Filière: TECHNIQUES DE SANTE

Options: TLAB

Pr. Karimi Hind

2023/2024
• Les eucaryotes : noyau isolé du cytoplasme et un
ADN linéaire.

• Les procaryotes : pas de noyau : matériel génétique

est directement dans le cytoplasme, et se présente
sous la forme d’un chromosome unique et d’un ADN
circulaire
 Réaction de
Polymérisation en
Chaine PCR :
Réplication in vitro
utilisée en laboratoire
pour copier de l’ADN
utile à la recherche.
Cycle cellulaire
1) Généralités La réplication procaryote
• 1) Généralités
La réplication est une synthèse d’ADN qui donne naissance à 2 molécules d’ADN « filles
» génétiquement identiques à la molécule d’ADN « mère » et entre elles.
• Elle permet donc la conservation de l’information génétique entre les différentes
générations cellulaires
• C’est un processus indispensable pour :
• La reproduction chez les unicellulaires
• La croissance et le renouvellement chez les pluricellulaires
1) Généralités
• Durant la duplication se produire des erreurs, il y a donc des mécanismes de contrôle (réparation de
l’ADN), pour limiter ces erreurs. Donc, il y a un taux de mutations de génome extrêmement bas : un seul
nucléotide modifié pour 109 nucléotides à chaque cycle de réplication.

• La réplication de l’ADN est un mécanisme cellulaire semi conservatif :

-sur la double hélice d’ADN de la cellule fille, un des deux bras provient du brin parental et l’autre est
synthétisé lors de la réplication par polymérisation (brin fils).

-Chaque brin parental est lu dans le sens 3’→5’ et sert de matrice à la synthèse d’un brin complémentaire et
anti-parallèle, appelé brin fils ou brin néosynthétisé, synthétisé dans le sens 5’→3’. Pour cela les deux brins
parentaux doivent se séparer par rupture des liaisons hydrogènes
Trois modèles théoriques ont été proposés pour que molécule d’ADN à se dupliquer en
donnant deux copies conformes à la molécule parentale
1) Généralités
● La réplication de l’ADN commence en un ou plusieurs sites appelés origines de
réplication (ORI) puis s'étend sous la forme de bulle (s) de réplication. Chaque bulle
comporte deux fourches de réplication qui s’éloignent l’une de l’autre.
● deux systèmes de réplication qui évoluent en sens opposés. La réplication est dite
bidirectionnelle .

NB : Il existe une seule origine de réplication chez les procaryotes, tandis qu’il en existe plusieurs chez les
eucaryotes
2) REPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI)
A-Eléments nécessaires pour la réplication

1. L’ADN parental La«réplication procaryote

ADN matrice», chacun des deux bras sert de matrice pour synthétiser le
brin anti-parallèle. Séparation des deux brins (dénaturation) : pour passer à un état simple
1) Généralités
brin et le rendre accessible aux enzymes de la polymérisation.

2. Les dNTP (dATP, dCTP, dTTP et dGTP) rentrent dans la réaction sous forme triphosphate,
et sont intégrés dans le brin sous forme monophosphate : le relargage du pyrophosphate
apporte l’énergie nécessaire à la réplication.
3. Les ions Mg2+ stabilisent les dNTP en les protégeant d’une hydrolyse enzymatique et sont
également importants pour l’ADN polymérase.
4. Les enzymes suivantes :
a. Les hélicases, à l’initiation de la réplication
b. Les topoisomérases
c. Les ADN polymérase
d. Les primases

et les protéines SSB (pour single stranded binding protein) ont une forte affinité pour l'ADN
simple brin et l'empêche ainsi de se réenrouler lors de la migration des fourches réplicatives.
Enzymes et leurs fonctions
Rôles des protéines

● Topoisomerases Reconnaissance des ori de rep

● Helicases Séparation des 2 brins

● Primase Synthèse des RNA primers

● Single strand binding proteins Empêche la fermeture simples brins d’ADN

● DNA polymerase Synthèse des nouveaux brins

● DNA ligase Liaisons phosphodiester entre les fragments d’Okasaki.

2) REPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI)

Les enzymes utilisées (dans l’ordre d’intervention):

• Les hélicases (ou DNA B)
permettent aux deux brins de l’ADN parental de se séparer en supprimant les liaisons hydrogène entre les
bases qui se font face. Le déplacement le long de l’ADN parental nécessite une énergie (hydrolyse des
molécules d’ATP en ADP et Pi).
Après les protéines SSB se lient à des simples brins, pour éviter la renaturation spontanée de l’ADN.

5’.
2) REPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI)

Les enzymes utilisées (dans l’ordre d’intervention):

• Les topoisomérases modifient l’état d’enroulement (+ ou -) de la molécule d’ADN. Chez la bactérie, la
topoisomérase est la gyrase bactérienne (TOP2).

Plusieurs étapes :
1) Coupure transitoire de l’ADN
2) Libre rotation de l’ADN
3) Ressoudure de l’ADN (= ligation), toujours par la topoisomérase

Il existe deux types de topoisomérases :

- Les topoisomérases I n’agissent que sur un seul brin de l’ADN et ne nécessitent donc pas d’ATP

- Les topoisomérases II agissent sur les deux brins de l’ADN, et nécessitent de l’ATP pour maintenir les
deux fragments d’ADN. Chez les procaryotes, la gyrase bactérienne est une topoisomérase II.
5’.
 Les enzymes utilisées (dans l’ordre d’intervention):

• Les ADN polymérases (enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S)

-Permettent la synthèse du brin fils par polymérisation en utilisant un brin de l’ADN parental.
-L’activité ADN-polymérasique est la synthèse de l’ADN dans le sens 5’→3’. Cette activité nécessite :
démarrage par l’amorce ARN synthétisée par une primase (ARN polymérase).
-L’ADN-polymérase se positionne sur l’extrémité 3’OH pour polymériser de l’ADN dans le sens 5’→3’
après incorporation successive de nucléotides. La synthèse se fait de manière complémentaire et anti
parallèle à l’ADN parental.

-La survie de la cellule à court terme dépend de la fidélité de la réplication. Cette haute-fidélité nécessite
plusieurs mécanismes de vérification des nucléotides :

- Avant addition covalente du nucléptide : Le dNTP entrant est celui qui possède la meilleure affinité et
un état énergétique optimal. A ce moment il y a une transconformation de la polymerase : elle change de
conformation pour vérifier la bonne géométrie de la paire de base.
- Après addition covalente du nucléotide : activité exonucléasique (= fonction d’édition) de la
polymérase : correction des erreurs d’appariement en 3’→5’ par clivage entre deux nucléotides adjacents
en bout de chaine. 5’.
 • Les ADN polymérases
Trois ARN polymérases participent dans la réplication de l'ADN chez les procaryotes ‘Chez E. Coli’ :
● L'ADN Polymérase I permet : Réparation de l'ADN. Elle a une activité polymérase dans le sens
5’ vers 3', exonucléase dans le sens 3' vers 5 et 5' vers 3’.
Intervention en fin de réplication pour éliminer l'amorce d'ARN grâce à son activité exonucléase
dans le sens 5' vers 3'.
● L'ADN Polymérase II permet : Réplication de l'ADN endommagé grâce à une activité
exonucléase 5' vers 3’.
● L'ADN Polymérase III permet : Principale action polymérase bactérienne intervenant dans la
réplication du brin avancé et synthèse des fragments d'Okazaki de l'ADN.
 Les enzymes utilisées :

•L’ADN polymérase III

ne fonctionne pas seule mais est associée à un

complexe multimérique appelé holoenzyme.
Holoenzyme ADN pol III est l’enzyme majeure, qui
réalise la synthèse de l’ADN (des brins fils). La 2e
enzyme qui intervient dans la réplication chez la
bactérie est l’ADN POL I, qui possède en plus une
activité exonucléasique 5’→3’ permettant la
dégradation des amorces d’ARN.
L’holoenzme de l’ADN ploymérase III est un dimère
asymétrique, elle est constituée de 10 polypeptides
différents (voir tableau ci-après). Chaque
monomère contient un cœur catalytique.

