Efecto de la nicotina en RMTG
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emmahdz04072018Efecto de la nicotina en RMTG
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emmahdz04072018Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Psicología
Efecto de la nicotina sobre la actividad
neuronal del núcleo rostromedial
tegmental (RMTG)
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
Licenciado en Psicología
P R E S E N T A :
José Enrique Ramírez Sánchez
TUTOR
Dr. Salvador Leonardo Hernández López
Ciudad Universitaria, Cd. Mx., 2020
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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En memoria de J.G.S.G., J.V.R. y B. Amigos increíbles...
¾Por qué preferir un punto de vista ingenuo basado en buscar la verdad?
¾Por qué preferir un camino oculto tras un velo de obscuro desconocimiento,
habiendo tantos rescates para el alma?
¾Por qué construir de manera microscópica los pequeños pasos para obtener
aproximaciones increíbles?
La única respuesta que encuentro, por ahora es: para saber, conocer y
sobretodo para aliviar esta angustia que aún no resuelvo de donde surge, pero a
veces, muy pocas, por cierto, no me dejan dormir.
Ojalá que cuando los tiempos cambien; se pueda dilucidar cuál increíble es
nuestro organismo y todas las maravillas que realiza de manera humilde, ahí
sin que uno lo note. Solamente, como un accidente, de repente se crea el
pensamiento, los sentimientos, los sueños y mientras eso pasa, sí sólo si eso
pasa, ocurre la vida.
Agradecimientos
Nunca está de más un pequeño espacio donde expresar el agradecimiento que
le tengo a las personas que han socorrido de manera directa, como indirecta a
este trabajo y al autor de dicha tesis. Me sobran los recuerdos y sentimientos,
pero no las palabras para plasmar todo lo que quiero decir. Aquí está una
aproximación muy certera a lo que en verdad siento.
Recuerdo cuando los tiempos eran difíciles. A veces, uno pasa por problemas
que lo ahogan y as xian, donde lo único que se siente además de la tristeza y la
ansiedad conjunta, es un nudo en la garganta. Sin embargo (y gracias a ustedes),
el pensamiento en esas personas que a lo largo de los momentos compartidos
y las consecuencias de esos encuentros, de esas aventuras, lo rescatan; de esta
manera logran aminorar esta vida tan dura, pero tan real. Cada uno de ustedes
conforman un pedazo en este vitral que en conjunto denomino como mi corazón.
Y creanme que aún cuando ustedes se sientan también en una situación similar
o piensen en la ilusión de que todo está mal, tengan por seguro que pueden
contar con alguien que los estima y daría mucho por ustedes, el mismo que
piensa día con día, amancer tras amanecer, que ustedes son las mejores y más
grandiosas personas del mundo.
Lo único que tengo por ahora de testimonio es este trabajo de unos cuantos
años, que más allá de ser simples experimentos, conllevan muchas cosas. Por
ejemplo, el esfuerzo de dejar a un lado algunos caminos fáciles y vacíos, aplazar
momentos únicos y dejar atrás oportunidades importantes con seres queridos.
Ésta es mi formación como investigador, siguiendo aquel sueño de un niño de-
seoso de ser espía, me moría por encontrar verdades. Ahora me doy cuenta que
voy por buen camino y cual bello es esculpir poco a poco la respuesta a una
pregunta.
Dos cuestiones que continuamente se atraviesan en mi pensamiento son:
¾Qué hace que una persona tome un camino y no otro? ¾Qué provoca el ser
lo que soy ahora y no lo que pude haber sido?. Encontrando por resolución el
entorno, ese contexto en el cual uno se desarrolla y por eso les agradezco, por
estar.
v
vi AGRADECIMIENTOS
A mi madre, Laura del Carmen; principalmente por tu apoyo, cariño, fortale-
za, pero sobre todo, la manera tan estricta como me has educado. Me mostraste
que la verdad no tiene puntos medios; es todo o nada. Y además, que la vida no
es fácil, los problemas no se solucionan únicamente con sentirse mal, necesitan
resolverse y seguir adelante teniendo en mente a las personas que son queridas
y amadas. Además de nunca dejar de soñar. Gracias.
A mi tío, Víctor. Por tu sinceridad; me has mostrado lo que es una verdadera
amistad. Sembraste en mi, desde niño, una cultura y un conocimiento que nadie
podrá arrebatarme. Por tus consejos en los momentos mas difíciles y ser lo más
cercano a un ejemplo para mí. Tocaste mi corazón y cambiaste mi destino.
A mi padre; Enrique; por tu esfuerzo y apoyo, velando por salir adelante,
sin importar cuanto cueste, ni cuantos sacri cios se necesiten.
A mi tía Guadalupe y mi tío Juan Manuel; por su cariño, paciencia y preo-
cupación.
A Lorena y Rocío; por escuchar y querer incondicionalmente, buscando en
todas las ocasiones nuestro bienestar. Gracias por ayudarme en tantos proble-
mas, dándome un consejo preciso, sensible y empático. Han creído en mí y en
el camino que tomé; siempre serán como unas hermanas para mí.
A mi más viejo amigo, Aldo Vázquez, su hermana, Valeria, y su madre
Rocío Valerio. Por brindarme en tiemplos complicados, un hogar donde impera
la comprensión, el apoyo, la con anza y la paciencia. Gracias por enseñarme
una de las profesiones más bonitas que siempre ejerceré, la panadería; siempre
les estaré en deuda.
A Marcos Olvera, Kevin Argaéz y Juan Manuel Santiago; por las caminatas,
los juegos, las pláticas, las comidas, las estas, los enojos, las historias, los
sustos, las bromas, los errores, las sinceridades, los consejos, las lágrimas, los
malos ratos, las ilusiones y nuestros sueños, por escucharnos; apoyarnos. La Av.
Insurgentes Sur siempre será nuestra testigo. Son aquellas personas con las que
reíre hasta llorar... Antes de la victoria, amigos.
A mis amigas y compañeras Andrea Mondragón y Gabina Arenas, si tan
sólo pudieran ver la manera más sincera y honesta de como yo las miro. Les
agradezco por hacerme sentir algo que muy pocas veces he experimentado y eso
es el mirarme a los ojos y creer en mi genuinamente. Agradecido por el soporte,
en una de las situaciones más complicadas de mi vida. Espero sigamos creciento
y creando conocimientos y moementos juntos.
vii
A Everardo y Paulina; desde los cafés capuccinos acopañados de panquecitos
mientras platicamos sobre nuestros problemas, hasta los momentos de deshini-
bición absoluta. Tantas alegrías y re exiones, como aquella, donde tenemos la
certeza de que la realidad nos engaña todo el tiempo y la única verdad veri cable
es nuestra amistad.
A Paulina Torres y Mariana Vergel; si bien el tiempo nos ha distanciado,
traigo siempre presente esas aventuras, risas y preocupaciones. MEP para siem-
pre.
A K. R.; a pesar de lo que nos depare el futuro, te agradezco por el apoyo
y la escucha en tantas situaciones. Llegamos a vencer el tiempo, formando y
creyendo en ese "nosotros". Tu esfuerzo siempre fué más allá de lo que nuestro
vínculo nos pudo demandar. Siempre contarás conmigo.
A Sonia y Diego; gracias por todas esas aventuras y todo el apoyo en el
desarrollo de este trabajo.
A los Doctores Salvador Hernández y Julieta Garduño; por su perseverancia
y apoyo en mi formación tanto académica, como personal. Sobretodo, por esa
con anza y paciencia ante cada locura que a veces suelo decir. Espero que los
futuros proyectos también puedan traernos muchas más alegrías.
A ti Gabriela. A veces, me encuentro con la esperanza de que si existiera ese
cielo que nos educaron a creer, el mío sería repitir ese momento donde aquellos
dos niños con tantos sueños e ilusiones caminan día tras día sobre las calles de
la colonia Extremadura Insurgentes, tomados de la mano de su abuelo.
Agradecimientos especiales a DGAPA-PAPIIT por el nanciamiento del pro-
yecto IN216319 al Dr. Salvador L. Hernández López (tutor de ésta tesis).
Resumen
El núcleo rostromedial tegmental (RMTg) es una estructura situada en la
parte posterior del núcleo ventral tegmental (VTA), por ello también es cono-
cido como la cola del núcleo VTA (tVTA). Del 70 % al 92 % de las neuronas
que lo conforman son GABAérgicas. El núcleo RMTg ha sido descrito como un
modulador de la actividad dopaminérgica (DA) del complejo VTA-substancia
negra compacta (SNc) el cual tiene un papel fundamental en la codi cación de
señales aversivas o grati cantes en roedores y primates. Estudios anatómicos
han demostrado que el RMTg recibe una densa inervación glutamatérgica pro-
veniente de la habénula lateral (LHb). Asimismo, este núcleo recibe importantes
aferencias colinérgicas que se originan de los núcleos tegmentales pedunculopon-
tino y laterodorsal. En varias estructuras del sistema nervioso central (SNC) se
ha observado que la acetilcolina es capaz de modular la liberación de diversos
neurotransmisores a través de la activación de receptores colinérgicos de tipo
nicotínico (nAChRs). Sin embargo, se desconoce si la acetilcolina es capaz de
incrementar la liberación de glutamato en el núcleo RMTg. En el presente traba-
jo se emplearon técnicas de registro electro siológico en célula completa (patch
clamp), para investigar el efecto de la nicotina sobre la liberación de glutamato
en el núcleo RMTg. Asimismo, se utilizó la técnica de imagenología de calcio
para determinar el efecto nicotínico sobre la excitabilidad de las neuronas GA-
BAérgicas en este núcleo. La técnica de imagenología de calcio permite estudiar
el efecto de la nicotina sobre una población de neuronas de manera simultánea,
pero con resolución de célula única.
Se demostró que la nicotina incrementa los sEPSCs en células GABAérgicas
del núcleo RMTg. Esto, mediante la activación presináptica de nAChRs homo-
méricos conformados por la subunidad α7. Además, este efecto de la nicotina fue
congruente con una activación poblacional tras la presencia de nicotina, la cual
promovió una mayor sincronía en el disparo de las células del núcleo RMTg.
La presente tesis tiene importantes implicaciones siológicas, conductuales y
clínicas ya que el núcleo RMTg ejerce un efecto inhibitorio sobre las neuronas
ix
x RESUMEN
dopaminérgicas del VTA y la SNc regulando las señales aversivas y el apren-
dizaje por reforzamiento. El núcleo RMTg se ha propuesto como un posible
blanco para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos como la ansiedad y
la depresión, así como de conductas adictivas.
