Actualización

sobre resistencias
a antimicrobianos

Módulo 5

La genómica y la bioinformática
aplicada al estudio de las
resistencias microbianas

Coordinador: Dr. Germán Bou Arévalo

ESCMID Fellow. Jefe Servicio Microbiología. Profesor Asociado Microbiología, USC.
Hospital Universitario A Coruña, Spain

Autores: Dra. María Dolores Pérez Vázquez Dr. Jesús Oteo Iglesias
Laboratorio de Referencia e Investigación en Resistencia Laboratorio de Referencia e Investigación en Resistencia
a Antibióticos e IRAS, Centro Nacional de Microbiología. a Antibióticos e IRAS, Centro Nacional de Microbiología.
CIBER de Enfermedades Infecciosas (CIBERINFEC). CIBER de Enfermedades Infecciosas (CIBERINFEC).
Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda. Madrid Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda. Madrid
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sobre resistencias
a antimicrobianos

Módulo 5

La genómica y la bioinformática
aplicada al estudio de las resistencias
microbianas
INDICE

1. Introducción 4

2. El impacto de la secuenciación genómica completa en el estudio 6

de la resistencia a antibióticos

3. Prediciendo la sensibilidad a antibióticos desde la genómica 14

4. La integración de la secuenciación genómica en la vigilancia 16

de la resistencia

5. El papel de la genómica en abordaje global de la resistencia 18

a antibióticos desde la inteligencia artificial
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1 Introducción

La secuenciación masiva o high-throughput sequencing (HS) apareció a principios de este siglo como una
alternativa a la secuenciación Sanger1.

La mayor ventaja de la secuenciación masiva sobre la secuenciación previa es el incremento

en la producción de secuencias debido a la incorporación de la nanotecnología, que permite
llevar a cabo miles de reacciones de secuenciación simultáneamente2.

Después de 15 años en el mercado, la tecnología que más se utiliza en el caso de estudios microbiológicos es
la de Illumina (Illumina, San Diego, CA, USA). Esta plataforma es muy conveniente para la mayoría de los pro-
pósitos y presenta una adecuada relación calidad-precio para grandes colecciones de muestras bacterianas.

En 2009-2011 aparecieron las plataformas consideradas como secuenciación de tercera generación o SMRT
(single molecule real time) encabezadas por las tecnologías PacBio (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA)
Oxford Nanopore, que se basan en la secuenciación en tiempo real de moléculas de ADN de cadena simple;
su gran ventaja es la elevada longitud de lectura obtenida. Estas tecnologías siguen mejorando en cantidad
de producto secuenciado, velocidad de secuenciación, reducción de la tasa de error y coste.

En general, a partir de las secuencias obtenidas en el secuenciador (secuencias crudas), se pueden aplicar
una serie de procesos para extraer o inferir los datos necesarios para el diagnóstico, la vigilancia y la inves-
tigación. Estos procesos incluyen diferentes metodologías aplicadas en serie sobre las lecturas crudas, que
están resumidas en la figura 1.

Figura 1. Diagrama esquemático de los métodos aplicados sobre los productos de secuenciación de genoma completo
(WGS). Los elementos amarillos representan los métodos que utilizan referencia. Los elementos azules representan
comparación de los resultados obtenidos del análisis con determinadas bases de datos para dar significado biológico,
que es representado con un guion delante de la información obtenida al final del análisis.

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Esas metodologías son:

1. Mapeado
Las lecturas son alineadas con una referencia conocida. En la secuenciación de genomas completos
(WGS), el ADN total se secuencia múltiples veces, por lo que muchas lecturas se pueden alinear sobre
la misma región: esto se conoce como profundidad. Además, las lecturas pueden quedar más o menos
repartidas a lo largo de la referencia tras el alineamiento: esto se conoce como cobertura.
La combinación de estos parámetros permite detectar la presencia y cantidad relativa de genes, si
estos se encuentran en la referencia3.

Tras alinear las lecturas, se pueden obtener las bases o regiones que son diferentes entre la muestra
problema y la referencia: esto se conoce como llamada a variantes y permite obtener las posiciones
de mutaciones puntuales (SNP–Single nucleotide polymorphism). Estas posiciones se pueden anotar,
es decir, añadir información biológica, para determinar la relevancia de la mutación y asignarla a un
fenotipo de interés. Por otro lado, estas posiciones son marcadores moleculares precisos que sirven
para determinar la distancia genética entre varios individuos de la misma especie, siempre que
compartan una referencia común.

