GENÉTICA MÉDICA
REACCIÓN DE LA CADENA
POLIMERASA (PCR)
RASHELL RIVADENEIRA
LUIS GARCIA
CONTENIDO
Introducción
Etapas
Tipos de Pcr
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: QUÉ ES LA
PCR MÁS ALLÁ DE SU USO POR LA COVID-19
PCR es una técnica ampliamente utilizada en
laboratorios desde hace años. Su popularidad aumentó
durante la pandemia de COVID-19. Permite la
secuenciación del ADN y la generación de copias en
cadena, y su abreviatura en inglés (Polymerase Chain
Reaction) se ha vuelto común en el lenguaje coloquial.
Que es la PCR?
La PCR amplifica y hace copias de
segmentos de ADN específicos en
laboratorios. Facilita el estudio,
secuenciación y detección de
enfermedades genéticas e infecciones,
como el COVID-19, mediante el uso de
enzimas y ciclos de calentamiento y
enfriamiento selectivos.
La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una
técnica ampliamente utilizada en laboratorios desde hace
años. Su popularidad aumentó durante la pandemia de
COVID-19. Se utiliza para diversos propósitos, como
secuenciación de ADN, perfilación forense y detección de
patógenos mediante la identificación de genes.
UNA EMULACIÓN DE UNA ACTIVIDAD
CELULAR NATURAL
La PCR nace de la necesidad de estudiar pequeños
segmentos de ADN en análisis moleculares y
genéticos. Permite amplificar millones de veces
estos fragmentos, lo que la convierte en una técnica
crucial en biología molecular. Su creador, Kary B.
Mullis, fue galardonado con el Premio Nobel de
Química en 1993.
La PCR se basa en la actividad enzimática de las
ADN polimerasas, que replican el ADN de forma
natural en las células. En la técnica, las polimerasas,
como la Taq, amplifican un fragmento de ADN en
ciclos de cambios de temperatura repetidos (20-35
veces), generando múltiples copias para su análisis.
Este proceso en cadena da nombre a la técnica de
PCR.
La polimerasa Taq es una enzima termoestable
utilizada en la técnica de PCR. Se deriva de la
bacteria Thermus aquaticus y fue aislada en
1968 por Thomas D. Brock. Es comúnmente
abreviada como "Taq Pol" o "Taq" y se emplea
para amplificar secuencias cortas de ADN en la
PCR.
USOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
El ADN amplificado mediante PCR tiene múltiples
aplicaciones en laboratorio. Se utiliza en técnicas de
mapeo genómico, pruebas de paternidad, análisis
forenses, detección de microorganismos como
bacterias y virus, incluyendo el COVID-19, y el
diagnóstico de trastornos genéticos. La PCR es una
herramienta versátil en diversas áreas clínicas y de
investigación.
VENTAJAS DE LA REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA
La PCR ofrece ventajas significativas en comparación con
los cultivos microbiológicos tradicionales. En lugar de
depender de la observación y el ensayo-error, la PCR
permite la detección y caracterización precisa de
microorganismos mediante la amplificación de su ADN. Por
ejemplo, diferenciar bacterias como E. coli y Pseudomonas
aeruginosa requiere pruebas de cultivo, pero la PCR puede
confirmar la capacidad de metabolizar la lactosa. Esta
técnica es más rápida, precisa y sensible, lo que la convierte
en una herramienta valiosa para la identificación de
especies microbianas en aplicaciones clínicas, de
investigación y de control de calidad en alimentos y agua.
SIN EMBARGO, LAS PRUEBAS MOLECULARES COMO LA PCR HAN
APORTADO ALGUNAS VENTAJAS A LAS PRUEBAS DE CULTIVO. LAS
PRINCIPALES SON:
Rapidez en la respuesta: reacción en Sensibilidad: hay organismos que son casi
imposibles de cultivar en un laboratorio, que la PCR
cadena de la polimerasa tarda tan
permite detectar en unos niveles bajos. Esto ayuda a
sólo unas horas en arrojar resultados, reducir falsos negativos, ya que puede darse la
mientras que las pruebas de cultivo posibilidad de que una muestra positiva se de por
bacteriano pueden alargarse días. negativa porque no se dispone de cantidad
suficiente para analizarla.
Qué se necesita para llevar a cabo una PCR
Una plantilla de ADN: en primer lugar se necesita el ADN que se debe
copiar, que generalmente se extrae y se purifica de la sangre o de otro
tejido.
Cebadores o iniciadores (primers, en inglés): se trata de oligonucleótidos
monocatenarios que se unen a la plantilla de ADN por los extremos y sirven
para que la polimerasa inicie la reacción para empezar a sintetizar el
material genético. Se necesitan dos cebadores para la PCR, cada uno de
ellos complementario a una cadena de ADN que queremos amplificar, y
delimitan la zona del ADN a amplificar, es decir, que corresponden a:
Una ADN polimerasa Una solución tampón: se trata de la creación
de un entorno óptimo para que tenga lugar
(por ejemplo, Taq la reacción en cadena, en el que poder
polimerasa o Pfu): para regular el pH, es decir, las condiciones de
acidez o basicidad en las que se produce la
sintetizar el ADN como síntesis del material genético.
hemos explicado.
dNTP (Trifosfatos de
desoxirribonucleótidos): los Solución de sal de cloruro de
componentes básicos del ADN son 4 magnesio: el cloruro de
tipos de nucleótidos, integrados por 4 magnesio se disocia y se libera
bases nitrogenadas (adenina,
magnesio, cuyos iones de carga
guanina, citosina y timina), por lo que
para poder obtener nuevas moléculas
positiva (+2) se usan como
de ADN (las copias) son cofactores de la polimerasa.
indispensables estos componentes.
