CROMATOGRAFÍA
INTRODUCCIÓN
La cromatografía es una técnica que permite la separación de los
componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos
contrapuestos.
a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por
una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado
a un soporte sólido.
b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla
por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.
El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo
largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre
de elución. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaría,
mientras que la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes
de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus
interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma
que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la
fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son
fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el
flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como
consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se
separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o
cuantitativamente.
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase
móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía
a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y
la móvil un líquido.
b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido
anclado a un soporte sólido.
c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no
volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.
d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la
móvil un gas.
Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes
de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre.
a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un
sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la
mezcla mediante interacciones de tipo polar.
b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las
diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla
en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.
c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria
es un sólido que lleva anclados grupos funcionales
ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos
iones presentes en la fase móvil.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
La adsorción es la propiedad que tienen ciertos sólidos de aumentar
la concentración en su superficie de otras sustancias. La separación se debe
a las diferencias de adsorción de los componentes de una mezcla sobre la
fase estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un sólido polar de gran
superficie (adsorbente). La fase móvil puede ser un gas o un líquido dando
lugar a la cromatografía gas-sólido (CGS) o líquido-sólido (CLS).
El grado de adsorción varía según la naturaleza y superficie
específica de los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre
moléculas adsorbidas y el adsorbente han de ser débiles para que su fijación
sea reversible, las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares
(interacciones dipolo-dipolo o puentes de hidrógeno). Como regla general,
las polaridades del adsorbente y de los solutos han de ser opuestas.
Cromatografía líquido-sólido (CLS).
La fase estacionaria está constituida por un sólido polar poroso y que
esta finamente granulado. La superficie específica contiene centros polares
aptos para la adsorción de las moléculas polares presentes en la fase móvil.
Al disminuir el tamaño de las partículas, el número de centros activos por
unida es mayor, y la capacidad de adsorción se incrementa. El adsorbente
más utilizado es gel de sílice aunque también se emplea alúmina activada.
En el caso del gel de sílice la interacción se establece entre los grupos Si-
OH y Si-O-Si, y los grupos funcionales polares de los compuestos
orgánicos.
La fase móvil está constituida por un disolvente en el que los
componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La
velocidad de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la
polaridad de la fase móvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad
aumentando con el tiempo la proporción del disolvente más polar.
Propiedades de los disolventes más comunes.
Disolvente Fórmula química Punto de Constante Densidad
ebullición dieléctrica
Disolvente s no polares
Hexano CH3-(CH2)4-CH3 69 °C 2,0 0,655 g/ml
Benceno C6H6 80 °C 2,3 0,879 g/ml
Tolueno C6H5-CH3 111 °C 2,4 0,867 g/ml
Éter dietílico CH3CH2-O-CH2-CH3 35 °C 4,3 0,713 g/ml
Cloroformo CHCl3 61 °C 4,8 1,498 g/ml
Acetato de etilo CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 77 °C 6,0 0,894 g/ml
Disolventes p olares apróticos
1,4-Dioxano CH2-CH2-O-CH2-CH2-O 101 °C 2,3 1,033 g/ml
Tetrahidrofurano (THF) CH2-CH2-O-CH2-CH2 66 °C 7,5 0,886 g/ml
Diclorometano (DCM) CH2Cl2 40 °C 9,1 1,326 g/ml
Acetona CH3-C(=O)-CH3 56 °C 21 0,786 g/ml
Acetonitrilo (MeCN) CH3-C≡N 82 °C 37 0,786 g/ml
Dimetilformamida H-C(=O)N(CH3)2 153 °C 38 0,944 g/ml
(DMF)
Dimetil sulfóxido CH3-S(=O)-CH3 189 °C 47 1,092 g/ml
(DMSO)
Disolventes p olares próticos
Ácido acético CH3-C(=O)OH 118 °C 6,2 1,049 g/ml
n-Butanol CH3-CH2-CH2-CH2-OH 118 °C 18 0,810 g/ml
Isopropanol (IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 °C 18 0,785 g/ml
n-Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 °C 20 0,803 g/ml
Etanol CH3-CH2-OH 79 °C 24 0,789 g/ml
Metanol CH3-OH 65 °C 33 0,791 g/ml
Ácido fórmico H-C(=O)OH 100 °C 58 1,21 g/ml
Agua H-O-H 100 °C 82 1,000 g
La retención se realiza en base a la competencia que se establece
entre el soluto a separar (S) y las moléculas de la fase móvil (M) por
adsorberse a los centros activos polares (X) de la fase estacionaria. Así las
moléculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria
y van siendo desplazados por las moléculas polares presentes en la fase
móvil.
