UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA Bioquímica para enfermería

“AÑO DE LA UNIDAD, LA PAZ Y EL DESARROLLO”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA
SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE
ENFERMERIA

CROMATOGRAFÍA

CURSO: Bioquímica

DOCENTE: Dra. Samame Talledo, Belinda Elvira

CICLO: 2023-II

ALUMNA: Valladolid Checa, Patricia Maribel

PIURA – PERÚ
2023

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ÍNDICE:

LABORATORIO N.º 03........................................................................................................ 3

I. INTRODUCCIÓN: ..................................................................................................... 3
II. OBJETIVOS: .............................................................................................................. 4
III. MARCO TEÓRICO: .............................................................................................. 4
3.1 CROMATOGRAFÍA ............................................................................................... 4
3.2 PARTES DEL SISTEMA CROMATOGRAFICO: ............................................. 4
3.2 CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS [3]: ....... 5
3.3 PROCEDIMIENTO DE SEPARACIÓN: ............................................................. 6
3.4 PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA .................................................................... 7
3.5 REACTIVOS ....................................................................................................... 7
3.6 DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................... 8
3.7 PATRONES EN HCL DE 3 AMINOACIDOS...................................................... 8
3.8 PROCEDIMIENTO: ............................................................................................... 9
IV. CONCLUSIONES: ............................................................................................... 10
V. CUESTIONARIO:.................................................................................................... 10
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: .............................................................. 22

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LABORATORIO N.º 03
“METODOS CROMATOGRAFICOS Y DE SEPARACIÓN EN LA
DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS
PUNTO ISOELECTRICO “

I. INTRODUCCIÓN:
En 1910, el botánico ruso M. Tswett describió por vez primera esta técnica, que fue

aplicada a la separación de pigmentos de plantas, dándole el nombre de cromatografía en

referencia a las bandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorción selectiva

sobre columnas de yeso.

Tras su descubrimiento, la cromatografía quedo prácticamente olvidada hasta 1930

año en que fue redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la separación de

carotenoides; a partir de este momento, el uso de esta técnica se fue extendiendo cada vez

más, al tiempo que se desarrollaban diferentes versiones de la misma: cromatografía de

reparto, de papel, de capa fina, entre otras.

Un hito importante en el desarrollo de la cromatografía lo constituyó el desarrollo de

la cromatografía gas-líquido (Martin y James, 1952), técnica que encontró rápidamente

aplicaciones de gran importancia, lo que llevo a su vez al desarrollo de la teoría de la

separación cromatográfica (Van Deemter, 1956; Giddings, 1965, etc.) así como al

desarrollo de una instrumentación que permitía un mayor control de las condiciones de

trabajo.

La cromatografía se utiliza en una variedad de campos, desde la química analítica y

la investigación farmacéutica hasta la biología y la ciencia de los alimentos. Permite la

separación eficaz de compuestos en una mezcla y proporciona información crucial sobre la

composición y la concentración de sustancias en una muestra. La cromatografía se ha

convertido en una herramienta esencial para la caracterización de compuestos químicos y

desempeña un papel fundamental en la investigación y el control de calidad en numerosas

aplicaciones científicas e industriales.

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II. OBJETIVOS:
• Utilizar el método cromatográfico para una separación.

• Interpretar la finalidad de la cromatografía y sus efectos de solubilidad.

• Conocer las fases de un método cromatográfico, junto con su procedimiento.

III. MARCO TEÓRICO:

3.1 CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un procedimiento químico utilizado en todas las ramas de la

ciencia, que permite la separación, identificación, cuantificación, cualificación y

determinación de los componentes químicos individuales de sustancias en mezclas

complejas, de acuerdo con la purificación de compuestos de una manera muy precisa. Estos

procedimientos, abarcan varias técnicas separativas basadas en propiedades físicas de

ciertos materiales que, en interacción con otras sustancias o mezclas de éstas, permite

descomponer la mezcla y analizar sus constituyentes, mediante una fase móvil que consta,

según el procedimiento, de un líquido o gas que corre a través de una superficie y de la fase

estacionaria y una fase estacionaria de materia sólida o líquida que se queda en la misma

posición [1].