2. Ensamblado 3. Anotación
Las lecturas son utilizadas para reconstruir una Los contigs se pueden anotar. La anotación
representación del genoma de origen, ya que puede ser automática con la búsqueda
son de menor tamaño que este. posicional de promotores, secuencias de
El ensamblado es de novo cuando no se tiene inicio y fin de transcripción que nos permiten
conocimiento del genoma a reconstruir. En este predecir secuencias codificantes (cds) y su
caso, se alinean los extremos de las lecturas posición con respecto a otras cds y al genoma.
para producir secuencias con la mayor longitud Decimos que la anotación es específica si a
posible, llamadas contigs. También es posible esas cds se les añade una función biológica
realizar el ensamblado utilizando una secuencia asignando un producto de transcripción
de referencia similar a la que queremos o traducción específico al comparar las
reconstruir como guía para colocar las lecturas secuencias codificantes con una base de datos
antes de generar los contigs. de genes conocidos4.

4. K-mers
A partir de las lecturas crudas o secuencias ensambladas de un organismo o gen conocido, se obtiene
un subconjunto de secuencias de menor tamaño llamados k-meros (por ejemplo 1000 secuencias de
21 pb) que son representativos de una especie, subespecie o gen. Posteriormente, se evalúa si las
lecturas crudas y/o ensamblados de la muestra a analizar contienen los k-meros previos y cuántos,
de manera que se puedan asignar a la misma diferentes atributos, como puede ser una especie
determinada5 o una subpoblación6, 7. Esta aproximación permite comparar grandes productos de
secuenciación de manera mucho más rápida que usando todas las lecturas crudas, aunque con
menor especificidad.

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La aplicación de WGS al diagnóstico microbiano es mucho más resolutiva que las técnicas de
uso frecuente. La secuenciación de genoma completo permite identificar la cepa productora
de la enfermedad y el contenido genético que resulte de interés (genes de resistencia y/o
virulencia).

Asimismo, también se han desarrollado aplicaciones que permiten diferenciar el ADN genómico y el plas-
mídico y han permitido obtener la estructura de los elementos genéticos móviles que contienen los genes
de interés, así como su entorno genético8.

Además, el WGS permite realizar la construcción de relaciones filogenéticas entre cepas de la misma
especie. Respecto a la filogenia, la construcción de árboles filogenéticos de máxima verosimilitud utilizando
SNPs9, o el tipado mediante el core genome MLST (cgMLST)10, permiten una alta capacidad discriminatoria en
el estudio de la dinámica de transmisión intra e interhospitalaria11, 12.

En comparación con los ensayos clásicos, como son la electroforesis de campo pulsado (PFGE) o Multilocus
Sequence Typing (MLST, Pasteur), la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de WGS para la construc-
ción de árboles filogenéticos resulta de gran utilidad en los programas de vigilancia de enfermedades
infecciosas.

Solo el estudio combinado genómico/clínico de las infecciones por bacterias multirresistentes puede propor-
cionar información necesaria para permitir la reconstrucción de las cadenas de transmisión y la detección de
indicadores clínicos que permitan implementar estrategias terapéuticas y de control adecuadas11.

El desarrollo e interpretación de estas metodologías requieren de un esfuerzo por parte de

la comunidad científica a la hora de generar iniciativas que establezcan protocolos comunes
para el análisis de cada patógeno13.

2 El impacto de la secuenciación genómica completa


en el estudio de la resistencia a antibióticos

2.1. Estudios filogenéticos

Se han utilizado, sobre todo, dos estrategias de análisis que permiten evaluar las distancias genómicas y
aplicar métodos de agrupación o de análisis filogenético para establecer las posibles relaciones entre los
aislados11, 14. Los dos métodos predominantes actualmente utilizados en la literatura son:

1. Reconstrucción filogenética 2. Identificación de un conjunto de genes

Reconstrucción filogenética basada Identificación de un conjunto de genes (cgMLST
en el mapeado frente a un genoma de o wgMLST) en los genomas ensamblados y
referencia y la búsqueda de las posiciones asignación alélica a cada uno de los genes
con mutaciones puntuales (SNPs). identificados. Posteriormente se utiliza este
La matriz de cambios así generada se utiliza perfil alélico para identificar al aislado en
para construir árboles filogenéticos basados cuestión. El último paso consiste en realizar una
en una aproximación de máxima verosimilitud. representación de las distancias mínimas entre
los aislados estudiados (minimum spanning tree).

