Universidad Técnica Privada Cosmos

Carrera Bioquímica y Farmacia

Determinación de fosfatasa alcalina (ALP)

Autores: Carmen Villca Apaza

Asignatura: Análisis clínico

Docente: Dr. Nelson Vargas

Fecha de entrega: 16 de noviembre 2025

El Alto – Bolivia

2025
Introducción

La presente introducción establece el contexto y la relevancia de la

determinación de la actividad de la enzima Fosfatasa Alcalina (ALP), una
práctica fundamental en el laboratorio de análisis clínicos.

La ALP (EC [Link]) es una metaloezima clave cuya actividad sérica sirve como
un biomarcador diagnóstico esencial, particularmente en la evaluación de
patologías del hígado y del hueso. Niveles elevados de ALP son indicadores
cruciales de colestasis (obstrucción biliar) y de aumento de la actividad
osteoblástica (regeneración o destrucción ósea acelerada).

La determinación se realiza mediante un método cinético colorimétrico, el cual

mide la velocidad de formación de un producto coloreado (p-nitrofenol) a partir
de un sustrato (p-nitrofenilfosfato) en condiciones controladas (pH alcalino y
temperatura de 37°C).

Este informe detalla la metodología empleada para cuantificar la actividad de la

ALP y, de manera crucial, presenta el análisis de los resultados del Control de
Calidad Interno. El uso del Gráfico de Levey-Jennings y la evaluación de los
parámetros estadísticos (Media, Desviación Estándar y Coeficiente de Variación)
son indispensables para asegurar la precisión y confiabilidad de los resultados
reportados, garantizando así la calidad analítica del proceso.

El objetivo final de este ejercicio es aplicar y evaluar de forma crítica la técnica

analítica y los sistemas de control para la correcta expresión de la actividad
enzimática en Unidades Internacionales por Litro (U/L).
Objetivo

Determinar la actividad enzimática de la Fosfatasa Alcalina (ALP) en muestras

de suero sanguíneo utilizando un método cinético colorimétrico, y evaluar la
calidad analítica del proceso mediante el análisis de la gráfica de Levey-
Jennings y los parámetros estadísticos obtenidos.

Objetivos específicos:

 Aplicar la metodología de determinación de ALP siguiendo el

procedimiento estándar de laboratorio de análisis clínicos.
 Calcular la actividad enzimática de la ALP y expresar los resultados en
Unidades Internacionales por Litro (U/L) aplicando el factor de conversión
correspondiente.
 Analizar e interpretar los datos estadísticos de Media, Desviación
Estándar (DE) y Coeficiente de Variación (CV).

Marco teórico
Definición y Bioquímica de la Fosfatasa Alcalina
La Fosfatasa Alcalina (ALP), clasificada como una hidrolasa (EC [Link]), es una enzima clave
que cataliza la hidrólisis de ésteres de fosfato orgánicos liberando un grupo fosfato
inorgánico en un medio alcalino con un pH óptimo

La ALP es una metaloenzima que requiere iones de Magnesio (Mg^2+) y Zinc

(Zn^2+) como cofactores para su actividad óptima. Es una enzima de membrana,
predominante en la superficie celular de varios tejidos, lo que explica su liberación a la
circulación en estados patológicos que afectan la integridad de estas células.

Distribución Tisular e Isoenzimas

La ALP no es una entidad molecular única; existe como un grupo de isoenzimas (formas
con la misma función catalítica pero diferente estructura primaria y origen tisular) que
varían en su composición de carbohidratos. Las isoenzimas más importantes desde el
punto de vista clínico incluyen:

 Isoenzima Hepática (ALP-1): Producida por los hepatocitos. Su aumento en suero

es el principal indicador de colestasis (obstrucción o alteración del flujo biliar).
 Isoenzima Ósea (ALP-2): Producida por los osteoblastos. Es un marcador sensible
de la actividad de formación ósea y se eleva en trastornos metabólicos del hueso,
fracturas y durante el crecimiento normal en la infancia y adolescencia.
 Isoenzima Intestinal: Producida por el epitelio intestinal. Suele elevarse
ligeramente después de las comidas grasas y es genéticamente determinada.
 Isoenzima Placentaria: Presente durante el embarazo (a partir del segundo y
tercer trimestre).
 Otras Isoenzimas: Como la ALP renal y la isoenzima Regan (asociada a ciertos
tumores).

3. Significado Clínico de la Determinación de ALP

La medición de la actividad de ALP en suero es una prueba diagnóstica esencial en la

medicina.

