Actividad N° 07
INMUNIDAD ADAPTATIVA
Blgo. – Mblgo. Teresa Francisca Alayo Padilla
Trujillo, 05 de Octubre del 2022
[Link].
[Link]ísticas
3.Técnica de citometría
de flujo.
Concepto: Inducido por la exposición a
microorganismos y combate la infección
con una respuesta específica a la medida
del patógeno atacante en la forma de una
gran población de linfocitos B y T que de
manera específica reconocen al invasor.
2. Características:
➢Fenómeno de memoria inmunitaria,
➢Respuestas más rápidas y a menudo más
potentes, por lo que es activada por un
patógeno específico y las exposiciones
ulteriores a éste inducen a dichas respuestas.
➢El reconocimiento de los invasores es mediado
por anticuerpos y receptores de célula T, los
“sensores” de la inmunidad adaptativa. Estas
moléculas son producidas por genes con una
característica extraordinaria: experimentan
modificación y diversificación —recombinación
genética— en el hospedador para generar una
gigantesca población única de centinelas en busca
de invasores.
➢La inmunidad adaptativa complementa a
un sistema bien desarrollado de
inmunidad innata.
Atributo Inmunidad adaptativa
Tiempo de reacción Días
Especificidad Altamente específica; incluso discrimina diferencias mínimas
en la estructura molecular; reconoce detalles de la estructura
microbiana o no microbiana con alta especificidad
Diversidad Altamente diversa; un número enorme de receptores que
surgen por recombinación genética de los genes que codifican
receptores
Respuestas de memoria Memoria persistente; la respuesta a la infección ulterior es
más rápida y de mayor magnitud
Discriminación entre lo Muy buena; fallos ocasionales de la discriminación entre lo
propio y lo extraño propio y
lo extraño dan por resultado enfermedad autoinmunitaria
Componentes solubles de Anticuerpos.
sangre o líquidos tisulares
Principales tipos celulares Linfocitos T y B, células presentadoras de antígeno.
Inmunidad humoral y celular
Existen dos tipos de respuestas inmunitarias
adaptativas, llamadas inmunidad humoral e
inmunidad celular, en las que intervienen
componentes diferentes del sistema
inmunitario y que sirven para eliminar
microbios de distintos tipos.
La inmunidad humoral cuenta con unas moléculas presentes
en la sangre y en las secreciones mucosas, que reciben el nombre
de anticuerpos, producidas por los linfocitos B. Los anticuerpos
reconocen los antígenos microbianos, neutralizan la infecciosidad
de los microorganismos y los marcan para su eliminación por los
fagocitos y el sistema del complemento. La inmunidad humoral
es el principal mecanismo de defensa contra los microbios
extracelulares y sus toxinas (p. ej., en las luces de los sistemas
digestivo y respiratorio y en la sangre) debido a que los
anticuerpos secretados pueden unirse a ellos y contribuir a su
destrucción.
La inmunidad celular queda a cargo de los linfocitos T.
Muchos microbios son ingeridos por los fagocitos y
sobreviven en su interior, y algunos microbios, sobre todo
los virus, infectan a varias células del hospedador y se
replican en ellas. En estos lugares los microbios son
inaccesibles a los anticuerpos circulantes. La defensa
contra estas infecciones corresponde a la inmunidad
celular, que fomenta la destrucción de los
microorganismos residentes en los fagocitos o la
eliminación de las células infectadas para suprimir los
reservorios de la infección.
3. Técnica de citometría de flujo.
La citometría de flujo es una tecnología que permite
analizar y cuantificar de manera simultánea múltiples
características celulares a medida que son transportadas
en un fluido e incitadas por un haz de luz. El citómetro de
flujo mide el tamaño y la granularidad de la célula, así como
la fluorescencia relativa de la misma. Estas características
se determinan usando un sistema óptico acoplado a un
procedimiento electrónico que graba la manera en que la
célula dispersa el haz de luz y emite fluorescencia.
¿Cómo funciona el citómetro de flujo?
Un citómetro de flujo se encuentra
compuesto por tres principales sistemas, el
de fluidos, el óptico, y el electrónico.