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Ambas aproximaciones han sido ampliamente estudiadas para la caracterización de bacterias multiresis-
tentes. Conozcamos algunos de esos estudios:

1. Estudio en 244 hospitales de 32 países europeos

En el caso de enterobacterales productores de carbapenemasas (EPC), destaca como ejemplo un
estudio en el que se analizaron 1.700 genomas de Klebsiella pneumoniae aislados en 244 hospitales de
32 países europeos; el análisis de SNPs permitió concluir que en K. pneumoniae solo cuatro linajes son
responsables de la diseminación de carbapenemasas en Europa (ST11, ST15, ST101 y ST258/512)
y además se analizó la variabilidad de los citados linajes (f 2), pudiendo identificar eventos de transmisión
entre los diferentes hospitales incluidos, en base a la variabilidad media de SNPs de los clones exclusivos
de un hospital. Además, encuentran que estos eventos de trasmisión interhospitalaria son más
frecuentes en las cepas productoras de carbapenemasas15.

Figura 2. Árbol filogenético de 1.649 aislamientos de K. pneumoniae sensu stricto; los ST que contienen más de
20 aislamientos se muestran en el anillo interior. En el anillo exterior, los aislamientos están coloreados por su
mecanismo de resistencia (extraída de referencia 15).

En este trabajo también se han incluido herramientas interactivas que permiten una visualización muy en
detalle de la colección de aislados estudiados, pudiendo ser el investigador el que realice una selección de
los datos en los que está interesado.

Más información en: [Link]

[Link]

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2. Estudio sobre resistencia a antibióticos carbapenémicos en España

Otro trabajo en el que se aplica la secuenciación de genomas completos en la vigilancia de la resistencia
a antibióticos carbapenémicos mediada por la producción de carbapenemasas en enterobacterales
en España16 ha permitido establecer la evolución epidemiológica en las cepas de K. pneumoniae
productoras de carbapenemasas, desde el predominio de ST11 y ST405 productores de OXA-48
en el 2015 hasta la aparición de ST307/OXA-48 y la dispersión de ST512/KPC detectado en siete
provincias del sur de España en el 2019 (figura 3)16.

Figura 3. Estructura de la población de Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasas: árbol de expansión

mínima. Las distancias que se muestran se basan en cgMLST de 2.358 genes. Los colores en cada círculo indican el
tipo de carbapenemasa. Los óvalos rojos representan grupos. Las sombras grises representan grupos de cepas
(5 SNP y 10 alelos, extraída de cita 16).

Otra de las aplicaciones de este tipo de análisis es la de realizar un trazado muy exhaustivo de
los brotes, pudiendo identificar las rutas de transmisión de una forma más eficaz que con la
metodología clásica, lo que puede ser clave a la hora de controlar la transmisión del brote.

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En el siguiente ejemplo se estudia un brote en un hospital de Estados Unidos de K. pneumoniae resistente a

los carbapenémicos: afectó a 18 pacientes, 11 de los cuales murieron. Lo que se consiguió fue:

• mentación
La secuenciación del genoma permitió comprender por qué progresó el brote a pesar de la imple-
temprana de procedimientos de control de infecciones.

• partir
El análisis genómico permitió rastrear el brote hasta detectar tres transmisiones independientes a
de un único paciente, que había sido dado de alta 3 semanas antes de que el siguiente caso
se hiciera clínicamente aparente.

• transmisión
La combinación de los datos genómicos y epidemiológicos proporcionó la evidencia de rutas de
inesperadas, cuya detección fue esencial para detener el brote (figura 4) . 17

Patient ID
Figura 4. A) Gráfico de posibles vínculos de transmisión entre pacientes. Los ID de los pacientes están dentro de los
círculos. Una flecha está presente de un paciente a otro si los dos pacientes se superponen en la misma unidad antes
de que el cultivo del receptor potencial sea positivo. Enlaces rojos cuando el evento de transmisión es predicho por el
análisis genómico. B) “Heat map” que representa las variantes entre los genomas con los pacientes en el eje de abs-
cisas y las posiciones variables en sus respectivos genomas en el eje de ordenadas. Azul y verde, los dos principales
grupos de pacientes identificados sobre la base de las variantes compartidas (extraída de referencia 17).

Otra gran ventaja de este tipo de análisis filogenéticos es que el hecho de disponer de bases
de datos con cepas secuenciadas de orígenes diversos nos permite analizar nuestra colección
de estudio y establecer relaciones con aislados de orígenes muy diversos y, de esta manera,
ampliar el enfoque global de los estudios.

