ESTUDIO DE DIVERSOS FACTORES QUE AFECTAN LA TASA

FOTOSINTÉTICA EN CLOROPLASTOS IN VITRO DE SPINACIA

OLERACEA
Departamento de Biología. Facultad Experimental De Ciencias Y Tecnología. Universidad de
Carabobo. Valencia. Venezuela.
Resumen: La fotosíntesis en un proceso en el cual un organismo es capaz de capturar la energía
en forma de luz y transformarla en energía química. La fotosíntesis tiene lugar dentro de los
cloroplastos pues poseen las enzimas necesarias para realizar las distintas reacciones que darán
lugar a la fotosíntesis. Es por ello que este informe tiene por objetivo evaluar diversos factores
que pueden alteran la tasa fotosintética en cloroplastos in vitro. Para ello se aislaron cloroplastos
de las hojas de S. oleracea, y se sometieron a diferentes intensidades de luz, tiempo de exposición
a la luz y se evaluo el efecto del herbicida DCMU. Obteniéndose experimentalmente que a
medida que aumenta la intensidad de la la luz, aumenta la tasa fotosintética, de igual manera se
obtuvo que al variar la concentración de DCMU varia la tasa fotosintética por unidad de tiempo.
Asi como la importancia del tiempo de exposición a la luz como factor limitante en la actividad
fotosintética. En conclusión se evidencia la dependencia de la tasa fotosintética a factores
externos relacionados con intensidad y tiempo de exposición de la luz, herbicidas en el ambiente
y factores internos como la concentración de cloroplastos.
Palabras Claves: 2,6 diclorofenol indofenol, Diclorofenil dimetilurea, Luz.
Introducción
La fotosíntesis en un proceso en el cual un organismo es capaz de capturar la energía en forma de
luz y transformarla en energía química. La fotosíntesis tiene lugar dentro de las células, en
orgánulos llamados cloroplastos que contienen las clorofilas y otros compuestos, en especial
enzimas, necesarios para realizar las distintas reacciones. Estos compuestos están organizados en
unidades de cloroplastos llamadas tilacoides; en el interior de éstos, los pigmentos se disponen en
subunidades llamadas fotosistemas. Cuando los pigmentos absorben luz, sus electrones ocupan
niveles energéticos más altos, y transfieren la energía al centro de reacción. La fotosíntesis es un
proceso de gran importancia no solo porque sintetiza la energía necesaria para el desarrollo de la
planta sino que también aporta la energía al resto de los niveles en la red trófica en el planeta
(Azcón-Bieto & Talón, 2000; Solomon et al.,2008, Carrasco, 2009)
A nivel celular el proceso fotosintético ocurre en los cloroplastos, estos orgánulos están
presentes en todas las células eucariotas fotosintéticas que se encuentran separados del citosol
celular por una doble membrana conocida como envoltura cloroplastica. La membrana externa es
rica es canales proteicos que la hacen muy permeable, mientras que la membrana interna posee
una permeabilidad más selectiva y constituyen el tilacoide, el cual consiste en un sistema de
pliegues membranosos formando laminas paralelas que pueden ser del tipo grana o estromatica.
Las membranas tilacoidales son las biomembranas fotosintéticas que en su interior poseen todo
el aparato biomolecular y enzimático capaz de iniciar la primera fase de la fotosíntesis
(Somerville & Somerville,1984; Herrera et al., 2001;Taiz & Zeiger, 2002)
En el proceso de fotosíntesis intervienen dos fotosistemas: el fotosistema I y el fotosistema II.
Estos fotosistemas son capaces de absorber y transformar la energía lumínica en energía
electroquímica redox. Esto se logra gracias a que el fotosistema II mediante el uso de complejos
antena es capaz de absorber los fotones de luz solar. Los electrones cargados de energía saltan a
un receptor de electrones y recorren una cadena de transporte de electrones que los conduce hasta
el fotosistema I. Los electrones perdidos por los receptores son reemplazados por electrones
procedentes de la fotolisis del agua. Durante el transcurso de este fenómeno se genera ATP y la
luz absorbida por el fotosistema I pasa al centro de reacción, donde continúa la cadena
transportadora de electrones, los cuales son conducidos hasta la coenzima NADP, que se reduce a
NADPH2. La energía producida en forma de ATP y NADPH2 se almacena para ser utilizada
posteriormente en otros procesos(Andersson & Styring,1991; Toledo et al., 2012; ).
Este informe tiene como objetivo el estudio de los procesos involucrados en la fotosíntesis, a
través de la medición de la actividad fotoquímica de cloroplastos in vitro bajo diferentes
condiciones de intensidad de luz, tiempo de exposición a la luz, concentración de cloroplastos y
la acción del herbicida Diclorofenil dimetilurea (DCMU).
Materiales y Métodos
 Aislamiento de cloroplastos: Se tomó 25 g de hoja de S. oleracea. Cortadas en trozos, se
licuo en un vaso frio, con 50 mL de buffer Tris-HCl 40 mM,– NaCl 350 mM a pH 8,
durante 10 s a baja velocidad y por 20 s a velocidad alta. La solución obtenida se filtró
con gasa y se centrifugo a 2000 rpm por 4 min. Se desechó el sobrenadante y el
sedimento se resuspendio en 60 de buffer de maceración a pH 6,8. Todo el proceso se
