INTEGRANTES: KEREN GASCÓN

LIZMETH CALDERÓN
MARÍA C.
YALEYXY
La cromatografía es un método físico de
separación basado en la distribución de los
componentes de una mezcla entre dos fases
inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.
La cromatografía es una técnica de separación
de sustancias que se basa en las diferentes
velocidades con que se mueve cada una de ellas
a través de un medio poroso arrastradas por un
disolvente en movimiento.
Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones,
el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo
hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad
de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase
móvil.
De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC), que requiere de equipos especiales
que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
La Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna
utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica.

CROMATOGRAFO HPLC El HPLC es una técnica utilizada para separar

los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de
interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica.
Fase estacionaria
Fase móvil
Muestra
En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la
(muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se
denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil)
que no puede mezclarse con la fase estacionaria se hace fluir a
través de ésta para "lavar" a las moléculas en la muestra.
Hay varias formas de interacción entre las cuales tenemos:
Adsorción superficial
Partición
Intercambio iónico
Exclusión por tamaño
La fase estacionaria es sólida.
La separación se logra por las diferencias en solubilidad
(en fase móvil) y de retención por absorción (en fase
estacionaria) de la mezcla de solutos.
Sílice (90%) y alúmina (10%) son las fases estacionarias más
comunes.
Tanto las moléculas de solutos como de disolvente son
atraídas hacia los lugares activos polares de la fase
estacionaria
 * La separación se basa en el reparto o distribución de los
solutos entre una fase móvil líquida y otra estacionaria
inmiscible, soportada sobre un sólido inerte.
* La migración se produce por diferencias de solubilidad.
* El mecanismo de actuación es similar al de un modelo de
extracción en contracorriente

Compuesto
Fase móvil
relativamente
relativamente
apolar Fase estacionaria polar
apolar Alta presión

Columna
cromatográfica
Tanto la fase estacionaria como la fase móvil son de naturaleza
iónica.
Los iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del
eluyente.
* La separación se basa en el tamaño molecular.
* Como fase estacionaria se emplean sustancias
porosas de un tamaño determinado.
* Se denomina también cromatografía de
permeabilidad.
Constante de distribución:
En general, los equilibrios de distribución implicados en
cromatografía se describen por ecuaciones sencillas que
suponen la transferencia de una analito entre las fases
estacionaria y la móvil. Así, para el soluto A, se puede
escribir:
A móvil A estacionario
La constante de equilibrio K:
para este proceso se denomina constante de distribución y mide la
distribución del analito entre la fase móvil y la estacionaria Entonces
tenemos:
𝐶𝑆
𝐾=
𝐶𝑀

Donde:
CS : Es la concentración molar del soluto en la fase estacionaria
CM : Es la concentración molar del soluto en la fase móvil
La resolución cromatográfica de una columna:
Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar sus analitos.
Se la define como:
𝑡𝑅𝐵 − 𝑡𝑅𝐴
𝑅𝑠 = 2
𝑊𝐴 + 𝑊𝐵

Donde: WA y WB son la anchura de los picos A y B en el cromatógrafo.

TR: Es el tiempo que tarda en aparecer el máximo de un pico
A partir de esto se deduce que si R> 1,5 la separación de los
componentes es completa, no será así si R<1,5.
Los componentes básicos de un cromatógrafo líquido son:
Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de
mezclado
de eluyentes)
Dispositivo de inyección
Columna
Conducciones y conexiones
Detector y registrador

*
* Además de los dispositivos anteriormente mencionados se
pueden incorporar en el sistema otros que pueden simplificar el
trabajo o bien mejorar algún aspecto concreto de la técnica
cromatográfica, como pueden ser:
Inyectores automáticos.
Colectores de fracciones.
Sistemas de tratamiento de datos.
  Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes
* La misión de la bomba características:
es la de suministrar un  Estar construido con materiales químicamente inertes
caudal constante y frente a la fase móvil.
libre de pulsos de la
fase móvil a través de  Ser capaz de trabajar a presiones elevadas. Presión
la columna, sin que el estable hasta 5000 psi (400 atm) 1 atm = 14,696 psi
flujo sea influido por  Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar
la presión en cabeza asociado un amortiguador de éstas, ya que las
de columna, ya que pulsaciones, aunque no afectan a la separación en sí,
ésta puede variar por pueden contribuir al ruido de fondo del detector y por
obstrucción de las lo tanto disminuir la sensibilidad.
líneas de conducción,
 Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos
del filtro de la cabeza
de columnas. El rango de caudales para las columnas
de la columna, etc.
que se utilizan habitualmente varía desde los 10µl/min
hasta los 10 ml/min (columnas microbore, analíticas y
semipreparativas)
* Bombas neumáticas
Bombas de motor eléctrico
* Un mal sistema de inyección puede
dar lugar a ensanchamientos de la
banda cromatográfica que
deterioren la eficacia del sistema
cromatográfico. Un inyector ideal
debe tener las siguientes
características:
* Introducir la muestra en la columna
como una banda lo más estrecha
posible.
* Ser de fácil manejo.
* Dar lugar a resultados
reproducibles, tanto en la cantidad
de muestra inyectada como en el
ensanchamiento que origina en la
banda cromatográfica.
• Se emplean válvulas inyectoras
de volumen (loop) constante
• Pueden ser manuales o
automáticas: existen dos tipos
de inyectores manuales: los de
jeringa y los de válvula.
• Para variar el volumen de
inyección se debe cambiar el
“loop” correspondiente
• Se debe evitar la entrada de
burbujas en el sistema de
inyección
* Se trata de una pequeña columna (0,5 – 3 cm)
colocada entre el inyector y la columna
* Ayuda a prevenir la entrada de suciedad,
procedente de la muestra o del eluyente, en la
columna analítica
* Va a permitir alargar la duración de las columnas.
* Debe ser del mismo relleno que el de la columna
analítica, se reemplaza cuando se contamina
* Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio
resistente
* Rectas (10-30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.
* Tamaño partículas de relleno 5-10 um
* Columnas termostáticas: en general se trabaja a T
constante
* gran avance en la última década por el progreso en
la tecnología de rellenos y columnas
* Rellenos más uniformes y de menor tamaño
* Fases químicamente ligadas a los soportes
aumentando su eficacia y resolución
* Mejora en los métodos de empaquetado

