PCR
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Técnica introducida en 1985, es capaz de generar grandes cantidades de copias de
un determinado fragmento de ADN a partir de mínimas cantidades de este
(AMPLIFICACIÓN: amplificación enzimática de un fragmento de ADN, simulando
una replicación natural del mismo “in vitro”) en pocas horas.
La PCR se basa en la replicación del ADN por las enzimas ADN polimerasas (se utiliza
la Taq polimerasa porque es termoestable).
Estos enzimas producen copias de ADN complementario a partir de una cadena de
ADN simple (tras desnaturalización del ADN mediante calor) pero sólo pueden
empezar a copiar añadiendo nucleótidos a una cadena de AN que debe estar
previamente acoplada al ADN de cadena simple (el iniciador o "primer" o cebador).
INICIADORES O PRIMER - 2 funciones:
[Link] los extremos del segmento diana, de manera que solamente este segmento
será amplificado y no toda la hebra.
[Link] el proceso de duplicación.
LA TECNICA CONSISTE EN UTILIZAR:
1. Dos oligonucleótidos de secuencia conocida que se acoplen específicamente a
los márgenes de una determinada secuencia que queremos amplificar
2. Después se añade la Taq polimerasa, nucleótidos y Mg+2 (indispensable para
la reacción).
3. La Taq polimerasa actúa copiando la secuencia de ADN contenida entre los
iniciadores.
4. El proceso se repite múltiples veces mediante la sucesión de ciclos en los que se
varía la Tº de la muestra:
- Al aumentar la Tª de la muestra se produce la desnaturalización del ADN ,de
doble cadena formada. (94-96ºC)
- Luego se vuelve a disminuir la temperatura con lo que se produce la
hibridación o emparejamiento de los oligonucleótidos (primers) con sus
secuencias complementarias específicas. (68ºC)
- Tras la hibridación actúa la Taq polimerasa (extensión 72ºC).
Este proceso se repite de 25 a 45 veces de manera que los “primers” permiten que
se copie solamente el fragmento de ADN que queremos a partir de la secuencia de
ADN original. En cada ciclo se dobla la cantidad de ADN del ciclo anterior, según la
fórmula: 2n (donde "n" es el número de ciclos).
La temperatura de hibridación (annealing), el tiempo de cada etapa, el número de
ciclos y las condiciones de la reacción son muy variables y tenemos que adaptarlos,
por ello es necesario hacer un protocolo especifico para cada una de las secuencias
de ADN que queremos aplicar.
GENERALIDADES
[Link] hebra nueva de ADN o ARN se sintetiza en dirección 5’ a 3’
[Link] ARN polimerasas pueden iniciar la síntesis de una cadena nueva utilizando una
hebra molde
[Link] ADN polimerasas además de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o
cebador de extensión)
[Link] transcriptasa reversa es una ADN polimerasa ARN-dependiente.
Pasos en la replicación de ADN
[Link] de las cadenas (origen de replicación)
[Link]ón de los iniciadores (primers de ARN) la cadena líder utilizará un solo
iniciador mientras que las cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de ARN.
3.Síntesis de cadenas de ADN (partiendo de los iniciadores)
[Link]ón de los iniciadores de ARN
[Link]ón de los fragmentos de ADN (por el enzima ADN ligasa)
ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL ADN POR PCR
1. Hebra templada (Hebra del DNA dúplex que actúa como molde para la
transcripción. Su secuencia es complementaria con la del producto transcripcional,
también se conoce como hebra anticodificadora. En el proceso de replicación del
ADN ambas hebras son templado)
2. Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de nucleótidos complementaria a la
hebra templado. El enzima ADN polimerasa sólo puede iniciar la síntesis de una
cadena de ADN a partir de un 3’OH libre.
3. dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
4. ADN Polimerasa
VENTAJAS
[Link] sensibilidad
[Link] especificidad
[Link]
DESVENTAJA
Problemas de contaminación con ADN extraño debido a la alta sensibilidad de la
técnica. Se utilizan cebadores degenerados (mezclas de cebadores que se
diferencian en alguna base) para para la detección de secuencias conservadas.
