TECNICAS DE AMPLIFICACION DE

GENES: BIOLOGIA MOLECULAR

APLICADAS AL DIAGNOSTICO
PCR
Fundamentos, variantes y aplicaciones
 REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)

1985 - Mullis & Falloona

Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
 Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades

• La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección

5’ 3’

• Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una

cadena nueva utilizando una hebra molde

• La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-

dependiente
• Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan
un iniciador (primer o cebador de extensión)

•.
 Basta un primer

Cadena líder
(Leading Strand)

Primer (riboNTPs)

Fragmento de Okasaki

Cadena rezagada
(Lagging Strand)

LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´ 3´.

Eventos en la Replicación del DNA:
• Apertura de las cadenas (orígen de replicación)
• Colocación de los iniciadores (primers de RNA)
( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las
cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
• Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
• Eliminación de los iniciadores de RNA.
• Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA
ligasa)
 REACTIVOS EQUIPO DE LABORATORIO
ADN molde Termociclador (PCR real time)

dNTPs (dATP, aGTP, dCTP y dTTP)

Lectores de fluorescencia*
ADN polimerasa (termoestable)

Mix de reacción (buffers, sales, Equipo de cómputo y software*

bloqueadores, etc.)

Primers (específicos)
 COMPONENTE DEL MIX FUNCIÓN
Necesario para la activdad de la ADN
polimerasa y para promover la
MgCl2 (fuente de iones Mg2+)
especificidad de unión de los primers a la
cadena molde.

Mantener el pH y la fuerza iónica de la

reacción dentro de un rango óptimo para
Buffers y otras sales (Tris, NaCl, KCl, etc.)
la función de la ADN polimerasa.
Estabilizan la unión de los primers al ADN.

Albúmina sérica bovina (BSA) Mejora la actividad de la polimerasa

Dimetilsulfóxido (DMSO) Aumenta la eficiencia de la reacción
Biotina Marcaje de moléculas
Agentes fluorescentes Identificación y cuantificación
PCR

Temperatura
100
Melting
94 oC

50

0
Tiempo

3’ 5’
DNA de 5’ 3’
cadena doble
PCR

Temperatura
100
Melting
94 oC

50

0
Tiempo
3’ 5’

DNA de
cadena simple
Calor

5’ 3’
PCR

Temperatura
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

Hibridación
de primers

5’
5’ 3’
PCR
30 ciclos

Temperatura
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’

Calor
5’

5’

Calor
5’
5’ 3’
PCR
30ciclos

Temperatura
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 3’
PCR
30ciclos

Temperatura
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’
5’ 3’

Calor
5’

5’

Calor
5’
 PCR 30ciclos

Temperatura
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’

5’
5’

5’
5’
PCR
30ciclos

Temperatura
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’

5’
5’
El numero de copias del DNA delimitado por los primers se
duplica en cada ciclo de PCR.

Numero de copias
1 2 4 8 16 32 64

0 1 2 3 4 5 6
# ciclos
 VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS

 ALTA SENSIBILIDAD
 ALTA ESPECIFICIDAD
 RAPIDEZ

DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado específico o productos amplificados previamente)
 TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR

 RT-PCR : detección de mRNA

 PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
 PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea
 In situ PCR : detección en tejido mismo, ubicación del fragmento
 IC-PCR : inmunocaptura previa a PCR
 PCR-RFLP : polimorfismo genético (usado más que RAPDs)
 Real Time PCR : cuantificación de copias iniciales – en tiempo real
 PCR Multiplex

- Varias secuencias target en forma simultánea.