Componentes de una
columna de CLAE
* Al disminuir el tamaño del relleno aumenta la
eficiencia pero también la presión de trabajo
* Las columnas constan de:
Cuerpo – normalmente de acero inoxidable
Relleno – material con i.d. definido
* Algunas casas comerciales permiten la
renovación del relleno sin tener que comprar
la columna completa
* Existen columnas de compresión radial, cuyo
cuerpo puede ser presurizado para aumentar
su eficiencia
* El modelo del plato teórico supone que la columna cromatográfica contiene gran
número de capas separadas, llamadas platos teóricos. Los equilibrios para la
separación de la muestra entre la fase estacionaria y la fase móvil tienen lugar en
estos supuestos platos.
* El analito se mueve en la columna por transferencia de fase móvil equilibrada desde
un plato hasta otro.
* Los platos son un concepto imaginario que ayuda a entender como funcionan los
procesos de separación en la columna. El modelo proporciona una medida de la
eficiencia de la columna, que se puede expresar como el número de platos teóricos
de una columna (N), cuántos más platos la columna será más eficiente.
* O como lo que mide cada plato (HEPT, altura equivalente del plato teórico), cuánto
más pequeño mayor eficiencia. Siendo (L) la longitud de la columna, estos conceptos
quedan relacionados de la siguiente forma:
* HEPT = L / N
* El número de platos teóricos que posee una columna real se
puede calcular a través del pico cromatográfico de un
compuesto dado después de su elución. El compuesto es,
generalmente, un compuesto de prueba con buena separación
que producirá un buen pico cromatográfico. (N) se definido
como:

* donde (s) es la desviación estándar del tiempo de retención.

* Cualquier propiedad física o química que se pueda
medir en la disolución podría usarse como método de
detección
* Los detectores en HPLC no son destructivos
* Se pueden clasificar en:
Detectores que miden una propiedad de la fase móvil
Detectores que miden una propiedad de los solutos
* UV/Vis
* Fotodiodos
* Índice de refracción
* Fluorescencia
* Conductividad
* Dispersión de luz
* Espectrometría de masa
 *

* Para sustancias que absorben radiación UV/VIS

* El más usado
* Con lámparas de deuterio, xenon o wolframio
* Desde 190 a 900 nm

Camino óptico de la microcelda de un detector

UV/VIS. Las celdas ordinarias tienen 0,5 cm de
camino óptico y contienen 8 μL de líquido
* Permite registrar la absorbancia simultánea en todo el rango UV/VIS.
* La muestra es atravesada por luz blanca (todas las λ) y el
policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las
hace incidir a la fila de fotodiodos. En cada diodo incide una λ
diferente, que manda la información al sistema de análisis de datos.
* Es el detector de índice de refracción, es el detector de uso de corriente de
respuesta mas universal
* La detección se basa en equilibrar el detector, a caudal constante, con fase móvil
pura y medir el cambio de índice de refracción cuando aparece la muestra eluida
junto con la fase móvil.
* Sólo se pueden usar si la elución es isocrática.
* Responden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad.
* Son muy sensibles a las variaciones de temperatura.
* Deben estar termostatizados.
* Para analitos fluorescentes por
naturaleza o derivados
fluorescentes. Se excitan con la
energía de ciertas longitudes de
onda y emiten radiación de mayor
longitud de onda que la absorbida.
* La radiación emitida se mide
normalmente, con objeto de evitar
interferencias, en dirección
perpendicular a la de incidencia
del haz de excitación. Se
seleccionará la λexc y la λem.
* Son de alta sensibilidad.
* No se ven interferidos por los
disolventes al no tener éstos
naturaleza fluorescente.
* Son detectores basados en una respuesta
diferencial y no absoluta.
* Empleados fundamentalmente en cromatografía
de intercambio iónico.
* Inconvenientes:
* Baja sensibilidad
* Sensibles a impurezas de la fase móvil.
* Enfunción de la composición de la fase móvil
inyectada a la columna, la elución de moléculas
puede ser de dos tipos: isocrática y en
gradiente.
* También existen casos en los que se cambia
totalmente la fase móvil en el transcurso de la
cromatografía y se conoce como elución
politíptica
 Los compuestos eluyen
usando una fase móvil
de composición
constante durante
toda la cromatografía.