Índice general
Agradecimientos v
Resumen ix
1. Introducción 1
2. Marco teórico 4
2.1. Adicción a nicotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.2. La nicotina y el sistema dopaminérgico mesolímbico . . . . . . . 7
2.3. El núcleo rostromedial tegmental. . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3.1. Aferencias del núcleo rostromedial tegmental . . . . . . . 9
2.3.2. Eferencias del RMTg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.3.3. RMTg y codi cación de señales . . . . . . . . . . . . . . 11
2.3.4. RMTg y sustancias de abuso . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.3.5. La nicotina y el núcleo RMTg . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.4. Justi cación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.5. Hipótesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.6. Hipótesis especí cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.7. Objetivo General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.8. Objetivos especí cos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3. Materiales y Métodos 22
3.1. Animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2. Obtención de rebanadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.3. Electro siología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.4. Administración de fármacos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.5. Aplicación local de acetilcolina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.6. Inmunohistoquímica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.7. Imagenología de calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.8. Análisis de imágenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.9. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
xi
xii ÍNDICE GENERAL
4. Resultados 29
4.1. Electro siología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.1.1. La nicotina afecta la frecuencia de las sEPSCs en las cé-
lulas GABAérgicas del núcleo RMTg . . . . . . . . . . . 29
4.1.2. El antagonismo de los nAChRs tipo α7, previene los efec-
tos de la nicotina sobre las células del núcleo RMTg. . . 32
4.1.3. La adición de un agonista selectivo a receptores α7, tiene
efectos similares a los de la nicotina sobre las células del
núcleo RMTg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.1.4. El antagonismo especí co a receptores tipo α4β 2, no pre-
viene los efectos de la nicotina sobre las células GABAér-
gicas del núcleo RMTg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.1.5. Un agonista selectivo a receptores α4β 2, no tiene efecto
sobre las sEPSCs en células del núcleo RMTg. . . . . . . 36
4.2. Imagenología de Calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.1. La nicotina incrementa el disparo neuronal poblacional en
el núcleo RMTg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.2. Los efectos de la nicotina sobre las poblaciones celula-
res del núcleo RMTg son prevenidos por un antagonista
selectivo a los nAChRs α7. . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
5. Discusión 41
6. Conclusiones 47
Índice de guras
2.1. Receptores nicotínicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2. Nicotina y sus efectos en el sistema DA mesolímbico. . . . . . . 8
2.3. Localización del núcleo RMTg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.4. Aferencias del núcleo RMTg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.5. Eferencias del núcleo RMTg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.6. Modelo del eje LHb-RMTg-VTA/SNc. . . . . . . . . . . . . . . 12
2.7. RMTg y su respuesta a diversas sustancias de abuso. . . . . . . 15
3.1. Técnica de imagenología de calcio. . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.1. Efecto de la nicotina sobre la actividad eléctrica de células del
núcleo RMTg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1. Efecto de la nicotina sobre la actividad eléctrica de células del
núcleo RMTg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.2. Los efectos de la nicotina sobre las sEPSCs son bloqueados por
un antagonista selectivo a nAChRs del subtipo α7. . . . . . . . 32
4.2. Los efectos de la nicotina sobre las sEPSCs son bloqueados por
un antagonista selectivo a nAChRs del subtipo α7. . . . . . . . 33
4.3. Un agonista selectivo de los nAChRs tipo α7 mimetiza los efectos
de la nicotina en las sEPSCs de las células del núcleo RMTg. . . 34
4.4. La presencia de un antagonista selectivo a nAChRs tipo α4β 2 no
previene los efectos de la nicotina sobre las sEPSCs. . . . . . . . 35
4.5. Un agonista con alta a nidad por los nAChRS tipo α 4β 2 no
mimetiza los efectos de la nicotina. . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.6. Registro poblacional de la actividad neuronal producida por ni-
cotina en el núcleo RMTg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.6. Registro poblacional de la actividad neuronal producida por ni-
cotina en el núcleo RMTg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.7. Registro poblacional de la actividad neuronal producida por ni-
cotina en presencia de MLA en el núcleo RMTg. . . . . . . . . . 39
5.1. Nicotina y el control de la actividad DA mediante nAChRs α7. . 44
xiii
xiv
Lista de abreviaturas
ACh Acetilcolina
CBR1 Receptor a canabinoides tipo 1
DA Dopamina / Dopaminérgico
DMSO Dimetilsufóxido
DR Rafé dorsal
EPSC Corrientes excitatorias postsinápticas
FR Fascículo retro exus
GABA Ácido gamma-aminobutírico
IP Núcleo interpeduncular
IPSPs Potenciales postsinápticos inhibitorios
LDTg Núcleo laterodorsal tegmental
LHb Habénula lateral
NAc Núcleo accumbens
nAChRs Receptores de acetilcolina nicotínicos
NIDA Intituto nacional del abuso de drogas-E.U.
PPTg Núcleo pedunculopontino tegmental
RMTg Núcleo rostromedial tegmental
RR Campo retrorubral
SEPSCs Corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas
SNC Sistema nervioso central
SNc Sustancia negra compacta
TH Tirosina hidroxilasa
VTA Área ventral tegmental
Capı́tulo 1
Introducción
Las recompensas y los castigos son eventos esenciales en el moldeamiento
conductual de los animales. Dichos eventos de nirán las respuestas conductua-
les futuras, siempre y cuando exista una contingencia entre ellas, generando un
aprendizaje adaptativo (Schultz, 2016). Todo organismo busca emitir una con-
ducta óptima donde se obtengan reforzantes y se eviten los castigos (Bromberg-
Martin et al., 2010). Sin embargo, existen alteraciones o desórdenes psicológicos
que pueden afectar la emisión de una respuesta adecuada ante cierta situación
que se enfrente, lo cual conduce a una desadaptación al entorno (Schultz, 2016).
Ejemplos de estos desórdenes son las adicciones, de nidas por el Instituto
Nacional sobre el Abuso de Drogas (NIDA, 2016), como un trastorno crónico
y recurrente, caracterizado por la búsqueda compulsiva y el uso de alguna sus-
tancia nociva sin importar las consecuencias. El abuso de drogas es considerado
un desorden del sistema nervioso central (SNC), debido a que ocurre un cambio
funcional en los circuitos cerebrales, implicados en la codi cación de recompen-
sas, estrés y autocontrol. Estos cambios tienen una duración muy amplia en el
tiempo, inclusive aún después de que la persona haya detenido el consumo de
la sustancia nociva (Hyman et al., 2006).
El sistema dopaminérgico mesolímbico, el cual es fundamental en el apren-
dizaje de reforzadores y castigos, es uno de los principales sistemas neurona-
les alterados en las adicciones (Goldstein y Volkow, 2002). Dicho sistema está
constituido por los núcleos mesencefálicos del área ventral tegmental (VTA), la
1
2 CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN
substancia negra compacta (SNc) y sus proyecciones dopaminérgicas a la corte-
za prefrontal y áreas subcorticales. El neurotransmisor dopamina (DA) tiene un
papel fundamental en el control de la motivación mediante el procesamiento de
aspectos especí cos de las consecuencias de la respuesta de un animal, como lo
son: la cantidad, probabilidad y el valor subjetivo de los estímulos. Por lo tanto,
este sistema es vital para el aprendizaje y la toma de decisiones (Bjorklund y
Dunnett, 2007; Bromber-Martin et al., 2010).
Otra estructura fundamental en los procesos de aprendizaje por reforza-
miento y aversión es el núcleo rostromedial tegmental (RMTg). Ésta, es una
estructura bilateral situada en la parte posterior del VTA. Por ello, también
es conocido como la cola del núcleo VTA (tVTA). El núcleo RMTg ha sido
descrito como un modulador GABAérgico de la actividad dopaminérgica del
complejo VTA-SNc y tiene un papel fundamental en la codi cación de señales
aversivas y grati cantes en roedores (Jhou et al., 2009; Sánchez-Catalán et al.,
2017; Stamatakis y Stuber, 2012) y en primates (Hong et al., 2011).
El descubrimiento de este núcleo fue debido a una serie de observaciones que
demostraron la conectividad de un grupo de neuronas que expresaban genes de
expresión temprana después de la administración de drogas psicoestimulantes
(Scammel et al., 2000; Jhou, 2005; Perrotti et al., 2005; Zahm et al., 2010). Éstas
mismas neuronas mostraban un notable marcaje después de la inyección de
trazadores retrógrados en el núcleo VTA (Geisler et al., 2008; Jhou, 2005; Jhou
et al., 2009) y expresaban la enzima ácido glutámico descarboxilasa (GAD) lo
cual indica el uso de GABA como neurotransmisor (Jhou et al., 2009; Kau ing
et al., 2010). Finalmente, otra región importante en el establecimiento y las
consecuencias de las adicciones (sensibilización y abstinencia) es la habénula
lateral (LHb) la cual origina una gran densidad de proyecciones glutamatérgicas
hacia las neuronas GABAérgicas del RMTg constituyendo la principal entrada
excitatoria a este núcleo (Jhou et al., 2009). Se sabe que los estímulos aversivos
producen una activación de las neuronas de la LHb las cuales tienen un efecto
excitatorio glutamatérgico sobre las neuronas GABAérgicas del RMTg. Éstas,
a su vez, producen un efecto inhibitorio mediado por GABA sobre las neuronas
DA del VTA. A través de esta vía, la LHb provoca la inhibición de alrededor del
95 % de células dopaminérgicas del VTA (Ji y Shepard, 2007). Esto ha llevado a
3
sugerir que el núcleo RMTg funciona como un freno del sistema dopaminérgico
mesolímbico (Bourdy y Barrot, 2012).
El núcleo RMTg recibe importantes aferencias colinérgicas que ejercen sus
efectos a través de receptores colinérgicos de tipo nicotínico (nAChRs). Éste
es el tema central del presente trabajo de tesis, pues el interés principal fue
investigar si la nicotina, la cual es una droga de abuso común, podría modular
la actividad del RMTg. Debido al control tónico que el núcleo RMTg ejerce
sobre las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, es válido inferir que la re-
gulación de la actividad de este núcleo por la nicotina tendría consecuencias
importantes sobre el funcionamiento del sistema dopaminérgico mesolímbico y
el aprendizaje de conductas por reforzamiento. Para estudiar el efecto de la
nicotina en el RMTg, en este trabajo se emplearon técnicas electro siológicas y
de imagenología de calcio.
Capı́tulo 2
Marco teórico
2.1. Adicción a nicotina
El consumo de tabaco es un problema mundial de salud pública, causando
el deceso de más de 7 millones de consumidores directos y 1.2 millones de
personas expuestas a humo ajeno. A pesar de sus negativas consecuencias, el
tabaco es usado comúnmente en todo el mundo, ya que aproximadamente 1.1
billones de personas lo consumen y cerca del 80 % de estos consumidores viven
en países de ingresos medianos o bajos (OMS, 2015). Por otra parte, sólo el
5 % de intentos de parar el consumo de esta droga, sin ayuda especializada, son
exitosos. Fumar es altamente coincidente con ciertos desórdenes psiquiátricos
incluyendo depresión, ansiedad y adicciones a otras drogas de abuso (Miller y
Picciotto, 2016).
De acuerdo con el manual diagnóstico y estadístico de desórdenes mentales
en su quinta edición (DSM-5, por sus siglas en inglés), la adicción al tabaco es
diagnosticado cuando un paciente presenta al menos dos de once criterios, en
los cuales están incluidos: el control de citario sobre su uso, deseos insistentes
en dejar o controlar su consumo, así como fallos en estos intentos, alta inversión
de tiempo intentando obtener la sustancia, deseo intenso de consumo a pesar de
tener problemas recurrentes causados o exacerbados en torno al uso de la dro-
ga, riesgos físicos, tolerancia y abstinencia (American Psychiatric Association,
2013). Además, dos indicadores fuertes en la adicción a nicotina son el número
de cigarros fumados al día y el tiempo que transcurre desde despertarse hasta
consumir el primer cigarro del día (Miller y Picciotto, 2016).
4
2.1. ADICCIÓN A NICOTINA 5
La nicotina es el principal componente psicoactivo del tabaco. Es un alcaloide
altamente adictivo y responsable de la gran prevalencia del uso de tabaco. Ésta
droga ejerce sus efectos por medio de su unión, activación y desensibilización
de los nAChRs expresados en todo el SNC que se encuentran en elementos
neuronales, tanto presinápticos como postsinápticos (Miller y Piccioto, 2016).
Los nAChRs son pentámeros formados por 5 subunidades, que pueden ser
tipo α o β. Cuando los receptores nicotínicos están conformados por 5 subuni-
dades idénticas que suelen ser del tipo α (p.e., α7 ó α9) se les denomina
homo-oligómeros. En cambio, cuando están conformados por la combinación
de subunidades α y β se les llama heterómeros (Changeux et al., 1992, 1998).