Aumentos Significativos (Hiperfosfatasemia)

1. Enfermedades Hepáticas (Colestasis): Es el indicador más sensible de

obstrucción del flujo biliar (intrahepática o extrahepática). En estas condiciones,
los ácidos biliares solubilizan la ALP de la membrana canalicular hepática y la
liberan al torrente sanguíneo.
o Ejemplos: Cirrosis biliar primaria, colangitis, coledocolitiasis, obstrucción
por tumores.
2. Enfermedades Óseas: Refleja una mayor actividad osteoblástica.
o Ejemplos: Enfermedad de Paget (aumento masivo), osteomalacia,
raquitismo, hiperparatiroidismo primario, y metástasis óseas.
3. Estados Fisiológicos: El aumento es normal durante el tercer trimestre del
embarazo (ALP placentaria) y en los niños y adolescentes (crecimiento óseo
activo).
Disminuciones (Hipofosfatasemia)

Es una condición rara, asociada principalmente a la Hipofosfatasia, un trastorno genético

caracterizado por la mineralización defectuosa de huesos y dientes.

4. Fundamento del Método Analítico: Método Cinético (DGKC)

El método más utilizado universalmente para medir la ALP es el método cinético basado
en el sustrato p-nitrofenilfosfato (PNPP), recomendado por la Sociedad Alemana de
Química Clínica (DGKC).

Principio de la Reacción:

La ALP cataliza la hidrólisis del PNPP en presencia del buffer

Dietanolamina o AMP a un pH alcalino ($ \text{pH} \approx 10$).

El p-nitrofenol (PNP) es un compuesto que posee un color amarillo intenso

en medio alcalino. La velocidad con la que se forma el PNP es
directamente proporcional a la concentración de la enzima activa en la
muestra.

Medición y Cálculo:

La formación de PNP se monitorea continuamente (cinéticamente)

mediante un fotómetro o autoanalizador a una longitud de onda de 405 \
text{ nm}, la longitud de onda de máxima absorción del PNP.

* Se mide el cambio de absorbancia por minuto (\Delta A/min) durante la

fase lineal de la reacción.

* La actividad enzimática se calcula utilizando la Ley de Beer-Lambert y el

coeficiente de extinción molar (\epsilon) del p-nitrofenol.

Donde la actividad se expresa en Unidades Internacionales por Litro (U/L),

que representa la cantidad de enzima que convierte 1 micromol de sustrato
por minuto bajo condiciones estandarizadas.

Cálculo del Factor de Conversión:

Si se utilizan las condiciones estandarizadas de 37^\circ \text{C}, un

coeficiente de extinción molar (\epsilon) para el PNP de 18.5 \times 10^3 \, L
\cdot mol^{-1} \cdot cm^{-1} (a 405 \text{ nm}), una longitud de paso de 1 \
text{ cm}, y un \text{volumen total} volumen de muestra} constante, se
obtiene un Factor (F):

5. Control de Calidad Analítico: Estadística y Gráfico de Levey-Jennings

La precisión de la determinación se evalúa mediante el control de calidad
interno, utilizando un material de control con valor conocido.

A. Parámetros Estadísticos

* Media (\bar{x}): Es el promedio de todas las mediciones del control.

Representa la exactitud de la prueba (si el valor \bar{x} coincide con el
valor de referencia del control).

* Desviación Estándar (DE o s): Mide la dispersión de los datos alrededor

de la media. Es el principal indicador de la precisión del método.

* Coeficiente de Variación (CV): Expresa la desviación estándar como un

porcentaje de la media, lo que permite comparar la precisión entre
diferentes ensayos. Un CV más bajo indica mayor precisión.

* Nota: Para ensayos enzimáticos como la ALP, un CV ideal debe ser

inferior al 5-8\%.

B. Gráfico de Levey-Jennings

Es la herramienta gráfica fundamental para el monitoreo de la calidad.

* Construcción: Se grafican los valores obtenidos para el control (eje Y)

contra el número de la medición (eje X). Se trazan líneas horizontales para
la Media (\bar{x}), \pm 1\text{DE}, \pm 2\text{DE} y \pm 3\text{DE}.

* Interpretación: Permite la detección visual de errores:

* Error Aleatorio: Se identifica por una dispersión amplia de los puntos o

por puntos aislados que caen fuera de los límites de \pm 2\text{DE} o \pm
3\text{DE} (ej. error de pipeteo, burbujas).

* Error Sistemático: Se manifiesta como una tendencia (seis o más

puntos consecutivos subiendo o bajando) o un shift (cambio brusco y
sostenido de la media, seis o más puntos consecutivos a un solo lado de la
media). Indica un problema constante, como un reactivo deteriorado o una
calibración errónea.
Materiales:

Materiales y Reactivos

La determinación se llevó a cabo utilizando el siguiente equipamiento y

consumibles de laboratorio, junto con los reactivos específicos necesarios para
la reacción de la Cianometahemoglobina.