La PCR utiliza un termociclador para realizar ciclos
de cambios de temperatura, permitiendo la
desnaturalización y síntesis del ADN. Este proceso
se programa para que se complete en unas pocas
horas, junto con los otros ingredientes necesarios
para la amplificación del ADN.
1.- Desnaturalización
REPETICIONES
ETAPAS DE
LA PCR
[Link]ón del ADN
3. Ampliación
Es el momento en el que la plantilla
1.- de ADN de doble cadena se calienta
Desnaturaliza para separarlo en dos cadenas
ción simples.
¿QUÉ OCURRE EN ESTA ETAPA?
1
Los componentes de la
2
La temperatura alta
3
Mantener un tiempo
hace que los enlaces de considerable para que
PCR junto con el ADN se
hidrógenos se rompam asegurar la separación de
calienta 94 - 95C
y las cadenas se separen las cadenas (15 y 30 seg).
Durante esta etapa, se baja la temperatura para
permitir que los cebadores (primers) de ADN se
2.- Alineación
adhieran a la plantilla de ADN.
del ADN
¿QUÉ SUCEDE EN ESTE PROCESO ?
Estos primers sirven como Este paso suele tardar
punto de partida para entre 10 y 30
sintetizar el ADN, Sólo segundos.
La temperatura baja a
50- [Link] que los
cuando el primer se ha unido
a la secuencia, la polimerasa 4
cebadores se adhieran a puede unirse y empezar a
2
un lugar específico de la generar la nueva hebra
plantilla de ADN 5
monocatenario.
Estas dos hebras de
3 ADN separadas son
complementarias, y
1 Los primers o cebadores
van en sentido
opuesto.
son secuencias de ADN
que poseen de 20 a 30
bases de longitud,
diseñados para
complementar secciones
cortas de este ADN
3.- Es el paso final, la parte en la que la temperatura
Ampliación aumenta y la nueva cadena de ADN es producida
del ADN por la enzima polimerasa Taq.
¿QUÉ PASA EN ESTE PREOCESO ?
Obtendremos una
El calor se nueva cadena de
incrementa a 72ºC ADN
1 2 3 4
Se adhiere al primer y Este paso puede
luego agrega bases de ADN tardar alrededor
a la hebra individual una de un minuto
por una en la dirección de (para copiar 1.000
5 ‘a 3’.
bases de ADN)
REPETICIONES
La reacción en cadena de la polimerasa requiere repetir estos tres
procesos o ciclos térmicos de 20 a 40 veces, duplicando el número
de copias de ADN cada vez.
Los nuevos fragmentos de El resultado es un gran
ADN que se generan número de copias de un
durante la PCR a su vez segmento de ADN concreto
sirven como plantillas a las obtenidas en un periodo
que la polimerasa puede de tiempo mucho más
unirse y comenzar a corto que otro tipo de
generar más ADN. técnicas
¿DE DÓNDE SE TOMA LA MUESTRA?
TIPOS DE
REACCIÓN EN SALIVA
SANGRE
LA CADENA
POLIMERASA
MOCO TEJIDO
TIPOS DE PCR
PCR anidada
PCR in situ
PCR múltiple
RT-PCR (con transcriptasa inversa)
PCR en tiempo real o cuantitativa
PRC de células viables.
PCR ANIDADA
Se usa cuando se quiere incrementar la sensibilidad y la
especificidad de la detección.
Por esta razón se duplica el paso de la amplificación con
distintos pares de primers en cada uno.
Primero se lleva a cabo una reacción en cadena con los
cebadores externos para amplificar la parte más extensa
de ADN, que contiene el segmento que tenemos por
objetivo, y luego está amplificación se usa como ADN
plantilla de una segunda PCR con cebadores internos
para copiar ese segmento específico.
PCR IN SITU
Se suele usar para detectar cadenas de ADN dentro
de células que con otras técnicas no se pueden
detectar, por lo que se hace en tejidos. En contrapartida
tiene menor capacidad de amplificación.
PCR MÚLTIPLE
En esta variante se usan varias parejas de cebadores
en una misma reacción en cadena para varias
ampliaciones.
Cada pareja corresponde a un virus distinto, y así se
puede detectar una misma reacción de varios patógenos
a la vez, como por ejemplo diferentes virus respiratorios.
RT-PCR (CON TRANSCRIPTASA
INVERSA)
Es la que se lleva a cabo en el diagnóstico de virus como el SARS-CoV-2 que
causa la COVID-19. Este tipo de PCR es necesario para virus que tienen
genoma de ARN, que requieren un paso adicional en el proceso: después de
aislar y purificar el ARN, se usa la transcriptasa inversa para sintetizar una
molécula de ADN complementario que sirve de inicio para la PCR convencional.
Consta, por lo tanto, de tres pasos:
Primer paso: retrotranscripción a partir del ARN.
Segundo paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
Tercero paso: PCR estándar.
PCR EN TIEMPO REAL O
CUANTITATIVA
La ventaja principal de esta PCR es que permite monitorizar (medir) en
tiempo real la cantidad de fragmentos de material genético que se
van produciendo, es decir, durante cada ciclo de amplificación, y no al
final, sin sacrificar la precisión.
Se requieren reactivos fluorescentes y un termociclador que mide la
fluorescencia en un momento concreto de cada ciclo de amplificación. Esto
es especialmente interesante si lo que se desea testar es un
microorganismo en alimentos muy perecederos o de vida útil corta.
PRC DE CÉLULAS VIABLES.
Como paso previo a la amplificación del fragmento de ADN diana, la
muestra se somete a una neutralización del material genético “libre” en
la suspensión, o el procedente de células dañadas o muertas. Con este
paso inicial, los resultados de la PRC evidenciarán solamente la presencia
de células vivas presentes en nuestra muestra.