Los tiempos de retención y la selectividad en la separación
dependerán de la polaridad de los compuestos a separar (S), la naturaleza
del adsorbente (X) y la naturaleza de los disolventes que componen la fase
móvil (M).
Cromatografía en capa fina.
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa,
uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de
vidrio, aluminio u otro soporte. La fase móvil es líquida y la fase
estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente
polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria,
de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán
los menos polares.
La mezcla a analizar se deposita a una pequeña distancia del borde
inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase móvil,
que asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los
componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su
separación. Cuando el frente del disolvente se encuentra próximo al
extremo superior de la placa esta se saca y se visualiza.
La relación entre la distancia recorrida por un compuesto y por el
disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor).
Rf= Distancia recorrida por el compuesto
Distancia recorrida por el disolvente
La búsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de
diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se
desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como
el hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de
hexano y acetato de etilo.
La mayoría de las placas de cromatografía llevan un indicador
fluorescente que permite la visualización de los componentes activos a la
luz ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la
luz ultravioleta, la visualización requiere utilizar un agente revelador. El
revelador reacciona con los productos proporcionando productos
coloreados.
Cromatografía preparativa en placa.
La cromatografía preparativa se lleva a cabo en placas de gel de
sílice de 1-2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Se utiliza para la
separación y aislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades
comprendidas entre 100-200 mg.
En la superficie del adsorbente (gel de sílice), mediante una pipeta
Pasteur, se traza una línea continua con la muestra disuelta y se introduce la
placa en posición vertical en una cubeta. Durante la elución debe
permanecer tapada para evitar la evaporación del disolvente. Una vez se
han separado los productos que componen la muestra, se marca con una
cuchilla el contorno del compuesto a aislar y con ayuda de una espátula se
desprende del soporte de vidrio el gel de sílice con el compuesto adsorbido.
Una vez transferido a un erlenmeyer se añade un disolvente en el cual sea
soluble el producto, se filtra el gel de sílice y una vez eliminado el
disolvente tenemos el producto puro.
Chromatotron.
Cromatografía en columna.
Es el método más utilizado para la separación de compuestos
orgánico a escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior
de una columna de vidrio que termina con una placa porosa que impide su
paso y en un estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la
parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa el
sistema. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se
recogen en fracciones, los más polares quedan más retenidos y para que
salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El
tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de
retención.
El adsorbente más utilizado para cromatografía de columna es gel de
sílice, aunque también se puede emplear alúmina y florisil. La elución de la
cromatografía puede realizarse por gravedad o mediante presión
(Flash chromatography), la diferencia en ambos casos está en el
tamaño de las partículas de gel de sílice (0,063-0,200 nm, sílice de
columna, 0,040-0,063 nm, sílice flash). Debido a que la disminución
del tamaño de las partículas de adsorbente conduce a una separación
más eficaz, la cromatografía a media presión (flash) proporciona
mejores resultados, además de ser más rápida.
Las variables que más influyen en la eficacia de la separación
en cromatografía de columna y utilizando gel de sílice como
adsorbente son las siguientes;
a) Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice. La
altura del adsorbente está relacionada con la diferencia de
Rf de los componentes de la mezcla. El diámetro de la
columna con la cantidad de producto a separar.
b) Elección del disolvente. El disolvente tienen que conducir
a una buena separación de los componentes de la mezcla
en capa fina, utilizándose en muchos casos mezclas de
disolventes y se realiza una elución en gradiente. Una de
las mezclas más utilizadas es hexano/acetato de etilo.
Cromatografía en papel.
Es la más sencilla de las técnicas, pero sólo nos dará
resultados cualitativos. Está casi en desuso. El método se basa en un
mecanismo de reparto, y consiste en depositar una pequeña cantidad
de muestra en el extremo de una tira de papel de filtro, que se deja
evaporar. Luego se introduce la tira en una cubeta que contenga el
disolvente, de manera que éste fluya por la tira por capilaridad.
Cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al
extremo, se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue
adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas
de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color
propio el papel se somete a procesos de revelado.
Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz:
la elección del disolvente y la del papel de filtro.
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN.