5’.
 Les enzymes utilisées (dans l’ordre d’intervention):

• Les primases

Les primases sont des ARN polymérases ADN-dépendante : elles synthétisent les amorces d’ARN et sont
dites ADN-dépendantes car elles se servent de l’ADN comme matrice.
L’amorce d’ARN se fait dans le sens 5’→3’ du sens de la chaine en cours de synthèse. Les primases sont
capables de synthétiser de courtes séquences d’ARN (de 4 à 12 ribonucléotides) qui sont ensuite utilisées
comme amorces par l’ADN polymérase réplicative.
Chez E. Coli, la primase et l’hélicase forment un seul complexe appelé le primosome.

5’.
2) REPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI)
La réplication à le même principe que chez les procaryotes avec le brin avancé et le brin
retarde, mais avecLaquelques
réplication procaryote
différences:
• L'ADN plus long 1) Généralités
• La vitesse de réplication est de 50 nucléotides par secondes; Ceci compensé par de
multiples origines de réplication;
• L'ADN est intégré dans la chromatine associée aux histones, au moment de la réplication il
y a production d'histones;
• L'ADN est répliqué par 5 ADN polymérases (α, β, ϒ, δ, ε).
• L'ADN polymérase a qui dispose d'une activité primase , est responsable de l'initiation de
la synthèse d'ADN.
• L'ADN est répliqué par les ADN polymérases α et δ:
- α synthétise le brin retardataire et δ synthétise le brin précoce .
L'ADN polymérase ε est impliqué dans la réparation de l'ADN et l'ADN polymérase ϒ réplique
l'ADN mitochondriale.
• β supprime l'ARN amorce et assure la synthèse et la réparation de l'ARN amorcé. Chez les
eucaryotes les fragments d'Okazaki ont une taille de 100 à 200 nucléotides alors que ceux
des procaryotes, leur taille varie de 1000 à 2000 nucléotides.
2) REPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI)
B-L’origine de réplication
La réplication procaryote

- Le chromosome1)d’E.Généralités
coli possède une seule
origine de réplication : OriC. Il s’agit d’une
séquence d’environ 245 pb.

- OriC est caractérisée par la présence de

séquences répétées de 9 et 13 nucléotides
(appelées séquences 9-mères et 13-mères
respectivement). Ces séquences constituent les
sites de liaison de la protéine DnaA.
. C’est une propagation bidirectionnelle

- OriC riche en A-T capable de s'ouvrir facilement

lors de l'initiation de la réplication.
B. C-MECANISME DE REPLICATION
1. Initiation de la réplicationREPLICATION :

La réplication chez E. coli est contrôlée par l’état de

méthylation de l’ADN. Pour que la réplication puisse
commencer, les deux brins d’ADN doivent être méthylés sur
l’adénine des séquences GATC.

L’ADN gyrase introduit des superenroulements négatifs

permettant le déroulement de la double hélice ; ceci est
nécessaire à l’assemblage du complexe d’initiation.
1-2-3 - La réplication est initiée par fixation des DnaA
(facteur d’initiation de la réplication) sur le site OriC,
précisément sur chacune des 4 séquences 9-mères. Ceci
crée une tension qui force l’ADN s’ouvrir au niveau des
régions 13-mèrs adjacentes riches en paires A-T.

4- l’hélicase (DnaB) vient par la suite se fixer sur l’ADN,

cette fixation est assurée par la protéine DnaC.
 1. Initiation de la réplicationREPLICATION :

5- l’hélicase commence à se déplacer tout au

long de l’ADN comme un curseur d’une
fermeture éclair séparant ainsi les deux brins
de l’ADN. Les protéines SSB viennent
immédiatement se fixer sur les deux ADNs
simple brins empêchant leur réassociation.

6- La primase (ARN polymérases) intervient

ensuite et synthétise les amorces d’ARN ( 4 à
12nt).
7-Le complexe [Hélicase+SSB+Primase] est
appelé « primosome » ; il assure
(1) la séparation des 2 brins d’ADN
(2) et l’attachement de l’ADN polymérase III
en fournissant les amorces.
1. Initiation de la réplicationREPLICATION :

- Au niveau du site d’initiation se forme une structure « œil de réplication ».