Actualmente, se han identi cado 9 subunidades α (α 2 α10), la subunidad α8
se ha localizado en aves pero no se encuentra en mamíferos (Lindstrom et al.,
1996). De la subunidad β se han identi cado a la fecha sólo tres tipos (β 2, β3
y β 4; Hogg et al., 2003; Gotti y Clementi, 2004; Dani y Bertrand, 2007). La
combinación de diferentes subunidades da lugar a diversos subtipos de nAChRs
nombrados con base en la combinación de las subunidades α y β que contienen
(Fig 2.1). Por ejemplo, existen los subtipos α2β 2, α2β 4, α3β 2, α3β 4, α4β 2, α7,
etc. (Wu y Lukas, 2011). Sin embargo, se sabe que aproximadamente el 90 %
de los nAChRs expresados en el SNC son de los subtipos α 4β 2 y α7 (Whiting
y Lindstrom, 1986). Las subunidades que constituyen los nAChRs les con eren
sus propiedades electro siológicas y farmacológicas, determinando su a nidad
a los agonistas y antagonistas. Además, in uyen la potencia y la e cacia de
estos compuestos (Luetje y Patrick, 1991; Harvey et al., 1997; Stauderman et
al., 1998). El receptor nicotínico α4β 2 está conformado por 2 subunidades α4 y
3 subunidades β 2. Si bien, se ha descrito otra estequiometria de este receptor,
la relación en la expresión de estas dos conformaciones proteicas aún no está
bien esclarecida (Lucero et al., 2016; Carbone et al., 2009). Este es el nAChR
de mayor distribución en el SNC y está localizado principalmente en la corteza
cerebral, núcleo estriado, núcleo supraquiasmático, núcleo geniculado lateral y
el mesencéfalo (Whiting et al. 1991; Flores et al. 1992). Los receptores α 4β 2
tienen mucha mayor a nidad (rango nanomolar) por la nicotina en comparación
con el receptor α7 (rango micromolar) pero se desensibilizan más rápidamente
(Zoli et al., 1998; Lambe et al., 2003; Wooltorton et al., 2003). Los receptores
α7 son homo-oligómeros constituidos por 5 subunidades α7 idénticas. Tienen
6 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
una amplia distribución en el cerebro incluyendo la corteza, el hipocampo y las
regiones subcorticales límbicas, con una menor distribución en regiones talámi-
cas y ganglios basales (Breese et al., 1997; Broide et al., 1995; Machaalani et
al., 2010). Los receptores α7 tienen 10 veces más permeabilidad al calcio que los
receptores α4β 2 (Role y Berg, 1996) y se desensibilizan con cantidades saturan-
tes de acetilcolina o nicotina (Seguela et al., 1993). Se sabe que, en el encéfalo,
los nAChRs se localizan principalmente en las terminales sinápticas donde par-
ticipan modulando la liberación de diversos neurotransmisores (Wonnacott et
al., 1997).
Figura 2.1: Receptores nicotínicos.
A) Ilustración esquemática de los nAChRs como pentámeros conformados por 5
subunidades las cuales pueden ser α y β . Los receptores que están conformados por
diferentes subunidades se les conoce como hererómeros o heteroméricos, en cambio,
los receptores que son conformados por 5 subunidades idénticas son llamados homo-
oligoméros u homoméricos. B) La conformación que tiene el receptor le con eren
propiedades farmacológicas y físicas especí cas, por ejemplo, su a nidad por el ligan-
do, sus cinéticas de activación e inactivación, su permeabilidad a cationes como Ca+2
o Na+ , etc. La localización de estos receptores es principalmente presináptica, sin em-
bargo, también se encuentra en elementos neuronales postsinápticos como dendritas
y somas (Modi cada de Cali et al., 2019).
2.2. LA NICOTINA Y EL SISTEMA DOPAMINÉRGICO MESOLÍMBICO 7
2.2. La nicotina y el sistema dopaminérgico me-
solímbico
Las propiedades adictivas de la nicotina son mediadas por el sistema DA me-
solímbico y sus proyecciones hacia el núcleo accumbens (NAc), además de las
eferencias de este último a la corteza, el neoestriado, la amígdala, el hipocampo
y otras áreas subcorticales (Björklund y Dunnett, 2007). La nicotina incrementa
la transmisión de DA del núcleo VTA mediante múltiples mecanismos media-
dos por nAChRs. Por ejemplo, la activación de nAChRs α 4β 2 en el soma de
células DA incrementan su excitabilidad y la tasa de disparo. Además nAChRs
α 4β 2α 6 en terminales dopaminérgicas incrementan la liberación de DA en el
NAc (Picciotto et al., 1998; Zoli et al., 2002). Finalmente, la nicotina puede
activar receptores presinápticos nAChRs α7 de terminales glutamatérgicas en
el VTA, lo cual induce el incremento de liberación de glutamato sobre neuronas
DA (Fig. 2.2) (Miller y Picciotto, 2016).
Precisamente, una de las vías importantes que es alterada, por el abuso de
nicotina, es la proyección dopaminérgica del VTA al NAc, lo cual contribuye
a las propiedades adictivas y reforzadoras de esta droga (Mao et al., 2011).
Por ejemplo, previamente se ha demostrado que la exposición aguda a nicotina
en rebanas cerebrales de ratas jóvenes promueve la potenciación a largo plazo
(LTP) dependiente de receptores NMDA en sinapsis excitatorias de neuronas
DA del VTA. Además, se observó un incremento en la tasa de expresión de los
receptores AMPA/NMDA en neuronas dopaminérgicas, siendo consistente con
la generación de LTP en estas sinapsis (Gao et al., 2010). Por otra parte, se ha
reportado que, en el NAc, la aplicación aguda de nicotina produce un incremento
persistente en la transmisión glutamatérgica (Mansvelder et al., 2002).
2.3. El núcleo rostromedial tegmental.
El núcleo RMTg también llamado cola del VTA (tVTA; Kau ing et al.,
2009; Perrotti et al., 2005), es parte de la formación reticular medial mesopon-
tina (Zahm, 2010), ha sido descrito en primates (Hong., 2011) y en roedores
(Stamatakis y Stuber, 2012) como una estructura bilateral, conformada por un
70 %-90 % de células GABAérgicas.
8 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
Figura 2.2: Nicotina y sus efectos en el sistema DA mesolímbico.
Representación esquemática del mecanismo celular y molecular subyacente al incre-
mento dopaminérgico (DA) por la activación de nAChRs. Area ventral tegmental
(VTA), núcleo accumbens (NAc), neurona colinérgica (ACh), neurona glutamatérgica
(Glu), neurona dopaminérgica (DA) (Modi cado de Miller y Piccioto, 2016).
La nomenclatura tVTA hace alusión al primer tercio de esta estructura,
debido a que se encuentra inserta en la parte posterior del VTA (Geisler et
al., 2008; Barrot y Thome, 2011). Otra nomenclatura asignada para la misma
estructura es RMTg, debido a que la parte posterior del núcleo se extiende cau-
dalmente en dirección al borde rostral del núcleo pendunculopontino tegmental
(PPTg), compartiendo cierta homología con núcleos tegmentales. Además, este
nombre es consistente con la nomenclatura de otras estructuras mesopontinas
(Bourdy y Barrot, 2012). Si bien ambas nomenclaturas tienen la misma validez,
en este trabajo se hará referencia a esta estructura como núcleo RMTg.
La localización del núcleo RMTg es posterior al núcleo VTA y dorsal al
núcleo interpeduncular (IP; Perrotti et al., 2005), extendiéndose en sentido
rostral-caudal en las zonas ventrales mesopontinas, quedando incrustada dentro
de la decusación del pedúnculo cerebeloso superior (Fig. 2.3) (Bourdy y Barrot,
2012). En atlas cerebrales de rata, su localización lo de ne como parte del nú-
cleo paranigral (PN; Paxinos and Watson, 2007), sin embargo, esta estructura
se diferencia de otras aledañas debido a la expresión del enzima ácido glutámico
decarboxilasa (GAD67 ) sintetizadora de ácido gamma-aminobutírico (GABA)
(Olson y Nestler, 2007), así como por su respuesta a diversos psicoestimulantes
2.3. EL NÚCLEO ROSTROMEDIAL TEGMENTAL. 9
como cocaína y anfetaminas (Kau ing et al., 2010; Geisler et al., 2008; Barrot
et al., 2012).
Figura 2.3: Localización del núcleo RMTg.
A)Ilustración esquemática en un plano coronal de la ubicación del RMTg (rojo).
En ratas el RMTg se extiende, en sentido rostro-caudal, aproximadamente de -6 a -7
mm a partir de bregma. B) Esquema sagital, delimitando en azul al núcleo RMTg y
en rojo al VTA y la SNc. C) Corte para-sagital 0.5mm lateral a la línea media. En café
se muestra la inmunohistoquímica para tirosina hidroxilasa (TH; delimitado en rojo),
que corresponde al VTA. En negro, se muestra la inmunohistoquímica para el receptor
opioide µ, que corresponde a la región del RMTg (delimitada en azul). Sustancia negra
compacta (SNc), Núcleo ventral tegmental (VTA), Nucleo rostromedial tegmental
(RMTg).
Estudios electro siológicos demuestran que la tasa de disparo de las neuronas
del RMTg registradas in vivo oscila entre 11 y 18 Hz, y la duración media del
potencial de acción tiene un valor aproximado de 1 ms (Jhou et al., 2009; Lecca
et al., 2011). En células de la misma estructura, pero en primates se observa una
media similar en la tasa de disparo; en cambio, el valor promedio de la duración
del potencial de acción es de 0.66 ms (Bourdy y Barrot, 2012).
2.3.1. Aferencias del núcleo rostromedial tegmental
Las aferencias más importantes al núcleo RMTg provienen principalmente
de la LHb, el área preóptica lateral, las áreas laterales y dorsales del hipotálamo,
el rafé dorsal (DR), los núcleos tegmentales LDTg y PPTg (Fig. 2.4; Jhou et
10 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
al., 2009; Kau ing et al., 2009; Yetniko et al., 2014; Bourdy y Barrot, 2012).
Figura 2.4: Aferencias del núcleo RMTg.
Estructuras que proyectan hacia el núcleo RMTg (en verde). Las principales aferencias
se originan en la habénula lateral (LHb), el hipotálamo (Hyp), los colículos superiores
(SC), la zona periacueductal gris (PAG), el rafé dorsal (DR), el núcleo laterodorsal
tegmental (LTDg) y el núcleo pedunculopontino tegmental (PPTg).
La proyección LHb-RMTg está comprendida como parte del fascículo retro-
exus (FR; Lavezzi y Zahm, 2011) y se encuentra organizada de manera topo-
grá ca, donde zonas mediales y laterales del núcleo RMTg reciben proyecciones
de áreas mediales y laterales de la LHb, respectivamente. Aproximadamente
sólo el 35 % de los axones que comprenden esta proyección están mielinizados
(Balcita-Pedicino et al., 2011; Fakhoury, 2018). Esta proyección es glutama-
térgica, por lo tanto, se trata de una aferente excitatoria (Balcita-Pedicino et
al., 2011; Brinschwitz et al., 2010; Hong et al., 2011). Se ha sugerido que las
terminales presinápticas LHb-RMTg expresan receptores nicotínicos (nAChR),
compuestos en su mayoría por la subunidad α7, además de la expresión de
receptores a cannabinoides de tipo 1 (CBR1 ; Lecca et al., 2011).
La caracterización de las demás entradas de información del RMTg aún es
muy limitada, sin embargo, se ha reportado que las aferencias que surgen desde
el núcleo DR y del locus coeruleus son de naturaleza serotoninérgica y noradre-
nérgica, respectivamente. Finalmente, el RMTg es densamente innervado por
aferentes colinérgicas que provienen de los núcleos LDTg y PPTg (Ikemoto y
Bonci, 2014; Yetniko et al., 2014).
2.3.2. Eferencias del RMTg
Las eferencias del RMTg son más especí cas en comparación a sus aferen-
cias, teniendo por blanco principal cuerpos celulares DA del complejo VTA-SNc,
extendiéndose de menor manera al campo retrorubral (Fig. 2.5). Aproximada-
2.3. EL NÚCLEO ROSTROMEDIAL TEGMENTAL. 11
mente el 80 % de terminales axónicas del RMTg forman sinapsis simétricas
(inhibitorias), con dendritas inmunoreactivas a la enzima tirosina hidroxilasa
(TH) la cual es indicativa de la presencia de DA (Jhou et al., 2009; Kau ing et
al., 2010; Bourdy and Barrot, 2012).