Un ejemplo sería la caracterización de clon ST307 de K. pneumoniae, que recientemente ha emergido como
un clon productor de carbapenemasas, a nivel mundial y también en España.

Ante el aumento de casos en nuestro país, se realizó un análisis de los casos encontrados y se comparan con
cepas de diferentes orígenes: se pudo concluir que los clones detectados en España son similares al linaje
descrito por Wyres et al.18 como distribuido a nivel global en América, Europa, Australia, Asia y el Oriente
Medio (figura 5)18.

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Figura 5. Estructura poblacional de aislados de K. pneumoniae ST307 productores de carbapenemasas. (a) “Mini-
mum spanning tree” que muestra la distancia basada en cgMLST de 2538 genes. (b) Árbol de máxima verosimilitud
que muestra la relación entre aislamientos; las longitudes de las ramas son indicativas del número de SNPs. El color
de cada círculo indica el origen geográfico de los aislados (extraída de la referencia 18).

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2.2. Caracterización del resistoma

La resistencia a los antibióticos está codificada genéticamente y suele ocurrir a través de una serie de meca-
nismos, como son la sobreexpresión o la duplicación de genes existentes, mutaciones puntuales o la adqui-
sición por transferencia horizontal de genes.

Las mejoras en las tecnologías de WGS y los métodos computacionales están facilitando la rápida identifica-
ción y caracterización de genes de resistencia a antimicrobianos en genomas (19).

La caracterización de los genes de resistencia presenta dos aproximaciones:

1. Uso de herramientas basadas 2. H

 erramientas basadas en la utilización de las lecturas
en un BLAST crudas
Las herramientas basadas en un Las herramientas basadas en la utilización de las lecturas crudas
BLAST permiten identificar los no parten de los ensamblados y, para detectar los genes diana,
genes diana en las secuencias es necesario que las lecturas se alineen con bases de datos de
ensambladas. Estas herramientas referencia o se dividan en k-meros antes de realizar la búsqueda
presentan la ventaja de que nos en la base de datos. En este caso no podemos identificar los
permiten identificar los genes y entornos genéticos, pero si permite la identificación de genes
sus entornos genéticos. que estén partidos en distintos contigs en el ensamblado.

Una revisión muy detallada de las herramientas que se utilizan para la identificación de los genes de resisten-
cia se presenta en el trabajo de Boolchaldani et al19. Algunos de los softwares más usados son:

• Resfinder • ARG-ANNOT
Herramienta para la detección de genes de resistencia Herramienta que realiza una comparación
adquiridos a partir de genomas ensamblados pareada de la secuencia ensamblada con
mediante BLAST. Puede utilizarse on-line o local su base de datos. Solo puede utilizarse en
([Link] local.

• ARIBA • PointFinder
Herramienta que realiza una identificación de los Herramienta permite la detección de
genes de resistencia a partir de lecturas crudas y mutaciones en genes cromosómicos
permite utilizar diferentes bases de datos públicas. asociadas con la resistencia a antibióticos.
Solo puede utilizarse en local ([Link] Puede ser utilizada on-line o en local
sanger-pathogens/ariba). ([Link]
PointFinder).

• NCBI-AMR-Finder • SRST2
Herramienta para la identificación de genes de Herramienta que identifica los genes de
resistencia adquiridos utilizando la base de datos resistencia a partir de lecturas crudas
disponible en el NCB. Su uso es en local mediante mapeo frente a una base de datos
([Link] curada. Su uso es en local ([Link]
antimicrobial-resistance/AMRFinder/). com/katholt/srst2).

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Tanto los enfoques basados en ensamblado como en lectura cruda para la predicción
computacional de la presencia de mecanismos de resistencia dependen en gran medida de las
bases de datos que se utilicen.

Estas bases de resistencia a veces son simplemente un listado de genes de resistencia y, en otras ocasiones
presentan, además, las relaciones de determinantes genéticos conocidos con la resistencia a las diferentes
familias de antimicrobianos.

En el siguiente enlace se muestra una relación muy detallada de bases de datos de genes de
resistencia más ampliamente utilizadas:
[Link]

Algunas de esas bases de datos incluyen genes de resistencia adquiridos y otros incluyen genes cromosómi-
cos cuyas modificaciones se asocian a perdida de sensibilidad a los antimicrobianos. Muchas son generales,
mientras que otras son específicas de patógeno. La selección de unas u otras va a depender del tipo de
estudio que vayamos a llevar a cabo.