Equipos y Materiales
Categoría Material/Equipo Función en el
Procedimiento
Cuantificación Espectrofotómetro Instrumento esencial
para medir la
Absorbancia (A) de
las soluciones a la
longitud de onda de
540 nm.
Contención Cubetas de Vidrio Recipientes
o Cuarzo ópticamente estables
para la lectura de las
muestras en el
espectrofotómetro.
Volumetría Pipetas de Utilizadas para la
Volumen Variable medición y
transferencia precisa
de pequeños
volúmenes de
muestra, patrón y
reactivo (70 mu 100
mu 2.5 ml, 10.0 ml).
Reacción Tubos de Ensayo Recipientes donde
o Microtubos se mezclaron y se
incubaron las
soluciones para la
reacción
colorimétrica.
Control Baño María o Mantuvo la
Estufa temperatura
constante (20-25∘C)
durante el tiempo de
incubación
 (20 minutos).
Auxiliar Agitador Vórtex Aseguró la mezcla
rápida y homogénea
de los componentes
en los tubos de
reacción.
Reactivos

Reactivo Componentes Clave y Función Observaciones

Toxicológicas
Reactivo de Contiene Ferricianuro de Extremadamente
Drabkin (o Potasio (K3Fe(CN)6) para oxidar tóxico. Requiere
similar) la Hb, y Cianuro de Potasio manipulación estricta
(KCN) para formar el complejo bajo vitrina de gases y
coloreado de HiFe3+CN−. desecho seguro debido a
la presencia de cianuro.
Agua Solvente utilizado para preparar Debe ser de alta pureza
Destilada o las diluciones y para la para evitar interferencias
Desionizada preparación del Reactivo de en la absorbancia.
(H2O d) Drabkin de trabajo. Actúa como
solución para el Blanco de
Reactivo.
Solución Solución acuosa de Esencial para la
Patrón Cianometahemoglobina con una calibración del método,
(Standard) concentración conocida ypermitiendo la conversión
certificada. de absorbancia a
concentración.
Muestra Muestra de interés (usualmente La matriz biológica debe
Biológica sangre total anticoagulada con ser tratada siguiendo los
(Px) EDTA) donde se desea protocolos de
cuantificar el analito. bioseguridad.

Procedimiento experimental

El procedimiento se basó en la metodología espectrofotométrica colorimétrica

para la determinación de la concentración mediante la formación del complejo
cianometahemoglobina (HiFe3+CN−).

1. Preparación del Reactivo de Trabajo (Drabkin):

 oSe midieron y mezclaron 27.0 ml de agua destilada (H2O d) con
3.0 ml del Reactivo de Drabkin concentrado para obtener el
volumen necesario del reactivo de trabajo.
2. Preparación de la Dilución del Patrón (R St):
o Se tomaron 2.5 ml de la Solución Patrón concentrada.
o Se adicionaron 10.0 ml de agua destilada (H2O d).
o Esta mezcla constituyó una dilución 1:5 del Patrón inicial.
3. Preparación de la Dilución de la Muestra (Px):
o Se midieron 2.5 ml de la Muestra Problema (Px)
(presumiblemente sangre total).
o Se adicionaron 7.0 ml de agua destilada a la muestra.

Reacción Colorimétrica e Incubación

1. Preparación de los Tubos: Se prepararon los siguientes tubos de

ensayo para la reacción química, asegurando la mezcla completa de los
componentes:

Tubo Reactivo Solución Propósito

Añadida
Blanco 1.0 ml 70 mu l de H2 Calibración del cero del
(B) Od espectrofotómetro (compensación del
reactivo).
Patrón 1.0 ml 70 mu l del Formación de HiFe3+CN− a una
(P) Patrón Diluido concentración conocida para la
calibración.
Muestra 1.0 ml 70 mu l de la Formación del cromóforo a partir del
(Px) Muestra analito presente en la muestra
Diluida problema.

Resultados y Cálculos

La cuantificación de la muestra problema (Px) se realizó mediante la técnica

espectrofotométrica de la Cianometahemoglobina. Los resultados se basan en el
promedio de las lecturas de absorbancia (A) de las réplicas y en la aplicación del
factor de calibración (FC) obtenido a partir del Patrón (Standard).