Sistema de fluidos
Su principal función es alinear y transportar
a las células dentro de una cámara de flujo
hacia el haz de luz; por tanto, es necesario
que la muestra se encuentre suspendida en
un fluido. Para lograrlo, se aplica una
propiedad hidrodinámica, que consiste en
la inyección de la muestra en el centro de
una corriente de fluido envolvente, el cual
puede ser agua o un buffer de fosfatos. Lo
anterior se logra porque la presión de la
muestra es mayor que la presión del líquido
envolvente. Gracias a este sistema, las
células pueden ser alineadas en “fila india”,
y de esta manera se asegura que el haz de
luz incida sobre una célula a la vez.
Sistema óptico
El sistema óptico está compuesto por láseres y
filtros, que se encargan de iluminar a las células
y dirigir las señales resultantes hacia los
detectores apropiados. Las células, al ser
incididas por el láser, tendrán la capacidad de
dispersar la luz de acuerdo con su tamaño y su
granularidad. En caso de que la luz se disperse
frontalmente, se obtendrá un parámetro
denominado FSC (forward scatter), que indica
el tamaño de la célula. Por tal motivo, aquellas
células marcadas con fluorocromos serán
excitadas por el láser y la luz será dirigida hacia
un detector, el cual recibirá la longitud de onda
emitida por la excitación del fluorocromo.
Gracias a este sistema, se puede conocer el
tamaño y la granularidad de la célula, así como
las proteínas que se expresan (marcadores),
permitiendo así la identificación de diferentes
tipos celulares. A medida que el citómetro
posea más detectores, mayor será su
capacidad para identificar poblaciones
celulares.
Sistema electrónico
Una vez que la señal luminosa es generada cuando
el haz de luz incide en la célula, ésta debe traducirse
en señales electrónicas. El sistema electrónico
consta de sensores luminosos como fotodiodos y
fotomultiplicadores, que tienen la finalidad de
convertir los fotones en electrones y éstos, a su vez,
en corriente eléctrica. De este modo, la señal
eléctrica es recibida por la computadora y traducida
en gráficos e histogramas.
Anticuerpos monoclonales acoplados a fluorocromos
El marcaje celular con anticuerpos monoclonales acoplados a
fluorocromos, representa un paso crucial para la identificación de
subtipos celulares mediante el uso de la técnica de citometría de
flujo. Los anticuerpos monoclonales permiten detectar y “etiquetar”
poblaciones específicas de células. Esta tecnología consiste en la
creación de un anticuerpo que sea capaz de unirse a una estructura
específica (antígeno), mismo que se expresa en el tipo celular que
se requiere identificar. Adicionalmente, este anticuerpo debe
contener una unión covalente a un fluorocromo, que emitirá luz
fluorescente cuando sea excitado por el láser; de este modo, la
célula se “tiñe” y facilitará la identificación de las células que se
unieron al anticuerpo o marcador.
Análisis de resultados
Gráfico de puntos: Este gráfico muestra la relación
entre dos marcadores diferentes y muestra a cada punto
como un evento (se define como evento a cualquier
partícula que haya sido excitada por el láser). Por tal
motivo, el desplazamiento de los puntos hacia la
derecha indica la expresión de un marcador X, mientras
que el desplazamiento de los puntos hacia arriba,
muestra la expresión de un marcador Y.
Gráficos de densidad: Estos gráficos, además de
representar a las poblaciones con base en la
expresión de dos marcadores, muestran la frecuencia
relativa (densidad) de las poblaciones; por ejemplo,
las poblaciones con mayor número de eventos se
representan mediante tonos de gris más intenso
(gráfico de zebra), mediante colores cercanos al
naranja (gráfico pseudocolor), o mediante líneas
(gráfico de contornos).
Histogramas: Los histogramas muestran la
intensidad de expresión de un marcador versus
el número de eventos. El desplazamiento de la
curva hacia la derecha indica mayor expresión
del marcador, mientras que la altura del pico
indica la frecuencia de las células capturadas.
En este sentido, es importante recalcar que el
area bajo la curva contiene a las células que se
están analizando.
Gráficos 3D: Este tipo de gráficos permite
comparar a las poblaciones con respecto a la
expresión de tres marcadores diferentes y la
frecuencia relativa (Figura 7 B). Los
histogramas también pueden ser representados
en gráficos de 3D, lo que permite la
comparación de la expresión de dos
marcadores diferentes versus el número de
eventos.
Aplicaciones de la citometría de flujo
➢Por tratarse de una técnica de identificación y
cuantificación específica de células, la
citometría de flujo facilita el diagnóstico o
seguimiento de patologías como leucemias,
linfoma, inmunodeficiencia primaria, monitoreo
del estado hematológico de pacientes con
infección de VIH, así como la detección de
células cancerosas o tumorales.