ANALISIS DEL PRODUCTO DE PCR
El método más frecuente y universal de detección de ADN es la ELECTROFORESIS
EN GEL teñido con bromuro de etidio (para permitir la visualización del ADN puesto
que esta molécula se inserta entre las bases del ADN dando lugar a una alta densidad
electrónica).
La posterior visualización del ADN se ve con el gel a luz ultravioleta (que estimula
los electrones en los lugares donde hay depósito de bromuro de etidio provocando
autofluorescencia).
Las bandas gruesas obtenidas tras la electroforesis del producto de PCR
corresponden a las secuencias de ADN que han sido copiadas por la Taq polimerasa
y su tamaño es conocido porque en cada electroforesis en uno de los pocillos se
añade una mezcla con fragmentos de ADN de tamaños conocidos, así, según la altura
a la que caiga la banda conoceremos su tamaño.
VARIANTES DE PCR
[Link]-PCR: sirve para la detección de ARNm.
Dado que el ARN es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una
transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. La
transcripción reversa genera una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN
complementario el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR.
Es decir, para la PCR necesitamos tener ADN, un acido nucleico de doble hebra. Si lo
que queremos amplificar es ARN (por ejemplo, de un virus) primero tenemos que
convertir ese ARN en ADN. Esto se consigue gracias a la enzima transcriptasa
inversa. Una vez tenemos el ADN se lleva a cabo la PCR normal.
2. Real Time PCR (PCR a tiempo real) o qPCR (PCR cuantitativa): cuantificación
de copias iniciales en tiempo real.
La PCR cuantitativa o PCR en tiempo real es una variante de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de
forma absoluta el producto de la amplificación de ADN. Para ello emplea, al igual que
la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores
específicos, desoxinucleotidos trifosfato (dNTPs), un tampón adecuado y una ADN
polimerasa termoestable (Taq polimerasa). A dicha mezcla se le adiciona una
sustancia marcada con un fluoróforo que permita medir la tasa de generación de
uno o más productos específicos en un termociclador provisto de sensores
de fluorescencia. Dicha medición se realiza tras cada ciclo de amplificación, y es por
esto que se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea).
[Link] Nested (anidada): amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada.
Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado
como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer
amplicón se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro
del amplicón inicial.
4. Multiplex PCR o PCR multiple: PCR en la cual se amplifica simultáneamente mas
de una secuencia.
La reacción en cadena de la polimerasa multiplex se refiere al uso de la reacción en
cadena de la polimerasa para amplificar varias secuencias de ADN diferentes
simultáneamente. Este proceso amplifica el ADN en muestras usando múltiples
cebadores
[Link] situ PCR: detección en tejido mismo, ubicación del fragmento
Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los
productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación, es realizada
sobre preparaciones fijas en un portaobjetos.
[Link]-PCR: inmunocaptura previa a PCR.
[Link]-RFLP: polimorfismo genético (usado más que RAPDs)
8.L-PCR o PCR larga: Denominada L-PCR (long PCR) o LA-PCR(Longer and Accurate
PCR, “PCR más larga y exacta”), su objetivo es superar los límites de la PCR
convencional para amplificar con fidelidad regiones diana de gran tamaño (entre 5
y 40 kb).
9. PCR inversa: esta variante se emplea para clonar regiones desconocidas de un
ADN, situadas en posición vecinal a secuencias diana conocidas. Es decir, en lugar de
amplificar la región interna flanqueada por los dos cebadores (PCR convencional),
se amplifica la región externa, que flanquea a los cebadores.
[Link] con adaptadores: también puede amplificarse una región de ADN de
secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de restricción unos adaptadores
oligonucleótidos sintéticos con extremos cohesivos compatibles con los generados
en la muestra
[Link] asimétrica: En este caso, se trata de generar copias de hebra sencilla de un
ADN.