Luminiscencia: principios generales y apagamiento

Espectrofluorímetro: crea un espectro utilizando distintas longitudes de ondas, realiza un barrido separando los espectros de absorción (de la molécula) y emisión
(de la luz que emite la molécula).

➢ Consta de una fuente de luz.

➢ Un collimator que permite seleccionar luz en cierta dirección.
➢ Slit selecciona la intensidad de luz para no saturar el fotocromador.
➢ El monocromador es un prisma o una red de difracción que separa la luz en sus distintas longitudes de onda.
➢ El detector debe encontrarse a 90° para no recibir el espectro de excitación, ya que la muestra absorbe parte de esa luz
y emite en todas direcciones.

¿Cómo distingo un espectro de emisión de uno de excitación? El espectro de excitación siempre es a menor longitud de
onda (más energía) que el de emisión ya que se pierde energía.

Fluorescencia intrínseca de las proteínas

Es la emisión de luz de manera natural cuando ciertos aminoácidos son excitados a cierta longitud de onda.

Rendimiento cuántico: que fracción de luz absorbida se transforma en luz fluorescente.

➢ Fenilalanina absorbe algo de luz a longitudes de onda cerca de 250 nm pero la curva de fluorescencia
es muy baja y plana, tiene un rendimiento cuántico bajo por lo que no contribuye significativamente
a la fluorescencia de proteínas.
➢ Tirosina y Triptófano tienen curvas de fluorescencia bien definidas. Triptófano tiene un espectro de
absorción más allá de los 295 nm por lo que para estudiar proteínas con Trp se excita con longitudes
de 295 nm para evitar interferencia con Tyr.
➢ La máxima fluorescencia de Trp y Tyr es a 350 y 303 nm respectivamente.
➢ La emisión del triptófano depende de las características polares del medio, en ambientes apolares trp
emite más cerca de los 330 nm y en polares se desplaza a 350 nm.

Fluorescencia extrínseca

La fluorescencia proviene de moléculas externas (fluoróforos o sondas) que interactúan con la

proteína que se quiere estudiar.

Proteína fluorescente verde: estructura de tipo barril con hojas beta, residuos de aminoácidos
glicina, tirosina y serina en un ambiente hidrofóbico.

Se utiliza mucho en microscopía confocal.

Ejemplo polimerización de actina:

La actina puede estar como monómero o como polímero, si tengo el Prodan unido a F- actina hay una diferencia en el espectro de emisión con el Prodan unido
G- actina.

G- actina está expuesto al solvente mientras que F- actina está enterrado.

Distribución de trp en estructura 3d de tubulina de cerebros de pollo:

Les interesó saber que pasaba con el plegamiento de la tubulina. Utilizaron la fluorescencia
intrínseca, tiene 4 trp por monómero. Tiene una subunidad alfa y beta. Tenían 4 sondas e
hicieron un espectro de emisión y colocaron un agente desaturarte para exponer al solvente
los triptófanos.

En ausencia de agente presentaba un máximo en 338 nm y en presencia una máxima de 356

nm.

Al aumentar la cc de agente se comporta de forma sigmoidea

Estudiaron la estructura secundaria de la proteína: Estudiaron el efecto del agente

denaturante en la estructura de la tubulina, luego hicieron DC (mide estructura secundaria) y fluorescencia (estructura terciaria).

➢ El Dc mostraba un corrimiento en la curva no coincidía con fluorescencia. Para denaturar la estructura secundaria se necesita más cantidad
de agente.
 Posibles 2 vías para la denaturación de la tubulina:

Primero se separan sus subunidades y luego pierden su estructura.

Primero pierden estructura terciaria y posteriormente se separan las subunidades.

La conclusión fue la vía 1.

Transiciones electrónicas en átomos y sondas orgánicas:

La fuente luminosa tiene electrones, al producirse la descarga eléctrica, los electrones reciben energía y saltan a un orbital de mayor energía, luego emiten energía
volviendo a su estado basal.

Las sondas son fundamentalmente enlaces de tipo pi.

Se tiene que escoger una sonda:

➢ Que sea de bajo peso molecular para no entorpecer el proceso.

➢ Coeficiente de abs altísimo.
➢ Alto rendimiento cuántico
➢ Longitud de onda m´zxima la escojo de acuerdo al experimento.