realizó a temperaturas cercanas a los 4 °C.
 Efecto de la concentración de cloroplastos: Se preparó de la solución madre de
cloroplastos aislados, soluciones con concentración de0,03; 0,04 y 0,06 v/v. y a cada uno
se adiciono 0,3 mL de colorante 2,6 diclorofenol indofenol (DCFIF) al 0,01 %,
agitándose la solución en vortex. Se midió absorbancia inicial a longitud de onda de 610
nm y se expuso cada tratamiento a 10 w/m 2 durante 15 min y se midio absorbancia a igual
longitud de onda. Durante la preparación de cada solución y después de la exposición a la
luz, los tubos se cubrieron con papel aluminio, este parametro se aplicó bajo igual
condición a todos los tubos de los demás experimentos. Eligiendo la concentración de
cloroplastos que reducen la mayor cantidad de DCFIF
 Efecto del tiempo de exposición: A la concentración de cloroplastos elegida en el
experimento de concentración de cloroplastos, se le adiciono 0,3 mL de DCFIF al 0,01 %.
Se midió absorbancia inicial a longitud de onda de 610 nm y se expuso a los siguientes
tiempos de exposición 1, 5, 10, 15, 20 y 25 min a 10 w/m 2, posteriormente se midió
absorbancia a igual longitud de onda.
 Efecto de la intensidad de luz: A la concentración de cloroplastos elegida en el
experimento de concentración de cloroplastos, se le adiciono 0,3 mL de DCFIF al 0,01 %.
Se midió absorbancia inicial a longitud de onda de 610 nm y se expuso a los siguientes
intensidades lumínicas 5, 10, 15 y 20 w/m 2, durante 15 min, posteriormente se midió
absorbancia a igual longitud de onda.
 Efecto del herbicida DCMU: A la concentración de cloroplastos elegida en el
experimento de concentración de cloroplastos, se prepararon soluciones con
concentración de DCMU de 0,5;1 y 5 μM y adiciono 0,3 mL de DCFIF al 0,01 %. Se
midió absorbancia inicial a longitud de onda de 610 nm y se expuso a intensidad lumínica
 de 10 w/m2, durante 15 min, posteriormente se midió absorbancia a igual longitud de
onda.
 Determinación de DCFIF reducido: Para cuantificar la cantidad de DCFIF reducido por
los cloroplastos se empleó una curva de calibración con micromoles de DCFIF reducido
con respecto a la absorbancia.
Resultados y Discusión
La fotosíntesis es esencial para el crecimiento y desarrollo de la planta. Sin embargo este proceso
puede verse afectado por diversos factores que limitan la actividad fotosintética, pudiendo incluso
causar daños irreversibles en la maquinaria enzimática de la célula fotosintética. Estos factores
pueden ser un exceso de radiación que tiene como consecuencia la fotoinhibición o la acción de
herbicidas que provocan la interrupción del acoplamiento entre los fotosistemas I y II.
Experimentalmente se evaluara los mecanismos fisiológicos y moleculares de diferentes factores
que causan estrés en el proceso fotosintético de la planta (Azcón-Bieto & Talón, 2000; Juurola,
2005; Solomon et al., 2008).
Efecto de la concentración de cloroplastos: La proteínas y sustancias esenciales para la
fotosíntesis se encuentran ubicadas en las membranas tilacoides del cloroplasto. Estas proteínas
constituyen el centro de reacción, los complejos de pigmentos antena y las enzimas necesarias
para el transporte de electrones. Es por ello que al momento de extraer los cloroplastos se realizó
en temperatura de 4 °C, pues de esta manera se evita la desnaturalización de las proteínas en el
sistema. En la fig 1 puede observarse la mayor cantidad de DCFIF reducido se alcanza con una
cantidad de 0,4 mL de cloroplastos seguid por 0,6 mL y por último la cantidad de 0,2 mL fue
la que menor cantidad de DCFIF logro reducir. La cantidad de DCFIF reducido está directamente
relacionado con la actividad fotosintética, debido a que este colorante sustituye a la ferredoxina
como aceptor de electrones en la cadena transportadora de electrones del fotosistema I, en
condición oxidada este colorante tiene un color azul, sin embargo al reducirse cuando recibe
electrones se torna de transparente, esto permite cuantificar la actividad fotosintética por técnicas
espectrofotométricas restando la absorbancia al momento de iniciar el experimento y la
absorbancia al terminar el experimento. Expresándose como micromoles de DCFIF reducido
(Decoteau, 1998; Azcón-Bieto & Talón, 2000).
Debido a que el cloroplasto es la organelas capaz de captar los fotones de la luz y transformarlos
en energía electroquímica por acción de los fotosistemas I y II, por tanto a mayor concentración
de cloroplastos mayor cantidad de fotones serán captados, además más moléculas de DCFIF
podrán intervenir en el fotosistema I, debido a la mayor concentración de cloroplastos. Teniendo
como consecuencia directa un aumento proporcional de la tasa fotosintética con respecto a la
concentración de cloroplastos. Sin embargo experimentalmente se observa que la mayor tasa
fotosintética se obtiene a una cantidad de 0,4 mL de cloroplastos y no a 0,6 mL como seria lo
esperado. Se desconoce los motivos de tal variación ( Taiz & Zeiger, 2002)
.
 0.0018
0.0016
0.0014
DCFIF reducido (μM)