La cromatografía líquido-líquido, también llamada de partición se
caracteriza por emplear una fase estacionaria líquida, anclada a un soporte
sólido, y una fase móvil también líquida. El soporte sólido por lo general es
gel de sílice, sobre cuya superficie se ha anclado una fase líquida con la
incorporación de una cadena hidrocarbonada larga, mediante la
transformación de los grupos silanol (Si-OH) de la gel de sílice en grupos
siloxano (Si-O-Si-R), lo que proporciona una fase líquida estacionaria
térmicamente estable y difícil de hidrolizar en condiciones normales.
Tabla. Cadenas hidrocarbonadas ancladas a la gel de sílice en
cromatografía líquido-líquido.
Funcionalidad Estructura Polaridad Tipo
Diamino -(CH2)3-NH(CH2)2-NH2 Muy alta Normal
Aminopropilo -(CH2)3-NH2 Alta Normal
Nitrilo -(CH2)n-CN Media Normal
Nitro -(CH2)n-NO2 Media Normal
Diol (CH2)3-OCH2-CH(OH)-CH2OH Débil Normal
Dimetilamino -(CH2)3-N(CH3)2 Débil Normal
Propilo -(CH2)2-CH3 Baja Inversa
Fenilo -(CH2)n-Ph Baja Inversa
Octilo -(CH2)7-CH3 Baja Inversa
Octadecilo -(CH2)17-CH3 Muy baja Inversa
La polaridad de la fase estacionaria puede modificarse en
función de la naturaleza de las cadenas hidrocarbonadas
introducidas en la gel de sílice, lo que permite disponer de fases
estacionarias con selectividad diferente. La separación en la
cromatografía líquido-líquido se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de la mezcla entre las dos fases líquida o en las
diferentes interacciones de los componentes de la mezcla con los
grupos funcionales presentes en la cadena enlazada al gel de sílice.
En función de la polaridad de la fase líquida estacionaria, se
distingue entre:
a) Cromatografía en fase normal. La fase estacionaria está
constituida por un líquido de carácter polar. Como fase móvil se
emplean mezclas de disolventes apolares (hexano, pentano), con
disolventes polares (cloroformo, diclorometano, T.H.F., etanol,
metanol o acetonitrilo). Se utiliza para la separación de
compuestos muy polares que quedarían demasiado retenidos en
una cromatografía sólido-líquido. En este tipo de cromatografía
el orden de elución está gobernado por interacciones de tipo
polar: los solutos más polares quedan más retenidos, igual que en
la cromatografía de adsorción.
b) Cromatografía en fase reversa. La fase estacionaria está
constituida por un líquido de carácter apolar. Como fase móvil se
emplean mezclas de agua con disolventes polares miscibles,
como metanol o acetonitrilo siendo la fase móvil más polar que
la fase estacionaria. Se emplea para la separación de mezclas de
compuestos de polaridad baja, que se retienen muy poco en una
cromatografía sólido-líquido, y para la separación de compuestos
de una misma serie homóloga. La retención se explica en base a
una adsorción preferencial del disolvente menos polar de la fase
móvil a la superficie de las cadenas apolares que constituyen la
fase estacionaria, de manera que se establece un mecanismo
complejo que supone una combinación de equilibrios de
solubilidad (partición) de la mezcla que se cromatografía entre la
fase líquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase móvil.
La separación ocurre como consecuencia de las diferencias en la
superficie apolar de los componentes de la muestra, los
compuestos menos polares serán más solubles en la fase
estacionaria que los más polares. Por tanto, al contrario que en la
fase normal, los compuestos más polares estarán menos
retenidos que los menos polares. Los tiempos de retención
disminuyen cuando menor sea la proporción de agua, cuando
menos polar sea el disolvente empleado.
Cromatografía de intercambio iónico.
La cromatografía de intercambio iónico (cromatografía
iónica) es un proceso que permite la separación de iones y
moléculas polares basado en las propiedades de carga de las
moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula
cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y
aminoácidos. La solución que se inyecta es usualmente llamada
muestra y los componentes separados individualmente son llamados
analitos. Es usada a menudo en purificación de proteínas, análisis de
agua o control de calidad.
La fase estacionaria (resina de intercambio) muestra en la
superficie grupos funcionales iónicos que interactúan con iones de
carga opuesta. Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en la
cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de
intercambio aniónico:
La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes
cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un
grupo funcional cargado negativamente (SO3-, CO2-). Las resinas
cuyo grupo funcional activo es un sulfonato (SO3-) se consideran
resinas intercambiadoras ácidas fuertes, mientras que aquéllas cuyo
grupo funcional activo es un ión carboxilato (CO2-) se consideran
resinas ácidas débiles.