El RMTg también tiene proyecciones robustas al hipotálamo lateral, regiones
de la parte medial del PPTg, la substancia gris periacueductal, el núcleo DR, y
la formación reticular y bulbar (Barrot y Thome, 2011; Bourdy y Barrot, 2012;
Fakhoury, 2018).
Figura 2.5: Eferencias del núcleo RMTg.
Estructuras blanco de las eferencias del núcleo RMTg (en rojo). Como puede observar-
se en el esquema las eferentes proyectan preferentemente a los núcleos que conforman
el sistema DA mesencefálico. Estos son, el núcleo ventral tegmental (VTA), la sustan-
cia negra compacta (SNc) y en menor medida al campo retrorubral (RR). Además
de estas regiones, el núcleo RMTg origina densas proyecciones al hipotálamo lateral
(LH).
Interesantemente, se ha reportado la existencia de eferentes colateralizadas
del núcleo RMTg al núcleo VTA y DR (Lavezzi et al., 2012), lo cual sugiere
una posible regulación coordinada de estas áreas. Esto sitúa al núcleo RMTg
como un modulador de la actividad DA y un posible regulador de la actividad
serotoninérgica, importante en la codi cación de señales del entorno y cuya
actividad celular es similar a las células DA del núcleo VTA (Barrot et al.,
2012, Cohen et al., 2015).
2.3.3. RMTg y codi cación de señales
El núcleo RMTg tiene un papel muy importante en la codi cación del apren-
dizaje y respuesta a estímulos aversivos y reforzadores del entorno. Su patrón
12 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
de actividad es sinérgico con la actividad celular de la LHb y opuesto a la ac-
tividad de las neuronas DA del mesencéfalo (Fig. 2.6; Matsumoto y Hikosaka,
2007; Jhou et al., 2009, 2013; Hong et al., 2011; Barrot et al., 2017).
Figura 2.6: Modelo del eje LHb-RMTg-VTA/SNc.
Representación esquemática de la conectividad y actividad neuronal de un trabajo
experimental realizado en monos. Las grá cas muestran la actividad de cada tipo de
neurona, expresada como cantidad de espigas por segundo (spk/s) ante un estímulo
visual que predice ya sea un evento reforzante o un evento aversivo. Note que ambos
núcleos, (RMTg) y (LHb), aumentan su tasa de disparo ante la proximidad de un
evento aversivo (trazos azules). Por el contrario, los dos núcleos decrementan su acti-
vidad cuando el estímulo visual predice un evento reforzante (trazos rojos). De manera
opuesta las neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo, aumentan su actividad
ante un evento reforzante y son inhibidas ante la proximidad de un evento aversivo.
La actividad neuronal de estas estructuras sugiere que el eje LHb-RMTg-VTA tiene
importantes implicaciones en la codi cación de las consecuencias de una conducta
emitida (Modi cada de Jhou et al., 2013 y Hong et al., 2011).
Las células GABAérgicas que comprenden al núcleo RMTg son sensibles a
la valencia de los estímulos, en términos de reforzadores o aversivos, observando
una ligera inhibición fásica durante estímulos reforzadores en comparación con
una excitación fásica después de la presentación de estímulos aversivos de dife-
rentes modalidades sensoriales (Li et al., 2019). En este sentido, se ha reportado
un incremento de la actividad neuronal después de la exposición a electrocho-
ques en las patas o pistas que los predigan (Jhou et al., 2009). También, se ha
demostrado que la exposición a estímulos aversivos impredecibles incrementa la
liberación glutamato de terminales nerviosas provenientes de la LHb que hacen
sinapsis con células del núcleo RMTg (Stamatakis y Stuber, 2012). El efecto
2.3. EL NÚCLEO ROSTROMEDIAL TEGMENTAL. 13
postsináptico consecuente es el incremento de la actividad de células GABAér-
gicas del RMTg aunado a la inducción de c-Fos (Brown y Shepard, 2013; Jhou
et al., 2009). Este incremento de actividad y de c-Fos mediado por el eje LHb-
RMTg se ve anulado al lesionar el FR (Brown y Shepard, 2013; Balcita-Pedicino
et al., 2011).
A este respecto, se ha reportado una respuesta neuronal heterogénea en el
núcleo RMTg después de la estimulación eléctrica en las patas por periodos
cortos de tiempo, ya que en zonas centrales del núcleo el aumento de células
positivas a c-Fos es mayor en comparación a regiones laterales (Jhou et al.,
2009). Experimentos con primates con rman dicha observación, ya que se ha
reportado que de todas las células que conforman al núcleo RMTg, el 64 % de
ellas son sensibles a la omisión de la recompensa, así como a pistas que predicen
su entrega, encontrándose el 94 % de esas células en la región central (core)
(Hong et al., 2011).
2.3.4. RMTg y sustancias de abuso
El abuso en el consumo de drogas es representado como un ciclo escalonado
de desregularizaciones del mecanismo cerebral codi cante de recompensas y
castigos, teniendo por consecuencia el uso compulsivo de drogas y la pérdida de
control de su consumo sin importar las consecuencias (Koob y Le Moal, 2008;
Volkow y Morales, 2015).
Inicialmente el núcleo RMTg fue descrito debido a su expresión de c-Fos en
respuesta a la administración aguda (Kau ing et al., 2009; Lecca et al., 2011)
y crónica (Perrotti et al., 2005) de psicoestimulantes, tales como la cocaína, las
anfetaminas (d-anfetamina, metanfetamina, 4- metilenedioxymetanfetamina) y
otras drogas de abuso (Kau ing et al., 2010; Zahm et al., 2011; Lecca et al.,
2011, 2012; Matsui y Williams, 2011; Cornish et al., 2012). Se ha hipotetizado
que esta respuesta podría ser mediada por el sistema DA (Fakhoury, 2018)
ya que la activación de proyecciones de neuronas DA del núcleo VTA a la
LHb incrementa la excitabilidad de células pertenecientes al eje LHb-RMTg por
medio de receptores D4 , resultando en una retroalimentación negativa indirecta
(Fig. 2.7) (Good et al., 2013). Además, tras la administración de un inhibidor
de la recaptura de DA, también es observado un incremento en la expresión de
14 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
c-Fos en el núcleo RMTg (Perrotti et al., 2005; Kau ing et al., 2019).
Después de la administración de cocaína se mantiene una expresión aumenta-
da de c-Fos y ∆FosB durante días en células del núcleo RMTg (Kau ing, 2010).
Esta expresión es anulada en un 50 % después de una lesión del FR (Jhou et al.,
2013), indicando que la expresión de c-Fos re eja la integración de información
proveniente de la LHb. Sin embargo, la causa del resto de la expresión no ha
sido esclarecida. Aunado a esto, la cocaína potencia por más de 24 horas las
corrientes excitatorias presinápticas (EPSC), mediadas por receptores AMPA
en neuronas de la LHb que proyectan especí camente hacia células del núcleo
RMTg (Maroteaux y Mameli, 2012; Meye et al., 2015).
La cocaína promueve un efecto bifásico, teniendo importantes propiedades
reforzadoras en un inicio, y posteriormente una etapa aversiva, la cual es más
duradera a través del tiempo. Interesantemente, ante la administración de esta
droga, el disparo de las células del RMTg muestran dicho efecto bifásico coinci-
diendo su actividad con estados aversivos o reforzantes en roedores, provocado
por la administración de cocaína (Li et al., 2019). Esto se puede observar du-
rante la constante administración de cocaína, la cual promueve un incremento
en conductas evasivas, sin embargo, al realizar una ablación del núcleo RMTg
dicha aversión deja de presentarse. Esto ocurre también, tras la inmediata in-
hibición de este núcleo mediante métodos optogenéticos (Jhou et al., 2013).
Resultados similares han sido observados en programas de autoadministración,
durante paradigmas de búsqueda de cocaína en roedores, donde la activación
del núcleo RMTg fomenta la extinción de la autoadministración y la inhibición
de este núcleo incrementa las respuestas operantes (Hu y LaLumiere, 2015).
Por consiguiente, el núcleo RMTg puede jugar un papel crucial en la modulación
de las propiedades negativas de la cocaína.
Un agonista opioide como la mor na, afecta la actividad de las células del
RMTg decrementando la tasa de disparo mediante receptores a opioides de tipo
µ (Fig. 2.7) (Jalabert et al., 2011), provocando la excitación de células DA
debido a la inhibición presináptica de potenciales postsinápticos inhibitorios
(IPSPs) de naturaleza GABAérgica (Johnson y North, 1992). Además, estudios
conductuales muestran que tras la administración local dentro del RMTg de
2.3. EL NÚCLEO ROSTROMEDIAL TEGMENTAL. 15
otro agonista opioide como lo es el endor n-1 produce una preferencia de lugar
en roedores. Por lo tanto, el RMTg también juega un papel importante en los
efectos reforzantes debido a la administración de opioides (Jhou et al., 2012).
Figura 2.7: RMTg y su respuesta a diversas sustancias de abuso.
Representación esquemática de los diversos sistemas involucrados en la respuesta del
eje LHb-RMTg-VTA en presencia de algunas sustancias de abuso como la cocaína,
mediante el incremento de liberación de DA y activación de receptores a DA tipo D4
provocando una inhibición de células glutamatérgicas de la LHb (1). Además de la
activación de receptores tipo D1 y D2 en el NAc (2). Los opioides, mediante la presencia
de receptores a opioides tipo µ en células GABAérgicas del RMTg generando una
inhibición de la actividad de estas células y por lo tanto facilitando la liberación de DA
de células del VTA (3). Finalmente los endocannabinoides mediante la sustancia activa
del cannabis (∆9-tetrahidrocannabinol) activa los CBR1 localizados en terminales
sinápticas de células GABAérgicas del RMTg inhibiendo la liberación de GABA sobre
las células DA del VTA (4).
Otra droga de abuso cuyos efectos se han estudiado en el RMTg, es el can-
nabis. El componente activo del cannabis es el ∆9-tetrahidrocannabinol el cual
promueve la activación de células DA del mesencéfalo. Este efecto es mediado
por CBR1 s los cuales se expresan en las terminales GABAérgicas que se originan
en el RMTg (Gessa et al., 1998; Herkenham et al., 1991). La activación de los
CBR1 s inhiben la liberación de GABA por lo tanto se incrementa la excitabi-
lidad de las neuronas DA por un mecanismo de desinhibición (Fig. 2.7) (Lecca
et al., 2011).
16 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
2.3.5. La nicotina y el núcleo RMTg
Se ha sugerido que la nicotina también puede mediar efectos aversivos posi-
blemente por la conexión entre la habénula medial y el núcleo interpeduncular.
Si bien, estudios farmacológicos muestran que existe una participación de esta
vía, su relación con el sistema DA aún no es clara (Antolin-Flores et al., 2015;
Miller y Picciotto, 2016). Por otra parte, los efectos aversivos también podrían
estar mediados por el eje LHb-RMTg. Esta idea esta reforzada por el hecho de
que la inhibición del núcleo RMTg incrementa la tasa de disparo de células del
VTA (Jalabert et al., 2011; Kau ing y Aston Jones, 2015) y de la SNc (Bourdy
et al., 2014). Mientras que la activación del RMTg, ya sea por estímulo eléctri-
co u optogenético, inhibe la actividad de las neuronas DA e induce aversión y
conductas de evitación de lugar (Lecca et al., 2011; Stamatakis y Stuber, 2012).
