EXTRACCION DE ADN:
La extracción de ácidos nucleicos (AN) consiste en la purificación y concentración de éstos a
partir de soluciones acuosas para separarlos de una matriz (células o muestras ambientales),
de la cual se tomaron las muestras, para la posterior aplicación de técnicas de biología
molecular. El esquema general de trabajo se representa a continuación:
Muestra: suero/plasma, materia fecal, muestras ambientales o muestras de alimentos
- Plasma: diluir
- Materia fecal: aclaramiento
- Tejido: homogenización
- Ambientales: debemos concentrar la muestra
MUESTRA
Debe ser recolectada en condiciones de esterilidad y debemos preservarla
Importante: resfrió y refrigerado
Procesamiento de la muestra: eliminar interferentes
- Arn: aun mas labil que el ADN
Si no la voy a procesar inmediatamente debo conservar a -20º para preservar el genoma
ARN: gastroinstetinal, se desintegra fácilmente
Cuidar la muestra para que los INHIBIDORES NO IBAN A LA POLIMERASA
La exraccion se hace en frio: mantener en hielo
3 tecnicas:
TECNICA DE FENOL CLOROFORMO:
Extracción liquido-liquido
Se trata la muestra con na mezcla de fenol cloroformo y alcohol para remover componentes y
lisar a celula. Se centrifuga y tenemos fase orgánica (restos de lípidos y organicos) y fase
acusosa (ac nucleicos) (no importa la orgánica)
- Pongo fenolclorofrmo y centrifugo
- Puede haber contaminación x arrastre de fase orgánica (contaminación x cloroformo)
La fase acuosa se coloca en alcohol y obtengo ac nucleicos que se Re suspenden en h20
COLUMNA COMERCIALIES
Se basa en la propiedad de los AN de unirse a sílica en presencia de un agente caotrópico
(tiocianato de guanidina).
La capacidad de ac nucleicos de interacción en presencia de agente cao trópico, estabiliza al
acido nucleico para que pueda interaccionar con la silica y quedarse unido
- Agente caotropico: desestabiliza la estructura de ADN, interaccionando con el h20 que
rodea a la célula, quedando mas expuestos los grupos fosfatos, uniendo por afinidad
de carga a la silica
- Lavados: agua destilada o agua con centracion salina
Uno hace lavados para sacar l que no queremos y con buffer se eluye el acido nucleico y se lo
epseja de la silica
PERLAS MAGNETICAS
Ácidos nucleicos a un ph acido tiene carga a negativa ,perlas están cargadas positivamente,
ácidos nucleicos interaccionan con las perlas hago lavado y eluyo material genético y obtego
puro
Comparación:
3 separadas ADN y ARN
Fenolcloroformo es mas lenta y manual
Las otras dos son automatizadas
Mejor: columnas, esta todo estandarizado
PCR:
Una vez eztraidos, los ac nucleios son la materia prima
Síntesis in virto de una sec especifica del ADN
Se fnque usando primers (oligonlucoetidos q se unen x complemnetariedada al segmento 3`de
la hebra, delimitando el segmento) sebasa en la capacidad que tiene de replicar el adn con la
enzima polirasa
3 etapas
Aumentar el numero de copias de acidos nucleicos
Trttodo se hace en termociclador
Utilidad cuanti y cualitativo
Fragmento debe tener una long entre 50 y 2000 nucleotidos y para sensibilidad hay un minimo
para que no haya interferencia y se pierda el poder resolutivo
Debo dar todas las condiciones para que lo que se haga in vitro sea tal cual como el núcleo
para esto hago MIX DE REACCION, donde esta todo lo necesario para amplificar el fragmento
- Buffer: composición especial, preserva la muestra y permite que la ADN polimerasa
(enzima q realiza la síntesis)
- Mg: cofactor necesario para la accion de la polimerasa
- Nucleótidos trifosfatos (mezcla de nucleótidos)
- Primers (oligonucleótidos que se unen a a hebra de adn una vez separada y me limitan
la región que se va a amplifcar y permiten que la ADN polimerasa acctue ya que esta
neceista una sec pequeña para hacer “pie” y comenzar a sintetizar)
Los primer se diseñan debo tener la sec del genoma y la sec que QUIERO REPLICAR
- Debo tener el genoma del virus y poder delimitar para hacer el diseño de primer que
debe ser COMPLEMENTARIO
- No pueden sobrepasra un determinado limite en función de la canyidad de guanina y
adenina, por que se aparean entre ellos y generan bucles intramoleculares
FORMANDO DIMEROS DE PRIMERS (una señal muy fuerte, con una luz, y tiene una
LONGITUD muy grande). En una zona donde no quiero VEO BANDAS
- El diseño del primer lleva mucha cabeza, análisis de dist secunecis
- Se hace a partir de plataformas digitales y diseño mi primer
- Polierasa: viene de mo termoressitentes (ya que se trabaja a dist T° y T° altas) debe ser
una enzima q soporte la Temperatura y las oscilaciones
ETAPAS:
1. DESNATURALIZAR LAS HEBRAS
Para que los primers en la región 3´pueden hibrdizar
CALENTANDO A 94° surante 15 seg (el tiempo depende de la extensión del genoma que quiero
amplificar
- Separo la doble helice
2. ANEALING o UNION DE CEBADOR
55-75°, baja la T° los primers se unen a la región 3´del fragmento a sintetizar, hibridaza el
primer
3. ELONGACION
72° la T° debe ser similar para asegurarme que hibridecen las dos juntas
comienza la elongación de la cadena, la ADN polimerasa ocmienza a sintetizar la secuencia
ocmplenetaria a lo qe esta usando de molde
esto sucede en distintos CICLOS en el TERMOCICLADOR, una vez que termine aseguro una
temperatura de 72° durante 10 min, para segurarme que todo se sintetizo
y voy onteniendo de manera exponencial una gran cantidad de copias del fragmento
hago ELECTROFORESIS
pongo un macrador de PM que me inica donde espero ver una banda
corro la electroforesis
hay distintos tipos para ver: bromuro de etidio
también se pueden poner intercalantes en el gel y cuando aparezca ADN hay fluoresencia