3.2 PARTES DEL SISTEMA CROMATOGRAFICO:

Fase fija: Una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un

sólido, un gel, o un líquido. Si es un líquido, puede estar adherido sobre un sólido. Este

sólido puede o no contribuir al proceso de separación. El líquido también se puede unir

químicamente al sólido (fase unida químicamente) o inmovilizarse sobre él (fase

inmovilizada). La expresión lecho cromatográfico o sorbente, se puede emplear como

término general para denominar cualquiera de las diferentes formas en las que se presenta la

fase estacionaria [2].

Fase móvil: Es un fluido que penetra a través o a lo largo del lecho estacionario, en

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una dirección determinada. Puede ser un líquido (cromatografía de líquidos) o un gas

(cromatografía de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos).

En cromatografía de gases se puede utilizar la expresión gas portador para designar la fase

móvil, y en cromatografía de elución se puede utilizar la palabra eluyente para designar esta

misma fase [2].

3.2 CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS [3]:

• Cromatografía plana: Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse

“en capa fina” o “en capa delgada” porque la fase estacionaria recubre un soporte

plano y rígido.

• Cromatografía en columna: Funcionamiento de una columna, mostrando la carga de

la muestra y diversos momentos a lo largo de la elución:

1. Muestra depositada sobre el lecho cromatográfico

2. La muestra penetra en el lecho
3. Se añade fase móvil
4. Comienza la separación de los componentes de la muestra
5. Eluye el primer componente
6. Eluye el segundo componente
• Cromatografía de gases: Con fase móvil gaseosa: Con fase móvil gaseosa.

1. Cromatografía gas-líquido
2. Cromatografía gas-sólido

• Cromatografía liquida: Con fase móvil liquida.

1. Cromatografía liquido – liquido

2. Cromatografía liquido – sólido
• Cromatografía de adsorción: Diferente afinidad de adsorción de los componentes de

la muestra sobre la superficie de un sólido activo. La adsorción es la capacidad de las

superficies para fijar moléculas.

• Cromatografía de reparto: Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en

la fase estacionaria (caso de la cromatografía de gases), o diferentes solubilidades de

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los componentes en las fases móvil y estacionaria (caso de la cromatografía líquida).

• Cromatografía de intercambio iónico:

1. Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del
disolvente (F.M.) o bien los de la muestra (de ahí la palabra intercambio).
2. Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del
disolvente (F.M.) o bien los de la muestra.
• Cromatografía de exclusión: También se llama de exclusión molecular.

Estrictamente, se basa en diferencias de tamaño, forma o carga entre las moléculas

de los distintos componentes de la muestra, pero lo más habitual es aprovechar

las diferencias de forma y tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía

de exclusión por tamaño, de filtración en gel, de permeación en gel o de tamiz

molecular.

• Cromatografía de afinidad: Variedad particular de cromatografía en la que la

separación se basa en la especificidad biológica singular de interacción entre un

componente de la muestra y otra molécula unida a la F.E.; los ejemplos más

comunes son las interacciones enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y ligando-

receptor.

3.3 PROCEDIMIENTO DE SEPARACIÓN:

Las proteínas en disolución muestran cambios profundos de su solubilidad en función:

1. El pH

2. fuerza iónica

3. propiedades dieléctricas del disolvente

4. temperatura

Estas variables que son reflejo del hecho de que las proteínas son electrolitos de

peso molecular muy grande pueden utilizarse para separar mezclas de proteínas, ya que

cada proteína posee su composición en aminoácidos característicos, la cual determina su

comportamiento como electrolito.

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3.4 PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA

La solubilidad de la mayor parte de proteínas globulares se halla profundamente

influida por el pH del sistema, casi todas las proteínas muestran un mínimo de solubilidad,

aunque el pH al que ello ocurre varía de una a otra.