Como se mencionó anteriormente, además de las proyecciones glutamatérgi-
cas de la LHb, el RMTg recibe entradas colinérgicas provenientes de los núcleos
del tegmento laterodorsal y pedunculopontino (Kau ing et al., 2009; Brinsch-
witz et al., 2010; Bourdy y Barrot, 2012; Barrot et al., 2017). En diversas es-
tructuras cerebrales incluyendo el hipocampo, la corteza, el tálamo y el núcleo
dorsal del rafé, entre otras, se ha demostrado que la acetilcolina modula la li-
beración de glutamato mediante la activación de nAChRs presinápticos. Este
efecto involucra diversos tipos de canales de calcio (McGehee et al., 1995; Girod
y Role, 2001; Maggi et al., 2004; Sharma et al., 2008; Dickinson et al., 2008;
Garduño et al., 2012). Luego, una pregunta importante es si la activación de
nAChRs podría regular la liberación de glutamato y por tanto la excitabilidad
de las neuronas del núcleo RMTg. Previamente se ha sugerido que las terminales
glutamatérgicas provenientes de la habénula contienen nAChRs tipo α7 que al
ser activados aumentan la actividad de las neuronas del RMTg (Lecca et al.,
2011, 2012). Sin embargo, las acciones de la nicotina sobre los nAChRs presi-
nápticos en el RMTg no han sido estudiados en forma detallada. En el presente
trabajo de tesis se investigó si la nicotina regula la liberación espontánea de
glutamato y la excitabilidad en neuronas del núcleo RMTg, mediante técnicas
electro siológicas y de imagenología de calcio.
2.4. JUSTIFICACIÓN 17
2.4. Justi cación
El consumo de tabaco es un problema de salud pública cuya prevalencia ha
aumentado en las últimas décadas al grado de causar alrededor de 7 millones de
decesos al año. La nicotina, sustancia activa del tabaco, tiene un efecto relajan-
te ansiolítico, sin embargo, ese efecto no es constante a lo largo del tiempo, ya
que fumadores reportan una mayor sensación placentera en el primer cigarro
del día y esa sensación va decreciendo conforme se consumen más cigarrillos
durante el día (Miller y Picciotto, 2016). Por otra parte, se ha reportado que
individuos con alto consumo de nicotina, muestran un patrón de alteraciones
tanto cognitivas como siológicas, así como de comportamiento. Estas altera-
ciones implican cambios a nivel del SNC, especialmente en circuitos neuronales
implicados en el sistema de recompensa y aversión. Como se señaló anterior-
mente, el complejo SNc/VTA es la principal fuente de dopamina en el cerebro
y existen evidencias de que la función de estos núcleos está alterada en las adic-
ciones. Por otra parte, el núcleo RMTg ejerce un fuerte tono inhibitorio sobre
ellos, por lo cual se ha propuesto este núcleo como un freno de los sistemas
dopaminérgicos. Además, por su situación anatómica, que le permite recibir in-
formación proveniente de áreas sensoriales, límbicas y motoras y transmitirla a
los sistemas dopaminérgicos y serotoninérgicos, el núcleo RMTg juega un papel
estratégico en el control de funciones cognitivas y conductuales, así como del
aprendizaje por reforzamiento. Un ejemplo de esto, son las abundantes aferen-
cias glutamatérgicas de la LHb, región talámica importante en la codi cación de
estimulas aversivos o grati cantes, así como en la toma de decisiones. Por ello,
este núcleo se ha propuesto como un futuro blanco terapéutico para el trata-
miento de diversos trastornos neuropsiquiátricos como la ansiedad, la depresión
y las conductas adictivas. Considerando lo anterior, resulta de gran importancia
clínica y siológica estudiar los mecanismos por los cuales la nicotina, siendo
una droga de abuso, controla la actividad del núcleo RMTg. Además, el presente
trabajo de tesis propone abordar el problema mediante técnicas electro sioló-
gicas y de imagenología de calcio. Esta última nos permitirá visualizar el efecto
de la nicotina sobre una población de decenas de neuronas, pero con resolución
de célula única. Cabe señalar que esta técnica no se ha utilizado antes en el
estudio del RMTg.
18 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
2.5. Hipótesis
Si existen receptores colinérgicos nicotínicos en las terminales glutamatérgi-
cas en el núcleo RMTg, su activación por nicotina incrementará liberación de
glutamato y la excitabilidad de las neuronas GABAérgicas.
2.6. HIPÓTESIS ESPECÍFICAS 19
2.6. Hipótesis especí cas
1. Las corrientes excitatorias post sinápticas espontáneas (EPSCs) en neuro-
nas GABAérgicas del núcleo RMTg incrementarán después de la aplicación
de nicotina
2. Los efectos de la nicotina pueden ser mediados por los nAChRs confor-
mados tanto por las subunidades α7 como las subunidades α4 y β 2.
3. Las ubicaciones de los nAChRs se encontrarán en las terminales sinápticas,
regulando la liberación de neurotransmisores.
4. La actividad poblacional de las células del núcleo RMTg será incrementada
tras la presencia de nicotina.
5. Los resultados electro siológicos patch-clamp de célula única serán con-
gruentes con la actividad poblacional registrada, antes, en presencia y
después de la nicotina, en células del núcleo RMTg.
20 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
2.7. Objetivo General
Determinar el efecto de la nicotina sobre la liberación espontánea de gluta-
mato y la actividad de las neuronas GABAérgicas del núcleo RMTg.
2.8. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 21
2.8. Objetivos especí cos
1. Determinar los efectos de la nicotina sobre las corrientes postsinápticas
excitatorias (EPSCs) en neuronas GABAérgicas del RMTg, mediante téc-
nicas electro siológicas.
2. Determinar farmacológicamente, el subtipo de receptor a través del cual
la nicotina ejerce sus efectos en el RMTg, mediante el uso de antagonistas
y agonistas selectivos de receptores colinérgicos nicotínicos.
3. Determinar la presencia de nAChRs postsinápticos mediante la aplicación
local de acetilcolina en el núcleo RMTg.
4. Utilizar la técnica de imagenología de calcio para estudiar el efecto de la
nicotina sobre la excitabilidad poblacional neuronal en el núcleo RMTg.
5. Esclarecer si existe una similitud entre los resultados observados en ex-
perimentos electro siológicos patch-clamp de célula única en comparación
con la actividad poblacional del RMTg en presencia de nicotina.
Capı́tulo 3
Materiales y Métodos
3.1. Animales
Se emplearon ratas de la cepa Wistar de 21-25 días de edad (28-35gr) man-
tenidas en condiciones controladas de alimento, agua y ciclo de luz-obscuridad
(12/12 horas), alojadas en el bioterio de la Facultad de Medicina de la Univer-
sidad Nacional Autónoma de México. Los experimentos se llevaron a cabo de
acuerdo con la NORMA O cial Mexicana de Especi caciones técnicas para la
producción, Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio (NOM-062-ZOO-
1999) y en conformidad con lo estipulado por el Comité Interno para el cuidado
y uso de los animales de laboratorio (CICUAL) de la UNAM.
3.2. Obtención de rebanadas
Los sujetos experimentales fueron anestesiados con ketamina (85mg/kg) y
xilacina (15mg/kg) vía intraperitoneal y enseguida fueron sacri cados mediante
decapitación. Posteriormente, se realizó la extracción del cerebro el cual fue
◦
inmerso en una solución salina o Ringer a 4 C cuyo contenido en mM fue:
125 NaCl, 3 KCl, 25 NaHCO3 , 1.25 Na2 HPO4 , 2 MgCl2 , 2 CaCl2 , 25 glucosa,
pH=7.3, 300mOsm/L, saturada con una mezcla de 95 % O2 y 5 % CO2 .
Mediante un vibratomo (Pelco 102, Ted Pella, INC), se obtuvieron rebana-
das coronales de 250 µm de grosor conteniendo el núcleo RMTg (Fig. 3.1A).
Las rebanadas fueron mantenidas en la solución salina anteriormente descrita
22
3.3. ELECTROFISIOLOGÍA 23
a temperatura ambiente durante al menos una hora (periodo de estabilización
del tejido), antes de la realización de los registros electro siológicos (Garduño
et al., 2012).
3.3. Electro siología
Las rebanadas, que contenían el núcleo RMTg, fueron transferidas, una a la
vez, a una cámara de registro montada en un microscopio y perfundidas con
solución de Ringer a una tasa de 4-5 ml/min. Se realizaron experimentos elec-
tro siológicos por medio de la técnica de patch-clamp en la con guración de
célula completa (whole cell), con jación de voltaje y jación de corriente, en
neuronas del RMTg. Para el registro electro ológico, se emplearon micropipetas
de vidrio (4-7 MΩ) llenadas con una solución interna cuyo contenido fue, (en
mM): 140 K-gluconate, 5 NaCl, 1 MgCl2 , 0.02 EGTA, 10 HEPES, 2 Mg2 -ATP,
0.5 Na2 GTP, y 0.1 % biocitina, pH=7.2-7.3, 280-300 mOsm/L. Se utilizó un
ampli cador Multiclamp 700B (Axon Instruments). Las señales obtenidas se
ltraron a 3 KHz y digitalizaron mediante una interfase análogo-digital (Digi-
data 1422A; Molecular Devices) a una velocidad de muestreo de 5 KHz. Los
datos fueron guardados en una computadora personal equipada con el softwa-
re pClamp 10 (Molecular Devices). Las neuronas fueron visualizadas mediante
un microscopio vertical (BX51WI; Olympus Instruments), equipado con un ob-
jetivo de inmersión en agua 80X. Como se trata de una estructura bilateral,
se eligieron de manera indistinta las células ubicadas dentro del RMTg tanto
del hemisferio izquierdo como del derecho. Las neuronas fueron primeramen-
te registradas mediante la técnica de jación de corriente para examinar sus
características electro siológicas y calidad del sello formado. Se seleccionaron
aquellas células que exhibieron potenciales de acción de breve duración (≈1ms)
y disparo regular ante la aplicación de un pulso despolarizante, ya que éstas son
características que se han descrito en las neuronas GABAérgicas de esta región.
Además, sólo se seleccionaron neuronas que mostraron un sobretiro (overshoot)
de 10-20 mV, para asegurar la viabilidad del sello. Una vez cumplidas estas con-
diciones, se cambió a la modalidad de jación de voltaje para realizar el registro
de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSCs). El registro
de estas corrientes se hizo de manera continua a un potencial de mantenimiento
de -70 mV (Garduño et al., 2012). Todos los experimentos fueron hechos en pre-
24 CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS
sencia de gabazina ó picrotoxina (10 µM) para bloquear los receptores GABAA
y aislar las corrientes excitatorias mediadas por glutamato.
3.4. Administración de fármacos
Todos los fármacos fueron preparados el día del experimento y se aplica-
ron disueltos en la solución de Ringer, mediante un sistema de perfusión por
gravedad. Después de tomar un registro control de 15 minutos la nicotina, sus
agonistas y antagonistas se aplicaron durante 8-10 minutos (según el experimen-
to), para asegurar que hubiera un equilibrio de la concentración de los fármacos
en la cámara de registro. Después de esto, los fármacos se retiraron del baño
de perfusión (lavado) y se continuó el registro por un periodo de al menos 30
minutos que fue tomado en cuenta para su análisis.
3.5. Aplicación local de acetilcolina
En algunos experimentos se aplicó acetilcolina (ACh) en el núcleo RMTg
(n=8) y en la substancia negra (SN, n=5) para explorar la presencia de nA-
ChRs postsinápticos. La aplicación local se realizó utilizando una pipeta de
vidrio de 2 MΩ de resistencia (pipeta de aplicación), llena con una solución de
Ringer conteniendo ACh (1 mM). La pipeta de aplicación estaba conectada a un
microinjector de presión (Mod. IM300, Narishige, Japón). La pipeta de aplica-
ción se colocó aproximadamente a 50 µm de distancia de la neurona registrada
utilizando un micromanipulador y se aplicó un pu de ACh de 0.5 psi de
presión (500 ms de duración). Las corrientes evocadas por la aplicación local de
ACh se registraron manteniendo la neurona a un potencial de mantenimiento
de -70 mV. Estos experimentos se realizaron en presencia de atropina (5 µM) y
tetrodotoxina (TTX, 500 nM). Para bloquear la posible participación de recep-
tores muscarínicos y eliminar efectos indirectos de la acetilcolina dependientes
de potenciales de acción.