0.0012
0.001
0.0008
0.0006 μM DCFIF reducido
0.0004
0.0002
0
0.2 0.4 0.6
Cantidad de cloroplastos (mL)
|

Fig. 1: Efecto de concentración de cloroplastos en la actividad fotosintética

Efecto del tiempo de exposición: En condiciones naturales el proceso fotosintético en la planta
se rige por los ciclos de día y noche. Esto evidencia que el tiempo de exposición a la luz varia
debido a días más largos o cortos, condiciones de nubosidad entre otros aspectos lo que implica
que en mayor o menor medida la tasa fotosintética se verá afectada por el factor tiempo de
exposición. Para evaluar la veracidad de esta hipótesis se sometió a una solución de cloroplastos
a una cantidad de luz constante variando el tiempo de exposición. Los resultados obtenidos
quedan expresados en la fig.2 donde puede observarse que a medida que aumenta el tiempo
aumenta la cantidad de DCFIF reducido hasta alcanzar un pico en 5 min. Luego de esto comienza
a disminuir hasta que llega a casi 0 y se mantiene constante a lo largo del tiempo ( Pibernat &
Abella,1994 ; Herrera et al.,2001; Casierra, 2007)

0.012

0.01
DCFIF reducido (μM)

0.008

0.006
μM DCFIF reducido
0.004

0.002

0
1 5 10 15 20 25
Tiempo de exposicion (min)

Fig.2: Cantidad de micromoles de DCFIF reducidos de acuerdo al tiempo de exposición