Transiciones electronicas en atomos y sonda organicas:

Todas las sondas utlizan enlaces pi para producir la absorción. Si tenemos un espectro de energía tendremos un enlace donde estarán estos enlaces pi. La mayoría
de transiciones electrónicas en sondas ocurren en las longitudes de onda UV visibles e incluyen la transición de un electrón desde un orbital pi enlazante a un
anti enlazante (de menor energía a mayor energía).

La promoción de electrones será desde el orbital más alto ocupado (HOMO) al orbital más bajo desocupado (LUMO) y las especies resultantes se denomina estado
excitado. Solo amarillo y purpura son los que está disponibles entre 200 y 800 nm (UV visible).

Para poder explicar los fenómenos de fluorescencia hay que ver el comportamiento energético:

Tengo un estado basal y excitado. Ocurre que si paso de un estado basal

(S0) a uno excitado (S1) va a ocurrir en un determinado tiempo
10−15 segundos (fentosegundos), la fluorescencia cae en 10−9 segundos.

La distancia internuclear es una forma de representar cómo cambia la estructura del fluoroforo al excitarse lo cual es relevante
ya que altera la geometría molecular y esto puede cambiar: el momento dipolar de la molécula, la interacción con el entorno
y la forma del espectro de emisión.

Principio de Franck Condon: La excitación electrónica ocurre muy rápido hacia niveles altos del estado excitado (la
probabilidad de absorción es mayor hacia ciertos niveles vibracionales altos) y los núcleos no tienen tiempo de moverse, una
vez en el estado excitado el electrón baja al nivel más bajo de S1 (relajación vibracional) y desde ahí emite un fotón regresando
a su estado basal. Siempre emite desde ahí S1v0.

Diagrama de Jablonski (clave):

- Si yo excito en S1 o en S2 la emisión será igual porque siempre se emite desde el nivel más bajo del estado excitado.
- Puedo tener un espectro de emisión, pero más de un espectro de absorción.
- Estado de triplete activado, se produce la fluorescencia en el orden de los milisegundos
(fosforescencia) sirve para medir cosas que ocurren en ese lapsus de tiempo.
- Espectro de excitación es la imagen especular de los espectros de emisión (en ambos se muestra como
se pasa de un estado basal a uno excitado o viceversa, pero en sentidos opuestos).
- La emisión desde el triplete es de más baja energía que la emisión del singlete.
Propiedades de las transiciones electrónicas desde el estado excitado:

➢ Las transiciones desde el estado de triplete excitado al estado basal son muy poco frecuentes (spin-prohibidas, ya que
en el triplete los spines de electrones cambian).
➢ La molécula se excita a S1, desde ahí puede emitir fluorescencia (desde S1 a S0) o fosforescencia (desde T1 a S0) pero
esta última es muy poco frecuente y lenta por eso la fosforescencia se observa como una luz persistente después de apagar la
fuente de excitación.
➢ La presencia de átomos pesados como el bromuro o electrones no enlazantes (como el oxígeno) aumentan la velocidad
del sistema S1 a T1.

Propiedades importantes para una sonda:

➢ Coeficiente de extinción (ε): La fluorescencia de emisión depende de la eficiencia con la que absorbe la onda. El valor de ε va entre 5000 a 200000
1
.
𝑐𝑚−1 𝑚𝑜𝑙 −1
➢ Rendimiento cuántico (Φ): Se relaciona con la intensidad de emisión, razón entre el número de fototnes emitidos y fotones absorbidos.
➢ Longitud de excitación: Para no dañar la muestra, en microscopía es preferible utilizar sondas que puedan ser excitadas por sobre 500 nm (deja de ser
importante en experimentos in vitro)
➢ Fotoestabilidad: Una misma sonda fluorescente idealmente debe dar muchos eventos de excitación y emisión.
➢ Tiempo de vida del estado excitado (τ): Tiempo de vida promedio en que la sonda permanece en estado excitado, la mayoría de los fluoroforos tienen
un tiempo de vida de nanosegundos.
➢ Provocar una mínima perturbación en la función de la proteína: No debe perturbar a la proteína, organelo o célula blanco, no debe ser fototóxica.