El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico

definido como aquel valor del pH al que la molécula no posee carga eléctrica. Ej. ovo

albúmina (huevo) pH 4.6 ureasa pH 5 en esas condiciones no existe repulsión electrostática

entre moléculas de proteínas vecinas y tiende a coalcer y precipitar, sin embargo, cuando los

valores del pH están por encima o debajo del punto isoeléctrico, todas las moléculas de

proteínas poseen carga eléctrica neta del mismo signo Por dicha razón se repelen

mutuamente impidiendo las coalescencias de moléculas para formar agregados insolubles.

Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH isoeléctrico diferentes, con

frecuencia pueden separase una de otra, mediante precipitación isoeléctrica, cuando el pH

de una mezcla de proteína se ajusta al pH isoeléctrico de uno de sus componentes.

La mayor parte o casi todo el componente precipitará que dando solución las

proteínas cuyos valores de pH isoeléctrico precipitada permanece en su conformación

nativa y puede disolverse en un medio a pH apropiado y concentración salina adecuada.

3.5 REACTIVOS

1. Fase móvil para cromatografía de papel metano –H2O Piridina (80-20-4)

2. Fase fija para papel de filtro

3. Solución de aminoácidos: arginina 1% en Na (OH) a pH neutro

aspártico 1% hasta disolución

histidina 1% hasta disolución

4. Solución de ninhidrina

ninhidrina 0.1 %

colidina 2 ml.
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ácido acético glacial 10 ml.

5. Ácido acético 1 N: tomar60 ml. de ácido acético glacial, densidad 1.06 pureza

96% y diluir hasta 100 ml con agua destilada

6. Solución de caseína en acetato de sodio 0.1 N

7. Sal de fenolftaleína

8. Na (OH) 10%

3.6 DISEÑO EXPERIMENTAL

1. CROMATOGRAFÍA DE PAPEL

a) Les será dado un papel Whatman N-1 cortado en tiras de 15x25 cm.

aproximadamente, manipule el papel por las esquinas evitando agarrarlo

en lo posible, colóquelo sobre un papel limpio.

b) Engrape un hilo a la parte superior del papel Whatman

c) Con un lápiz marque el punto de origen, trazando una línea, esta debe

estar por encima de la altura del solvente.

d) Aplique utilizando los tubos capilares las diferentes muestras según el

esquema:

HILO

MUESTRA A· B· C.

3.7 PATRONES EN HCL DE 3 AMINOACIDOS

NOTA:

➢ Para Aplicar la muestra tocar el papel levemente con el tubo capilar puesto

verticalmente.

➢ Retire el tubo cuando la mancha haya alcanzado unos 3mm de diámetro.

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➢ Una vez seca la mancha repetir la aplicación dos veces más.

a. Coloque el papel en la cámara dejando que el borde inferior quede sumergido 1

o 2 cm. en el solvente.

b. Dejar el papel en posición rectal asegurando los hilos a los lados de la cinta

adherida

c. Una vez que la muestra halla corrido, sacar el papel.

d. Marcar el límite de migración de frente del solvente.

e. Secar los papeles en un horno.

f. Rociar una solución reveladora, Ninhidrina-colina-ácido acético glacial.

g. Calentar el papel en un horno a 100 ·C hasta que aparezca las manchas.

h. Calcular el Rf de cada mancha, e identifique los aminoácidos.

Rf = distancia del punto de origen al centro de la mancha

distancia del punto de origen al frente del solvente.

i. Determinación del punto isoeléctrico de las proteínas.

3.8 PROCEDIMIENTO:

_ Marcar una serie de tubos del 1 al 9

_ En el tubo 1, medir 3.2 ml. de ácido acético 1N y 6.8 ml de agua destilada

_ Medir 5ml de agua destilada en cada uno de los otros 8 tubos

_ Sacar 5ml de solución del tubo 1 y agregarlos al tubo 2, mezclar

_ Sacar 5ml del tubo 2 y transferir al tubo 3, continuar así hasta el tubo 9, al Final se

eliminan 5ml

_ Agregar 1ml de caseína en acetato de sodio 0.1 N, mezclar

_ Observar el efecto en la solubilidad en cada tubo.

_ Después de 30’ anotar el pH

_ Agregar 1 gota de fenolftaleína y mezclar

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_ Agregar Na (OH) al 10%, agitar hasta la aparición de un color rosado y observar el

efecto sobre la solubilidad.