- La eficiencia de amplificación de ambos targets no es
necesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets
(%GC)
- Temperatura de hibridación de los diferentes
primers
- Tamaño de las diferentes secuencias target
- Artefactos / dímeros entre diferentes primers.
PCR ANIDADA MULTIPLEX
INTERPRETACION PCR ANIDADA MULTIPLEX
 Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
RT-PCR • PCR
mRNA

OBJETIVO:
Detección de la expresión de cDNA (simple cadena)
un gen – por presencia de
mRNA
Detección de patógenos de cDNA (doble cadena)

RNA

PCR
Transcripción Reversa
1. Purificación de RNA mensajero
2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)
PCR ANIDADA

TECNICA MODIFICADA DE LA PCR QUE INCREMENTA LA SENSIBILIDAD

NIVEL DE DETECCION: 15 fmg (5-15 part/muestra)
PCR RFLP´S
• TÉCNICA BASADA EN LA AMPLIFICACIÓN POR PCR Y
POSTERIORMENTE EN LA DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN,
LAS SIGLAS RFLP´S SIGNIFICAN POLIMORFISMO EN LA LONGITUD DE
LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION
• técnica utilizada para tipificacion viral, polimorfismos etc
 PCR ANIDADA RFLP´S
1 2 3 4 1 2 3 4

1 2 3 4 5
238
pb

157/81 pb 262 pb 178/

96 pb

16 18

453 pb (B-
GLOBINA)

232 pb

188/
46 pb
33
 USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR
EN LA SOCIEDAD

• Medicina : Diagóstico Molecular:

Enfermedades geneticas
Enfermedades infecciosas
• Identificación genética y filiación (Pruebas de paternidad,
medicina forense, pedigree de animales, etc...)
• Mejoramiento genético en animales y plantas
• Productos biomédicos
• Terapia génica
 REAL TIME PCR

INTRODUCCION
- PCR (estandar monoplex o variantes)
- RT-PCR
- PCR Cualitativo (end point analysis) PUNTO FINAL
- PCR en tiempo real (análisis de la cinética de
reacción)
- ventajas
- desventajas
- aplicaciones
Cuantificación de copias de mRNA

1. Diferencias en la expresión de genes (por efecto de drogas

por ejemplo)

2. La poca cantidad de mRNA disponible en ciertos

procedimientos:
•células obtenidas por LCM (laser capture microdissection)
•cantidades pequeñas de tejidos
•células primarias
REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL

•Cuantificación del número de copias de DNA

presentes en la muestra (diagnóstico, monitoreo de
carga viral, comparación entre número de copias en
diferentes subespecies, etc.)
•Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real
(análisis de la expresión de genes en diferentes
tejidos o en diferentes condiciones normales vs
patológicas, efecto de drogas, etc)
•Análisis de la cinética de la reacción
PCR en tiempo real

• Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes.

• La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de

producto formado en cada ciclo de PCR.

• Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares, SYBR

Green
TaqMan PCR
Sonda específica
SYBR Green

• Agente que se intercala

en DNA de doble
cadena.
• Desventaja: se une a
CUALQUIER DNA de
doble cadena (dímeros
de primers y productos
inespecíficos).
 Amplification Plot of real-time PCR

Log phase Level off/ plateau

DNA copy number (log)

2
4

16

32

PCR cycle (Ct)

CYCLE NUMBER DNA copy number
0
1
1
2
Copies of DNA=2N
2 4 1.8E+09
3 8
1.6E+09
4 16
5 32 1.4E+09

6 64 1.2E+09

DNA copy number

7 128
1.0E+09
8 256
9 512 8.0E+08

10 1,024 6.0E+08
11 2,048
4.0E+08
12 4,096
13 8,192 2.0E+08

14 16,384 0.0E+00
15 32,768 0 5 10 15 20 25 30 35

16 65,536 PCR cycle

17 131,072 10
18 262,144
9
19 524,288
8
20 1,048,576
7

DNA copy number (log)

21 2,097,152
22 4,194,304 6

23 8,388,608 5

24 16,777,216 4

25 33,554,432 3
26 67,108,864 2
27 134,217,728 1
28 268,435,456
0
29 536,870,912 0 5 10 15 20 25 30 35
30 1,073,741,824 PCR cycle

31 1,400,000,000
32 1,500,000,000
33 1,550,000,000
PCR reagent is the limiting factor!!
34 1,580,000,000
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS

Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relación como línea recta

al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción
logarítmica.
Real Time PCR
 PROBLEMAS

PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que

pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.

ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:

• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeños
 APLICACIONES DE PCR EN MEDICINA

• Detección de cantidades mínimas (diagnóstico temprano en

pacientes asintomáticos)
• Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga viral)
• Evaluación de terapia - pronostico de recaída
• Detección de cepas resistentes a antibióticos
• Detección temprana de Citomegalovirus y otros patógenos en
pacientes con transplante de órganos (por inmunosupresión
y mayor riesgo a infecciones latentes)
MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER
SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR

•Sangre - Bacterias
•Mucosa - Hongos
•Tejido - Parásitos
•Orina - Virus
•Heces - Mutaciones en Genes
•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de
genes
Secuenciación del DNA
Principios y Métodos más empleados
Genomas Secuenciados
• En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran escala del genoma
de organismos eucariotes
• Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos pluricelulares son:
• 1998 Caenorhabditis elegans - 8 x 107 pb - un nemátodo
• 2000 Homo sapiens - 3 x 109 pb - el Humano
• 2000 Arabidopsis thaliana - 1.15 x 108 pb- una planta
• 2000 Drosophila melanogaster - 1.65 x 108 pb - la mosca de la fruta
• 2002 Anopheles gambiae - 2.78 x 108 pb - el mosquito vector de la malaria
Secuenciación Tipo Sanger
• El método de secuenciación de Sanger aprovecha la forma normal de
la replicación del DNA
• Para extender la cadena de DNA, usando la DNA polimerasa, deberá
estar presente un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la deoxiribosa
• Los fragmentos se generan al agregar pequeñas cantidades de 2’ 3’
dideoxinucleótidos a la reacción lo que interrumpe la polimerización
cada vez que son incorporados en la cadena de DNA
• La polimerasa usada deberá de carecer de la actividad de la
exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que funcione el método
 Dideoxinucleótidos
• La secuenciación de DNA usando el
método de Sanger emplea 2’3’- 2’-deoxinucleótido
dideoxinucleótidos trifosfatados monofosfato
ademas de los normales 2’- OH
Fosfato
deoxinucleótido trifosfatado HO O NH2
P
Base
• Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos O
N N
trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo,
N N
y la polimerización del DNA ocurre solo 5’CH2
O
en la dirección 3’, cada vez que un 2’3’-
4’ 1’
dideoxinucleótido trifosfato es Azucar
3’ 2’
incorporado la extención se detiene
H
OH H

2’3’-dideoxinucleótido
monofosfato
 OH
H OH
NH2
HO P O
N
O N
N O
CH2 N CH2
Los 2’3’ O
O

dideoxi- O H
O P OH

nucleótidos HO P O
O H
OH
H

terminan O
N

N
NH

la síntesis del CH2

O
N NH2 O
CH2

DNA
O

O
P HO
O H
NH2 H O
H H2O
HO P O
N
O
N O
CH2
O
O CH2
O

O HO
OH H P
HO
Secuenciación de DNA
fragmento
Clonado

Prímero
Sitios de Prímeros

Plásmido con un
fragmento clonado
de DNA
 La Reacción con ddATP
3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’
5’TTATCG