3.6. INMUNOHISTOQUÍMICA 25
3.6. Inmunohistoquímica
Durante el registro electro siológico, las células fueron marcadas con bio-
citina (0.5 % disuelta en la solución interna de la micropipeta) mientras su
actividad fue registrada. Una vez terminado el experimento electro siológico,
las rebanadas se jaron en paraformaldehído al 4 % y ácido pícrico al 1 % en un
amortiguador de fosfatos (PBS 0.1 M) con pH=7.4, durante 24 hrs. Posterior-
mente la rebanada se lavó con PBS y se mantuvo en sacarosa al 30 % durante
30 minutos. Después, el tejido se incluyó en un bloque de agar para obtener
rebanadas de 40 µm de grosor mediante un vibratomo (Serie 1000). Las rebana-
das obtenidas se incubaron 4 a 6 horas en una mezcla de PBS con Triton X-100
(0.2 %) y streptavidina conjugada a Cy3 (1 mg/ml; Zymed) diluida 1:100, para
el marcaje de la neurona registrada. La rebanada con la célula marcada se incu-
bó luego en BSA (1 %) por media hora e inmediatamente después se incubó con
el anticuerpo anti-GAD65/67 (anti-rabbit; ImmunoStar) diluido 1:1000, durante
2 días. Transcurrido este periodo, las rebanadas se enjuagaron con PBS y fueron
reincubadas por 2 horas con un anticuerpo secundario (anti-rabbit) conjugado
a uorescencia (Alexa) diluido 1:100 (Vector Laboratories). Luego, las rebana-
das se colocaron en portaobjetos utilizando un medio de montaje (Vectashield;
Vector Laboratories) y fueron observadas en un microscopio de epi uorescencia,
para la identi cación de la neurona marcada con el anticuerpo secundario. Fi-
nalmente, la célula marcada se examinó por medio de un microscopio confocal
y las imágenes se digitalizaron y almacenaron en una computadora personal.
3.7. Imagenología de calcio
Una vez transcurrido el periodo de estabilización del tejido las rebanadas
fueron incubadas en la obscuridad durante 20-30 minutos a una temperatura de
≈30◦ C en una solución conteniendo uo 4-AM (1-10 µM) (Invitrogen, Life tech-
nologies), disuelto en 0.1 % de dimetilsufóxido (DMSO) y solución Ringer. Pos-
teriormente, cada rebanada se colocó sobre una cámara de registro (plexiglas)
y se perfundió con solución de Ringer a una tasa de 4-5 ml/min a temperatura
ambiente, mediante un sistema de perfusión por gravedad. Para la visualización
de células y la obtención de los videos de uorescencia se utilizó un microsco-
pio vertical (Nikon FN1 Eclipse), provisto con un objetivo 16X de inmersión
26 CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS
en agua. El campo que podrá ser observado será de 280 x 260µm. Para obte-
ner los cambios de uorescencia, el tejido fue estimulado con pulsos de luz de
488 nm de longitud de onda (15-30 ms de exposición) mediante una lámpara
LED (Lambda HpX L5, Sutter Instruments) conectada mediante bra óptica al
microscopio. Los videos se realizaron mediante una cámara digital CCD (Cold
SNAP MYO, Photometrics), controlada mediante un software personalizado y
programado en el ambiente LabView (National Intruments). La frecuencia de
adquisición de imágenes fue de 4 frames por segundo y los videos tuvieron una
duración de 6 minutos (1440 frames). Al nalizar el experimento se colocó una
solución de alto potasio (5 mM), para el cálculo total de neuronas que captaron
el indicador de calcio dentro del campo de registro. La actividad fue estimada
mediante los transitorios de calcio generados por las neuronas. Las señales de
uorescencia dependientes a calcio se calcularon como (Fi-Fo)/Fo, donde Fi es
la orescencia en cualquier cuadro de video y Fo es dado por la uorescencia
basal.
3.8. Análisis de imágenes
En cada video, las células activas se seleccionaron usando un templete circu-
lar de tamaño variable (4-30 µm). Un mapa de coordenadas de neuronas activas
fue generado automáticamente a partir de las imágenes utilizando el software
Im-Patch (Fig. 3.1C; Perez-Ortega et al., 2016). Las señales de calcio intrace-
lular (transitorios de calcio) de cada región de interés fueron colectadas en el
tiempo (Fig. 3.1D). Los transitorios de calcio y su primera derivada son tomados
como indicadores del disparo neuronal (Carrillo-Reid et al., 2008). Solo aquellos
transitorios con amplitudes mayores a 2.5 veces la desviación estándar del ruido
basal, se consideraron para el análisis. El fotoblanqueo (bleaching), el fenómeno
de los discos de Airy y el ruido fueron corregidos al restar el fondo local de la
neurona de interés a la señal cruda de la misma. A partir de las derivadas de los
transitorios de calcio, para cada experimento se construyó una matriz binaria
de ceros (0) y unos (1) en la cual cada la representa una neurona activa y cada
columna una ventana de tiempo (frame) y donde 1 representa un frame activo
y 0 un frame inactivo para cada neurona. El eje y en la matriz representa
el número de neuronas activas mientras que el eje x representa el número de
frames del video. Las matrices se utilizaron para generar grá cas tipo raster
3.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 27
(rasterplots) que ilustran la actividad de las células a lo largo del experimento.
3.9. Análisis estadístico
En los experimentos electro siológicos, la captura de los datos se llevó a cabo
utilizando el programa Clamp t 10 (Molecular Devices). El análisis de los datos
se efectuó utilizando el programa Mini-Analysis (Synaptosoft, Decatur, GA) y
los paquetes para grá cas y análisis estadístico fueron: Origin version 8 (Ori-
ginLab Corporation, Wellesley Hills MA), Igor Pro 6 (WaveMetrics Inc, Lake
Oswego, OR) y GraphPad Prism 6 (San Jose CA, USA). Los datos obtenidos de
los experimentos de imagenología de calcio fueron analizados utilizando rutinas
personalizadas elaboradas en MatLab (Math Works) para analizar estadística-
mente la actividad de células individuales, así como la actividad de la población
total de células en todos los experimentos realizados (Aparicio-Juarez et al.,
2017). Los datos fueron expresados como media ± error estándar. Las compa-
raciones estadísticas entre muestras electro siológicas fueron hechas utilizando
la prueba t de student, en el caso del análisis de imagen de calcio se utilizó la
prueba de Kolmogorov-Smirnov para comprobar la distribución normal de las
muestras experimentales, y la comparación entre condiciones se realizó mediante
la prueba Kruskal-Wallis. Finalmente para la comparación entre los grá cos de
caja se realizó mediante la prueba de Friedman. Un valor de p <0.05 fue tomado
como estadísticamente signi cativo. Finalmente, para cada grupo experimental
de imagenología de calcio, se realizó un histograma de coactividad de todas las
células por frame. Mediante el algoritmo de Monte Carlo (1000 simulaciones) se
determinó un umbral de signi cancia para el número de células coactivas (picos
de sincronía). El umbral corresponde a un nivel de signi cancia de p <0.05,
que representa la probabilidad de que los picos de coactividad hayan ocurrido
al azar.
28 CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS
Figura 3.1: Técnica de imagenología de calcio.
A) Diagrama de las regiones del cerebro de rata donde fueron realizados el análisis
de imágenes de los transitorios de calcio. B) Fragmento de video de células del núcleo
RMTg durante dos condiciones control (lado izquierdo) y en presencia de nicotina (lado
derecho). C) Mapa de coordenadas de neuronas activas, las células que incrementaron
su actividad durante nicotina son señaladas con echas blancas. D) Transitorios de
calcio a través del tiempo de una célula representativa (círculo rojo), la variación
porcentual de la uorescencia (superior), cambio de nivel de uorescencia con respecto
al tiempo o derivada (inferior).
Capı́tulo 4
Resultados
4.1. Electro siología
Para la obtención del registro individual de las corrientes postsinápticas
excitatorias espontáneas (sEPSCs) se registraron 72 células en la región corres-
pondiente al núcleo RMTg. La identi cación de estas células registradas fue
realizada de acuerdo a sus características electro siológicas: tasa de disparo
(≈18 Hz en promedio) y duración de potencial de acción (1 ms).
4.1.1. La nicotina afecta la frecuencia de las sEPSCs en
las células GABAérgicas del núcleo RMTg
Para observar el efecto de la nicotina sobre las células GABAérgicas del
núcleo RMTg, se agregó nicotina (1µM) en la solución de perfusión. La gura
4.1A muestra trazos de corriente de una sola célula en condiciones control, en
presencia de nicotina y posteriormente el lavado. Puede observarse un incre-
mento en la frecuencia de las sEPSCs producido por nicotina (trazo medio) y
un lavado del efecto 20 minutos después de retirar la droga del baño. Una frac-
ción del trazo correspondiente al efecto de la nicotina se muestra a un barrido
más lento (recuadro rojo). Aquí se aprecia la cinética característica de las co-
rrientes sinápticas, las cuales exhiben una fase ascendente rápida de ≈1ms de
duración, seguida de una fase de decaimiento de aproximadamente 12 ms. La
nicotina produjo un incremento en la frecuencia de las sEPSCs del 174 ± 26 %
29
30 CAPÍTULO 4. RESULTADOS
con respecto al control (Fig.4.1B; n=17, p<0.05, t de student). El efecto persis-
tió de 20 a 40 minutos después del lavado y posteriormente decrementó a valores
basales. La grá ca de la distribución acumulada de los intervalos inter-evento
(Fig.4.1C) muestra que la nicotina produjo un desplazamiento de la curva hacia
la izquierda trazo (línea roja) con respecto al control (línea negra) mientras
que la distribución acumulada de la amplitud no se modi có (Fig.4.1D). Esto
demuestra que la nicotina incrementa la frecuencia de las sEPSCs pero no la
amplitud de las mismas lo cual sugiere un efecto presináptico (Garduño et al.,
2012).
Posteriormente, diecisiete de las células utilizadas fueron procesadas median-
te un marcaje inmunohistoquímico para determinar su naturaleza GABAérgica,
obteniendo un resultado de 15 células (88 %) con un marcaje positivo (Fig.4.1E).
Para corroborar la naturaleza de las corrientes excitatorias, en algunos ex-
perimentos se agregó CNQX (10µM) después del lavado, un antagonista com-
petitivo de los receptores AMPA/kainato. La adición de CNQX suprimió por
completo las sEPSCs (Fig.4.1F), comprobando que éstas son de naturaleza glu-
tamatérgica y mediadas por receptores AMPA/kainato.
Para descartar la presencia de nAChRs postsinápticos en las neuronas del
RMTg, se realizaron experimentos de aplicación local de acetilcolina (ACh, 1
mM) directamente sobre el soma de células GABAérgicas (Fig. 4.1G, ver Mate-
rial y Métodos). Como puede observarse, la aplicación local de ACh no provocó
corrientes nicotínicas en el RMTg lo cual demuestra que no hay presencia de
nAChRs postsinápticos en este núcleo. Como control, también se realizó la apli-
cación local de ACh en el área ventral tegmental (VTA), núcleo cuyas células
expresan en el soma nAChRs tanto del subtipo α7 como α4β 2 (Matsubayashi
et al., 2003; Wooltorton et al., 2003; Dani A., 2006). La aplicación local de ACh
en el VTA produjo una corriente rápida seguida de una lenta y de baja ampli-
tud que corresponden a las corrientes nicotínicas mediadas por receptores α7 y
α4β 2, respectivamente (Wooltorton et al., 2003).
4.1. ELECTROFISIOLOGÍA 31
32 CAPÍTULO 4. RESULTADOS
Figura 4.1: Efecto de la nicotina sobre la actividad eléctrica de células del
núcleo RMTg
A) Trazos de corriente obtenidos en jación de voltaje de las sEPSCs de la una neurona
representativa en condiciones control (izquierda), adición de nicotina (medio) y lavado
(derecha). El inserto muestra una ampliación de un fragmento del registro de las
sEPSCs, delimitado por la caja en rojo y en presencia de nicotina. B) Histograma
de frecuencia de la misma célula durante la adición de nicotina(1µM). La nicotina
incrementa la frecuencia de las sEPSCs. El inserto se muestra la grá ca de barras
ilustrando el efecto de la nicotina sobre las sEPSCs en comparación con la fase control.