➢Adicionalmente, esta herramienta permite analizar funciones
celulares como la proliferación, la fagocitosis y la apoptosis,
por mencionar algunas. En el mercado existen diversas
moléculas fluorescentes que se incorporan cuando las células
realizan este tipo de funciones. Por ejemplo, para determinar
la proliferación celular, las células pueden ser teñidas por
medio de una molécula fluorescente denominada éster de
succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE), la cual se incorpora
al interior de la célula, y ésta es diluida cuando la célula entra
en proliferación, es decir, la reducción en la fluorescencia de la
molécula indica mayor proliferación celular.
➢Por otra parte, la citometría de flujo también
permite identificar, caracterizar y separar
poblaciones celulares. Los equipos que
pueden realizar este trabajo se denominan
Cell Sorters.
➢En la clínica, esta técnica tiene una importante función en la
purificación de células que posteriormente serán transplantadas a
pacientes con ciertas patologías. Tal es el caso de la nueva terapia
aprobada por la FDA para tratar linfoma de linfocitos B, la cual
consiste en el transplante de linfocitos T con receptores de
antígeno modificados (CAR-T, por sus siglas en inglés). Este
proceso implica purificar los linfocitos T del paciente y modificarlos
genéticamente para expresar un receptor de superficie específico
para un antígeno de cáncer, que a su vez se encuentra fusionado
con un dominio proteico que activa al linfocito T. Posteriormente,
los linfocitos CAR-T se expanden y se reinfunden en el paciente
como una inmunoterapia para atacar a células cancerosas.
➢No se limita al estudio de células, pues por
medio de esta técnica también se puede
conocer la cantidad de RNA o DNA que posee
una célula, lo cual tiene una alta aplicación en
el pronóstico de diversos tipos de cáncer.
➢Actualmente, la citometría de flujo es una
poderosa herramienta para el diagnóstico,
clasificación y determinación del pronóstico de
diversas enfermedades.
Citometría de flujo explicada en 5
procesos
“No es solo saber usar el hardware y el software,
sino responsabilizarse de todos los pasos desde
que se diseña el experimento hasta que se
presentan los resultados”
Preparar las muestras: Tratar las
muestras apropiadamente y mantenerlas
hasta su procedimiento. No es solo seguir
un protocolo, es ser exquisito en la
preparación del mismo. Los mayores
problemas pueden venir de no tener en
cuenta que las células que estudiamos
tienen tendencia a adherirse entre ellas.
Optimizar los ajustes: Consiste en tener
preparados los controles necesarios, crear una
plantilla apropiada, seguir el diagrama de flujo
de la imagen y guardar los cambios. No es
difícil si se sabe lo que se está haciendo y para
qué. No siempre las poblaciones se van a
comportar como en las representaciones de los
libros y hay que entender qué se está viendo.
Adquirir las muestras: Hay que tener claro el orden en el que
las muestras van a ser adquiridas, de nada sirven resultados sin
identificar. No se pueden cambiar los ajustes en medio de la
adquisición, impide la correcta comparación con los controles y
por lo tanto lleva a errores en la interpretación de los resultados.
Desde otro punto de vista, se pueden ahorrar muchos
problemas agitando ligeramente las muestras antes de
colocarlas en el citómetro; pero es importante ajustar el número
de muestras a la experiencia del operador: Hay que trabajar
rápido, generalmente en frío y en obscuridad. El tiempo aglutina
las células, la temperatura provoca uniones inespecíficas y la
luz reduce la emisión de fluorescencia.
Interpretar los resultados: Si los tres procesos
anteriores -preparar, ajustar y adquirir- se han
realizado correctamente, interpretar los
resultados solo depende del investigador que lo
haga y como los relacione, ya que estos son
precisos y reproducibles.
Presentar los resultados: Es obvio que hay que
representar los resultados en la forma que mejor se puedan
interpretar por el lector. Presentar justo las necesarias,
normalmente el control negativo y el problema: Se
presupone que la técnica y los ajustes están bien hechos,
no hay que demostrarlo. Solo en el caso de que el ensayo
se presente por primera vez, podría ser conveniente incluir
los controles positivos para demostrar que la técnica en sí
es factible.
TAREA
Elabora organizador visual
de los temas desarrollados
en clase.
Muchas gracias por su atención mis
estimadas jóvenes estudiantes.
Atte.:
Prof. Teresa Alayo Padilla.