IV. CONCLUSIONES:

• La cromatografía demostró ser efectiva en la separación de los componentes de la

muestra en función de sus propiedades físicas y químicas. Los diferentes

componentes se movieron a diferentes velocidades a través de la fase estacionaria, lo

que permitió su separación.

• Se identificó a los diferentes componentes presentes en la muestra mediante la

comparación de los tiempos de retención o elución con estándares conocidos. Esto

es especialmente útil cuando se trabaja con muestras desconocidas.

• Existen diferentes tipos de cromatografía las cuales ayudan en la aplicación del

campo de la medicina, biología, microbiología, además cabe mencionar que es un

método que se realiza de una manera sencilla, practica y rápida.

V. CUESTIONARIO:

1. ¿Qué entiendes por cromatografía?

La cromatografía es un método físico de separación ampliamente utilizado en la

ciencia, donde los componentes que se desean separar interactúan con dos fases diferentes.

En este proceso, los componentes se distribuyen entre dos fases: una es la fase estacionaria,

que permanece fija en su lugar, y la otra es la fase móvil, que se desplaza en una dirección

específica [1]. Esta técnica se basa en las diferencias en la afinidad de los componentes por

ambas fases, lo que resulta en una separación efectiva de los mismos.

La cromatografía encuentra aplicaciones en una amplia gama de disciplinas, desde la

química analítica hasta la investigación farmacéutica y la ciencia de los alimentos,

permitiendo la identificación y cuantificación precisa de los componentes de una muestra.

2. Diga tres aplicaciones de la cromatografía en muestras biológicas

1. Aplicaciones forenses: La cromatografía tiene aplicaciones únicas en la

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ciencia forense, como la cuantificación de drogas en muestras biológicas, el

análisis de tintes textiles, la identificación de esteroides en sangre, orina, etc.

La cromatografía es muy importante para el trabajo de patología forense [4].

Juega un papel crucial en la patología forense, brindando a los expertos en

criminalística las herramientas necesarias para analizar evidencia crucial y

proporcionar pruebas sólidas en investigaciones criminales y judiciales.

2. Uno de los estudios más completos sobre la aplicación de cromatografía para

detectar cambios conformacionales de proteínas fue realizado por Withka y sus

colaboradores (Withka y col., 1987), para ello utilizaron tres proteínas modelo:

BSA (albumina de suero bovino), tripsina y lisozima y las analizaron por SEC,

HIC e IEC. En el caso de BSA detectaron cambios conformacionales en SEC

debido al uso de urea. Bajo las condiciones mencionadas, observaron una

disminución en la altura del pico de la proteína nativa a la vez que se observó

un incremento en la altura del pico de un intermediario, el cambio en la altura

de ambos picos fue completamente dependiente de la concentración de urea.

Los cambios conformacionales en BSA están correlacionados con su

comportamiento cromatográfico durante SEC. Cuando se utilizó IEC e HIC

sólo se pudo detectar y cuantificar la forma nativa de BSA. En cuanto a los

estudios con IEC, los tiempos de retención para especies cargadas

positivamente, como el caso de tripsina, disminuyeron cuando se incrementaba

la concentración de urea. Mientras que tanto la tripsina como la lisozima

poseen una carga neta positiva bajo las condiciones empleadas, tripsina

muestra un incremento en el tiempo de retención; lo que sugiere que el efecto

sobre el proceso cromatográfico puede ser independiente de cualquier

modificación de la fase estacionaria por la urea. De manera general, en este

estudio concluyeron que las alteraciones conformacionales detectadas

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cromatográficamente pueden ser correlacionadas directamente con los cambios

detectados por fluorescencia y la medición de actividad enzimática [5].