Elución isocrática
Todos los compuestos
acaban migrando a
través de la columna
Tipos de hasta el final
elusión

Los diferentes compuestos son

eluidos modificando
Elución en gradualmente la composición de
gradiente la fase móvil durante el
transcurso de la cromatografía
(aumentando la fuerza iónica,
modificando la polaridad, etc.).
n-hexano
Acetonitrilo
Metanol
Cloroformo
Cloruro de metileno
Tetrahidrofurano
2-propanol
Cloruro de butilo
 Parámetros a seguir:

Interacción
Naturaleza
de la fase Tamaño de Composición Detector
de la fase
móvil y la partícula y flujo
Estacionaria
estacionaria
1. El compuesto pasa por la columna cromatográfica a través
de la fase estacionaria mediante el bombeo de líquido (fase
móvil) a alta presión a través de la columna.
2. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las
interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que
adelantan por la columna.
(El grado de retención de los componentes de la muestra depende
de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase
estacionaria y de la fase móvil.)
3. Después los componentes pasan por un detector que genera
una señal (dependiendo de la concentración y del tipo de
compuesto)
4. Se utilizará una bomba para impulsar a la fase móvil
con velocidad y presión constante.
5. Luego llegan a las columnas en donde hay unos
detectores que no hacen mas que indicar el momento de
aparición de los distintos componentes que constituyen la
muestra.
Tener baja viscosidad para reducir
las caídas de presión
No debe disolver la fase
estacionaria

Miscible con otros solventes para

formar mezclas útiles
Bajo contenido de impurezas

Ser compatible con el detector

utilizado
La mas importante diversidad de sus aplicaciones, tanto en compuestos
orgánicos como inorgánicos. Además:

Ampliamente utilizada

Fácil adaptación a las

Posee alta
determinaciones
sensibilidad
cuantitativas exactas

Determinación de compuestos no Aplicabilidad a sustancias de

volátiles (alto peso molecular, interés general (industria, salud,
iones metálicos) medio ambiente).
 INSTRUMENTACION
COSTOSA

REQUIERE DE UNA ALTA

EXPERIENCIA PARA SU DIFICULTADES EN
FUNCIONAMIENTO ANALISIS CUALITATIVOS

ELEVADO COSTO DE
OPERACION
La cromatografía líquida de alta presión a pesar de ser una técnica
relativamente nueva, tiene numerosas aplicaciones en la química.
En la mayoría de los casos, éstas consisten en determinaciones de
sustancias cuyo análisis por otra técnica cromatografía resulta muy
difícil.
Compuestos iónicos: como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos
orgánicos, etc.
Compuestos de alto peso molecular: como polímeros,
hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.
Compuestos no volátiles: como vitaminas, pesticidas, esteroides,
plastificantes, drogas y una parte muy grande de otros productos
farmacéuticos.
* Tienegrandes aplicaciones en lo que se refiere a la contaminació
ambiental la HPLC se utiliza para analizar la capacidadque tiene
algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas, herbicidas, etc.)
El análisis de medicamentos constituye la Aplicación mas grande
de la Cromatografía HPLC que nos sirve para determinar los
componentes activos de diferentes productos usados en la
Industria Farmacéutica como por ejemplo en tabletas analgésicas.
*A. Presión
*B. Forma del Pico
*C. Retención
Síntomas de la columna Posibles causas
Alta presión Obstrucción
Contaminación de la columna
Baja presión Fuga
Flujo incorrecto

Corrección de la sobrepresión
Si la presión con columna es alta:
• Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro)
• Limpiar la frita bloqueada (flujo reverso con un solvente fuerte)
• Lavar la columna Lavar la columna
Eliminar la contaminación en la columna y limpiar el empaquetado bloqueado
Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular
Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampón
* 1. Picos dividos
* 2. Colas en los picos (simetría <3)
* 3. Picos anchos (mala resolución. Rs<2)
* Dependerá de cuántas muestras y tipos de ensayos deban ser
analizados.
* Lafacilidad para reemplazar los sellos de las bombas
(mantenimiento).
* La exactitudes y precisión del sistema de bombas La suavidad y
reproducibilidad de la mezcla