5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCA
5’TTATCGTACCATGA
5’TTATCGTACCATGACTA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGA
5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA
Separación de los Fragmentos
• Todos los métodos actuales de secuenciación
requieren que la separación de los fragmentos de DNA
detecten diferencias en longitud de una base
• Esto se logra por una electroforesis ya sea en geles de
poliacrilamida o en capilares con polímeros líquidos
Separación de Fragmentos (Sanger)
• Los productos de las 4 ddATP ddCTP ddGTP ddTTP

reacciones, cada una

conteniendo una pequeña

Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope

cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleótidos, son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
• Como la polimerización es solo
en dirección 5’ a 3’, los
fragmentos más cortos estarán
en 5’ y los más largos que se
encontrarán en la dirección 3’
Secuencia con Terminadores Fluorados
3’AATAGCATAACGTTAACGTTACGCTAT5’
5’TTATCG
5’TTATCGTA
5’TTATCGTAT Como la base al
5’TTATCGTATT final de cada
5’TTATCGTATTG fragmento esta
5’TTATCGTATTGC marcada con un
5’TTATCGTATTGCA
5’TTATCGTATTGCAA fluoróforo único, la
5’TTATCGTATTGCAAT reacción total se
5’TTATCGTATTGCAATT puede hacer en un
5’TTATCGTATTGCAATTG solo tubo
5’TTATCGTATTGCAATTGC
5’TTATCGTATTGCAATTGCA
 Sistema Prisma 3100 ABI
ATTGC A

Capilar
Pol.
líquido
…..

Laser
Placa caliente
-
Prisma
Reacción
Ventana Secuencia
Detectores
+
 TECNICAS DE
HIBRIDACION DE
GENES
 SOUTHERN BLOT
* Interacción DNA-DNA (hibridación por complementariedad de cadena)
* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Detectar la presencia de un gen, etc.
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA 32P
moléculas de DNA
de DNA …TAACGT…
DNA
…ATTGCA… interés

Resultado
Gel Agarosa Southern BLOT
4. Revelado

DNA
interés
32P

Todos los DNA

DNA de interés
 NORTHERN BLOT
* Interacción RNA-DNA (hibridación)
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Expresión génica
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA 32P
moléculas de RNA
de RNA …TAACGT…
RNA
…AUUGCA… interés

Resultado
Gel Agarosa Northern BLOT
4. Revelado

RNA
interés
32P

Todos los RNA

RNA de interés
TECNICAS BASICAS DE
CLONACION
Clonación es un conjunto de técnicas por la que podemos generar
múltiples copias de un fragmento de DNA

¿Para qué?

producir grandes cantidades de una proteína o del vector con fines

industriales
investigación básica:
estudio de la función de la proteína
regulación de la expresión
análisis de complementación
aislamiento para estudios bioquímicos
mutagénesis in vitro
[Link]ón del fragmento a clonar

enzimas de restricción tipoII: reconocen secuencias específicas

dejando extremos cohesivos
[Link]ón del fragmento a clonar

enzimas de restricción tipoII: reconocen secuencias específicas

dejando extremos romos
Nomenclatura
 Análisis de los fragmentos de DNA en geles de agarosa

composición de los geles

agarosa +
tampón

hervir
verter en molde
solidificar

+
Factores que afectan a la velocidad de migración de los
fragmentos de DNA en geles de agarosa

a. tamaño: la velocidad de migración del fragmento es

inversamente proporcional al log del nº de pares de bases
patrón
b. concentración de agarosa: la velocidad de migración
del fragmento es menor a mayor concentración.
El rango de separación de tamaños varía

distancia
mm
d. voltaje aplicado: la velocidad de migración es proporcional al voltaje
aplicado

condiciones standar son 5v/cm

e. composición de bases: no afecta a la migración

f. composición del tampón: la velocidad de la migración es mayor a mayor

fuerza iónica
(en agua la conductividad es nula)

Tampones mas usados son

Tris-Acetato (TAE)
Tris-Borato (TBE)
g. dirección del campo eléctrico
-

- +
- +

“lo normal”
- +

- +
+
campo pulsante
(PFGE)
para separar fragmentos
50-100Kb
 Análisis de los fragmentos de DNA en geles de agarosa

visualización de los fragmentos de DNA

tinción con Bromuro de Etidio: molécula fluorescente que se

intercala entre la s bases de la molécula de DNA

absorción a 330 nm (UV) emisión en luz visible (anaranjado)

cuantificación de la cantidad de DNA

partir de una banda de DNA patrón

ng kb
100 23
a
50 9
200 6 b
10 2 ¿qué cantidad de cada uno de los fragmentos
tenemos en la muestra?
musetra
patrón

¿qué tamaño tiene cada uno de los fragmentos?

