“UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN”
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA PESQUERA
PRUEBA RM VP
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA PESQUERA
DOCENTE: ING. CESAR JULIO CACEDA
INTEGRANTE:
• EDUARDO QUESADA HUAYTA 2017-107050
MEDIDAS PARA ELABORAR LAS PRUEBAS
• El personal debe tener un entrenamiento especifico en el manejo de esta bacteria
• No se debe pipetear material infeccioso con la boca
• Las mesas de trabajo serán descontaminados al menos una vez al día o cuando
se derrame algún material contaminado
• Todo las personas deberán lavarse las manos después de manejar material
infeccioso
• Se descontaminaran todos los desechos solidos o líquidos contaminados
antes de su contaminación
• El personal del laboratorio deberá llevar todo el uniforme apropiado para
ingresar al laboratorio
• El jefe de laboratorio solo dará acceso al laboratorio a personas indicadas
para así prevenir posibles riesgos
• Las puertas del laboratorio se mantendrán cerradas cuando se esta
haciendo los respectivos trabajos
• Cualquier derrame peligroso o accidente se le deberá notificar
inmediatamente al jefe de laboratorio
¿PARA QUE SIRVE LA PRUEBA RM-VP?
• Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un
microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido
por la vía ácido mixta o con producción de un producto final
neutro (acetoína) por la vía butanodiólica.
• La inoculación se lleva a cabo por medio de una asada simple y es
incubado de 72 a 120 horas de 35 a 37°C
MEDIO DE CULTIVO
• Esta prueba se realiza por medio de un caldo de RM-VP
• Es utilizado para la diferenciación de organismos
coliformes en base a las pruebas de Rojo de Metilo y
Voges-Proskauer, este medio también sirve para la
clasificación de Enterobacterias
FORMULA
PREPARACION DEL MEDIO
• Suspender 17 g del medio en un litro de agua purificada.
Calentar con agitación suave hasta su completa disolución
y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio,
tapar y esterilizar en autoclave a 118-121 °C
ENSAYO ROJO DE METILO
PRINCIPIOS
• Se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo
fermenta glucosa
• Los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el
camino de Embden-Meyerhof
• Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y
butanodiol
• El test es útil para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella
(rojo metilo negativo)
REACCION DEL ROJO DE METILO
MATERIAL
• Preparación del medio
Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a
121ºC por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos,
indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera.
• Preparación del reactivo
Disolver 0.1 gr de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua
destilada, para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 año.
Rotular y guardar en heladera.
PROCEDIMIENTO
• Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo con
caldo RM/VP.
• Incubar a 35ºC por un mínimo de 48 horas.
• Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo.
• Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de
color
RESULTADOS
• Un resultado positivo da coloración roja,
indica presencia de ácidos de la
fermentación de la glucosa, una coloración
amarilla constituye una reacción negativa
• Si el resultado es negativo continuar la
incubación de la bacteria por 24 horas más.
CONSIDERACIONES
• Variaciones en la cantidad de peptona del medio puede afectar el
resultado. Aumentando la concentración de glucosa en el medio no
se acelera la reacción del rojo de metilo.
• No sobreinocular, el crecimiento bacteriano se inhibe cuando el
inóculo es grande. Una incubación de 48 horas es suficiente para la
mayoría de los cultivos; pero el ensayo no se debe realizar con
cultivos que tengan menos de 48 horas de incubación.
ENSAYO VOGES-PROSKAUER
PRINCIPIO
• El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa
• A partir del ácido pirúvico un microorganismo puede seguir varios
caminos. Algunos forman productos finales como ácidos láctico, acético o
fórmico
• El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos metabólicos
• En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da
un complejo rojo
MATERIAL
• Preparación del medio
El medio está disponible comercialmente. Para la preparación del caldo
RMVP, ver el procedimiento indicado para el test de rojo de metilo.
• Preparación de solución de α-naftol
Disolver 5.0 gr de α-naftol en una pequeña cantidad de alcohol absoluto
y luego llevar el volumen a 100 ml. La solución debe ser incolora.
El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y
de expiración. Guardar en heladera en frascos color caramelo
• Preparación de la solución de KOH
Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen
final a 100 ml (trabajar sobre baño de agua fría para evitar
recalentamiento). El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha
de preparación y de expiración.
PROCEDIMIENTO
• Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP.
• Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas.
• Transferir 2.5 ml de la suspensión a otro tubo.
• Agregar 0.6 ml del reactivo de α-naftol.
• Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH.
• Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos.
• Observar la formación de un color rosado a rojo.
RESULTADOS
• La aparición de un color
rosado constituye una
reacción positiva indicadora
de la presencia de acetoína,
producto de la fermentación
de la glucosa
CONSIDERACIONES
• Una incubación de más de 3 días algunos organismos VP producen un aumento de la acidez
del medio, dando reacciones positivas débiles o falsas reacciones negativas.
• La mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas entre
el rojo de metilo y VP
• Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversión del orden puede dar un
resultado positivo débil o un falso negativo
• No agregar KOH en exceso, ya que puede enmascarar una reacción positiva débil por el
color cobrizo de la reacción KOH con el α-naftol