Parámetros que describen la emisión de fluorescencia:

Rendimiento cuántico: Número de fotones emitidos dividido por el número de fotones absorbidos. La fluorescencia ocurre desde el estado excitado.

El electrón en estado excitado puede retornar al estado basal vía otros procesos los cuales en conjunto determinarán el rendimiento cuántico medido.

El rendimiento cuántico de la fluorescencia depende de la velocidad de emisión de fluorescencia dividida por la suma de las velocidades de todos los procesos de
desactivación (como disipación térmica, cruces entre intersistemas). El rendimiento cuántico te dice qué tan probable es que ña molécula emita luz en lugar de
disipar energía por otro camino.

𝑘𝑓
𝛷= donde kf: velocidad de fluorescencia, ki: velocidad de decaimiento no radioactivo, kx: velocidad de cruzamiento intersistema o 𝛷 =
𝑘𝑓+𝑘𝑖+𝑘𝑥
𝑛° 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑒𝑚𝑖𝑡𝑖𝑑𝑜𝑠
.
𝑛° 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑖𝑑𝑜𝑠

➢ Si las velocidades de los procesos de desactivación son menores (más lentas) en comparación con kf. 𝛷 es grande.
➢ Si las velocidades de estos procesos son rápidas (mayores) comparadas con kf 𝛷 es bajo.

Energía de emisión de fluorescencia: Los espectros de absorción, excitación y emisión

suelen presentarse en función de la longitud de onda, para análisis cuantitativo es útil
expresarlos en energía usando el número de onda (recíproco de la longitud de onda).

Al realizar un espectro en función del número de onda pueden distinguirse 3 momentos:

➢ Momento 0: es un pico de intensidad máxima y representa la energía más probable

de emisión. Te dice donde está el pico de emisión útil para identificar el fluoroforo.
➢ Momento 1 (centro de masa): es el promedio ponderado de energía, energía media
del estado excitado.
➢ Momento 2 (ATMM o ancho total a mitad del máximo): indica heterogeneidad del entorno molecular. Revela cuan dispersa está la energía de emisión
(puede correlacionarse con flexibilidad conformacional o entornos moleculares mixtos).

Mecanismo de relajación del solvente y corrimiento espectral

Por qué el Prodan unido a actina cuando está unido al filamento es distinto cuando está unido al monómero. El Prodan es
una molécula fluorescente sensible al ambiente local, su espectro de emisión cambia dependiendo del entorno químico.
Cuando Prodan se une a G-actina (monómero que flota libre por el citoplasma) interactúa con una proteína más expuesta
al solvente y con un entorno más polar en cambio cuando se une a F-actina (polímero formado por unión de G-actinas) el
entorno es más rígido.

Resulta que las ondas están rodeadas de solventes (dipolos) y cuando se excita cambia su momento dipolar y con ello una
reorganización del solvente.
Al excitarse el Prodan tiene una relajación (muy favorable) dipolar al estado basal. El hecho de que se exponga al solvente baja la energía por lo que la longitud
de fluorescencia es mayor, y si no está expuesto al solvente la longitud es menor.

Relajación del solvente es más favorable en estado excitado ya que en este estado la molécula tiene un dipolo más fuerte, el solvente polar se reorienta para
estabilizar el nuevo dipolo generando interacciones cipolo- dipolo más fuertes, con esta relajación se estabiliza la molécula disminuyendo su energía. Como el
estado excitado ya esta más bajo en energía el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el fotón absorbido.

➢ Intensidad de fluorescencia depende del tiempo de vida del estado excitado.

APAGAMIENTO

Es la reducción de la intensidad de la fluorescencia, estos procesos pueden ocurrir durante el tiempo de vida del estado excitado (apagamiento colisional, energía
de transferencia, reacciones de transferencia de carga) o en la formación de complejos del estado basal.

Nos enfocaremos en el apagamiento colisional (dinámico) y el estático.

Apagamiento colisional: Ocurre cuando en el estado excitado el fluoroforo experimenta un contacto con una molécula que facilita transiciones no radioactivas
𝐹0
hacia el estado basal (O2, I-, Cs+ y acrilamida). En el caso más simple se cumple la relación de Stern- Volmer: = 1 +
𝐹
𝐾𝑠𝑣 [𝑄] siendo F0 y F florescencia observada en ausencia y presencia de apagador respectivamente, Ksv cte de apagamiento
Stern Volmer y Q cc del apagador.