5µl
Recuperación de los fragmentos de DNA en geles de agarosa

+ GELasa ó
AGARasa

filtro

centrifugar

DNA
 Clonación molecular
• Se refiere al aislamiento de secuencias de DNA de
cualquier especie, y su inserción en un vector para su
propagación, sin alteración de la secuencia de DNA
original.
• Una vez aisladas, las clonas moleculares pueden ser
usadas para generar muchas copias de DNA para el
análisis de la secuencia, expresar la proteína resultante

• Las clonas también pueden ser alteradas o mutadas para

alterar su expresión y evaluar su función.
Clonación molecular
• El diagrama de flujo básico de la clonación molecular incluye
4 pasos:

Ligación de Selección/búsqued
fragmento en un •Bacteria a de clonas con
•Enzimas de vector DNArecombinante
restricción •Virus
•Plásmido
•PCR •PCR
•Vector viral Transformación de
Aislamiento de DNA recombinante
•Hibridación
fragmentos de DNA en huésped
2. Elección del vector de clonación

Plásmidos Fago M13 DNAss Fago  DNA ds

Fagómidos
Plásmidos: moléculas circulares de DNA con un origen
propio de replicación

nº de copias: 1-2/5-6 bajo-medio

10-20 alto pBR322
200-1000 muy alto pUC18
 gran escala
Aislamiento de plásmidos
mini-prep
a partir de una colonia
Protocolo

lisis: NaOH ó 100ºC

lisozima
detergente

bacterias
DNA

restos celulares
gradientes de cloruro de cesio+ Bromuro de Etidio

El BrEt se intercala entre las bases de la molécula de DNA

Gradiente de ClCs
+
BrEt

DNA lineal
(cromosoma,
plásmido L y OC)

DNA superenrollado
(plásmido CCC)

DNA CCC+ BrEt aumenta

su densidad
Extracción- purificación-concentración de DNA

Protocolo general

DNA en solución + etanol

(de lisis ó tampón) DNA precipita
1 2 3

4
eliminamos sobrenadante
resuspendemos DNA precipitado en el tampón adecuado
5
 CREACION DE BIBLIOTECAS
GENOMICAS

El ADN del fago lambda es una molécula lineal

de 48,5 kb que termina en dos extremos cohesivos
constituidos por 12 nucleótidos; que se denominan
«secuencia cos»

una parte del genoma depuede ser reemplazado

Aislamiento del fago: Ciclo lítico del fago 

lisis

partículas
de fago

restos
celulares
 Aislamiento del DNA del fago y clonación de un fragmento

cos cos

brazo izquierdo 20kb 15-20 kb brazo derecho 8-10kb

EcoRI EcoRI

[Link] del fago con fenol/SDS para desnaturalizar proteínas de

la cabeza y cola
[Link] con las enzimas de restricción (EcoRI)
[Link]ón del DNA de los brazos cos
EcoRI EcoRI
por electroforesis
por gradiente de sacarosa tras ligar los extremos cos
[Link] con el fragmento a clonar
[Link] in vitro del DNA de fago  recombinante y selección
Empaquetamiento Selección
fago M13 como vector
Fagómidos
BANCOS DE cDNA

Es una técnica para clonar secuencias de

cDNA inducidos bajo un determinado
estímulo. Estas secuencias, se obtienen a
partir de RNAs poliadenilados
 Plásmidos
Los plásmidos son moléculas de ADN de doble
cadena circular covalentemente cerrado (ccc)
extracromosómicas de origen natural que tienen
un origen de replicación (ori+) y que se replican
autónomamente en las células bacterianas.