3. El método de Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) es un método

de separación basado en las diferentes interacciones, tanto físicas como

químicas, que existen entre la muestra y una fase estacionaria contenida en la

columna cromatográfica. De acuerdo a estas interacciones, los distintos

componentes de la muestra atraviesan la columna a diferentes velocidades y de

esa forma se produce la separación de los mismos. Este método de

determinación de concentración de sacarosa y contenido de azúcares reductores

directos (glucosa y fructosa principalmente) en melaza por HPLC brinda una

mayor exactitud en los resultados debido a que es específico y selectivo para

los mismos, permitiendo cuantificar cada azúcar por separado. Sumando

estequiométricamente estos tres azúcares mayoritarios se obtienen los azúcares

reductores totales que pueden ser fermentados por las levaduras para obtener

alcohol (azúcares fermentescibles totales) [6].

3. Diga el fundamento de 2 tipos de cromatografía

Cromatografía de intercambio iónico: La cromatografía de intercambio iónico

(Ion Exchange Chromatography, IEC) separa las moléculas en base a su carga

iónica neta. La separación se lleva a cabo por la competencia entre proteínas con

diferente carga superficial por grupos cargados opuestamente sobre un adsorbente o

una matriz de intercambio icónico. Actualmente, IEC es una de las técnicas de

purificación de proteínas más usadas. En una separación utilizando IEC, las

interacciones hidrofóbicas reversibles entre los solutos son controladas con el

objetivo de favorecer la unión o elución de moléculas específicas logrando su

separación. Una proteína que no tiene carga neta a un pH equivalente a su punto

isoeléctrico (pl) no podrá interactuar con la matriz o fase estacionaria cargada. Sin
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embargo, a un pH por encima de su punto isoeléctrico una proteína podrá ligarse a

una matriz cargada positivamente o intercambiador aniónico mientras que, a un pH

por debajo de su pl, una proteína podrá unirse a una matriz cargada negativamente o

intercambiador catiónico. Dichos intercambiadores existen en estado de equilibrio

entre la fase móvil y la fase estacionaria, dando lugar a dos tipos de IEC, llamados

aniónico y catiónico. La matriz intercambiadora puede incluir protones (H+), grupos

hidroxilo (OH-), iones monoatómicos cargados (Na+, K+, Cl-), iones monoatómicos

doblemente cargados (Ca2+, Mg2+) e iones poliatómicos inorgánicos (SO24-, PO34-),

además de bases orgánicas (NR3H+) y ácidos (R-COO-) [5].

Cromatografía de fase reserva: La cromatografía de fase reversa (Reversed Phase

Chromatography, RPC) describe un tipo de cromatografía en la cual la fase

estacionaria es menos polar que la fase móvil. La RPC es una técnica de

purificación capaz de separar componentes con características muy similares, como

proteínas que difieren en solo un aminoácido e isómeros conformacionales de

péptidos. Sin embargo, el valor de la RPC puede estar limitado por diversos

factores, como el uso de solventes y su disposición final, así como a los bajos

porcentajes de recuperación debidos a los cambios conformacionales ocasionados

por las interacciones envueltas en el proceso [5].

4. Diga dos importancias de la separación de proteínas desde el punto de vista de

la aplicación biológica

En la última década, se ha observado como la industria farmacéutica ha tenido un

fuerte auge en investigaciones y desarrollo de nuevos medicamentos con el fin de

hacer más efectivos sus productos. Con el paso de los años, la utilización de

proteínas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades se ha vuelto cada vez

más popular. Sin embargo, su aplicación se ha visto limitada por la dificultad de

obtener cantidades suficientes del material biológico y la necesidad de dirigir las

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moléculas hacia un área específica del cuerpo, ya que presentan cierta inestabilidad

en su funcionamiento A pesar de sus complicaciones, se han desarrollado grandes

avances para la aplicación de estas proteínas, por ejemplo, la conjugación de

péptidos y proteínas a una o varias cadenas de polietilenglicol (PEG), cuyo proceso

es llamado pegilación [7].

La separación de proteínas es de vital importancia desde el punto de vista de su

aplicación biológica, ya que las proteínas son componentes fundamentales en la

biología y juegan un papel esencial en una variedad de procesos biológicos. La

capacidad de separar y analizar proteínas con precisión y eficacia es esencial para

comprender su estructura, función y regulación, lo que tiene importantes

implicaciones en la investigación científica y en aplicaciones prácticas en áreas

como la medicina, la biotecnología y la industria alimentaria.