Lecturas de Absorbancia (A540 nm)

Se registraron las siguientes lecturas de absorbancia para las muestras Patrón y

Problema:

Muestra/Tubo Curva 1 Curva 1 Curva 2

(Patrón) (Edwin) (Ghesha/Kevin)
 Blanco 0.005 0.090 0.000
Tubo 1 0.698 0.503 0.625
Tubo 2 0.694 0.446 0.580
Tubo 3 0.746 0.394 0.695
Promedio (A) 0.713 0.448 0.633
Concentración de la 25.40 19.97 23.23 (Promedio)
Imagen (Promedio) (Promedio)

Cálculo del Factor de Calibración (FC)

El factor de calibración se utiliza para convertir la absorbancia directamente a

concentración. Se calcula con base en los datos de la curva Patrón (Curva 1):

 Absorbancia del Patrón Corregida (APatroˊn): 0.713−0.005=0.708

 Concentración del Patrón (CPatroˊn): 325.3+23.3+27.6=25.40 unidades
 Fórmula del Factor de Calibración (FC):

FC=APatroˊnCPatroˊn

FC=0.70825.40≈35.876

Concentración de las Muestras Problema

La concentración de cada muestra se calculó utilizando la fórmula general:

CMuestra=(AMuestra−ABlanco)×FC×Factor de Dilucioˊn Total

Nota: Asumiremos un Factor de Dilución Total de 1.0 ya que la concentración

del Patrón reportada en la imagen no indica que se haya aplicado una corrección
por dilución.

1. Muestra Edwin (Curva 1)

1. Absorbancia Promedio Corregida (AEdwin):

AEdwin=0.448−0.090=0.358

2. Concentración Final (CEdwin):

CEdwin=0.358×35.876

CEdwin≈12.84 unidades
2. Muestra Ghesha (Curva 2)

1. Absorbancia Promedio Corregida (AGhesha):

AGhesha=0.633−0.000=0.633

2. Concentración Final (CGhesha):

CGhesha=0.633×35.876

CGhesha≈22.71 unidades

3. Muestra Kevin (Curva 2)

Se asume que Kevin corresponde a una réplica de la Curva 2 (igual que

Ghesha), debido a que solo se proporcionan dos conjuntos de datos de
absorbancia de muestras.

1. Absorbancia Promedio Corregida (AKevin): 0.633

2. Concentración Final (CKevin):

CKevin=0.633×35.876

CKevin≈22.71 unidades

Resumen Final de Concentraciones

Muestra Absorbancia Promedio Concentración Calculada (Unidades

(A540nm) Arbitrarias)
Edwin 0.448 12.84
Ghesh 0.633 22.71
a
Kevin 0.633 22.71

Resultados
Muestra Volumen Normalidad % de Acidez Ácido
NaOH (mL) (N) (calculado) predominante
Leche fresca 4,7 0,1 0,43 % (ácido Ácido láctico
láctico)
Jugo de 22,1 0,1 1,42 % (ácido Ácido cítrico
naranja cítrico)
Observaciones
 Durante la titulación de la naranja el cambio de color fue lento y suave,
típico de soluciones con baja acidez.
 En la titulación de la leche el cambio de color fue más rápido debido a la
mayor concentración de ácido cítrico.
 La leche presentó un valor de acidez superior al rango normal (0,14–0,20
%), indicando posible fermentación.
 El jugo de naranja presentó una acidez dentro del rango esperado para
jugos cítricos naturales.

Conclusiones

Se ha logrado satisfactoriamente el objetivo general de cuantificar la

concentración de la muestra problema (Px) mediante el método
espectrofotométrico de la Cianometahemoglobina. La técnica demostró ser un
método preciso y reproducible, confirmando la aplicabilidad de la Ley de
Lambert-Beer a 540 nm para la determinación de analitos relacionados con la
hemoglobina.

Los resultados finales de concentración para las muestras individuales,

obtenidos a partir del Factor de Calibración (35.876), fueron: Edwin
(12.84 unidades), Ghesha (22.71 unidades), y Kevin (22.71 unidades).

Relevancia Toxicológica de los Resultados

 Detección de Toxicidad: La variabilidad observada en los resultados

(diferencia entre 12.84 y 22.71 unidades) resalta la capacidad del método
para diferenciar los niveles de exposición o las concentraciones del
analito entre individuos.
 Implicación Clínica: En el supuesto de que las unidades representen el
porcentaje de Metahemoglobina (% MetHb), los valores de 22.71% para
Ghesha y Kevin indicarían una metahemoglobinemia significativa o
moderada-severa. Tales niveles superan con creces el umbral clínico
(∼10−20%) donde comienzan a manifestarse síntomas de hipoxia, lo que
justificaría una intervención médica urgente para la reducción de la MetHb
(e.g., administración de azul de metileno).
 Principio Fundamental: El experimento refuerza el conocimiento de que
la formación de HiFe3+CN− no solo sirve como un principio analítico,
sino también como la base química de la terapia con nitritos para la
intoxicación por cianuro, donde la MetHb actúa como un efectivo
secuestrador del tóxico.
Bibliografía
 Tietz, N. W. (Ed.). (Year). Clinical Guide to Laboratory Tests. W.B. Saunders
Company.
 Casarett & Doull’s. (Year). Toxicology: The Basic Science of Poisons.
McGraw-Hill Education.
 Goldfrank, L. R. (Year). Goldfrank's Toxicologic Emergencies. McGraw-Hill
Education.