R-A-H+ + M+ + B- <--> R-A-M+ + H+ + B-
La cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones
usando grupos funcionales cargados positivamente, como un catión
de amonio cuaternario (R4N+).
R4-N+L- + M+ + B- <--> R4-N+B- + L- + M+
R-H++ M+<--> R-M++ H+ Kd= [M+]R[H+] / [M+] [H+]R
Este tipo de cromatografía se basa en el equilibrio de
intercambio iónico entre una fase sólida que contiene grupos
sulfónicos o carboxílicos (para la separación de cationes) o grupos
amino cuaternarios, ternarios o secundarios (para la separación de
aniones) y los iones presentes en la fase móvil. Por ejemplo, para la
separación de cationes se puede utilizar una resina de ácido débil
donde se producirá el siguiente equilibrio:
R-CO2H + M+ R-CO2M + H+
En este caso, el catión M + puede ser eluido de la columna por
un ácido fuerte en una concentración capaz de desplazar el
equilibrio representado en la ecuación anterior hacia la izquierda. El
desarrollo de esta técnica al estado de cromatografía de alta
resolución, llamada cromatografía iónica, fue posible a partir de la
década del 70 cuando se desarrollaron recubrimientos que contienen
los materiales típicos para el intercambio (grupos sulfónicos para
cromatografía catiónica y grupos aminos cuaternario para
cromatografía aniónica). Estos recubrimientos se depositan sobre
pequeñas esferas de sílice, vidrio o de algún polímero que son
capaces de soportar las altas presiones comúnmente utilizadas en
cromatografía líquida de alta resolución.
PRÁCTICA DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
En todo procedimiento en química orgánica reconocemos las
etapas que se muestran en el siguiente esquema para el aislamiento
y caracterización de los productos orgánicos.
Esquema: Esquema general de las etapas de aislamiento y
purificación de los productos preparados en un proceso sintético en
química orgánica
A+B C+D
Otros
Reactivos Mezcla de reacción
Productos de reacción Purificación Caracterización
Extracción Separación Cristalización Pf
cromatográfica Destilación Peb
RMN
Una vez ha concluido la reacción, la mezcla resultante se
extrae para separar los sustratos que nos interesan. A continuación
la mezcla obtenida, que generalmente es el producto de reacción,
productos secundarios, reactivos y/o algo del producto de partida, se
separa por cromatografía de columna. Finalmente los productos,
para caracterizarlos correctamente, y por regla general, requieren de
una purificación adicional que se lleva a cabo mediante otra
cromatografía más cuidadosa y/o cristalizaciones-destilaciones,
según el caso.
En ocasiones y por necesidades de tiempo en los laboratorios
de prácticas no se lleva a cabo la separación cromatográfica, aunque
sea una operación necesaria en el trabajo de síntesis, como hemos
indicado en párrafos anteriores. Por esta razón hemos considerado
oportuno incluirla como ejemplo en un curso introductoria, de esta
manera damos una visión real del trabajo sintético en química
orgánica.
En esta experiencia se propondrá la separación de los
componentes de una mezcla hipotética de reacción por
cromatografía de columna. Las mezclas estarán constituidas
realmente por dos sustancias. Por ello, y como en casos anteriores,
se sugiere tener conocimiento de las características de los sustratos
antes de comenzar.
Las mezclas estarán constituidas por 0.2 g de cada uno de los
productos y antes de proceder a su separación habrá que decidir
eluyente más adecuado para poder desarrollar una separación
aceptable.
Procedimiento general
Para el proceso de separación-purificación por cromatografía de
columna se siguen los siguientes pasos:
A) Se sujeta la columna a un soporte y se rellena con la fase estacionaria
en forma de papilla o en seco según se nos indique.
B) Opcionalmente se puede añadir arena hasta obtener una franja de
unos 2-5 mm de espesor, para proteger el frente de la fase estacionaria.
C) Se deposita la muestra en disolución o adherida a una pequeña
cantidad de adsorbente sobre la arena, procurando tener una franja
horizontal.
D) Opcionalmente se puede poner otra franja de arena como la primera
o un poco de lana de vidrio.
E) Añadir la fase móvil con cuidado por la pared de la columna hasta
llenarla.
F) Los componentes
continuo de disolvente.
G) Las fraccio
cromatográfica analítica: cromatografía
de capa fina para comprobar su contenido
y pureza. Las fracciones que tengan
semejante contenido se juntan en el
mismo matraz, previamente pesado y
el disolvente se elimina en el rotavapor.