5. ¿Qué entiende por punto isoeléctrico de las proteínas?

Denominamos punto isoeléctrico (pI) de un aminoácido al pH al cual no tiene carga neta.

En otras palabras, es el pH al cual la cantidad de carga positiva de un aminoácido es

exactamente igual a la cantidad de carga negativa [8].

Es esencial recordar que los aminoácidos son las unidades básicas de construcción

de las proteínas, y cada aminoácido tiene un grupo amino (NH2) con carga positiva

y un grupo carboxilo (COOH) con carga negativa. Además, en la cadena lateral de

cada aminoácido, hay grupos químicos adicionales que pueden tener cargas

positivas o negativas según el pH del entorno.

El pI es un valor crítico porque, en condiciones de pH por encima de su pI, un

aminoácido o proteína tendrá una carga neta negativa, mientras que, en condiciones

de pH por debajo de su pI, tendrá una carga neta positiva. A medida que el pH se

acerca al pI, las cargas positivas y negativas se equilibran, y la molécula en cuestión

se vuelve eléctricamente neutra. Este concepto es esencial en diversos campos,

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como la electroforesis en gel, donde se utiliza para separar proteínas en función de

sus cargas eléctricas en un gel con gradientes de pH. Además, el pI es importante en

la purificación y caracterización de proteínas, ya que el control del pH puede ayudar

a separar proteínas con diferentes cargas en columnas de cromatografía.

6. ¿Qué entiende por coagulación, precipitación y desnaturalización de

proteínas?

Coagulación de proteínas: Está integrado por una serie de proteínas plasmáticas, a

las que se les asignó un número romano según el orden en el cual fueron

descubiertas. La mayoría de estas proteínas o factores de la coagulación, existen

bajo condiciones fisiológicas en forma inactiva, como cimógenos, que son

convertidos a enzimas activas por ruptura de una o dos uniones peptídicas. Para

indicar la forma activa de los factores de la coagulación se adiciona el sufijo “ a”

después del número romano. No obstante, a algunos factores de la coagulación,

entre ellos la precalicreína (PK), también llamada Factor Fletcher, y los

quininógenos de alto peso molecular (QAPM), no se les asignó ningún número,

mientras que los fosfolípidos plaquetarios, componentes muy importantes del

proceso, no están incluidos en esta clasificación [9].

Precipitación de proteínas: Es útil para la limpieza de diferentes tipos de matrices en

industrias como la alimentaria, y de las bebidas, así como también en la industria

bioanalítica entre otras. Se puede llevar a cabo con solventes orgánicos, ácidos fuertes o

sales, forzando a las proteínas a desnaturalizarse y asociarse con otras en vez de

permanecer en disolución. Además, permite eliminar selectivamente la proteína de una

muestra o reducir la interacción de una molécula pequeña con una proteína de unión en el

plasma, como la vitamina D [10].

Desnaturalización de las proteínas: Es la pérdida de la forma nativa de una

proteína. La desnaturalización implica la ruptura de los enlaces no covalentes en la

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estructura de la proteína, lo que suele provocar la pérdida de la forma,

la estructura y la función de la proteína; como consecuencia se llega a

una degradación. Es una modificación de su conformación, por diversos factores

dentro de los que se encuentra el calor, además las proteínas de productos marinos

son más susceptibles a la desnaturalización que las proteínas de carne roja. Al

aplicar tratamientos térmicos a los alimentos se causa alteración química de

residuos de aminoácidos y se produce formación de nuevos enlaces covalentes intra

o intermoleculares. Estos cambios pueden alterar las propiedades nutritivas y

funcionales de las proteínas y dependen de las condiciones de tiempo y temperatura

de los tratamientos aplicados [11;12].

