémentaire à une région connue de
l'ADN matrice, servant de point de départ pour la synthèse d'ADN.
ADN polymérase : Enzyme qui catalyse l'incorporation des dNTPs et des ddNTPs.
DNTPs (désoxyribonucléotides triphosphates) : Les quatre nucléotides classiques
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) utilisés pour la synthèse d'ADN.
DdNTPs (didésoxyribonucléotides triphosphates) : Nucléotides modifiés qui, une
fois incorporés, bloquent l'élongation de la chaîne d'ADN. Chaque ddNTP est
généralement marqué avec un fluorophore différent pour l'analyse automatisée.
Tampon de réaction PCR : Pour fournir un environnement optimal à l'ADN
polymérase.
Thermocycleur : Pour contrôler les cycles de température nécessaires à la réaction
PCR.
Matériel d'électrophorèse capillaire ou sur gel : Pour séparer les fragments d'ADN
en fonction de leur taille.
II. Protocole Expérimental :
1. Préparation de l'ADN matrice :
-L'ADN matrice doit être purifié et de bonne qualité.
2. Préparation de la réaction de séquençage :
-Mélanger l'ADN matrice, l'amorce de séquençage, l'ADN polymérase, les dNTPs et les
ddNTPs dans un tube de réaction.
-La concentration des dNTPs est généralement 100 fois supérieure à celle des ddNTPs
pour permettre une élongation suffisante tout en assurant une terminaison aléatoire.
3. Réaction de cyclage thermique (PCR de terminaison de chaîne) :
Soumettre le mélange à des cycles de température dans un Thermocycleur :
Dénaturation : Chauffer à 94-96°C pour séparer les brins d'ADN.
Hybridation : Refroidir à une température spécifique (généralement 50-65°C)
pour permettre à l'amorce de se fixer à l'ADN matrice.
Élongation (Extension) : Chauffer à 72°C pour permettre à l'ADN polymérase
d'ajouter des nucléotides. Cette étape est répétée plusieurs fois.
L'incorporation aléatoire d'un ddNTP termine l'élongation de la chaîne d'ADN,
créant des fragments de différentes longueurs.
4. Purification des produits de séquençage :
-Éliminer les ddNTPs et autres contaminants non incorporés. Plusieurs méthodes sont
possibles : précipitation à l'éthanol, colonnes de centrifugation, etc.
5. Séparation des fragments d'ADN par taille :
-Les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse capillaire ou sur gel de
polyacrylamide. L'électrophorèse capillaire est la méthode la plus courante pour le
séquençage automatisé.
6. Détection et analyse :
Les fragments d'ADN sont détectés par leur marqueur fluorescent. Un détecteur lit l'ordre
des couleurs, correspondant à la séquence d'ADN.
Un logiciel d'analyse interprète les données et produit un chromatogramme, qui représente
la séquence d'ADN.
7. Analyse des données :
-Le chromatogramme est analysé pour déterminer la séquence d'ADN.
-Des logiciels spécialisés peuvent être utilisés pour aligner les séquences, identifier les
variations et effectuer d'autres analyses.