A chacune des extrémités de la bulle, se trouve une fourche de réplication. Les deux fourches de
réplication progressent simultanément et dans deux sens opposés : réplication bi-directionnelle.
RAPPEL DEROULEMENT DE LA REPLICATION:
- Hélicases
- Gyrase Topoisomerase
- Protéine SSB pour éviter la renaturation et maintien de la
structure sous une forme facile d’accès aux enzymes. Inhibent
les structures en épingle à cheveux.
- amorces d’ARN : primase + hélicase = primosome
synthétisées par la primase en 5’-3’
B. C-MECANISME DE REPLICATION
2. Elongation
LICATION :
• l enzyme ADN polymérase I fabrique les nouvelles molécules d’ADN et s’insère dans la bulle de réplication
• L'ADN Polymérase utilise les brins parents comme matrice et commence par l'addition de nucléotides
dérivant de désoxyribonucléosides triphosphate (dNTP) pour créer un nouveau brin complémentaire (dans
le sens 5'à 3').

• ADN polymérase commence à l’extrémité 3’ du brin parental. Par conséquent, elle synthétise le nouveau
brin d'ADN dans le sens 5’ à 3’
 2. Elongation
-Le caractère antiparallèle des deux brins d'ADN fait que la réplication se produit asymétrique, avec
un brin avancé, pour lequel la polymérase avance dans le même sens que l'hélicase et la fourche de
réplication dans le sens 5'-3', et un brin retarde, sur lequel la polymérisation se fait en sens inverse
- Dans chaque fourche de réplication, les deux brins d’ADN (brin avancé et brin retardé) sont
synthétisés simultanément par l’ADN polymérase III.
● Pour le brin avancé (besoin 1 seule amorce) , la synthèse de l’ADN dans le sens d’ouverture
d’ADN, donc dans le sens de propagation de la fourche de réplication. C’est le brin continu.
● Pour le brin retardé ou discontinu (besoin +ieurs amorces) , la synthèse d’ADN se fait dans le
sens contraire de l’ouverture la molécule d’ADN : l’ADN polymérase n’exerce son activité
polymérasique seulement dans le sens 5’→3’ de la chaine en cours de synthèse, or sur ce brin
d’ADN, le sens de propagation de la fourche de réplication est 3’→5’. La synthèse de ce brin est
donc discontinue. Elle va s’effectuer de manière rétrograde, à partir de multiples fragments
d’ARN. On obtient de multiples fragments d’ADN (fragments de 1000 à 2000 nt), appelés
fragments d’Okazaki.
C-MECANISME DE REPLICATION .
3. Terminaison
Présence
Chez E-coli, la partie entre les deux terminateurs des deux fourches n'est d'abord pas répliqué, les deux
ADN circulaires sont ainsi associés, on utilise alors la topo-isomérase Il pour les dissociés.
L'ADN polymérase I complètera ensuite les parties non répliquées.

• La protéine Tus (terminator utilisation substance) reconnaît les séquences d’arrêt de réplication «
terminateur Ter » et bloque DnaB ---met fin à la réplication
• Intervention d’une topoisomérase IV pour catalyser la séparation des 2 chromosomes (2 ADN)
• Le processus de réplication est terminé et les nouvelles molécules d'ADN, composées chacune d'un brin
d'ADN parental et d'un brin d'ADN fils, se reforment en hélices.
La réplication de la molécule d'ADN
chez les procaryotes.
 3. REPLICATION CHEZ LES EUCARYOTES

➢Mécanisme comparable aux procaryotes

➢La réplication est bidirectionnelle, complémentaire, antiparallèle, simultanée

pour chaque brin mais discontinue pour l’un des deux brins

➢Elle s’effectue dans le sens 5’-3’, avec des amorces d’ARN

➢Le génome est plus grand et réparti sur plusieurs chromosomes, il existe
plusieurs sites d’initiation de la réplication sur chaque chromosome

➢ Les ADN polymérases eucaryotes ont les mêmes besoins que les ADN
polymérases procaryotes (les 4 désoxynucléotides tri-(P), une matrice d'ADN
simple brin et une amorce)
3. REPLICATION CHEZ LES EUCARYOTES
A. SPECIFICITES
La réplication chez les eucaryotes : semblable au E. Coli mais il y a quelques spécificités.
Spécificités du génome eucaryote :
- Sa localisation :dans le noyau cellulaire, alors que la bactérie ne possède pas de noyau.

- Sa taille : le génome eucaryote est plus grand que le génome procaryote. le génome
humain a 3 log d’écart (3.109 paires de bases) avec le génome de la bactérie.