El comportamiento observado en la fig.2 se debe a que a medida que trascurre el tiempo las
moléculas de DCFIF sustituyen a la ferredoxina en el el fotosistema I, y se van reduciendo a
consecuencia del estímulo lumínico. Al principio la concentración de DCFIF es alta por lo que
las moléculas tienen mayor probabilidad de interactuar con el fotosistema y compiten con la
ferredoxina.. Sin embargo a medida que pasa el tiempo la concentración de DCFIF va
disminuyendo producto de su reducción química, hasta que el colorante se reduce
completamente, esto se observa a los 15 min, y aunque la actividad fotosintética continua ya no
puede cuantificarse debido a la ausencia de colorante. Este experimento evidencia que a medida
que aumenta el tiempo de exposición, mayor es la cantidad de energía lumínica que el cloroplasto
puede trasformar en energía electroquímica. En un tiempo de exposición de 1 min no se logra
reducir todo el colorante, mientras que a mayor tiempo de exposición mayor cantidad de fotones
son capturados y mayor es la actividad fotosintética en la plantas, a tal punto que en 15 min
puede reducirse todo el colorante presente en la solución (Sheller & Haldrup, 2005; Casierra,
2007)
Efecto de la intensidad de luz: Una porción de la energía lumínica es absorbida por las
clorofilas y los carotenoides, esta energía captada será convertida en energía química mediante un
conjunto de reacciones. La conversión de energía es un proceso complejo que depende de la
cooperación entre los pigmentos fotosintéticos y las proteínas encargadas de la trasferencia de
electrones ubicadas tanto en el fotosistema I como en el fotosistema II. En la fig.3 se observa una
curva con tendencia lineal en el que la cantidad de DCFIF reducido es proporcional a la
intensidad de luz aplicada sobre el sistema ( Pibernat & Abella,1994; Azcón-Bieto & Talón,
2000).

0.0035

0.003

0.0025
DCFIF reducido (μM )

0.002

0.0015
μM DCFIF reducido
0.001

0.0005

0
5 10 15 20
Intensidad de Luz (w/m2)

Fig.3: Efecto de la intensidad fotosintética en la cantidad de DCFIF reducido.