7. Señalar 3 métodos de fraccionamiento de las proteínas y fundamentar

Centrifugación: Es un método para separar sustancias sólidas de líquidas de

distinta densidad en una mezcla, siempre y cuando las primeras sean insolubles, empleando

para ello la fuerza giratoria o fuerza centrífuga. Para ello se emplea a menudo

una centrífuga, que hace girar la mezcla sobre un eje fijo y determinado. Como su

nombre lo sugiere (centrífuga: que huye del centro), esta fuerza tiende a llevar los

componentes más densos hacia afuera del eje de rotación, dejando a los menos

densos en el centro mismo. Es contraria a la fuerza centrípeta [13]. La

centrifugación de proteínas es una técnica poderosa en la investigación biológica y

bioquímica, ya que permite separar proteínas en función de su tamaño y densidad.

Esto es especialmente útil en la purificación de proteínas y la preparación de

muestras para una variedad de experimentos, incluida la cristalización de proteínas

para estudios estructurales, la caracterización bioquímica y la identificación de

biomarcadores en muestras clínicas.

Electroforesis: Es un método de laboratorio que se usa para separar moléculas de

ADN, ARN o proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se usa una

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corriente eléctrica para mover las moléculas a través de un gel o de otra matriz. Los

poros del gel o la matriz actúan como un tamiz, lo cual permite que las moléculas

más pequeñas se muevan más rápido que las moléculas más grandes. Para

determinar el tamaño de las moléculas de una muestra, se usan estándares de

tamaños conocidos que se separan en el mismo gel y luego se comparan con la

muestra [14]. Se puede utilizar desde la caracterización de proteínas y la

investigación en biología molecular hasta el diagnóstico médico y la evaluación de

la pureza de proteínas en la industria farmacéutica y biotecnológica. Su fundamento

en las propiedades eléctricas y el tamaño de las proteínas la convierte en una

herramienta poderosa para la separación y el análisis de proteínas en diferentes

contextos.

Cromatoenfoque: Por otro lado, el cromatoenfoque es conocido por su alta

resolución, siendo capaz de separar proteínas que difieren en valores de Pl de 0.02

unidades de pH. Su alta resolución permite muchas veces separar isoformas que

presentan propiedades muy similares. Hay dos conceptos claves que explican la alta

resolución de la técnica de cromatoenfoque. El primero es que el desarrollo del

gradiente de pH es lento en comparación a los gradientes que se utilizan en otro tipo

de cromatografías. El segundo es que el flujo de elución es rápido. Esto quiere decir

que, durante un cromatoenfoque, proteínas con puntos isoeléctricos diferentes

migrarán a ritmos distintos a medida que se desarrolla el gradiente de pH. Éstas se

van a unir y disociar continuamente provocando su acumulación en bandas angostas

que eventualmente van a eluir de la columna [15].

8. ¿Cómo se clasifican las proteínas?

Se clasifican en diferentes grupos [16]:

- Proteínas globulares, que adquieren formas más o menos esféricas o

redondeadas; generalmente son solubles en agua o en disoluciones diluidas.

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- Proteínas fibrilares, que adquieren formas alargadas; generalmente son

insolubles en agua y las responsables de la mayor parte de las estructuras fijas

de los organismos.

- Proteínas estructurales, que contribuyen a fijar la forma o dar rigidez o

flexibilidad a las diversas partes de los organismos, desde los orgánulos

celulares a los miembros de los pluricelulares. Pertenecen a este grupo la mayor

parte de las proteínas fibrilares, como el colágeno de los tendones, la queratina

de pelos y uñas, la fibroína de la seda.

- Proteínas de reserva, que constituyen un almacén de aminoácidos que el

organismo utilizará en el crecimiento o reparación de sus estructuras y en su

desarrollo. Ejemplos son la albumina de las semillas, leche y huevos.

- Proteínas activas, que desempeñan múltiples funciones activas en el

funcionamiento del organismo; todas tienen en común que para desempeñar su

función han de interaccionar específicamente con otra sustancia llamada

ligando. A su vez podemos subdividir esta clase de proteínas en las siguientes:

- Enzimas, que se unen a un ligando que se denomina sustrato y catalizan su

transformación química en otra sustancia diferente.

- Proteínas transportadoras, que se unen reversiblemente a un ligando y lo

transportan de un lugar a otro del organismo. Actúan así la hemoglobina y la

mioglobina, citadas como proteínas conjugadas transportadoras de oxígeno, la

primera en la sangre y la segunda en el interior de la célula. Existen proteínas

con forma de canal que sirven para la entrada y salida de otras moléculas a

través de la membrana celular, como los canales de potasio.

