MÉTODOS INSTRUMENTALES DE

ANÁLISIS

MANUAL DE LABORATORIO PRÁCTICO

DEPARTAMENTO DE FARMACÉUTICA
QUÍMICA
COLEGIO DE FARMACIA [Link]
RAJA NAGER, VADAKANGULAM-627116

1
 COLEGIO DE FARMACIA [Link]
RAJA NAGER, VADAKANGULAM-627116

CERTIFICADO DE LABORATORIO

Por la presente se certifica que la Sra./ Sr. ……………………………………………………………… ha tenido un desempeño satisfactorio.

completó el curso de experimentos en ……………………........................ práctica, prescrito por el

Consejo de Farmacia de India RGUHS para el ………………….. curso en el laboratorio de esta facultad en el
año

Fecha: Firma del Profesor a Cargo

Jefe del Departamento

Name:……………………………………………………………………………………….

Núm. de registro …………………………………………………………………………………….

Centro de examen …………………………………………………………………………

Fecha del Examen Práctico………………………………………………………......

2
 PARTICULARES DE LOS EXPERIMENTOS REALIZADOS

[Link] DATE NOMBRE DE LOS EXPERIMENTOS Nº

1. Introducción a la espectroscopía U.v.

2. Para llevar a cabo la estimación de ibuprofeno en la muestra dada por UV

espectroscopia.

3. A la estimación de paracetamol por el método U.V.

4. Estimar la cantidad de diclofenaco presente en la muestra dada.

5. Para estimar la cantidad de ampicilina presente en el dado

muestra.

6. Para llevar a cabo la estimación de la cápsula de amoxicilina dada por

espectroscopía de doble haz.

7. Estimación simultánea de aspirina y cafeína a partir de un dado

muestra de formulación de combinación.

8. Estimación simultánea de paracetamol y nimesulida por

Método de espectroscopia UV-Visible.

9. Estimación simultánea de paracetamol y diclofenaco en un

formulación de combinación utilizando espectroscopia UV-visible.

10. Para llevar a cabo la estimación simultánea de paracetamol y

ibuprofeno

11. Introducción a la cromatografía.

12. Para separar e identificar los aminoácidos por papel

cromatografía (tipo ascendente).

13. Para identificar la mezcla dada de aminoácidos por medio de un círculo [o] radial
cromatografía.

14. Para llevar a cabo la separación e identificación de aminoácidos por

cromatografía en capa delgada

3
15. Para llevar a cabo la separación e identificación de
una mezcla dada de los aminoácidos mediante cromatografía en columna.

16. Introducción a la H.P.L.C.

17. Para determinar el tiempo de retención (tr)

y AUC para una muestra dada
de diclofenaco sódico por método HPLC (análisis cualitativo).

18. Estimación de diclofenaco sódico de la muestra dada por HPLC

método (análisis cuantitativo).

4
 Date:

Introducción a la Espectroscopía UV-Visible

La absorción de radiación UV que varía de 200 a 400 nm.

La absorción de radiación visible que abarca de 400 a 800 nm.

Tanto en UV como en visible, los electrones de valencia absorben la energía, de este modo la

la molécula pasa de un estado fundamental a un estado excitado.

Instrumentos que miden la relación de la intensidad de dos haces de

La luz en la región UV-visible se llama ultravioleta visible
espectrofotómetros.

La espectroscopia es una rama de la ciencia que se ocupa del estudio de la interacción

de la radiación electromagnética con la materia.

La energía de un REM se puede expresar mediante la siguiente ecuación.

E = hν
Donde, E = energía de la radiación

h = constante de Planck (6.624 × 10-34)

ν= frequency
E = hν = h.c/λ
= h.c.λ-1
Mientras, frecuencia ν = c/λ

5
 Donde, c = Velocidad de la luz en el vacío

λ= Wave length
Cuando la EMR viaja, un medio que contiene átomos, moléculas o iones
donde hay absorción de energía, intensidad de la luz emergente (intensidad)
de la luz incidente.

DISCUSIÓN:-
La espectroscopía es una de las estructuras atómicas y moleculares más importantes.

y se utiliza en el análisis de una amplia variedad de muestras. El estudio de

la espectroscopía se puede llevar a cabo bajo los siguientes encabezados.

ESPECTROSCOPÍA ATÓMICA:-

Esto se ocupa de la interacción de la EMR con átomos que son más

comúnmente en su estado de energía más bajo llamado el estado fundamental.

ESPECTROSCOPÍA MOLECULAR:
Esto trata sobre la interacción de la RME con la molécula. Esto resulta
en transición entre el nivel de energía racional y el nivel de energía de vibración en edición de
transición electrónica. Los espectros moleculares se extienden desde el visible hasta
infrarrojo en la región de microondas.

ESPECTROS DE RACION (MICROONDAS):

Este espectro se eleva debido a la transición entre el
energía rotacional de moléculas gaseosas tras la absorción de radiación
siguiente en la región de microondas. Estos espectros son mostrados por molécula
que poseen un momento dipolar por ejemplo - HCl, CO, H2O, vapores, NO, etc.
6
ESPECTROS VIBRACIONALES-ROTACIONALES:-

Estos espectros surgen debido a la transición incluida entre vibraciones

nivel de energía de la molécula de la absorción en la radiación que pertenece a
IR. Los espectros de IR se muestran por la molécula cuando el movimiento vibracional es

acompañado por un cambio en el movimiento dipolar de las moléculas.

ESPECTROS MAGNÉTICOS NUCLEARES:-

Surge debido a la transición incluida entre el spin de la molécula

nivel de energía de una molécula en un campo magnético aplicado.

ESPECTROS ELECTRÓNICOS:-

Surge debido a la transición electrónica en una molécula por absorción

radiación en las regiones visible y UV.
ELECTRONIC SPIN RESONANCE:-
Los resultados de ESR provienen de las transiciones inducidas entre la energía del spin del electrón.

de moléculas en un campo magnético aplicado.

LEY DE FOTOMETRÍA:-
1) LA LEY DE BEER:-

Se establece que cuando la luz monocromática pasa a través de un

medio transparente que contiene la muestra. La tasa de disminución de la
la intensidad es directamente proporcional al aumento de la concentración
de especies de absorbancia.

Yotyo010-kc…………(1)
Dónde, yot intensidad por luz viajada

Yo0intensidad de la luz incidente

7
 k = constante
C = concentración de medio.

Se indica que cuando la luz monocromática pasa a través de

medio transparente, la disminución de la intensidad del medio transmitido
La radiación es directamente proporcional al aumento del grosor del medio.
YotYo010-kt…………..(2)
Combinando (1) y (2)
Yot Soy yo0.10-kct
YotSoy yo0.10-actuar
La ecuación anterior se llama la ley de Beer-Lambert y puede ser
escrito de la siguiente manera.

registro I0/It acta

A = act
Dónde,
A = Absorbance
a = absorción molecular
t = grosor o longitud del camino del medio

c = concnde mediana

8
Experimento No:1 Date:
ESTIMACIÓN DE IBUPROFENO
OBJETIVO:- Realizar la estimación de ibuprofeno en la muestra dada por
Espectroscopía UV.
REQUISITOS:-Vaso de precipitados, matraz volumétrico, cilindro graduado,
pipeta (10ml, 1ml)
PRINCIPIO DE ESPECTROSCOPIA UV:
El tipo de electrones presentes en cualquier molécula puede ser
clasificado cómodamente como
σelectrón: presente en compuestos saturados, tales electrones no
absorber UV cercano, pero absorber radiación UV al vacío.

πelectrón: presente en compuestos insaturados ejemplo: doble

enlace o triple enlace.

un electrón: estos son electrones no enlazados que no están involucrados

en cualquier ejemplo de enlace: par solitario de electrones

Cualquier molécula tiene ya sea electrones n, electrones π o σ

electrón o combinación de estos electrones. Estos enlaces y
los electrones no enlazantes absorben la radiación UV característica y
sufre una transición del estado fundamental al estado excitado por el
picos de absorción característicos, la naturaleza del electrón presente
y por lo tanto se puede elucidar la estructura molecular.

9
1. LA LEY DE LAMBERT:

Esta ley se puede enunciar de la siguiente manera cuando un rayo de luz como
permitido pasar a través de un medio transparente, la tasa de disminución de
La intensidad con el grosor del medio es directamente proporcional a la intensidad
de luz.
Matemáticamente, la ley de Lambert se puede expresar de la siguiente manera.