Un aspecto esencial que garantiza la calidad de estas bases de datos es que se mantengan
actualizadas con mecanismos de resistencia nuevos o emergentes.

Además, la posibilidad que tienen algunas de las herramientas presentadas, como puede ser el ARIBA o el
SRST2, de utilizar bases de datos creadas por los usuarios muy ajustadas a un determinado problema de
resistencia es un aspecto clave para realizar un análisis más personalizado.

2.3. Elementos genéticos móviles

Los plásmidos son moléculas de ADN circulares o lineales de doble cadena, que poseen replicación autóno-
ma y son transferibles entre diferentes especies y clones bacterianos.

La mayoría de los plásmidos conocidos se han identificado porque confieren fenotipos que
están sujetos a selección positiva en el huésped bacteriano. La mayoría de estos fenotipos se
deben a la presencia de genes de resistencia antimicrobiana o virulencia.

Tales características ayudan a la propagación exitosa de diferentes tipos de plásmidos entre bacterias de
diferentes fuentes y orígenes geográficos. Por lo tanto, es importante no solo estudiar la epidemiología mo-
lecular de diferentes clones bacterianos multirresistentes, sino también estudiar y comprender la epidemio-
logía molecular de los plásmidos transferibles que confieren los citados perfiles de resistencia.

Las técnicas de WGS más extendidas en la actualidad son las de lectura corta, que generan datos con los
que resulta difícil el ensamblado de los plásmidos por tratarse de secuencias que presentan muchas re-
giones repetidas (por ejemplo, secuencias de inserción) y compartidas entre los distintos plásmidos de un
mismo aislado. Por esto, en los últimos años se han desarrollado numerosas herramientas informáticas que
intentan reconstruir la estructura de los plásmidos y, de esta manera, conocer el impacto de la movilidad
de los mismos a nivel epidemiológico en las bacterias multirresistentes. Algunas de estas herramientas se
muestran en la tabla 1.

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Tabla 1. Análisis comparativo de las herramientas de software para la reconstrucción de plásmidos.

Software Basado en Ventajas Inconvenientes

PlasmidFinder Homología con BD BD curada y disponible. • No se puede automatizar

curada • Basado en web
• Límite de tamaño de carga

Recycler Circularización (grafos) Predicción de plásmidos • Solo reporta secuencias cerradas

nuevos completas
• Suele fallar en los plásmidos de mayor
tamaño

PlasmidSPAdes Obtención de secuencias Predicción de plásmidos • No detecta secuencias de cobertura

con cobertura diferente nuevos similar al cromosoma
al cromosoma • Incluye secuencias cromosómicas
bacteriano como falsos positivos

PLACNET Clasificación de contigs • Convergencia de varias • Usa secuencias ensambladas

en constelaciones por aproximaciones • No se puede automatizar
similitud con BD de • Resultados visuales
plásmidos • Requiere un post procesado manual
• Sesgado a plásmidos móviles

mlplasmid Clasificación por • Rapidez por uso de •U

 sa secuencias ensambladas
PlasFlow k-meros de lecturas k-meros •L
 a BD para comparar es limitada a
como cromosomales o • Algoritmos evaluados pocas especies
plasmídicas
•N
 o se adapta a las secuencias
compartidas entre plásmidos y
cromosoma

PlasmidTron Clasificación por • Uso de metadatos • La BD puede estar sesgada.

k-meros de lecturas con • Ensambla después de • No se adapta a las secuencias
metadatos clasificar compartidas entre plásmidos y
cromosoma

PlasmidId Filtrado de BD de • Convergencia de varias • Tiempo de ejecución prolongado si la

plásmidos por k-meros aproximaciones BD es muy redundante
Identificación de • Resultados visuales • Requiere nivel bioinformático
los citados k-meros • Anotación de las adecuado para su uso
en lecturas crudas secuencias • Interpretación del resultado en manos
mapeo para identificar de especialistas
plásmidos presentes • Representación gráfica
considerando su
longitud cobertura y
homología
Alineamiento de contigs

Recientemente, esos problemas de las técnicas de WGS lectura corta se han superado con el uso de la se-
cuenciación de lectura larga, que permite una resolución completa (o casi completa) y precisa de secuencias
de plásmidos, particularmente cuando los datos se ensamblan junto con lecturas cortas20.

Este avance, junto con los costes decrecientes en la secuenciación de lectura larga,
posiblemente hará que las comparaciones de plásmidos a gran escala sean cada vez más
factibles, permitiendo así mejorar el conocimiento de su epidemiología molecular.