¿Porqué son empleados como vectores?

Porque son:
-Pequeños.
-Producen múltiples copias.
 PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO

GEN LACZ
(MARCADOR
DE
GEN DE SELECCIÓN)
RESISTENCIA
AL
ANTIBIÓTICO
(MARCADOR SITIO DE
DE CLONADO
SELECCION) MÚLTIPLE

ORIGEN DE
REPLICACION
PURIFICACION DE RNA
TOTAL

ELABORACION DE cDNA

Primera cadena

Doble cadena

Purificacion de RNA poly A

 3. Ligamiento

formación de nuevos
puentes entre los extremos

5’-P y 3’-OH
4. Transferencia a la célula huesped

transformación bacteriana
crear “huecos” en pared y membrana
celular para que entre el DNA exógeno

tratamiento con cloruro cálcico

electroporación
 5. Selección de los recombinantes

Inactivación de la resistencia a algún antibiótico: pBR322

Complementación : E. coli M15/ pUC18 en placas X-gal

Comprobación de los recombinantes

Análisis de restricción de los plásmidos recombinantes

Línea 1: plásmido pKT49 digerido con la enzima BamH1

Líneas 6, 7, 9 y 10: vectores no recombinantes

Líneas 2, 3, 4, 5, 8 y 11: plásmidos con insertos de ADN

LOS PLÁSMIDOS SON ELEMENTOS DE TRANSFERENCIA
DE INFORMACIÓN GENÉTICA ENTRE BACTERIAS
 GEN LACZ

SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE

AMPR

PLÁSMIDO DE CLONADO

ORIGEN DE
REPLICACIÓN
 inserto

DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO Y

DEL FRAGMENTO DE ADN CON
LA MISMA ENZIMA DE
PLÁSMIDO DE CLONADO RESTRICCION
 INSERTO

EcoRI EcoRI

DIGESTIÓN CON LA MISMA

ENZIMA DE RESTRICCION
PLÁSMIDO DE CLONADO
PLÁSMIDO DE CLONADO
DIGERIDO CON EcoRI

DIGESTIÓN CON LA MISMA

ENZIMA DE RESTRICCION
LIGACIÓN
ADN LIGASA
¿CON QUÉ?

ADN LIGASA
TUBO CON MEZCLA DE
FRAGMENTO DE ADN Y
PLÁSMIDO DIGERIDOS CON
EcoRI
 DOS
RESULTADOS
POSIBLES ….
PLÁSMIDO NO
RECOMBINANTE

PLÁSMIDO RECOMBINANTE
TRANSFORMACIÓN
BACTERIANA
¿CÓMO?

MÉTODO QUÍMICO O FÍSICO

TUBO CON MEZCLA DE TUBO CON CULTIVO
PLÁSMIDOS LÍQUIDO DE BACTERIAS
RECOMBINANTES Y NO
RECOMBINANTES
 BACTERIA NO
TRANSFORMADA

DOS
RESULTADOS
POSIBLES ….

BACTERIA
TRANSFORMADA
SIEMBRA PLACAS CON MEDIO AGAR LB SUPLEMENTADO CON

AMPICILINA, IPTG Y X-gal

INCUBACIÓN A 37°C POR 16 HORAS
TRES RESULTADOS POSIBLES ….

A. BACTERIA NO
TRANSFORMADA

EN UN MEDIO
CON AMPICILINA

LA BACTERIA SIN
PLÁSMIDO NO CRECE
 TRES RESULTADOS POSIBLES ….

B. BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO
NO
RECOMBINANTE

EN UN MEDIO EN UN MEDIO
CON AMPICILINA CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO

LA BACTERIA CON
NO RECOMBINANTE (GEN
PLÁSMIDO CRECE
LACZ INTEGRO) ES AZUL
 TRES RESULTADOS POSIBLES ….

C. BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO
RECOMBINANTE

EN UN MEDIO EN UN MEDIO
CON AMPICILINA CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO

LA BACTERIA CON
NO RECOMBINANTE (GEN
PLÁSMIDO CRECE
LACZ DISRUPTO) ES BLANCA
 4
 

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/ 572208 - BIOLOGIA MOLECULAR PARA

CIENCIAS BIOLOGICAS (6 - A)

/ Tópico/tema 7 / EXAMEN 3°

Comenzado en viernes, 9 de junio de

2023, 10:10
Estado Terminados
Finalizado en viernes, 9 de junio de
2023, 10:35
Tiempo 25 mins 48 segundos
empleado
Puntos 32.0/32.0
Calificación 10.0 de un total de
10.0 (100%)

Pregunta 1
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

un gen reportero debe expresarse para

tener la certeza de que fue clonado un
fragmento en él.

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 2
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

es el vector mas utilizado para la

generación de bibliotecas genómicas es:

a. pMOS

b. pBlue script

c. fago lambda

Su respuesta es correcta.

Pregunta 3
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

La enzimas ligasa es la responsable de

formar enlaces fosfotriester entre las
bases de una sola hebra de ADN.

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 4
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

un fragmento cortado con una enzima

que forma extremos cohesivos garantiza
que dicho fragmento se insertó en la
orientación esperada

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 5
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

en un vector de clonación utilizado para

expresión de proteínas recombinantes es
preferible:

a. que tenga sitios de restricción

unicos

b. que haya una gran cantidad de

copias en la bacteria

c. que tenga un SCM con multiples

sitios de restricción

Su respuesta es correcta.

Pregunta 6
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

un paciente infectado con VIH cuyo

genoma de ARN puede ser diagnosticado
en el laboratorio utilizando una muestra
de plasma, a través de la técnica de
southern blot.

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 7
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

Son enzimas utilizadas para remover

impurezas de una muestra de ADN:
excepto

a. Proteasas

b. Nuclesas

c. RNAasas

d. DNAasas

Su respuesta es correcta.

Pregunta 8
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

para la formación de placas de lisis es

necesario eliminar los genes del ciclo
litico del fago lambda con enzimas de
restricción.

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 9
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

una sonda utilizada en una hibridación

molecular se puede obtener por PCR

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 10
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

es un gen marcador de selección en un

plásmido excepto:

a. neomicina fosfotransferasa II

b. gen bla

c. gen tet

d. gen Z

Su respuesta es correcta.

Pregunta 11
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

en los bancos de cDNA se forman placas

de lisis

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 12
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

para elaborar un banco de cDNA se

requiere purificar RNA poly A utilizando
resinas con oligos de poly A

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 13
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

son sitios que quedan en las secuencias

después de ser cortadas

a. sitios romos

b. sitios cohesivos

c. sitios pegajosos

d. sitios rasurados

e. a y b son correctas

f. todas son correctas

g. ninguna es correcta

Su respuesta es correcta.

Pregunta 14
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

una genoteca representa todo el

conjunto de genes inducidos bajo un
determinado estímulo

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 15
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

cuando se quiere transfectar y observar

la expresión de RNA en una célula se
requiere de la enzima:

a. fosfatasa alcalina

b. agarasa

c. fragmento Klenow

d. poly A polimerasa

Su respuesta es correcta.

Pregunta 16
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

son enzimas que cortan en sitios que se

leen igual de 5´a 3´

a. enzimas de restricción

b. enzimas proteolíticas

c. endonucleasas

d. a y b son verdaderas

e. a y c son verdaderas

f. todas son verdaderas

Su respuesta es correcta.

Pregunta 17
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

la formación de colonias blancas

garantizan que el fragmento cortado con
la misma enzima que el plasmido y que
deja extremos romos, se encuentra en la
orientación adecuada

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 18
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

Al expresar el gen de la insulina humana

en un sistema de expresión bacteriana se
requiere que su promotor propio sea
constitutivo para obtener alta
concentraciones de la proteína

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 19
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

un estudio tipo northern blot es utilizado

para la detección de secuencias de:

a. DNA

b. RNA

c. proteínas

Su respuesta es correcta.