- Son organisation : le génome eucaryote est organisé sous forme de chromosomes,

formés de molécules d’ADN linéaire et double brin. Contrairement à la bactérie, le génome
eucaryote est organisé sous forme de chromatine.
- Sa structure : structure en nucléosomes pour faciliter la condensation de l’ADN afin que le
génome puisse rentrer dans le noyau cellulaire. On a donc un ADN qui n’est pas nu.

On a donc un génome beaucoup plus grand, qui se réplique à une vitesse plus
faible et qui est associé à des structures.
En raison de la grande longueur de l’ADN, la réplication chez les eucaryotes en plusieurs points d’un même
chromosome appelés réplicons
 B. LES ENZYMES ET PROTEINES
intervenant dans la réplication eucaryote

Enzymes eucaryotes :
5 DNA polymerases chez les mammifères:

1. Polymerase (alpha α): associée à la primase :

elle prend le relai direct au niveau des fragments
d’Okazaki eucaryote, sur le brin retardé. initiation
2. Polymerase beta): impliquées dans la réparation
de l’ADN.
3. . Polymerase (gamma ϒ): impliquée dans la
réplication de l’ADN mitochondrial. ,
4. . Polymerase (delta δ): retardé , DNA réplication,
(initiation et élongation) réparation 3’-5
5. Polymerase (epsilon ε): impliquées dans la
réparation de l’ADN. 3’-5

ADN polymérase I et III synthétisent ADN

chez Procaryote
C-phases de la réplication chez les eucaryotes
1. Phase d’initiation
 Reconnaissance de la séquence d’origine ORI par les MCM « minichromosome maintenance proteins
» déclenché par CDK/cycline à la phase S

 Ouverture du double brin et stabilisation des brins

-Ouverture du double brin : par la topo-isomérase (activité Hélicases) qui déspiralise l’ADN en formant
des boucles de réplication (œil de réplication)
-Stabilisation des brins : par l’intervention de la RPA en assurant la fixation et le maintien de la
séparation et empêchant la respiralisation
 Synthèse d’une amorce ARN : de 10 ribonucléotides par la primase (ARN Polymérase)

 Synthèse d’une amorce ADN : de 20 desoxyribonucléotides par une ADN Polyméraseα (A)( permet
Synthèse d’une amorce ARN) en présence d’un facteur associé RPA
-chaque chromosome
possède plusieurs
réplicons
-Le réplicon progresse
d une façon
bidirectionnelle jusq
Ouverture du double
brin
La réplication de la molécule d'ADN chez
les eucaryotes.
2-Phases d’Elongation

L’élongation permet la polymérisation de l’extremité 3’ OH libre dans les sens 5’→3’, elle est assurée par
une ADN Polymérase δ(D) qui va s’adhérer à l’amorce ADN et poursuivre son élongation en présence de
Mg2+.
L’ADN Polymérase δ nécessite pour sa fonction un facteur associé : RF-C (Replication factor C) recrute
PCN ( facteur de glissement)

ADN Polyméraseα se
dissocier est replace
par L’ADN
Polymérase δ et ε
3-Phase de terminaison
L’arrêt se fait spontanément à la rencontre de l’amorce de la séquence en aval. Il n’existe pas d’équivalents
des protéines TUS comme chez les procaryotes
 La réplication du brin discontinu à partir d’un brin matrice
orienté dans le sens 5’→3’

-Une amorce mixte (ARN/ADN) est synthétisée par les mêmes enzymes que pour le
brin avancé

-L’ADN polymérase δ s y attache et y ajoute des nucléotides d’ADN dans le sens

5’vers 3’donc présence de fragments d’OKAZAKI

- Une nouvelle amorce est synthétisée tout les 200 Nt pour permettre la réplication du
brin antisens L’amorce est ensuite détruite

-L’ADN polymérase δ complète les trous engendrés par les nucléases

-L’ADN ligase relie (joint) les fragments d’OKAZAK

 la finition du brin retardé ?

• Une enzyme de la classe des RNases (H-1 et FEN-1) élimine les amorces
d’ARN. Le comblement est réalisé par l’ADN POL δ, puis l’ADN ligase ligue les
morceaux entre eux pour former un seul brin.