El comportamiento de la cuerva en la fig.1 se debe a que la mayoría de los pigmentos sirven de
complejos antenas, que colectan los fotones de la luz y transfieren la energía a los complejos de
centro de reacción, donde tendrá lugar las reacciones químicas de oxidación y reducción . La
intensidad de la luz en el sistema determinan el número de fotones que incide sobre una
superficie particular. A mayor número de fotones mayor número de pigmentos fotosintéticos son
excitados, transfiriendo los electrones desde la clorofila a la cadena transportadora de electrones
donde por acción de reacciones químicas de oxidación y reducción se permite el flujo de
electrones, debido a que el DCFIF sustituye a la ferredoxina se puede cuantificar la actividad
fotosintética mediante la determinación de DCFIF reducido. De esta manera se puede comprobar
experimentalmente que a medida que aumenta la intensidad de luz, aumenta la actividad
fotosintética( Pibernat & Abella,1994; Azcón-Bieto & Talón, 2000).
Sin embargo es importante destacar que aunque en la curva no se alcanzó la saturación del
proceso de fotosíntesis. En la planta, si la energía lumínica que llega a los centros de reacción
excede la cantidad de energía que puede utilizarse se pueden generar daños en el aparato
fotosintético, en un proceso conocido como fotoinhibición y consiste en la reducción de la
actividad fotosintética consecuencia de un exceso de iluminación. La fotoinhibición tiene como
consecuencia la disminución de la actividad fotorreductora del NADP +, inutilización del
fotosistema II y degradación de la proteína D1. De esta manera la curva completa del efecto de la
intensidad de la luz inicia con un aumento proporcional de la tasa fotosintética a medida que
aumenta la cantidad de luz, luego alcanza una fase estacionaria en la que los pigmentos antenas
alcanzan el límite de fotones que pueden capturar y si continúa aumentando la intensidad de la
luz, ocurren daños en el aparato fotosintético que provocan la disminución de la tasa fotosintética
hasta que no hay actividad en la planta. En base a lo anteriormente descrito se observa que la
intensidad de luz es un factor limitante en la fotosíntesis debido que, a bajos y altos niveles de
intensidad provocan la inhibición de la actividad fotosintética de la planta (Falk et al,.1990
;Demming & Adams, 1992; Sonoike & Terashima,1994)
Efecto del herbicida DCMU: El uso de herbicidas para limpiar los cultivos de plantas dañinas se
ha difundido la agricultura moderna. Se han desarrollado diversas clases de herbicidas, cada uno
afectando de manera particular a la planta, algunos afectan la síntesis de aminoácidos y
carotenoides, lípidos o evitando la división celular. En el caso del DCMU, este es un herbicida
formulado con la capacidad de inhibir el proceso fotosintético. Es por ello que es comúnmente
utilizado en los experimentos de estudio de la fotosíntesis para evaluar los mecanismos de la
fotosíntesis in vitro y tener una aproximación de como la planta se verá afectada en los campos
de cultivo. En la fig.4 se observa como la concentración de DCMU afecta la tasa fotosintética
expresada como cantidad de DCFIF reducido. A una concentración de 1 μM de DCMU se
reduce poco el DCFIF, la máxima cantidad de DCFIF reducido se alcanza con 5 μM de DCMU y
una reducción intermedia ocurre con 10 μM de DCMU. El fundamento del mecanismo de acción
del DCMU consiste en que este herbicida bloquea el flujo de electrones en entre quinonas en el
fotosistema II, EL DCMU compite por el sitio de unión de la plastoquinona de esta manera los
electrones no pueden desplazarse desde la quinona A hasta la quinona b. Esto desacopla a su vez
a los dos fotosistemas evitando la reducción de NADP + a NADPH y por tanto no se obtienen
moléculas energéticas y ocurre una disminución de la actividad fotosintética ( Ridley,1977; Taiz
& Zeiger,2002).
Además Ridley, 1976 plantea que la exposición de luz en cloroplastos in vitro con DCMU
provoca la disrupción de la moléculas de clorofila y de carotenoides teniendo como consecuencia
la fotodestruccion de los complejos antena y de centro de reacción. De igual manera sus
experimentos revelan que a concentraciones de 5 μM de DCMU el cloroplasto se ve
completamente afectado y no permite la realización del proceso de fotosíntesis Teóricamente se
espera que a mayor cantidad de DCMU menor será la cantidad de DCFIF reducido debido a que
al haber más moléculas de DCMU, mayor será la cantidad de cloroplastos afectados en la
solución y habrá menos cloroplastos disponibles para reducir de DCFIF. Sin embargo los
resultados experimentales difieren con los planteamientos teóricos anteriormente descritos. Tal
diferencia podría explicarse por un uso inadecuado de los instrumento de laboratorio, que tiene
como consecuencia la adición de una cantidad de DCMU distinta a la establecida en el protocolo
o el mal estado de DCMU que afecta la eficiencia del reactivo ( Silva et al,.2006).

μM DCFIF reducido
0.005
0.0045
0.004
DCFIF reducido (μM )

0.0035
0.003
0.0025 μM DCFIF reducido
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
1 5 10
DCMU (μM )

Fig.4: Efecto de la concentración de DCMU en la actividad fotosintética de la planta expresada

como cantidad de DCFIF reducido.

Conclusiones
- La tasa fotosintética de los cloroplastos aislados dependerá de la intensidad de luz, el tiempo de
exposición a la luz y concentración de cloroplastos. Cada uno de estos factores pueden beneficiar
o incluso inhibir la capacidad de realizar fotosíntesis en la planta.
- Dada la importancia de la fotosíntesis en la nutrición y crecimiento de la planta, provoca que la
inhibición de este proceso sea el mecanismo de acción de ciertos herbicidas como el DCMU
- Es fundamental que empleen los instrumentos de manera adecuada y se verifique el buen
estado de los reactivos a utilizar puesto que de ello dependerá que los resultados sean confiables
y con un rango de error menor.

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