-dI/dt = KI……(1)
Donde, I = intensidad de la luz incidente de longitud de onda (λ)

t = thickness of medium
k = Constante de proporcionalidad

Integrando la ecuación y poniendo I = I0& t=0

En mí0/It=kt

Yo=Yo0.e-kt
ItYo010-kt(cambiando la ecuación a logaritmo natural)
Donde, k = 1/ 2.303
2. LEY DE BEER:-
La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente.
con aumento en la concentración al absorber sustancia aritméticamente.
YotYo0e-k’c
YotYo0e-kc
Combinando la ecuación,

YotYo0.10-actuar
10
 registro It/Yo0= actuar…….(3)

Se llama la ley de Beer-Lambert.

Estructura del Ibuprofeno:

PROCEDIMIENTO:-
Preparación de solución estándar:-
Pese con precisión 100 mg de polvo de ibuprofeno, añada 0.1 NaOH a
disolver y completar el volumen hasta 100 ml y hacer diferente
concentración 5,10,15,20,25,30μg/ml.
Preparación de la solución de muestra:-

Pese con precisión 10 mg de polvo de medicamento y dilúyalo a 100 ml.

da una concentración de 100μg/ml. Toma 1.5 ml de la solución anterior y diluye a
10 ml with 0.1N NaOH to give concentration of 15μg/ml.
Encuentra λmáxpara el valor de absorbancia estándar y de llevar para cada muestra.

REPORT:-
El λmáxel valor para el ibuprofeno se encontró en ………….nm.
La concentración desconocida se encontró que era……………
μg/ml. La concentración de ibuprofeno en la tableta se encontró que era ………

11
Experimenta No:2 Date:
ESTIMACIÓN DEL PARACETAMOL
Aim:To Estimation Of Paracetamol by U.V. Method

Referencias: I.P. 1996. vol-I, Espectroscopía Orgánica, 3rdedición por

William Kemp.

Aparatos: Matraz volumétrico, pipeta, vaso de precipitados, cilindro de medición.

Chemicals:Paracetamol (drug), 0.1 N HCl.

Estructura del paracetamol:

Pharmaceutical uses of paracetamol:

analgésico para dolor de cabeza, dolor musculoesquelético, etc.

Procedimiento:

1) Preparation of stock solution: Dissolve 100 mg of Paracetamol

(droga) en suficiente HCl 0.1 N para producir 100 ml. A partir del stock anterior

se toma 1 ml de solución y se diluye nuevamente a 25 ml–40 g/ml que es

la solución final de stock. Tomar 1 ml, 2 ml, 3, 4, 5 ml y completar hasta 10 ml.

Para obtener 4, 8, 12, 16, 20 g/ml. Respectivamente

12
 2) Preparación de la solución de muestra: Disolver la muestra dada en
100ml 0.1N HCl. Toma 1ml de esta solución y completa el volumen hasta
25 ml con 0.1N HCl y estimar la cantidad de paracetamol en el
muestra dada a una longitud de onda de 244 nm.

Informe: La cantidad de paracetamol en la muestra dada se encontró que

ser……...

13
Experimento No:3 Date:
ESTIMACIÓN DE CAFETINA
OBJETIVO: Realizar la estimación de cafeína de una muestra dada por
Espectroscopía U.V.
REQUIREMENT:- Pipette, beaker, volumetric flask, digital balance,
spatula , funnel.
REAGENT:- 7% of ammonia solution, Distilled water.
STRUCTURE OF CAFFEINE:-

USOS FARMACÉUTICOS DE LA CAFINA:

Asma bronquial y EPOC
PROCEDIMIENTO:-
ESTIMACIÓN DE CAFFEÍNA:-

Solución estándar: - Hacer diferentes concentraciones de 4, 8, 12, 16, 20

µg/ml y medir la absorbancia en λmáx272 nm. Dibuja un estándar
gráfica de absorbancia frente a concentración.

• Preparación de la muestra: Pesar con precisión un polvo equivalente a 30 mg de

cafeína en 2 ml de agua destilada. Diluir 0.5 ml de lo adecuado a
producir concentración final (µg/ml) de citrato de cafeína. Medir
absorbancia a 272 nm tomando agua como blanco.

14
 • INFORME:- La cantidad de citrato de cafeína en la muestra dada fue
se encontró que……...

Experimento No:4 Date:

ESTIMACIÓN DE DICLOFENACO SÓDICO
OBJETIVO:- Estimar la cantidad de diclofenaco presente en la muestra dada.

REQUIREMENT:-Beaker, volumetric flask, stirrer, digital balance,

embudo, NaOH, diclofenaco sódico estándar.
ESTRUCTURA DEL DICLOFENACO :-

USOS FARMACÉUTICOS DICLOFENAC SÓDICO:-

Analgésicos a corto plazo y actividad antiinflamatoria a largo plazo

PROCEDIMIENTO:-
Preparación de la solución estándar:-

Pese con precisión 100 mg de diclofenaco sódico, disuelva y haga

aumentar el volumen a 100 ml con NaOH 0.1 N, hacer diferentes concentraciones
4, 8, 12, 16, 20μg/ml. Trace el gráfico estándar.
Solución de muestra :-

15
 Pese con precisión la muestra dada y diluya con 0.1N NaOH y
preparar una concentración de 8μg/ml.

REPORT:-
Se encontró que la cantidad de diclofenaco sódico en la muestra era
ser___________mg.

16
Experimento No:5 Date:
ESTIMACIÓN DE AMPICILINA
OBJETIVO:- Estimar la cantidad de ampicilina presente en la muestra dada.
REQUIREMENT:-Beaker, volumetric flask, stirrer, digital balance,
embudo, soluciones de Fehling A y B, ampicilina estándar.

ESTRUCTURA DE LA AMPICILINA:-

USOS FARMACÉUTICOS DE AMPICILINA:

infección del tracto urinario, infección del tracto respiratorio, meningitis
gonorrea
PROCEDIMIENTO:-
Preparación de la solución estándar:
Pese 50 mg de ampicilina, disuélvala en agua y complete
volume 50 ml & make up different concentration 10, 20,30, 40, 50ml.
A 2 ml de solución estándar, agregue de 3 a 5 ml de agua, luego agregue 0.5 ml de
solución de Fehling (A y B). Después de 1 minuto, mide la absorbancia en
espectroscopia visible.
Preparación de la solución de muestra:-

Pese con precisión 50 mg de ampicilina en polvo y 40 ml de agua.

Agitar y hacer el volumen a 50 ml, para producir 1μg/ml.
17
Solución de Fehling:
Prepare mezclando 2 ml de la solución A y B de Fehling, pesados.
diluyendo a 50 ml con agua.
INFORME:-
La muestra dada se encontró ____________.

18
Experimento n.º 6 Date:
ESTIMACIÓN DE AMOXICILINA
OBJETIVO:- Realizar la estimación de la cápsula de amoxicilina dada por
espectroscopía de doble rayo

REQUIREMENT:-
Reactivos-PDAB (P-dimetilamino-bencilo, agua destilada)
Aparato: pipeta, vaso de precipitados, matraz volumétrico, cilindro graduado.

ESTRUCTURA DE LA AMOXICILINA:-

USOS FARMACÉUTICOS DE LA AMOXICILINA:-

infección del tracto urinario, infección del tracto respiratorio, meningitis
gonorrea
PROCEDIMIENTO:-
Pese con precisión 400 g de PDBA, agregue 10 ml de alcohol etílico y
2 ml de H concentrado2SO4& diluir a 50 ml con agua.

Solución estándar–
1 mg/ml de amoxicilina en agua.
Solución de muestra–

Pesar con precisión 25 mg de amoxicilina y 15 ml de

agua y calor en baño maría para disolver y ajustar a 25 ml con agua.
19
 A 2 ml de la muestra y estándar, añadir 4 ml de reactivo PDBA y
calor en baño de agua a 60 °Cْ durante 1 hora, enfriar a temperatura ambiente y ajustar
llevar el volumen a 10 ml con agua. Medir la absorbancia de ambas muestras
& estándares a 410 nm. El método obedece a la ley de Beer-Lambert en
reacción de concentración de 10-600μg/ml.