En un gráfico se ve una línea recta con una pendiente igual as Ksv.

𝐾𝑠𝑣 = 𝑘𝑞 × τ0 donde kq es la cte de velocidad de apagamiento bimolecular (pp a la suma de los coeficientes de difusión
para el fluoróforo y el apagador) y tau cero es el tiempo de vida del estado excitado sin apagador. En el caso de apagamiento
𝐹0 τ0 τ0
colisional puro = ↔ = 1 + 𝑘𝑞 × τ × [𝑄] .
𝐹 τ τ

Apagamiento estático: También puede pasar que el fluoroforo forme un complejo estable con otra molécula. No tengo un apagador (a altas cc), en el estático con
𝐹0
poca molécula se apaga. La molécula se une a la proteína y apaga la sonda. = 1 + 𝐾𝑎 [𝑄] Donde Ka es la cte de asociación del complejo.
𝐹

En el caso de un apagamiento estático la vida media de la muestra no se reducirá ya que los fluoroforos que no están acomplejados pueden emitir después de la
excitación, pero la intensidad del fluoroforo disminuye dado que el apagador reduce el número de fluoroforos que pueden emitir.

Si hay apagamiento dinámico y estático a la vez se observa la siguiente relación:

𝐹0
= (1 + 𝑘𝑞 × τ × [𝑄])(1 + 𝐾𝑎 × [𝑄]) El gráfico dará una línea que se curva hacia arriba:
𝐹

Sin embargo, en un apagamiento estático puro el tiempo de vida no se ve afectado por lo que el gráfico de tiempo
de vida se ve como una línea recta:

Algunas veces se encontrará una ecuación para el

𝐹0
apagamiento dinámico y estático de esta forma: = (1 +
𝐹
𝐾𝑠𝑣 × [𝑄])𝑒 𝑉[𝑄] Donde la exponencial se utiliza como descriptor fenomenológico del proceso de apagamiento.
V representa el volumen activo alrededor del fluoroforo, tal que cualquier apagador dentro de este volumen,
al tiempo de excitación, es capaz de apagar el fluoroforo.

Consideremos el caso de residuos múltiples de triptofano en una proteína, uno se puede imaginar facilmente que alguno de estos residuos podría estar más
accesibles a apagadores del solvente que otros.

El gráfico de apagamiento para una población de proteínas en que una parte está accesible y la otra no se ve así:

➢ Apagamiento depende del tiempo de vida y cte de difusión.

Polarización de fluorescencia:

La luz puede ser considerada como oscilaciones de un campo electromagnético, caracterizado por componentes eléctricos y magnéticos, perpendiculares a la
dirección de la luz.

La luz tiene varios fotones podemos concluir que la luz natural no es polarizada, sino que está en todas direcciones.

En la luz natural el vector del campo eléctrico puede asumir cualquier dirección de oscilación perpendicular o normal a la dirección de propagación de luz.

Polarizadores son elementos ópticamente activos que pueden aislar la dirección del vector eléctrico. La luz polarizada depende de la posición del [Link]
esta luz polarizada haremos los estudios de las macromoléculas.

Los polarizadores más comunes usados hoy, son (1) los dicroicos, que operan absorbiendo efectivamente un plano de polarización (ej., las placas Polaroid tipo-H
basadas en polivinil alcohol estirado e impregnado con ioduro) y (2) cristales polarizadores doble refractantes (CaCO3) que dispersan los dos planos de
polarización (ejemplos de esta clase de polarizadores son los Nicol, los prismas Wollaston y los polarizadores de tipo Glan tales como los Glan-Foucault,
GlanThompson y Glan-Taylor).

Si consideramos un marco xzy con una solución fluorescente puesta en el origen, donde xz está en el plano de la página. Las moléculas de fluorofor emitirán luz
en todas las direcciones, pero emitirán luz polarizada, introducimos un nuevo polarizador

En este sistema, la luz de excitación viaja a lo largo de la dirección X. Si un polarizador se inserta en el rayo, se puede aislar una
dirección única del vector eléctrico y se obtiene luz polarizada paralela al eje Z que corresponde a la vertical de los ejes del
laboratorio.