Todos los experimentos fueron hechos en presencia de gabazina ó picrotoxina (10
µM). C-D) Grá cas de fracción acumulada del intervalo interevento y la amplitud
de las sEPSCs durante la fase control (negro) y después de la adición de nicotina
(rojo). E) Célula representativa del marcaje inmunohistoquímico para biocitina (panel
izquierdo), marcaje con anticuerpo anti-GAD 65/67 (panel medio) y la sobreposición de
ambas marcas (panel derecho). F) Trazos de corriente en jación de voltaje mostrando
el bloqueo de las sEPSCs por CNQX (10µM) administrado después de la fase de
lavado. H) Trazo de corriente representativo durante la aplicación local de ACh (1
mM) y atropina (5 µM) en una célula del núcleo RMTg (izquierda) y VTA (derecha)
como control positivo de la presencia de nAChRs en el soma de las células.
4.1.2. El antagonismo de los nAChRs tipo α7, previene
los efectos de la nicotina sobre las células del núcleo
RMTg.
Para determinar el subtipo de receptor involucrado en los efectos de la nico-
tina sobre las células del núcleo RMTg, se administró en la solución de perfusión,
metilcaconitina (MLA, 100 nM), un antagonista selectivo los nAChRs del sub-
tipo α7.
4.1. ELECTROFISIOLOGÍA 33
Figura 4.2: Los efectos de la nicotina sobre las sEPSCs son bloqueados por un
antagonista selectivo a nAChRs del subtipo α7.
A) Trazos de corriente obtenidos en jación de voltaje que muestran las sEPSCs de
una célula en condiciones control (izquierda), adición de nicotina en presencia de MLA
(medio) y lavado (derecha). B) Histograma de frecuencia de una célula representativa
durante la adición de nicotina (1µM) en presencia de MLA (100nM). La MLA suprime
los efectos de la nicotina sobre la frecuencia de las sEPSCs. C) Gra ca de barras
mostrando que la nicotina, en presencia de la MLA, no tuvo un efecto signi cativo
sobre la frecuencia de las sEPSCs. Todos los experimentos fueron hechos en presencia
de gabazina ó picrotoxina (10 µM).
Después de 10 minutos, se agregó nicotina (1µM). Al agregar nicotina en
presencia de MLA no hubo variación signi cativa en la frecuencia de sEPSCs
en -comparación con el control (Fig. 4.2A-C), es decir, antes de agregar nicotina
(control vs nicotina, n=6, p>0.05, t de student). Por lo tanto, la MLA bloqueó
el incremento en la frecuencia de las sEPSCs en neuronas del núcleo RMTg
producido por la nicotina (Fig. 4.1B). Esto sugiere que el efecto excitador de la
nicotina está mediado por nAChRs del subtipo α7.
4.1.3. La adición de un agonista selectivo a receptores α7,
tiene efectos similares a los de la nicotina sobre las
células del núcleo RMTg.
Para con rmar que el efecto observado de la nicotina sobre las sEPSCs es
mediado por los nAChRs tipo α7, en otro grupo experimental se administró el
fármaco PNU-282987 (PNU, 100 nM), un agonista altamente selectivo para los
receptores tipo α7.
El PNU, por sí solo, mimetizó el efecto de la nicotina causando un incremen-
to del 69 % ± 6 en las sEPSCs (Fig. 4.3A-C). Si bien el incremento es menor
comparado con el efecto provocado por la nicotina, éste sigue siendo estadísti-
camente signi cativo (control vs PNU, n=5, p<0.05, t de student). De manera
similar a la nicotina, la adición de PNU provocó el desplazamiento hacia la iz-
quierda de la curva en el grá co de fracción acumulada del intervalo inter-evento
(4.3D), pero no modi có la amplitud (4.3E).
34 CAPÍTULO 4. RESULTADOS
Figura 4.3: Un agonista selectivo de los nAChRs tipo α7 mimetiza los efectos
de la nicotina en las sEPSCs de las células del núcleo RMTg.
A) Trazos de corriente en la modalidad de jación de voltaje de las sEPSCs en condi-
ciones control (izquierda), adición de PNU (medio) y posteriormente lavado (derecha).
B) Histograma de frecuencia de la misma célula durante la adición de PNU-282987
(100 nM). La presencia de PNU incrementa la frecuencia de las sEPSCs. C) Grá ca
de barras mostrando el efecto del PNU sobre las sEPSCs en comparación con la fase
control. Todos los experimentos fueron hechos en presencia de gabazina ó picrotoxina
(10 µM). D-E) Gra cas de fracción acumulada del intervalo interevento y amplitud
de las corrientes sEPSCs durante la fase control (negro) y después de la adición de
PNU (rojo).
4.1. ELECTROFISIOLOGÍA 35
4.1.4. El antagonismo especí co a receptores tipo α4β 2,
no previene los efectos de la nicotina sobre las cé-
lulas GABAérgicas del núcleo RMTg.
Otro de los principales nAChRs localizados en el SNC son los conformados
por las subunidades α 4β 2 (Miller y Piccioto, 2016).
Figura 4.4: La presencia de un antagonista selectivo a nAChRs tipo α4β 2 no
previene los efectos de la nicotina sobre las sEPSCs.
A) Trazos de corriente en la modalidad de jación de voltaje de las sEPSCs de una
célula en condiciones control (izquierda), adición de nicotina en presencia de DHβ E
(medio) y lavado (derecha). B) Histograma de frecuencia de una célula representativa
durante la adición de nicotina (1µM) en presencia de DHβ E (100 nM). La DHβ E no
suprime los efectos de la nicotina sobre la frecuencia de las sEPSCs. C) Gra ca de
barras mostrando el efecto de la nicotina aún en presencia del DHβ E sobre las sEPSCs.
Todos los experimentos fueron hechos en presencia de gabazina ó picrotoxina (10 µM).
Para esclarecer si estos receptores tienen participación en los efectos provo-
cados por la nicotina se aplicó, en el medio de perfusión, dihidro-β -eritroidina
(DHβ E, 100nM), un antagonista selectivo de receptores tipo α 4β 2 y posterior-
mente se agregó nicotina. Aún en presencia de este antagonista, la nicotina
incrementó las sEPSCs en un porcentaje de 149 ± 12 %; Fig. 4.4A-C) lo cual
sugiere que el efecto de la nicotina sobre la excitabilidad del núcleo RMTg, no es
mediado a través de nAChRs α4β 2 (control vs nicotina + DHβ E, n=5, p<0.05,
t de student).
36 CAPÍTULO 4. RESULTADOS
4.1.5. Un agonista selectivo a receptores α4β 2, no tie-
ne efecto sobre las sEPSCs en células del núcleo
RMTg.
Para corroborar que los nAChRs conformados por las subunidades α4β 2 no
tiene participación en el incremento de sEPSCs en células del núcleo RMTg, se
agregó a la solución de perfusión RJR-2403 (RJR, 100nM), un agonista selectivo
a receptores α4β 2.
Figura 4.5: Un agonista con alta a nidad por los nAChRS tipo α4β 2 no mi-
metiza los efectos de la nicotina.
A) Trazos de corriente obtenidos en jación de voltaje de las sEPSCs de una célula
en condiciones control (izquierda), adición de RJR (medio) y lavado (derecha). B)
Histograma de frecuencia de la misma célula durante la adición de RJR-2403 (100 nM).
C) Grá ca de barras mostrando el efecto del RJR sobre las sEPSCs en comparación
con la fase control. Todos los experimentos fueron hechos en presencia de gabazina ó
picrotoxina (10 µM).
La aplicación de RJR no provocó ningún cambio en la frecuencia ni en el
porcentaje de las sEPSCs en células del núcleo RMTg (Fig.4.5 B y C, control
vs RJR (n=5, p>0.05, t de student). Esto con rma la idea de que los nAChRs
α4β 2 no participan en los efectos de la nicotina sobre las sEPSCs en las células
del núcleo RMTg.
4.2. IMAGENOLOGÍA DE CALCIO 37
4.2. Imagenología de Calcio
4.2.1. La nicotina incrementa el disparo neuronal pobla-
cional en el núcleo RMTg
Para estudiar los efectos de la nicotina sobre la actividad poblacional en el
núcleo RMTg, se realizaron experimentos de imagenología de calcio.
38 CAPÍTULO 4. RESULTADOS
Figura 4.6: Registro poblacional de la actividad neuronal producida por nico-
tina en el núcleo RMTg.
A) Diagrama tipo ráster que representa la actividad celular espontánea a través del
tiempo, el eje de las ordenadas representa el número de célula y eje de las abscisas el
tiempo. Cada punto representa como la activación de la célula en un frame (ventana de
tiempo de 250 ms). El histograma debajo muestra el número de células que dispararon
juntas en cada ventana de tiempo (frame). En rojo se observan los picos de sincronía
signi cativos. B) Grá ca de distribución acumulada para cada condición, el desplaza-
miento a la derecha signi ca un incremento de la actividad neuronal. La actividad es
determinada dividiendo el número de frames en las cuales se observó actividad sobre
el número total de frames (obtenidos de todo el video) para cada célula. C) Grá ca de
cajas donde se representa la actividad celular en 3 diferentes condiciones, se muestra
un incremento de actividad durante la presencia de nicotina en comparación con el
control (*p = 0.0001, prueba de Friedman, 142 células).
Primeramente, se probó solo el efecto de la nicotina (1 µM). La gura 4.6A
es una grá ca tipo raster que muestra la actividad espotánea de 142 células re-
gistradas de un total de 6 experimentos, en tres diferentes condiciones: control,
nicotina y lavado (remoción de la nicotina). Tras agregar nicotina, se produjo un
incremento signi cativo de la actividad neuronal poblacional del 71 % (control
vs nicotina n=142, p<0.001, Kruskal-wallis). El histograma debajo del raster
muestra los picos de coactividad, los cuales representan el número de células
que dispararon juntas en el mismo frame, estos picos solamente son signi ca-
tivos si pasan el umbral de signi cancia (Prueba de Montecarlo, ver Material
y Métodos). Durante la presencia de nicotina los picos de sincronía se ven in-
crementados. El efecto de la nicotina se prolongó 12-20 minutos y nalmente
se revirtió después del lavado (Fig. 4.6A). La grá ca de la distribución acumu-
lada de la actividad celular muestra que la nicotina desplazó la curva hacia la
derecha (Fig. 4.6B, trazo rojo) indicando un incremento en la probabilidad de
la actividad neuronal que se revierte después del lavado (trazo azul). El efecto
de la nicotina también puede observarse en la grá ca de cajas (Fig. 4.6C). El
incremento en la probabilidad de la actividad producido por la nicotina fue signi-
cativamente diferente del control y del lavado (p <0.001, prueba de Friedman).
4.2.2. Los efectos de la nicotina sobre las poblaciones ce-
lulares del núcleo RMTg son prevenidos por un an-
tagonista selectivo a los nAChRs α7.
Para corroborar los resultados electro siológicos, en una serie de experimen-
tos de imagenología de calcio se administró nicotina en presencia del antagonista
de los nAChRs α7 MLA [100 nM].
4.2. IMAGENOLOGÍA DE CALCIO 39
Figura 4.7: Registro poblacional de la actividad neuronal producida por nico-
tina en presencia de MLA en el núcleo RMTg.
A)Diagrama tipo ráster que representa la actividad celular a través del tiempo, el eje
de las ordenadas representa el número de célula y eje de las abscisas el tiempo. Cada
punto es considerado como la activación de la célula. El histograma debajo representa
muestra el número de células activas en el mismo periodo de tiempo. El MLA previno
los picos de sincronía provocados por la nicotina. B) Grá ca de distribución acumulada
para cada condición. C) Grá ca de cajas donde se representa la actividad celular en
3 diferentes condiciones. No se muestra un cambio signi cativo en la actividad celular
durante la presencia de nicotina o el lavado con respecto al control (p = 0.06, prueba
de Friedman, 145 células).