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En este sentido cabe destacar algunas aportaciones en la literatura, como puede ser el trabajo de Sophia
David et al.21. En él, mediante la combinación de secuenciación de lectura larga y corta en una colección am-
plia de aislados de K. pneumoniae productor de carbapenemasas, se describen tres patrones principales de
transmisión de:

• plásmidos portadores de carbapenemasas,

• un mismo plásmido en múltiples linajes bacterianos (bla ),
OXA-48

• múltiples plásmidos en múltiples linajes (bla ybla ) VIM NDM

• y múltiples plásmidos en un único linaje (bla ) (figura 6).

KPC

Figura 6. A) Filogenia construida usando todos los SNPS del genoma core de los linajes de aislados productores de
blaOXA-48-like, a la izquierda, y, a la derecha, de los del plásmido pOXA-48-like. B) Filogenia del linaje ST258/512 cons-
truido utilizando todos al SNPs del genoma core y filogenia del plásmido de tipo pKpQIL portador de KPC (en este
linaje se han detectado hasta 24 plásmidos distintos con predominio del tipo IncF). Extraída de referencia 21.

3 P
 rediciendo la sensibilidad a antibióticos desde la genómica

Como hemos visto en los apartados previos, la WGS ha demostrado su utilidad en el análisis de los meca-
nismos de resistencia a antibióticos en los últimos años, tanto de los adquiridos horizontalmente a través
de elementos genéticos móviles (plásmidos, integrones, transposones) como de los debidos a mutaciones
cromosómicas.

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Una aplicación añadida de la WGS en este campo es la capacidad predictiva del fenotipo de resistencia.
Sin duda, se trata de una de sus mayores potencialidades, pero que aún está lejos de alcanzarse para la
mayoría de patógenos22.

El enfoque más sencillo es utilizar una clasificación basada en reglas, en la que la presencia de uno o
más genes, o mutaciones de resistencia, a los antimicrobianos, se asocia con un perfil de resistencia
fenotípica. Para esta aproximación, uno de los principales retos es disponer de registros cruzados y
detallados de todos los mecanismos de resistencia posibles a un antibiótico en una especie deter-
minada y de los correspondientes datos de sensibilidad. Se trata de un reto de diversa complejidad en
función del patógeno; por ejemplo, la predicción de la resistencia a meticilina en Staphylococcus aureus
es más fácil de implementar que la de la resistencia a β-lactámicos en Pseudomonas aeruginosa, dada
la extraordinaria diversidad y complejidad de las mutaciones cromosómicas implicadas en la resistencia
en esta última.

Para muchas especies y fenotipos de resistencia a antibióticos, se ha demostrado una buena concordan-
cia entre la base genética conocida de la resistencia y el fenotipo, con buena sensibilidad y especificidad
(> 95 %). Sin embargo, no todos los modelos han tenido resultados tan satisfactorios, por lo que los
enfoques basados en reglas, por sí solos, pueden no ser siempre suficientes predecir la sensibilidad a
antibióticos mediante el WGS. Un estudio reciente realizado con P. aeruginosa23 en el que se probó una
aproximación predictiva de este tipo, mostró una muy buena capacidad de predecir la sensibilidad a anti-
bióticos (95-100 %), pero la capacidad de predicción de la resistencia fue mucho más variable en función
del antibiótico.

La mayoría de los métodos basados en reglas tienen en cuenta una serie de

consideraciones (a veces no bien probadas) sobre los fenotipos que intentan predecir,
como, por ejemplo:

1) que un solo locus genético es responsable del fenotipo,

2) que si hay múltiples loci presentes no están interactuando de manera compleja,

3) y que existe un conocimiento completo de su base genética.

Con frecuencia, estas suposiciones no se cumplen por completo. Para solventar esta debilidad, se han
realizado otras aproximaciones de aprendizaje automático e inteligencia artificial. La estrategia más uti-
lizada es utilizar grandes bases de datos con genomas bien caracterizados de un microorganismo sen-
sible y resistente a un determinado antimicrobiano y entrenar a un clasificador para que “aprenda” qué
características genéticas (SNPs, secuencias repetidas, K-meros, etc) se asocian significativamente a uno
u otro fenotipo.

En esta aproximación no se consideran específicamente los genes implicados en la resistencia, sino todo
el genoma en su conjunto. Por ejemplo, el Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC)24 ha desa-
rrollado un procedimiento basado en el cálculo de k-meros (subcadenas de longitud k contenidas dentro
del genoma) para diferenciar Acinetobacter baumannii resistente a carbapenémicos o Staphylococcus
aureus resistente a meticilina, con una precisión el 88-95 %24.