Esta luz de excitación será absorbida por el fluoroforo en el origen y dará lugar a la fluorescencia la cual tipicamente se observa a
90o respecto a la dirección de excitación, i.e., a lo largo del eje Y. Inicialmente consideremos que esta fluorescencia puede tener
cualquier dirección de polarización. La dirección efectiva del vector eléctrico de la emisión se puede determinar observando la
emisión a través de un polarizador el cual puede ser orientado alternativamente en una dirección paralela y perpendicular relativa
al eje Z o dirección vertical del laboratorio. La polarización se define entonces como una función de la intensidad paralela (III) y
Iparalelo - Iperpendicular 1-0
perpendicular (I⊥): P = →P= = 1 nunca se alcanza el valor de 1.
Iparaleo + Iperpendicular 1+0

Si la emisión es completamente polarizada en la dirección paralela, es decir el vector eléctrico de la luz de excitación se mantiene en su totalidad.

Fenómeno de polarización de polarización de anisotropía: cuando tengamos una medida de la intensidad de fluorescencia y hemos usado polarizadores. Tendremos
dos medidas de fluorescencia, cuando pongamos el polarizador de forma paralela y perpendicular.

0-1
Si la luz emitida es totalmente polarizada en dirección perpendicular entonces: P = = - 1. Como las macromoléculas se están moviendo se alejan de los valores
0+1
+1 y -1, si vitrificamos la muestra, por lo que cuando excitemos solo absorberán esos vectores en la misma posición del rayo y van a emitir en la misma posición y
podemos obtener esos valores. Otro término frecuentemente usado en el contexto de la emisión polarizada es la anisotropía (usualmente designada como A o r).

2 tipos de polarizaciones: intrínseca (congelado) y polarización a la temperatura ambiente.

Iparalelo - Iperpendicular
Anisotropía: r es igual a , porque la luz se disipa en todas las direcciones, para considerar toda la luz. La anisotropía simplifica la matematica
Iparaleo + 2Iperpendicular
de análisis de la polarización, los valores varían de 1 y -0,5.

➢ La relación que existe entre polarización y anisotropía es que se miden igual.

2 1 1
Anisotropía r = ( - )-1 (definición de anisotropía en términos de la polarización, da lo mismo mediar cualquiera de las dos, pero es más fácil hacer el análisis
3 P 3
2P
con anisotropía) → r =
3-P

Los valores son teóricos, estamos considerando que pasa toda la luz pero ocurre que la muestra tiene moléculas ubicadas en todas direcciones y por ende tendremos
valores que difieran del +1 y -1, a este fenómeno se le denomina fotoselección, la luz paralela con la cual estamos iluminando va a seleccionar algunas moléculas
que corresponden y que están dentro del coseno cuadrado de teta de la muestra.

En efecto, si luz de una orientación particular del vector eléctrico (plano de la luz polarizada) golpea sobre una muestra, sólo aquellas moléculas las cuales están
propiamente orientadas relativo a este vector eléctrico pueden absorber la luz. Específicamente, la probabilidad de la absorción es proporcional al coseno cuadrado
del ángulo  entre la luz de excitación y el dipolo de transición (cos2 ).

De allí que cuando se excita un conjunto de fluoróforos orientados al azar con un plano-polarizado de luz, se efectúa un proceso de fotoselección, creando una
población de moléculas excitadas las cuales nominalmente tienen sus dipolos excitados alineados con la dirección de la excitación. Este proceso se ilustra a
continuación:

Ocurre que la muestra tiene moléculas ubicadas en todas direcciones y por ende vamos a considerar un ángulo
de la luz, coseno cuadrado de teta.

Perrin encontró una relación entre la polarización del estado excitado, el tiempo de vida y la difusión
rotacional de un fluoroforo (como se mueve el fluoroforo dentro de la solución).
1 1 1 1 RT
- = ( - ) (1 + 𝜏) V es el volumen molar de la unidad rotante, R es la constante universal de los gases, T es la temperatura absoluta, η la viscosidad y τ el
P 3 P0 3 𝜂V
tiempo de vida del estado excitado. P es la que yo mido experimentalmente. P0 es la polarización vitrificada.