INFORME:-La muestra dada se encontró en__________μg/ml.

la concentración de amoxicilina en la tableta se encontró que era ___________
μg/ml &_____________%.

20
 ANÁLISIS CUANTITATIVO
1. Método de curva de calibración: En un método estándar único, cuando hay un error
se introduce en la preparación de la solución o medición de la absorbancia,
el error en el resultado sería mayor, eliminar o minimizar este error,
podemos usar el método de curva de calibración. En el método de curva de calibración, un
la curva de calibración se traza utilizando la concentración frente al valor de absorbancia de 5
o soluciones más estándar. Se traza una línea recta ya sea a través de
número máximo de puntos o de tal manera que haya una magnitud igual de
errores positivos y negativos. A partir de la absorbancia de la solución de muestra
y usando la curva de calibración, la concentración del fármaco, cantidad
y se puede calcular el porcentaje de pureza.
2. método de comparación estándar única o directa: En este método, el
absorbancia de una solución estándar de concentración conocida y una muestra
solution is measured. The concentration of unknown can be calculated
usando la fórmula.
A1= €c1t

A2= €c2t

Dónde,
A1, A2–Absorbancia de estándar y muestra
c1,c2–Concentración de estándar y muestra

€ - Coeficiente de extinción molecular

t–Longitud del camino (1 cm)

Al dividir, obtenemos
A1/A2= €c1t /€c2t
21
 A1/A2=c1/c2

c2=c1A2/A1
Dado que c1, A1 y A2 son conocidos, c2 se puede calcular.

3. Usando E1%Valores de 1 cm: Este método se puede usar para la estimación de

formulación o materia prima, cuando la norma de referencia está disponible. E1%
1 cm significa la absorbancia de una solución al 1% w/v, utilizando una longitud de camino de 1

cm. E1%1cmat una longitud de onda es un valor constante para cada medicamento y puede ser
visto en farmacopeas y libros estándar sobre el tema.
Espectrofotometría simultánea
DETERMINACIÓN
cuando no se puede encontrar ninguna región libre de espectros superpuestos de dos
cromóforos (grupos que producen color en un compuesto), todavía es
posible idear un método basado en la medición en dos o más
longitudes de onda. Dos cromóforos disímiles tienen diferentes poderes de
absorción de radiación en algunos o varios puntos de su absorción
espectros. Si, por lo tanto, se realizan mediciones en una solución desconocida
en dos longitudes de onda donde las absorbancias de los dos componentes
son diferentes, es posible establecer dos ecuaciones independientes y
resuélvelos simultáneamente para las dos concentraciones desconocidas.
Primero, es necesario seleccionar dos puntos en la escala de longitud de onda.
donde la proporción de las absorbancias molares es máxima. A continuación, es
necesario calcular la absorción molar para cada componente en
cada longitud de onda seleccionada. Así, se pueden formar dos ecuaciones simultáneas.
escrito: C1(Є1) 1+ C2(Є2) 1= A 1

C1(Є1) 2+ C2(Є2) 2= A 2

Las ecuaciones se resuelven para la concentración de cada componente

22
Experimento No:7 Date:
ESTIMACIÓN SIMULTÁNEA DE ASPIRINA Y CAFÉ
OBJETIVO:- Estimación simultánea de aspirina y cafeína a partir de un dado
muestra de formulación de combinación.

REQUIREMENT:- Pipette, beaker, volumetric flask, digital balance,

spatula , funnel.
REAGENT:- 7% of ammonia solution, Distilled water.
Estructura del ácido acetilsalicílico y la cafeína:

PROCEDIMIENTO:-
ESTIMACIÓN DE CAFETINA:-

• Solución estándar: - Hacer diferentes concentraciones de 4, 8, 12, 16, 20

µg/ml y medir la absorbancia a λmáx272 nm. Dibuja un estándar
gráfica de absorbancia vs concentración.

• Preparación de Muestras:- Pesar el polvo con precisión equivalente a 30 mg de

cafeína en 2 ml de agua destilada agitando suavemente y filtrar
a través de un embudo de vidrio sinterizado. Retenga el residuo para estimación
de aspirina. Diluya 0.5 ml del filtrado adecuado para producir el final
concentración (µg/ml) de citrato de cafeína. Medir la absorbancia a
272 nm tomando agua como blanco.

23
 ESTIMACIÓN DE LA ASPIRINA :-

• Solución estándar: Pesar con precisión 100 mg de aspirina, disolver

y diluir a 100 ml con una solución de amoníaco al 7%, hacer adecuadamente
dilución para producir soluciones de concentración de 4, 8, 12, 16, 20 µg/ml
mide la absorbancia de cada solución y traza un gráfico estándar.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:-Disolver toda la sustancia insoluble

residuo obtenido arriba en 6 ml de solución de amoníaco al 7% para producir
concentración de aproximadamente 10 µg/ml. Medir la absorbancia a 240 nm
utilizando una solución de amoníaco al 7% como blanco.

REPORT:-
La muestra dada contiene __________ de Aspirina
y______________ de cafeína.

24
Experimento No:8 Date:
ESTIMACIÓN SIMULTÁNEA DE PARACETAMOL Y
NIMESULIDA
OBJETIVO: -Estimación simultánea de paracetamol y nimesulida por UV-
Método de espectroscopía visible.

REQUIREMENT:-Beaker, volumetric flask, pipette, digital balance,

espátula.
REAGENTS:-0.1N HCl,
0.1N NaOH
Agua destilada.
ESTRUCTURA DEL PARACETAMOL Y NIMESULIDA:

PROCEDIMIENTO:-
Preparación de la solución estándar de PCM y Nimesulide:
Pese con precisión la cantidad de PCM y nimesulida y dilúyalo con
0.1 N HCl y 0.1 N NaOH respectivamente, para obtener una solución final de
4,8,12,16,20 µg/ml. Mida la absorbancia para cada uno y trace un estándar.
gráfico de absorbancia vs concentración.

25
 Preparación de la solución de muestra:-

Tome una cantidad de polvo de tableta pesadamente igual a 100 mg

PCM, disolver en NaOH 0.1 N en un matraz volumétrico de 10 ml, completar hasta el
volumen a 100 ml, filtrarlo. El filtrado se disolvió en HCl 0.1 N y
Haga el volumen hasta 100 ml. Analice ambos fármacos por UV.
espectroscopía.
INFORME:-La muestra dada de tabletas contiene __________ de
PARACETAMOL y ___________ de NIMESULIDA de valor etiquetado.

26
Experimento No:9 Date:
ESTIMACIÓN SIMULTÁNEA DE DICLOFENACO Y
PARACETAMOL
OBJETIVO:-Estimación simultánea de paracetamol y diclofenaco en un
formulación de combinación utilizando espectroscopia UV-visible.

ESTRUCTURA DEL DICLOFENACO Y PARACETAMOL:

PROCEDIMIENTO:-
ESTIMACIÓN DEL PARACETAMOL:-

• Solución estándar: -10 µg/ml de PCM en 0.1 N HCl

• Mida con precisión una muestra de polvo equivalente a aproximadamente

100 mg de PCM. Realice la extracción del fármaco con dos veces 25 ml.
porción de 0.1 N HCl. Filtrar a través de C4embudo de vidrio sinterizado.
Combina el filtrado a 100 ml con ácido para obtener la concentración final
of above 10 µg/ml, dilute the filtrate further approximately.
Mida la extracción tanto de la muestra como de la solución estándar
en λmáxdurante aproximadamente 244 nm.
ESTIMACIÓN DE DICLOFENACO SÓDICO:-

• Solución estándar: -100 µg/ml

27
• Muestra de solución: - Todo el residuo dejado después de la extracción de
el paracetamol como se describió anteriormente se utiliza para la estimación de
diclofenaco. Transfiera el residuo que queda en el matraz cónico y en la parte superior de
embudo sinterizado cuantitativamente a un matraz volumétrico de 100 ml con el
ayuda de 0.1 N NaOH. Completar el volumen y llevar a cabo más
dilución aproximada con NaOH para obtener una concentración final de 100
µg/ml.
Mida la absorbancia de estándar y muestra a aproximadamente 276 nm
usando NaOH 0.1 N como blanco.
INFORME:-
La muestra de tableta contiene ___________ de paracetamol
y ___________ de diclofenaco sódico.

