PCR REACCIÓN DE LA

CADENA POLIMERASA

MG. TM. FREDDY ORIHUELA VILLAR

 PROPOSITO
Conocer:

• Los fundamentos de la técnica de amplificación de DNA por

PCR

• Usos y aplicaciones del PCR

• Ventajas y desventajas del PCR

• Métodos de secuenciación de DNA

 PCR
Polymerase Chain Reaction

•Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la

polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.

•El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento

de DNA.

•Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA,

teniendo poco material disponible.
Polimerasa Chain Reaction:
Reacción en Cadena de la
Polimerasa
• Fue diseñada por el Dr. Kary
Mullis en 1987.

• Ganó el premio Nóbel de

Química en 1993 por su
invento.

• Utilizo el PCR para

amplificación del gen de -
hemoglobina humana, y el
diagnostico prenatal de anemia
falciforme.
 Termociclador

La PCR se realiza

en un “Thermo
Cycler”
Termociclador.

Es una máquina

que calienta y enfría
la reacción en
periodos cortos de
tiempo.
 El proceso de “PCR” incluye 3 pasos
básicos que se repiten 25 veces o más:
• 1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y
convertirla en hebra sencilla.
-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos
–el tiempo depende del tamaño del genoma-
2. Apareamiento o “anneling”:
• Los cebadores “primers” previamente diseñados,
reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en
lugares específicos por complementariedad de bases.
Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30
segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar
entre cebadores según sea el caso.
3. Polimerización o Extensión.
Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio
comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos
trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De
estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las
hebras de DNA molde

Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea

necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

En el PCR hay una amplificación
exponencial
 Reactivos necesarios para PCR:
• Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a
temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.
• MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM
-Es un cofactor para la función de la polimerasa-
• dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del
fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un
fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más
concentración de dNTPS para el de 5500pb.
-Generalmente, se usa una concentración de 200M de cada
uno.
 Reactivos necesarios para PCR:
• Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de
nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud,
complementarias a una región del DNA que se quiere
amplificar. -Se usa a concentración de 1M-
• DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50
a 2,000 nucleótidos de longitud.
El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500
ng.
• Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por
reacción.
 ADYUVANTES DE LA PCR
• Son elementos que mejoran el rendimiento y la
especificidad de la PCR.

• Se usa DMSO, glicerol o BSA.

• El adyuvante más utilizado es el BSA. A concentraciones

por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de
la PCR ya actúa como una proteína captadora de iones
que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa
Polimerasa

•En un principio, la polimerasa de DNA que

se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero
esta es sensitiva a alta temperatura, por lo
que había que añadir enzima fresca al
comenzar el tercer ciclo.

•Se reemplazo la enzima por la de la

bacteria “Thermus aquaticus” conocida
como Taq pol
 Análisis de la Muestra
• La detección del producto de la PCR se realiza
normalmente mediante corrido electroforético.

• Dependiendo del tamaño de la amplificación y la

resolución que deseemos utilizaremos diferentes
medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas
concentraciones.
 Análisis de la Muestra
• La posterior visualización se puede realizar con
bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de
plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecíficos se pegan a
varios sitios)
Análisis de la Muestra

• En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que

son reconocidas por endonucleasas
• Hibridación, Southern Blot
Se puede amplificar directamente de:
• ADN genómico
• cDNA (RT-PCR)
Aplicaciones
Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y
C, papiloma virus, HIV, entre otros
Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o
muerto, análisis de fósiles
Mutagénesis dirigida (cambios en la información
contenida a través de “primers” con mutaciones)
Investigación forense
Pruebas de paternidad
Aplicaciones
Criminalística
• Ejemplo de un caso de
criminalística resuelto utilizando
electroforesis en gel vertical de
acrilamida.

• Si se observan los patrones

bandas podrá comprobarse como
los perfiles obtenidos en las
manchas de sangre encontradas
en el sombrero (Hat) y pantalón
(Jeans) del sospechoso (S)
coinciden con el perfil genético
de la víctima (V)
Utilidad del PCR
 Ventajas del “PCR”
• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una
cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.
• El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.
• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
• Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos,
análisis prenatales, etc.
 Desventajas del “PCR”
• Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se
conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.
• Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al
fragmento que se desea sintetizar.
• La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN
• Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo
investigador o de cualquier otro)
 Materiales Para PCR

• ADN molde (ADN en estudio)

• Termociclador “Thermo cycler”
• Primer Forward y Reverse
• Microcentrífuga
• dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP, dGTP de
• Micropipetas de 2, 20 y 200 ul
[25 μM] c/u)
• Microtubos para “PCR”, estériles
• 10X buffer para PCR (Solución
• Puntas estériles amortiguadora para “PCR”)
• Agua destilada, desionizada y estéril • MgCl2 (25 mM)
• BSA
• Polimerasa Taq
Herencia del DNA mitocondrial

•Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de

16571 pares de bases: Hebra pesada (H), Hebra liviana
(L). Primer Directo H34, primer reverso L15829
Procedimiento para extracción del
DNA genómico (previamente
realizado)
• Se realizó un frotis bucal
• El contenido del hisopo “swab” se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%
• Centrifugar por 5 minutos a 7K
• Descarta sobrenadante
• Resuspender el precipitado “pellet” en 500ul de chelex al 10%
• Incubar a 100˚C por 20 minutos
• Centrifugar por 5 minutos a 7K
• Tomar el sobrenadante ( DNA en solución)
• Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella
Nota: El chelex actúa como agente desestabilizador de membranas y quelante.
Diagrama de la extracción del DNA genómico
(previamente realizado)
 Procedimiento para amplificar el
DNA (PCR)
• Añada los siguientes reactivos en el orden indicado:

Cantidad (ul) Componente

10.3 Agua estéril (dH2O)
3.0 MgCl2 25mM
Mix 1 0.5 BSA 100X
17.3
1.5 2.5 Mm de dNTPs
1.0 Primer H34. 5’-3’
1.0 Primer L15829. 3’-5’
Mix 2
2.7
2.5 Buffer 10X
0.2 Taq pol
5.0 DNA en estudio
Total: 25 ul
• Condiciones para reacción en el
termociclador:
1 ciclo : 94°C por 2.5 minutos.
32 ciclos: 94 °C por 30 segundos
54 °C por 1 minutos
72 °C por 70 segundos
1 ciclo: 72 °C por 10 minutos

• Lleve a reaccionar en el termociclador.

 Secuenciación de DNA
Método enzimático de terminación de cadena (método dideoxi de Sanger)
• Polimerización interrumpida de ADN
• Se lleva a cado polimerización de ADN en presencia de derivados dideoxi
que detienen la polimerización en diferente momento, obteniéndose
fragmentos de diferente tamaño.
• Se examinan en electroforesis, se “lee” secuencia directamente del gel
Método dideoxi de Sanger
Método dideoxi de Sanger (2)
Método dideoxi de Sanger
(3)
 Método secuenciación
automática
 Electroferograma de la
secuenciación
automática
Geles de secuencia

Secuencia automática Secuencia Manual