• L’ADN POL α réalise le début de la synthèse du brin retardé, en initiant la

polymérisation, puis elle est remplacée par l’ADN POL δ, qui continue la
synthèse dans le sens 5’→3’ du brin en cours de synthèse.
On retrouve sur le brin retardé des fragments d’Okazaki (100 à 200 nt),
• Pour la finition du brin retardé, l’ADN POL δ élonge le fragment en synthétisant
de l’ADN, et remplit la lacune jusqu’à rencontrer le 1er nucléotide du fragment
suivant.
Notion de boucles : il y un repliement structurel de l’ADN du brin fils, de façon à ce
que l’allongement se fasse dans le sens 5’-3’ mais aussi dans le la fourche de
réplication.
D. PARTICULARITE EUCARYOTE
 1 ère particularité eucaryote: La présence de nucléosomes

• Les nucléosomes sont des structures composées de protéines : les histones

• Les génomes des cellules filles doivent être identiques au génome de la cellule
mère, ce qui concerne également les nucléosomes.

• Les nucléosomes parentaux restent associés, puis une répartition équivalente

se fait entre les deux brins (brin parental et brin fils) de la molécule d’ADN.

• Pendant la phase S du cycle cellulaire, de nouveaux nucléosomes sont

synthétisés pour compléter les nucléosomes parentaux dans les cellules filles.

• Chaque brin possède alors 50% de nucléosomes parentaux et 50% de

nucléosomes néosynthétisés.
  2ème particularité eucaryote : les télomères à l’extrémité des chromosomes
Les télomères sont des séquences d’ADN courtes répétées en tandem situées aux extrémités des
chromosomes. On y retrouve une séquence répétée en tandem (chez l’homme : TTA GGG).

• La réplication du brin
parental débute grâce
à la primase qui
synthétise pour
amorce la séquence
CCC UAA, séquence
complémentaire et
antiparallèle de la
séquence répétée
(TTAGGG).

• En fin de réplication,
cette séquence va
être éliminée par les
RNases par
hydrolyse.
- La solution au problème de raccourcissement des chromosomes linéaires à la
fin de la réplication est l’allongement des télomères( seq répète ). Ceci est
assuré par une enzyme "Télomérase". Cette enzyme allonge l'extrémité 3'
pour permettre la synthèse d'une amorce et la reconstitution du brin
complémentaire.

- La télomérase est une ribonucléoprotéine (protéine qui contient de l’ARN

dans sa structure).
- L’ARN faisant partie de la télomérase a une séquence complémentaire à la
séquence du télomère.
-La télomérase reconnait l’extrémité du chromosome et s’y lie grâce à cette
complémentarité.
- La télomérase utilise son propre ARN comme matrice et commence à ajouter
les nucléotides sur l’extrémité 3’-OH de l’ADN dans le sens 5’ ----3’. La
télomérase est donc une transcriptase inverse.

- Après l'addition de quelques nucléotides, la télomérase se déplace

(translocation) pour allonger davantage l'extrémité 3'. Après plusieurs cycles de
synthèse, l'ADN polymérase α (primase) vient synthétiser une amorce sur le
brin 3' maintenant allongé, afin de permettre à l'ADN polymérase de synthétiser
le brin complémentaire.
D. PARTICULARITE EUCARYOTE
3. 3ème particularité eucaryote : Méthylations

Chez les cellules eucaryotes, seule la cytosine peut être méthylée. Ces cytosines font généralement
parties des îlots CG. Elles seront méthylées sur le brin fils seulement si le brin parental est méthylé.
Les méthylations sont réalisées par les méthylases.

Rôle des méthylations :

Elles jouent un rôle dans la régulation de l’expression de certains gènes. Certains gènes sont régulés
par un mécanisme épigénétique de méthylation. L’hypométhylation entraine le déverrouillage du
gène, alors que l’hyperméthylation entraine le verrouillage du gène.

Exemple : Le gène de l’insuline est présent dans toutes les cellules, or l’insuline est seulement
sécrétée par les cellules pancréatiques.

Donc l’information n’est exprimée que dans les cellules pancréatiques, où il y a donc hypométhylation.
Dans toutes les autres cellules, il y a hyperméthylation.
différences de la réplication entre procaryotes et eucaryotes