28
Experimento No:10 Fecha:
ESTIMACIÓN SIMULTÁNEA DE PARACETAMOL Y
IBUPROFENO
OBJETIVO:- Realizar la estimación simultánea de paracetamol y
ibuprofeno
STRUCTURE OF PARACETAMOL AND IBUPROFEN:

PROCEDURE:-
ESTIMACIÓN DEL PARACETAMOL:-

• Solución estándar: -10 µg/ml de PCM en 0.1 N HCl.

• Muestre solución: - Pese con precisión la cantidad exacta de la muestra eq.

a 100 mg de paracetamol. Extraiga el fármaco y filtre a través de C4
embudo de vidrio sinterizado. Mide la extinción de ambas soluciones en
λmáxde aproximadamente 244 nm utilizando HCl como blanco.
ESTIMACIÓN DE IBUPROFENO:

• Solución estándar: -250 µg/ml de ibuprofeno en metanol.

• Solución de muestra: - Disolver todo el residuo obtenido en el

estimación de PCM en metanol para hacer 10 ml. Dilucciones adicionales son
hecho aproximadamente y paso a paso con metanol para obtener el final
concentración de 250 µg/ml. Medida de ambas muestras y estándar
solución a un máximo de aproximadamente 267 nm utilizando metanol como banco.

29
INFORME:-
La muestra dada contiene ________mg de paracetamol y
_______mg de ibuprofeno.

30
 CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un poderoso método de separación que encuentra aplicación
en todas las ramas de la ciencia, la cromatografía fue inventada y nombrada por

the Russian botanist Mikhail Tswett at the beginning of the twentieth

siglo .

Utilizó la técnica para separar varios pigmentos vegetales.

como la clorofila y los xantófilos.

El nombre cromatografía (griego chroma–color y graphy

la escritura ) significa escritura de color.

Se utiliza para resolver una mezcla multicomponente de trazas, menor o

constituyentes principales en sus fracciones individuales. Identificación final
requiere confirmación por algunos otros procedimientos analíticos, tales como
espectroscopía infrarroja, RMN o espectrometría de masas análisis cualitativo
se puede llevar a cabo midiendo el área del pico cromatográfico.
Por lo tanto, la cromatografía se puede utilizar para el análisis cualitativo.

Definición: la cromatografía puede considerarse como una técnica analítica

técnica empleada para la purificación y separación de orgánicos y

sustratos inorgánicos. La cromatografía se basa principalmente en el principio
que todas las sustancias tienen una tendencia a adherirse a los sustratos con
fuerzas definidas que son una combinación de adsorción, partición e iones
intercambio.

31
Clasificación en cromatografía:

Basado en la naturaleza de la fase fija y en movimiento, diferentes tipos de

la cromatografía es la siguiente

Cromatografía de adsorción
2. Cromatografía de partición
3. Cromatografía de gases
4. Cromatografía de intercambio iónico

5. Cromatografía de exclusión
1. Cromatografía de adsorción;

Es una técnica en la que la fase estacionaria es sólida (por ejemplo

alúmina o sílice) y la fase móvil es un gas o un líquido.
La separación ocurre cuando un componente de un sistema de dos componentes

la mezcla se adsorbe más fuertemente que la otra por la fase estacionaria sólida,
los componentes adsorbidos se eluyen luego al pasar disolventes adecuados
a través de la columna. Los adsorbentes comúnmente utilizados para la columna

la cromatografía de adsorción son sacarosa, celulosa, almidón, calcio

["carbonato","sulfato de calcio","gel de sílice","carbonato de magnesio","carbón vegetal"]

etc.

2. Cromatografía en partición:

En esta técnica, la fase estacionaria es un líquido, frecuentemente

agua retenida en un sólido poroso inerte adecuado como la celulosa. El móvil
32
la fase puede ser una mezcla de gas o líquido. En este caso, el soluto se distribuye
entre el líquido fijo y el líquido en movimiento (solvente).

La cromatografía en papel es un tipo especial de cromatografía de partición.

en la que la columna adsorbente es una tira de papel.

Los sistemas de disolventes comúnmente utilizados son

Fase estacionaria: Agua

Agua + ácido

Agua + álcali

Agua + amortiguador

Alcoholes

Formamida

Glicoles.

Fase móvil:

Alcoholes (n-butanol)

Isobutanol

Hidrocarburos (benceno, tolueno, hexano)

Cloroformo

33
 Acetato de etilo

3. Cromatografía de gases (Gc)

Cuando la fase móvil es una mezcla de gases, se llama gas

cromatografía o cromatografía en fase de vapor

Los gases portadores que se utilizan generalmente son helio y nitrógeno.

Cromatografía de gases y líquidos

La fase móvil es un gas y la fase estacionaria es una capa delgada de

líquido no volátil unido a un soporte sólido

Cromatografía gas-sólido

Esto utiliza el adsorbente sólido como fase estacionaria y

se lleva a cabo el proceso de adsorción.

Ventajas de la GC:

La técnica tiene un gran poder de separación e incluso compleja

las mezclas pueden resolverse en sus constituyentes.

La sensibilidad del método es bastante alta, es un método micro.

y solo unos pocos miligramos de la muestra son suficientes para el análisis.

4. Cromatografía de intercambio iónico

34
 El intercambio iónico es un proceso en el que se produce un intercambio de iones similares.

los signos tienen lugar entre una solución y un sólido esencialmente insoluble (ion
intercambiador) en contacto con la solución. En el intercambio iónico

la cromatografía permite un intercambio reversible de iones entre iones

en una fase líquida (fase móvil) de sustancias sólidas e insolubles
que contiene sitios iónicos (resina de intercambio iónico). La resina de intercambio iónico consiste en

de perlas de material orgánico entrelazado de alta polimerización que contiene

gran número de grupos ácidos o básicos.

5. Cromatografía de exclusión :

Es un proceso de cromatografía en el que se separa la muestra

el componente tiene lugar según el tamaño molecular. Los dos tipos de
las técnicas de cromatografía de exclusión son

• Permeación de gel

• Separación por tamizado

Los otros tipos de cromatógrafo incluyen

• Cromatografía en capa delgada

• Cromatografía líquida de alta presión (o de rendimiento)

• Cromatografía en capa delgada a alta presión (HPTLC)

• Cromatografía contracorriente

35
Teorías de la cromatografía;

➢ Teoría de placas

➢ Teoría de tarifas

Teoría de placas

La teoría de placas fue desarrollada por Martin y Singe, según esto

la teoría de una columna cromatográfica consiste en una serie de discretos pero

capa horizontal continua que se denomina platos teóricos

Una equilibración del soluto entre la fase estacionaria y la fase móvil
ocurre en cada una de estas placas. La migración de solutos ocurre por un
serie de transferencias progresivas entre un plato y el otro. El
la eficiencia de separación en una columna cromatográfica aumenta a medida que
el número de platos teóricos aumenta.

El número de platos teóricos se da por N = L / H

Donde L = longitud de la columna

H = altura equivalente a la placa teórica

Teoría de tasas

La teoría de tasas puede explicar el efecto de variables como

la velocidad de la fase móvil y las adsorciones que determinan el ancho de
una banda de elución también se relaciona con el efecto de estas variables en el tiempo

tomado por un soluto para hacer su aparición al final de la columna. Si un

36
la molécula está unida a la fase estacionaria, su migración hacia abajo de la
la columna está temporalmente detenida, pero la zona pasa por eso es una
la molécula la hace inmovilizada temporalmente en la columna mientras el

molécula migrar . Una partícula puede migrar solo si está presente en el

fase móvil y como resultado, la migración por la columna es altamente
irregular, por lo tanto, algunas moléculas de soluto pueden migrar rápidamente, mientras que

otros pueden quedarse atrás, el resultado neto de todos estos individuos aleatorios

el ancho de la zona aumenta a medida que migra hacia abajo

columna porque se necesita más tiempo para que la migración tenga lugar, por lo tanto

el ancho de la zona está directamente relacionado con el tiempo de residencia o retención en el

columna e inversamente proporcional a la velocidad de la fase móvil.

Desarrollo del cromatograma

Se han utilizado tres métodos para desarrollar el cromatograma, son

frontal analysis , elution analysis ,and displacement analysis .