También se puede reescribir en términos de la cte del volúmen:

ro coeficiente de difusión rotacional. Donde  es el tiempo de relajación rotacional de Debye el cual es el tiempo para que una
orientación dada rote a través de ángulo dado por el arccos e -1 (68.42o).

Para una molécula esférica:

Ro cero también se puede correlacionar con el peso molecular:

➢ v volúmen parcial específico para proteínas y aa más o menos 0,7.

➢ h volumen de hidratación capa que rodea la molécula.

Estamos mirando el volumen de la molécula. Si uno quiere usar el tiempo de correlación (tau c) en lugar del tiempo de relajación de Debyel hay una relación en
que ro es tres veces tau c.

Ejemplos de cómo se aplica la polarización de fluorescencia en el estudio de macromoléculas desde el punto d ¿e vista del volúmen de la
macromolécula:

➢ Uno mide la polarización y varia la viscosidad o temperatura. La ecuación es de una línea recta. El experimento se hace con sacarosa, en la cubeta se
le agrega distintas cc de sacarosa.

La polarización observada en el buffer solo fue 0.151 mientras que el valor límite de polarización obtenido desde la intersección con el eje Y fue 0.225, el cual es
el mismo valor que se obtiene al excitar protoporfirina IX en glicerol a bajas temperaturas. Desde la ecuación de Perrin:

Tenemos una pendiente y la intersección que corresponde a 1/P0. Puedo sacar la fluorescencia intrínseca.

y con un tiempo de vida 16.9 ns, se puede calcular un tiempo de relajación rotacional de 96 ns para el complejo
proteína-porfirina:

Para un proteína esférica de 44,000 daltons y suponiendo un volumen parcial

específico de 0.74 y una hidratación de 0.3 ml/mg, se puede calcular:

➢ De que dende el coeficiente de difusión rotaciones, del tamaño de la molécula, la molécula pequeña va a
girar más rápido por lo que tendré u coeficiente de difusion rotacional proporcional al movimiento.

Nos hacemos la pregunta, ¿es esta molécula esférica? Puede ser una molécula alargada que genere dos cuerpos un
prolato es que la molécula este girando en torno a su eje longitudinal y queda como un cigarrito, o un oblato que esté girando con respecto a su centro y
queda como una ayuya.

Se calcula ro cero lo que da un valor de 56 nanosegundos. No es una molécula esférica porque el valor me dió 56 en vez de 96ns por lo que puede ser un oblato o
un prolato.

Estoy midiendo una sonda unida fuertemente a la macromolécula. Qué pasa si pongo una sonda unida a un átomo va a girar sobre el
eje de unión. En el caso de sondas fluorescentes asociadas no covalentemente con proteínas (ej. Porfirinas, FAD, NADH o ANS para
mencionar unos pocos sistemas), la sonda se sostiene a la matriz de la proteína por varios puntos de unión y de allí que su movilidad
“local”, esto es la habilidad para rotar de manera independiente del movimiento “global” de la proteína, está muy restringido. En el
caso de una sonda unida covalentemente a una proteína, a través de un enlace con un grupo amina o sulfidrilo, o en el caso de la
cadena lateral de un triptófano o tirosina puede haber un considerable movimiento “local” del fluoróforo. Además, la proteína puede
consistir de dominios flexibles los cuales pueden rotar independientemente de la rotación total “global” de la proteína. Este tipo de
movilidad jerárquica se ilustra a la derecha para el caso de una sonda covalentemente unida a una proteína dimérica.

¿Cómo será el gráfico en este caso? Depende del volumen por lo que depende del movimiento, pero aquí
tengo 3 movimientos, curvada hacia abajo, 1/P-1/3 para la sonda que ni se va a mover.

La polarizacion de fluorescencia me sirve para cualquier agregado de la solución. Si tengo un equilibrio monómero dímero tendré
dos polarizaciones porque hay dos movimientos distintos, el monómero se moverá más rápido pero el dímero tendrá más
polarización.