Los resultados se muestran en la grá ca tipo raster que ilustra la activi-
dad espontánea de 145 células obtenidas de 5 experimentos (Fig. 4.7A). En
presencia de MLA, la nicotina no fue capaz de incrementar la actividad neuro-
nal (p >0.05, Kruskal-wallis). De manera interesante, también la presencia de
40 CAPÍTULO 4. RESULTADOS
MLA previno los picos de sincronía causados por la nicotina. La grá ca de la
distribución acumulada de la actividad celular no muestra un desplazamiento
de la curva por nicotina (Fig. 4.7B), como tampoco se obtuvieron diferencias
signi cativas en la grá ca de cajas (Fig. 4.7C; p>0.05, prueba de Friedman).
Los resultados obtenidos mostraron que en presencia de MLA, la nicotina no
produce cambios en la probabilidad de la actividad neuronal ya que no hubo
diferencias estadisticamente signi cativas de la nicotina con respecto al control
y el lavado.
Capı́tulo 5
Discusión
El principal hallazgo de este trabajo de tesis es que la nicotina produce un
aumento en la liberación de glutamato y en consecuencia un incremento en la
actividad poblacional del núcleo RMTg. La nicotina incrementó las corrientes
postsinápticas excitatorias (sEPSCs) registradas en las células GABAérgicas del
núcleo RMTg. La concentración de nicotina (1 µM) utilizada en nuestros expe-
rimentos, se encuentra dentro del rango siológico ya que es la máxima concen-
tración que se alcanza en el plasma de un fumador inmediatamente después del
consumo de un cigarrillo (Dani y Heinemann, 1996). Nuestros datos demostra-
ron que las sEPSCs son mediadas por glutamato ya que tras la administración
de CNQX, un antagonista de los receptores glutamatérgicos AMPA/kainato,
desaparece toda actividad espontánea (Fig.4.1F). La nicotina provocó un cam-
bio en la frecuencia, pero no en la amplitud de las sEPSCs lo cual demuestra
que el efecto nicotínico es presináptico (ver Garduño et al., 2012). Esto fue
con rmado por la demostración de que la aplicación local de acetilcolina di-
rectamente sobre el soma de las neuronas GABAérgicas del RMTg no produjo
corrientes mediadas por nAChRs lo cual si pudo observarse en neuronas del
VTA (ver Fig. 4.1G). Además, nuestros datos demostraron que el incremento
de actividad inducido por la nicotina es bloqueado por el antagonista selectivo
a los nAChRs α7 (MLA) pero no por el antagonista de los receptores α 4β 2
(DHBE; Fig.4.2 y 4.4). De manera consistente, la aplicación de PNU-282987,
un agonista selectivo de los receptores nicotínicos α7 mimetizó el efecto de la
nicotina mientras que la administración de RJR-2403, agonista de receptores
α4β 2, no produjo ningún efecto. Estos datos son congruentes con un estudio
previo en el cual se reportó que la nicotina aumenta la respuesta sináptica evo-
41
42 CAPÍTULO 5. DISCUSIÓN
cada mediante estimulación y que este efecto es antagonizado por MLA (Lecca
et al., 2012). Como se mencionó anteriormente, los receptores nicotínicos tipo
α7 poseen 10 veces más permeabilidad al calcio que los receptores α4β 2. La
cantidad de calcio que entra a través de los receptores α7 es capaz de producir
liberación de calcio de las pozas intracelulares mediante un proceso que se lla-
ma liberación de calcio inducida por calcio (CICR), lo cual facilita la liberación
del neurotransmisor sin la participación de los canales de calcio dependientes
de voltaje como ocurre en los receptores α4β 2 (Gray et al., 1996; Sharma y
Vijayaraghavan, 2003; Sharma et al., 2008; Garduño et al., 2012). Por lo tanto,
este es el mecanismo que proponemos, mediante el cual la nicotina incrementa
la e ciencia sináptica de las terminales glutamatérgicas en el núcleo RMTg.
Estos hallazgos son congruentes con reportes previos que indican que los
nAChRs se localizan preferentemente en terminales axónicas donde regulan la
liberación de neurotransmisores (Wonnacot et al., 2008). Por ejemplo, se ha
reportado que los nAChRs, se encuentran en terminales presinápticas, donde
inducen la liberación de glutamato en células del VTA, el NAc, la amígdala, el
hipocampo y la corteza prefrontal (Mansvelder y McGehee, 2002). Los datos
aquí presentados demuestran que en el núcleo RMTg ocurre de manera similar.
Las terminales glutamatérgicas de la LHb son moduladas por la activación de
nAChRs tipo α7. Estas terminales glutamatérgicas tienen como blanco principal
a las células GABAérgicas del núcleo RMTg sobre las cuales ejercen un efecto
excitatorio a través de receptores AMPA/kainato (Balcita-Pedicino et al., 2011;
Lecca et al., 2011). Acorde con esto, la estimulación optogenética de terminales
provenientes de LHb evoca corrientes excitatorias postsinápticas (EPSC) en las
células GABAérgicas del núcleo RMTg (Lammel et al., 2012).
En los experimentos electro siológicos, el monitoreo de la actividad celular
solamente se puede hacer registrando una neurona a la vez. En el presente es-
tudio se utilizó, además, la técnica de imagenología de calcio la cual permite
registrar la actividad de docenas de neuronas simultáneamente. De manera que
es posible examinar cómo se comporta una determinada población neuronal. Sa
sabe que los transitorios de calcio y su derivada se correlacionan con el dispa-
ro repetitivo de potenciales de acción de las células (Carrillo-Reid et al., 2008,
Perez- Ortega et al., 2016). Los resultados de los experimentos de imageno-
43
logía de calcio fueron congruentes con lo reportado en nuestros experimentos
electro siológicos. La nicotina produjo una activación global poblacional en las
neuronas del núcleo RMTg. Además, aumentó los picos de sincronía lo cual es
muy importante, pues signi ca que un aumento en la e ciencia en la libera-
ción sináptica de glutamato, producido por la nicotina, provoca que decenas
de neuronas del núcleo RMTg disparen de manera sincronizada. El efecto fue
bloqueado por (MLA) un antagonista selectivo de los receptores nicotínicos tipo
α7. El efecto de la nicotina fue persistente, es decir, la duración del incremento
de la actividad fue de 20-30 minutos después del lavado de la droga, lo cual es
consistente con los resultados electro siológicos.
Como se mencionó previamente, los estímulos aversivos, así como señales
que los predicen, promueven la activación fásica en el núcleo RMTg y por con-
siguiente una inhibición de la actividad DA del mesencéfalo tanto en murinos
(Barrot et al., 2015; Brown y Shepard, 2013; Jhou et al., 2009) y primates (Hong
et al., 2011).
En experimentos conductuales, se ha observado que el incremento de la ac-
tividad celular del núcleo RMTg produce aversión de lugar y decrementa las
propiedades reforzadoras de la sacarosa (Stamatakis y Stuber, 2012). También,
se ha demostrado que induce conductas tipo depresivas como el incremento de
la inmovilidad en la prueba de suspensión de cola, ampli ca el rechazo social
inducido por el paradigma de derrota social (Cui et al., 2014; Jhou et al., 2013).
Por lo tanto, un incremento en la actividad neuronal del núcleo RMTg promueve
conductas tipo depresivas y ansiosas. El presente trabajo demostró que la nico-
tina incrementa la liberación de glutamato mediante la activación de receptores
presinápticos tipo α7 en núcleo RMTg.
El resultado es un incremento en la excitabilidad y la tasa de disparo de las
neuronas GABAérgicas. Más aun, la nicotina promueve el disparo sincronizado
y persistente de decenas de neuronas del núcleo RMTg, lo cual aumentaría en
gran medida la liberación de GABA sobre las neuronas dopaminérgicas del VTA
y la SNc. Esto, en consecuencia, tendría un efecto inhibitorio sobre los siste-
mas dopaminérgicos que controlan los mecanismos de reforzamiento asociados
a diversas conductas adaptativas (Fig.5.1).
44 CAPÍTULO 5. DISCUSIÓN
Figura 5.1: Nicotina y el control de la actividad DA mediante nAChRs α7.
Representación esquemática del mecanismo celular y molecular subyacente al decre-
mento dopaminérgico (DA) inducido por nicotina y mediado por el incremento de
la actividad de las neuronas del núcleo RMTg. Área ventral tegmental (VTA), nú-
cleo accumbens (NAc), núcleo rostromedial tegmental (RMTg), neurona GABAérgica
(GABA), neurona acetilcolinérgica (ACh), neurona glutamatérgica (Glu), neurona
dopaminérgica (DA).
Los resultados mostrados en este trabajo sugieren que las acciones de la
nicotina en el núcleo RMTg tendría efectos ansiogénicos, pues existen trabajos
que reportan que la activación de aferentes glutamatérgicas al RMTg provoca
conductas de aversión y de evitación ante estímulos que usualmente son inocuos
(Stamatakis y Stuber, 2012). De manera opuesta se sabe, por estudios en fuma-
dores, que la nicotina es capaz de aliviar el estrés y producir efectos ansiolíticos
(Pomerleau, 1986; Gilbert et al., 1989). Estas discrepancias pueden explicarse
porque los efectos descritos en este trabajo son resultado de la acción aguda de
la nicotina sobre las neuronas del RMTg mientras que los efectos que se reportan
en fumadores resultan de la acción crónica de la nicotina. Se sabe que la nicoti-
na crónica es capaz de producir diversos cambios en la expresión de receptores,
así como desensibilización de los mismos. Por ejemplo, se ha reportado que la
nicotina crónica produce incremento en la expresión (upregulation) de algunos
subtipos de nAChRs, particularmente aquellos que poseen las subunidades α2 y
45
α3 (Peng et al., 1994; Kuryatov et al., 2005; Dani, 2015). Cabe señalar también,
que la nicotina tiene acciones directas en varias estructuras involucradas en el
control de los estados afectivo tales como la amígdala, el NAc y el núcleo del
rafé dorsal. Los efectos ansiogénicos o ansiolíticos de la nicotina también depen-
den de la vía de administración, el estado emocional previo a su administración
(relajación o estrés) o condiciones de abstinencia a la propia nicotina (Picciotto
et al., 2008). Como perspectiva, sería interesante analizar, en un trabajo poste-
rior, si ocurren cambios en los efectos nicotínicos dentro del núcleo RMTg como
resultado de la exposición crónica a la nicotina.
Asimismo, una propuesta interesante para continuar con esta línea de inves-
tigación sería estudiar cómo se modi can los ensambles neuronales (grupos de
células coactivas) en el núcleo del RMTg, en un modelo de aplicación crónica
de nicotina durante la abstinencia a esta droga.
46
Capı́tulo 6
Conclusiones
La nicotina incrementa la frecuencia de las sEPSCs en neuronas GABAérgi-
cas del núcleo RMTg, este incremento es mediado por los nAChRs conformados
por la subunidad α7 y no α4β 2.
El efecto de la nicotina es mediado por mecanismos presinápticos debido
a que su administración sólo modi ca la frecuencia de las sEPSCs y no su
amplitud.
Las neuronas GABAérgicas del núcleo RMTg no poseen nAChRs, ya que la
aplicación local de acetilcolina no provocó corrientes mediadas por este tipo de
receptores.
El efecto presináptico es de naturaleza glutamatérgica debido a que tras la
administración de un antagonista a receptores AMPA/kainato se bloquean las
sEPSCs.
La nicotina promueve la actividad neuronal poblacional del núcleo RMTg,
estimada mediante el conteo de los transitorios de calcio. Este efecto fue blo-
queado al administrar un antagonista selectivo a nAChRs α7.
La nicotina promueve el disparo sincronizado de las neuronas GABAérgicas
del núcleo RMTg.
47
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