Análisis frontal

Este método fue desarrollado por Tisellius. Consiste en pasar el

solución de muestra continuamente a través de la columna de adsorbente. Esto

hace que los centros activos de la columna adsorbente sean ocupados por el
solutos adsorbidos más fuertemente. Los solutos adsorbidos menos fuertemente son
adsorbido hacia abajo de la columna o recolectado en el frente del disolvente migrante.

el disolvente sale primero por la salida de la columna seguido por el menos

37
soluto adsorbido. Otros solutos emergen uno tras otro dependiendo
según su grado de adsorción

Análisis de elución

Esta técnica se utiliza más ampliamente para desarrollar

cromatogramas. En esta técnica, se utiliza una pequeña cantidad de solución de muestra.

introducido en la parte superior de la columna, el disolvente puro se vierte hacia abajo

la columna, esto da lugar a la migración diferencial de solutos en el

fase móvil, cada soluto emerge de la salida de la columna dependiendo de
su coeficiente de partición. Si el coeficiente de partición para el soluto en el
las muestras son lo suficientemente diferentes como para que las mezclas se separen en

bandas que migran a diferentes tasas.

Análisis de desplazamiento

En este método, una pequeña cantidad de una solución de muestra se toma primero

introducido en la parte superior de la columna. los componentes de la mezcla son

than separated by running a solution of substances which is more
más fuertemente adsorbido que cualquier componente de la mezcla.
la sustancia así corrida se denomina agente desplazante.
Composición de qué papel de filtro Mann:

Celulosa alfa 98.99 %

Celulosa beta 0.3 -1%

38
 Pentósanos - 0.4-0.8%

Materia soluble en éter 0.015-0.02%

Cenizas 0.07-0.01%

Fases móviles para la cromatografía en papel:

Isopropranol - Amoníaco–agua

n-butanol–ácido acético–agua

Agua- fenol.

Formamida–cloroformo

Formamida–cloroformo–benceno

Formamida - benceno–ciclohexano

Localizando o visualizando agentes;

Reagente de ninhidrina - para la detección de aminoácidos, azúcares amino.

Ftalato de anilina - para la detección de azúcares reductores

Cloruro de antimonio (III) en CHCl3 -para esteroides y glucósidos

Reactivo de Dragendroff – alcaloides

Bromocresol púrpura–iones halógenos (excepto flúor) dicarboxílico

ácidos
39
Verde bromocresol–ácidos carboxílicos

40
Experimento No:11 Date:

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

OBJETIVO: Separar e identificar los aminoácidos por papel

cromatografía (tipo ascendente).

REQUISITOS: Papel de filtro Whatmann grado-1, papel

chromatography chamber, capillary tube, test tubes, standard amino
soluciones ácidas, solución de aminoácidos de muestra, reactivo de Ninhidrina.

PRINCIPIO: La cromatografía en papel se basa en el principio de

partición en la que las sustancias se distribuyen entre dos líquidos,
es decir, uno es el líquido estacionario (generalmente agua) que se mantiene en el

fibras del papel y se llama la fase estacionaria, la otra es la

fase móvil o disolvente en desarrollo y llamada la fase móvil
fase móvil. Los componentes de la mezcla que se van a separar migran
a diferentes velocidades y aparecen como manchas en diferentes puntos del papel.

En esta técnica, se aplica una gota de la solución de prueba como una pequeña
mancha en el papel de filtro y la mancha está seca. El papel se mantiene en un
cámara cerrada y el borde del papel de filtro se sumerge en una
disolvente llamado disolvente de revelado. Tan pronto como el líquido atraviesa

su eje capilar y cuando llega al punto de la solución de prueba (un

mezcla de dos o más sustancias), las diversas sustancias se mueven
por sistema de disolvente a varias velocidades. Cuando el disolvente se mueve estos

41
sustancias a una altura adecuada, el papel se seca y los varios
Las manchas se visualizan mediante reactivos adecuados llamados reactivos de visualización.

El movimiento de la sustancia en relación con el solvente se expresa en

términos de Rfvalores que son un parámetro de migración.

DISCUSIÓN: El análisis de sustancias desconocidas por el flujo de

el solvente en un papel de filtro se conoce como cromatografía en papel. Esto

la técnica procede por un mecanismo que es en parte partición (distribución)

y parcialmente adsorción. Los componentes de una mezcla están distribuidos
entre el agua retenida en el papel de filtro y el disolvente orgánico.

TYPES:Ascending chromatography, descending chromatography,

cromatografía ascendente-descendente, cromatografía radial, dos-
cromatografía dimensional.

Parámetros de migración: La posición de los puntos migrados en el

el cromatograma se indica con diferentes términos como Rf, Rx, Rm, y Rc.
Estos parámetros son características cuantitativas y cualitativas de un
substance.R es una función del coeficiente de partición. Es una constante para un
sustancia dada, siempre que se cumplan las condiciones del sistema cromatográfico

se mantienen constantes con respecto a la temperatura, tipo de papel, duración, y

dirección del desarrollo, etc.

RfDistancia recorrida por el soluto desde la línea de origen

Distancia recorrida por el disolvente desde la línea de origen

42
 RxDistancia recorrida por la sustancia desde la línea de origen

Distancia recorrida por la sustancia estándar 'x' desde la línea de origen

Rm=log (1/RF-1)

En algunos casos, el frente del disolvente se escapa del final del papel de filtro, el

el movimiento de una sustancia en tales casos se expresa como Rx.

• Rmse usa cuando Rflos valores de compuestos químicamente relacionados son

muy cerca.
Types:

(1) Cromatografía en partición (papel utilizado).

(2) Cromatografía de adsorción en papel (papel primero impregnado con
un adsorbente, como sílice o alúmina).
PROCEDIMIENTO:

• Toma una hoja de papel Whatmann y dibuja una línea 2-4 cm por encima de
límite inferior.
• Aplique 5 microlitros de soluciones de aminoácidos en un intervalo de 1-
2 cm.
• Seque esto en una corriente de aire caliente.
• Coloca este papel en la cámara de cromatografía en papel, saturada
con sistema de disolventes.

43
 • Permita que el borde del papel toque el disolvente.
• Run the chromatogram until the solvent has reached 3/4eldel
desnudarse durante 1 hora.

• Now take out the paper and dry it in a stream of hot air.
• Visualiza las manchas rociando el reactivo de Ninhidrina sobre el papel y
sécalo.
• Calcula la Rfvalora e informa sobre ello.
APPLICATIONS:

La pureza de la muestra: La pureza de la muestra se lleva a cabo de forma rutinaria

fuera para esta comparación directa de la muestra y la auténtica

la muestra está lista, si la impureza presente se muestra como manchas adicionales

y esto se puede detectar muy fácilmente.

(2) Examen de la reacción: Para evaluar si la reacción es
completa o de otro modo, este método también se utiliza en la comprobación

otros procesos de separación y procesos de purificación como

destilación, destilación molecular.
(3) En cromatografía, se utiliza para la identificación de compuestos naturales

productos como aceite volátil, aceite fijo, ceras, terpenos, alcaloides,

glicósidos, esteroides, etc.
(4) Análisis bioquímico: Separación de metabolitos bioquímicos
constituentes de sus fluidos corporales, suero de plasma sanguíneo, orina

etc.,

44
 (5) Para la detección de impurezas en un medicamento de farmacopea
análisis.
(6)Varios medicamentos como hipnóticos, sedantes, anticonvulsivos,
se han probado tranquilizantes, anestésicos locales, medicamentos esteroides

cualitativamente.
(7) Importante en la separación y formulación de multicomponentes.
INFORME: La Rfel valor de sampleA se encontró que es …….. y ……..
Por lo tanto, la muestra contiene

45
Experimento No:12 Date:

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL CIRCULAR

Objetivo: Identificar la concentración de la mezcla dada de aminoácidos

por cromatografía circular [o] radial.

Referencia: 1) Método instrumental de análisis químico por G. Chatwal

y P Anand 5thPágina de edición -585-590

2) Química analítica por B. K. Sharma página -85-95.

Requerimiento: n-butanol : Ácido acético glacial : Agua, 4 : 1 : 5

0.2 % p/v de ninhidrina en acetona y solución estándar de aminoácidos.

Aparato: embudo de separación, placa de Petri, rociador y tubo capilar.

papel de filtro Whatman.