- Proteínas reguladoras, interaccionan con el ligando y ponen en marcha

determinados procesos celulares. Por ejemplo, los receptores hormonales, al

unirse a una hormona, el ligando, desencadenan un proceso o conjunto de

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reacciones en la célula.

- Proteínas contráctiles, que, al unirse al ligando, experimentan un cambio de

conformación que tiene como consecuencia el acortamiento o alargamiento del

órgano u orgánulo en que se encuentra. Un ejemplo es la miosina de las fibras

musculares.

- Proteínas inmunes o inmunoglobulinas, que se unen específica e

irreversiblemente a un ligando que es una sustancia tóxica o una célula o

fragmento celular; como consecuencia de dicha unión, el agente tóxico o

antígeno, queda bloqueado y no puede ejercer su función.

9. Diga 8 funciones de las proteínas:

_ Los anticuerpos se unen a partículas extrañas específicas, como virus y

bacterias, para ayudar a proteger el cuerpo [17].

_ Las enzimas llevan a cabo casi todos los miles de reacciones químicas que

ocurren en las células. También ayudan con la formación de nuevas moléculas

leyendo la información genética almacenada en el ADN [17].

_ Al igual que algunos tipos de hormonas, las proteínas mensajeras transmiten

señales para coordinar procesos biológicos entre diferentes células, tejidos y

órganos [17].

_ Estas proteínas brindan estructura y soporte a las células. A mayor escala,

también permiten que el cuerpo se mueva [17].

_ Estas proteínas se unen y transportan átomos y moléculas pequeñas dentro de

las células y por todo el cuerpo [17].

_ La proteína es esencial para el crecimiento celular y tisular, la ingesta adecuada

de proteína es particularmente importante durante los períodos de rápido

crecimiento o aumento de la demanda, como la infancia, la adolescencia, el

embarazo y la lactancia [18]

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_ Las proteínas cumplen funciones vitales en el transporte de nutrientes y

oxígeno a las células y tejidos, como en el caso de la hemoglobina y la

mioglobina [19].

_ Desarrollan una labor de biocatalizadores, activando las interacciones entre

diferentes sustancias llamadas a producir energía o a sintetizar un metabolito

acelerando las reacciones químicas del metabolismo [19].

10. ¿En qué se fundamenta la electroforesis?

Es un método de laboratorio que se usa para separar moléculas de ADN, ARN o

proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se usa una corriente eléctrica

para mover las moléculas a través de un gel o de otra matriz. Los poros del gel o la

matriz actúan como un tamiz, lo cual permite que las moléculas más pequeñas se

muevan más rápido que las moléculas más grandes. Para determinar el tamaño de

las moléculas de una muestra, se usan estándares de tamaños conocidos que se

separan en el mismo gel y luego se comparan con la muestra [14]. Es utilizada para

separar y analizar moléculas, como proteínas y ácidos nucleicos, en función de su

carga eléctrica y movilidad en un campo eléctrico. La electroforesis de proteínas, en

particular, se enfoca en la separación de proteínas en una matriz gelatinosa,

generalmente hecha de poliacrilamida o agarosa.

11. ¿En qué se fundamenta el método cromatográfico de exclusión?

La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en

gel o de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en

la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza

en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este

fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex),

agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles
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(fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de un material

esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado

[20].

Se utiliza una matriz porosa compuesta por partículas esféricas, como agarosa o

poliacrilamida. Estas partículas tienen poros de diferentes tamaños, pero en su

mayoría son mayores que las moléculas que se están separando. La cromatografía

de exclusión no implica interacciones químicas significativas entre las moléculas y

la matriz. La separación es principalmente física debido a las diferencias de tamaño.

La cromatografía de exclusión se utiliza comúnmente en la purificación y

caracterización de biomoléculas, como proteínas y ácidos nucleicos. Permite la

identificación de diferentes formas o tamaños de una molécula y la cuantificación

relativa de estas formas.

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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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