Pregunta 20
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

la aparición de múltiples bandas en un

experimento de PCR con un par de oligos
significa:

a. una adecuada temperatura de

alineamiento

b. la amplificación de varios
segmentos de un gen

c. una baja temperatura en el

alineamiento

d. un alto contenido de G-C.

e. a y b son verdaderas

f. c y d son verdaderas

Su respuesta es correcta.

Pregunta 21
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

en la ligación de un fragmento a un
vector deben respetarse la relación

a. igual número de bases de la

moléculas del vector y el inserto

b. el peso en bases del vector

c. la concentración idéntica de
ambos cuantificada
espetrofotometricamente

Su respuesta es correcta.

Pregunta 22
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

la aparición de muchas bandas en un

ensayo de hibridación tipo southern
puede deberse a :

a. varias copias idénticas del gen

b. variantes similares del gen

c. lavados agresivos (astringentes)

d. lavados a temperatura y fuerza

ionica baja

Su respuesta es correcta.

Pregunta 23
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

cuando una muestra contiene patógenos

cuyo genoma es de ARN en una cantidad
muy baja es recomendable realizar:

a. PCR simple

b. RT-PCR-anidada

c. PCR multiplex

d. secuenciación

Su respuesta es correcta.

Pregunta 24
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

es una técnica basada en la amplificación

de secuencias multiples.

a. southern blot

b. northern blot

c. secuenciación

d. PCR

e. c y d son verdaderas

f. ninguna es verdadera

Su respuesta es correcta.

Pregunta 25
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

la ténica utilizada para encontrar

mutaciones puntuales (base única)
desconocidas es:

a. PCR-RFLP

b. pcr en tiempo real

c. secuenciación

d. southern blot

Su respuesta es correcta.

Pregunta 26
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

es la técnica de PCR en la que se puede

cuantificar la expresión de un gen:

a. PCR en tiempo real

b. PCR anidada

c. PCR multiplex

d. PCR semianidada

Su respuesta es correcta.

Pregunta 27
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

la aparición de varias bandas utilizando

una sonda 100 % homóloga en un
southern blot.

a. varios genes identicos

detectados

b. temperaturas de hibridación muy

bajas

c. lavados ligeros para remover

sonda

d. a y c son verdaderas

e. b y c son verdaderas

Su respuesta es correcta.

Pregunta 28
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

son las enzimas de resticción mas

usadas en biología molecular

a. Enzimas tipo I

b. Enzimas tipo II

c. Enzimas tipo III

d. Enzimas tipo IV

Su respuesta es correcta.

Pregunta 29
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

la generación de colonias azules durante

la selección recombinantes es suficiente
para interpretar que la bacteria ha sido
transformada con un plamido al que se le
 ha incorporado exitosamente un inserto:

Elija una;
Verdadero

Falso

Pregunta 30
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

un fragmento de ADN migrara más en un

campo eléctrico

a. si tiene una gran cantidad de

enlaces A-T

b. si tiene una gran cantidad de

enlaces G-C

c. si el número de bases es bajo

d. a y c son verdaderas

Su respuesta es correcta.

Pregunta 31
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

son vectores de clonación

a. plasmidos

b. fagos

c. carontes

d. fásmidos

e. todas son correctas

f. ninguna es correcta

Su respuesta es correcta.

Pregunta 32
Completada

Puntúa 1.0 sobre 1.0

Señalar con bandera la pregunta

Un fragmento de ADN cortado con una

enzima se separa en agarosa por:

a. su carga eléctrica la cual es

mayor mientras grande sea el
fragmento

b. por su conformación (estructura

secundaria)

c. por su tamaño

d. todas las anteriores

Su respuesta es correcta.

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