Principle:In this technique a circular piece of paper having a wick cut

paralelo al radio desde el borde hasta el centro se utiliza el centro está depositado

en el papel en el extremo superior de la mecha y fluye a través del papel es

colocado en el borde de un plato circular como resultado el líquido asciende por la mecha

y fluye a través del papel, el flujo de la fase móvil es hacia afuera desde un
parte central en el lugar

El proceso que permite que el disolvente se mueva a lo largo del papel de filtro se llama

el desarrollo de la separación de componentes después del desarrollo es

46
llamada resolución. La cantidad aplicada como un punto sobre el papel se llama
cargando

Para el cromatógrafo de papel circular

1. Choice Of Paper:

El papel tiene muchos grados de grosor y porosidad en hojas. Apto

el papel para un particular solo puede ser determinado por una prueba y error pero
Whatmann No: 1 es de gran importancia y amplia aplicabilidad para
tasa de flujo media

2. Control de temperatura: La temperatura debe mantenerse al mínimo

ya sea aislando individualmente con espuma de plástico [o] por
armario controlado termostáticamente

3. Aplicación de muestras: La muestra se puede aplicar mediante un tubo capilar,

lazo de platino o cuantitativamente por una micropipeta, capilar graduado o

micro jeringa. Varias ampollas se pueden observar a la vez por varios
dispositivo automático y semiautomático es preferible aplicar el deporte en
un pequeño volumen la posición del compuesto se puede expresar por su
retardation factor [Rf]

47
[Rf] = Distancia recorrida por el componente desde la línea original
-------------------------------------------------------------
Distancia recorrida por el disolvente desde la línea de origen

El valor RF depende de varios factores: son

La naturaleza del disolvente.

2. El medio utilizado calidad del papel.
3. The nature of mixture to be separated.
4. La temperatura.
5. El tamaño del contenedor en el que se realiza el experimento.
Procedimiento:

1. Prepare solution of 0.1mg / 100ml each of glycine, Leucine, alanine

y mezcla de glicina, leucina, alanina.

2. El aparato fue diseñado con una placa de Petri equilibrada y un disco de filtrado.

3. La mecha estaba hecha de un papel filtrante enrollado en un cilindro de 2-3 mm

grueso en el extremo en forma de cepillo e insertado a través de una pequeña nota
en el centro del papel.

48
4. La muestra a analizar se colocó en papel y se dejó secar al aire
el disolvente de desarrollo se preparó con n-butanol : GL ácido acético : agua
[4 : 1 : 5]

5. Se colocó entre dos platos de vidrio el inferior conteniendo disolvente el

solvente que ya está saturado durante 1 hora.

6. El disolvente asciende por capilaridad y corre el cromatograma completo

desarrollo y quita el papel y la marca del disolvente frente al aire seco
papel y rociar el reactivo de ninhidrina así mancha púrpura identificar el
el aminoácido determina el [Rf] value.

Resultado: El valor de Rf de los aminoácidos se encontró que es

Glicina

Leucina

Alanina

Desconocido ---------

Conclusión: El valor Rf desconocido 1 y 2 coincide con la glicina y

fenilanina así que la mezcla dada contiene glicina y
fenilalanina.

49
Experiment No:13 Date:

CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

OBJETIVO: Realizar la separación e identificación de aminoácidos por

cromatografía en capa delgada.

DISCUSIÓN: La cromatografía en capa delgada generalmente emplea capas sólidas

que se adhieren a la placa de vidrio, generalmente en virtud de un agente de unión

como el calcio, el sulfato que se incorpora con esto y particular

la ventaja es que el reactivo corrosivo que ataca el papel puede ser utilizado para

la pulverización. La capa delgada preparada en vidrio a menudo se llama cromatos

plato.

Las placas de cromatos se preparan aplicando una capa uniforme de un

material apropiado en forma de pasta acuosa para limpiar vidrio

placa. Los sorbentes habituales incluyen gel de sílice, alúmina, kieselguhr, y
polvo de celulosa.

El gel de sílice se utiliza en gran medida porque puede servir como un medio para la

separación de compuestos polares y no polares. Las manchas son

colocados a distancias regulares y iguales. La mezcla se puede aplicar usando un
tubo capilar. El desarrollo se lleva a cabo mediante la técnica de ascenso en un
pequeño frasco de vidrio.

50
PREPARACIÓN DE PLACA DE GEL DE SILICA: Mezcle 2g de gel de sílice con

4 ml de agua destilada en un pequeño matraz cónico y agitar/mezclar bien y

extender sobre la placa de vidrio.

MATERIALS

Sistema de solventes: -n-Butanol: Ácido acético: Agua (8:2:2)

Agente de visualización: -Reactivo de ninhidrina

Amino acids: -Alanine, Valine, Leucine, and Glycine

PROCEDIMIENTO:

Preparación de las placas

Las placas se preparan vertiendo una suspensión de adsorbente (gel de sílice)

en agua con una consistencia suave / utilizando un esparcidor. Deje que los platos
dejar reposar durante 5 minutos. Luego secar los platos a 120 grados Celsius durante 30

minutos. Luego dejar enfriar y reservar para la exposición a la atmósfera

durante unos 30 minutos.

Dibuja la línea base a 1.5 cm del extremo inferior de la placa de vidrio.

Marque los puntos equidistantes entre sí y localice la muestra usando

tubo capilar.

Preparación del estándar

51
Disolver 5 mg de cada uno de los aminoácidos anteriores por separado en 0.25 ml de

agua. Mide el volumen de agua utilizando una pipeta graduada de 1 ml. Mezcla un
deje caer cada solución para proporcionar la mezcla de prueba, diluya el resto de
cada soluto por separado a 1 ml para dar solución del respectivo amino
ácidos. Este último contendrá aproximadamente 5 mg/ml de cada aminoácido / ml.

Desarrollo de la cromatografía

Después de la aplicación de la muestra, las placas se colocan en previamente

sistema de solvente saturado. Se permite que el solvente pase hasta 3/4thdel
placa. La placa se retira y se deja secar al aire. Reagente de visualización
(El reactivo de ninhidrina) se rocía y las placas se secan en un horno de aire caliente hasta que el

se desarrollan manchas. Rfel valor se calcula.

INFORME: La Rfse encontró el valor de la mezcla de la muestra desconocida

ser ………. y …………….

52
Experimento No:14 Fecha:

CROMATOGRAFÍA EN COLONNA

OBJETIVO: Realizar la separación e identificación de un dado

mezcla de los amino
ácidos por cromatografía en columna

APARATO: Columna de vidrio con un grifo

Vaso de precipitados

Matraz cónico

placa de TLC

Tubo capilar

CHEMICALS : Benzene , silica gel , sand , glass wool , sintered

vidrio

PRINCIPIO: La cromatografía en columna se basa en el principio de

adsorción selectiva. La mezcla que se va a separar está disuelta en un adecuado
disolvente y permitido pasar a través de un tubo que contiene el adsorbente. El
el componente que tiene mayor poder de absorción se adsorbe en la parte superior

parte de la columna. el componente neto se adsorbe en la porción inferior

de la columna que tiene menor poder de adsorción que la primera
componente, el proceso continúa, como resultado, los materiales son
parcialmente separada y adsorbida en las diversas partes de la columna, el
53
la separación inicial de varios componentes se puede mejorar pasando
ya sea el original o algún otro disolvente adecuado lentamente a través del
Se utilizan dos procedimientos de columna para separar varios constituyentes.

A) Las diversas zonas se cortan con un cuchillo en los límites y el

la sustancia presente en las zonas se extrae con un disolvente adecuado
el proceso de recuperación de constituyentes se conoce como elución.

B) Después del desarrollo, la columna puede ser lavada con más disolvente,
ahora denominado el eluente y cada componente se recoge por separado a medida que

llega al final de la columna y es liberado.

DISCUSIÓN:

El disolvente se selecciona en función de la relación de solubilidad de las sustancias.

Los disolventes comúnmente utilizados como fase móvil se organizan de acuerdo a

hay un aumento del poder eluente. así se obtienen series eluotrópicas.

que varían con el tipo de adsorbente utilizado.

Los disolventes utilizados en cromatografía tienen tres funciones que cumplir.