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Figura 7. Proceso de clasificación de genomas resistentes o sensible en base al estudio de k-meros (Extraída de
referencia 24). Los genomas de una especie se agrupan según sean resistentes o sensibles a un antibiótico. Se calcu-
lan los recuentos de k-meros para cada genoma y se fusionan en una matriz. Un algoritmo de aprendizaje automá-
tico busca en esta matriz los k-meros que distinguen los genomas resistentes de los sensibles, que se utilizan luego
como un “clasificador” para predecir el fenotipo de un nuevo genoma.

4 La integración de la secuenciación genómica en la vigilancia


de la resistencia

La integración de la WGS en la rutina del laboratorio de microbiología aporta grandes

mejoras, tanto en la práctica clínica como en la vigilancia de microorganismos
multirresistentes.

Respecto a la vigilancia, es una herramienta muy útil y precisa para la detección precoz de mecanismos de
resistencia y clones resistentes emergentes. Además, aporta conocimiento relevante sobre los eventos de
transmisión, tanto de clones como de elementos genéticos móviles que portan genes de resistencia, y mejo-
ra sustancialmente el estudio de brotes.

Así lo reconoció el ECDC que, en 2013, estableció como un objetivo prioritario la inclusión del tipado molecu-
lar en la vigilancia de enfermedades infecciosas en la Unión Europea (UE), estableciendo unas hojas de ruta
estratégicas sobre su implementación en patógenos prioritarios14.

La resistencia a antibióticos se consideró desde la fase inicial de esta iniciativa, con especial énfasis en su
aplicación al estudio de brotes transfronterizos25. Un estudio basado en WGS realizado en 13 países euro-
peos con cepas de K. pneumoniae co-productoras de las carbapenemasas NDM-1 y OXA-48 mostró hasta
15 grupos de transmisión multinacional no detectados anteriormente; en 10 de ellos había antecedentes
previos de viaje/hospitalización en países fuera de la UE25.

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La Red Europea de Vigilancia de Genes de Resistencia a los Antimicrobianos (EURGen-Net) es una red
para la vigilancia genómica de bacterias multirresistentes. Coordinada por el ECDC, incluye a los laboratorios
nacionales de referencia de 37 países. Su principal objetivo es la integración de la WGS en la vigilancia de la
resistencia y su actividad se estructura fundamentalmente en la vigilancia centinela basada en cortes tem-
porales orientada a objetivos concretos. Por ejemplo, el “Estudio europeo sobre enterobacterias resistentes
a antibióticos carbapenémicos y/o colistina” (CCRE-survey) se ha realizado durante seis meses (2019-2020)
combinando el análisis fenotípico con el análisis genómico basado en WGS de casi 6000 aislamientos en los
que se está analizando la filogenia, el resistoma, el viruloma y los plásmidos portadores de genes de resis-
tencia. España ha participado en el CCRE-survey con una subred nacional de 26 hospitales representantes
de las diferentes regiones geográficas.

A nivel nacional, en 2019 se creó la Red Española para la Vigilancia de los Microorganismos Resistentes
(RedLabRA), en el contexto del Plan Nacional contra la Resistencia a antibióticos (PRAN)26. Se trata de una red
de laboratorios de microbiología, coordinados e interconectados a nivel nacional, para trabajar coordinada-
mente en el estudio molecular de las infecciones causadas por microorganismos resistentes. Su actividad se
articula a diferentes niveles (figura 8); el último nivel o nivel 3 implica la caracterización de cepas representa-
tivas de todas las regiones geográficas mediante WGS que permita una mejor comprensión de la evolución
bacteriana, los brotes y los eventos de transmisión. Los principales retos para su plena implementación son
la necesidad de bases de datos compartidas, sistemas informáticos ágiles con plataformas interactivas e
implicación política para la dotación de recursos.

WGS

PCR/Secuenciiación Sanger
WGS

Métodos fenotípicos

Figura 8. Estructura de RedLabRA. La red incluye a todos los laboratorios del Sistema Nacional de Salud y se estruc-
tura en niveles: Lab. de Nivel 1, que garantizan la detección fenotípica de la resistencia; Lab. de Nivel 2, que realizan
una primera caracterización molecular a nivel de mecanismo y secuenciotipo (ST); y Lab. de Nivel 3, que coordina y
realiza análisis comparativos integrados mediante WGS de cepas representativas de cada comunidad autónoma.