Siguiendo o la fluorescencia intrínseca de la proteína (si es posible) o al marcarla con una sonda adecuada se debería esperar
una disminución de la polarización del sistema con la disociación del dímero en monómeros, pues los monómeros mas pequeños
rotarán mas rápidamente que los dímeros (durante el tiempo de vida del estado excitado)
 De allí que para una sonda de un tiempo de vida dado la polarización (o la anisotrtopía) del monómero
será menor que la del dímero.

En el rango de concentración cerca de la constante de equilibrio dímero/monómero, se espera observar una

polarización intermedia entre la asociada al dímero o al monómero. Se puede relacionar la polarización
observada a la fracción de dímero o monómero utilizando la aditividad de las polarizaciones como descrita
por primera vez por Weber (1952):

Donde <P> es la polarización observada, fi es la fracción de intensidad dada por el imo componente y Pi es la polarización del imo componente. Se debe entonces
relacionar la contribución de la fracción de intensidad a cantidades molares lo cual significa que se debe tomar en cuenta el rendimiento cuántico del fluorósforo
asociado con cada especie. La función de anisotropía es directamente aditiva (considerando el hecho que el denominador representa la intensidad total emitida)
de allí que

Puedo determinar la cte de disociación observando la anisotropía: Así para determinar la constante de disociación, se puede diluir la proteína y observar la
polarización (o la anisotropía) como una función de la concentración, como se muestra abajo. Lisozima siempre es un monómero (proteína testigo).

Grafico la polarización respecto de la concentración, a cc más altas de la proteína tengo dímero y más bajas tengo monómero.

Se diluye la proteína de izq a derecha.

¿Por qué aumenta la anisotropía a medida que aumenta la cc? cuando el ligando se une a la proteína
anisotropía aumenta.

La utilización de polarización/anisotropía es muy útil para estudiar interacciones proteína-ligando en general. La primera aplicación de polarización de
fluorescencia para seguir la unión de pequeñas moléculas a proteínas fue efectuada por D. Laurence en 1952 con un instrumento de Gregorio Weber en Cambridge.
Específicamente, Laurence estudió la unión de numerosos colorantes, incluyendo fluoresceina, eosina, acridina y otros, a seroalbumina de bovino, y usó los datos
de polarización para estimar las constantes de unión. Aunque muchas sondas (tales como fluoresceina) no alteran significativamente su rendimiento cuántico al
interactuar con proteínas, no se debería tomar este hecho como sentado y debería aconsejarse que se mida. Si el rendimiento cuántico en efecto cambia, se debe
corregir la ecuación de ajuste para tomar en cuenta el cambio en rendimiento. En términos de anisotropía la expresión correcta que relaciona la anisotropía
observada (r) a la fracción de ligando unido (x), anisotropía del unido (rb), anisotropía del libre (rf), y el factor de aumento del (g) es

Un gráfico típico de polarización versus la razón de ligando/proteína se muestra abajo:

En este experimento, a 1 micromolar de mant-GTPS (un análogo no hidrolizable de

GTP) se le adicionó dinamina (proteína que une GTP) comenzando con una alta concentración, seguida por diluciones.
La curva de unión fue ajustada a la ecuación de anisotropía (en este caso el rendimiento del fluorósforo aumento 2
veces con la unión) Se encontró una Kd de 8,3 micromolar.

Cuando el ligando se une a la proteína la anisotropía aumenta.

Diagnóstico de embarazo:

Embarazo produce un aumento de gonadotropina coriónica. Se fabrican anticuerpos contra gonadotropina coriónica.
Utilizo gonadotropina corionica unida a un ligando con fluoroforo, la gonadotropina se une al anticuerpo y tiene
una alta polarización. Si tomo la muestra de orina con gonadotropina no marcada va a desplazar a la que está
marcada y la polarización será baja.

➢ La fluorescencia es altamente sensible.

➢ Hemos visto apagamiento y polarizacion de fluorescencia como aplicaciones de la fluorescencia.

DICROISMO CIRCULAR:

➢ Permite estudiar no solo a la proteína sino también su estructura secundaria.

➢ Para ver la estructura secundaria vamos a utilizar el dicroísmo circular.