1. Servir para introducir la mezcla en la columna

2. Efectuar el proceso de desarrollo por el cual las zonas de

la cromatografía se separa en su máxima extensión

3. Se utiliza para eliminar el contenido requerido de cada zona del

partes mecánicamente separadas de la columna o de la columna como un

54
completo después de que esté parcialmente desarrollado. Los disolventes utilizados para este propósito son

llamados eluentes. Disolventes: éter de petróleo

➢ Ciclohexano

➢ Tetracloruro de carbono

➢ Tricloroetileno

➢ Benceno

➢ Cloroformo

➢ Alcohol absoluto

➢ Acetato de etilo

➢ Piridina

PROCEDIMIENTO

1) Inicialmente se realizó la TLC para la selección del sistema de solventes

2) La muestra se disolvió en un disolvente adecuado, utilizando un tubo capilar.

se aplicó una pequeña cantidad de muestra en la placa de TLC.

3) La placa TLC se desarrolló en diferentes sistemas de solventes y se dejó secar al aire.

y observado bajo luz UV

4) El disolvente que muestra suficiente separación entre las manchas fue

seleccionado como fase móvil (benceno)
55
5) Se mezcló gel de sílice con la fase móvil y luego se llenó en
columna

6) La arena fue lavada con la fase móvil y añadida a la columna

formar una capa sobre el adsorbente

7) La muestra se mezcló con la fase móvil y se introdujo en

columna.

El nivel de la fase móvil se mantuvo por encima del nivel del adsorbente

Se recogió el eluyente de la parte inferior y se verificó la presencia de individuos

Los constituyentes se determinaron realizando TLC y observando el

placas en UV

Se recogieron y evaporaron una serie de eluentes para obtener el puro

muestra.

INFORME

56
 Date:

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Introducción

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una forma delíquido

cromatografíapara separar compuestos que están disueltos en solución.
Los instrumentos HPLC consisten en un depósito de fase móvil, una bomba, un
inyector, una columna de separación y un detector. Los compuestos se separan
inyectando un tapón de la mezcla de muestra en la columna. Los diferentes
los componentes de la mezcla pasan a través de la columna a diferentes velocidades debido

a diferencias en suparticionamientocomportamiento entre el líquido móvil

fase y la fase estacionaria.

PARÁMETROS utilizados en HPLC

TIEMPO DE RETENCIÓN (tR): es el tiempo entre la inyección de la muestra (tiempo

cero) y la aparición de la banda máxima; cuando todas las condiciones están

manteniéndose constante, el tiempo de retención para un pico (o compuesto) permanece

constante.

VOLUMEN DE RETENCIÓN: Es el volumen de fase móvil requerido para

eluir el 50% del componente de la columna

Volumen de retención = tiempo de retención x tasa de flujo

57
Factor de separación: FACTOR DE SEPARACIÓN (a): definido para dos
bandas adyacentes como la relación de k' para la segunda banda dividida por k' para la
primera banda; cuando el factor de separación es igual a 1.00, las dos bandas están en

uno encima del otro y completamente inseparados. Cambiando el

las condiciones experimentales pueden aumentar a y permitir que las dos bandas sean

separado. También a veces llamado

RETENCIÓN RELATIVA

RESOLUCIÓN (Rs): define cuán separadas están dos bandas adyacentes

Los valores más grandes de resolución significan mejor separación.

TEORÍAS DE HPLC

TEORÍA DE PLACAS:

Según esta teoría, la columna cromatográfica consiste en

placas continuas, estrechas y horizontales de unidades iguales llamadas como

"Placas teóricas". Aunque estas unidades son hipotéticas, dan lugar

a un método muy útil para la medición práctica de columnas
eficiencia.

Height equivalent to theoretical plates (HETP):

Es la longitud de la columna necesaria para obtener el equilibrio del

partículas de soluto entre las dos fases y se da por

HETP = length of the column / no. of theoretical plates

58
Donde L= longitud de la columna cromatográfica

N= número de platos teóricos

HETP se da por la ecuación de Van Demeter:

HETP=A+B/u + Cu

Dónde,

A= término de difusión por remolinos o difusión por múltiples caminos que surge debido a

el empaquetado de la columna. Esto no se ve afectado por la velocidad del gas portador o

tasa de flujo. Esto se puede minimizar mediante la uniformidad en el empaquetado

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

B= término de difusión longitudinal o difusión molecular que depende de

caudal

C= efecto de la transferencia de masa que depende del caudal.

u = tasa de flujo o velocidad de la fase móvil

Resolution (R):

Se define como la distancia entre dos picos máximos adyacentes divididos

por su ancho de pico promedio.

N, HETP y R son preferidos como medidas de la eficiencia de la columna.

59
Tiempo de retención ( Rt ) :

It is thedifference in time between the point of injection and appearance

de máximos de pico.

Es el tiempo requerido para que el 50% de un componente sea eluido de la

columna.

·Medido en mmin o seg

TEORÍA DE LA TASA:

La teoría de placas no logró explicar las maneras de mejorar el rendimiento de

la columna, que la teoría de la tasa hizo. Esta teoría explicó el hecho de que
la fase móvil fluye continuamente y que las partículas de soluto

se transportan y particionan constantemente en la columna. Puede ser

explicado por la ecuación de Van Deemeter:

TIPOS DE TÉCNICAS DE HPLC

A) Basado en modos de cromatografía

Modo de fase normal

Modo de fase inversa

B) Basado en el principio de cromatografía

Cromatografía de adsorción

60
2. Cromatografía de intercambio iónico

3. Cromatografía de exclusión por tamaño/permeación en gel

4. Cromatografía de afinidad

5. Cromatografía quiral

C) Basado en técnicas de elución

Separación isocrática

2. Separación por gradiente

D) Basado en la escala de operación

HPLC analítico

2. HPLC preparativa

E) Basado en el tipo de Análisis

1. Análisis cualitativo

2. Análisis cuantitativo

F) Basado en el diámetro interno de la columna empleada para HPLC

1. Basado en modos de cromatografía - Interacción o Afinidad entre

polar-polar y no polar-no polar

61
es más mientras que la afinidad de interacción entre lo polar y lo no polar es
menos. A. Cromatografía de fase normal. Separación de analitos polares por
particionamiento en una fase estacionaria unida a un polar. En este, la fase estacionaria

la fase es polar (por ejemplo, gel de sílica) y la fase móvil es no polar. En este
técnica los compuestos no polares viajan más rápido y se eluyen primero esto
es por la menor afinidad entre el

El soluto y la fase estacionaria. Los compuestos polares se retienen por un

más tiempo en la columna debido a una mayor afinidad hacia el

Fase estacionaria y tardan más en ser eluidos de la columna. Esto

se convierte en una desventaja y el proceso no se puede aplicar

para los productos farmacéuticos, ya que la mayoría de las moléculas de los fármacos son polares

en la naturaleza y tarda más tiempo en ser eluido y detectado Como un

el resultado de esta técnica no se utiliza ampliamente en Farmacia

B. Cromatografía de fase inversa: Separación de analitos no polares

por partición en una fase estacionaria unipolar unida.

En cromatografía de fase inversa, una fase estacionaria no polar y polar

se utiliza fase móvil. Por lo tanto, los componentes polares se obtienen

Eluidos y los componentes no polares son retenidos por más tiempo

tiempo. Dado que la mayoría de los medicamentos y productos farmacéuticos son polares

62
En la naturaleza, no se retienen por más tiempo y se eluyen más rápido.
cuál es ventajoso

B. Basado en el principio de cromatografía:

1. Cromatografía de intercambio iónico. El principio de separación es ión-

intercambio, que es el intercambio reversible de grupos funcionales en iones
la cromatografía de intercambio iónico, se utiliza una resina de intercambio iónico para separar un

mezcla de iones cargados similares. Para cationes, una resina de intercambio de cationes es

se utiliza una resina de intercambio aniónico para aniones.

2. Cromatografía de afinidad: utiliza la afinidad de la muestra con

fase estacionaria específica. Esta técnica se utiliza principalmente en el campo

de biotecnología, microbiología, bioquímica, etc.

2. Basado en técnicas de elución:

Elución isotámica: Aquí se utiliza la misma combinación de fase móvil.

a lo largo. El proceso de separación. La misma polaridad o elución
la fuerza se mantiene a lo largo del proceso.