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Actualización Módulo 5 La genómica y la bioinformática
sobre resistencias aplicada al estudio de las resistencias
a antimicrobianos microbianas

5 El

papel de la genómica en abordaje global de la resistencia a
antibióticos desde la inteligencia artificial

La disponibilidad de repositorios con gran número de secuencias genómicas de patógenos

permite utilizar aplicaciones de inteligencia artificial basadas en el aprendizaje automático
(AA) para luchar contra la resistencia a antibióticos.

Hay tres aspectos en los que el AA puede tener un papel trascendente en este campo:

• la predicción de fenotipos de resistencia a partir de datos genómicos,

• la caracterización de posibles dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevos fármacos
• y los sistemas de apoyo a las decisiones clínicas (administración de antimicrobianos) basadas en
el AA27.

Se trata de una disciplina joven, aún en desarrollo, pero que puede desempeñar un rol trascendente en la
implementación de la medicina de precisión contra la resistencia a antibióticos.

Los análisis de AA son capaces de integrar una gran variedad de datos (clínicos, de laboratorio, imágenes,
información de la historia clínica electrónica…) que permitan la elaboración de algoritmos predictivos para
guiar la toma de decisiones. En el caso de la resistencia a antibióticos, es clave la inclusión de datos de se-
cuencias genómicas bien clasificadas, así como de su sensibilidad a antibióticos, integradas en grandes bases
de datos que permitan su análisis conjunto con el resto de información clínica y analítica.

Algunos de los principales desafíos para el desarrollo de un sistema de medicina de

precisión contra la resistencia a antibióticos (tabla 2) son:

• la dificultad en la obtención de datos de calidad y con un mismo formato,

• la necesidad de un equipo multidisciplinar con personal tecnológico, bioinformático,

analítico, clínico y microbiológico

• y el objetivo final de obtener resultados sencillos y rápidos mediante plataformas

interactivas que permitan su implementación “point of care”.

Se está generando una gran cantidad de información mediante la WGS de colecciones de especies bacte-
rianas multirresistentes; los esfuerzos deben ir ahora dirigidos a la unificación de protocolos y formatos,
a potenciar la calidad de los datos y promover la clasificación de las secuencias disponibles junto con
su correlación con los fenotipos de sensibilidad a antimicrobianos y a tener registros comunes fácilmente
integrables en modelos de AA.

Por otra parte, la integración futura de la genómica del paciente/hospedador en estos modelos podría
facilitar la detección de marcadores genómicos humanos de predisposición a infecciones por determinadas
bacterias o clones multirresistentes. En esta línea, se han realizado algunos trabajos que muestran cómo
variantes genéticas relacionadas con la respuesta inmunitaria aumentan el riesgo de sufrir infección Myco-
bacterium tuberculosis28.

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Actualización Módulo 5 La genómica y la bioinformática
sobre resistencias aplicada al estudio de las resistencias
a antimicrobianos microbianas

Tabla 2. D
 esafíos en la implementación de un sistema de medicina de precisión contra la resistencia a antibióticos.
Se agrupan en las tres fases del proceso: 1) Obtención de datos para alimentar y entrenar el modelo, 2)
realización de los análisis de AA y 3) salida de datos o emisión de resultados.

Entrada de datos Integración. Análisis. Resultados.

Elaboración de algoritmos Recomendaciones clínicas

Dificultad en obtención de datos Necesidad de un equipo Obtención de resultados sencillos

de calidad: genómicos, analíticos, multidisciplinar: tecnológico, y rápidos mediante un interfaz
clínicos, PK/PD analítico, clínico y microbiológico amistoso (nivel usuario)

Necesidad de limpiar/curar los “Entrenamiento” continuo del Implementación point of care

datos. Eliminación de datos modelo. Necesidad de gran cantidad
erróneos. Mismo tipo de entradas/ de datos que puede variar en
formato función de la complejidad el par
bacteria/antibiótico

Necesidad de registros integrados Seleccionar los mejores modelos de Desarrollo de plataformas

de datos clínicos, microbiológicos, predicción de IA/AA interactivas
inmunológicos, epidemiológicos,
genómicos

Protección de datos y bioética Identificación de marcadores

Medidas de evaluación clínica

PK/PD: Farmacocinéticos/Farmacodinámicos. IA: Inteligencia artificial. AA: Aprendizaje automático.

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Actualización Módulo 5 La genómica y la bioinformática
sobre resistencias aplicada al estudio de las resistencias
a antimicrobianos microbianas

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