Con dicroismo solo conocemos los cambios de estructura el porcentaje de estructura que tiene

Usamos luz polarizada pero la ¨complicamos” porque utilizamos luz circularmente polarizada. Tenemos que desfasar campos eléctricos uno de otro en 90 grados

Tendré un vector hacia la izquierda y hacia la derecha. Obtengo la suma de los vectores desplazados a la izquierda y derecha.
Si en el camino de la luz circularmente polarizada coloco un elemento quiral capaz de absorber uno de los planos de esta luz y hago la suma de los vectores, la
luz resulta ser elípticamente polarizada.

El fenómeno de dicroísmo lo tendremos cuando coloquemos en el paso de la luz un elemento quiral que transforme la luz
circularmente polarizada en luz elípticamente polarizada.

Si se mezclan los vectores de la luz polarizada lineales (perpendicular y horizontal) obtenemos luz polarizada que sale de
los planos. Si tomamos luz circularmente polarizada vamos a tener que el vector está oscilando de forma circular.

El equipo de dicroismo utiliza primero luz linealmente polarizada pero tiene un elemento que está vibrando a 50 heartz
que es un material piezo electrico (si mecánicamente lo perturbo me perturba el paso de la luz) ejemplo: toca discos

➢ La luz que sale es absorbida por lo que sale con una menor intensidad a la emitida.
➢ Tiene poca sensibilidad.

La unidad de dicrosmo circular se denomina la elipticidad, mide cuanto absorbe y produce esta
elipticidad.

Elemento quiral es un carbono asimétrico y por ende tiene oportunidad de absorber luz a la
izquierda o derecha.

Puede que haya residuos de aa que no son quirales pero cuando están en un elemento quiral si
presentan el fenómeno de dicroismo circular.

Fundamentalmente dicroismo circular es una técnica de absorcion de luz por ende se deben
expresar sus unidades en absorcion pero nadie lo hace.

Cuando quiero relacionar el valor que me da el instrumento este me lo da en radianes, milidegrees

y estos los tengo que convertir en elipticidad o absorbancia.

➢ 1 radian es una unidad de perímetro.

La metodología es poco sensible porque 1 grado es 33 delta A pero si se divide por 100 y por la cc, para una medida de teta de 10 mdeg el delta de absorbancia
es 0,0003, por ende al medir:

➢ Buena estabilidad del espectrofotómetro.

➢ Cubetas de cuarzo fundido de alta transparencia.
➢ Temperatura controlada.
➢ En UV lejano molestan algunas sales o buffers y oxígeno.

Reglas simples:

➢ Un espectro de DC es aditivo, es decir es la simple suma de los espectros de sus componentes. Esto
no es siempre estrictamente cierto pero es una buena aproximación.
➢ La fuerza rotacional de una curva DC es una medida del grado de asimetría. Un agente que
aumenta o disminuye este parámetro usualmente lo hace al aumentar o disminuir la asimetría (aunque
otras características espectrales usualmente acompañan el cambio en asimetría
➢ Un cromósforo que es simétrico puede llegar a ser ópticamente activo cuando se encuentra en un
ambiente asimétrico (ej. Hélice alfa). Esto puede ser acompañado de un cambio en alfa o .
➢ El valor de lo y el signo de D a lo permite identificar al cromósforo porque se encuentra siempre
muy cercano al valor de lo obtenido por espectroscopia simple de absorción
➢ Un cromóforo simétrico puede llegar a ser asimétrico.

Quien absorbe es el enlace peptídico por lo que estamos mirando es la cadena peptídica, puede haber interferencias de enlaces pi pero lo fundamental son esos
enlaces. Tenemos dos ángulos, el fi y el psi el que está entre el N y el C alfa es el fi y entre el C carbonilo y el C alfa del doble enlace es el psi. La intensidad y
energía de estas transiciones dependen de los ángulos (es decir, de la estructura secundaria).
Si analizamos el espectro de dicroismo circular de proteínas modelo se ve que la curva 1 del grafico CD hay una absorbancia negativa
con dos máximos, corresponde a una estructura helicoidal, la curva 2 tiene un corrimiento a la derecha con un solo máximo y una
estructura beta.

El espectro me va a dar la suma de las curvas y lo que yo tengo que hacer es una decombolución, se hace por programas computacionales.

No sólo se aplica a proteínas sino también a ácidos nucleicos

Un elemento quiral permite tener la combinación de dos cosas