·Elución en gradiente: Aquí una combinación de fase móvil de menor polaridad

o la fuerza de eluti0n se utiliza seguida de un aumento gradual de la polaridad

o fuerza de elución.

63
3. Basado en la escala de operación:

HPLC Analitica1: utilizado solo para fines analíticos y la recuperación

del muestreo no se realiza ya que la cantidad de muestra utilizada es muy pequeña
generalmente en microgramos. HPLC preparativo: aquí las fracciones individuales

de compuesto puro

Can be collected using fraction collector and the collected samples can
ser reutilizado Ej. separaciones de unos pocos gramos de una mezcla.

Basado en el tipo de análisis:

a. Análisis cuantitativo: se utiliza para identificar el compuesto, detectar

impurezas y para encontrar el número de componentes. Se hace mediante el

valores de tiempo de retención.

[Link]álisis cuantitativo: se realiza para detectar la cantidad de individuos o

varios componentes en una mezcla. Se hace comparando el área del pico
de estándar y muestra

Principio de separación en HPLC:

Cuando se introduce una mezcla de componentes en una columna HPLC, ellos

viajan de acuerdo a sus afinidades relativas hacia la fase estacionaria.
El componente que tiene más afinidad hacia el adsorbente viaja
el más lento, el componente que tiene menos afinidad hacia la fase estacionaria

64
la fase viaja más rápido. Dado que ningún componente tiene la misma afinidad
hacia lo estacionario

fase, los componentes están separados.

Fases estacionarias: Las fases estacionarias son partículas que normalmente

alrededor de 1 a 20 μm de diámetro promedio (a menudo en forma irregular).

Polar (“Fase Normal”):

o sílice, alúmina

o Ciano, amino o terminaciones de diol en la fase unida. No-

Polar("Fase Inversa")

o, terminaciones de C18 a aproximadamente C8 en la fase unida

o Terminaciones fenilo y ciano en la fase unida

NOTA

1. Ni la sílice ni los materiales de sílice unida deben ser utilizados por encima de pH8

porque la sílice misma comienza a disolverse alrededor de un pH de 8.

Los materiales con enlaces químicos también se separan a un pH de 2.0

3. Los compuestos adsorbidos generalmente se pueden eliminar de las columnas de sílice por

lave con metanol o agua y desde columnas de fase unida por

lavado con metanol o diclorometano

65
4. In Adsorption chromatography, there is no additional phase on the
partículas de fase estacionaria (sílice, alúmina)

5. En la cromatografía de partición, la fase estacionaria está recubierta en

(a menudo enlazado) un soporte sólido (sílice, alúmina, resina de divinilbenceno)

La fase móvil en HPLC

Debo hacer lo siguiente

1. solvate las moléculas de analito y el disolvente en el que se encuentran

2. ser adecuado para que el analito se transfiera "de ida y vuelta" durante
el proceso de separación

3. Debe ser compatible con el instrumento (bombas, sellos, mezclado,

detector, etc)

4. compatible con la fase estacionaria

5. disponible fácilmente (a menudo se utiliza litros/día)

6. de pura adecuación La espectroscopia y la composición en trazas usualmente

7. No muy compresible (causa problemas de bomba/flujo)

Nota:

1. La pureza del disolvente es muy importante en la HPLC preparativa donde el

La muestra generalmente se recupera mediante la evaporación del solvente.

66
2. Para lograr reproducibilidad en la cromatografía de adsorción, el
El contenido de agua de la fase móvil debe controlarse cuidadosamente.

3. porque la mayor parte del cromatógrafo está en contacto con el móvil

la fase está construida de acero inoxidable o teflón, hay pocos
sin embargo, se deben evitar los iones halógenos
porque estos iones atacan el acero inoxidable, especialmente a valores de pH bajos.

4. El crecimiento de algas puede resultar del uso prolongado del biológico

las soluciones amortiguadoras como el citrato y estas generalmente tienen que ser

descartado

5. Al trabajar con soluciones tampón y otros materiales potencialmente corrosivos

los eluentes, el sistema debe ser lavado con agua o un

mezcla de agua y metanol cuando no está en uso. Esto es ventajoso para ambos
el cromatógrafo así como el material de empaque de la columna.

67
INSTRUMENTACIÓN DE HPLC

Sistema de desgasificación

2. Sistema de entrega de solvente por bomba

3. Válvulas de retención

4. Amortiguador de pulso

5. Pre-columnas

6. Columna de guardia

7. Divisor de flujo

8. Muestreador automático
68
9. Sample injection port

[Link]

[Link]

APLICACIONES DE HPLC

1. Pruebas de control de calidad de medicamentos

2. En análisis cualitativo y cuantitativo

3. Monitoreo terapéutico de estudios de metabolismo de fármacos

4. Separación y control de impurezas

5. En el análisis de fluidos biológicos

6. Estudios de estabilidad

7. Estudio de las rutas metabólicas en las vías bioquímicas básicas

8. Separación de isómeros de posición, enantiómeros, isómeros ópticos

9. Aplicaciones industriales

a. Determinación de intermedios sintéticos ej: atenolol

b. Al determinar trazas de impureza ex: Tolnafato

c. Estudios de estabilidad ex Acyclovir

69
 Experimento No:15 Fecha:

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE RETENCIÓN Y DEL ÁREA BAJO

CURVA PARA UNA MUESTRA DE FÁRMACO DADA POR EL MÉTODO HPLC

OBJETIVO: Determinar el tiempo de retención (tr) y AUC para una muestra dada de
diclofenaco sódico por método HPLC (análisis cualitativo).

PRINCIPIO: La cromatografía es un método físico de separación de

diferentes tipos de compuestos a partir de mezclas complejas; utiliza dos mutuamente

fases insolubles/inmiscibles - fase estacionaria y fase móvil, esta última

pasa sobre el anterior.

La cromatografía líquida de alta presión (HPLC) utiliza una alta presión para
hacer pasar la fase móvil a través de la fase estacionaria empacada uniformemente

columna, a velocidades y tasas de flujo suficientes, y puede operarse a varias

presiones de hasta 1500 psi.

A tan alta presión, la propiedad de resolución del sistema cromatográfico

cambios; por lo tanto, a veces también se conoce como líquido de alto rendimiento

cromatografía (a medida que cambian las prestaciones de las fases estacionarias y móviles

a alta presión).

Tiempo de retención (trEs el tiempo requerido por la muestra dada para eluir.
de la columna con la fase móvil. La muestra se inyecta en el
fase móvil a través del puerto de inyección antes de la columna.

70
En HPLC, trestá relacionado con el parámetro, Rf(factor de retención) en papel
cromatografía y TLC.

INSTRUMENTATION:

Reservorio de fase móvil

(2) Sistema de entrega de fase móvil, consiste en:
• Bombas
• Sistema de amortiguación pública
• Regulador de flujo
• Cámara de mezcla
• Desaireación y filtros
(3) Sistema de inyección de muestras

(4) Columna
• Columna de guardia
• Columna principal
• Horno (cámara termoestática)
(5) Detector
(6) Procesador de datos, grabador y pantalla.

INFORME: Se encontró que el tiempo de retención para el diclofenaco sódico fue

ser…………… y se encontró que AUC fue…………………

71
Experimento No:16 Date:

ESTIMACIÓN DE DICLOFENACO SÓDICO POR HPLC

OBJETIVO: Estimación de sodio diclofenaco a partir de la muestra dada por HPLC

método (análisis cuantitativo).

CONDICIÓN CRONATOGRÁFICA:

HPLC instrument: Water

Detector Detector de doble longitud de onda

Columna C18fase inversa

(4.9mm*250mm)

Temperature Temperatura ambiente

Fase móvil Metanol

Caudal 1ml/min

Presión de entrada 1824 psi

Volumen inyectado: 30 microlitros

PROCEDIMIENTO:

Preparación de la solución estándar y curva estándar de

diclofenaco sódico

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 • Solución estándar con una concentración que varía de 5, 10,
Se prepara 15, 20, 25 microgramos/ml.
• Cada muestra se inyecta en la columna y se calcula el AUC.
• Se preparó un gráfico estándar de AUC vs. concentración, a partir de
¿cuál puede ser la concentración de la muestra desconocida?

determinado.

INFORME: La concentración de sodio diclofenaco en la muestra dada es

se encontró que…………..

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